KR100501863B1

KR100501863B1 - 열안정화된조영제

Info

Publication number: KR100501863B1
Application number: KR10-1998-0706416A
Authority: KR
Inventors: 마리트 스웨어드-노르드모; 퍼 헬게 굴릭센; 요룬 운트하임 브렌덴; 안네 크예르스티 팔빅
Original assignee: 아머샴 헬스 에이에스
Priority date: 1996-02-19
Filing date: 1997-02-19
Publication date: 2005-09-27
Also published as: CN1092988C; EP0885016A1; NO983584L; EA000900B1; ES2197331T3; CZ262698A3; NO313815B1; HUP9900812A2; CA2246778A1; EA199800739A1; ATE237362T1; JP4250747B2; IL125800A0; KR19990082670A; NO983584D0; NZ331372A; PL328309A1; DE69720979T2; EE9800248A; AU722735B2

Abstract

본 발명은 동결 건조용 안정제를 함유하고 20 ℃를 넘는 온도에서 열에 안정한, 동결-건조된 소포 함유 초음파 조영제에 관한 것이다.

Description

열 안정화된 조영제{Thermally Stabilized Contrast Agent}

본 발명은 열 안정화된 동결-건조된 소포 함유 초음파 조영제 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

소포 (이 용어는 본 명세서에서 단층 및 다층 구조, 예를 들면, 다양하게는 리포좀, 미셀, 미세 기포 및 미세 기구로 언급되는 구조를 지칭함)는 종종 치료 또는 진단학적 활성제를 전달하는 수단으로서 사용된다. 초음파 영상화 조영제 분야에 있어서, 체온에서 기체 상태인 소포 함유 물질 (본 명세서에서 소포형 물질로서 언급됨)은 공명 발생 조영제로서, 특히 혈관계 중으로 투여하는데 사용할 수 있다.

소포형 조영제는 통상적으로는 수성 담체 매질에 비해 저농도의 소포를 함유하는 수분산액의 형태로 투여될 것이다. 따라서, 그러한 소포형 조영제의 저장 및 전달은 소포를 무수 형태로 저장할 수 있는 경우, 상당히 더 효과적으로 이루어진다.

소포형 조성물은 동결 건조시킬 수 있고, 이러한 경우, 부형제는 통상적으로는 조성물 중에 포함되어 건조 기술에 도움이 된다. 그러한 부형제는 통상적으로는 두 가지 기능 중 하나로 제공된다. 벌크제를 가하여 총 고체 함량을 증가시켜 기계적으로 더욱 단단한 생성물을 얻는다. 안정화제 (달리, 내냉동제 또는 동결보호제로서 언급됨)를 가하여 탈수 반응 동안에 일어나는 유리질 상태의 형성을 돕고, 무수 생성물에 있어서 물리적 강도를 제공한다. 이러한 방법에 사용되는 안정화제의 예는 만니톨 및 글루코스를 포함한다.

동결-건조된 소포형 초음파 조영제는 즉석 사용가능한 수분산액에 비해 부피의 감소에 기인한 전달 및 저장상의 이점을 제공하는 한편, 또한 동결-건조된 생성물이 전달되고 저장되는 동안 통상적으로 접하게 되는 주위 온도의 범위에서 열에 안정하지 않기 때문에 결과적으로 제2 제조 전까지, 온도가 주위 온도 미만 (예를 들면, 5 내지 10 ℃)으로 유지되는 환경에서 유지되어야 한다는 문제를 야기한다.

본 발명자들은 동결-건조에 사용되는 안정화제를 적절하게 선택함으로써 주위 온도 이상에서, 실제로는 전달 및 저장되는 동안 통상적으로 접하게 되는 모든 온도에서 열에 안정한 동결-건조된 소포형 초음파 조영제를 제조할 수 있음을 의외로 발견하였다.

열에 안정한 동결-건조된 생성물은 그의 환경의 온도를 제어할 필요없이 저장되고 전달될 수 있고, 특히 그 사용자가 특수한 저장 설비를 가질 필요없이 현장에서의 투여를 위해 투여가능한 분산액으로 병원 및 의사에게 공급할 수 있다.

따라서, 본 발명은 일면으로, 동결-건조용 안정화제를 함유하고 20 ℃를 넘는 온도, 바람직하게는 22 ℃ 이상, 특히 22 ℃, 25 ℃ 이상, 더욱 바람직하게는 30 ℃ 이상, 특히 바람직하는 40 ℃ 이상, 예를 들면, 65 ℃ 이하 또는 그 이상의 온도에서 열에 안정한 동결-건조된 소포 함유 초음파 조영제를 제공한다. 다른 일면으로, 본 발명은 동결-건조용 안정화제를 함유하고 20 ℃를 넘는 온도, 바람직하게는 22 ℃, 특히 바람직하게는 25 ℃ 이상, 더욱 바람직하게는 30 ℃ 이상, 특히 바람직하게는 40 ℃ 이상, 예를 들면, 65 ℃ 이하 또는 그 이상의 유리 전이 온도 (Tg)를 갖는 동결-건조된 소포 함유 초음파 조영제를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일면으로, 소포형 초음파 조영제 및 동결-건조용 안정화제 또는 안정화제 혼합물을 포함하는 수분산액을 동결-건조시키는 단계를 포함하는, 열에 안정한 동결-건조된 소포 함유 초음파 조영제의 제조 방법에 있어서, 상기 안정화제 또는 안정화제 혼합물이 20 ℃ 이상 (바람직하게는 22 ℃ 이상, 특히 25 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 30 ℃ 이상, 특히 바람직하게는 40 ℃ 이상, 예를 들면, 65 ℃ 이하 또는 그 이상)의 Tg 값 및 -37 ℃ 이상 (바람직하게는 -36 ℃를 넘는 온도, 특히 바람직하게는 -35 ℃를 넘는 온도, 예를 들면, -10 내지 -37 ℃)의 Tg' 값을 가짐을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 일면으로, 동결-건조용 안정화제 또는 안정화제 혼합물이 20 ℃ 이상 (바람직하게는 22 ℃ 이상, 특히 25 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 30 ℃ 이상, 특히 바람직하게는 40 ℃ 이상, 예를 들면, 65 ℃ 이하 또는 그 이상)의 Tg 값 및 -37 ℃ 이상 (바람직하게는 -36 ℃를 넘는 온도, 특히 바람직하게는 -35 ℃를 넘는 온도, 예를 들면, -10 내지 -37 ℃)의 Tg' 값을 가짐을 특징으로 하는, 수성 담체 매질, 동결-건조용 안정화제 또는 안정화제 혼합물 및 공명 발생 소포형 초음파 조영제를 포함하는 초음파 조영제를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일면으로, 진단용 초음파 영상화를 포함하는 진단에 사용하기 위한 초음파 조영제를 함유하는 소포의 제조를 위한, 20 ℃ 이상 (바람직하게는 22 ℃ 이상, 특히 25 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 30 ℃ 이상, 특히 바람직하게는 40 ℃ 이상, 예를 들면, 65 ℃ 이하 또는 그이상)의 Tg 값 및 -37 ℃ 이상 (바람직하게는 -36 ℃를 넘는 온도, 특히 바람직하게는 -35 ℃를 넘는 온도, 예를 들면, -10 내지 -37 ℃)의 Tg' 값을 갖는 동결-건조용 안정화제 또는 안정화제 혼합물의 용도를 제공한다.

본 발명은 또 다른 일면으로, 소포형 초음파 조영제가 동결-건조된 형태이고, 동결-건조용 안정화제를 함유하고, 20 ℃ 이상 (바람직하게는 22 ℃ 이상, 등등)의 유리 전이 온도 (Tg)를 가지며, 저장 및 전달이 냉각 없이 이루어짐을 특징으로 하는, 상기 조영제의 저장 또는 전달 방법을 제공한다.

본 발명은 또 다른 일면으로, 본 발명에 따른 동결-건조된 조영제를 생리적으로 허용되는 수분산 매질 중에 분산시키는 것을 포함하는, 초음파 조영제를 함유하는 소포의 제조 방법을 제공한다.

어떤 물질에 대해서도, Tg는 무수 물질의 유리 전이 온도인 반면, Tg'는 최대로 동결-농축된 물질의 순수한 수용액의 유리 전이 온도이다.

개선된 열 안정성 외에도, 본 발명에 따른 동결-건조된 소포형 조영제는 초음파 조영제 중에 통상적으로 사용되는 할로카본 기체 및 기체 전구체를 보유하는 소포의 능력도 또한 의외로 향상시킨다.

본 발명에 있어서, 초음파 조영제는 임의의 생리적으로 허용되는 공명 발생 소포형 조영제일 수 있으나, 바람직하게는 소포는 기체 또는 기체 전구체 (예를 들면, 정상 사람 체온 (37 ℃)에서 실질적으로 기체 (증기 포함) 형태인 화합물 또는 화합물의 혼합물)를 함유할 것이다. 임의의 생체적합성인 기체, 기체 전구체 또는 혼합물을 사용할 수 있다. 따라서, 기체는 예를 들면, 공기; 질소; 산소; 이산화탄소; 수소; 산화질소; 헬륨, 아르곤, 크세논 또는 크립톤과 같은 불활성 기체; 설퍼 헥사플루오라이드, 디설퍼 데카플루오라이드 또는 트리플루오로메틸설퍼 펜타플루오라이드와 같은 설퍼 플루오라이드; 셀레늄 헥사플루오라이드; 테트라메틸실란과 같은 임의로 할로겐화된 실란; 저분자량 탄화수소 (예를 들면, 탄소 원자 7개 이하를 함유하는), 예를 들면, 메탄, 에탄, 프로판, 부탄 또는 펜탄과 같은 알칸, 시클로부탄 또는 시클로펜탄과 같은 시클로알칸, 프로펜 또는 부텐과 같은 알켄, 또는 아세틸렌과 같은 알킨; 에테르; 케톤; 에스테르; 할로겐화된 저분자량 탄화수소 (예를 들면, 탄소 원자 7개 이하를 함유하는); 또는 상기 화합물 중 임의의 혼합물을 포함한다. 할로겐화된 기체 중 적어도 일부의 할로겐 원자는 유리하게는 불소 원자이다. 따라서, 생체적합성인 할로겐화된 탄화수소 기체는 예를 들면, 브로모클로로디플루오로메탄, 클로로디플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 브로모트리플루오로메탄, 클로로트리플루오로메탄, 클로로펜타플루오로에탄, 디클로로테트라플루오로에탄 및 퍼플루오로탄소, 예를 들면, 퍼플루오로메탄, 퍼플루오로에탄, 퍼플루오로프로판, 퍼플루오로부탄 (예를 들면, 퍼플루오로-n-부탄, 임의로는 퍼플루오로-이소-부탄과 같은 다른 이성질체와의 혼합물), 퍼플루오로펜탄, 퍼플루오로헥산 및 퍼플루오로헵탄과 같은 퍼플루오로알칸; 퍼플루오로프로펜, 퍼플루오로부텐 (예를 들면, 퍼플루오로부트-2-엔) 및 퍼플루오로부타디엔과 같은 퍼플루오로알켄; 퍼플루오로부트-2-인과 같은 퍼플루오로알킨; 및 퍼플루오로시클로부탄, 퍼플루오로메틸시클로부탄, 퍼플루오로디메틸시클로부탄, 퍼플루오로트리메틸시클로부탄, 퍼플루오로시클로펜탄, 퍼플루오로메틸시클로펜탄, 퍼플루오로디메틸시클로펜탄, 퍼플루오로시클로헥산, 퍼플루오로메틸시클로헥산 및 퍼플루오로시클로헵탄과 같은 퍼플루오로시클로알칸으로부터 선택될 수 있다. 다른 할로겐화된 기체는 플루오르화, 예를 들면, 퍼플루오로아세톤과 같은 퍼플루오르화 케톤 및 플루오르화, 예를 들면, 퍼플루오로디에틸 에테르와 같은 퍼플루오르화 에테르를 포함한다.

특히 바람직하게는, 소포는 퍼플루오로알칸, 특히 퍼플루오로부탄, 퍼플루오로펜탄 또는 퍼플루오로헥산, 특히 n-퍼플루오로부탄을 함유할 것이다.

소포에 있어서, 막은 임의의 생리적으로 허용되는 막 형성 물질, 특히 인지질로 형성될 수 있고, 교차 결합되거나 그렇지 않을 수 있다. 하전되거나 하전되지 않은 인지질의 혼합물로 형성된 막이 특히 바람직하고, 소포는 순표면 전하, 바람직하게는 음전하를 전달해야 하는 것이 특히 바람직하다. 그러한 인지질 소포는 특히 바람직한 혈액 체류 시간을 갖는다.

소포는 혈액 체류 연장제를 예를 들면, 그러한 작용제를 막 또는 막 내에 정착하게 될 친지질성 기에 결합시킴으로써 추가로 제공할 수 있다. 그러한 혈액 체류 연장제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 옥시드는 망내계에 의해 혈관계로부터 소포의 흡수를 지연시키는 옵소닌 작용 억제제로서 작용할 수 있다.

본 발명의 조영제 중 인지질 물질은 바람직하게는 75 % 이상, 바람직하게 실질적으로는 전체가 제조 및(또는) 사용의 조건하에 순전체 전하 (이 전하는 양성, 또는 바람직하게는 음성임)를 개별적으로 보유하는 분자로 구성된다. 대표적인 양전하 인지질은 디팔미토일포스파티드산 또는 디스테아로일포스파티드산과 같은 포스파티드산과 히드록시에틸렌디아민과 같은 아미노알코올의 에스테르를 포함한다. 음전하 인지질의 예는 천연 (예를 들면, 대두 또는 난황에서 유래된), 반합성 (예를 들면, 부분적 또는 전적으로 수소화된) 및 합성 포스파티딜세린, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜이노시톨, 포스파티드산 및 카르디올리핀을 포함한다. 그러한 인지질의 지방 아실기는 전형적으로는 각각 약 14 내지 22개의 탄소 원자를, 예를 들면, 팔미토일 및 스테아로일기로서 함유할 것이다. 그러한 하전된 인지질의 리소 (lyso) 형태도 또한 본 발명에 따라 유용한데, 용어 "리소"는 단지 1 종의 지방 아실기를 함유하는 인지질을 의미하고, 이는 바람직하게는 글리세릴 잔기의 1-위치 탄소 원자에 에스테르 결합된다. 그러한 하전된 인지질의 리소 형태는 유리하게는 2 종의 지방 아실기를 함유하는 하전된 인지질과의 혼합물로 사용할 수 있다.

포스파티딜세린은 본 발명에 따른 조영제에 사용하기에 특히 바람직한 인지질이고, 바람직하게는 실질적인 부분, 예를 들면, 그의 초기 인지질 함량의 80 % 이상, 예를 들면, 85 내지 92 %를 구성하지만, 이는 가열 멸균과 같은 후속 처리에서 어느 정도, 예를 들면, 약 70 %까지 감소될 수 있다. 본 발명자들은 이론에 의해 제한되는 것을 바라지는 않지만, 인접한 세린 잔기의 카르복실과 아미노기 사이의 이온성 브리지 형성은 그러한 계의 안정성에 기여할 수 있다. 바람직한 포스파티딜세린은 포화된 (예를 들면, 수소화되거나 합성의) 천연 포스파티딜세린 및 합성 또는 반합성 디알카노일포스파티딜세린, 예를 들면, 디스테아로일포스파티딜세린, 디팔미토일포스파티딜세린 및 디아라키도일포스파티딜세린을 포함한다.

그러한 포스파티딜세린-기재 조영제를 사용하는 중요한 이점은 신체가 노화된 적혈구 및 혈소판을 그들의 표면에서 고농도의 포스파티딜세린에 의해 인식하고, 따라서 노화된 적혈구를 제거하는 것과 유사한 방법으로 혈류로부터 그러한 조영제를 제거할 수 있다는 것이다. 더우기, 그러한 조영제의 표면이 신체에 의해 내생적인 것으로 등록될 수 있기 때문에, 그들은 혈액 동력 효과 및 약간의 리포좀 제제의 투여를 수반할 수 있는 다른 과민증 반응과 같은 위해한 전신성 부작용의 유발을 피할 수 있다. (WO-A-95/12386호 참조).

본 발명에 따른 용도로 적절한 리포좀형 초음파 조영제는 문헌에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다 (WO-A-92/22247호, WO-A-94/28780호, WO-A-93/05819호, WO-A-95/16467호, PCT/GB96/01361호 및 Unger et al. Invest. Radiol. 29 (Suppl. 2): S134-S136 (1994) 참조).

본 발명에 따라 사용되는 안정화제는 20 ℃를 넘는 온도, 예를 들면, 25 내지 70 ℃ 범위의 유리 전이 온도 (Tg)를 가지며, -37 ℃ 이상의 Tg' 값을 갖는 생리적으로 허용되는 동결-건조용 안정화제 (또는 혼합물)일 수 있다. 적절한 안정화제의 예는 수크로스, 말토스·H₂O, 트레할로스, 라피노스 및 스타키오스를 포함한다. 특히 적절한 예는 수크로스이고, 임의로는 소량 (예를 들면, 20 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하)의 다른 안정화제와의 혼합물일 수 있다.

통상적으로, 안정화제는 동결-건조된 조성물 중에 소포형 조영제의 농도 보다 상당히 높은 농도, 예를 들면, 10:1 중량비 이상, 보다 통상적으로는 20:1 중량비 이상, 최적으로는 200:1 중량비 정도로 높게, 예를 들면 5000:1 중량비 이하 또는 그 이상으로 존재할 것이다. 따라서, 무수 생성물의 유리 전이 온도 (Tg)에 미치는 영향은 소포형 성분과 비교적 독립적이며, 유력한 안정화제는 통상의 기술에 의해 쉽게 스크리닝할 수 있고, 그들이 수성 담체 매질 중에 존재하는 다른 부형제와 함께 건조되어 20 ℃를 넘는 유리 전이 온도 (Tg)를 갖는 생성물을 형성하는 지를 결정할 수 있다.

편리하게는, 안정화제는 동결-건조 단계를 거친 조성물 중에 1 내지 50 중량%, 바람직하게는 5 내지 30 중량%, 보다 특히 약 10 내지 20 중량%로 존재할 것이다. 안정화제의 농도는 목적하는 경우, 등장 농도를 상당히 넘을 수 있는데, 이는 동결-건조 단계 후 재구성할 때 생성물을 희석할 수 있기 때문이다. 소포 성분은 0.01 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 3 중량%, 특히 바람직하게는 약 0.5 내지 1.5 중량%로 존재하는 것이 바람직할 것이다 (그의 중량을 단지 막 형성 물질의 중량인 것으로 고려함). 동결-건조된 생성물을 투여가능한 분산액으로 전환시키는데 사용되는 재구성 용액에 대한 안정화제의 양은 영상화될 신체 부위 또는 기관 및 선택된 투여 방식에 따라 선택될 것이다. 예로서, 동결-건조 단계를 거친 조성물 중에 2 배 이상일 수 있다.

초음파 심장촬영술과 같은 초음파 사용에 있어서, 폐를 자유롭게 통과하고 약 0.1 내지 15 MHz의 바람직한 영상 주파수를 갖는 공명을 얻기 위해, 0.1 내지 10 ㎛, 예를 들면, 1 내지 7 ㎛의 평균 크기를 갖는 소포를 사용하는 것이 편리할 수 있다. 소포는 초음파 심장촬영술에 바람직한 범위내에서 매우 좁은 크기 분포로 제조될 수 있고, 이로써 그의 공명 발생 뿐만 아니라 생체내 안정성도 크게 증진되며, 혈압 측정, 혈류 추적 및 초음파 단층촬영법과 같은 사용에 있어 특히 유리한 조영제가 가능해진다. 따라서, 90 %를 넘는 (예를 들면, 95 % 이상, 바람직하게는 98 % 이상) 소포가 1 내지 7 ㎛ 범위의 직경을 갖고, 5 % 미만 (예를 들면, 3 %를 넘지 않고, 바람직하게는 2 %를 넘지 않음)의 소포가 7 ㎛를 넘는 직경을 갖는 생성물을 쉽게 제조할 수 있다.

초음파 분야에 있어서, 조영제는 예를 들면, 투여될 막 형성 물질 (예를 들면, 인지질)의 양이 0.1 내지 10 ㎍/체중 ㎏, 보다 바람직하게는 1 내지 5 ㎍/㎏의 범위로 주사되도록 투여할 수 있다. 그러한 낮은 수준으로 막 형성 물질을 사용하는 것이 가능한 독성 부작용을 최소화하는데 실질적으로 유리함을 알게될 것이다.

본 발명의 무수 생성물을 사용하여 제조된 즉석 사용가능한 조성물 중 전체 막 형성 물질 농도는 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.05 내지 2.0 중량%, 특히 약 0.5 중량%의 범위가 바람직할 것이다.

동결-건조 처리된 조성물은 유리하게는 1 종 이상의 벌크제, 예를 들면, 폴리올 (예를 들면, 글리세롤 또는 프로필렌 글리콜과 같은 C₃ 폴리올), 덱스트란과 같은 다당류 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리글리콜 또는 그의 혼합물을 함유한다. 대표적으로는, 벌크제는 안정화제의 농도와 유사하거나 약간 낮은 농도, 예를 들면, 3 내지 10 중량%, 바람직하게는 약 5 중량%로 사용할 수 있다. 벌크제는 단지 이 상태에서 그들이 생성물 안정성 상에 중립 효과를 가지는 것과 마찬가지로 동결-건조 처리 동안 결정화될 수 있어야 한다. 따라서, 그들은 동결-건조 단계 동안 무정형 상태로 존재해야 하는 안정화제와 구별된다.

다른 부형제는 목적하는 경우, 무수 상태로 조성물 중에 존재할 수 있거나, 투여용 제제에 가해질 수 있다. 그러한 부형제는 예를 들면, pH 조절제, 삼투 조절제, 점도 증진제, 유화제 등을 포함할 수 있고, 통상적인 양으로 사용할 수 있다.

무수 생성물은 통상적으로는, 분말 형태일 것이고, 물, 생리 식염수 (주사용 최종 생성물이 저장성이 되지 않도록 유리하게 평형시킬 수 있음)와 같은 수용액, 염 (예를 들면, 혈장 양이온과 생리적으로 허용되는 카운터 이온과의 염), 설탕, 설탕 알코올, 글리콜 및 다른 비이온성 폴리올 물질 (예를 들면, 글루코스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 등)과 같은 1 종 이상의 강직성 조절 물질의 용액 중에 쉽게 재구성될 수 있다. 재구성은 통상적으로는 예를 들면, 온화하게 손으로 진탕하는 것과 같이 단지 최소의 교반을 필요로 한다. 그렇게 생성된 소포의 크기는 일관되게 재현가능하고, 실제로는 가해진 교반 에너지의 양과 관계가 없고, 초기 소포 분산액 중에 형성된 소포의 크기에 의해 결정되고, 의외로 이 크기 변수는 동결 건조되고 재구성된 생성물 중에 실질적으로 유지된다. 그리하여, 초기 분산액 중의 소포의 크기는 교반의 방법, 속도 및 기간과 같은 처리 변수에 의해 쉽게 제어될 수 있으므로 최종 소포 크기는 쉽게 제어될 수 있다.

재구성 액체의 부피 및 농도는 바람직하게는 평형 상태가 되어, 생성된 즉석 사용 제제를 실질적으로 등장성이 되도록 할 수 있다. 그리하여, 선택된 재구성 액체의 부피 및 농도는 동결-건조된 생성물 중에 존재하는 안정화제 (및 다른 벌크제)의 유형 및 양에 의존할 것이다.

본 발명에 따른 동결 건조된 생성물은 주위 조건에서 수 개월 동안 안정하게 저장됨이 밝혀졌다. 물 (또는 상기 논의된 다른 재구성 액체) 중에 재구성하여 생성된 소포 분산액은 상당한 시간, 예를 들면, 적어도 12 시간까지 안정할 수 있고, 무수 생성물이 주사 전에 재구성되는 경우에 따라 상당히 유동적이다.

재구성 액체가 동결 건조에 있어서의 안정화제로서 사용되는 것과 동일한 화합물을 강직성 조절제로서 함유하는 경우, 동결-건조에 필요한 조성물 중에 존재하는 안정화제의 양은 동결-건조 동안 최적 안정화를 나타내는데 충분하기만 하면 된다. 따라서, 최종 생성물의 등장성은 재구성 액체의 적절한 양 및 농도를 선택함으로써 얻을 수 있다. 그리하여, 동결-건조 단계 동안 안정화제(들)로서 사용된 화합물의 농도 및 유형 및 재구성 액체 중의 화합물(들)의 농도 및 유형은 상당히 다를 수 있지만, 안정한 재구성된 생성물을 얻을 것이다.

본 발명에 따른 동결-건조를 통상의 방법으로 수행할 수 있지만, 본 발명에 따른 안정화제를 사용하면 보다 짧은 동결-건조 주기를 사용할 수 있다는 추가의 이점이 있는데, 이는 건조 단계 전의 조성물이 통상적으로는 글루코스 또는 만니톨과 같은 내냉동제를 함유하는 동등한 조성물 보다 높은 유리 온도 (Tg')를 갖기 때문이다.

본 발명은 소포형 초음파 조영제에 관하여 상기 기재하였다. 그러나, 또한 다른 진단용 영상 양식 (예를 들면, MRI, X-선, SPECT, PET, 자기촬영 영상화 등)을 위한 소포형 조영제에도 또한 사용할 수 있다.

하기 비제한적인 실시예를 들어 본 발명을 추가로 기재하고자 한다.

<실시예 1>

동결 건조된 생성물의 제조

수소화된 난 포스파티딜세린 500.4 ㎎을 프로필렌 글리콜 및 글리세롤 (3:10 중량비)의 혼합물 5.4 중량%를 함유하는 물 100 ㎖에 가하였다. 이 혼합물을 진탕하고, 80 ℃에서 5분 동안 가열하고, 실온으로 냉각시키고, 다시 진탕하고 사용하기 전에 밤새 방치하였다.

생성된 용액 50 ㎖를 원추형 목이 달린 둥근 바닥 플라스크로 옮겼다. 플라스크에 25 ℃로 유지되는 수조에 연결된 온도 제어 입구 및 출구를 갖는 유리 덮개를 씌웠다. 로터 고정자 혼합축을 용액 중으로 도입하고, 기체 누출이 일어나지 않도록 목 벽 및 혼합축 사이의 공간을 기체 함량 조절 및 압력 제어를 위한 기체 입구/출구 연결부에 꼭 맞도록 특별히 고안된 금속 마개로 밀폐하였다. 기체 출구는 진공 펌프로 연결하고, 용액은 1 분 동안 기체를 제거하였다. 이어서, 퍼플루오로-n-부탄 기체 분위기를 기체 입구를 통해 가하였다.

용액을 23000 rpm에서 10 분 동안 균질화하고, 로터 고정자 혼합축은 개방부가 액체 표면의 약간 위에 오도록 유지시켰다. 백색의 크림형 분산액을 얻고, 이를 밀폐가능한 용기로 옮기고 퍼플루오로-n-부탄으로 플러싱하였다. 이어서, 분산액을 분별 깔때기로 옮기고, 12000 rpm에서 30 분 동안 원심분리하여 상부에 크림과 같은 기포층 및 탁한 하층액을 얻었다. 하층액을 제거하고 물로 대체하였다. 이어서, 원심분리를 2 회 반복하였으나, 이번에는 12000 rpm에서 15 분 동안 수행하였다. 마지막 원심분리 후, 상층액을 10 중량% 수크로스로 대체하였다. 생성된 분산액의 일부 2 ㎖를 동결 건조용으로 특별히 고안된 10 ㎖ 용량의 평평한 바닥 바이알로 분주하고, 바이알을 -47 ℃로 냉각시키고, 약 48 시간 동안 동결 건조시켜 백색의 보풀이 있는 고체 물질을 얻었다. 바이알을 진공 챔버로 옮기고, 공기를 진공 펌프로 제거하고 퍼플루오로-n-부탄 기체로 대체하였다. 사용하기 전에 물을 가하고, 바이알을 온화하게 수 초 동안 손으로 진탕하여 초음파 조영제로서 적절한 미세 기포 분산액을 얻었다.

특성 분석

미세 기포의 크기 분포 및 부피 농도는 1 내지 30 ㎛ 범위를 측정하는 50 ㎛ 구경에 맞는 쿨터 (Coulter) 계수기 마크 (Mark) II 장치를 사용하여 측정하였다. 시료 20 ㎕를 실온에서 공기로 포화된 생리 식염수 200 ㎖ 중에 희석하고, 측정하기 전에 3 분 동안 평형시켰다.

초음파 특성 분석은 문헌 [de Jong, N. and Hoff, Ultrasonics, 31:175-181 (1993)]으로부터 약간 수정된 실험 장비 상에서 수행하였다. 이 기구로 2 내지 8 MHz의 주파수 범위에서 묽은 조영제 현탁액의 초음파 감쇠 효능을 측정하였다. 감쇠를 측정하는 동안, 압력 안정성 시험은 시료를 120 mmHg의 과압에 90 초 동안 노출시켜 수행하였다. 전형적으로는, 시료 2 내지 3 ㎕를 이소톤 (Isoton) II 55 ㎖ 중에 희석시키고, 희석된 시료 현탁액을 분석하기 전에 3 분 동안 교반하였다. 초기 반응 변수로서 3.5 MHz에서의 감쇠를, 과압의 방출 후 3.5 MHz에서의 회복 감쇠값과 함께 사용하였다.

수 농도[10⁶/㎖]	부피 농도[%]	부피평균 직경[㎛]	3.5 MHz에서의 감쇠[dB/㎝]	과압 후잔존율[%]	최대 감쇠 에서의 주파수[MHz]
10518	6.51	3.16	150.4	96	4.3

<실시예 2>

실시예 1에 따라 제조된 시료 5 종의 기체 함유물을 공기, 퍼플루오로부탄, 설퍼 헥사플루오라이드, 트리플루오로메틸설퍼 펜타플루오라이드 및 테트라메틸실란으로 하기 방법에 따라 각각 대체하였다.

실시예 1로부터의 동결 건조된 생성물을 함유하는 시료 2 종을 기체 입구 및 기체 출구가 장착된 건조기 내에 위치시켰다. 건조기를 시료의 제어 배출 및 선별된 기체의 주입을 가능하게 하는 뷔히 (Buechi) 168 진공/증류기 제어자에 연결하였다. 시료를 약 10 밀리바아 (mbar)에서 5 분 동안 배출시킨 후, 선별된 기체를 주입하여 압력을 대기압으로 증가시킨 다음, 바이알에 뚜껑을 조심스럽게 덮었다. 이 방법을 각각의 선별된 기체에 대해 시료의 쌍을 사용하여 반복하였다.

증류수 2 ㎖를 각각의 바이알에 가하고, 사용하기 전에 바이알을 온화하게 손으로 진탕하였다. 생성된 미세 기포 분산액을 실시예 1에 기재된 크기 분포 측정에 관해 특성 분석하였다. 결과를 표 2에 요약하였다.

기체	수 농도[10⁶/㎖]	수 평균 직경[㎛]	부피 농도[%]	부피 평균 직경[㎛]
퍼플루오로부탄	9756	1.8	4.9	5.8
트리플루오로메틸설퍼 펜타플루오라이드	10243	1.9	5.9	3.5
설퍼 헥사플루오라이드	9927	1.9	5.7	3.2
테트라메틸실란	9947	1.9	6.1	3.7
공기	9909	1.9	6.4	4.0

상기 결과로부터 알 수 있듯이, 기체 교환에 따른 크기 분포에는 유의적인 변화가 없었고, 이는 미리 형성된 미세 기포 크기가 동결 건조 및 재구성 동안 실질적으로 보존됨을 나타낸다.

생체내 결과

5 종의 기체로 각각 제조된 하나의 배치를 10 MHz에서 도플러 (Doppler) 상승 특성에 대해 생체내 평가하였다. 분산액을 친칠라 토끼에 귀 정맥을 통해 주사하고, 초음파 탐침이 경동맥 상에 직접 위치되는 도플러 기술을 사용하여 측정하였다. 시그널 강도 및 지속 기간을 기록하고, 도플러 곡선의 적분치를 계산하였다. 얻어진 결과 (하기 표 3 참조)는 퍼플루오로부탄을 함유하는 미세 기포가 가장 강한 도플러 강도 상승을 나타냄을 가리킨다. 설퍼 헥사플루오라이드, 트리플루오로메틸설퍼 펜타플루오라이드 또는 테트라메틸실란을 함유하는 미세 기포는 퍼플루오로부탄을 함유하는 미세 기포에 비해 도플러 상승제로서의 효능이 아주 약간 낮았고, 이는 퍼플루오로부탄에 대해 60 내지 80 % 범위의 적분치를 나타낸다.

기체	동맥의 도플러 상승 적분치 (NDU.s)
퍼플루오로부탄*	10361
트리플루오로메틸설퍼 펜타플루오라이드	8006
테트라메틸실란	6370
설퍼 헥사플루오라이드	6297
공기	1024
* 2회 주사한 평균

<실시예 3>

퍼플루오로부탄 분위기 하에 동결 건조된 물질을 함유하는 바이알을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 사용하기 직전에 물을 바이알에 가하여 미세 기포 현탁액을 얻었다.

이소톤 II 유체 200 ㎖를 실온에서 공기에 수 일 동안 노출시켜 공기로 완전히 포화된 용액을 얻었다. 유체 또 다른 200 ㎖를 진공 플라스크 내에서 60 ℃에서 1 시간 동안 기체를 제거하고, 진공을 유지하면서 실온으로 냉각시켰다. 공기는 사용 직전에 플라스크로 유입되었다.

미세 기포 현탁액 일부 10 ㎕를 각각의 유체에 가하고, 생성된 혼합물은 크기 특성 분석 (쿨터 멀티싸이저 (Multisizer) 마크 II)을 하기 전에 5 분 동안 배양하였다.

기체가 제거된 환경에서, 유체로부터 미세 기포 중으로 기체의 확산이 예기되지 않는 경우, 평균 미세 기포 직경은 1.77 ㎛이었고, 미세 기포의 0.25 %는 5 ㎛를 넘었다. 공기로 포화된 유체에 있어서, 상응하는 수치는 2.43 ㎛ 및 0.67 %이었고; 추가의 5 분 후에 행해진 반복 측정에서 미세 기포 크기가 안정한 수치에 도달했음이 나타났다.

이러한 발견은 미세 기포가 동맥혈과 유사한 공기로 포화된 유체에 노출되는 경우, 그 평균 직경이 37 %까지만 증가하고, 극소수의 미세 기포가 모세 혈관을 막을 수 있는 크기에 도달함을 나타낸다. 이것은 WO-A-95/03835호의 실시예 II에 보고된 유사한 환경 (즉, 용해된 공기를 함유하는 물 중에 고도로 희석된 미세 기포 분산액) 중의 공기/퍼플루오로헥산-함유 미세 기포의 크기가 두배가 되는 것과 대조될 수 있다.

<실시예 4>

비교예

동결 건조 전에 상층액을 (a) 65 ㎎/㎖ 수크로스 및 65 ㎎/㎖ 만니톨, (b) 100 ㎎/㎖ 만니톨 및 50 ㎎/㎖ 글루코스, (c) 20 ㎎/㎖ 수크로스, 76 ㎎/㎖ 만니톨 및 38 ㎎/㎖ 글루코스 및 (d) 90 ㎎/㎖ 수크로스로 대체하여 실시예 1을 반복하였다.

습윤 및 무수 조성물의 Tg' 및 Tg 값을 결정하고 하기 표 4에 기재하였다.

제제	Tg'	Tg
(a)(b)(c)(d)	-38 ℃-43 ℃-42 ℃-32 ℃	19 ℃14 ℃12 ℃66 ℃

제제 (a) 내지 (c)는 제제 (d) 보다 긴 동결-건조 주기를 필요로 하고, 제제 (d)와 달리 그의 완전성을 유지하도록 주위 온도 보다 낮은 온도에 저장하여야 한다.

<실시예 5>

기체 보유

(a) 10 중량% 수크로스, (b) 5 중량% PEG 3000, (c) 2 중량% 만니톨 및 1 중량% 글루코스, 및 (d) 5 중량% 트레할로스를 사용하여 동결 건조 전에 상층액을 대체한 것을 제외하고는 실시예 1과 유사한 방법으로 제조된 물질을 N₂로 대량플러싱하고, 반복된 진공 주기에 노출시키고, 압착하여 생성물의 퍼플루오로부탄 보유 능력을 시험하였다. 스트레스 처리 후, 잔류 퍼플루오로부탄 함량을 결정하였다. 결과를 하기 표 5에 기재하였다.

내냉동제	PFB (㎎)/생성물 (g)
수크로스PEG 3000만니톨 및 글루코스트레할로스	0.69 ± 0.10≤ 0.050.29 ± 0.101.24 ± 0.38

전술한 실시예에 있어서, 보다 높은 비율 (예를 들면, 10 % 보다는 20 %)의 안정화제를 사용할 수 있고, 물 이외의 재구성 유체, 예를 들면, 상기 언급된 생리 식염수 또는 폴리올 용액을 사용할 수 있다. 이와 유사하게, 동결 건조되는 부분이 보다 커질 수 있고 (예를 들면, 2 ㎖ 보다는 4 ㎖), 동결 건조용 바이알이 보다 커질 수 있으며 (예를 들면, 20 ㎖), 동결 건조가 보다 길어질 수 있다 (예를 들면, 60 시간).

Claims

수크로스, 말토스·H₂O, 트레할로스, 라피노스 및 스타키오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 동결-건조용 안정화제를 함유하며, (i) 상기 안정화제가 20 ℃가 넘는 Tg 값 (유리 전이 온도) 및 -37 ℃ 이상의 Tg' 값 (상기 안정화제의 최대로 동결-농축된 순수한 수용액의 유리 전이 온도)을 갖고, (ii) 상기 안정화제를 인지질 막을 포함하는 소포에 대해 10:1 이상의 중량비로 함유하고, (iii) 20 ℃가 넘는 온도에서 열에 안정한, 동결-건조된 소포 함유 초음파 조영제.
제1항에 있어서, 안정화제가 수크로스를 포함하는 조영제.
제1항에 있어서, 안정화제 대 소포의 중량비가 20:1 이상인 조영제.
제1항에 있어서, 상기 조영제 중의 소포가 브로모클로로디플루오로메탄, 클로로디플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 브로모트리플루오로메탄, 클로로트리플루오로메탄, 클로로펜타플루오로에탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 퍼플루오로탄소, 플루오르화 케톤 및 플루오르화 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 할로카본 기체를 함유하는 조영제.
제4항에 있어서, 상기 조영제 중의 소포가 퍼플루오로알칸을 함유하는 조영제.
제4항에 있어서, 상기 조영제 중의 소포가 퍼플루오로부탄 및 퍼플루오로펜탄으로부터 선택된 퍼플루오로알칸을 함유하는 조영제.
인지질 막을 포함하는 소포형의 초음파 조영제, 및 수크로스, 말토스·H₂O, 트레할로스, 라피노스 및 스타키오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 동결-건조용 안정화제를 포함하는 수분산액을 동결-건조시키는 단계를 포함하며, 상기 안정화제가 20 ℃ 이상의 Tg 값 및 -37 ℃ 이상의 Tg' 값 (상기 안정화제의 최대로 동결-농축된 순수한 수용액의 유리 전이 온도)을 갖고, 상기 안정화제가 상기 소포형 초음파 조영제에 대해 10:1 이상의 중량비로 상기 분산액 중에 존재함을 특징으로 하는, 열에 안정한 동결-건조된 소포 함유 초음파 조영제의 제조 방법.
제7항에 있어서, 수분산액이 1 내지 50 중량%의 안정화제를 함유하는 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 소포형 조영제가 브로모클로로디플루오로메탄, 클로로디플루오로메탄, 디클로로디플루오로메탄, 브로모트리플루오로메탄, 클로로트리플루오로메탄, 클로로펜타플루오로에탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 퍼플루오로탄소, 플루오르화 케톤 및 플루오르화 에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 할로카본 기체를 함유하는 방법.
제9항에 있어서, 소포가 퍼플루오로부탄 및 퍼플루오로펜탄으로부터 선택된 할로카본을 함유하는 방법.
제7항에 있어서, 수분산액이 벌크제를 추가로 함유하는 방법.
제11항에 있어서, 벌크제가 C₃ 폴리올인 방법.
제11항에 있어서, 수분산액이 3 내지 10 중량%의 벌크제를 함유하는 방법.
수성 담체 매질; 수크로스, 말토스·H₂O, 트레할로스, 라피노스 및 스타키오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 동결-건조용 안정화제; 및 인지질 막을 포함하는 소포형의 초음파 조영제를 포함하며, 상기 안정화제가 20 ℃ 이상의 Tg 값 및 -37 ℃ 이상의 Tg' 값을 가지고, 상기 안정화제가 상기 소포형 초음파 조영제에 대해 10:1 이상의 중량비로 존재하는 것을 특징으로 하는, 초음파 조영제 매질.
인지질 막을 포함하는 소포를 함유하는 초음파 조영제가 동결-건조된 형태이고, 수크로스, 말토스·H₂O, 트레할로스, 라피노스 및 스타키오스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 동결-건조용 안정화제를 상기 소포에 대해 10:1 이상의 중량비로 함유하고, 20 ℃ 이상의 유리 전이 온도 (Tg)를 가지며, 저장 및 전달이 냉각없이 일어남을 특징으로 하는, 상기 조영제의 저장 또는 전달 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 청구된 동결-건조된 조영제를 생리적으로 허용되는 수분산액 매질 중에 분산시키는 단계를 포함하는, 소포 함유 초음파 조영제의 제조 방법.