FI113878B - Kasvisoluseinämiä hajottavia entsyymejä sisältäviä puhdistuskoostumuksia ja niiden käyttö puhdistusmenetelmissä - Google Patents

Description

113878

Kasvisoluseinämiä hajottavia entsyymejä sisältäviä puhdis-tuskoostumuksia ja niiden käyttö puhdistusmenetelmissä Tämä keksintö koskee entsyymien käyttöä puhdistus-5 sovelluksissa, erityisesti kotitalouspuhdistussovelluksis-sa. Tähän tarkoitukseen käytetään tunnetusti esimerkiksi proteaaseja, lipaaseja, amylaaseja ja sellulaaseja.

Nämä entsyymit ovat kuitenkin kykenemättömiä poistamaan kaikkia lika- ja tahralajeja, joita esiintyy teks-10 tilleillä, keittiötavaroilla jne. tai niiden sisällä, samoin kuin myös synteettiset pesuaineet ja muut alalla tunnettujen puhdistuskoostumusten komponentit.

Nykyiset pesuaineet eivät poista riittävästi, jos ollenkaan, esimerkiksi kasviperäisiä tahroja. Pesuaineet 15 käsittävät tavallisesti valkaisuainetta, joka vaalentaa tahroja hapetusreaktioiden kautta, muttei poista niitä.

Lisäksi nämä valkaisuaineet saattavat vahingoittaa puhdistettavaa kohdetta, erityisesti kun se on puhdistettava usein.

20 Tahrat määritellään yleensä voimakkaan värisiksi aineiksi, jotka värjäävät kangasta, vaikka niitä olisi läsnä hyvin pieniä määriä kuiduilla, ja jotka eivät poistu '· pelkillä pesuaineilla (Cutler, W. G. ja Kissa, E., Deter- gency, theory and technology, 1987, luku 1, s. 1 - 90).

•f><J 25 Yksi yleinen tahratyyppi on peräisin kasvimateri- : aaleista, jotka sisältävät niihin liittyneitä pigmenttejä.

; Esimerkkejä manitunlaisista tahroista ovat ruoho, kasvik- .·;·. set, kuten pinaatti, punajuuri, porkkana ja tomaatti, he- ♦ delmät, kuten kaikentyyppiset kirsikat ja marjat, persik-. 30 ka, aprikoosi, mango, banaani ja viinirypäleet, samoin ;;; kuin tahrat, joita jää kasvimateriaaliperäisistä juomista, kuten viinistä, oluesta ja hedelmämehuista, ja lisäksi to-*.* maattikastikkeesta, hyytelöistä jne.

Näissä kasvimateriaaleissa olevat pigmentit ovat 35 tavallisesti liittyneinä kuitumateriaaleihin, jotka ovat

• I

• · > 2 113878 kasvisolujen seinämien yksi tärkeä osa, joko kovalenttisin sidoksin tai fysikaalisen sitoutumisen ("tarttumisen") kautta. Näiden pigmenttien poistaminen voi olla hyvin vaikeaa, sillä pesuaineet pystyvät tuskin poistamaan kuitu-5 pigmenttimassaa puhdistettavasta pinnasta. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvisoluseinämät koostuvat monimutkaisesta kuitumateriaaliverkostosta. Solusei-nämien koostumus vaihtelee huomattavasti kasvimateriaalin lähteen mukaan. Koostumuksen voidaan tiivistetysti todeta 10 kuitenkin käsittävän pääasiassa ei-tärkkelyspolysakkaride- ja. Nämä polysakkaridit voivat esiintyä erilaisissa muodoissa: selluloosana, hemiselluloosana ja pektiineinä.

Kasvisolun seinämän koostumus on sekä monimutkainen että vaihteleva. Polysakkaridit esiintyvät pääasiassa pit-15 kien selluloosaketjujen (kasvisolun seinämän tärkein rakennekomponentti) , hemiselluloosan (käsittää esimerkiksi erilaisia β-ksylaaniketjuja) ja pektiinin muodossa. Kasvi-solun seinämän polysakkaridien esiintyminen, jakautuminen ja rakenteelliset piirteet määräytyvät 1. kasvilajin; 2.

20 lajikkeen; 3. kudoksen tyypin; 4. kasvuolosuhteiden; ja 5. iän mukaan (Chesson, Recent Advances in Animal Nutrition, : toim. Haresign on Cole, Butterworth, Lontoo 1987, s. 71 - 89) .

!! Perustavaa laatua olevia eroja on yksisirkkaisten ,25 (esimerkiksi viljakasvit ja heinät) ja kaksisirkkaisten ·*·’ : (esimerkiksi apila, rapsi ja soija) ja kasvin siementen ja ' kasvullisten osien välillä [Carre’ ja Brillouet, Science ' and Food Agric. 37 (1986) 341 - 351] . Yksisirkkaisille on tunnusmerkillistä arabinoksylaanikompleksin läsnäolo tär-’ 30 keimpänä hemiselluloosarunkona. Kaksisirkkaisten tärkein ; hemiselluloosarakenne on ksyloglukaanikompleksi. Lisäksi kaksisirkkaisissa esiintyy suurempia pektiinipitoisuuksia kuin yksisirkkaisissa. Siemenet sisältävät yleensä hyvin runsaasti pektiiniaineksia mutta suhteellisen vähän sellu-: : : 3 5 loosamateriaalia. Soluseinämästä voidaan erottaa seuraavat I » · 3 113878 kolme enemmän tai vähemmän vuorovaikutuksessa olevaa poly-sakkaridirakennetta: 1. Keskikerros muodostaa solun ulkoseinän. Se toimii myös kohtana, jossa yksittäiset solut liittyvät toi- 5 siinsa kasvikudosmatriksissa. Keskikerros koostuu pääasiassa voimakkaasti esteröityneiden pektiinien kalsium-suoloista .

2. Primaarinen seinämä sijaitsee heti keskikerroksen sisäpuolella. Se on pitkälle orgaanistunut rakenne, 10 joka koostuu amorfisen, pektiini-, hemiselluloosa-, feno-liesteri- ja proteiinimatriksin sisällä olevista selluloo-samikrofibrilleistä.

3. Sekundaarinen seinämä muodostuu kasvin kypsyessä. Selluloosatibrillejä, hemiselluloosaa ja ligniiniä 15 kerääntyy kasvin kasvu- ja ikääntymisvaiheen aikana.

Ennen tätä keksintöä ei ole ollut saatavana pesuainetta tai muuta puhdistusainetta, joka pystyy hajottamaan kasvisoluseinämien tai niiden komponenttien monimutkaisen kuiturakenteen tai geelimäisen matriksin ja vapauttamaan 20 siten pigmentin puhdistettavasta pinnasta, kohteesta tai kankaasta.

, ; Tällä keksinnöllä ei pelkästään pyritä ratkaisemaan ongelmaa, joka koskee kasviperäisten tahrojen poistamista, vaan sen päämääränä on myös auttaa poistamaan tahroja ja 25 likaa, jotka ovat ainakin osittain samanlaisia rakenteel-··* : taan (esimerkiksi tahroja, jotka ovat peräisin elintarvi-

» « I

kekoostumuksesta, jossa on läsnä kasvisoluseinämäkompo- * I » V ' nentteja sakeutteina, hyytelöintiaineina tms.).

Tämä keksintö pystyy siten ratkaisemaan tämä ongel-30 man tarjoamalla käyttöön puhdistuskoostumuksen, joka kä-; sittää vähintään yhtä kasvisoluseinämiä hajottavaa entsyy miä tai ainetta, jolla on sama aktiivisuus kuin mainitunlaisella entsyymillä, sillä ehdolla, että kun läsnä on vain yhtä mainitunlaisen entsyymin tyyppiä, se ei ole sel-; 35 lulaasi. Niinpä keksinnön ajatuksen mukaista ei ole käyt- 4 113878 tää vain yhtä tai useampaa sellulaasia yksinään vaan muita kasvisoluseinämiä hajottavia entsyymejä (sellulaaseja voidaan tosin haluttaessa sisällyttää mukaan mainitunlaisten muiden ohella). Niinpä tämän keksinnön ensimmäinen puoli 5 koskee puhdistuskoostumusta, joka käsittää yhtä tai useampaa ainetta, jolla on kyky hajottaa kasvisoluseinämiä, ja joka on muu kuin koostumus, joka käsittää yhtä tai useampaa sellulaasia ainoina kasvisoluseinämiä hajottavina aineina .

10 Tämä ehto asetetaan, koska sellulaaseja tiedetään sisällytettävän puhdistuskoostumuksiin. Tekstiilien puhdistukseen tarkoitettuihin nykyisiin pesuaineisiin sisällytetään joskus sellulaaseja pehmeyden edistämiseksi, nyp-pyyntymisenestokomponentiksi tai lisäpuhdistusvaikutusten 15 aikaansaamiseksi. Sellulaaseja ei kuitenkaan voida käyttää merkittäviä määriä, sillä monet tekstiilikuidut käsittävät suurena prosenttiosuutena selluloosakuituja, jotka ovat tietenkin alttiita hajoamaan näiden entsyymien vaikutuksesta. Nämä entsyymit eivät itse ole siksi erityisen sopi-20 via tämän keksinnön päätarkoitukseen, koska niitä ei voida lisätä riittävää määrää kasviperäisten tahrojen poistami-: seksi vahingoittamatta tekstiiliä. Niitä voidaan kuitenkin käyttää yhdistettyinä muihin entsyymeihin, joilla on kyky hajottaa soluseinämiä, missä tapauksessa niitä voidaan 25 lisätä pienempiä määriä entsyymiseoksen mainitunlaisten • · t ··· ’ tahrojen kuitumassaan kohdistuvan yhteisvaikutuksen an- siosta. Soluseinämiä hajottavien entsyymien käyttö voi V ‘ siten saada aikaan optimaaliset puhdistusolosuhteet teks tiilikuituja vahingoittamatta, jos sellulaasi(e)n määrä :* 30 pienennetään alle 50 paino-%:iin, edullisesti alle 25 pai- : no-%:iin ja edullisimmin alle 10 paino-%:iin lisättyjen kasvisoluseinämiä hajottavien entsyymien kokonaismäärästä. Joissakin suoritusmuodoissa sellulaasi (t) voi(vat) puuttua kokonaan.

5 113878

Keksinnön mukaiset puhdistuskoostumukset käsittävät siten vähintään 50 paino-%, edullisesti vähintään 75 pai-no-% pektinaasia ja/tai hemisellulaasia kasvisoluseinämiä hajottavien entsyymien kokonaismäärästä. Joissakin suori-5 tusmuodoissa koostumus voi käsittää vähintään 90 paino-% pektinaasia tai hemisellulaasia kasvisoluseinämiä hajottavana ent syymi akt i ivi suut ena.

Selluloosan, hemiselluloosan ja pektiinin vuorovaikutus soluseinämässä on korkea-asteista. Näiden sangen 10 voimakkaasti silloittuneiden polysakkaridirakenteiden ent-symaattinen hajotus ei ole yksinkertainen prosessi. Suuren joukon entsyymejä tiedetään osallistuvan kasvisoluseinä-mien hajotukseen. Ne voidaan laajasti jakaa sellulaasei-hin, hemisellulaaseihin ja pektinaaseihin [Ward ja Young, 15 CRC Critical Rev. in Biotech. 8 (1989) 237 - 274].

Selluloosa on kasvisoluseinämien tärkein polysakka-ridikomponentti. Se koostuu S-1,4-kytkeytyneistä glukoosi-polymeereistä .

Sellulaasit, joita kutsutaan myös sellulolyyttisik-20 si entsyymeiksi, pystyvät hajottamaan selluloosaa. Sellu-lolyyttiset entsyymit on jaettu perinteisesti kolmeen ryh-: mään: endoglukanaaseihin, eksoglukanaaseihin eli sellobio- hydrolaaseihin ja β-glukosidaaseihin [Knowles, J. et ai., TIBTECH 5 (1987) 255 - 261]. Samoin kuin kaikkia solusei-25 nämiä hajottavia entsyymejä, niitä voi tuottaa suuri jouk- • t » ’’·/ ko bakteereja, hiivoja ja sieniä, β-l,4-glukoosipolymeere- jä hajottavien sellulaasien lisäksi tulisi mainita endo- V ’ 1,3/1,4-β-glukanaasit ja ksyloglukanaasit (Ward ja Young, op. cit.).

3 0 Pektiinit ovat hedelmien ja kasvisten syötävien osien soluseinämien tärkeitä rakenneosia. Keskikerrokset, jotka sijaitsevat soluseinämien välissä, koostuvat pää-asiassa protopektiinistä, joka on pektiinin liukenematon ;·’ muoto. Pektiinejä pidetään solunsisäisinä liimoina, ja : : 35 niillä on kolloidisen luonteensa ansiosta myös tärkeä teh- i * · 6 113878 tävä kasvien vedensäätelyjärjestelmässä. Pektiinin määrä voi olla hyvin suuri. Esimerkiksi sitruunankuorten ilmoitetaan sisältävän pektiiniä jopa 30 % kuivamassastaan, appelsiininkuoret sisältävät sitä 15 - 20 % ja omenankuo-5 ret noin 10 % [Norz, K. Zucker und Susswaren Wirtschaft 38 (1985) 5 - 6].

Pektiinit koostuvat ramno-galakturonaanirungosta, jossa 1,4-kytkeytyneet α-D-galaktouronaaniketjut katkeavat välillä ketjuun sijoittuneiden 1,2-kytkeytyneiden a-L-ram-10 nopyranosyyliryhmien vuoksi (W. Pilnik ja A. Voragen teoksessa The Biochemistry of fruits and their products, voi.

1, Acad. Press 1970, luku 3, s. 53). Muita sokereita, kuten D-galaktoosia, L-arabinoosia ja D-ksyloosia on läsnä sivuketjuina. Suuri osa galakturonaaniryhmistä on esteröi-15 tynyt asemissa C2 ja C3 olevilla metyyliryhmillä.

Suuren joukon entsyymejä tiedetään hajottavan pek-tiinejä. Esimerkkejä mainitunlaisista entsyymeistä ovat pektiiniesteraasi, pektiinilyaasi (jotka kutsutaan myös pektiinitranseliminaasiksi) , pektaattilyaasi ja endo- tai 20 eksopolygalaktouronaasi [Pilnik ja Voragen, Food Biotech 4 (1990) 319 - 328]. Sileitä alueita hajottavien entsyymien lisäksi on löydetty myös karvaisia alueita hajottavia ent- "· syymejä, kuten ramnogalakturonaasi, ja apuentsyymejä [Schols et ai., Carbohydrate Res. 206 (1990) 105 - 115; J 25 Searle Van Leeuwen et ai., Appi. Microbiol. Biotechn., 38 : (1992) 347 - 349] .

; Hemiselluloosat ovat monimutkaisin ryhmä ei-tärk- kelyspolysakkaride j a kasvisoluseinämässä. Ne koostuvat ksyloosi-, arabinoosi-, galaktoosi- tai mannoosipoly-. 30 meereistä, jotka ovat usein voimakkaasti haaroittuneita ja liittyneinä muihin soluseinämärakenteisiin. Niinpä tarvi-“···1 taan suuri joukko entsyymejä hajottamaan näitä rakenteita ·:1 (Ward ja Young, op. cit.). Ksylanaasi, galaktanaasi, arabinanaasi, lichenaasi ja mannanaasi kuuluvat hemi- • i i 35 selluloosaa hajottaviin entsyymeihin.

1 » * · i · I · 1 7 113878

Kormelink (tohtorinväitöskirja, University of Wageningen, Alankomaat 1992) on tehnyt yhteenvedon endo-ja eksoksylanaaseista ja apuentsyymeistä, kuten glukuroni-daaseista, arabinofuranosidaaseista, asetyyliksylaanieste-5 raasista ja ferulahappo- ja kumariinihappoesteraasista. Niitä tuottavat monet erilaiset mikro-organismit, ja niillä on vaihtelevat lämpötila- ja pH-optimit.

Samoin kuin muita soluseinämiä hajottavia entsyymejä (CWDE; cell wall degrading enzyme), galaktanaaseja 10 esiintyy monissa mikro-organismeissa [Dekker ja Richards, Adv. Carbohydrat. Chem. Biochem. 32 (1976) 278 - 319].

Kasvisoluseinämissä on läsnä kahta arabinogalaktaanityyp-piä: tyypin I 1,4-fi-galaktaaneja ja tyypin II 1,3/1,6-β-galaktaaneja, joilla on haaroittunut runko (Stephen 15 teoksessa The Polysaccharides, toim. G. O. Aspinael, Ac. Press, New York 1983, s. 97 - 193). Kumpikin galaktaa-nityyppi vaatii oman endoentsyymityyppinsä hajotakseen. On odotettavissa, että muilla entsyymeillä, kuten arabinaania hajottavilla entsyymeillä ja eksogalaktanaaseilla on jokin 20 rooli arabinogalaktaanien hajotuksessa.

Hemiselluloosa 1,3-1,4-5-glukaani on viljakasveissa (ohra, kaura, vehnä ja ruis) esiintyvä soluseinämä-, : komponentti, β-glukaanin määrä viljakasvien endospermissä j*’ vaihtelee alueella 0,7 - 8 %. Se on haaroittumaton : : 25 polysakkaridi, joka koostuu 1,3-glukosidisidoksen kytke- * mistä sellotrioosi- ja sellotetroosiryhmistä. Suhde tri- . sakkaroosi: tetrasakkaroosi on alueella 1,9 - 3,5.

Lichenaasi (EC 3.2.1.73) hydrolysoi 1,4-beeta-D- • · · glukosidisidoksia 1,3- ja 1,4-sidoksia sisältävissä beeta-30 D-glukaaneissa. Lichenaasi ei reagoi esimerkiksi selluloo-·;;; sassa esiintyvien pelkästään 1,4-sidoksia sisältävien bee- ta-D-glukaanien kanssa. Niinpä kankaissa ei tapahtu sellu-;· loosakuitujen vahingoittumista käytettäessä lichenaasia.

Lichenaaseja tuottavat bakteerit, kuten B. amyloliquefa-35 ciens, B. circulans ja B. licheniformis, ja kasvit [S.

• » 113878 8

Bielecki et al., Rev. in Biotechn. 10(4) (1991) 275 - 304] .

Arabinaanit koostuvat toisiinsa kytkeytyneiden [α-(1—>5)] α-L-arabinoosialayksiköiden muodostamasta pääket-5 justa. Sivuketjut ovat a-(l->3)- tai joskus a- (1—>2)-kytkeytyneinä α-(1—>5)-L-arabinaanirunkoon. Esimerkiksi omenassa kolmannes arabinoosin kokonaismäärästä on läsnä sivuketjuissa. Arabinaanin molekyylimassa on normaalisti noin 15 kDa.

10 Arabinaania hajottavia entsyymejä tuottavat tunne tusti erilaiset kasvit ja mikro-organismit. Kolme A. ni-geristä saatavissa olevaa entsyymiä on kloonattu molekyylibiologisin menetelmin (EP-hakemusjulkaisu 0 506 190). Myös bakteereista, kuten Bacteroides-lahkosta, peräisin 15 oleva arabinosidaasi on kloonattu {Whitehead ja Hespell, J. Bacteriol. 172 (1990) 2408].

Galaktomannaanit ovat Leguminosae-heimon siemenissä esiintyviä varastopolysakkarideja. Galaktomannaa-neilla on lineaarinen (1_>4)-β-mannaanirunko ja ne ovat 20 substituoituneet yksittäisillä (1—>6)-a-galaktoosiryhmil-lä. Esimerkiksi guarkumissa suhde mannoosi:galaktoosi on noin 2:1. Galaktomannaaneja käytetään sakeutteina elin-: tarviketuotteissa, kuten kastikkeissa ja keitoissa.

Mannanaasientsyyme j ä kuvataan PCT-hakemus j ulkai-: 25 sussa WO 93/24 622.

* Glukomannaani koostuu glukoosin ja mannoosin muo- i · · ; dostamasta pääketjusta. Pääketju voi olla substituoitunut galaktoosi- ja asetyyliryhmillä; mannanaaseja pystyy tuot- • · · * tamaan joukko mikro-organismeja, johon kuuluu bakteereja , 30 ja sieniä.

’ * # ;;; Yhteenvetona voidaan sanoa, että on olemassa suuri ··’ joukko kasvisoluseinämiä hajottavia entsyymejä, joita ·;· tuottavat erilaiset organismit. Entsyymeillä on lähteestä riippuen erilainen substraattispesifisyys, pH- ja lämpöti-35 laoptimi, Vmax, Km jne. Entsyymien moninaisuus heijastaa i t t Ml 9 113878 kasvisoluseinämien monimutkaista luonnetta, joissa seinämissä on suuria eroja kasvilajien välillä ja lajin sisäisesti kasvikudosten välillä. Voidaan valmistaa sopiva ent-syymiseos kasvimateriaalin lähteen, käyttötarkoituksen ja 5 kulloistenkin käyttöolosuhteiden mukaisesti.

Näiden soluseinämiä hajottavien entsyymien saatavuus ja valikoima ovat kasvaneet huomattavasti viime vuosina, mikä antaa mahdollisuuden käyttää näiden entsyymien valikoituja yhdistelmiä lisäaineina pesuaineissa. Nämä 10 pesuaineet soveltuvat erityisesti kasviperäisten tahrojen poistamiseen.

Samalla kun perusteellisemmin tutkitut soluseinämiä hajottavat entsyymit ovat peräisin sienistä ja niiden pH-optimit ovat happamalla pH-alueella, nykyään kuvataan 15 yhä enemmän CWDE:ejä, jotka ovat aktiivia emäksisemmissä olosuhteissa, esimerkiksi ksylanaaseja [A. Shendye ja M.

Rao, FEMS Microbiol. Lett. 108 (1993) 297 - 302; S. Nakamura, K. Wakabayashi, R. Nakai, R. Aono ja K. Horikoshi, Appi. Environ. Microbiol. 59 (1993) 2311 - 2316), 20 mannaaseja (T. Akino, N. Nakamura ja K. Horikoshi, Agric. Biol. Chem. 52 (1988) 773 - 779] ja galaktanaaseja [K.

Tsumura, Y. Hashimoto, T. Akiba ja K. Horikoshi, Agric.

*; Biol. Chem. 55 (1991) 125 - 127] . Tämä ominaisuus tekee näistä entsyymeistä yhteensopivia nykyisten pesuaine-l : 25 formuloiden kanssa.

: Monissa tapauksissa on mahdollista saada aikaan . *. tämän keksinnön yhteydessä käyttökelpoisia entsyymejä vil- jelemällä entsyymiä tuottavaa mikro-organismia ja eristämällä entsyymi viljelmästä tai kasvatusliemestä.

, 30 Tämän keksinnön yhteydessä käyttökelpoisia entsyymi mejä voidaan saada aikaan myös yhdistelmä-DNA-tekniikalla, ’··' jolloin isäntäsolu varustetaan haluttua entsyymiä koodit- ’;* tavalla geneettisellä informaatiolla yhdessä sopivien ele- menttien kanssa kyseisen geneettisen informaation ilmen-35 tämiseksi.

i · · 10 113878

Isäntäsolu voi olla homologinen mikro-organismi tai heterologinen mikro-organismi, joihin molempiin voi kuulua, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, bakteereja, basilleja, hiivoja ja sieniä; niihin voi kuitenkin kuulua 5 myös ylempien eukaryoottien soluja, kuten kasvi- tai eläinsoluja. Voi olla myös hyvin käyttökelpoista varustaa isäntäsolu geneettisellä informaatiolla, joka koodittaa useampaa kuin yhtä entsyymiä tai useampaa kuin yhtä entsyymiaktiivisuutta, esimerkiksi hybridientsyymiä.

10 Vaikka mikro-organismeja on korostettu jossakin määrin tämän keksinnön yhteydessä käyttökelpoisten entsyymien kätevänä lähteenä, ymmärrettäneen, että voidaan käyttää mistä tahansa lähteestä saatavia entsyymejä, kunhan niillä on sellainen aktiivisuus, että ne pystyvät hajotta-15 maan ainakin osia kasvisoluseinämistä.

Koska tämä aktiivisuus on merkitsevin ominaisuus, lienee ilmeistä, että voidaan käyttää myös niiden aktiivisuudeltaan samanlaisia tai samankaltaisia johdannaisia, fragmentteja tai yhdistelmiä ja ne on sisällytettävä ent-20 syymin määritelmän piiriin.

Johdannaisten piiriin on nimenomaisesti tarkoitus sisällyttää mutantit, joissa on tehty yhden tai useamman * · aminohapon lisäys, poisto tai korvaaminen, niin että ent- '·’. syymien tietyt ominaisuudet säilyvät tai paranevat, samoin * 25 kuin kemiallisesti muunnetut entsyymit.

'/ Keksinnön mukaiset koostumukset voivat käsittää ’·* yhtä entsyymiä (missä tapauksessa entsyymi ei ole sellu- ’·* * laasi) , vaikka on edullista, että ne sisältävät erilaisten entsyymien seosta, jotka entsyymit ovat edullisesti kyke-30 neviä hajottamaan kasvisoluseinämien eri osia tai tahrojen : : muita komponentteja, jotka tahrat ovat ainakin osittain samankaltaisia rakenteeltaan (esimerkiksi tahrat, joita jää elintarvikekoostumuksesta, jossa on läsnä kasvisolu- » t ‘7 seinämäkompnentteja sakeutteina, hyytelöintiaineina tms.).

» » • » • » * 11 113878

Tehokkaimman tahranpoiston kannalta ovat edullisia entsyymit, joilla on endopilkkomisominaisuuksia. Nämä entsyymit katkaisevat polymeerisiä kuituyhdisteitä pienemmiksi osiksi ja tekevät siten kuitumassan ja siihen liitty-5 neet pigmentit paremmin liukeneviksi.

Koostumukset voidaan tehdä erityisesti sopiviksi aiottuun käyttöönsä. Koostumukset, jotka on tarkoitettu tekstiilien puhdistukseen joko käsin tai koneellisesti, käsittävät yleensä erilaisia aineosia kuin keittiötavaroi-10 den tai esimerkiksi lattioiden ja kaakeleiden puhdistukseen tarkoitetut koostumukset. Erityisen edullisia koostumuksia ovat niin kutsutut ennen pesua käytettävät tahran-poistajat ("pre-spotters").

Mainitunlaisten koostumusten tavallisiin aineosiin 15 kuuluvat pinta-aktiivisuusaineet, builderit, valkaisuai neet, entsyymit, kuten amylaasit ja proteaasit, jne. Edullisia keksinnön mukaisia koostumuksia ovat tekstiilien puhdistukseen tarkoitetut koostumukset.

Niinpä ensimmäisen puolen mukaisia edullisia koos- 20 tumuksia ovat pesuainekoostumukset. Niihin voi kuulua pe- sujauheita ja -nesteitä, astianpesukoostumuksia, kotita- :**,· lous (esimerkiksi lattia ja kaakeli) -puhdistusaineita, esipesukoostumuksia ja/tai muita tekstiilien ja kankaiden ,···. puhdistuskoostumuksia.

• · 25 Keksinnön toinen puoli koskee menetelmää kohteen * » « "V tai pinnan puhdistamiseksi, jossa menetelmässä saatetaan * * · ;; kohde tai pinta kosketukseen ensimmäisen puolen mukaisen '·’ koostumuksen kanssa ja annetaan puhdistumisen tapahtua.

Pinta voi olla esimerkiksi lattialla tai kaakeloinnilla, 30 ja kohde voi olla tekstiili tai kangastuote tai keittiöta-ί vara (kuten ruokailuväline tai astia). Toisen puolen edul- liset piirteet ja tunnusmerkilliset ominaisuudet ovat samat kuin ensimmäisen kohdalla tarpeellisin muutoksin.

12 113878

Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavissa esimerkeissä, jotka annetaan keksinnön valaisemiseksi ja joita ei tule ymmärtää sitä rajoittaviksi.

Esimerkki 1 5 Entsyymilähde Tässä tutkimuksessa käytettyihin puhdistettuihin entsyymeihin kuuluvat seuraavat.

A. Trichoderma viridestä peräisin oleva sellobio-hydrolaasi III (EC 3.2.1.91) puhdistettiin kaupallisesta 10 sellulolyyttisestä entsyymivalmisteesta MaxazymeR CL2000 (Gist-brocades) Beldmanin et ai. menetelmällä [Eur. J. Biochem. 146 (1985) 301 - 308] . Puhdistuksen jälkeen CBHIII:a sisältävä entsyymitraktio konsentroitiin ultra-suodattamalla Filtron-kalvolla (molekyylimassaraja 10 kD) 15 proteiinipitoisuuteen 108,6 mg/ml.

B. Endoglukanaasi V (EC 3.2.1.4, tämä ei ole tavanomainen endoglukanaasi) puhdistettiin myös MaxazymeR

CL2000:sta Beldmanin et ai. mukaisesti (op. cit.). Puhdistuksen jälkeen entsyymi konsentroitiin ultrasuodattamalla 20 Filtron-kalvolla (molekyylimassaraja 10 kD) proteiinipi toisuuteen 48,2 mg/ml.

: C. Endoarabinanaasi (EC 3.2.1.99) saatiin AbnA-gee- nillä (EP-A 0 506 190) transformoidusta A. nidulans -kannasta G191. Tähän tutkimukseen käytettiin materiaalia, 25 joka oli peräisin kannasta G191::pIM950-170, josta käyte-• · tään merkintää ABN102. Kantaa ABN102 kasvatettiin 40 tun tia lämpötilassa 30 °C 2 l:n ravistuspulloissa, jotka si-.· : söisivät 0,5 1 kasvualustaa. Alusta sisälsi litraa kohden 10 g sokerijuurikassulppua, 1 g hiivauutetta, 15 g magne-30 siumsulfaattia, 0,5 g kaliumkloridia ja 1 ml Vishniac-liuosta. Vishniac-liuos sisältää 100 ml:aan kohden 0,44 g sinkkisulfaattiheptahydraattia, 0,1 g mangaanikloriditet-; rahydraattia, 0,03 g kobolttikloridiheksahydraattia, 0,03 g kuparisulfaattipentahydraattia, 0,025 g dinatrium-: 35 molybdaattidehydraattia, 0,14 g kalsiumklorididihydraat- 13 113878 tia, 0,1 g rauta(II)sulfaattiheptahydraattia ja 1,0 g EDTAa. Alustan pH säädettiin arvoon 6,0 KOH:lla (1 ekv/1).

Alustasta poistettiin pieneliöt fermentoinnin jälkeen suodattamalla se peräjälkeen seuraavien suodattimien 5 läpi: 1. suodatinpaperi (Buchner-suppilo); 2. lasikuitusuodatin (Whatmann GF/A tai GF/B); 3. kovetetut suodatinrenkaat (Whatmann); 4. kalvosuodatin, 0,45 μπι (Schleicher & Schuell) .

10 Steriili fermentointisupernatantti konsentroitiin edelleen ultrasuodattamalla edellä kuvatulla tavalla proteiinipitoisuuteen 12,2 mg/ml.

D. Endopektinaasi (pektiinilyaasi; EC 4.2.2.10) on yksi mahdollisista endopektinaaseista, ja se puhdistettiin 15 kaupallisesta pektolyyttisestä entsyymivalmisteesta

Rapidase PressR (Gist-brocades) seuraavalla menetelmällä.

Kun entsyymivalmiste oli syötetty Whatmann QA-cellulose/DS29:lie, kolonni huuhdottiin fosfaattipuskurilla (0,02 mol/1, pH 6,0), joka sisälsi 0,2 mol/1 NaCl-.a.

20 Endopektinaasi eluoitiin samalla puskurilla, joka sisälsi 0,2 mol/1 NaCl:a. Entsyymi konsentroitiin puhdistuksen . : jälkeen YM10-tyyppisellä Amicon-suodattimena (molekyyli- massaraja 10 kD) proteiinipitoisuuteen 14,5 mg/ml.

E. Arabinofuranosidaasia B (EC 3.2.1.55) tuotettiin 25 Aspergillus niger -kannasta N593, joka oli transformoitu

'“/· useilla kopioilla A. niger -peräistä abfS-geeniä (EP-A

0 506 190), joka oli A. niger -peräisen amyloglukosidaasi-v ’ promoottorin (EP-A 0 506 190) säätelyn alaisena. Parhaiten tuottavaa transformanttia, josta käytetään merkintää N593-30 T8 , kasvatettiin EP-hakemusjulkaisussa 0 506 190 kuvatulla : tavalla.

Entsyymieristä poistettiin fermentoinnin jälkeen ; pieneliöt endoarabinaasin yhteydessä kuvatulla tavalla.

;·’ Fermentointisupernatantti konsentroitiin ultrasuodattamal- : 35 la kohdassa D kuvatulla tavalla ja kylmäkuivattiin.

14 113878

Arabinofuranosidaasi B laimennettiin ennen käyttöä vedellä proteiinipitoisuuteen 118,9 mg/ml.

F. Endoksylanaasi I (EC 3.2.1.8) eristettiin A. niger CBS 513.88:sta, joka oli transformoitu plasmidilla 5 pXYL3AG, joka sisälsi ksylanaasigeenin A. nigerin amylo-glukosidaasipromoottorin säätelyn alaisena, kuten kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0 463 706. Kantaa kasvatettiin EP-hakemusjulkaisussa 0 463 706 kuvatulla tavalla ja fermen-tointisupernatantista poistettiin pieneliöt endoarabinaa-10 sin yhteydessä kuvatulla tavalla.

Supernatantti kuivattiin ultrasuodattamalla endo- arabinaasin yhteydessä kuvatulla tavalla ja se liuotettiin veteen, niin että proteiinipitoisuudeksi tuli 72,0 mg/ml.

G. Endogalaktanaasi (EC 3.2.1.89) hankittiin Mega-15 zyme LTD:stä (Australia). Sen proteiinipitoisuus on 1,08 mg/ml.

Muita entsyymejä, jotka ovat joko puhdistettuja tai TUDVA-tekniikalla tuotettuja, voidaan myös käyttää.

Käytettyihin kaupallisesti saatavissa oleviin ent-

20 syymeihin kuuluvat pektinaasia sisältävä Rapidase PressR

(Gist-brocades) , lichenaasia, sellulaasia ja ksylanaasia sisältävä Filtrase BRr (Gist-brocades), sellulaasia ja '· ksylanaasia sisältävä MaxazymeR CL2000 (Gist-brocades) , .. *: * hemisellulaasia sisältävä Fermizym H400R (Gist-brocades) !|ti! 25 ja ksylanaasia sisältävä Xylanase 5000R (Gist-brocades).

• * ; ; Esimerkki 2 ; /; Erilaisten entsyymiseosten toimintakyky pesussa , /. määritettiin erityisesti kehitetyssä pesutestissä, jota kuvataan yksityiskohtaisesti EP-hakemusjulkaisussa 30 0 328 229. Tässä esimerkissä käytetyn natriumtripolyfos- faattia (STPP) sisältävän jauhemaisen pesuaineen (IEC-STPP) lisäksi käytettiin myös fosfaatitonta jauhemaista ' pesuainetta (IEC-zeoliitti). Uusien entsyymiseosten pesu- ; kyvyn testaamiseen käytettyjen kahden testijärjestelmän 35 tyypilliset piirteet on koottu seuraavaan: 15 113878

Pesujärj es telinä IEC-STPP IEC-zeoliitti

Annosteltu pesuaine/valkaisuaine 4 g/1 7 g/1 5 Vaahtotilavuus/dekantterilasi (ml) 250 200 Lämpötila 40 30

Aika (min) 30 30

Pesuaine IEC-STPP IEC-zeoliitti

Pesuaineannostus (g/1) 3,68 5,6 10 Na-perboraatti.4H20 (g/1) 0,32 1,4 TAED (mg/1) 60 210 EMPA 116/117 (5x5 cm) 2/2 2/2 CFT-tilkut 0 2

Puhdas tilkku EMPA 221 (10 x 10 cm) 0 2 15 Ruostumattomat teräskuulat (0,/ 6 mm) 0 15 [Ca2+] (mmol/1) 2 2 [Mg2+] (mmol/1) 0,7 0,7 [NaCCb] (mmol/1) 2,5 0 20 IEC-STPP-pesujauhe (IEC Test Detergent Type I, formula: toukokuu 1976) ja IEC-zeoliittipesujauhe (formula: huhtikuu 1988) ostettiin WFK-Testgewebe GmbH:sta, . '1 Alderstrasse 44, D-4150, Krefeld, Saksa.

,!·* Entsyymiseosten pesukykyä mitattiin 30 minuuttia i>ti 25 lämpötilassa 40 °C ja 20 minuuttia lämpötilassa 30 °C.

Joidenkin entsyymiseosten pesukyvyn määrittämisek- i # · ;’· si olosuhteissa, joissa puhdistuskyky on pieni, tyypillis- ’ten Yhdysvalloissa käytettävien olosuhteiden (20 min t lämpötilassa 38 °C) jäljittelemiseksi pesut tehtiin käyt-30 tämällä edellä kuvatun kaltaista, mutta jonkin verran j muunnettua pesutestiä. Alla on yhteenveto tämän testin ;·’ tärkeimmistä tunnusmerkillisistä piirteistä: 5 · 16 113878

Vaahtotilavuus/dekantterilasi (ml) 200

Aika (min) 20

Pesuaineen A annostus (g/1) 1,3 EMPA 116/117 (5x5 cm) 2/2 5 CFT-tilkut (5x5 cm) 2

Puhdas tilkku EMPA 221 (10 x 10 cm) 2

Ruostumattomat teräskuulat (0 6 mm) 15 [Ca2+] (mmol/1) 2 [Mg2*] (mmol/1) 0,7 10

Pesuaineen A koostumus oli seuraava:

Aineosat paino-% 15 Alkoholietoksylaatti 13 LAS-90 7

Polyakrylaatti 1

Zeoliitti 35

Na-silikaatti 3 2 0 Na2C03 20

Tri-Na-sitraatti·2H20 4 ; Na2S04 8 , Vesi 100:ksi i » > < · · 25 Entsyymiseosten toimintakyky mitattiin CFT-tilkuil- '·- > la (ostettu CFT:stä, Center for Test Materials, P.O. Box 120, Vlaardingen, Alankomaat), Nämä tilkut liattiin tah-: roilla, jotka oli suunniteltu kasvisoluseinämiä hajotta vien entsyymien toimintakyvyn mittaamiseen. Lika sisälsi 30 mm. mangon hedelmälihaa, persikan hedelmälihaa, punaista hedelmälihaa, pinaattia ja tomaattipitoisia kastikkeita ja salaatinkastikkeita.

; Testattiin seuraavien entsyymivalmisteiden pesuky- ky: kaupalliset seokset, kuten Rapidase PressR (Gist-broca-/: 35 des); puhdistetut yksittäiset kasvisoluseinämiä hajottavat 17 113878 entsyymit, kuten sellobiohydrolaasi 11, endoglukanaasi V, endoarabinanaasi, endopektinaasi, arabinofuranosidaasi B, endoksylanaasi 1 ja endogalaktanaasi; puhdistettujen solu-seinämiä hajottavien entsyymien muutama seos.

5 Liatut tilkut pestiin entsyymivalmisteiden läsnä ja poissa ollessa.

Entsyymivalmisteen puhdistuskykyä parantava vaikutus mitattiin Datacolor Elrephometer 2000 -laitteella. Puhdistuskyky määritettiin noudattamalla seuraavaa yhtälö löä: R (liattu, pesty) - R (liattu, pesemätön)

Puhdistuskyky = - R (likaamaton, pesemätön) - R( liattu, pesemätön) 15 jossa R tarkoittaa remissiota.

Tulokset osoittavat, että keksinnön mukaiset koostumukset, jotka sisälsivät soluseinämiä hajottavia entsyymejä tai niiden seoksia, antoivat tulokseksi kasvimateriaalia, hedelmiä, kastikkeita, mehuja, hyytelöitä jne.

20 sisältävien tahrojen poistumisen lisääntymisen.

Esimerkki 3

Kehitettiin pienimittainen testijärjestelmä ent-syymien toimintakyvyn mittaamiseksi pyykinpesussa ja kone-tiskissä.

25 3.1. Testimateriaalit

Astianpesua varten kiinnitettiin tahroja ja ruuantähteitä lasiin (mikroskoopin objektilasi, 76 mm x 26 mm) upottamalla lasi tahrausliuokseen tai ruokaan, mitä seura-• ‘ ' si kuivaus yön yli pystyasennossa huoneenlämpötilassa.

30 Nopeutettu vanhennus saatiin lisäksi aikaan kuivaamalla i;’ (24 tuntia) uunissa lämpötilassa 40 °C.

: Pyykinpesua varten imeytettiin tai levitettiin esimerkiksi ruuantähdetahroja puuvillakankaille (EMPA,tuo- YY. tenumero 221) tai polyesterikankaille (EMPA, tuotenumero » * * » • · 18 113878 407) , joiden mitat olivat 5 x 35 cm. Ennen pesutestejä nämä kankaat leikattiin paloiksi, joiden mitat olivat 2,5 x 2,5 cm. Tahroja vanhennettiin kuivaamalla muutamia päiviä huoneenlämpötilassa.

5 Tahroja tehtiin esimerkiksi koostumuksista, joissa pigmentit olivat kovalenttisesti sitoutuneina kasvisolu-seinämämateriaaliin. Näitä koostumuksia, esimerkiksi Azo-Wheat -ArabinoxylanR ja Azo-Barley-GlucanR, hankittiin Mega-zymestä (Australia).

10 Tahroja tehtiin myös koostumuksista, jotka käsitti vät kasvisoluseinämäperäistä materiaalia (esimerkiksi guarkumia, Aldrichilta), joka muodosti kompleksin väriaineen (esimerkiksi Congo Red, Sigmalta) kanssa.

Lisäksi tahroja tehtiin elintarvikekoostumuksista, 15 jotka käsittivät kasvisoluseinämäperäisiä sakeutteita, esimerkiksi mannaania sisältävästä salaattikastikkeesta Thousand IslandsR, joka hankittiin liikkeestä Albert Heijn (Alankomaat).

3.2. Testijärjestelmä 20 Sijoitettiin muoviputkia (Greiner, 50 ml) , jotka sisälsivät 25 ml pesuainetta, termostaatilla varustettuun ,·, ; vesihauteeseen (40 °C tai mikä tahansa muu edullinen läm- • i · pötila). Tasapainon saavuttamisen jälkeen lisättiin ent-syymi ja testimateriaali ja muoviputki suljettiin. Putket 25 sijoitettiin Heidolph-putkenpyörityslaitteeseen (30 kierii · rosta/min) , joka laitettiin ennalta kuumennettuun uuniin (40 °C tai mikä tahansa muu edullinen lämpötila) . Inku- ' ' i V · boinnin (20 min) jälkeen putket tyhjennettiin ja testima teriaali kuivattiin KleenexR-pehmopapereilla ennen solusei-·· 30 nämiä hajottavien entsyymien toimintakyvyn arvioimista.

Pyykinpesutesteihin (puuvillalla ja polyesterillä ', tehdyt testit) käytettiin seuraavia pesuaineita: ;; - LIQUID TIDER (tyyppi: lokakuu 1994); ··* - ARIEL ULTRAr (tyyppi: maaliskuu 1992); 35 - TIDE P0WDERR (tyyppi: 1995).

19 113878

Pesuaineet eivät sisältäneet valkaisuainetta. LIQUID TIDEr ja ARIEL ULTRAr eivät sisältäneet entsyymiyh-disteitä; TIDE POWDERr -pesuaineen sisältämät entsyymikom-ponentit deaktivoitiin kuumentamalla 2 minuuttia lämpöti-5 lassa 80 °C. LIQUID TIDER -pesuainetta käytettiin pitoisuutena 1 g/1 synteettisessä hanavedessä ("synteettinen hana-vesi" on demineralisoitua vettä, johon on lisätty Mg2+:a ja Ca2+:a, niin että saadaan määrätty kovuus) , jonka kovuus saksalaisella asteikolla (GH; German Hardness) oli 5 10 (5 GH = 0,23 mmol/1 Mg:a ja 0,67 mmol/1 Ca:a) . ARIEL ULTRAr -pesuainetta käytettiin pitoisuutena 5 g/1 synteettisessä hanavedessä, jonka kovuus saksalaisella asteikolla oli 15 (15 GH = 0,7 mmol/1 Mg2+:a ja 2 mmol/1 Ca2+:a) . TIDE P0WDERr -pesuainetta käytettiin pitoisuutena 1,3 g/1 synteettises-15 sä hanavedessä, jonka kovuus saksalaisella asteikolla oli 15 .

Konetiskitesteissä (lasilla tehdyt testit) käytimme CALGONIT FL1JSSIGr -pesuainetta (tyyppi: maaliskuu 1992). Tämä pesuaine ei sisällä valkaisuainekomponentteja, ja 20 entsyymikomponentit dekativoitiin kuumentamalla 2 minuut tia lämpötilassa 80 °C. CALGONIT FLlissIGR -pesuainetta käy-.·, ; tettiin pitoisuutena 5 g/1 synteettisessä hanavedessä, • I · jonka kovuus saksalaisella asteikolla oli 15.

3.3 Olosuhteet *·; 25 Testiolosuhteet (pyykinpesu ja konetiski) olivat : : 20 minuutin pesu lämpötilassa 40 °C tai missä tahansa ’ muussa edullisessa lämpötilassa. Raati arvioi visuaalises- ' : ti soluseinämiä hajottavien entsyymien tehon tahroihin ja ruuantähteisiin, tai se mitattiin tekemällä heijastuskyky ;· 30 (remissio) -mittaus Photovolt-fotometrillä, malli 577, joka oli varustettu vihersuodattimella. Puhdistuskyky las-, kettiin käyttämällä esimerkissä 2 kuvattua yhtälöä.

» > · · * · 20 113878 3.4. Entsyymilähteet A. tubigensis (CBS 323.90) -peräinen ksylanaasi

Viljelmäsuodos saatiin viljelemällä Aspergillus niger DS16813:a [CBS 323.90 - luokiteltu myöhemmin kuulu-5 vaksi todennäköisemmin lajiin A. tubigensis; (Kusters-van Someren et ai. 1991)] alustassa, joka sisälsi (litraa kohden) 30 g kauraspelttiglykaania (Sigma); 7,5 g NH4N03:a, 0,5 g KCl:a, 0,5 g MgS04:a, 15 g KH2P04:a ja 0,5 g hiivauu-tetta (pH 6,0). Viljelmäsuodos konsentroitiin suunnilleen 10 tilavuuteen 35 ml ja ultrasuodatettiin sitten Diaflo PM 10 -suodattimena 50 ml:n Amicon-yksikössä suolojen poistamiseksi .

Supernatantti konsentroitiin sitten tilavuuteen 10 ml ja retentaatti pestiin kahdesti 25 ml :11a Tris-HCl-15 puskuria (25 mmol/1, pH 7,0). Pesun jälkeen retentaatin tilavuus säädettiin 25 ml:ksi. Tuloksena olevaa ksylanaa-sikoostumusta kutsutaan kokeissa nimellä "A. tubigensis -peräinen ksylanaasi".

Disporotrichum dimorphosporum -peräinen ksylanaasi 20 Ksylanaasia sisältävää kaupallista tuotetta

Xylanase 5000R (Gist-brocades) kutsutaan kokeissa nimellä .·. : "D. dimorphosporum -peräinen ksylanaasi".

• I I

* KEX301-peräinen ksylanaasi

Alkalista ksylanaasia (pH-optimi yli 7), joka saa-25 tiin E. coli -kloonista KEX301 (kuvataan avoinna olevassa • » t

·· · hakemuksessa PCT/EP94/04312; luovuttajaorganismi oli CBS

'h* 672.93, eräs Bacillus-tyyppinen mikro-organismi), kutsu- ·" taan kokeissa nimellä "KEX301-peräinen ksylanaasi".

TG53-peräinen xyn D -ksylanaasi 1 :* 30 Ksylanaasi, jota koodittaa kannan TG53 (talletettu CBS:ään numerolla CBS 211.94) xyn D -geenin nukleotidisek-venssi, saatiin tavalla, jota kuvataan avoinna olevassa PCT-hakemuksessa, joka on jätetty 14. kesäkuuta 1995. Ha- : v ;· kemuksen numero ei ole vielä saatavissa. Siten saatua ksy- 21 113878 lanaasia kutsutaan kokeissa nimellä "TG53-peräinen xyn D -ksylanaasi".

A. tubigensis (CBS 323.90) -peräinen endoksylanaasi 5 Endoksylanaasi I (EC 3.2.1.8) eristettiin A. niger CBS 513.88:sta, joka oli transformoitu plasmidilla pXyl3AG, joka sisältää ksylanaasigeenin A. nigerin amylo-glukosidaasipromoottorin säätelyn alaisena, EP-hakemusjulkaisussa 0 463 706 kuvatulla tavalla. Kantaa kasvatettiin 10 EP-hakemusjulkaisussa 0 463 706 kuvatulla tavalla ja fer-mentointiseoksesta poistettiin pieneliöt suodattamalla se peräjälkeen seuraavien suodattimien läpi: 1. suodatinpaperi (Biichner-suppilo) ; 2. lasikuitusuodatin (Whatmann GF/A tai GF/B); 15 3. kovetetut suodatinrenkaat (Whatmann); 4. kalvosuodatin, 0,45 μτη (Schleicher & Schuell) .

Steriili fermentointisupernatantti konsentroitiin edelleen Amicon-suodattimella, tyyppi YM10 (molekyylimas-saraja 10 kD) proteiinipitoisuuteen 12,2 mg/ml.

20 Siten saatua ksylanaasivalmistetta kutsutaan kokeissa nimellä "endoksylanaasi I".

: B. amyloliquefaciens -peräinen lichenaasi • · ·

Lichenaasilähteenä käytettiin lichenaasia sisältäni! vää kaupallista tuotetta Filtrase BRr. Filtrase BRR:stä ."! 25 eristettyä lichenaasia kutsutaan kokeissa nimellä "B. amy- ·*· · loliquefaciens -peräinen lichenaasi".

Galaktomannanaasi Sumizyme ACHR

* Galaktomannanaasia sisältävää kaupallista tuotetta

Sumizyme ACHR [Shin nihon; eränumero 91-1221, 100 000 U/g :* 30 (yksikköä/g)] kutsutaan kokeissa nimellä "galaktomannanaa- si Sumizyme ACHR" .

Mannanaasi Megazyme

Mannanaasia (EC 3.2.1.25) sisältävää kaupallista ;·’ beeta-mannanaasituotetta (Megazyme; erä MMA82001, 38 U/mg 22 113878 proteiinia ja 418 U/ml) kutsutaan kokeissa nimellä "manna-naasi Megazyme".

Alkalinen mannanaasi

Alkalista mannanaasia saatiin kasvattamalla 72 tun-5 tia lämpötilassa 37 °C kantaa C11SB.G17 (joka on talletettu Centraal Bureau voor Schimmelculturesiin, Baarn, Alankomaat, 16. kesäkuuta 1995; kannan talletusnumero CBS 480.95) minimialustalla, jonka pH oli 10 ja joka sisälsi 0,5 g/1 hiivauutetta (Difco) , 10 g/1 KN03:a, 1 K2HP04:a, 10 0,2 g/1 MgS04· 7H20:a, 10 g/1 Na2C03:a ja 1 g/1 gurakumia (Sigma).

Kun viljelmää oli kasvatettu väliseinällisissä ra-vistuspulloissa, se sentrifugoitiin biomassan erottamiseksi. Supernatantti konsentroitiin 10 kDa:n kalvolla manna-15 naasiaktiivisuuspitoisuuteen 60 AMU/1.

Siten saatua mannanaasikoostumusta kutsutaan kokeissa nimellä "alkalinen mannanaasi".

3.5. Entsyymiaktiivisuusmittaukset

Proteaasiaktiivisuus (yksikkönä DU = Delft-yksikkö) 20 määritettiin Detmarin et ai. mukaisesti [JAOCS 48 (1971) 77 - 79]. Amylaasiaktiivisuus (yksikkönä TAU) määritettiin .; julkaisun W091/00 353 esimerkissä 8(a) kuvatun menetelmän mukaisesti.

Ksylanaasiaktiivisuus (yksikkönä EXU) määritettiin 25 seuraavalla menetelmällä: Putkia, jotka sisälsivät 0,8 % · kauraspelttiksylaania sitruunahappopuskurissa (100 mmol/1, > » · pH 3,5) esi-inkuboitiin (15 min) lämpötilassa 40 °C. Reak-V : tio käynnistettiin lisäämällä entsyymiä 0,04 - 0,15 EXU/ml sitruunahappopuskuria (100 mmol/1, pH 3,5). Reaktio kes-;* 30 keytettiin 60 minuutin kuluttua lisäämällä dinitrosalisyy- : lihappoa (DNS) [Miller, Anal. Chem. 31 (1959) 426 - 428] .

Aktiivisuus (EXU) laskettiin käyttämällä samoissa olosuhteissa määritettyä ksyloosikalibrointisuoraa. Yksi ’ EXU määritellään entsyymimääräksi, joka tuottaa 1 μπιοί 23 113878 pelkistäviä ksyloosisokeriekvivalentteja/minuutti edellä kuvatuissa olosuhteissa.

Lichenaasiaktiivisuus (BGLU) määritettiin mittaamalla β-glukaaniliuoksen viskositeetin lasku.

5 β-glukaani (5 g) liuotettiin 100 ml:aan K-fosfaat-

tipuskuria (50 mmol/1, pH 6,5) kuumentaen korkeintaan lämpötilaan 100 °C. Subtraattiliuos laitettiin jäähdyttyään vesihauteeseen, jonka lämpötila oli 45 °C. Tasapainottumisen jälkeen lisättiin 2 ml entsyymiliuosta, joka sisälsi 10 0,006 - 0,012 BGLU/ml K-fosfaattipuskurissa (50 mmol/1, pH

6,5), 20 ml:aan substraattiliuosta.

Viskositeetti (ulosvirtausaika sekunteina) mitattiin 3, 6, 9, 12 ja 15 minuutin kuluttua reaktion käynnistymisestä Ubbelhode N°lC:ssä, joka oli tasapainotettu läm-15 pötilassa 45 °C (Tt) . β-glukaaniliuoksen alkuviskositeetti (TQ) mitattiin, kun oli lisätty 2 ml K-fosfaattipuskuria (50 mmol/1). Mitattiin β-glukaaniliuoksen viskositeetin maksimilasku (Tm) inkuboimalla vähintään 1 tunti lämpötilassa 45 °C entsyymipitoisuuden ollessa 2,5 BGLU/ml.

20 Laskettiin kulmakerroin K (s"1) käyrältä, joka kuvaa inkubontiaikaa X:n funktiona, jossa X lasketaan kunkin . : mittauksen kohdalla kaavasta (T - T )/(T* - T ) .

Aktiivisuus (BGLU/g tai BGLU/ml) lasketaan käyttä-mällä kaavaa (K-ll)/C, jossa 11 = (20 ml + 2 ml)/2 ml; C = ” 25 näytteen konsentraatio (g/ml tai ml/ml) ,- 1 BGLU = entsyy- */ mimäärä, joka pystyy muuttamaan näennäistä nopeusvakiota 1 s'1.

* » · v ' Alkalinen mannanaasi -aktiivisuus (yksikkönä AMY = alkalinen mannanaasi -yksikkö) määritettiin seuraavalla t) ;* 30 menetelmällä; inkuboitiin hankitusta mannanaasikoostumuk- sesta otettua näytettä 15 minuuttia lämpötilassa 60 °C fosfaattipuskurissa (50 mmol/1, pH 8,0), joka sisälsi ".[[ 0,25 % guarkumia (Sigma). Tämän inkuboinnin jälkeen määri- *;·’ tettiin pelkistävä sokeri dinitrosalisyylihapolla (DNS) : 35 Millerin mukaisesti [Anal. Chem. 31 (1959) 426 - 428]. 1 24 113878 AMU määritellään entsyymimääräksi, joka pystyy tuottamaan 1 μτηοΐ pelkistäviä mannaasisokeriekvivalentteja minuuttia kohden.

Viskositeettiin vaikuttava ksylanaasiaktiivisuus 5 (yksikkönä XVU) määritetään mittaamalla ksylaaniliuoksen viskositeetin lasku. Ksylaani (8 g) liuotettiin 200 ml-.aan tislattua vettä. pH säädettiin arvoon 4,7 käyttämällä 50-prosenttista etikkahappoliuosta. Ksylaaniliuosta sentrifu-goitiin 10 minuuttia kierrostaajuudella 4 000 min 1 ja su-10 pernatantti käytettiin substraattiliuoksena.

Substraattiliuos laitettiin vesihauteeseen, jonka lämpötila oli 42 °C. Tasapainon asetuttua lisättiin 2 ml entsyymiliuosta, joka sisälsi 0,6 - 1,0 XVU/ml, 20 ml:aan substraattiliuosta.

15 Viskositeetti (ulosvirtausaika sekunteina) mitat tiin 3, 6, 9, 12 ja 15 min:n kuluttua reaktion käynnistymisestä Ubbelhode N°lC:ssä, joka oli tasapainotettu lämpötilassa 42 °C (Tt) . Ksylaani liuoksen alkuviskositeetti (T0) mitattiin, kun oli lisätty 2 ml tislattua vettä. Mitattiin 20 ksylaaniliuoksen viskositeetin maksimilasku (Tm) inkuboi-malla vähintään 1 tunti lämpötilassa 42 °C entsyymipitoi- : suuden ollessa 100 XVU/ml.

» » _ 1

Laskettiin kulmakerroin K (min ) käyrältä, joka 1”^ kuvaa inkubointiaikaa X:n funktiona, jossa X lasketaan 25 kunkin mittauksen kohdalla kaavasta (T - T)/(T, - TJ .

_· Aktiivisuus (XVU/ml tai XVU/g) lasketaan käyttämäl- *·’ lä kaavaa (K· 11) / (5 · C) , jossa 11 = (20 ml + 2 ml)/2 ml; V C = näytteen konsentraatio (g/ml tai ml/ml) ; 5 = 5 min (katso määritelmä): 1 XVU = entsyymimäärä, joka pystyy 3 0 muuttamaan näennäistä nopeusvakiota 5 s'1.

: Ksylanaasiaktiivisuus (yksikkönä XU) määritettiin '. käyttämällä avoinna olevan patenttihakemuksen PCT/EP94/ / 04 312 esimerkissä 1 (menettely 1) kuvattua analyysimenet- ;·’ telyä. Substraattina käytettiin kauraspelttiä. pH oli 7, • 35 ja lämpötila oli 65 °C.

• » * 25 113878 3.6.1 Ksylanaasitestit

Tehtiin Azo-Wheat-ArabinoxylanR-tahroja puuvillakankaille (EMPA, tuotenumero 221) edellä kuvatulla tavalla. Kankaat pestiin edellä kuvatulla tavalla lämpötilassa 5 40 °C. Puhdistuskykyarvot laskettiin heijastuskykymittaus ten tuloksista. Pesutestien puhdistuskykytulokset esitetään taulukossa 3 LIQUID TIDER:n ja taulukossa 4 ARIEL ULTRAr:n ollessa kyseessä.

10 Taulukko 3

Puhdistuskykytulokset Liquid Tidellä1 tehdyn pesutestin j älkeen

Koe Entsyymiak- Puhdis- tiivisuus/ml tuskyky 15 -;-

Ilman entsyymiä _ 0,43

MaxataseR (proteaasi, Gist-brocades) 20 DU / 0,48 ja MaxamylR (amylaasi, Gist-brocades) 0,27 TAU A. tubigensis -peräinen ksylanaasi 10,0 EXU 0,67 20 D. dimorphosporum -peräinen 0,3 XVU 0,59 ksylanaasi : KEX301-peräinen ksylanaasi 3,2 XU 0,65 , . TG53-peräinen xyn D -ksylanaasi 11,8 XU 0,69 25 Kuten lienee selvää edellä olevien tulosten perus- teella, ksylanaasit saavat aikaan parannettuja pesutulok-siä jopa proteaasia ja amylaasia sisältävään pesuaineeseen '»' 1 verrattuna.

Y \ 26 113878

Taulukko 4

Puhdistuskyky Ariel Ultralla11 tehdyn pesun jälkeen

Koe Entsyymiak- Puhdis- tiivisuus/ml tuskyky 5---

Ilman entsyymiä _ 0,44 KEX301-peräinen ksylanaasi 3,2 XU 0,56 TG53-peräinen xyn D -ksylanaasi 11,8 XU 0,48 D. dimorphosporum -peräinen 0,3 XVU 0,47 10 ksylanaasi 3.6.2

Toistettiin kohdan 3.6.1 mukainen Liquid TideR:llä tehty koe pesulämpötilassa 25 °C. Tämän kokeen tulokset 15 esitetään taulukossa 5.

Taulukko 5

Puhdistuskyky Azo-Wheat-ArabinoxylanillaR liatulla puuvillalla Liquid TidelläR lämpötilassa 25 °C tehdyn pesutestin 20 jälkeen

Aktiivi- Puhdis- : suus/ml tuskyky

Ilman entsyymiä 0,49 ; 25 A. tubigensis -peräinen ksylanaasi 10,0 EXU 0,72 1 D. dimorphosporum -peräinen 0,3 XVU 0,58 » ksylanaasi KEX301-peräinen ksylanaasi 3,2 XU 0,65 TG53-peräinen xyn D -ksylanaasi 11,8 XU 0,70 ’ 30 3.6.3

Ksylanaaseja testattiin vielä edelleen Laundero- ; meter-pesutestissä. Puuvillakankaita (EMPA, tuotenumero 221) , joiden mitat olivat 5x5 cm, liattiin Azo-Wheat- 35 ArabinoxylanillaR edellä kuvatulla tavalla. Kankaita pes- 27 113878 tiin Launderometer-laitteessa 20 minuuttia lämpötilassa 38 °C. Pesuaineena käytettiin Tide PowderiaR. Pesumenette-lyn aikana oli läsnä ruostumattomia teräskuulia (15) ja 2 puhdasta tilkkua (EMPA, tuotenumero 221), joiden mitat 5 olivat 10 x 10 cm, todellisten pyykipesuolosuhteiden jäljittelemiseksi. Pesun jälkeen kankaat ilmakuivattiin ja mitattiin testikankaan heijastuskyky Photovolt-fotometril-lä, malli 577, joka oli varustettu vihersuodattimella. Puhdistuskyky laskettiin näiden heijastuskykymittausten 10 tuloksista esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Puhdistusky-kytulokset esitetään taulukossa 6.

Taulukko 6

Puhdistuskyky Azo-Wheat-ArabinoxylanillaR liatulla puuvil-15 lalla Tide PowderillaR Launderometer-laitteessa (38 °C) tehdyn pesun jälkeen

Aktiivi- Puhdis-suus/ml tuskyky 20 Ilman entsyymiä 0,39 KEX301-peräinen ksylanaasi 1,6 XU 0,51 3.6.4

Ksylanaasia testattiin lisäksi käyttämällä testiä, 25 jossa tehtiin tahranpoisto ennen pesua. Azo-Wheat-Arabino- xylanR-tahroja tehtiin puuvillakankaille (EMPA, tuotenumero *;··* 221) edellä kuvatulla tavalla. Tahraiselle puuvillalle V * levitettiin tietty määrä entsyymiaktiivisuutta [1 ml ent syymin liuosta sitraattipuskurissa (50 mmol/1, pH 5,5)] ja 3 0 inkuboitiin 3 0 minuuttia suunnilleen lämpötilassa 2 0 °C.

: Tämän inkuboinnin jälkeen kankaat pestiin kohdassa 3.6.3 kuvatulla tavalla Launderometer-laitteessa Tide PowderillaR lämpötilassa 38 °C. Puhdistuskykytulokset esitetään taulu-;· kossa 7.

0 35 i » » 28 113878

Taulukko 7

Puhdistuskyky Azo-Wheat-ArabinoxylanillaR liatulla puuvillalla ksylanaaseilla tehdyn tahranpoiston ja TidePowderil-laR lämpötilassa 38 °C tehdyn pesun jälkeen 5 Aktiivi- Puhdis- suus tuskyky

Ilman entsyymiä _ 0,56 A. tubigensis -peräinen ksylanaasi 250 EXU 0,63 10 Endoksylanaasi I 527 EXU 0,70

Ksylanaasit saavat aikaan parannettuja pesutuloksia, jos niitä käytetään ennen pesua levitettävässä tah-ranpoistokoostumuksessa.

15 3.7.1 Lichenaasitesti

Tehtiin Azo-Barley-GlucanR-tahroja puuvillakankaille (EMPA, numero 221). Kankaat pestiin Liquid TidellaR edellä kuvatulla tavalla lämpötilassa 40 °C. Puhdistuskykyarvot laskettiin heijastuskykymittausten tuloksista edellä kuva-20 tulla tavalla. Pesutestien puhdistuskykytulokset esitetään taulukossa 8.

• I »

I I

Taulukko 8 - Puhdistuskyky Liquid TidellaR tehdyn pesun jälkeen 25 Koe Entsyymiak- Puhdis- tiivisuus/ml tuskyky t

Ilman entsyymiä 0,41

MaxataseR yhdessä 2 0 DU / 0,47

30 MaxamylinR kanssa 0,27 TAU

B. amyloliquefaciens -peräinen 4,5 BGLU 0,68 lichenaasi t t ' t » 29 113878 3.7.2

Lichenaaseja testattiin lisäksi Launderometer-ko-keessa. Puuvillakankaita (EMPA, tuotenumero 221), joiden mitat olivat 5x5 cm, liattiin Azo-Barley-GlucanillaR 5 edellä kuvatulla tavalla. Kankaita pestiin Launderometer-laitteessa 20 minuuttia lämpötilassa 38 °C. Pesuaineena käytettiin Tide PowderiaR. Pesumenettelyn aikana oli läsnä ruostumattomia teräskuulia (15) ja 2 puhdasta tilkkua (EMPA, tuotenumero 221), joiden mitat olivat 10 x 10 cm, 10 todellisten pyykipesuolosuhteiden j älj ittelemiseksi . Pesun jälkeen kankaat ilmakuivattiin ja mitattiin testikankaan heijastuskyky Photovolt-fotometrillä, malli 577, joka oli varustettu vihersuodattimella. Puhdistuskyky laskettiin näiden heijastuskykymittausten tuloksista esimerkissä 2 15 kuvatulla tavalla. Puhdistuskykytulokset esitetään taulu kossa 9.

Taulukko 9

Puhdistuskyky Azo-Barley-GlucanillaR liatulla puuvillalla 20 Tide PowderillaR Launderometer-laitteessa lämpötilassa 38 °C tehdyn pesun jälkeen : Aktiivi- Puhdis- :> suus/ml tuskyky » 25 Ilman entsyymiä 0,61 • B. amyloliquefaciens -peräinen 2,25 BGLU 0,69 lichenaasi i >

Kuten edellä esitetystä ilmennee, lichenaasi saa 30 aikaan parannettuja pesutuloksia.

3.8.1 Mannanaasitestit

Mannanaasitesti tehtiin käyttämällä Congo Red -vä- • a ;;; riaineella värjättyjä guarkumitahroja. Tahrat tehtiin la- ;·’ sille ja pesu toteutettiin lämpötilassa 40 °C Calgonit 35 FlussigR -pesuaineella edellä kuvatulla tavalla. Raati ar- 30 113878 vioi pesukokeiden tulokset [mitä enemmän miinuksia (-), sitä likaisempi, mitä enemmän plussia (+), sitä puhtaampi] . Katso taulukko 10.

5 Taulukko 10

Mannanaasien toimintakyky guarkumilla liatulla lasilla Koe Arvosana Aktiivisuus/ml

Ennen pesua --- --- 10 Ilman entsyymiä --- ---

Galaktomannanaasi SumizymeR ACH ++ 3,9 U

Mannanaasi MegazymeR ++ 0,8 U

3.8.2 15 Koe toistettiin salaatinkastikkeella (Thousand

IslandsR) liatulla lasilla. Tämän kokeen tulokset esitetään taulukossa 11.

Taulukko 11 20 Mannanaasien toimintakyky salaatinkastikkeella liatulla lasilla Cagonit Flussigillä* lämpötilassa 40 °C tehdyn pe- .·, ; sun jälkeen • ·

Aktiivisuus/ml Arvosana 2 5 Ilman entsyymiä --- --- • Galaktomannanaasi SumizymeR ACH 3,9 U ++ 3.8.3

Mannanaaseja testattiin myös pyykinpesukokeissa.

30 Polyesterikankaita (EMPA, tuotenumero 407) tahrattiin man- ; naanipitoisella salaatinkastikkeella (Thousand IslandsR) .

t Kankaat pestiin edellä kuvatulla tavalla lämpötilassa ; 40 °C. Pesukokeiden puhdistuskykytulokset esitetään taulu- kossa 12.

V: 35 31 113878

Taulukko 12

Puhdistuskyky polyesterillä Liquid TidellaR tehdyn pesun (20 min, 40 °C) jälkeen

Koe Entsyymiak- Puhdis- 5 tiivisuus/ml tuskyky

Ilman entsyymiä --- 0,53

Galaktomannanaasi SumizymeR ACH 3,9 U 0,65

Alkalinen mannanaasi 0,001 AMU 0,84 10 3.8.4

Galaktomannanaasia testattiin kokeessa, jossa tehtiin tahranpoisto ennen pesua. Tässä kokeessa käytimme puuvillakankaita (EMPA, tuotenumero 221, 5x5 cm), jotka 15 oli liattu salaatinkastikkeella (Thousand Islands11) . Tahraiselle puuvillalle levitettiin 97 U SumizymeR ACH:ta [1 ml entsyymin liuosta sitraattipuskurissa (50 mmol/1, pH

7)] ja inkuboitiin 30 minuuttia suunnilleen lämpötilassa 20 °C. Inkuboinnin jälkeen kankaat pestiin esimerkissä 20 3.6.3 kuvatulla tavalla Launderometer-laitteessa Tide

PowderillaR lämpötilassa 38 °C.

. : Puhdistuskykytulokset esitetään taulukossa 13.

» . ·

Taulukko 13 25 Puhdistuskyky salaatinkastikkeella liatulla puuvillalla galaktomannanaasilla tehdyn tahranpoiston ja Tide PowderillaR Launderometer-laitteessa lämpötilassa 38 °C ' tehdyn pesun jälkeen

Aktiivi- Puhdis- , , ‘ 3 0 suus tuskyky " -> Ilman entsyymiä 0,75 1 Galaktomannanaasi SumizymeR ACH 97 U 0,83 Ί13878 32

Kuten lienee ilmeistä edellä esitetyistä tuloksista, joita on saatu mannanaasilla konetiski-, pyykinpesuja tahranpoistokokeissa, mannanaasit saavat aikaan parannettuja pesutuloksia.

5 Esimerkki 4

Tehtiin puuvillakankaille tahroja käyttämällä Azo-Wheat -ArabinoxylaninR ja Azo-Barley-GlucaninR (molemmat hankittu Megazymestä) seoksia esimerkissä 3 kuvatulla tavalla. Kankaita pestiin (käyttämällä esimerkin 3.2 mukais-10 ta testijärjestelmää) 20 minuuttia lämpötilassa 40 °C käyttämällä pesuaineena Liquid TideaR (annostus 1 g/1 pesuainetta, GH = 5). Puhdistuskyky laskettiin heijastuskyky-mittausten tuloksista esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Puhdistuskykytulokset esitetään taulukossa 14.

15

Taulukko 14

Puhdistuskyky Azo-Wheat-Arabinoxylanin* ja Azo-Barley-Glu-caninR seoksella liatulla ja yhdellä entsyymillä tai ent-syymiseoksella pestyllä puuvillalla 20 Aktiivi- Puhdis- suus/ml tuskyky

Ilman entsyymiä --- 0,47 “!! KEX301-peräinen ksylanaasi 3,2 XU 0,59 i 25 B. amyloliguefaciens -peräinen 4,5 BGLU 0,65 lichenaasi KEX301-peräinen ksylanaasi + 3,2 XU + 0,79

’ B. amyloliquefaciens -peräinen 4,5 BGLU

lichenaasi 30

Esimerkki 5

Koe, jossa tehtiin tahranpoisto ennen pesua, toteu-tettiin käyttämällä CFT-puuvillatilkkuja NR. CS-8, joiden pinta-ala oli 25 cm2 (nämä ovat ruohotahroilla liattuja 35 standarditilkkuja, ja niitä myy CFT). Tahraiselle puuvil-

I » I

33 113878 lalle levitettiin 112 BGLU B. amyloliquefaciens -peräistä lichenaasia [1 ml entsyymin liuosta sitraattipuskurissa (50 mmol/1, pH 7,0)] ja inkuboitiin 30 minuuttia suunnilleen lämpötilassa 20 °C. Tämän inkuboinnin jälkeen kankai-5 ta pestiin Launderometer-laitteessa 20 minuuttia lämpötilassa 38 °C käyttämällä pesuaineena Tide PowderiaR. Pesume-nettelyn aikana oli läsnä ruostumattomia teräskuulia (15) ja 2 puhdasta tilkkua (EMPA, tuotenumero 221), joiden mitat olivat 10 x 10 cm, todellisten pyykipesuolosuhteiden 10 jäljittelemiseksi. Pesun jälkeen kankaat ilmakuivattiin ja mitattiin testikankaan heijastuskyky Photovolt-fotometril-lä, malli 577, joka oli varustettu vihersuodattimella. Puhdistuskyky laskettiin näiden heijastuskykymittausten tuloksista esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Puhdistuskyky-15 tulokset esitetään taulukossa 15.

Taulukko 15

Puhdistuskyky CFT CS-8 -tilkuilla entsyymeillä tehdyn tah-ranpoiston ja Tide PowderillaR Launderometer-laitteessa 20 tehdyn pesun jälkeen

Aktiivi- Puhdis- : suus tuskyky » · !! Ilman entsyymiä 0,11 25 B. amyloliquefaciens -peräinen 112 BGLU 0,20 * · ’ ' lichenaasi ‘ * Esimerkki 6

Kannasta C11SB.G17 (CBS 480.95) peräisin olevan 3 0 mannanaasin pH-optimi

Mannanaasia saatiin kannasta C11SB.G17 (CBS 480.95) esimerkin 3.4 mukaisesti. Entsyymin pH-optimin määrittämi-seen käytettiin seuraavaa mannanaasiaktiivisuusmittausta.

» ► · i 34 113878

Guarkumiliuoksen (0,5 %) viskositeetin alussa tapahtuvaa laskua käytettiin mittana (endo)mannanaasiaktiivisuudelle eri pH-arvojen vallitessa.

Inkubaatin (60 °C) viskositeetin laskua mitattiin 5 (epä)jatkuvasti erityislaitteella, jota kuvataan seuraa-vassa.

Paineanturi (paine-eroja mittaava laite) liitettiin T-kappaleella Gilson model 22 -näytteenvaihtimen imulin-jaan (polyeteeniletku). Toinen näytteenvaihtimeen tehty 10 muutos oli kapillaarin sijoittamiseen kyseiseen imulin-j aan.

Anturi mittaa painehäviötä imettäessä (jäykkäliik-keistä) liuosta kapillaarin läpi, joka painehäviö korreloi liuoksen viskositeetin kanssa. Mannanaasiaktiivisuuden 15 aiheuttamaa viskositeetin laskua voidaan mitata (epä)jatkuvasti imemällä inkubaattiannoksia kapillaarin läpi.

Näiden mittausten tulokset ilmoitetaan suhteellisena aktiivisuutena ja esitetään taulukossa 16.

20 Taulukko 16

Kannasta C11SB.G17 (CBS 480.95) peräisin olevan mannanaa-.: sin pH-optimi i pH Suhteellinen aktiivisuus 25 7,0 43 » · * : 8,0 62 9,0 100 V : 10,0 60 11,0 19 . 30

Claims (13)

113878

1. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavia aineita: 5 a) pinta-aktiivista ainetta, b) soluseinämän hajottavaa seosta, joka koostuu sellulaasientsyymistä ja pektinaasientsyymistä, c) hemisellulaasientsyymiä, joka on valittu ksy-lanaasin, arabinofuranosidaasin, asetyyliksylaaniesteraa- 10 sin, glukuronidaasin, ferulihappoesteraasin, kumariinihap- poesteraasin, endo-galaktanaasin, mannanaasin, lichenaasin, endo- tai ekso-arabinanaasin, ekso-galaktanaasin tai niiden seosten joukosta, d) muita pesuaineen lisäaineita valittuna builder- 15 aineista, valkaisuaineista, amylaasientsyymeistä, prote- aasientsyymeistä tai niiden seoksista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että sellulaasi on endoglukanaasi, eksoglukanaasi tai beeta-glukosidaasi.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että pektinaasi on pektiiniesteraa- '·,· si, pektiinilyaasi, pektaattilyaasi, eksopolygalakturonaa- » si, endopolygalakturonaasi tai ramnogalakturonaasi.

··. 4. Jonkin edellä olevan patenttivaatimuksen mukai- '! 25 nen koostumus, tunnettu siitä, että hemisellulaasi f · » · on ksylanaasi.

;·’ 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen koostumus, * * · *·' * tunnettu siitä, että ksylanaasi on alkalinen ksy lanaasi . • · · • 30

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että ksylanaasi on ksylanaasi, joka on saatavissa mikro-organismista, edullisesti Aspergillus-, • · i Disporotrichum- tai Bacillus-organismista.

·;*' 7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen koos- • · : : 35 tumus, tunnettu siitä, että hemisellulaasi on man- * ·« · ' ' ·;··: nanaasi. 113878

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että mannanaasi on alkalinen man-nanaasi.

9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen koostumus, 5 tunnettu siitä, että mannanaasi on mannanaasi, joka on saatavissa mikro-organismista, edullisesti kannasta C11SB.G17 (CBS 480.95).

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että hemisellulaasi on 10 lichenaasi.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen koostumus, tunnettu siitä, että lichenaasi on lichenaasi, joka on saatavissa mikro-organismista, edullisesti Bacillus-organismista.

12. Menetelmä likaisen vaatteen tai tekstiilin pe semiseksi, tunnettu siitä, että likainen vaate tai tekstiili saatetaan kosketuksiin minkä tahansa edellä olevan vaatimuksen mukaisen koostumuksen kanssa.

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että pesemiseen liittyy epätoivottavien kasviperäisten jäännösten poisto. * · I · • * · I < · • · • · t I · I I · # » · • · • · • · • · · • · · t I 113878