FI106380B - Menetelmä verihiutaleaggregaatiota ja veritukoksen muodostusta inhiboivan N-[8-[(aminoiminometyyli)amino]-1-okso-oktyyli]-N-L-alfa-aspartyyli-L-fenyylialaniinin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä verihiutaleaggregaatiota ja veritukoksen muodostusta inhiboivan N-[8-[(aminoiminometyyli)amino]-1-okso-oktyyli]-N-L-alfa-aspartyyli-L-fenyylialaniinin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI106380B FI106380B FI913006A FI913006A FI106380B FI 106380 B FI106380 B FI 106380B FI 913006 A FI913006 A FI 913006A FI 913006 A FI913006 A FI 913006A FI 106380 B FI106380 B FI 106380B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- asp
- platelet
- phe
- blood
- platelet aggregation
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C279/00—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
- C07C279/04—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton
- C07C279/14—Derivatives of guanidine, i.e. compounds containing the group, the singly-bound nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups having nitrogen atoms of guanidine groups bound to acyclic carbon atoms of a carbon skeleton being further substituted by carboxyl groups
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
- C07K5/021—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link containing the structure -NH-(X)n-C(=0)-, n being 5 or 6; for n > 6, classification in C07K5/06 - C07K5/10, according to the moiety having normal peptide bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/06—Dipeptides
- C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
- C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
, 106380
Menetelmä verihiutaleaggregaatiota ja veritukoksen muodostusta inhiboivan N-[8-[(aminoiminometyyli)amino]-1-okso-oktyyli]-N-L-alfa-aspartyyli-L-fenyylialaniinin valmistamiseksi 5 Tämä keksintö koskee menetelmää verihiutaleaggregaatiota ja veritukoksen muodostusta inhiboivan N-[8-[ (aminoiminometyyli) amino]-1-okso-oktyyli]-N-L-alfa-aspar-tyyli-L-fenyylialaniinin valmistamiseksi. Uudella pepti- 10 diä jäljittelevällä yhdisteellä on vahva verihiutaleaggre-gaation in vivo inhibiittoriaktiivisuus.
Fibrinogeeni on glykoproteiini, jota on läsnä veriplasmassa sen normaalina osana. Se ottaa osaa verihiutale-aggregaatioon ja fibriinin muodostukseen veren hyytymisme- 15 kanismissa.
Verihiutaleet, joita löytyy kokoverestä, ovat solun osia, jotka myös ottavat osaa veren hyytymiseen. Fibrino-geenin sitoutuminen verihiutaleisiin on tärkeätä verihiutaleen normaalille toiminnalle veren hyytymismekanismissa.
20 Kun verisuoneen tulee vaurio, verihiutaleiden sitoutuminen ' fibrinogeeniin aloittaa aggregoitumisen ja muodostaa veri- '···' tukoksen. Fibrinogeenin reaktio verihiutaleiden kanssa tapahtuu membraaniglykoproteiinikompleksin välityksellä, • · · • V joka kompleksi tunnetaan nimellä gpIIb/IIIa; tämä on tär- 25 keä verihiutaleen toiminnan ominaisuus. Tämän reaktion inhibiittorit ovat käyttökelpoisia verihiutaleiden aiheuttaman veritukoksen muodostuksen moduloinnissa.
.*··. Tiedetään myös, että toinen suuri glykoproteiini • · ,···. nimeltään fibronektiini, joka on pääasiallinen solun ulko- T 30 puolinen matriksiproteiini, reagoi fibrinogeenin ja fib- • · · - · riinin ja muiden rakennemolekyylien, kuten aktiinin, kol- lageenin ja proteoglykaanien, kanssa. Fibronektiinin so- - : luun sitoutuvan domeenin monilla suhteellisen suurilla Τ'. polypeptidifragmenteilla on osoitettu olevan soluun kiin- • Il 35 nittymisen aktiivisuutta. Katso US-patentit 4 517 686; 106380 2 4 589 881 ja 4 661 111. Nämä polypeptidit sisältävät sisäisen aminohapposekvenssin Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS). Samasta molekyylistä peräisin olevien tiettyjen suhteellisen lyhyiden peptidifragmenttien osoitettiin parantavan solun 5 sitoutumista substraattiin silloin, kun oli immobilisoitu substraattiin, tai inhiboivan kiinnittymistä, kuten patenteissa 4 517 686; 4 589 881 ja 4 661 lii. Nämä polypeptidit sisältävät sisäisen aminohapposekvenssin Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS). Samasta molekyylistä peräisin olevien tietty-10 jen suhteellisen lyhyiden peptidifragmenttien osoitettiin parantavan solun sitoutumista substraattiin silloin, kun oli immobilisoitu substraattiin, tai inhiboivan kiinnittymistä silloin, kun oli liuotetussa tai suspendoidussa muodossa. Katso US-patentit 4 578 079 ja 4 614 517. Näiden 15 peptidien määritettiin olevan muotoa X-Arg-Gly-Asp-R-Y jossa X = H tai aminohappo, R = Thr tai Cys; ja muotoa
, 20 X-Arg-Gly-Asp-Ser-Y
jossa X = H tai aminohappo, '···* Y = OH tai aminohappo.
US-patentissa 4 683 291 verihiutaleen toiminnan • inhibitio on kuvattu tapahtuvan synteettisillä peptideil- 25 lä, jotka oli suunniteltu olemaan korkea-affiniteettisia antagonisteja fibrinogeenin sitoutumiselle verihiutaleisiin. Näillä synteettisillä peptideillä on C-päässä jopa .···, 16 aminohappotähdettä, joissa on • · ,···. Arg-Gly-Asp-Val tai 30 Arg-Gly-Asp-Ser.
• M
:...· Samanlaiset synteettiset peptidit, jotka sisältävät «
Arg-Gly-Asp sekvenssin, ja niiden käytön f ibrinogeenin :.·. verihiutaleisiin sitoutumisen inhibiittoreina ovat kuvan- « « · .·] ; neet Koczewiak et ai., Biochem. 23, 1767 - 1774 (1984); 35 Plow et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 82., 8057 - 8061 3
'.CCiXO
(1985) ; Ruggeri et ai., samassa paikassa 83. 5708 - 5712 (1986) ; Ginsberg et ai., J. Biol. Chem. 260 (7), 3931 -3936 (1985); Haverstick et ai., Blood 66 (4), 946 - 952 (1985) ja Ruoslahti ja Pierschbacher, Science 238. 491 - 5 497 (1987). Vielä muita sellaisia inhibitorisia peptidejä on kuvattu EP-patenttihakemuksissa 275 748 ja 298 820.
US-patentissa 4 857 508 on kuvattu tietyt uudet tetrapeptidijohdannaiset, joilla on parantuneet verihiuta-leaggregaation inhibiittoriaktiivisuudet. Nämä tetrapepti-10 dijohdannaiset sisältävät sekvenssin X-Gly-Asp-Y, jossa X ja Y on määritelty sisältävän monia orgaanisia osia. Kuvaava suositeltava esimerkki on Arg-Gly-Asp-(0-metyyli-Tyr)-NHZ.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti esitetään uusi 15 peptidiä jäljittelevä yhdiste, jolla on vahva verihiutale-aggregaation inhibiittoriaktiivisuus in vivo. Tämän inhibiittorin uskotaan toimivan vastustamalla fibrinogeenin ja/tai solun ulkopuolisten matriksiproteiinien ja verihiutaleen gplIb/IIIa reseptorin välistä reaktiota. Tämän kek-20 sinnön mukaisella uudella inhibiittoriyhdisteellä on gua- nidiinoryhmä N-päässä, pseudopeptidi tai peptidiä jäljit-• televä sidos ketjussa ja fenyylialaniiniryhmä C-päässä.
*...· Tämä peptidiä jäljittelevä yhdiste voidaan esittää seuraa- • valla kemiallisella kaavalla:
;J 25 XOOH
: 0 p /L nhh cooh M 8‘ 6’ 4' 2· ^H Hl! NH 042 L2 30 I 1 6 5 • · 1 i : .·. Sen systemaattinen nimi on N-[8-[ (aminoiminometyy- · li) amino]-l-okso-oktyyli] -N-L-alf a-aspartyyli-L-f enyyli- 35 alaniini, mutta siihen viitataan mukavuuden vuoksi tästä 4 106380 lähtien nimellä 8-guanidiino-oktanoyyli-aspartyyli-fenyy-lialaniini tai lyhennetyllä muodolla 8-GO-Asp-Phe.
Keksinnön mukaisella uudella peptidiä jäljittelevällä yhdisteellä 8-GO-Asp-Phe osoitetaan olevan huomatta-5 va verihiutaleaggregaation inhibiittoriaktiivisuus seuraa-vien tulosten, jotka saatiin eri iji vitro ja in vivo kokeista, perusteella:
Se inhiboi suoraan I-flbnnogeenin sitoutumista trombiinilla aktivoituihin ihmisen verihiutaleisiin.
10 Se inhiboi ihmisen ja koiran verihiutaleaggregaa- tiota in vitro. joka aggregaatio on stimuloitu eri aineilla: trombiinilla, kollageenilla, ADP:llä.
Se indusoi jatkuvan verihiutaleiden vastaisen vaikutuksen jatkuvan laskimonsisäisen infuusion aikana.
15 Sillä on suhteellisen lyhyt toiminta-aika, joka sallii nopean verihiutaleen vastaisten vaikutusten lopettamisen, jos kliininen tilanne vaatii sitä.
Sillä ei ole mitään vaikutuksia ihmisen neutrofii-lin elastaasin vapautumiseen tai degranulaatioon.
20 Siltä puuttuu akuutit hemodynaamiset tai elektro- ' kardiografiset vaikutukset koirissa infuusionopeuksilla, t | r jotka ovat 10 kertaa korkeammat kuin ne, joita vaaditaan saavuttamaan verihiutaleaggregaation 90 % inhibitio tällä : lajilla.
25 Siltä puuttuu vaikutukset hiiren CNS:ään aikapis- .•j·. teissä 0,5, 1, 2 ja 24 tuntia yhdisteannoksen antamisen jälkeen, joka annos on 20 kertaa suurempi kuin rotan veri-... hiutaleen vastainen ED—.
• · jU
• · II! Kun verrataan läheiseen yhdisteeseen 8-guanidiino- « · **'* 30 oktanoyyli-Asp-2-(4-metoksifenyyli)-etyyliamidi (8-G0- • t *
Asp-MPE), joka on kuvattu US-patentissa 4 879 313, havai-*: *: taan, että uudella yhdisteellä 8-GO-Asp-Phe on odottamat- . tomasti oleellisesti kohonnut liukoisuus ja vahvuus. Yh- • i « "/ diste 8-GO-Asp-Phe on yllättävästi noin 5-15 kertaa vah-
• t I
106380 5 vempi in vivo ja noin 5 kertaa aktiivisempi in vivo kuin yhdiste 8-GO-Asp-MPE.
Edellämainittuihin koetuloksiin perustuen uskotaan, että yhdiste 8-GO-Asp-Phe on käyttökelpoinen monissa tera-5 peuttisissa käsittelyissä, esimerkiksi estettäessä uusi tukkeutuminen, joka seuraa sellaisten uusien kanavointime-netelmien, kuten fibrinolyyttisen terapian, trombolyytti-sen terapian, verisuoniplastiikan ja sepelvaltimon ohitusleikkauksen jälkeen. Muita mahdollisia käyttöjä ovat sy-10 dänlihaksen infarktin, uusiutuvan sydänlihaksen infarktin, epästabiilin angiinan, perifeerisen valtimotaudin, aivojen paikallisen verettömyyden, halvauksen ja verihiutaleiden hyperaggregoitumistautien ehkäiseminen ja veren dialysoin-nin sivuvirtausmenetelmissä tapahtuvan tukkeutuman ehkäi-15 seminen ja valtimon kovetustaudin edistymisen ehkäiseminen.
Uuden yhdisteen 8-GO-Asp-Phe on myös havaittu lyhentävän oleellisesti uuteen perfuusioon kuluvaa aikaa ja pidentävän oleellisesti tukkeutuman uudelleen muodostuk-20 seen kuluvaa aikaa sen jälkeen, kun verihyytymä on hajotettu antamalla koirille trombolyyttistä ainetta t-PA.
« · « Näin ollen yhdiste on käyttökelpoinen trombolyyttisissä terapioissa annettaessa yhtäaikaa t-PA:n kanssa.
• · *···1 Samalla, kun selitysosa yhdessä patenttivaatimusten • · · : V 25 kanssa korostaa erikoisesti ja erikseen vaatii sitä asia-sisällystä, joka muodostaa esillä olevan keksinnön, usko- • · · ; taan, että keksintö on helpompi ymmärtää seuraavasta kek sinnön suositeltavien suoritustapojen yksityiskohtaisesta ;***; kuvauksesta yhdistämällä siihen liitetyt piirrokset, jois- • 1 · .··1, 3 0 sa kuviot ovat graafisia esityksiä seuraavasti: • · ·
Kuvio 1 esittää fibrinogeenin sitoutumisen inhibi- • · *···1 tion ihmisen pestyihin verihiutaleisiin inhibiittoreilla 8-GO-Asp-Phe (lH), 8-GO-Asp-MPE (MD ja RGDS (X), jossa f ibrinogeenin sitoutumisprosentti verrattuna kontrolliin • « • · · 106380 6 (ilman inhibiittoria) on esitetty graafisesti inhibiittorin molaarista konsentraatiota (M) vastaan.
Kuvio 2 esittää ADP:llä indusoidun verihiutaleagg-regaation inhibition ihmisen verihiutalerikkaassa plasmas-5 sa yhdisteillä 8-GO-Asp-Phe (| j) ja 8-GO-Asp-MPE (Μβ , jossa verihiutaleen aggregaatioprosentti verrattuna kontrolliin (ilman inhibiittoria) on esitetty graafisesti inhibiittorin molaarista konsentraatiota (M) vastaan.
Kuvio 3 esittää kollageenin indusoiman verihiutale-10 aggregaation inhibition koiran verihiutalerikkaassa plas massa yhdisteillä 8-GO-Asp-Phe (| i) ja 8-GO-Asp-MPE (M) esitettynä graafisesti kuten kuviossa 2.
Kuvio 4 esittää trombiinilla indusoidun verihiuta-leaggregaation inhibition pestyissä ihmisen verihiutaleis-15 sa yhdisteillä 8-GO-Asp-Phe ([ i) ja 8-GO-Asp-MPE (Mi) esitettynä graafisesti kuten kuviossa 2.
Kuvio 5 esittää kollageenilla indusoidun verihiuta-leniukkuuden inhibition rotassa seuraavilla inhibiittoreilla 8-GO-Asp-Phe (£□) , 8-GO-Asp-MPE (Mi) ja RGDS (X) , 20 jossa verihiutaleniukkuuden inhibitioprosentti (verihiuta- , leiden määrän väheneminen) verrattuna kontrolliin (ilman inhibiittoria) on esitetty graafisesti inhibiittoriannosta ' (mg/kg) vastaan.
Kuvio 6 esittää kollageenilla indusoidun verihiuta- • V 25 leniukkuuden inhibition aikakäyrän rotassa yhdisteillä 8-GO-Asp-Phe (IHj) ja 8-GO-Asp-MPE () , jossa inhibitio-prosentti on esitetty graafisesti aikaa (min) vastaan.
Kuvio 7 esittää yhdisteiden 8-GO-Asp-Phe fi—p ja .···, 8-GO-Asp-MPE (M|) laskimonsisäisen kerta-annoksen vaiku- • · ,···. 30 tuksen kollageenilla ex vivo indusoidun verihiutaleaggre- *·* gaation inhibitioon koirissa, jossa verihiutalenäytteen • · · inhibitioprosentti verrattuna kontrolliin (ilman inhibiit-' 1 toria) on esitetty graafisesti inhibiittoriannosta (mg/kg) : vastaan.
« I
< t « 106380 7
Kuvio 8 esittää yhdisteiden 8-GO-Asp-Phe (\—i) ja 8-GO-Asp-MPE () laskimonsisäisen infuusion vaikutuksen kollageenilla ex vivo indusoituun verihiutaleaggregaatioon koirilla esitettynä graafisesti kuten kuviossa 7.
5 Kuvio 9 esittää yhdisteen 8-GO-Asp-Phe vaikutuksen uuteen perfuusioon (hajoaminen) ja uudelleen tukkeutumiseen ajan (min) funktiona, kun koirille on annettu yhtäaikaa t-PA:ta verrattuna kontrolliin (ilman yhdistettä 8-GO-Asp-Phe) ja ASA:an.
10 Verihiutaleaggregaation inhibiittoriyhdiste 8-GO-
Asp-Phe voidaan valmistaa erilaisilla tavanomaisilla menetelmillä. Näin ollen se voidaan valmistaa kiinteä- ja liuosfaasimenetelmillä, jotka ovat analogisia menetelmille, jotka on kuvattu US-patentissa 4 879 313 8-guanidiino-15 oktanoyyli-Asp-2-(4-metoksifenyyli)etyyliamidin (8-GO-Asp-MPE) valmistamiseksi paitsi, että C-pään 4-metoksife-nyylietyyliamidi korvataan fenyylialaniinilla.
Eräässä käyttökelpoisessa menetelmässä verihiutaleaggregaation inhibiittoriyhdiste 8-GO-Asp-Phe syntetisoi-20 tiin liittämällä 8-guanidiino-oktaanihappo aspartyylife-nyylialaniinimetyyliesterin (aspartaami) kanssa, jonka jälkeen metyyliesteri saippuoitiin natriumhydroksidi11a. Tuote kiteytettiin kylmästä vesipitoisesta metanolista (pH
« « 4,0) ja sen jälkeen kiteytettiin uudelleen vesipitoisesta : 25 metanolista kokonaissaannon ollessa 73 %. Laboratorioval- misteissa 8-guanidiino-oktaanihappo valmistettiin joko an- ♦ · · : tamalla 8-amino-oktaanihapon reagoida 3,5-dimetyylipyrat- soli-l-karboksiamidiinin kanssa tai guanidiinista ja 8-bromioktaanihaposta.
• m .···. 30 Vaikka tässä on kuvattu tuotannon spesifiset mene- *·" telmät, on ymmärrettävä, että tämän keksinnön mukainen yhdiste 8-GO-Asp-Phe ei ole rajoittunut mihinkään spesi-fiseen tuotantomenetelmään.
• · « s 106380
Seuraavat esimerkit kuvaavat edelleen keksintöä yksityiskohtaisemmin, vaikka on ymmärrettävä, että keksintö ei ole rajoittunut näihin spesifisiin esimerkkeihin. Esimerkki 1 5 A. 8-guanidiino-oktaanihappo (8-GO) 3,5-dimetyylipyratsoli-l-karboksiamidiini (100 g; 0,5 moolia) ja N,N-di-isopropyylietyyliamiini (DIEA) (65 g; 0,5 moolia) suspendoitiin dioksaaniin (300 ml) ja veteen (115 ml) . Seokseen lisättiin 8-amino-oktaanihappoa 10 (48 g; 0,3 moolia) sekoittaen. Sitten väritöntä liuosta kuumennettiin palautusjäähdyttäen 2 vuorokautta. Tuote suodatettiin ja pestiin vedellä (3 x 50 ml).
Kuivattu materiaali painoi 60 g; FAB-MS: (M+H) = 202 .
15 B. 8-guanidiino-oktaanihappo-HC1 (8-GOHC1) 8-GO-HC1 valmistettiin lyofilisoimalla 8-GO, joka oli liuotettu yhteen ekvivalenttiin 0,1 M HCl:oa. Esimerkki 2 8-guanidiino-oktaanihappoHC1 (39 g; 195 mmoolia), 20 disukkinimidyylikarbonaatti (50 g; 195 mmoolia) ja 4-dime- ,·. tyyliaminopyridiini (2 g) liuotettiin pyridiini/DMF:ään « < < !!! (1:2; 350 ml). Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpötila lassa yli yön. Tähän voimakkaasti sekoitettuun liuokseen lisättiin suspensio, jossa oli Asp-Phe-OMe: iä (50 g; 169 I I t ; <' 25 mmoolia) ja natriumbikarbonaattia (15 g; 169 mmoolia) ve- dessä (150 ml). Liitäntäreaktio oli täydellinen 20 tunnin • · « ·.· ; kuluttua määritettynä analyyttisellä HPLC analyysillä.
Seos haihdutettiin in vacuo öljymäiseksi tähteeksi, joka liuotettiin metanoliin (150 ml) . Tähän liuokseen (350 ml) ·*": 30 lisättiin 2,5 N NaOH:ia (280 ml) sekoittaen jäähauteessa « · · ja sekoitusta jatkettiin 5 tuntia, jossa vaiheessa reak- • · tioseos säädettiin happamaksi pH 4: ään 4 N HCltlla (185 ml). Tuloksena syntynyttä liuosta jäähdytettiin kiteytyk-: sen aikaansaamiseksi ja kiinteä tuote kerättiin suodatta- 35 maila ja ilmakuivattiin. Tuote liuotettiin veteen (1 lit- 106380 9 ra) lämmittämällä varovasti ja lisättiin metanolia (400 ml) , kunnes saatiin kirkas liuos. Tuote kiteytyi, kun jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja se kerättiin suodattamalla. Tämä materiaali kuivattiin in vacuo fosforipentok-5 sidin yllä saaden 64 g tuotetta 8-GO-Asp-Phe.
Osa kiteisestä tuotteesta puhdistettiin preparatii-visella käänteisfaasikromatografiällä sen analyyttistä karakterisoimista varten.
Preparatiivinen käänteisfaasikromatografia suori-10 tettiin Waters Prep LC-3000 -laitteistolla käyttäen 4,5 x 30 cm pylvästä (15 - 20 μ partikkelikoko, μ-Bondapak) . 0,5 g näyte yhdistettä 8-GO-Asp-Phe, joka oli liuotettu 10 ml kyllästettyä NaHC03:ia, lisättiin pylvääseen ja alistettiin liuotingradientille, joka oli 5 - 20 % CH3CN (0,05 % TFA) , 15 30 minuutin ajaksi virtausnopeudella 80 ml/minuutti. Tuo tetta sisältävät fraktiot yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Tuotteen saanto oli noin 90 %.
Analyyttinen HPLC (Vydac C-18 -pylväs, 300 Ä huokoskoko; 15 - 40 % CHjCN/HgO/0,05 % TFA-gradientti 25 mi-20 nuutin ajan, virtausnopeus 1,5 ml/minuutti) UV detektiolla 215 nm:11a paljasti tuotteen, joka muodosti 99 % UV absor- t < hoivasta materiaalista.
FAB-MS tunnisti tuotteen, jonka molekyylipaino oli 463,54.
t i ' f c > 25 Kaksiulotteiset NMR-resonanssitulokset (500 MHz, ’·”· DMS0-d6) ovat kokonaisuudessaan yhdenmukaisia rakenteen i»· V · kanssa ja ne on esitetty taulukossa 1.
Aminohappoanalyysi osoitti, että 91 % näytteestä painon mukaan sisälsi fenyylialaniinia ja asparagiinihap- « · · .**·. 30 poa ekvimolaarisissa suhteissa.
• « ·
Alkuaineanalyysi: Laskettu yhdisteelle c22h33n5o6 ; • · *—[ C: 57,0, H: 7,17, N: 15,1; löydetty: C: 56,8, H: 7,08, • N: 15,0.
« « • · « t «4 • · 10 106380
XOOH
HjN. .NH iL JL JL JL X NH ö COOH 5 Y 8· 8· 4· 2' NHTV 3 6 5 10 Taulukko l 8-guanidiino-oktanoyyli-aspartyyli-fenyylialaniinin kemialliset siirtymätulokset 30 °C:ssa DMSO-d6:ssa*.
Tähde NH alfa-H beeta-H muut 15 _
Asp 8,19 4,48 2,67, 2,42
Phe 7,03 4,02 3,05, 2,95 H2-6, 7,13 monta 8-GO** H2' 2,12, 2,01; H31 1,57, 1,34; 20 H4' 1,10; H7' 1,33; H8' 2,97 I ( ( guanidiini NH 9,7 , V.'.' NH2 6,93
• I
I I 4 « » « 1 ’ " 1 ------ 1 --- -- ' * · · : «* 25 *ppm:iä suhteessa DMSOrhon (2,5 ppm).
4 * * **8-guanidiino-oktanoyyli.
• · · • · ♦
• I I
Esimerkki 3
Yhdistettä 8-GO-Asp-Phe arvioitiin verihiutaleagg- ·**’; 30 regaation inhibitorisena aineena ja sitä verrattiin yhdis- • · · .1. teisiin 8-guanidiino-oktanoyyli-Asp-2-(4-metoksifenyyli)- • · etyyliamidi (8-GO-Asp-MPE) ja/tai RGDS in vitro ja in vivo 4««4* kokeissa seuraavasti: « < < 11 106380
Fibrinogeenin sitoutumiskoe
Fibrinogeenin sitoutumiskoe suoritettiin oleellisesti, kuten ovat kuvanneet Plow et ai., Blood 70. 110 -115 (1987). Lyhyesti, vapaaehtoisista ihmisistä, jotka
5 eivät olleet nauttineet mitään verihiutaleiden vastaista lääkitystä kahteen viikkoon, kerättiin verta 1/10 tilavuuteen CCD puskuria (100 mM natriumsitraatti, 136 mM glukoosi, pH 6,5). Veri sentrifugoitiin 3 minuuttia 1 000 x g ja verihiutalerikas plasma siirrettiin muoviputkeen muovipi-10 petillä ja laitettiin jäille. 15 minuutin kuluttua lisättiin 1/2 tilavuutta jääkylmää CCD puskuria ja näyte sentrifugoitiin 900 x g 10 minuuttia 2 °C:ssa. Supernatantti kaadettiin pois ja verihiutalenappi suspendoitiin varovasti l/2:een alkuperäisestä tilavuudesta jääkylmään modi-15 fioituun Tyrode'n puskuriin (137 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 12 mM NaHCOj, 5,5 mM glukoosi, 15 mM HEPES, 0,5 % BSA, pH
7,4). Kun oli inkuboitu 30 minuuttia 37 °C:ssa, verihiutaleiden määrä säädettiin 4 x 108 verihiutaleeseen/ml modifioidulla Tyrode'n puskurilla. Verihiutalenäytteisiin (1 x 20 108 verihiutaletta/ml) lisättiin peräkkäin: ADP:tä (10 μΜ) ,
CaCl2:ia (1 mM) , testattavaa yhdistettä ja I-fibrinogee- i · < .'!! nia (0,3 μΜ) edellämainittuihin loppukonsentraatioihin 200 ;;; μ1:η tilavuudessa. Näytteitä inkuboitiin 40 minuuttia 37 • i *;··1 °C:ssa ja 50 μΐ määrät sentrifugoitiin 8 000 x g 20 % sak- ·' 25 karoosityynyn (400 μΐ) läpi. Putket jäädytettiin nopeasti *·“· ja kärjet, jotka sisälsivät verihiutalenapin, leikattiin • · · <i oc ; irti ja määritettiin sitoutuneen I-fibrinogeenin suhteen gammanestetuikelaskennalla. Spesifinen sitoutuminen kussa-kin kokeessa määritettiin vähentämällä kokonaissitoutumi- »·· .1·1. 30 sesta sen 125I-f ibrinogeenin määrä, joka sitoutui, kun läsnä M1 oli 60-kertainen ylimäärä leimaamatonta f ibrinogeenia.
• » ‘•••j Testattavien yhdisteiden vahvuus (IC50) määritettiin yhdis- ‘ ' teen konsentraatioksi, joka tarvittiin inhiboimaan I-fib- • :”· rinogeenin sitoutuminen 50 %:sti.
106380 12
Ihmisen verihiutaleaggregaatio in vitro PRP:ssä
Terveitä mies- tai naispuolisia luovuttajia, jotka eivät olleet nauttineet mitään verihiutaleiden vastaista lääkitystä ainakaan kahteen viikkoon, pidettiin paastolla 5 8 tuntia ennen veren ottoa, sitten kerättiin 30 ml koko- verta käyttäen perhosneulaa ja 30 kuutiosenttimetrin muo-viruiskua 3 ml:aan 0,129 M puskuroitua natriumsitraattia (3,8 %) . Ruiskua pyöritettiin varovasti verta otettaessa sitraatin sekoittamiseksi. Verihiutalerikas plasma (PRP) 10 valmistettiin sentrifugoimalla 100 x g 10 minuuttia huoneenlämpötilassa antaen sentrifuugin pysähtyä ilman jarrutusta. PRP poistettiin verestä muovipipetillä ja sijoitettiin muovikorkilliseen 50 ml:n Corning’in kartiopohjäiseen steriiliin sentrifugiputkeen, jota pidettiin huoneenlämpö-15 tilassa. Verihiutaleköyhä plasma (PPP) valmistettiin sentrifugoimalla jäljelle jäänyt veri 2 000 x g 15 minuuttia huoneenlämpötilassa antaen sentrifugin pysähtyä ilman jarrutusta. PRP säädettiin PPP:n avulla sisältämään 2 - 3 x 108 verihiutaletta/ml. 400 μΐ PRP-valmistetta ja 50 μΐ tes-20 tattavaa yhdistettä tai suolaliuosta esi-inkuboitiin yksi minuutti 37 °C:ssa Payton-aggregometrissä (Payton Scienti-
* I I
fic, Inc., Buffalo, NY). Kyvetteihin lisättiin 50 μΐ ade-nosiini-5'-difosfaattia (ADP) (50 μΜ) ja aggregoitumista < i '·«·' tarkkailtiin yhden minuutin ajan. Kaikki yhdisteet testat-
I I I
.* 25 tiin rinnakkaisina. Tulokset laskettiin seuraavasti: Kon- t ’·“♦ trolliprosentti = [(maksimi OD - yhdisteen alkuperäinen ·* OD) jaettuna (maksimi OD - kontrollisuolaliuoksen alkupe räinen OD)] x 100. Inhibitioprosentti = 100 - (kontrolli-prosentti).
• · « .**·. 30 Rotan in vivo verihiutaleniukkuus ,1, Käytettiin urospuolisia rottia (Charles River, « · *···[ CRL: CD (SD) , 400 - 450 g). Rotat nukutettiin natriumpento- barbitaalilla (65 mg/kg, Vet Labs, Limited, Inc., Lenexa, : KA) . Tehtiin kaksi viiltoa molempien kaulasuonten paljas- 3 5 tamiseksi. Käyttäen infuusiopumppua (Harvard Apparatus, 106380 13
South Natick, Mass.) ja 5 kuutiosenttimetrin ruiskua, jossa oli 19 g:n perhosneula, testattava yhdiste tai liuotin infusoitiin vasempaan kaulasuoneen nopeudella 0,39 ml/mi-nuutti 3 minuutin ajan. Kun oli suoritettu 2 minuutin ajan 5 yhdisteen/liuottimen infuusiota, injektoitiin oikeaan kaulasuoneen kollageenia (60 μg/kg) (Helena Laboratories, Beaumont, TX) yhden ml ruiskulla. Ruumiinontelo avattiin ja onttolaskimo paljastettiin veren keräystä varten. Yksi minuutti kollageenin injektion jälkeen yhdisteen infuusio 10 lopetettiin ja veri kerättiin onttolaskimosta (30 sekunnin sisällä) 3 kuutiosenttimetrin ruiskulla, joka sisälsi 0,3 mg 4,5 % EDTA/Tris liuosta (0,1 M) (pH 7,35) plus 150 μΜ indometasiinia. Verihiutalerikas plasma (PRP) valmistettiin sentrifugoimalla veri 126 x g 10 minuuttia. Viisi μΐ 15 PRPctä laskettiin 20 ml:ssa IsotonR III puskurissa (Coulter, isotoninen liuos) Coulter Counter -laskijassa.
Kollageenin indusoiman aggregaation inhibitiopro-sentti laskettiin vertaamalla verihiutalemääriä eläimissä, joita oli käsitelty testattavalla yhdisteellä ja kollagee-20 nilla (a) sellaisten eläinten verihiutalemääriin, jotka eivät olleet saaneet yhtään kollageenia (ei-aggregaatio- « I < .'!! kontrolli) ja (b) sellaisten eläinten verihiutalemääriin, ;;; jotka olivat saaneet liuotinta ja kollageenia (aggregaa- I l j·;1 tiokontrolli) . ED50:t laskettiin laskimon sisäisesti (i.v.) t t ‘ «' 25 annetuille testattaville yhdisteille.
* ** Näiden kokeiden tulokset ovat seuraavat: • · · V : A. Fibrinogeenin sitoutuminen verihiutaleisiin
Yhdiste 8-GO-Asp-Phe inhiboi 125I-fibrinogeenin si-toutumista ADPrllä stimuloituihin pestyihin ihmisen veri- • » · .*·*. 30 hiutaleisiin. Kuvio 1 osoittaa, että se inhiboi IC50-arvol- la 6,0 X 10‘7 M.
• · *···] Yhdiste 8-GO-Asp-Phe oli noin 15 kertaa vahvempi kuin yhdiste 8-GO-Asp-MPE inhiboimaan fibrinogeenin sitou- • tumista verihiutaleisiin ja noin 7 0 kertaa vahvempi kuin i < # * 14 106380 yhdiste RGDS. Sitoutumisen inhibitiokäyrän muoto oli samanlainen kaikille kolmelle yhdisteelle.
B. Verihiutaleaggregaation inhibitio in vitro
Verihiutalerikas plasma (PRP) valmistettiin juuri 5 otetuista ihmisten ja koirien verinäytteistä. Sitten PRP:-tä inkuboitiin yhdisteiden 8-GO-Asp-Phe tai 8-GO-Asp-MPE kanssa kaksi minuuttia aggregometrikyvetissä 37 °C:ssa, jonka jälkeen lisättiin joko ADP:tä (kuten on kuvattu ihmisen PRP:lie kuviossa 2) tai kollageenia (kuvattu koiran 10 PRP:lie kuviossa 3) (taulukko 2). Aggregaation määrää tarkkailtiin mittaamalla valon kulkua PRP-liuoksen läpi. Molemmat yhdisteet inhiboivat verihiutaleaggregaatiota konsentraatiosta riippuvaisella tavalla ihmisen ja koiran PRP:ssä responssina ADP:lle ja kollageenille, vastaavassa 15 järjestyksessä.
Sekä ihmisen että koiran PRP:ssä yhdiste 8-GO-Asp-Phe oli noin 5 kertaa vahvempi kuin yhdiste 8-GO-Asp-MPE.
Ihmisen PRP alistettiin myös pesumenetelmälle plasman proteiinien poistamiseksi ennen aggregaatiokoetta. 20 Sitten pestyjä verihiutaleita inkuboitiin testattavan yh- disteen kanssa kyvetissä ja aggregoitiin trombiinilla (tu-,":. lokset on kuvattu kuviossa 4, taulukko 2).
t!i Yhdiste 8-GO-Asp-Phe oli 5 kertaa vahvempi kuin i .'‘ 8-GO-Asp-MPE inhiboimaan trombiinilla indusoitua aggregaa- i « 4 ' 25 tiota pestyissä verihiutaleissa.
«tn.
• ♦ ♦ · ♦ • · · ♦ · • ·
• M
»·» • 0
·< O
• Il • · ··· • 1 f t I < » | (
«tl I
( I
’ i i ' I I « I
15 106380
Taulukko 2
Yhteenveto verihiutaleaggregaation in vitro aktiivisuuden inhiboimisesta yhdisteillä 8-GO-Asp-Phe ja 8-GO-Asp-MPE In vitro IC50:t (M) 5 _
8-GO-Asp-Phe 8-GO-Asp-MPE
Ihminen - PRP (ADP) 2,4 X 10'6 9,6 X 10‘6 10 - pestyt (trombiini) 6,0 x 10'7 3,0 x 10*6
Koira - PRP (kollageeni) 2,1 x 10'6 9,3 x 10'6 15
Kaikissa tapauksissa, joissa yhdisteen 8-GO-Asp-Phe havaittiin olevan aktiivinen in vitro, ainoastaan agg-regaatio inhiboitui, kun taas verihiutaleen muodon muuttuminen vasteena eri agonistialtistuksille ei estynyt. Näin 20 ollen yhdiste ei häiritse verihiutaleen aktivaatioproses- siä vaan mieluummin estää aggregaatioprosessin myöhemmässä :(1<! fibrinogeenin sitoutumisvaiheessa.
C. Verihiutaleaggregaation inhibitio in vivo ·*·*: Kollageenin indusoima verihiutaleniukkuus rotassa 25 Verihiutaleiden määrä veressä, joka otetaan sellai- sista rotista, joille on ensin injektoitu laskimonsisäi- ♦ ♦ · sesti kollageenia, vähenee merkittävästi verrattuna nor- ... maaleihin määriin. Kollageenin läsnäolo veressä aiheuttaa « · verihiutaleiden aktivaation ja aggregoitumisen. Nämä agg- • · ···* 3 0 regoituneet verihiutalemassat poistetaan verenkierrosta :***: hiussuonien aiheuttaman sieppauksen johdosta, joka selit- • · · ·;··· tää havaitun laskun verihiutaleiden määrissä. Yhdisteitä . 8-GO-Asp-Phe, 8-GO-Asp-MPE tai RGDS infusoitiin laskimon- ; sisäisesti rottiin kaksi minuuttia ennen kollageenin in- 35 jektiota, jatkettiin lisää yhden minuutin ajan kollageenin ie 106380 injektion jälkeen ja määritettiin vaikutus verihiutaleiden määriin (kuvio 5).
Yhdiste 8-GO-Asp-Phe inhiboi kollageenilla (60 /xg/ kg) indusoitua verihiutaleniukkuutta annoksesta riippuvai-5 sella tavalla ED50-arvon ollessa 0,05 mg/kg. Yhdiste 8-G0-Asp-MPE oli myös tehokas ED50-arvolla 0,07 mg/kg. Päinvastoin kuin nämä, yhdiste RGDS ei inhiboinut aggregaatiota 50 %:sti annoksilla, jotka olivat jopa 10 mg/kg.
Yhdisteen 8-GO-Asp-Phe antaminen laskimonsisäisesti 10 annoksena 0,10 mg/kg (2 x ED50) osoitti maksimiaktiivisuu-den 15 minuuttia 3 minuutin pituisen infuusion jälkeen ja johti kollageenilla indusoidun verihiutaleniukkuuden 90 % inhiboitumiseen (kuvio 6) .
Kun annettiin yhdistettä 8-GO-Asp-Phe annoksena 15 0,1 mg/kg (t1/2 2 x ED50:llä), verihiutaleaggregaation inhi- bitioaktiivisuus laski puoliintumisajan ollessa 12 minuuttia. Vertailun vuoksi, 0,14 mg/kg annos yhdistettä 8-GO-Asp-MPE (2 x ED5q) johti 70 % laskuun verihiutaleniukkuu-dessa puoliintumisajan ollessa 43 minuuttia.
. 20 D. Kollageenilla ex vivo indusoitujen verihiutalei- ;;; den aggregaation inhibitio koirissa
Koirat nukutettiin ja niille infusoitiin laskimon-sisäisesti yhdistettä 8-GO-Asp-Phe. Ennen yhdisteen infu-: soimista eri annosnopeuksilla, sen aikana ja sen jälkeen '1": 25 otettiin verinäytteet, valmistettiin PRP:t ja arvioitiin verihiutaleiden aggregaatioresponssit kollageenille agg-regometrillä. Erillisissä kokeissa yhdistettä 8-GO-Asp-.·**. MP E annettiin kerta-annoksena yhden minuutin aikana (kuvio .···, 7) tai infusoitiin 2 tuntia (kuvio 8) verihiutaleiden ’!* 3 0 steady state -responssien aikaan saamiseksi.
'...· Yhdiste 8-GO-Asp-Phe tuotti annoksesta riippuvaisen kollageenilla indusoitujen verihiutaleiden aggregaation : .·. inhibition koirilla kummallakin menetelmällä. Kertainjek- V ; tioissa ED50-arvo yhdisteelle 8-GO-Asp-Phe oli 0,6 mg/kg 35 verrattuna EDS0-arvoon 1,7 mg/kg, joka määritettiin yhdis- 106380 17 teelle 8-GO-Asp-MPE 5 minuuttia injektion jälkeen (Johtuen yhdisteen 8-GO-Asp-Phe aktiivisuuden lyhyestä puoliintumisajasta, se mitattiin myös 2 minuuttia annon jälkeen. Yhdisteellä 8-GO-Asp-Phe oli ED50-arvo 0,30 mg/kg, kun mi-5 tattiin 2 minuuttia injektion jälkeen). Steady state -inhibition ED50-arvo (määritettiin laskemalla 45 minuutin -2 tunnin välisten responssien keskiarvo) oli 0,0075 mg/kg/ minuutti (verrattuna arvoon 0,03 mg/kg/minuutti yhdisteelle 8-GO-Asp-MPE).
10 Esimerkki 4
Yhdistettä 8-GO-Asp-Phe arvioitiin aineena, joka lyhentäisi aikaa uuteen perfuusioon ja pidentäisi aikaa uuden tukkeutuman muodostukseen sen jälkeen, kun verihyy-tymä on hajotettu antamalla koirille trombolyyttistä ai-15 netta, kudoksen plasminogeeniaktivaattoria (t-PA). Tätä koetta varten suoritettiin seuraava menetelmä:
Koirat, jotka painavat noin 25 kg, nukutetaan pen-tobarbitaalilla, 30 mg/kg i.v. Vasen kaulasuoni eristetään ja kanyloidaan muodostaen reitti i.v. injektioita varten. 20 Pään vasen valtimo kanyloidaan verenpaineen mittausta var-ten. Suoritetaan vasemmanpuoleinen rintaontelon avaus vii-dennen kylkiluuvälin läpi. Sydänpussi avataan ja rakenne-
I : I
taan sydänpussin suoja käyttäen 00 silkkisutuuraa. Vasen i i i : ' ? etummainen laskeva sepelvaltimo (LADCA) leikataan irti sen ; 25 kalvosta ainakin kolmen senttimetrin matkalta. Kaikki si- ;*·*; vuhaarat lukuunottamatta yhtä suurta liitetään yhteen 4-0 tai 5-0 silkkisutuurilla. LADCA:n eristetyn alueen proksi-.···, maaliseen päähän sijoitetaan sopivan kokoinen elektromag- • o neettinen virtauskoetin. Säilytetty sivuhaara kanyloidaan *;* 30 PE-50 -katetrilla, joka on kiinnitetty 23 g:n neulan adap- * · » ί.,.ϊ teriin ja 3-haaraiseen sulkuhanaan. Alueen distaaliseen ·:··: päähän sijoitetaan 2 mm leveä muovilaite, joka on tehty . suonten kuristamista varten. Useita silkkisutuurapaloja, Τ ! kooltaan 2-0 ja 4-0, (noin kymmenen palaa), jotka voidaan ’ ’ 35 poistaa, sijoitetaan muovirenkaan silmukan sisäpuolelle 106380 18 niin, että virtausta saadaan säädettyä sen jälkeen, kun silmukka on kiristetty verisuonen ympärille.
Alueen läpi kulkevaa virtausta vähennetään kiristämällä muovirengasta ja säädöt tehdään purkamalla silkki-5 sutuuraliitosalueet saaden aikaan virtausnopeuden väheneminen 40 - 50 %. Mekaanisia tukkeutumia muodostetaan sen varmistamiseksi, että verentungos on poistunut. Aluetta, jossa tukkeutuma on muodostunut, vaurioitetaan puristamalla sitä 3-4 kertaa Dekabey -pinseteillä. Virtauskoetti-10 men distaalipuolelle ja muovisen tukkeuttajan proksimaali-puolelle sijoitetaan erittäin hienoja 'moskiitto 1-puristimia, joiden sahalaitaosat on päällystetty muovilla, alueen eristämiseksi ja vuodon ehkäisemiseksi. Veri otetaan kany-loidun sivuhaaran kautta. Jos eristettyyn alueeseen jää 15 hiukan verta, se huuhdotaan ensin pois suolaliuoksella avaamalla lähellä distaalista tukkeuttajaa oleva puristin. Kanyloitua sivuhaaraa käyttäen injektoidaan eristetylle alueelle 0,1 ml trombiinia (1 000 yksikköä/ml), jonka jälkeen poistetaan kaulasuonesta 0,3 ml verta. Tukkeutuman 20 annetaan "parantua" 15 minuuttia.
!!! Otetaan verinäyte PT:n (protrombiiniaika) ja APTT:n (aktivoitu osittainen tromboplastiiniaika) mittaamiseksi.
‘15 minuutin ajan jälkeen poistetaan 'moskiitto'-puristi- i « t χ I I < : met, proksimaalinen puristin ensin, distaalinen puristin 2 '25 minuuttia myöhemmin. Jos virtausmittari edelleen osoittaa
Mt .* 0 virtausta osoittaen tukkeuttavan hyytymän läsnäolon, annetaan i.v. 5 000 yksikköä hepariinia, sivuhaarakatetri ;***; poistetaan ja sivuhaara sidotaan. Annetaan hepariinin • « « .·**. 1 000 yksikön suuruisia lisäannoksia i.v. tunnin välein « · · ^ 30 hepariinin alkuannoksesta, jos tarvitaan.
• · *··»* Verinäyte otetaan verihiutaleiden responsiivisuu- * *· den, PT:n ja APPT:n mittaamiseksi juuri hepariinin ensim- ; /; mäisen annon jälkeen ja valittuina aikoina, kuten on osoi- .·. : tettu alla. 30 minuutin pituisten lisäaikojen, joiden ai- 35 kana hyytymän tukkeava luonne varmistetaan, jälkeen anne- 106380 19 taan testattavat yhdisteet (joko kertainjektiolla tai aloittaen infuusiot, kumpi on sopiva ja sopivaa reittiä käyttäen) ja annetaan i.v. kertainjektiolla 0,25 mg/kg annos t-PA:ta. t-PA:n anto toistetaan joka 15 minuutti 5 yhden tunnin ajan tai siihen asti, kunnes uusi perfuusio tapahtuu. Uuden perfuusion määritetään olevan se, kun verisuonessa muodostuu uudelleen 50 % siitä virtauksesta, joka siinä oli ennen hyytymän muodostusta. Aika uuteen perfuusioon mitataan ensimmäisen t-PA:n injektion ajasta. 10 Verinäyte otetaan uuden perfuusion tapahtuessa hyytymistekijöiden ja verihiutaleiden responsiivisuuden mittaamiseksi .
Uuden tukkeutuman määritetään olevan se, kun verisuonessa virtaus palaa nopeuteen 0 ml/minuutti ja aika 15 uuteen tukkeutumaan mitataan uuden perfuusion tapahtumisesta. Lopullinen verinäyte otetaan hyytymistekijöiden ja verihiutaleiden responsiivisuuden mittaamiseksi.
Eläimiä seurataan 1-2 tuntia hyytymän hajottamisen jälkeen riippuen eläimen fysiologisesta tilasta.
20 Yhdisteitä arvioidaan niiden kyvyn suhteen lyhentää M.· aikaa uuteen perfuusioon, pidentää aikaa uuteen tukkeutu- *,,/ maan tai molempien suhteen.
< < !i(i· Yhdisteen maksimitehokkuus määritellään epäonnis- ‘ tuneen tukkeutuman uudistumisen suhteen testin aikana.
25 Yhdisteet voivat olla vähemmän kuin maksimaalisesti tehoksi*. kaita, jos ne johtavat merkittävään pidentymiseen ajassa, joka tarvitaan saavuttamaan uusi tukkeutuma hajotuksen jälkeen. Sellaisille aineille tehdään uudet testaukset • · käyttäen eri annosjärjestelmää.
• · ·;·' 30 Yllä olevan kokeen tulokset, käyttäen kliinisesti saatavissa olevaa Genentech Activase t-PA:ta, on esitetty ·;·*: seuraavassa taulukossa 3 ja kuviossa 9.
• e f I < 20 106380
Taulukko 3 A. Aika hajoamiseen (minuutteja)
Käsittely Aika hajoamiseen SEM N
5____
Kontrclii 18,4 2,9 8
Aspiriini (ASA) 37,0 — 2 8-GO-Asp-Phe 8,4 0,6 4 10 ______ B. Aika uuteen tukkeutumaan (minuutteja)
Käsittely Aika uuteen SEM N
_tukkeutumaan____ 15 Kontrolli 3,1 0,6 7
Aspiriini (ASA) 29,0 — 2 8-GO-Asp-Phe 75,7 14,3 3 . 20 SEM = keskiarvon keskivirhe I I · Tämän keksinnön mukaista uutta peptidiä jäljitte- levää yhdistettä voidaan käyttää nisäkäsisännälle antoa : V varten tavanomaisilla tavoilla, kuten parenteraalisilla 25 tai suun kautta tapahtuvilla antomenetelmillä suositelta- vasti formulaatioina farmaseuttisesti hyväksyttävien lai- mentimien tai kantajien kanssa. Verihiutaleaggregaation .***. inhibiittorin suositeltava antoreitti on parenteraalinen, • · « .···, esimerkiksi laskimonsisäisesti. Peptidiä jäljittelevän 30 yhdisteen anto laskimonsisäisesti liuoksena normaalin fy- • · · '...· siologisen suolaliuoksen, ihmisen albumiinin ja muiden sellaisten laimentimien ja kantajien kanssa, on kuvaileva.
< : Farmaseuttisesti hyväksyttävissä laimentimissa ja kanta- ,·, ; jissa olevat aktiivisen peptidiä jäljittelevän yhdisteen 35 muut sopivat terapeuttisessa annosmuodossa olevat formu- 106380 21 laatiot voidaan valmistaa farmaseuttisen alan yleisten julkaisujen mukaisesti, kuten esimerkiksi teos Remington's Pharmaceutical Sciences, toim. Arthur Osol, 16. painos, 1980, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania.
5 Infuusionopeus, joka tarvittiin inhiboimaan täydel lisesti verihiutaleaggregaatio koirassa, oli noin 20 - 30 μg/kg/minuutti. Olettaen, että täydellinen verihiutaleen responsiivisuuden inhibitio halutaan saavuttaa, tarvitaan noin 43 mg/kg lääkettä 24 tunnin infuusioaika (noin 3 g/ 10 vuorokausi, kokonaisannos), jos verihiutaleiden annosres-ponssi koirissa on suoraan verrannollinen ihmisiin. Terapian kestoaika voi vaihdella yhdestä useisiin vuorokausiin.
Alan asiantuntijalle tulee ilmeisiksi useita mui-15 takin esimerkkejä esillä olevan esityksen lukemisen jälkeen ilman, että ne poikkeavat keksinnön mukaisesta hengestä ja piiristä. On tarkoitettu, että kaikki sellaiset esimerkit sisältyvät lisättyjen patenttivaatimusten piiriin.
I t ( I I « I 1 I I « i 4 1 « ( 1 I t I I « *.
• a a
I I I
( » « a • * · • · • · a a a • · · • · ♦ • · · a • · · a · • » • · · a a a a a a • a a • i • « * 4 · « · • «
Claims (2)
1. Menetelmä verihiutaleaggregaatiota ja veritukok-sen muodostusta inhiboivan N-[8-[(aminoiminometyyli)ami-5 no] -1-okso-oktyyli] -N-L-alfa-aspartyyli-L-f enyylialanii-nin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että liitetään kemiallisesti 8-guanidiino-oktaanihappo aspartyyli-fenyylialaniinimetyyliesteriin, jonka jälkeen tuloksena syntynyt metyyliesteri saippuoidaan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että metyyliesteri saippuoidaan natriumhydroksidillä. < < < t I « ( ♦ 1 1 • · · * 1 · « « • · • · · • · « «tr ( 1 I • f • « • · · 23 1 0 6 3 8 0
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54095390 | 1990-06-20 | ||
| US07/540,953 US5053393A (en) | 1988-07-20 | 1990-06-20 | Novel platelet-aggregation inhibitor |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI913006A0 FI913006A0 (fi) | 1991-06-19 |
| FI913006A FI913006A (fi) | 1991-12-21 |
| FI106380B true FI106380B (fi) | 2001-01-31 |
Family
ID=24157584
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI913006A FI106380B (fi) | 1990-06-20 | 1991-06-19 | Menetelmä verihiutaleaggregaatiota ja veritukoksen muodostusta inhiboivan N-[8-[(aminoiminometyyli)amino]-1-okso-oktyyli]-N-L-alfa-aspartyyli-L-fenyylialaniinin valmistamiseksi |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5053393A (fi) |
| EP (1) | EP0462960B1 (fi) |
| JP (1) | JPH0651719B2 (fi) |
| KR (1) | KR940000753B1 (fi) |
| AT (1) | ATE123293T1 (fi) |
| AU (1) | AU631070B2 (fi) |
| CA (1) | CA2044978C (fi) |
| DE (1) | DE69110091T2 (fi) |
| DK (1) | DK0462960T3 (fi) |
| ES (1) | ES2075415T3 (fi) |
| FI (1) | FI106380B (fi) |
| IE (1) | IE72519B1 (fi) |
| IL (1) | IL98557A (fi) |
| NO (1) | NO301373B1 (fi) |
| NZ (1) | NZ238611A (fi) |
| PT (1) | PT98026B (fi) |
| ZA (1) | ZA914728B (fi) |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5332726A (en) * | 1989-09-29 | 1994-07-26 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Antithrombotic peptides and pseudopeptides |
| TW201303B (fi) * | 1990-07-05 | 1993-03-01 | Hoffmann La Roche | |
| US5260277A (en) * | 1990-09-10 | 1993-11-09 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Guanidinyl and related cell adhesion modulation compounds |
| NZ239846A (en) * | 1990-09-27 | 1994-11-25 | Merck & Co Inc | Sulphonamide derivatives and pharmaceutical compositions thereof |
| MX9201416A (es) * | 1991-03-28 | 1992-10-01 | Rhone Poulenc Rorer Int | Peptidos y pseudopeptidos antitromboticos. |
| DE4126277A1 (de) * | 1991-08-08 | 1993-02-11 | Cassella Ag | Hydantoinderivate |
| US5239113A (en) * | 1991-10-15 | 1993-08-24 | Monsanto Company | Substituted β-amino acid derivatives useful as platelet aggregation inhibitors and intermediates thereof |
| US5625093A (en) * | 1991-10-15 | 1997-04-29 | G. D. Searle & Co. | Substituted β-amino acid derivatives useful as platelet aggregation inhibitors |
| US5254573A (en) * | 1991-10-15 | 1993-10-19 | Monsanto Company | Substituted heterocyclic derivatives useful as platelet aggregation inhibitors |
| WO1993008823A1 (en) * | 1991-11-06 | 1993-05-13 | Tanabe Seiyaku Co., Ltd. | Guanidinyl and related cell adhesion modulation compounds |
| US5258398A (en) * | 1991-12-16 | 1993-11-02 | Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. | Antithrombotic diaminoalkanoic acid derivatives |
| TW223629B (fi) * | 1992-03-06 | 1994-05-11 | Hoffmann La Roche | |
| US5338725A (en) * | 1992-06-30 | 1994-08-16 | The Research Foundation Of The State University Of New York | Anti-aggregatory agents for platelets |
| US6380163B1 (en) * | 1992-12-22 | 2002-04-30 | Baxter International Inc. | Peritoneal dialysis solutions with polypeptides |
| DE4302485A1 (de) * | 1993-01-29 | 1994-08-04 | Merck Patent Gmbh | Piperazinderivate |
| AU687790B2 (en) * | 1993-02-09 | 1998-03-05 | Biogen Idec Ma Inc. | Treatment for insulin dependent diabetes |
| EP0623615B1 (de) * | 1993-05-01 | 1999-06-30 | MERCK PATENT GmbH | Substituierte 1-Phenyl-oxazolidin-2-on Derivate, deren Herstellung und deren Verwendung als Adhäsionsrezeptor-Antagonisten |
| TW394760B (en) * | 1993-09-07 | 2000-06-21 | Hoffmann La Roche | Novel Carboxamides, process for their preparation and pharmaceutical composition containing the same |
| DE4332384A1 (de) * | 1993-09-23 | 1995-03-30 | Merck Patent Gmbh | Adhäsionsrezeptor-Antagonisten III |
| DE4405378A1 (de) * | 1994-02-19 | 1995-08-24 | Merck Patent Gmbh | Adhäsionsrezeptor-Antagonisten |
| DE4429461A1 (de) * | 1994-08-19 | 1996-02-22 | Merck Patent Gmbh | Adhäsionsrezeptor-Antagonisten |
| ES2123889T3 (es) | 1994-11-02 | 1999-01-16 | Merck Patent Gmbh | Antagonistas de receptores de adhesion. |
| DE4439846A1 (de) * | 1994-11-08 | 1996-05-09 | Merck Patent Gmbh | Adhäsionsrezeptor-Antagonisten |
| DE19504954A1 (de) * | 1995-02-15 | 1996-08-22 | Merck Patent Gmbh | Adhäsionsrezeptor-Antagonisten |
| DE19516483A1 (de) * | 1995-05-05 | 1996-11-07 | Merck Patent Gmbh | Adhäsionsrezeptor-Antagonisten |
| US5891418A (en) * | 1995-06-07 | 1999-04-06 | Rhomed Incorporated | Peptide-metal ion pharmaceutical constructs and applications |
| US7018627B1 (en) | 1995-06-07 | 2006-03-28 | Icos Corporation | Macrophage derived chemokine (MDC), MDC analogs, MDC inhibitor substances, and uses thereof |
| US5654334A (en) * | 1995-06-23 | 1997-08-05 | Oklahoma Medical Research Foundation | Analgesic use of N-L-α-aspartyl-L-phenylalanine 1-methyl ester |
| US5872122A (en) * | 1997-10-16 | 1999-02-16 | Monsanto Company | Pyrimidinylamidino β-amino acid derivatives useful as inhibitors of platelet aggregation |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2215948B1 (fi) * | 1973-02-01 | 1976-05-14 | Centre Etd Ind Pharma | |
| US4127580A (en) * | 1975-02-07 | 1978-11-28 | Parcor | Process for the preparation of thieno-pyridine derivatives |
| US4661111A (en) * | 1982-08-04 | 1987-04-28 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
| US4589881A (en) * | 1982-08-04 | 1986-05-20 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
| US4517686A (en) * | 1982-08-04 | 1985-05-21 | La Jolla Cancer Research Foundation | Polypeptide |
| US4578079A (en) * | 1982-08-04 | 1986-03-25 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
| US4614517A (en) * | 1982-08-04 | 1986-09-30 | La Jolla Cancer Research Foundation | Tetrapeptide |
| US4683291A (en) * | 1985-10-28 | 1987-07-28 | Scripps Clinic And Research Foundation | Platelet binding inhibitors |
| US4857508A (en) * | 1987-12-03 | 1989-08-15 | Monsanto Company | Novel platelet-aggregation inhibitor peptide derivatives |
| US4992463A (en) * | 1988-07-20 | 1991-02-12 | Monsanto Company | Thienyl peptide mimetic compounds which are useful in inhibiting platelet aggregation |
| US4879313A (en) * | 1988-07-20 | 1989-11-07 | Mosanto Company | Novel platelet-aggregation inhibitors |
| US5169836A (en) * | 1988-11-10 | 1992-12-08 | Trustees Of The University Of Penna. | Inhibitors of platelet binding |
| CA2008116C (en) * | 1989-02-23 | 2001-11-20 | Thomas Weller | Glycine derivatives |
-
1990
- 1990-06-20 US US07/540,953 patent/US5053393A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-06-19 PT PT98026A patent/PT98026B/pt active IP Right Grant
- 1991-06-19 IL IL9855791A patent/IL98557A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-06-19 DK DK91870098.0T patent/DK0462960T3/da active
- 1991-06-19 AU AU79121/91A patent/AU631070B2/en not_active Ceased
- 1991-06-19 NZ NZ238611A patent/NZ238611A/xx not_active IP Right Cessation
- 1991-06-19 FI FI913006A patent/FI106380B/fi not_active IP Right Cessation
- 1991-06-19 EP EP91870098A patent/EP0462960B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-19 AT AT91870098T patent/ATE123293T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-06-19 KR KR1019910010241A patent/KR940000753B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-06-19 CA CA002044978A patent/CA2044978C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-19 DE DE69110091T patent/DE69110091T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-19 ZA ZA914728A patent/ZA914728B/xx unknown
- 1991-06-19 ES ES91870098T patent/ES2075415T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-06-19 JP JP3147194A patent/JPH0651719B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-06-19 IE IE210091A patent/IE72519B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-06-19 NO NO912396A patent/NO301373B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NZ238611A (en) | 1992-09-25 |
| DK0462960T3 (da) | 1995-10-02 |
| US5053393A (en) | 1991-10-01 |
| FI913006A0 (fi) | 1991-06-19 |
| DE69110091D1 (de) | 1995-07-06 |
| KR920000785A (ko) | 1992-01-29 |
| NO912396L (no) | 1991-12-23 |
| IL98557A (en) | 1996-01-31 |
| DE69110091T2 (de) | 1996-02-08 |
| IL98557A0 (en) | 1992-07-15 |
| AU7912191A (en) | 1992-01-02 |
| AU631070B2 (en) | 1992-11-12 |
| IE72519B1 (en) | 1997-04-23 |
| NO301373B1 (no) | 1997-10-20 |
| ATE123293T1 (de) | 1995-06-15 |
| IE912100A1 (en) | 1992-01-01 |
| NO912396D0 (no) | 1991-06-19 |
| KR940000753B1 (ko) | 1994-01-29 |
| EP0462960A1 (en) | 1991-12-27 |
| PT98026B (pt) | 1998-11-30 |
| PT98026A (pt) | 1992-04-30 |
| CA2044978C (en) | 2001-06-12 |
| JPH04230299A (ja) | 1992-08-19 |
| FI913006A (fi) | 1991-12-21 |
| JPH0651719B2 (ja) | 1994-07-06 |
| ES2075415T3 (es) | 1995-10-01 |
| ZA914728B (en) | 1993-02-24 |
| EP0462960B1 (en) | 1995-05-31 |
| CA2044978A1 (en) | 1991-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI106380B (fi) | Menetelmä verihiutaleaggregaatiota ja veritukoksen muodostusta inhiboivan N-[8-[(aminoiminometyyli)amino]-1-okso-oktyyli]-N-L-alfa-aspartyyli-L-fenyylialaniinin valmistamiseksi | |
| EP0319506B1 (en) | Novel platelet-aggregation inhibitor peptide derivatives | |
| EP0352249B1 (en) | Novel platelet-aggregation inhibitors | |
| US5493007A (en) | Platelet aggregation inhibitors having high specificity for GPIIBIIIA | |
| JP3042887B2 (ja) | 血栓塞栓症疾患を診断するための像形成剤としての放射線標識された血小板ＧＰ▲ＩＩ▼ｂ／▲ＩＩＩ▼ａ受容体アンタゴニスト | |
| SK282391B6 (sk) | Cyklopeptid, spôsob jeho prípravy, použitie a farmaceutický prostriedok, ktorý ho obsahuje | |
| PT2077995E (pt) | Métodos de sintetizar sais farmacêuticos de um inibidor de fator xa | |
| US5498601A (en) | Platelet aggregation-inhibiting peptides | |
| Cook et al. | Inhibition of platelet hemostatic plug formation by trigramin, a novel RGD-peptide | |
| JPH07278091A (ja) | 抗血栓症剤 | |
| Tandon et al. | Interaction of human platelets with laminin and identification of the 67 kDa laminin receptor on platelets | |
| RU2287580C2 (ru) | Рекомбинантный рецептор коллагена на тромбоцитах гликопротеин vi и его применение в фармацевтике | |
| JP3489628B2 (ja) | 血小板凝集阻害剤 | |
| Calzada et al. | Novel integrin antagonists derived from thrombospondins | |
| JPH09509936A (ja) | 抗血栓剤 | |
| JPH107671A (ja) | 抗血栓性ジアミド | |
| JPH06504989A (ja) | 新規の抗凝固作用を有するペプチド | |
| AU734935B2 (en) | Bradykinin analogs as selective inhibitors of cell activation | |
| RU2396271C1 (ru) | Rgd-подобные пептиды | |
| JPH089635B2 (ja) | 新規ペプチド化合物 | |
| JPH0797397A (ja) | 新規ペプチド及びそれを用いた血小板凝集抑制剤 | |
| JPH07309894A (ja) | 新規ペプチド並びにそれを用いた血小板凝集抑制剤、体外循環用血液凝固抑制剤及び輸血用血小板製剤保護剤 | |
| WO1992022580A1 (fr) | Nouvel agent inhibiteur de l'adhesion de neutrophiles d'origine humaine et composition pharmaceutique contenant cet agent |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |