KR940000753B1

KR940000753B1 - 새로운 혈소판 응집 억제 인자

Info

Publication number: KR940000753B1
Application number: KR1019910010241A
Authority: KR
Inventors: 시옹 청 포우; 폴 아담스 스티븐; 필립 페이건 레리
Original assignee: 몬산토 캄파니; 제임스 클리프튼 보올딩; 지. 디. 써얼 앤드 캄파니; 포올 디. 메투카이티스
Priority date: 1990-06-20
Filing date: 1991-06-19
Publication date: 1994-01-29
Also published as: IE912100A1; FI106380B; NO912396D0; FI913006A; JPH04230299A; IL98557A; NO301373B1; CA2044978C; DE69110091D1; EP0462960B1; JPH0651719B2; EP0462960A1; CA2044978A1; PT98026B; IL98557A0; DE69110091T2; NZ238611A; FI913006A0; IE72519B1; AU631070B2

Abstract

내용 없음.

Description

세로운 혈소판 응집 억제 인자

제1도는 8-GO-Asp-phe(□), 8-GO-Asp-MPE() 그리고 RGDS(x)와 같은 억제 인자를 사용하여 세척된 인체 혈소판에 대한 섬유소원 결합의 억체를 나타낸다 ; 억제 인자들의 섬유소원 결합 비율을 대조구(억제 인자가 없을때)와 비교하여 억제 인자의몰랄 농도에 따라 표시하였다.

제2도는 인체 혈소판이 풍부한 혈장내에서 8-GO-Asp-Phe(□)와 8-GO-Asp-MPE()에 의한 ADP-유도 혈소판 응집의 억제를 대조구 (억제 인자가 없을때 )와 비교하여 혈소판 응집 비율을 억제 인자의 몰랄 농도에 따라 표시하였다.

제3도는 개의 혈소판이 풍부한 혈장내에서 8-GO-Asp-Phe(□)와 8-GO-Asp-MPE()에 의한 콜라겐-유도 혈소판 응징의 억제를 제 2도와 같은 방법으로 표시햐였다.

제4도는 세척된 인체 혈소판에서 8-GO-Asp-Phe(□)와 8-GO-Asp-MPE()에 의한 트롬빈- 유도 혈소판 응집의 억제를 제 2도와 같은 방법으로 표시하였다.

제5도는 쥐에서 8-GO-Asp-Phe(□)와 8-GO-Asp-MPE()그리고 RGD S(x)와 같은 억제 인자에 의한 콜라겐-유도 혈소판 감소증의 억제를 대조구 (억제 인자가 없을때)와 비교하여 혈소판 감소증 (혈소판 숫자의 감소)의 억제 비율을 억제 인자의 복용량(mg/kg)에 따라 표시하였다.

제 6도는 쥐에서 8-GO-Asp-Phe(□)와 8-GO-Asp-MPE()에 의한 콜라겐 유도 혈소판 감소증의 억제를 시간(분)에 따른 억제 비율로 표시하였다.

제7도는 개에서 생체밖의 콜라겐-유도 혈소판 응집에서 IV용 알약에 의한 8-GO-Asp-Phe(□)와 8-GO-Asp-MPE()의 영향을 나타낸다 ; 대조구 (억제 인 자가 없을때 )와 비교하여 혈소판 샘풀의 억제 비율을 억제 인자의 복용량(mg/kg)에따라 표시하였다.

제8도는 개의 생체밖의 콜라겐-유도 혈소판 응집에서 8-GO-Asp-Phe(□)와 8-GO-Asp-MPE()의 IV투입의 영향을 대조구(8-GO-Asp-Phe가 없을때)와 비교하여 제 7도와 같은 방법으로 표시하였다.

제 9도는 개에서 8-GO-Asp-Phe를 t-PA와 함께투여했을 경우, 대조구 (8-GO-Asp-Phe가 없을때)와 ASA에 비교하여 시간(분)에 따른 재환류(용해)와 재폐쇄에 대한 8-GO-Asp-Phe의 영향을 나타냈다.

본 발명은 혈소판 응집의 억제 인자로서 생체내에서 효능있는 활성을 가진 새로운 펩타이드 모방성 화합물에 관한 것이다.

섬유소원(Fibyinogen)은 혈장내의 구성요소로서 존재하는 당 단백질이다. 이러한 섬유소원은 혈액의 응고 과정에서 혈소판의 응집과 혈액 응고 과정에서 섬유소 (fibrin)의 형성에 관여한다. 혈소판은 혈액에서 발견되는 세포물질로, 또한 혈액의 응고에도 관여한다. 혈액 응고 매카니즘에서 혈소판에 대한 섬유소원의 결합은 정상적인 혈소판 기능에 있어서 중요한 점이다.

혈관에 상처가 나면, 섬유소원에 결합하는 혈소판은 응집을 개시하고, 혈전을 형성할 것이다.

섬유소원과 혈소판의 상호 작용은 gpIIb/IIIa로 알려진 막 단백질 복합체에 의하여 일어나며, 이것은 혈소판 기능에 중요한 특징중의 하나이다.

이러한 상호작용의 억제 인자들은 혈소판 혈전 형성의 조절에 있었서 유용하다.

주요한 세포외의세포 간질 단백질인 파이브로넥틴(fibronectin) 은 또 다른 고분자량의 당단백질로서 섬유소원과 섬유소 사이에서 상호작용하며.섬유담백질 (Actin), 콜라겐, 그리고 프로테오글라이칸(proteoglycans)과 같은 구조적 분자들도 상호작용한다.

다양한 비교적 고분자량의 폴리펩타이드의 단편들은 파이브로넥틴의 세포결합영역에서 세포부착 활동을 하는 것으로 밝혀졌다(미국특허 제 4,517,686호 ; 제4,589, 881호 ; 및 제4, 661,111호), 이러한 폴리펩타이드들은 내부의 아미노산 서열 Arg-Gly-Asp-Ser(RGDS) 를 포함한다. 동일한 분자로부터 대체로 짧은 특정한 펩타이드 단편들을 기질상에서 고정시켰을때 기질에 대한 세포부착을 촉진하고, 미국특허 제4,517,686호; 제4,589,881호; 및 제4,661, 111호의 경우에서는 부착을 억제한다. 이러한 폴리펩타이드들은 내부의 아미노산 서열 Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)를 포함한다.

동일한 분자중에서 대체로 짧은 특정한 펩타이드 조각들은 기질상에 고정되어졌을 때,기질에 대한 세포 부착을 촉진시키고, 용해되거나 현탁된 상태에서는 부착을 억재한다. (미국특허 제4,578,079호 및 제4,614,517호),이러한 펩타이드는 하기와 같이 표시된다.

X-Arg-Gly-Asp-R-Y

여기에서 X=H(수소) 또는 아미노산, R=Thr(트레오닌)또는 Cys(시스테인) ; 및

X-Arg-Gly-Asp-Ser-Y

여기에서 X=H도는 아미노산, Y=OH 도는 아미노산으로 표시된다.

미국특허 제4,683,291호에서 , 혈소판 기능의 억제는 혈소판에 결합하는 섬유소원의 높은 친화성 길항제로 고안된 합성 펩타이드로 나타낸다,

이 합성 펩타이드들은 C 터미날에서 Arg-Gly-Asp-Val 또는 Arg-Gly-Asp-Ser를 지니는 16개 까지의 아미노산 잔기로 이루어진다.

Arg-Gly-Asp 서열을 포함하고, 혈소판의 섬유소원 결합의 억제 인자로서 사용되는 유사한 합성 펩타이드는 하기 참고 문헌에서 발표되고 있다.

코제위악 등, Biochem, 23, 1767-1774(1984); 플로우 등, Proc, Natl Acad. Sci 82,8057-8061(1985) ; 루게리 등, Ibid 83, 5708-5712(1986); 하버스틱 등, Blood 66(4), 946-952(1985) ; 및 루오슬라티와 피에슈바체, Science 238, 491-497(1987) 또 다른 억제 펩타이드들로는 유럽 특허 출원 제 275, 748호와 제 298,820호에 기재되어 있다.

미국특허 제4,857,508호에서는, 혈소판 응집의 억제 인자로서 향상된 활성을 보이는, 새로운 테트라 펩타이드 유도체가 기재되어 있다. 이들 테트라 펩타이드 유도체들은 X-Gly-Asp-Y로 정의된 서열로 이루어지며, X와 Y는 이중 한쪽이 유기물질인 다양성을 함유한다. 예를들면 Arg-Gly-Asp- (O- methyl-Tyr)-NH₂이다.

본 발명에 따라 혈소판 응집의 억제 인자로서 생체내(in vivo)에서 효능인는 활성을 가진 새로운 펩타이드 모방성 화합물이 제공되었다. 이러한 억제 인자는 섬유소원 및/또는 세포와의 세포간질 단백질과 혈소판 gpIIb/IIIa 수용체 사이에서 길향 작용을 하는 것으로 믿어지고 있다. 본 발명의 새로운 억제 인자 화합물은 N-터미날에 구아니노기 (guanidino group)를 가지고, 체인 안에 슈도펩타이드 (pseudopeptide)나 펩타이드 모방성 결합 (peptide mimetic bond)을 가지고 있으며 C-터미날에는 페닐알라닌을 가지고 있다. 이 펩타이드 모방성 화합물은 하기의 화학구조식으로 표시된다.

이러한 화합물의 계통적 명칭은 N-[8-I(아미노이미노메틸)아미노]-1-옥소옥틸]-N-L-α-아스파티르- L-페닐알라닌이지만, 이후로는 8-구아니디옥타노일-아스파틸-페닐알라닌 또는 속기명으로 8-GO-Asp-Phe로 표기된다.

본 발명의 새로운 8-GO-Asp-Phe 펩타이드 모방성 화합물은 여러가지 생체외(in vitro)와 생체내(in vivo)의 실험을 통하여 얻어진 하기의 결과에 의해 우수한 혈소판 응집 억제 인자 활성이 있음을 입증한다 ;

·직접적으로 트롬빈으로 활성화된 인체 혈소판에 대한¹²⁵I-섬유소원의 결합을 억제한다.

·생체외에서 트롬빈, 콜라겐, A D P와 같은 다양한 응집 촉진제에 대하여 사람과 개에서의 혈소판 응집을 억제한다.

· 지속적인 정맥내 주입동안에 지속되는 항혈소판 효과를 유도한다.

·임상에서 요구된다면 항혈소판 효과의 빠른 중단을 가능하게 하는 비교적 짧은 지속기간을 수행한다.

·인체 호중구 엘라스타제(elastase) 분비 또는 과립감소에 아무런 영향을 나타내지 않는다.

·개들의 혈소판 응집의 90% 억제 작용을 얻기 위해 요구된 것보다 10배가 높은 정맥 투입율에서, 급성혈액 동력이나 심전계 그랙픽 효과가 결핍된다.

·쥐의 항 혈소판 ED₅₀보다 20배가 높은 화합물의 복용량을 취한 0.5, 1, 2 그리고 24시간 후에 생쥐에서 CNS 효과가 결핍된다.

미국특허 제4,879,313호에 설명되어 있는 유사하게 관련된 8-구아니디노-옥타노일 -Asp-2-(4-메톡시페닐)-에틸아미드(8-GO-Asp-MPE)와 비교할때, 새로운 8-GO-Asp-Phe가 용해도와 약효능을 눈에 뛰게 증가시켜다. 놀랍게도 8-GO-Asp-Phe는 8-GO-Asp-MPE보다 생체내에서 5배 가량 활동성이 높고, 5배에서 15배의 높은 효능을 보여준다.

전술한 실험결과를 기초로 하여 8-GO-Asp-Phe는 여러가지 치료조정들에 유용하게 사용될 수 있다.

예를들면, 섬유소 용해 치료 후, 혈전 붕괴 치료, 혈관 형성술, 관동맥 측로 수술과 같은 재혈관신생 과정후에 따르는 재폐쇄를 방지하는데 사용될 수 있다.

또 다른 가능성 있는 사용은 심근경색, 심근경색의 재발, 안정되지 않은 후두염, 말초의 동맥증, 대뇌의 신경증, 졸증과 혈소판의 과응집병들을 방지하고, 혈액투서, 제거과정에서 폐쇄를 방지하며 아테롬성 동맥경화증의 진행을 방지한다.

새로운 8-GO-Asp-Phe는 재환류 시간을 눈에 띄게 줄이며, 개에게 혈액 붕괴 작용물 t-PA를 투여했을 때 응괴의 용해 후에 재폐쇄되는 시간을 놀랍게도 연장시켜다. 그러므로 이화합물은 혈전 붕괴 치료에서 t-PA와 함께 투약되기에 유용할것이다.

특허 청구범위에서 이 발명에 따른 주요 문제를 설명하고 있으나, 첨부된 도면에 따른 발명의 상세한 설명의 실시예로 부터 더 잘 이해되리라고 믿어진다.

혈소판 응집 억재인자 화합물인 8-GO-Asp-Phe는 여러가지 편리한 과정에 의해 준비될 수 있다.

그러므로 C-터미날에 4-메톡시페닐 에틸아미드를 페닐 알라닌으로바꾸는 것을 제외하고 나머지가 유사한 미국특허 제 4,879,313호에서 설명한 8-구아니디노-옥타닐 -Asp-2-(4-메톡시페닐)에틸아미드(8-GO-Asp-MPE)를 만드는, 고체와 액체상 방법으로 만들어질 수 있다.

한가지 유용한 방법은 혈소판 응집 억제 인자 화합물인 8-GO-Asp-Phe를 수산화나트륨으로 메틸 에스터의 비누화를 한 뒤, 아스파틸-페닐알라닌 메틸 에스터(아스파탐)와 8-구아니디노옥타노익산의 결합에 의해 합성하는 것이다. 생성물은 차가운 메탄을 수용액 (pH 4.0)에서 결정화되고, 메탄을 수용액에서 재결정화되며, 전반적으로 73%의 수득률을 갖는다.

실험 준비과정에서, 8-구아니디노옥타노익산은 3,5-다이메틸피라조플-카복사미딘과 8-아미노옥타노익산의 반응에 의하거나, 구아니딘으로 부터 8-브로모옥타노익산의 반응에 의해 준비될 수 있다.

비록 제조방법에 대하여 상세히 설명되었지만, 본 발명의 8-GO-Asp-Phe는 어느 특정한 생산방법에 제한되어 있지 않다.

아래의 실시예들에 따라 발명은 더욱 상세하게 설명될 것이다. 본 발명은 이런 상세한 실시예들에만 국환되어 있지 않다.

[실시예 1]

A. 8-구아니디노-옥타노익산(8-Go)

3,5-다이메틸-피라졸 -1-카복사미딘(100g:0.5몰)과 N,N-다이아이소프로필에틸 아민(DIEA) (65g:0.5몰)을 다이옥세인(300ml)과 물(115ml)에서 현탁시켰다.

이러한 혼합물에 8-아미노- 옥타노익산 (48cg:0.3몰)을 교반중에 첨가하였다. 그런 다음 이 무색의 용액을 2일동안 환류시켰다. 생성물을 여과시킨 뒤에 물 (50ml)로 세번 세척하였다.

물질의 건조중량은 60g이었다 ; FAB-MS.(M+H)=202

B. 8-구아니디노-옥타노익산·HCI(8-Go·HCI)

8-GO·HCI은 0.1M 염산과 동당량으로 용해된 8-Go을 동결 건조시켜 준비하였다.

[실시예 2]

8-구아니디노 옥타노익산·HCI(39g : 195밀리몰), 다이석시니미딜 카보네이트(50g : 195밀리몰)과 4-다이메틸아미노피리딘(2g)을 피리딘/DMF(1 : 2 : 350ml )에 용해시켰다. 반응혼합물은 밤새실온에서 교반시켰다.

이렇게 교반시킨 용액에 Asp-Phe-OMe(50g ; 169밀리몰)의 현탁액과 물(150ml)에서 용해시킨 소디움 바이카보네이트(15g ; 169밀림몰)를 첨가하였다.

결합반응은 HPLC 분석에 의해 측정된 바에 의하면 20시간 내에 종결되었다. 혼합물을 진공에서 증발시켜 오일성 잔여물을 얻었으며 이 잔여물을 메탄올(150ml)에 용해시켰다. 이 용액(350ml)에 냉각조에서 교반시키면서 2.5N 수산화나트륨을 첨가하고 4N 염산(185ml)으로 반응 혼합물이 pH 4로 산성화될 때까지 5시간 동안 교반시켰다. 제조된 용액은 냉각되어 결정화되고 이러한 고체 산물은 여과와 건조에 의해 수집되었다.

생성물은 약간 가열하면서 함께 물(1.0리터)에 현탁시키고 투명한 용액이 얻어질 때까지 메탄올(400ml)을 첨가하였다.

생성물은 실온에서 냉각하여 결정화시켰고, 여과에 의해 수집되었다. 이 물질은 진공상태에서 오산화인 위에서 건조시켜서 64g의 8-GO-Asp-Phe 생성물을 얻었다.

결정화된 생성물 약간은 분석특성에 따라 프레파라티브 역상 크로마토그래피에 의해 정제되었다.

프레파라티브 역상 크로마토그래피는 4.5×30cm 칼럼(15-20마이크로 입자 크기, 마이크로-본다팩)을 이용하여 워터스 프랩 LC-3000 시스템으로 수행되었다. 포화상태로 NaHCO₃10ml에 용해된 8-GO-Asp-Phe 0.5g 샘플이 컬럼에 적용되고, 80ml/1분의 유동율로 30분 동안 5-20% CH₃CN(0.05% TFA)의 용매구배로 사용되었다. 단편들을 포함하는 생선들을 모아 동결 건조시켰다. 생성물의 회수율은 약 90% 정도였다.

HPLC 분석(바이닥 C-18 컬럼, 300Å 입자크기 ; 25분간 15-40% CH₃CN/ H₂O/0.05% TFA 구배, 1.5ml/분 유동율)은 215nM에서 99+% 이상의UV 흡수물질로 구성된 생성물의 UV 흡수물질을 나타냈다.

FAB-MS 생성물이 분자량 463.54를 가진 것으로 밝혀졌다.

2-D NMR 공명으로 (500MHZ. DMSO-d6) 표 1에서 나타낸 것과 완전히 일치하는 구조를 보여주고 있다.

아미노산 분석은 샘플 91wt%가 동일한 몰 비율로 페닐 알라닌과 아스파틱산을 포함하고 있는 것으로 나타냈다.

원소분석 :C₂₂H₃₃N₅O₆로 계산되었다;

탄소 :57.0, 수소 :7.17, 질소 :15.1.

측정 :탄소 :56.8, 수소 :7.08, 질소 15.0

[표 1]

*DMSO에 대한 ppm(2.5ppm

**8-구아니디노-옥타노일

[실시예 3]

8-GO-Asp-Phe가 혈소판 응집 억제 인자로 평가되었고, 아래와 같이 생체외와 생체내의 실험으로 8-구아니디노-옥타노일 -Asp-2-(4-메톡시페닐)-에틸아 마이드 (8 -GO-Asp-MPE)와/또는 RGDS와 비교되었다.

[섬유소원 결합 실험]

섬유소원 결합은 플로우등, Blood 70, 110-115(1987)에 설명된 것같이 실행되었다. 간략하게, 지난 2주동안 어떠한 항혈소판 약품도 사용하지 않은 자원자의 혈액은 CCD 완충액 (100mM 구연산나트륨, 136mM 포도당, pH 6.5)에 1/10양 만큼 수집하였다. 이 혈액은 1000xg에 3분동안 원심분리되어 혈소판이 많은 혈장을 플라스틱 파이펫으로 플라스틱 튜브에, 옮겨서 얼음위에 위치시켰다. 15분이 지난뒤에 차가운 CCD 완충액의 1/2을 첨가하고, 샘플은 2℃에서 10분 동안 900Xg에서 원심분리되었다. 상등액은 제거되고 혈소판펠렛은 원래 부피의1/2인 차가운 변경된 타이로드 완충액(137mM 염화나트륨, 2.6mM 염화칼륨, 12mM NaHCO₃,5.5mM 포도당, 15mM HEPES, 0.5% BSA, pH 7.4)에서 재현탁되었다. 37℃에서 30분간 배양시킨 뒤에 변경된 타이로드 완충액과 함께 4×10⁸혈소판/ml로 혈소판 숫자가 조정되었다.

혈소판 샘플(1X10⁸혈소판/ml)에 후기의 순서대로 첨가되었다: ADP(10μM), CaCl₂(lmM), 시험화합물, 그리고¹²⁵I 섬유소원(0.3μM)이 200μI의 양의 앞서말한 최종농도에 더해졌다. 샘플은 37℃에서 40분간 배양되었고, 50μI의 부분표본이 20% 자당패드(400μI)를 통해 8000xg에서 원심분리되었다.

튜브들은 재빨리 동결되었고 혈소판 펠렛을 지닌 끝부분이 절단되어 감마 신틸레이션 계수(gamma scintillation counting)에 의해 결합된¹²⁵I-섬유소원을 분석하였다. 각 실험에서의 특정한 결합은 표식되지 않은 섬유소원의 60배 초과의 상태에서 총합¹²⁵I-섬유소원 결합의 양으로 부터 감하여 결정하였다. 실험 결합의 효능은¹²⁵I-섬유소원 결합은 50% 억제하는 결합물의 농도 (IC₅₀)에 의해 결정되었다,

PRP에서 생체외의 인간 혈소판 응집

적어도 2주 동안 어떠한 항 혈소판 약을 복용하지 않은, 건강한 남자나 여자 혈액 제공자는 혈액을 제공하기 전 8시간 동안 절식시켰다. 3ml 의 0.129M 완충된 구연산염 (3.8%)을 함유한 30cc의 플라스틱 주사기 와 나비 주사기바늘을 사용하여 30ml 의 혈액을 수집하였다. 주사기는 혈액이 뽑아짐에 따라 구연산과 혼합하기 위해 조심스럽게 돌려졌다. 혈소판이 풍부한 혈장(PRP)은 파손됨이 없이 원심분리가 정지된 것을 용이하게 할 수 있도록 하면서 실온에서 10분간 100xg에서 원심분리하여 준비하였다. PRP는 플라스틱 파이펫으로 혈액에서 제거되고 상온에서 보관된 40ml 코닝 원추형의 살균 원심분리 튜브에 뚜껑을 닫은 채로 놓여졌다.

혈소판이 부족한 혈장은 (PPP) 파손됨이 없이 원심분리가 정지되는 것을 용이하게 할 수 있도록 하면서 실온에서 15분간 2000xg로 남은 혈액을 원심분리하여 준비하였다.

PRP는 1ml당 혈소판의 숫자가 2-3×10⁸가 되도록 PPP 로 조정되었다. 400μl의 준비된 PRP와 50μl의 시험될 화합물 또는 식염수가 페이톤 아그레고미터 (페이턴 사이언티픽 회사, 버팔로, 뉴욕)에서 37℃로 1분간 전배양되었다.

50μl의 아데노신이인산 (ADP) 50μM이 큐벳에 첨가되었고 응집은 1분 동안 관찰되었다. 모든 화합물은 이중으로 실험되었다. 결과들은 아래와 같이 계산되었다.

% 억제율=100-(대조구의 비율)

생체내에서의 쥐의 혈소판 감소증

숫쥐들[챨스 리버, CRL :CD( SD), 400-450g]이 사용되었다. 쥐들은 페노바르비탈 소듐(65mg/kg 베트실험실, 리미티드회사, 레넥사, KA)으로 마취되었다. 양쪽 경정맥을 노출시키기 위해 2개의 절개가 이루어졌다. 주입펌프(하바드 장치, 사우스 나틱, Mass.)와 19g 나비주사를 가진 5cc 주사기를 사용하여 실험화합물 또는 비히클을 3분동안 0.39ml/분이 속도로 왼쪽 경정맥에 주입하였다.

화합물/비히클의 주입 2분후에 콜라겐(60μg/kg)(헬레나 실험실, 버몬트, Tx)을 1ml 주사기로 오른쪽 경정맥을 투입하였다. 체강이 열려졌고, 혈액 샘플을 위해 정맥, 대정맥이 노출되었다. 콜라겐 주입 1분후에 화합물 주입이 정지되고, 0.3mg의 4.5% EDTA/Tris(0.1M)(pH 7.35)와 150μM 인도메타신을 함유한 3cc 주사기로 30초 안에 정맥, 대정맥으로부터 혈액을 체취하였다. 혈소판이 풍부한 혈장은 126xg에서 10분동안 혈액을 원심분리함으로써 준비되었다.

5μl의 PRP는 쿠울터 계수기(Coulter counter)내의 20ml의 아이소톤III(쿠울터, 아이소톤 용액)에서 계산되었다.

콜라겐-유도 응집의 억제 비율은 시험화합물과 콜라겐으로 처리한 동물중에서 a) 콜라겐을 주입받지 않은 동물(응집되지 않은 대조구)의 혈소판 숫자, b) 비하클과 콜라겐을 주이받은 동물(응집된 대조구)의 혈소판 숫자와 함께 혈소판 숫자를 비교하여 계산하였다. ED₅₀은 정맥내 투여된 실험 화합물을 위해 계산되었다.

이러한 분석의 결과들은 하기와 같다 :

[결과]

A. 혈소판에 대한 섬유소원의 결합

8-GO-Asp-Phe는 ADP로 자극된 세척된 인체의 혈소판에 대한¹²⁵I-섬유소원의 결합을 억제했다. 제 1도는 8-GO-Asp-Phe가 6.0×10^-7M의 IC₅₀으로 억제하는 것을 나타내었다.

8-GO-Asp-Phe는 혈소판의 섬유소원 결합을 억제하는데 8-GO-Asp-MPE보다 약 15배 정도 효능이 있고, RGDS 보다는 70배 정도의 효능이 있다. 결합 억제 곡선의 모양은 3가지 화합물이 모두 비슷했다.

B. 생체외에서의 혈소판 응집 억제 작용

혈소판 풍부한 혈장(PRP)은 새로이 뽑은 사람이나 개의 혈액 셈플을 통해 준비되었다. PRP는 ADP(제 2도에서 사람 PRP를 위해 설명된 것과 같이)나 콜라겐(제3도에서 개 PRP를 위해 설명된 것과 같이)이 첨가된 후에, 37℃에서 어그레고미터안에서 2분동안 8-GO-Asp-Phe나 8-GO-Asp-MPE로 배양했다. 응집의 정도는 PRP 용액을 통한 빛의 투과율 측정에 의해 관찰되었다. 이들 화합물은 ADP나 콜라겐에 응하여 사람이나 개의 PRP에서 농도에 비례하는 방식으로 혈소판의 응집을 억제했다.

사람과 개의 PRP 모두에서 8-GO-Asp-Phe는 8-GO-Asp-MPE보다 약 5배 정도 효능이 있었다.

사람 PRP는 응집 실험전에 혈장 단백질을 제거하기 위해 세척 과정이 제의되었다. 세척된 혈소판은 큐뱃속에서 시험 화합물과 배양되었고, 트롬빈(thrombin)과 응집되었다(결과들은 제4도와 표2에서 나타내었다).

8-GO-Asp-Phe는 세척된 혈소판에서 트롬빈 유도의 응집을 억제하는데 8-GO-Asp-MPE보다 5배 효능이 있었다.

[표 2]

생체외에서 8-GO-Asp-Phe가 활성이 있는 모든 경우에 있어서 단지 응집만 억제되었고, 여러가지 아고니스트(agonist)에 대한 혈소판 모양의 변화는 차단되지 않았다. 그러므로, 화합물은 혈소판 활성의 과정을 방해하지 않고, 섬유소원 결합 단계 다음의 응집과정을 차단하였다.

C. 생체내에서의 혈소판 응집의 억제

쥐에서의 콜라겐 유도 혈소판 감소증

콜라겐을 정맥 주입한 뒤에 쥐로 부터 체취한 혈액속의 혈소판 숫자는 정상 쥐의 혈소판 숫자와 비교했을 때 현저히 줄어 들었다. 혈액속에서의 콜라겐 존재는 혈소판의 활성과 응집을 유발한다. 이 응집된 혈소판 덩어리들은 소혈과 인트랩먼트에 의해 혈행으로 부터 제거되는데, 관찰된 침전 혈소판 숫자로 설명할 수 있다. 8-GO-Asp-Phe, 8-GO-Asp-MPE, 또는 RGDS는 콜라겐을 주입하기 2분전에 쥐에 정맥내로 주입되고, 콜라겐 주입후에 1분동안 계속하여, 혈소판 숫자에 대한 영향이 결정되었다(제5도). 8-GO-Asp-Phe는 ED₅₀가 0.05mg/kg일때 콜라겐(60μg/kg)로 유도된 혈소판 감소증을 복용량에 비례하는 방식으로 억제했다. 8-GO-Asp-Phe는 ED₅₀가 0.07mg /kg일 때 또한 영향력이 있었다. 반대로, RGDS는 10mg/kg 복용량까지 투여했을때, 50% 정도의 응집도 억제하지 않았다.

0.1mg/kg의 8-GO-Asp-Phe(2xED₅₀)의 정맥 투입은 3분동안 주입한 끝의 15분후에 최대의 활성을 보였고, 콜라겐으로 유도된 혈소판 감소증의 90% 억제를 보였다(제6도).

0.1mg/kg의 8-GO-Asp-Phe(2xED₅₀에서의 t1/2)후에 혈소판 응집 억제 인자 활성은 12분의 반감기로 감소했다. 이를 비교해 볼 때, 0.14mg/kg의 8-GO-Asp-MPE(2xED₅₀)는 43분의 반감기(t1/2)로 혈소판 감소증의 70% 감소를 나타냈다.

D. 생체밖에서 개의 콜라겐-유도 혈소판 응집의 억제

개들은 마취시키고 8-GO-Asp-Phe을 정맥내 주입하였다. 혈액 샘플이 채집되기 전에, 여러가지 투입량의 비율로 화합물이 주입되는 동안과 그 후에 PRP가 준비되었고 콜라겐에 대한 혈소판 응집 반응이 어그레고미터로 평가되었다.

다른 연구중에서, 8-GO-Asp-Phe는 1분에 걸쳐 큰 알약으로 투약되거나(제7도), 또는 2시간 동안 주입되었는데(제8도), 혈소판 응집의 안정된 상태를 이루기 위해 시행되었다.

8-GO-Asp-Phe는 상기의 어떠한 프로토콜(protocol)에서나 콜라겐으로 유도된 개의 혈소판 응집의 억제가 투입량에 비례하는 것을 나타냈다.

큰 알약의 주입은, 주입 5분후에 측정된 8-GO-Asp-MPE의 1.7mg/kg로 결정된 ED₅₀와 비교하여, 8-GO-Asp-Phe의 ED₅₀는 0.6mg/kg이었다(8-GO-Asp-Phe 활성의 짧은 반감기 때문에 투약 2분후에 또한 측정되었다. 8-GO-Asp-Phe는 주입 2분후에 측정했을때 ED₅₀가 0.30mg/kg이었다). 안정된 상태의 억제(45분부터 2시간 까지의 반응을 평균한 것에 의해 결정됨)에 대한 ED₅₀는 0.0075mg /kg/min이였다(비교해보면 8-GO-Asp-Phe에 대해 0.03mg/kg/min).

[실시예4]

8-GO-Asp-Phe는 재환류의 시간을 줄이고, 개에서, 혈전 붕괴의 매체인, 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA)의 투입에 의한 응혈의 용해후에 재폐쇄의 시간을 최대한으로 연장한다. 이러한 시험을 하기 위해 하기의 과정에 따른다 :

약 25kg 정도 되는 개들은 페노바비탈 30mg/kg 정맥주사로 마취되었다.

왼쪽 경정맥은 정맥내 주사를 위한 경로를 제공하기 위해 분리되고 배관되었다. 왼쪽 경동맥은 혈압을 측정하기 위해 배관되었다. 왼쪽 흉강절개술이 다섯째 늑골간 공간을 통해 실행되었다. 심막이 열렸고, 00비단 봉합을 사용하여 심막이피가 (Pericardial Cradle)가 조립되었다.

왼쪽 복측에서 내려오는 관의 동맥(LADCA)은 적어도 3cm 정도 거리로 부터 피포가 없도록 해부되었다. 모든 옆의 브랜치들은 가장 큰 한 개를 제외하고 4-0 또는 5-0의 비단 봉합으로 묶었다. 알맞은 크기의 전자기 흐름 탕침이 LADCA의 분리된 분절의 중앙 끝에 적용되었다. 보존된 옆의 브랜치들은 23g 바늘 아답터와 3가지 방법으로 조절되는 마개에 부착된 PE-50 카테테르로 배관되었다. 포장전선을 위해 만들어진 2mm 넓이의 프라스틱 기구가 단편의 말초 끝에 적용되었다. 비단 봉합의 여러조각들(약 10개)은 제거될 수 있는데 2-0과 4-0크기로서, 혈관 주위의 루우프를 조인 후에 흐름을 조정하도록 제공된 플라스틱 밴드의 루우프 안에 위치하고 있다. 단편을 통한 흐름은 플라스틱 밴드를 조임으로써 줄일 수 있고, 조정은 비단 봉합 부분을 제거함으로써 40-50% 정도의 흐름 감속이 가능할 수 있다. 기계적인 폐쇄가 충혈이 폐지되는 것을 확실히 하기 위해 실행되었다. 응혈이 형성된 부분을 데바키 핀셋으로 3-4번 압착함으로서 상처를 내었다. 플라스틱으로 거상 상태를 싸고, 아주 정교한 모스키토 클램프가 분절을 분리하고, 세는 것을 막기 위해 플라스틱 폐쇄기의 근위에, 그리고 흐름 탐침의 말초에 적용되었다.

혈액은 배관된 옆 브랜치를 통해 거두어 들였다. 만약 약간의 혈액이 분리된 분절에 남아 있으면 이것을 말초의 폐쇄기 가까이에 있는 클램프를 열어주므로써 식염수로 흘려 씻는다.

0.3ml의 혈액이 경정맥으로부터 제거된 뒤에, 0.1ml의 트롬빈(1000U/ml)이 분리된 분절로 주입되었다.

응혈은 "치유"되기 위해 15분동안 허용되었다. 혈액샘플은 PT(프로트롬빈 시간)과 APTT(활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간)의 측정을 위해 취하였다. 15분 동안의 끝에 모스키토 클램프는 제거되었는데, 먼저 근위의 클램프, 그리고 2분후에 말초의 클램프가 제거되었다. 만약 흐름 계량기가 아직도 0을 기록하면, 폐쇄적인 응혈의 존재를 나타내는데, 정맥을 통해 5000U의 헤파린이 주입되고, 옆 브랜치 카테테르가 제거되며, 옆 브랜치가 묶여진다.

요구된 대로 헤파린의 초기 투입후에 1시간 간격으로 정맥내 주입방법으로 1000U 헤파린의 첨가된 복용량이 투입되었다.

혈액 샘플은 혈소판 반응을 측정하기 위해(PT와 APPT) 취해졌는데. 최초의 헤파린 투입 바로 후, 그리고 아래에 표시한대로 정해진 시간에 취해졌다. 또 다른 30분이 경과한 후, 응혈의 폐쇄적인 본질이 형성되는 동안, 실험 화합물이 투입되었고, (큰 알약 주입이나 처음의 주입에 의한 방법으로, 적당한 통로에 의해서) 0.25mg/Kg t-PA의 주입이 정맥내 큰 알약 주입에 의해 투약되었다. t-PA의 투약은 한시간 동안 매 15분에 반복되거나, 재환류가 발생할 때까지 반복된다. 재환류는 응혈의 형성 바로전 혈관내에서 흐름의 양이 50% 재확립되는 것을 의미한다. 재환류될 때까지의 시간은 최초 t-PA 주입의 시간으로부터 측정된다. 혈액샘플은 응고인자와 혈소판 반응의 측정을 위한 재환류의 시간에서 취해졌다.

재폐쇄는 혈관내에서 흐름이 0 ml/min으로 되돌아가는 것을 의미하며, 재폐쇄까지의 시간은 재환류의 시간으로 부터 측정되었다. 최종의 혈액 샘플은 응집인자와 혈소판 반응의 측정으로 얻어진다.

동물들은 동물의 생리적 상태에 따라 용해후에 1-2시간 동안 지켜봐 주었다.

화합물은 재환류 시간을 줄이는 능력이나, 재폐쇄 시간을 늘리는 능력, 또는 이 2개의 능력 모두에 의해 평가되었다.

화합물의 최대 효율성은 시험기간 동안 재폐쇄의 실패로 정의한다. 화합물이 용해후에 재폐쇄를 이룩하는데 요구된 시간을 눈에 띄게 연장시켰더라도 화합물은 최대한의 효율성보다는 뒤떨어질 것이다. 이러한 약품들은 다른 복용량 양생법을 사용한 재 실험이 고려될 것이다.

임상적으로 유용한 제넨텍 액티베이즈 t-PA를 사용한 위의 시험결과가 아래의 도표 3과 제9도에서 설명되었다.

[표 3]

SEM=평균값의 표준 오차

본 발명의 새로운 펩타이드 모방성 화합물은 재래의 방법을 사용해서 포유류 숙주에 투여될 수 있는데, 제약적으로 인정할 수 있는 희석액이나 담체를 가진 처방의 비경구적 또는 구강 방법 투약을 말한다. 혈소판 응집 억제 인자로서 바람직한 투여 경로는 예를들면 정맥을 통하는 것과 비경구적인 것이다. 정상적인 생리 식염수, 사람의 알부민, 다른 희석액들과 담체와 함께 용액중의 펩타이드 모방성 화합물의 정맥투입은 실례가 있다. 치료적인 투용량 형태의 약학적으로 인정받을 수 있는 희석액이나 담체에서 활동적인 펩타이드 모방성 화합물의 적합한 처방은 예를들면 레밍톤의 약제학적 과학(Ed. 아써 오솔, 16 th ed., 1980, 맥 출판 회사., 이스톤, 펜실베니아)과 같은 약제학 분야의 일반적인 책을 참고로 준비할 수 있다.

개에서 혈소판 응집을 완전히 억제하는데 요구되는 주입율은 약 20-30μg /kg/분이다. 혈소판 반응의 완전한 억제를 원한다면, 개에서의 혈소판 투약 반응이 사람들의 반응과 직접적으로 측정된다고 할때, 24시간 동안의 주입마다(-3g/하루 총합 투약량), 약 43mg/kg의 약이 요구된다. 치료의 기간은 하루에서 여러날까지의 범위가 가능하다.

여러가지 다른 실시예들은 이 발표 후에 본 발명의 정신과 범위에서 벗어남이 없이, 당 기술분야의 숙련자에게는 명백해질 것이다. 모든 그러한 실시예들은 첨부된 특허 청구범위안에 포함되도록 한 것이다.

Claims

N-[8-[(아미노이미노메틸)아미노]-1-옥소옥틸]-N-L-α-아스파틸-L-페닐알라닌.
약학적으로 허용되는 담체내의 제1항의 화합물을 혈소판 응집을 억제하기에 효과적인 양으로 포유동물에게 투여함으로써 혈소판 응집을 억제하는 방법.
약학적으로 허용되는 담체내의 제1항의 화합물을 혈전형성의 억제에 효과적인 양으로 포유동물에게 투여함으로서 온혈 포유동물에서 혈전 형성을 억제하는 방법.
약학적으로 허용되는 담체내에 있는 제1항의 화합물.
재환류 시간을 단축하고 재폐쇄가 이루어지는 시간을 연장하기에 적합한 제1항의 화합물을 효과적인 양으로 공동투여함으로써 온혈 포유동물에 투여된 조직플라스미노겐 활성제의 혈전용해활성을 촉진하는 방법.