DE69110091T2 - Neuer Blutplättchenaggregationsinhibitor. - Google Patents

Neuer Blutplättchenaggregationsinhibitor.

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft eine neue Peptid-mimetische Verbindung, die in vivo eine starke Aktivität als Blutplättchenaggregations-Inhibitor aufweist.
  • Fibrinogen ist ein Glykoprotein, das als normaler Bestandteil des Blutplasmas vorhanden ist. Es nimmt an der Blutplättchenaggregation und Fibrinbildung im Blutgerinnungsmechanismus teil.
  • Blutplättchen sind Zellelemente, die im Vollblut vorkommen, die auch an der Blutgerinnung teilnehmen. Die Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen ist für die normale Funktion der Blutplättchen im Blutgerinnungsmechanismus wichtig. Wenn ein Blutgefäß verletzt wird, beginnen die sich an Fibrinogen bindenden Blutplättchen die Aggregation und bilden einen Thrombus. Die Wechselwirkung von Fibrinogen mit Blutplättchen geht durch einen Membran-Glykoproteinkomplex, der als gpIIb/IIIa bekannt ist, vonstatten; dies ist ein wichtiges Charakteristikum der Blutplättchenfunktion. Die Inhibitoren dieser Wechselwirkung sind für die Modulierung der Blutplättchen-Thrombusbildung nützlich.
  • Es ist auch bekannt, daß ein anderes großes Glykoprotein, genannt Fibronektin, das ein wichtiges extrazelluläres Matrix- Protein ist, mit Fibrinogen und Fibrin und mit anderen Strukturmolekülen, wie Actin, Collagen und Proteoglykanen in Wechselwirkung tritt. Es zeigte sich, daß verschiedene, relativ große Polypeptidframgente im Zellbindungsbereich von Fibronektin eine zellanhaftende Wirkung aufweisen. Vgl. U.S. Patente 4,517.686; 4,589.881; und 4,661.111. Diese Polypeptide enthalten eine innere Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS). Es zeigte sich, daß bestimmte, relativ kurze Peptidfragmente aus demselben Molekül die Zellhaftung an einem Substrat fördern, wenn sie auf dem Substrat immobilisiert sind, oder die Haftung inhibieren, wenn sie in solubilisierter oder suspendierter Form vorhanden sind. Vgl. U.S. Patente 4,578.079 und 4,614.517. Diese Peptide wurden als
  • X-Arg-Gly-Asp-R-Y,
  • worin X = H oder eine Aminosäure;
  • R = Thr oder Cys;
  • und
  • X-Arg-Gly-Asp-Ser-Y,
  • worin X = H oder eine Aminosäure,
  • Y = OH oder eine Aminosäure definiert.
  • Im U.S. Patent 4,683.291 ist die Inhibition der Blutplättchenfunktion mit synthetischen Peptiden, die so gestaltet sind, daß sie Hochaffinitäts-Antagonisten der Fibrinogenbindung an Blutplättchen sind, geoffenbart. Diese synthetischen Peptide haben bis zu 16 Aminosäurereste mit
  • Arg-Gly-Asp-Val oder
  • Arg-Gly-Asp-Ser am C-Terminus.
  • Ähnliche synthetische Peptide, die die Arg-Gly-Asp-Sequenz enthalten, und ihre Verwendung als Inhibitoren der Fibrinogenbindung an Blutplättchen sind von Koczewiak et al., Biochem. 23, 1767-1774 (1984); Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 8057- 8061 (1985); Ruggeri et al., Ibid. 83, 5708-5712 (1986); Ginsberg et al., J. Biol. Chem. 260 (7), 3931-3936 (1985); Haverstick et al., Blood 66 (4), 946-952 (1985); und Ruoslahti und Pierschbacher, Science 238, 491-497 (1987) geoffenbart. Noch andere solche inhibitorische Peptide sind in den EP-Patentanmeldungen 275.748 und 298.820 geoffenbart.
  • Im U.S. Patent 4,857.508 sind bestimmte neue Tetrapeptidderivate geoffenbart, die eine verbesserte Aktivität als Inhibitoren der Blutplättchenaggregation besitzen. Diese Tetrapeptidderivate enthalten die Sequenz X-Gly-Asp-Y, worin X und Y so definiert sind, daß sie eine Vielfalt von organischen Gruppen umfassen. Ein illustratives bevorzugtes Beispiel ist Arg-Gly- Asp-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2;.
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine neue Peptidmimetische Verbindung vorgesehen, die eine starke in vivo- Aktivität als Inhibitor der Blutplättchenaggregation besitzt. Man nimmt an, daß dieser Inhibitor durch antagonisierende Wechselwirkungen zwischen Fibrinogen und/oder extrazellulären Matrixproteinen und dem Blutplättchen-gpIIb/IIIa-Kezeptor wirkt. Die neue Inhibitorverbindung dieser Erfindung hat eine Guanidin- Gruppe am N-Terminus, eine Pseudopeptid- oder Peptid-mimetische Bindung in der Kette und eine Phenylalanin-Gruppe am C-Terminus. Diese Peptid-mimetische Verbindung kann durch die folgende chemische Struktur dargestellt werden:
  • Ihre systematische Bezeichnung ist N-[8-[(Aminoiminomethyl)- amino]-1-oxooctyl]-N-L-α-aspartyl-L-phenylalanin; doch wird sie nachstehend praktischerweise als 8-Guanidinooctanoyl-aspartylphenylalanin cder mit der Abkürzung 8-GO-Asp-Phe bezeichnet.
  • Durch die folgenden Ergebnisse, die in verschiedenen in vitro- und in vivo-Tests erhalten wurden, wird bewiesen, daß die neue Peptid-mimetische Verbindung der Erfindung, 8-GO-Asp-Phe, eine hervorragende Blutplättchenaggregations-Inhibitionaktivität besitzt:
  • Sie inhibiert direkt die Bindung von ¹²&sup5;I-Fibrinogen an mit Thrombin aktivierte Blutplättchen des Menschen.
  • Sie inhibiert die Aggregation von Blutplättchen von Mensch und Hund in vitro auf eine Vielfalt von Pro-Aggregationsstimuli: Thrombin, Collagen, ADP.
  • Sie induziert eine Langzeit-Antiblutplättchenwirkung während konstanter intravenöser Infusion.
  • Sie hat eine relativ kurze Wirkungsdauer, was eine rasche Beendigung der Antiblutplättchenwirkungen ermöglicht, wenn dies durch die klinische Situation erforderlich ist.
  • Sie zeigt keine Wirkungen auf die Freisetzung oder Degranulierung von neutrophiler Elastase beim Menschen. Sie hat keine akute hämodynamische oder elektrokardiographischen Wirkungen bei Hunden bei Infusionsraten die 10 mal höher als jene sind, die notwendig sind, um eine 90% Inhibition der Blutplättchenaggregation bei dieser Spezies zu erreichen.
  • Sie hat keine ZNS-Wirkungen bei Mäusen 0,5, 1, 2 und 24 Stunden nach einer Dosis der Verbindung, die 20mal größer als die Antiblutplättchen-ED&sub5;&sub0; der Ratte war.
  • Beim Vergleich mit dem nah verwandten, im U.S. Patent 4,879.313 beschriebenen 8-Guanidino-octanoyl-Asp-2-(4-methoxyphenyl)-ethylamid (8-GO-Asp-MPE) sieht man, daß das neue 8-GO- Asp-Phe unerwarteterweise eine wesentlich höhere Löslichkeit und Wirksamkeit hat. 8-GO-Asp-Phe ist überraschenderweise in vitro etwa 5- bis 15mal wirksamer und in vivo etwa 5mal wirksamer als 8-GO-Asp-MPE.
  • Auf der Basis der voranstehenden Testergebnisse nimmt man an, daß das 8-GO-Asp-Phe bei einer Vielfalt therapeutischer Interventionen geeignet ist, beispielsweise bei der Verhinderung der Re-Occlusion nach Re-Kanalisierungsverfahren, wie postfibrinolytische Therapie, thrombolytische Therapie, Angioplastie und Koronarbypass-Operationen. Andere potentielle Verwendungszwecke sind zur Prävention von Myokardinfarkt, rezidivierendem Myokardinfarkt, instabiler Angina, Erkrankung der peripheren Arterien, zerebraler Ischämie, Schlaganfall und Blutplättchenhyperaggregabilitätserkrankungen und zur Verhinderung der Occlusion bei Hämodialyse, Shunt-Verfahren und zur Verhinderung des Fortschreitens der Atherosklerose.
  • Es zeigte sich auch, daß das neue 8-GO-Asp-Phe bei Hunden die Zeit zur Reperfusion wesentlich verkürzt und die Zeit zum Eintreten einer Re-Occlusion nach Lyse eines Gerinnsels durch Verabreichung des thrombolytischen Mittels t-PA wesentlich verlängert. Somit sollte die Verbindung zur gemeinsamen Verabreichung mit t-PA bei thrombolytischen Therapien geeignet sein.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Obgleich die Beschreibung mit Patentansprüchen endet, in welchen besonders hervorgehoben und genau beansprucht wird, was als Gegenstand der vorliegenden Erfindung angesehen wird, nimmt man an, daß die Erfindung aus der folgenden detaillierten Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung zusammen mit den beiliegenden Zeichnungen besser verständlich ist, wobei die Figuren graphische Darstellungen, wie folgt, sind:
  • Fig. 1 zeigt die Inhibition der Fibrinogenbindung an gewaschenen Blutplättchen vom Menschen durch die jeweiligen Inhibitoren 8-GO-Asp-Phe ( ), 8-GO-Asp-MPE ( ) und RGDS (X), wobei die % der Fibrinogenbindung im Vergleich zur Kontrolle (ohne Inhibitor) gegen die Molkonzentration (M) des Inhibitors aufgetragen ist.
  • Fig. 2 zeigt die Inhibition der ADP-induzierten Blutplättchenaggregation im blutplättchenreichem Humanplasma durch 8-GO- Asp-Phe ( ) und 8-GO-Asp-MPE ( ), als % Blutplättchenaggregation im Vergleich zur Kontrolle (ohne Inhibitor) gegen die Molkonzentration (M) des Inhibitors aufgetragen.
  • Fig. 3 zeigt die Inhibition der Collagen-induzierten Blutplättchenaggregation in blutplättchenreichem Plasma vom Hund, durch 8-GO-Asp-Phe ( ) und 8-GO-Asp-MPE ( ), aufgetragen wie in Fig. 2.
  • Fig. 4 zeigt die Inhibition von Thrombin-induzierter Blutplättchenaggregation bei gewaschenen Blutplättchen vom Menschen durch 8-GO-Asp-Phe ( ) und 8-GO-Asp-MPE ( ), aufgetragen wie in Fig. 2.
  • Fig. 5 zeigt die Inhibition von Collagen-induzierter Thrombozytopenie bei der Ratte durch die jeweiligen Inhibitoren 8-GO- Asp-Phe ( ), 8-GO-Asp-MPE ( ) und RGDS (X), wobei die % Inhibition der Thrombozytopenie (Verringerung der Thrombozytenzählung) im Vergleich zur Kontrolle (ohne Inhibitor) gegen die Dosis (mg/kg) des Inhibitors aufgetragen ist.
  • Fig. 6 zeigt den Zeitverlauf für die Inhibition von Collagen-induzierter Thrombozytopenie bei der Ratte durch 8-GO- Asp-Phe ( ) und 8-GO-Asp-MPE ( ), wobei % Hemmung gegen die Zeit (min) aufgetragen ist.
  • Fig. 7 zeigt die Wirkung von 8-GO-Asp-Phe ( ) und 8-GO-Asp- MPE ( ) durch IV-Bolus auf ex vivo-Collagen-induzierte Blutplättchenaggregation bei Hunden, wobei die % Hemmung der Blutplättchenprobe im Vergleich zur Kontrolle (ohne Inhibitor) gegen die Dosis (mg/kg) des Inhibitors aufgetragen ist.
  • Fig. 8 zeigt die Wirkung einer IV-Infusion von 8-GO-Asp-Phe ( ) und 8-GO-Asp-MPE ( ) auf ex vivo-Collagen-induzierte Blutplättchenaggregation bei Hunden, aufgetragen wie in Fig. 7.
  • Fig. 9 zeigt die Wirkung von 8-GO-Asp-Phe auf die Reperfusion (Lyse) und Re-Occlusion im Lauf der Zeit (min) nach gemeinsamer Verabreichung mit t-PA bei Hunden, im Vergleich zur Kontrolle (ohne 8-GO-Asp-Phe) und ASA.
  • Die Blutplättchenaggegations-Inhibitorverbindung 8-GO-Asp- Phe kann mittels verschiedener praktischer Verfahren hergestellt werden. So kann sie durch Fest- und Lösungsphasenmethoden analog zu den Methoden, die im U.S. Patent 4,879.313 für die Herstellung von 8-Guanidino-octanoyl-Asp-2-(4-methoxyphenyl)-ethylamid (8-GO-Asp-MPE) beschrieben ist, hergestellt werden, nur daß das C-terminale 4-Methoxyphenylethylamid durch Phenylalanin ersetzt wird.
  • Bei einem geeigneten Verfahren wurde die Blutplättchenaggregations-Inhibitorverbindung 8-GO-Asp-Phe durch Kupplung von 8-Guanidinooctansäure mit Aspartyl-Phenylalaninmethylester (Aspartam), gefolgt von einer Verseifung des Methylesters mit Natriumhydroxid, synthetisiert. Das Produkt kristallisierte aus kaltem wässerigem Methanol (pH 4,0) aus und wurde danach aus wässerigem Methanol in einer Gesamtausbeute von 73% umkristallisiert. Bei Herstellungen im Labor wurde 8-Guanidinooctansäure entweder durch Umsetzung von 8-Aminooctansäure mit 3,5-Dimethylpyrazol-1-carboxamidin oder aus Guanidin und 8-Bromoctansäure hergestellt.
  • Obwohl hierin spezifische Herstellungsverfahren beschrieben sind, ist es verständlich, daß das 8-GO-Asp-Phe dieser Erfindung nicht auf irgendein spezifisches Herstellungsverfahren eingeschränkt ist.
  • Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung weiter in größerem Detail, obwohl es verständlich ist, daß die Erfindung nicht auf diese spezifischen Beispiele eingeschränkt ist.
    • Beispiel 1 A. 8-Guanidino-octansäure (8-GO)
  • 3,5-Dimethyl-pyrazol-1-carboxamidin (100 g; 0,5 mol) und N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) (65 g; 0,5 mol) wurden in Dioxan (300 ml) und Wasser (115 ml) suspendiert. 8-Amino-octansäure (48 cg; 0,3 mol) wurde unter Rühren zur Mischung zugegeben. Die farblose Lösung wurde dann 2 Tage lang am Rückfluß gehalten. Das Produkt wurde filtriert und mit Wasser (3 x 50 ml) gewaschen.
  • Das getrocknete Material wog 60 g; FAB-MS: (M+H) = 202.
    • B. 8-Guanidino-octansäure HCl (8-GO HCl)
  • 8-GO HCl wurde durch Lyophilisieren von 8-GO, gelöst in einem Äquivalent von 0,1 M HCl, hergestellt.
    • Beispiel 2
  • 8-Guanidinooctansäure HCl (39 g; 195 mmol), Disuccinimidylcarbonat (50 g; 195 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (2 g) wurden in Pyridin/DMF (1:2; 350 ml) gelöst. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Zu dieser heftig gerührten Lösung wurde eine Suspension von Asp-Phe-OMe (50 g; 169 mmol) und Natriumbicarbonat (15 g; 169 mmol) in Wasser (150 ml) zugegeben. Die Kupplungsreaktion war in 20 Stunden vollständig, was mittels analytischer HPLC-Analyse bestimmt wurde. Die Mischung wurde im Vakuum zu einem öligen Rückstand eingedampft, welcher in Methanol (150 ml) gelöst wurde. Zu dieser Lösung (350 ml), die in einem Eisbad gerührt wurde, wurden 2,5 N NaOH (280 ml) zugegeben, und es wurde 5 Stunden lang weitergerührt, zu welchem Zeitpunkt die Reaktionsmischung mit 4 N HCl (185 ml) auf pH 4 angesäuert wurde. Die resultierende Lösung wurde gekühlt, um eine Kristallisierung zu bewirken, und das feste Produkt wurde durch Filtration gesammelt und luftgetrocknet. Das Produkt wurde in Wasser (1,0 Liter) unter gelindem Erhitzen suspendiert, und Methanol (400 ml) wurde zugegeben, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Das Produkt kristallisierte nach Abkühlen auf Raumtemperatur aus und wurde durch Filtration gesammelt. Dieses Material wurde im Vakuum über Phosphor(III)-pentoxid getrocknet, was 64 g des Produkts 8-GO- Asp-Phe ergab.
  • Ein Teil des kristallinen Produkts wurde mittels präparativer Reversphasen-Chromatographie zwecks analytischer Charakterisierung gereinigt.
  • Die präparative Reversphasen-Chromatographie wurde mit einem Waters Prep LC-3000-System unter Verwendung einer 4,5 x 30 cm- Säule (15-20 u Teilchengröße, u-Bondapak) durchgeführt. Eine 0,5 g-Probe von 8-GO-Asp-Phe, gelöst in 10 ml gesättigtem NaHCO&sub3;, wurde auf die Säule aufgetragen und einem Lösungsmittelgradienten von 5-20% CH&sub3;CN (0,05% TFA) während 30 min mit einer Fließgeschwindigkeit von 80 ml/min unterzogen. Die produkthältigen Fraktionen wurden gepoolt und lyophilisiert. Es wurden etwa 90% Produkt gewonnen.
  • Analytische HPLC (Vydac 0-18-Säule, 300 Å Porengröße; 15-40% CH&sub3;CN/H&sub2;O/0,05% TFA Gradient während 25 min, Fließgeschwindigkeit 1,5 ml/min) mit UV-Detektion bei 215 nM zeigte ein Produkt, das 99+% des UV-absorbierenden Materials ausmacht.
  • FAB-MS identifizierte ein Produkt mit MW 463,54.
  • 2-D NMR-Resonanzzuordnungen (500 MHz, DMSO-d6) stimmen mit der Struktur genau überein und sind in Tabelle 1 gezeigt.
  • Aminosäureanalyse zeigte an, daß 91 Gew.-% der Probe Phenylalanin und Asparaginsäure in äquimolarem Verhältnis enthielten.
  • Elementaranalyse: Berechnet für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub3;N&sub5;O&sub6;; C 57,0, H 7,17, N 15,1; gefunden: C 56,8, H 7,08, N 15,0. TABELLE 1 Zuordnungen der chemischen Verschiebung von 8-Guanidinooctanoyl-aspartyl-phenylalanin bei 30ºC in DMSO d-6*. Rest andere Multiplett Guanidino *ppm in bezug auf DMSO (2,5 ppm). ** 8-Guanidino-octanoyl
    • Beispiel 3
  • 8-GO-Asp-Phe wurde als Blutplättchenaggregationsinhibitionsmittel bewertet und mit 8- Guanidino-octanoyl-Asp-2-(4-methoxyphenyl)-ethylamid (8-GO- Asp- MPE) und/oder RGDS mittels in vitro- und in vivo-Untersuchungen wie folgt verglichen:
    • Fibrinogenbindungstest
  • Die Fibrinogenbindung wurde im wesentlichen wie von Plow et al., Blood 70, 110-115 (1987) beschrieben, durchgeführt. Kurz gesagt wurde Blut von freiwilligen Testpersonen, die in den vorangehenden zwei Wochen keine Antiblutplättchenmedikamente genommen hatten, in 1/10 Volumen CCD-Puffer (100 mM Natriumcitrat, 136 mm Glucose, pH 6,5) gesammelt. Das Blut wurde 3 min lang bei 1000 x g zentrifugiert, und Blutplättchen-reiches Plasma wurde mit einer Kunststoffpipette in ein Kunststoffröhrchen transferiert und auf Eis gegeben. Nach 15 min wurde 1/2 Volumen eiskalter CCD-Puffer zugegeben, und die Probe wurde 10 min lang bei 2ºC bei 900 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert, und das Blutplättchen-Pellet wurde vorsichtig in 1/2 des ursprünglichen Volumens von eiskaltem modifiziertem Tyrode-Puffer (137 mm NaCl, 2,6 mM KCl, 12 mM NaHCO&sub3;, 5,5 mM Glucose, 15 mM HEPES, 0,5% BSA, pH 7,4) resuspendiert. Nach 30minütiger Inkubation bei 37ºC wurde die Thrombozytenzählung mit modifiziertem Tyrode-Puffer auf 4x10&sup8; Blutplättchen/ml eingestellt. Zu Blutplättchenproben (1x10&sup8; Blutplättchen/ml) wurde der Reihe nach zugegeben: ADP (10 uM), CaCl&sub2; (1 mM), Testverbindung und ¹²&sup5;I-Fibrinogen (0,3 uM) auf die zuvor erwähnten Endkonzentrationen in einem Volumen von 200 ul. Die Proben wurden 40 min lang bei 37ºC inkubiert, und 50 ul Aliquots wurden bei 8000 x g durch eine 20% Saccharose-Schicht (400 ul) zentrifugiert. Die Röhrchen wurden rasch gefroren, und die das Blutplättchen-Pellet enthaltenden Spitzen wurden abgeschnitten und mittels Gamma-Szintilliationszählung auf gebundenes 125I- Fibrinogen untersucht. Die spezifische Bindung wurde in jedem Test bestimmt, indem von der Gesamtbindung die Menge an 125I- Fibrinogen, das in Anwesenheit eines 60fachen Überschusses an unmarkiertem Fibrinogen gebunden war, subtrahiert wurde. Die Stärke der Testverbindungen (IC&sub5;&sub0;) wurde als die Konzentration der Verbindung, die zur Inhibition von 50% der 125I- Fibrinogenbindung nötig war, bestimmt
    • In vitro-Blutplättchenaggregation vom Menschen in PRP
  • Gesunde männliche oder weibliche Spender, die mindestens 2 Wochen lang keine Antiblutplättchenarzneistoffe eingenommen hatten, ließ man vor der Blutabnahme 8 Stunden lang fasten; danach wurden 30 ml Vollblut unter Verwendung einer "Butterfly"- Nadel und einer 30 cc Kunststoffspritze mit 3 ml von 0,129 M gepuffertem Natriumcitrat (3,8%) gesammelt. Die Spritze wurde zur Mischung des Citrats während der Blutabnahme sorgfältig gedreht. Blutplättchenreiches Plasma (platelet richt plasma, PRP) wurde durch 10minütiges Zentrifugieren bei Raumtemperatur bei 100 x g hergestellt, wobei man die Zentrifuge ohne Bremsen bis zum Stillstand auslaufen ließ. Das PRP wurde mit einer Kunststoffpipette vom Blut entfernt und in ein steriles, konisches 50 ml-Corning-Zentrifugenröhrchen mit Kunststoffkappe gegeben, das auf Raumtemperatur gehalten wurde. Blutplättchenarmes Plasma (platelet poor plasma, PPP) wurde durch 15minütiges Zentrifugieren des restlichen Bluts bei Raumtemperatur bei 2000 x g hergestellt, wobei man die Zentrifuge ohne Bremsen bis zum Stillstand auslaufen ließ. Das PRP wurde mit PPP auf eine Zählung von 2-3 x 10&sup8; Blutplättchen pro ml eingestellt. 400 ul der PRP-Präparation und 50 ul der zu testenden Verbindung oder von Kochsalzlösung wurden 1 min lang bei 37ºC in einem Payton- Aggregometer (Payton Scientific, Inc., Buffalo, N.Y.) vorinkubiert. 50 ul Adenosin-5'-diphosphat (ADP) (50 uM) wurden in die Küvetten zugegeben, und die Aggregation wurde 1 min lang überwacht. Alle Verbindungen werden im Duplikat getestet. Die Ergebnisse werden wie folgt berechnet: Prozent der Kontrolle = [(maximale OD minus Anfangs-OD der Verbindung) geteilt durch (maximale OD minus Anfangs-OD der Kontroll-Kochsalzlösung)] x 100. Die % Inhibition = 100 - (Prozent der Kontrolle).
    • In vivo-Thrombozytopenie der Ratte
  • Es wurden männliche Ratten [Charles River, CRL:CD(SD), 400-- 450 g] verwendet. Die Ratten wurden mit Na-Pentobarbital (65 mg/kg, Vet Labs, Limited, Inc., Lenexa, KA) anästhesiert. Zwei Einschnitte wurden vorgenommen, um beide Jugularvenen freizulegen. Unter Verwendung einer Infusionspumpe (Harvard Apparatus, South Natick, Mass.) und einer 5 cc-Spritze mit einem 19 g- "Butterfly" wurde die Testverbindung oder Träger in die linke Jugularvene mit einer Rate von 0,39 ml/min 3 min lang infundiert. Nach 2minütiger Verbindung/Träger-Infusion wurde Collagen (60 ug/kg) (Helena Laboratories, Beaumont, TX) mit einer 1 ml- Spritze in die rechte Jugularvene injiziert. Die Körperhöhle wurde geöffnet, und die Vena cava wurde zur Blutprobennahme freigelegt. Eine Minute nach der Collageninjektion wurde die Infusion der Verbindung gestoppt, und Blut aus der Vena cava (innerhalb von 30 sec) mit einer 3 cc Spritze, die 0,3 mg 4,5% EDTA/Tris (0,1 M) (pH 7,35) plus 150 uM Indomethacin enthielt, zur Probe entnommen. Blutplättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch 10minütiges Zentrifugieren des Bluts bei 126 x g hergestellt. Fünf ul PRP wurden in 20 ml Isoton III (Coulter, isotonische Lösung) in einem Coulter-Counter gezählt.
  • Die Prozent Inhibition der durch Collagen herbeigeführten Aggregation wurde durch Vergleich der Thrombozytenzählungen bei Tieren, die mit Testverbindung und Collagen behandelt wurden, (a) mit Thrombozytenzählungen für Tiere, die kein Collagen erhielten (nicht-aggregierte Kontrolle) und (b) mit Thrombozytenzählungen für Tiere, die Träger und Collagen erhielten (aggregierte Kontrolle) errechnet. Die ED&sub5;&sub0; wurden für die intravenös verabreichten (i.v.) Testverbindungen berechnet.
  • Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind wie folgt:
    • ERGEBNISSE A. Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen.
  • 8-GO-Asp-Phe inhibierte die Bindung von ¹²&sup5;I-Fibrinogen an ADP-stimulierte, gewaschene Blutplättchen vom Menschen. Fig. 1 zeigt daß es mit einer IC&sub5;&sub0; von 6,0 x 10&supmin;&sup7; M inhibiert wird.
  • 8-GO-Asp-Phe war um etwa das 15fache wirksamer als 8-GO-Asp- MPE bei der Inhibierung der Bindung von Fibrinogen an Blutplättchen, und etwa 70 mal mehr wirksam als RGDS. Die Form der Bindungsinhibitionskurve war für alle drei Verbindungen ähnlich.
    • B. Inhibition der Blutplättchenaggregation in vitro.
  • Blutplättchenreiches Plasma (PRP) wurde aus frisch abgenommenen Blutproben von Menschen oder Hunden hergestellt. PRP wurde dann 2 min lang in einer Aggregometer-Küvette bei 37ºC mit 8-GO-Asp-Phe oder 8-GO-Asp-MPE inkubiert, wonach entweder ADP (wie für PRP vom Menschen in Fig. 2 veranschaulicht) oder Collagen (für PRP vom Hund in Fig. 3 veranschaulicht) (Tab. 2) zugegeben wurde. Das Ausmaß der Aggregation wurde durch Messung des Lichtdurchlaßgrades durch die PRP-Lösung überwacht. Beide Verbindungen inhibierten die Blutplättchenaggregation in PRP von Mensch und Hund als Reaktion auf ADP bzw. Collagen in Abhängigkeit von der Konzentration.
  • In PRP von sowohl dem Menschen als auch vom Hund war 8-GO- Asp-Phe etwa 5mal wirksamer als 8-GO-Asp-MPE.
  • PRP vom Menschen wurde auch einem Waschverfahren unterzogen, um vor der Aggregationsuntersuchung Plasmaproteine zu entfernen. Gewaschene Blutplättchen wurden dann in der Küvette mit einer Testverbindung inkubiert und dann mit Thrombin aggregiert (die Ergebnisse sind in Fig. 4, Tabelle 2, veranschaulicht).
  • 8-GO-Asp-Phe war zur Inhibition der mit Thrombin induzierten Aggregation bei gewaschenen Blutplättchen 5mal wirksamer als 8- GO-Asp-MPE. TABELLE 2 Zusammenfassung der in vitro-Aktivität zur Inhibition der Blutplättchenaggregation durch 8-GO-Asp-Phe iund 8-GO-Asp-MPE in vitro: IC&sub5;&sub0; (M) Human-gewaschen (Thrombin) Hunde(Collagen)
  • In allen Fällen, in welchen sich 8-GO-Asp-Phe in vitro als aktiv erwies, war nur die Aggregation inhibiert, während eine Formveränderung der Blutplättchen als Reaktion auf die verschiedenen Agonistenangriffe nicht blockiert wurde. So greift die Verbindung nicht in das Verfahren der Blutplättchenaktivierung ein, sondern blockiert eher den Aggregationsprozeß im nachfolgenden Fibrinogenbindungsschritt
    • C. Inhibition der Blutplättchenaggregation in vivo Collagen-induzierte Thrombozytopenie bei der Ratte.
  • Im Vergleich zu normalen Zählungen ist die Anzahl von Blutplättchen in von Ratten entnommenem Blut nach intravenöser Injektion von collagen wesentlich reduziert. Die Anwesenheit von Collagen im Blut bewirkt eine Aktivierung und eine Aggregation der Blutplättchen. Diese aggregierten Blutplättchenmassen werden durch mikrovasculäres Einfangen aus dem Kreislauf entfernt, was für das beobachtete Absinken der Thrombozytenzahl verantwortlich ist. 8-GO-Asp-Phe, 8-GO-Asp-MPE oder RGDS wurde Ratten zwei Minuten lang vor der Collageninjektion intravenös infundiert, nach der Collageninjektion eine weitere Minute lang fortgesetzt, und die Wirkung auf die Anzahl der Blutplättchen wurde bestimmt. (Fig. 5).
  • 8-GO-Asp-Phe inhibierte die durch Collagen (60ug/kg) induzierte Thrombozytopenie in Abhängigkeit von der Dosis, mit einer ED&sub5;&sub0; von 0,05 mg/kg. 8-GO-Asp-MPE war auch bei einer ED&sub5;&sub0; von 0,07 mg/kg wirksam. Dagegen inhibierte RGDS die Aggregation bei Dosen bis zu 10 mg/kg nicht um 50%.
  • Die intravenöse Verabreichung von 0,10 mg/kg 8-GO-Asp-Phe (2 x ED&sub5;&sub0;) zeigte eine maximale Aktivität 15 min nach Ende einer 3minütigen Infusion und führte zu einer 90% Inhibition der Collagen-induzierten Thrombozytopenie (Fig. 6).
  • Nach 0,1 mg/kg 8-GO-Asp-Phe (t1/2 bei 2 x ED&sub5;&sub0;) nahm die Blutplättchenaggregationsinhibitionsaktivität mit einer Halbwertszeit von 12 min ab. Im Vergleich dazu führten 0,14 mg/kg 8-GO-Asp-MPE (2 x ED&sub5;&sub0;) zu einer 70% Reduktion der Thrombozytopenie bei einer t1/2 von 43 min.
    • D. Inhibition von Collagen-induzierter ex-vivo-Blutplättchenaggregation bei Hunden
  • Hunde wurden anästhesiert und erhielten intravenöse Infusionen von 8-GO-Asp-Phe. Vor, während und nach der Infusion der Verbindung in verschiedenen Dosisraten wurden Blutproben entnommen, PRP hergestellt, und die Blutplättchenaggregationsreaktionen auf Collagen wurden in einem Aggregometer ausgewertet. In separaten Untersuchungen wurde 8-GO-Asp-Phe als Bolus im Laufe einer Minute (Fig. 7) verabreicht oder 2 h lang (Fig. 8) infundiert, um gleichbleibende Blutplättchenreaktionen zu erhalten.
  • 8-GO-Asp-Phe erzeugte eine Dosis-abhängige Inhibition der Collagen-induzierten Blutplättchenaggregation beim Hund bei jedem der Protokolle. Bei Bolus-Injektionen war die ED&sub5;&sub0; für 8- GO-Asp-Phe 0,6 mg/kg, im Vergleich zur ED&sub5;&sub0; von 1,7 mg/kg, die für 8-GO-Asp-MPE bestimmt wurde, was 5 min nach der Injektion bewertet wurde (Wegen der kurzen Halbwertszeit von 8-GO-Asp-Phe wurde die Aktivität auch 2 min nach der Verabreichung bewertet. 8-GO-Asp-Phe hatte bei einer Messung 2 min nach der Injektion eine ED&sub5;&sub0; von 0,30 mg/kg). Die ED&sub5;&sub0; zur gleichbleibenden Inhibition (bestimmt, indem man den Duchschnitt der Reaktionen von 45 min bis 2 h nahm) betrug 0,0075 mg/kg/min (im Vergleich zu 0,03 mg/kg/min für 8-GO-Asp-MPE).
    • Beispiel 4
  • 8-GO-Asp-Phe wurde als Mittel zur Kürzung der Zeit zur Reperfusion und zur Verlängerung der Zeit zur Erreichung einer Re-occlusion nach Lyse eines Gerinnsels durch Verabreichung des thrombolytischen Mittels, Gewebsplasminogenaktivator (t-PA) bei Hunden bewertet. Für diesen Test wurde die folgende Vorgangweise verwendet:
  • Hunde mit einem Gewicht von etwa 25 kg werden mit Pentobarbital, 30 mg/kg i.v., anästhesiert. Die linke Jugularvene wird isoliert und kanüliert, um einen Weg für i.v.-Injektionen zu schaffen. Die linke Halsschlagader wird zum Zweck des Blutdruckmessens kanüliert. Eine Thoracotomie wird links bis zum fünften Zwischenrippenraum durchgeführt. Das Perikard wird geöffnet, und unter Verwendung von 00 Seidennähten wird eine Perikard-"Wiege" konstruiert. Die linke vordere absteigende Coronararterie (left anterior descending coronary artery, LADCA) wird aus ihrer Hülle auf eine Länge von mindestens 3 cm seziert. Alle Seitenäste außer einem großen werden mit 4-0 oder 5-0 Seidennähten ligiert. Eine elektromagnetische Strömungssonde von geeigneter Größe wird an das proximale Ende des isolierten LADCA-Segments angelegt. Der zurückbehaltene Seitenast wird mit einem PE-50-Katheter kanüliert, der an einem 23 g-Nadeladapter und einem 3-Weg-Absperrhahn befestigt ist. Eine 2 mm breite Kunststoffvorrichtung zum Umhüllen von Drähten wird am distalen Ende des Segments angebracht. Mehrere Stück Seidennähte, Größe 2-0 und 4-0, (etwa 10 Stück), die entfernt werden können, werden in die Schleife des Kunststoffbandes placiert, um nach dem Festziehen der Schleife um das Gefäß die Strömung einstellen zu können.
  • Die Strömung durch das Segment wird durch Festziehen des Plastikbandes verringert, und durch Entfernen der Seidennahtsegmente werden Einstellungen vorgenommen, um eine 40-50% Strömungsverringerung zu erreichen. Mechanische Occlusionen werden vorgenommen, um zu gewährleisten, daß die Hyperämie beseitigt wird. Das Segment, in welchem das Gerinnsel gebildet wird, wird verletzt, indem es 3 oder 4 mal mit einer Debakey- Pinzette zusammengedrückt wird. Sehr feine Moskito-Klemmen, deren Sägezähne mit Kunststoff überzogen sind, werden distal an der Strömungssonde und proximal an der Kunststoff-Occludiervorrichtung angebracht, um das Segment zu isolieren und ein Durchsickern zu verhindern. Blut wird durch den kanülierten Seitenzweig entnommen. Wenn im isolierten Segment etwas Blut zurückbleibt, wird es durch Öffnen der Klemme in der Nähe der distalen Occludiervorrichtung fortschreitend mit Kochsalzlösung gespült. Unter Verwendung des kanülierten Seitenzweiges werden 0,1 ml Thrombin (1000 E/ml) in das isolierte Segment injiziert, gefolgt von 0,3 ml Blut, das aus der Jugularvene entfernt wurde. Man läßt das Gerinnsel 15 min lang "aushärten".
  • Eine Blutprobe wird genommen, um die PT (Prothrombinzeit) und die APTT (aktivierte partielle Thromboplastinzeit) zu messen. Am Ende des 15minütigen Zeitraumes werden die Moskito- Klemmen entfernt, und zwar zuerst die proximale Klemme und 2 min später die distale Klemme. Wenn der Strömungsmesser noch immer 0 Strömung registriert, was das Vorhandensein eines occlusiven Gerinnsels anzeigt werden 5000 E Heparin i.v. gegeben, der Seitenzweigkatheter wird entfernt, und der Seitenzweig wird abgebunden. Weitere Dosen von 1000 E Heparin werden nach der ersten Heparindosis je nach Bedarf in einstündigen Intervallen i.v. verabreicht.
  • Kurz nach der ersten Verabreichung von Heparin und zu ausgewählten Zeiten, wie nachstehend angegeben, wird eine Blutprobe zur Messung der Blutplättchenreaktivität, PT und APPT entnommen. Nachdem weitere 30 min verstrichen sind, während welcher bestätigt wird, daß das Gerinnsel occludiert, werden Testverbindungen verabreicht (entweder durch Bolus-Injektion oder durch den Beginn von Infusionen, wie es passend ist und auf dem geeigneten Weg), und eine Injektion von 0,25 mg/kg t-PA wird durch i.v. Bolus-Injektion verabreicht. Die Verabreichung von t-PA wird alle 15 min bis zu einer Stunde wiederholt, bis eine Reperfusion eintritt. Reperfusion ist als die Wiederherstellung von 50% der Strömungsmenge im Gefäß vor der Gerinnselbildung definiert. Die Zeit bis zur Reperfusion wird von der Zeit der ersten t-PA- Injektion an gemessen. Zum Zeitpunkt der Reperfusion wird eine Blutprobe zur Messung der Koagulationsfaktoren und der Reaktivität der Blutplättchen entnommen.
  • Reocclusion ist definiert als das Zurückkehren der Strömung auf 0 ml/min im Gefäß und die Zeit bis zur Reocclusion wird ab der Zeit der Reperfusion gemessen. Eine letzte Blutprobe wird zur Messung der Koagulationsfaktoren und der Reaktivität der Blutplättchen erhalten.
  • Die Tiere werden nach der Lyse 1-2 Stunden lang beobachtet, je nach dem physiologischen Zustand des Tieres.
  • Die Verbindungen werden im Hinblick auf ihre Fähigkeit, die Zeit zur Reperfusion zu verkürzen, die Zeit zur Reocclusion zu verlängern, oder beides, bewertet.
  • Die maximale Wirksamkeit einer Verbindung ist als das Nichtstattfinden einer Reocclusion während der Dauer des Tests definiert. Verbindungen können weniger als maximal wirksam sein, wenn sie zu einer bedeutenden Verlängerung der Zeit führen, die nach der Lyse zur Erreichung einer Reocclusion notwendig ist. Solche Mittel werden zum erneuten Testen unter Verwendung eines anderen Dosierungsschemas in Betracht gezogen.
  • Die Ergebnisse des obigen Tests sind in der nachstehenden Tabelle 3 und in Fig. 9 angegeben, wobei klinisch erhältliche Genentech Activase t-PA verwendet wurde. TABELLE 3 A. Zeit bis zur Lyse (Minuten) B. Zeit bis zur Re-occlusion (Minuten) Behandlung Kontrolle Aspirin (ASA) SEM - Standardfehler des Mittelwertes (Standard Error of the Mean)
  • Die neue Peptid-mimetische Verbindung dieser Erfindung kann zur Verabreichung an einen Säugerwirt mit herkömmlichen Mitteln, wie mittels parenteraler oder oraler Verabreichungsverfahren, vorzugsweise in Formulierungen mit pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungs- oder Trägermitteln, verwendet werden. Der bevorzugte Verabreichungsweg als Blutplättchenaggregationsinhibitor ist parenteral, z.B. intravenös. Die intravenöse Verabreichung der Peptid-mimetischen Verbindung in Lösung mit normaler physiologischer Kochsalzlösung, Humanalbumin und anderen solchen Verdünnungs- und Trägermitteln dient zur Veranschaulichung. Andere geeignete Formulierungen der aktiven Peptid-mimetischen Verbindung in pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungs- und Trägermitteln in therapeutischer Dosierungsform können durch Bezugnahme auf allgemeine Texte auf dem Gebiet der Pharamzie, wie beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Hrsgb. Arthur Osol, 16. Auflage, 1980, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania, hergestellt werden.
  • Die zur vollständigen Inhibition der Blutplättchenaggregation beim Hund notwendige Infusionsrate war etwa 20-30 ug/kg/min. Unter der Annahme, daß eine vollständige Inhibition der Blutplättchenreaktivität erwünscht ist, würden etwa 43 mg/kg des Arzneistoffs pro 24stündiger Infusionszeit ( 39/Tag, Gesamtdosis) notwendig sein, wenn man die Blutplättchen-Dosis- Reaktion bei Hunden im gleichen Maßstab auf Menschen überträgt. Die Dauer der Therapie kann von einem bis zu mehreren Tagen reichen.
  • Verschiedene andere Beispiele sind für den Fachmann nach dem Lesen der vorliegenden Offenbarung augenscheinlich. Alle derartigen Beispiele sollen im Bereich der beigefügten Ansprüche eingeschlossen sein.

Claims (8)

1. N-[8-[(Aminoiminomethyl)-amino]-1-oxooctyl]-N-L-α-aspartyl- L-phenylalanin.
2. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Verbindung des Anspruchs 1 aufweist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, welche die Verbindung des Anspruchs 1 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel aufweist.
4. Verwendung der Verbindung des Anspruchs 1 zur Herstellung eines Medikaments.
5. Verwendung nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zur Inhibition der Blutplättchenaggregation bei einem warmblütigen Säuger.
6. Verwendung nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zur Inhibition einer Thrombusbildung bei einem warmblütigen Säuger.
7. Verwendung nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikaments zur Verbesserung der thrombolytischen Aktivität von an einen Warmblüter verabreichtem Gewebsplasminogenaktivator, wenn dieses Medikament zusammen mit dem Gewebsplasminogenaktivator verabreicht wird.
8. Verwendung nach Anspruch 4 zur Herstellung eines Medikaments, welches zur Verkürzung der Zeit zur Reperfusion und zur Verlängerung der Zeit zur Erreichung einer Reocclusion bei gleichzeitiger Verabreichung dieses Medikaments mit Gewebsplasminogenaktivator an einen warmblütigen Säuger geeignet ist.
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