DE3888310T2 - Peptidderivate des Blutplättchen-Aggregations-Inhibitors. - Google Patents

Peptidderivate des Blutplättchen-Aggregations-Inhibitors.

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Description

    Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung bezieht sich auf neue Peptid-Derivate und insbesondere auf Tetrapeptid-Derivate mit einer Wirksamkeit als Inhibitoren der Plättchenaggregation.
  • Fibrinogen ist ein Glykoprotein, das als normale Komponente des Blutplasmas vorliegt. Es trägt zur Plättchenaggregation und Fibrinbildung im Blutgerinnungsmechanismus bei.
  • Plättchen sind im Vollblut zu findende zelluläre Elemente, die auch zur Blutkoagulation beitragen. Die Fibrinogen-Bindung an Plättchen ist für die normale Plättchenfunktion im Blutkoagulationsmechanismus von Bedeutung. Wenn ein Blutgefäß verletzt wird, initiieren die an Fibrinogen bindenden Plättchen die Aggregation und bilden einen Thrombus. Die Wechselwirkung von Fibrinogen mit Plättchen tritt durch einen Membran-Glykoprotein- Komplex auf, der als gpIIb/IIIa bekannt ist; dieser ist ein wichtiges Merkmal der Plättchenfunktion. Inhibitoren dieser Wechselwirkung sind bei der Modulation der Plättchen-Thrombusbildung verwendbar.
  • Es ist auch bekannt, daß ein weiteres großes Glykoprotein mit dem Namen Fibronectin, das ein extrazelluläres Matrix-Hauptprotein darstellt, mit Fibrinogen und Fibrin sowie mit anderen Strukturmolekülen, wie Actin, Collagen und Proteoglycanen, in Wechselwirkung tritt. Es wurde gefunden, daß verschiedene relativ große Polypeptid-Fragmente in der Zellbindungsdomäne von Fibronectin eine Zellhaftwirksamkeit aufweisen; siehe US-Patente 4 517 686, 4 589 881 und 4 661 111. Diese Polypeptide enthalten eine interne Aminosäuresequenz Arg-Gly-Asp-Ser. Es wurde gefunden, daß bestimmte relativ kurze Peptidfragmente vom gleichen Molekül die Zellhaftung an ein Substrat fördern, wenn sie am Substrat immobilisiert werden, oder die Haftung inhibieren, wenn sie in solubilisierter oder suspendierter Form vorliegen; siehe US-Patente 4 578 079 und 4 614 517. Diese Peptide wurden definiert als
  • X-Arg-Gly-Asp-R-Y,
  • worin X = H oder eine Aminosäure, R = Thr oder Cys; und
  • X-Arg-Gly-Asp-Ser-Y,
  • worin X = H oder eine Aminosäure, Y = OH oder eine Aminosäure.
  • Im US-Patent 4 683 291 ist die Inhibierung der Plättchenfunktion mit synthetischen Peptiden geoffenbart, die ausgebildet sind, um starke Affinitäts-Antagonisten der Fibrinogen-Bindung an Plättchen zu sein. Diese synthetischen Peptide haben bis zu 16 Aminosäurereste mit
  • Arg-Gly-Asp-Val oder
  • Arg-Gly-Asp-Ser
  • am C-Terminus.
  • Ähnliche synthetische Peptide, welche die Arg-Gly-Asp-Sequenz enthalten, und ihre Verwendung als Inhibitoren der Fibrinogen-Bindung an Plättchen werden von Kloczewiak et al., Biochem. 23, 1767-1774 (1984); Plow et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82, 8057-8061 (1985); Ruggeri et al., Ibid. 83, 5708-5712 (1986); Ginsberg et al., J. Biol. Chem. 260 (7), 3931-3936 (1985); und Haverstick et al., Blood 66 (4), 946-952 (1985), geoffenbart.
  • Tetrapeptide mit der Sequenz Arg-Gly-Asp-Phe und Arg-Gly- Asp-Ser sowie ihre Wirksamkeit als Inhibitor der Bindung von Fibrinogen (Fg), Fibrinectin (Fn) und des von Willebrand-Faktors (vWF) an Plättchen werden von E.F. Plow et al., Blood, Bd.70 (1), 110-115 (1987), geoffenbart.
    • Kurze Beschreibung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung sind neue Tetrapeptid-Derivate vorgesehen, die eine nützliche Wirksamkeit als Inhibitoren der Plättchenaggregation aufweisen. Es wird angenommen, daß sie durch Antagonisieren der Wechselwirkungen zwischen Fibrinogen und/oder extrazellulären Matrixproteinen und dem Plättchen-gpIIb/IIIa-Rezeptor wirken. Diese Tetrapeptid-Derivate enthalten die Sequenz
  • X-Gly-Asp-Y (I),
  • worin X = H&sub2;N NH-(CH&sub2;)n- H-COOH oder Ac-Arg, Z = H, NH&sub2; oder NH-Acyl, n = 1 bis 4,
  • R&sub1; = H, Alkyl, Phenyl oder Phenylalkyl, R&sub2; = H, COOH, CONH&sub2;, COCH&sub3;, CH&sub2;OH, CH&sub2;NH&sub2;, C(NH)CH&sub3; oder C(NH)NH&sub2;, R&sub3; = Phenyl, Biphenyl oder Naphthyl, jeweils substituiert mit 1 bis 3 Alkyl- oder Alkoxygruppen oder einer unsubstituierten Naphthyl- oder Pyridylgruppe, m = Null bis 2, wobei Alkyl und Alkoxy jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen, vorausgesetzt, daß, wenn Y die Bedeutung Tyr-NH&sub2; oder Phe-NH&sub2; hat, X Ac-Arg darstellt, und ferner vorausgesetzt, daß, wenn Z NH&sub2; oder NH-Acyl ist, X in der D- oder L-Aminosäure-Stereokonfiguration vorliegt.
  • In der obigen allgemeinen Formel (I) sind X und Y durch herkömmliche Peptidbindungen an Glycin bzw. Asparaginsäure gebunden, wobei der N-Terminus an der linken Seite und der C- Terminus an der rechten Seite gezeigt ist.
  • Es ist ersichtlich, daß X in der obigen Formel Arginin ist, wenn Z = NH&sub2; und n = 3; Homoarginin bedeutet, wenn Z = NH&sub2; und n = 4; und Guanidinobuttersäure, wenn Z = H und n = 2. Alternativ kann dieses α-NH&sub2; von Arginin durch H oder N-Acyl, vorzugsweise N-Acyl, ersetzt werden. Die Methylenkette kann ein bis vier Einheiten haben, wie gezeigt, weist jedoch vorzugsweise eine Länge von drei CH&sub2;-Einheiten auf.
  • Es ist ebenfalls ersichtlich, daß Y in der obigen Formel (I) im allgemeinen ein nicht-natürliches aromatisches Aminosäure-Derivat, vorzugsweise ein Tyrosin-Derivat ist, worin der C-Terminus H, COOH, CONH&sub2;, COCH&sub3;, CH&sub2;OH, CH&sub2;NH&sub2;, C(NH)CH&sub3; oder C(NH)NH&sub2; bedeutet und der aromatische oder Benzolring mit einer bis drei nied.Alkyl- oder Alkoxygruppen substituiert ist. Die nied.Alkylsubstituenten in der allgemeinen Formel (I) können beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl oder Butyl sein.
  • Eine am meisten bevorzugte Verbindung ist Arg-Gly-Asp-(O- Methyltyrosin)-amid:
  • Diese Verbindung, worin die p-Hydroxyphenylgruppe von Tyrosin methyliert ist und der C-Terminus Carboxyamid darstellt, ist unerwartet als Inhibitor der Plättchenaggregation wesentlich aktiver als entweder Arg-Gly-Asp-Ser oder Arg-Gly-Asp-Tyr. Dieser Vorteil wurde in Tests an plättchenreichen Plasma und mit in vivo-Tests nachgewiesen, in denen Arg-Gly-Asp-Ser vergleichsweise relativ unwirksam ist. Außerdem ist Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid beim Verhindern einer Thrombose in einem Karotisarterientestmodell bei Ratten wirksam, wodurch sich seine Verwendbarkeit als Antithrombosemittel zeigt.
  • In den Fällen, in denen die C-terminale Aminosäure Y in der obigen Formel (I) eine natürliche Aminosäure ist, ist sie ein Amid-Derivat von Tyrosin oder Phenylalanin, und bedeutet die NH&sub2;-terminale Aminosäure X Acetylarginin. So wurde überraschend gefunden, daß Acetyl-RGDY-amid im in vivo-Thrombozytopenie-Test sehr wirksam ist (85 % Inhibierung), während das nicht-acetylierte RGDY-Amid relativ unwirksam ist (nur 19 % Inhibierung).
  • Andere bevorzugte Verbindungen der Erfindung sind Arg-Gly- Asp-(O-Ethyltyrosin)-amid, Desamino-Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid, Desamino-(Homoarginin)-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)- amid, Acetyl-Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid, Acetyl-(D-Arg)- Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid, Arg-Gly-Asp-(4-Methoxy-1- naphthylalanin)-amid, Arg-Gly-Asp-(2,6-Dimethyl-O-methyltyrosin)-amid und Arg-Gly-Asp-(p-Phenyl-phenylalanin)-amid.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die neuen Peptide dieser Erfindung können durch herkömmliche Peptid-Syntheseverfahren hergestellt werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Festphasensynthese von Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Science 150, 178-185 (1965); Ibid. 232, 341-347 (1986).
  • Beim Synthetisieren eines Peptidamid-Derivats wird die Festphasensynthese allgemein vom C-Terminus des Peptids durch Koppeln einer geschützten α-Aminosäure mit einem geeigneten Harz, z.B. chlormethyliertem Polystyrolharz oder p-Methylbenzhydrylaminharz, begonnen. In der vorliegenden Erfindung kann das oben beschriebene Tyrosin-Derivat als C-terminales Peptid zur Initiierung der Festphasensynthese verwendet werden. Dann werden die drei verbleibenden α-Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge gekoppelt, wobei ein an das Harz gekoppeltes Zwischenpeptid erhalten wird. Während dieser Synthese werden geeignete Schutzgruppen nach Bedarf verwendet. So wird Asparaginsäure an der β-Carboxylgruppe als Benzylester geschützt, und Arginin wird an der Guanidino-Gruppe durch Tosyl geschützt. Jede α-Aminogruppe wird mit der tert.Butyloxycarbonylgruppe (BOC) geschützt.
  • Nachdem die gewünschte Tetrapeptid-Sequenz hergestellt wurde, wird das Zwischenpeptid vom Harz abgespalten, und die Schutzgruppen werden durch Behandlung mit einem Reagens, wie HF, entfernt. Dann kann das Peptid durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) oder andere derartige Verfahren der Proteinreinigung gereinigt werden.
  • Hintergrundinformationen über das etablierte Festphasen- Syntheseverfahren, das zur Herstellung der vorliegenden Tetrapeptide verwendet werden kann, sind durch Bezugnahme auf die Abhandlung von Stewart and Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1969, und das Übersichtskapitel von Merrifield in Advances in Enzymology 32, S.221-296, F.F. Nold, Hrg., Interscience Publishers, New York, 1969; und Erickson and Merrifield, The Proteins, Bd.2, S.255ff. (Hrg. Neurath and Hill), Academic Press, New York, 1976, zu finden.
  • Die hier verwendeten Peptidsequenzen sind durch herkömmliche Abkürzungen mit einem oder drei Buchstaben für die Aminosäurekomponenten wie folgt angegeben: Abkürzung Aminosäure Alanin Cystein Asparaginsäure Glutaminsäure Phenylalanin Glycin Histidin Isoleucin Lysin Leucin Methionin Asparagin Prolin Glutamin Arginin Serin Threonin Valin Tryptophan Tyrosin * Nicht zu verwechseln mit dem C-Terminus Y in der allgemeinen Formel (I) für die hier definierten Tetrapeptid-Derivate.
  • Die Plättchenbindungs-Inhibitorwirksamkeit der Peptid-Derivate dieser Erfindung wird durch verschiedene Tests nachgewiesen. In einem Test werden die Peptide auf ihre Inhibierung von Thrombin-induzierter Plättchenaggregation in gewaschenen menschlichen Plättchen geprüft. Die %-Inhibierung für das Testpeptid wird durch Vergleichen des Ausmaßes der Plättchenaggregation in Anwesenheit und Abwesenheit des Peptids bestimmt.
  • In einem weiteren Test wird die Plättchenaggregation in plättchenreichem Plasma, das auch reich an Fibrinogen und anderen Plasmaproteinen ist, untersucht.
  • In noch einem weiteren Test wird die Wirkung des Peptids auf Collagen-induzierte Thrombozytopenie (Plättchenaggregation) in vivo bei Ratten gemessen. Wiederum wird die %-Inhibierung für das Testpeptid bestimmt und mit einem Kochsalzlösungs- oder Ethanol-Träger in Abwesenheit von Peptid verglichen.
  • Anschließend wurden in diesen Tests die Ergebnisse der Testverbindung mit der Wirksamkeit des bekannten aktiven Inhibitor-Tetrapeptids
  • Arg-Gly-Asp-Ser
  • verglichen.
  • Schließlich wurde eine am meisten bevorzugte Verbindung dieser Erfindung in einem Karotisarterien-Thrombosen-Biotest bei Ratten getestet. In diesem Test wird die Bildung eines Thrombus in der Karotisarterie einer Ratte induziert, indem 5 Minuten elektrischer Strom an die Arterie angelegt wird. In Anwesenheit von infundierter Kochsalzlösung bildet sich ein Klumpen und okkludiert die Arterie in etwa 8 bis 9 Minuten. Die Infusion der bevorzugten Inhibitor-Verbindung dieser Erfindung, Arg-Gly-Asp- (O-Methyltyrosin)-amid, verzögerte die Okklusion signifikant oder verhinderte diese, während im Vergleich dazu die Infusion des bekannten Inhibitors Arg-Gly-Asp-Ser die Zeit bis zur Okklusion nur geringfügig verlängerte.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung detaillierter.
    • Beispiel 1:
  • Die neuen Peptid-Derivate dieser Erfindung wurden durch herkömmliche Festphasensynthese hergestellt. Diese Synthese wird durch die Herstellung von Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-NH&sub2; wie folgt erläutert:
  • 20 g p-Methylbenzhydrylaminharz (enthaltend 14 mMol Aminogruppen) wurden mit 2 Äquivalenten (eq.) BOC-Tyrosinmethylether und 2 eq. Dicyclohexylcarbodiimid (DDC) in Methylenchlorid 4 h geschüttelt. Das Harz wurde filtriert und wiederholt mit Dimethylformamid (DMF), gefolgt von Methanol und dann Methylenchlorid gewaschen. Die BOC-Gruppe wurde durch 30 min Behandlung mit 50 % Trifluoressigsäure (TFA) in Methylenchlorid entfernt und das Harz mit Methylenchlorid gewaschen, mit 10 % Diisopropylamin neutralisiert und erneut gewaschen. Dann war das Harz bereit für die Reaktion mit 2 eq. der nächsten Aminosäure, BOC- β-benzylasparaginsäure. Der wie oben beschriebene Zyklus wurde für jede Aminosäure wiederholt, außer daß 2 eq. Hydroxybenzotriazol dem BOC-tosylarginin und DCC zugesetzt wurden.
  • Das erhaltene Tetrapeptid wurde aus 10 g Harz entfernt und mit 88 ml 10 % Anisol in flüssigem HF bei 0ºC entschützt, und nach dem Abdampfen des HF wurde das Peptid in 30 % wässeriger Essigsäure aufgenommen und gefriergetrocknet. Das Peptidprodukt wurde durch HPLC auf einer 700 ml Säule mit einer 15 bis 20 um (300 Å) Vydac C&sub1;&sub8; Umkehrphasen-Packung (The Separations Group, Hesperia, California) gereinigt, wobei ein 0 bis 50 % Gradient in Acetonitril (0,1 % TFA) verwendet wurde. Produkthaltige Fraktionen, wie durch analytische HPLC festgestellt, wurden vereinigt und gefriergetrocknet, wobei etwa 1,0 g reines Tetrapeptid aus 10 g Harz erhalten wurden.
  • Im wesentlichen ähnliche Syntheseverfahren wurden für die Festphasensynthese anderer Peptid-Derivate dieser Erfindung verwendet, indem äquivalente Mengen anderer BOC-tyrosin-Derivate für BOC-tyrosinmethylether, und/oder Desaminoarginin, Homoarginin oder Acetylarginin für Arginin im obigen Beispiel ersetzt wurden.
    • Beispiel 2:
  • Die in Beispiel 1 hergestellten Peptid-Derivate wurden durch das folgende Standard-Protokoll auf ihre Plättchenbindungs-Inhibitorwirksamkeit getestet:
    • Inhibierung von Thrombin-induzierter Plättchenaggregation in gewaschenen menschlichen Plättchen
  • Plättchenherstellung: 60 ml Vollblut werden frisch abgenommen und mit 1/10 Volumen CCD (100 mM Na-citrat und 136 mM Glukose, pH 6,5 mit HCl) bei Raumtemperatur (RT) antikoaguliert. Das Blut wird in zwei 60 ml Einweg-Kunststoffzentrifugenröhrchen aufgeteilt und 3 min bei 1000 x g zentrifugiert, wobei die Zentrifuge auslaufen gelassen wird (keine Bremsung). Das plättchenreiche Plasma (PRP) wird abgezogen, wobei darauf geachtet wird, daß keine weißen Zellen entnommen werden, und in ein 60 ml Zentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wird sofort 15 min auf Eis gelegt. Nach 15 min bei 0ºC wird 1/2 Volumen eiskaltes CCD zugesetzt (d.h. 15 ml CCD/30 ml PRP). Das Röhrchen wird gemischt und der Inhalt gleichmäßig in zwei Zentrifugenröhrchen aufgeteilt. Diese werden dann 10 min bei 0ºC bei 900 x g zentrifugiert (keine Bremsung). Der Überstand wird sorgfältig abgegossen. Das Plättchenpellet wird vorsichtig in 1/2 des ursprünglichen Volumens von PRP in einem 0ºC modifizierten Tangen-Hepes- BSA-Puffer, pH 7,4, bestehend aus 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,05 mM CaCl&sub2;, 0,1 mM MgCl&sub2;, 11 mM Glukose, 15 mM Hepes (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure), 1 mg/ml Rinderserumalbumin, (pH mit NaOH eingestellt), resuspendiert. Die resuspendierten Pellets werden in ein Zentrifugenröhrchen kombiniert und ungestört 30 min bei 37ºC inkubiert. Nach der Inkubation wird die Plättchensuspension entfernt und eine aliquote Menge rasch in einem Hemocytometer oder einem Coulter -Zähler (Coulter Electronics, Hialeah, Fl.) gezählt. Die Plättchenzahl wird mit dem Tangen-Hepes-BSA-Puffer auf 3 x 10&sup8; Zellen/ml eingestellt.
  • Testen der Verbindung: Aggregationsuntersuchungen werden unter Verwendung eines Payton-Aggregometers (Payton Scientific Inc., Buffalo, N.Y.) durchgeführt. Die verwendete Kontrollverbindung war RGDS (Arg-Gly-Asp-Ser), erworben von Peninsula Laboratories, Cal.; das Thrombin wurde von Parke-Davis, N.J., gekauft und bei einer Arbeitskonzentration von 0,5 Einheiten/ml mit dem Tangen-Hepes-BSA-Puffer, ergänzt mit 16 mM CaCl&sub2;, 16 mM MgCl&sub2;, hergestellt. Alle Verbindungen werden mit doppelt destilliertem Wasser auf eine Arbeitskonzentration von 10&supmin;³ M verdünnt. Die Reaktionsmischung bestand aus 400 ul 3 x 10&sup8;/ml gewaschenen Plättchen, 50 ul Puffer (Kontrolle) oder Testverbindung bei 10&supmin;³ M mit einer Endkonzentration von 10&supmin;&sup4; M. Plättchen, Testverbindung oder Puffer werden vor dem Zusatz von Thrombin in Küvetten im Aggregometer für 1 min Vorinkubation gegeben. 50 ul 0,5 E/ml Thrombin werden den Küvetten zugesetzt, und die Aggregation wird 1 min überwacht, was die Zeit für eine maximale Aggregation der Plättchen darstellt. Alle Verbindungen werden zweifach getestet. Der gesamte Versuch wird innerhalb von 3 h durchgeführt, da dies die maximale Lebensdauer der Plättchen ist. Die Ergebnisse werden wie folgt berechnet: % Kontrolle = [(maximale OD minus anfänglicher OD der Verbindung) geteilt durch (maximale OD minus anfänglicher OD der Kontrolle)] x 100. % Inhibierung = 100 minus (% Kontrolle).
  • Die getesteten Verbindungen und ihre Wirksamkeitsergebnisse in %-Inhibierung bei 10&supmin;&sup4; M sowie IC&sub5;&sub0; waren wie in Tabelle I angegeben. IC&sub5;&sub0; (wenn eine Verbindung 50 % Inhibierung zeigte) wurden durch lineare Regression der Dosis-Reaktions-Kurve berechnet. Tabelle I Peptidsequenz % Inhibierung bei 10&supmin;&sup4; M IC&sub5;&sub0; (M) RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; RGD-(O-Ethyl-Tyr)-NH&sub2; Ac-RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; RGD-(2,6-Dimethyl)-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; Des-NH&sub2;-RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; Des-NH&sub2;-(Homo-Arg)-GD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; Ac = Acetyl
    • Beispiel 3:
  • Einige in Beispiel 1 hergestellte Peptid-Derivate wurden weiter auf ihre Plättchen-Bindung in plättchenreichem Plasma (PRP) durch das folgende Standard-Protokoll getestet:
    • In vitro-Human-Plättchenaggregation in PRP
  • Gesunde männliche oder weibliche Spender, die während mindestens 2 Wochen keine Antiplättchen-Arzneimittel eingenommen hatten, nahmen 8 h vor der Blutabnahme keine Nahrung zu sich; dann wurden 30 ml Vollblut unter Verwendung einer Butterfly-Nadel und 30 cc Kunststoffspritze mit 3 ml 0,129 M gepuffertem Natriumcitrat (3,8 %) gesammelt. Die Spritze wird während der Blutabnahme vorsichtig gedreht, um das Citrat zu mischen. Plättchenreiches Plasma (PRP) wird durch Zentrifugieren bei 100 x g während 10 min bei Raumtemperatur hergestellt, wobei die Zentrifuge ohne Bremsen auslaufen gelassen wird. Das PRP wird mit einer Kunststoffpipette vom Blut entfernt und in ein mit einer Kappe zu verschließendes, steriles konisches 50 ml Corning- Kunststoff-Zentrifugenröhrchen gegeben. Das Röhrchen wird mit der Kappe verschlossen und bei Raumtemperatur stehengelassen. Plättchenarmes Plasma (PPP) wird durch Zentrifugieren des verbleibenden Blutes bei 2000 x g während 15 min bei Raumtemperatur hergestellt, wobei die Zentrifuge ohne Abbremsen auslaufen gelassen wird. Das PRP wird mit PPP auf eine Zahl von 2 bis 3 x 10&supmin;&sup8; Plättchen pro ml eingestellt. 400 ul der PRP-Zubereitung und 50 ul der zu testenden Verbindung oder Kochsalzlösung wurden 1 min bei 37ºC in einem Payton-Aggregometer (Payton Scientific Inc., Buffalo, NY) vorinkubiert. 50 ul Adenosin-5'-diphosphat (ADP) (50 uM) werden den Küvetten zugesetzt, und die Aggregation wird 1 min überwacht. Alle Verbindungen werden zweifach getestet. Der gesamte Versuch wird innerhalb von 3 h durchgeführt, da dies die maximale Lebensdauer der Plättchen ist. Die Kochsalzlösung wird anstelle der Verbindung zur Bestimmung der maximalen Aggregation verwendet. Die Ergebnisse werden wie folgt berechnet: % Kontrolle = [(maximale OD minus anfänglicher OD der Verbindung) geteilt durch (maximale OD minus anfänglicher OD der Kontrolle)] x 100. %-Inhibierung = 100 minus (% Kontrolle).
  • Die getesteten Verbindungen und ihre Wirksamkeitsergebnisse in %-Inhibierung bei 10&supmin;&sup4; M sowie IC&sub5;&sub0; waren wie in Tabelle II angegeben. IC&sub5;&sub0; (wenn eine Verbindung 50 % Inhibierung zeigte) wurden durch lineare Regression der Dosis-Reaktions-Kurve berechnet. Tabelle II Peptidsequenz % Inhibierung bei 10&supmin;&sup4; M IC&sub5;&sub0;(M) RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; Ac-RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; RGD-(2,6-Dimethyl-O-methyl-Tyr)-NH&sub2; Des-NH&sub2;-RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; Des-NH&sub2;-(Homo-Arg)-GD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; RGD-(4-Methoxy-1-naphthyl-Ala)-NH&sub2; Des-NH&sub2;-RGD-(O-Methyl-tyramin)-NH&sub2; Ac-(D-Arg)-GD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; RGD-(p-Phenyl-Phe)-NH&sub2;
  • Aus den obigen Ergebnissen in Tabelle II ist ersichtlich, daß Verbindungen 4 bis 13 verglichen mit den Kontroll-Verbindungen Nr.1 und 2 bei der %-Inhibierung der Plättchenaggregation in plättchenreichem Plasma in vitro zwei- bis viermal wirksamer waren. Während Verbindung 3 bei diesem in vitro-Test auch wirksam war, war sie im in vivo-Test des nachstehenden Beispiels 4 weniger wirksam.
    • Beispiel 4:
  • Einige in Beispiel 1 hergestellte Peptid-Derivate wurden weiter wie folgt auf ihre Wirkung auf collagen-induzierte Thrombozytopenie in vivo bei Ratten getestet:
    • In vivo-Thrombozytopenie bei Ratten
  • Männliche Ratten (Charles River, CRL:CD(SD), 400-450 g) wurde verwendet. Die Ratten wurden mit Na-pentabarbital (65 mg/kg, Vet Labs, Limited, Inc., Lenexa, KA) betäubt. Zwei Einschnitte wurden zur Freilegung beider Drosselvenen vorgenommen. Unter Verwendung einer Infusionspumpe (Harvard Apparatus, South Natick, Mass.) und einer 5 cc Spritze mit einer 19 g Butterfly- Nadel wurde die Testverbindung oder Träger in die linke Drosselvene bei einer Rate von 0,39 ml/min während 3 min infundiert. Nach 2 min Infusion von Verbindung/Träger wurde Collagen (60 ug/kg) (Helena Laboratories, Beaumont, TX) mit einer 1 ml Spritze in die rechte Drosselvene injiziert. Die Körperhöhle wurde geöffnet und die Vena cava zur Blutabnahme freigelegt. 1 min nach der Collagen-Injektion wurde die Infusion von Verbindung beendet und Blut aus der Vena cava (innerhalb von 30 s) mit einer 3 cc Spritze, enthaltend 0,3 mg 4,5 % EDTA/Tris (0,1 M) (pH 7,35) Plus 150 uM Indomethacin, entnommen. Plättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch Zentrifugieren des Blutes bei 126 x g während 10 min hergestellt. 5 ul PRP wurden in 20 ml Isoton III in einem Coulter-Zähler gezählt.
  • %-Inhibierung von Collagen-induzierter Aggregation wurde durch Vergleichen der in behandelten Tieren gezählten Plättchenzahl mit den Zahlen, die in Tieren gezählt wurden, die kein Collagen erhielten, und mit Zahlen von Tieren, die Träger und Collagen erhielten, berechnet. Die Feststellung der Wirkungsstärke basierte auf der Inhibierung von Collagen-induzierter Thrombozytopenie.
  • Die %-Inhibierung der Plättchenaggregation in vivo und der maximale Inhibierungs-Prozentsatz der Testverbindungen sind in der folgenden Tabelle III angegeben. Vier Tiere wurden mit jeder Testverbindung getestet, wobei die gezeigten Daten erhalten wurden: Tabelle III Peptidsequenz % Inhibierung bei 1 mg/kg Maximale Inhibierung % RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; Ac-RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; RGD-(2,6-Dimethyl-O-methyl-Tyr)-NH&sub2; Des-NH&sub2;-RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; Des-NH&sub2;-(Homo-Arg)-GD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2;
  • Aus den obigen Ergebnissen in Tabelle III ist ersichtlich, daß bevorzugte Verbindungen der Erfindung (Nr.5 bis 10) verglichen mit den Kontroll-Verbindungen Nr.1 bis 3 bei der % -Inhibierung der Plättchenaggregation in vivo zwei- bis viermal wirksamer waren. Verbindung 4 zeigte eine dazwischenliegende Wirksamkeit.
    • Beispiel 5:
  • Das Tetrapeptid-Derivat Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid wurde weiter wie folgt auf seine Wirksamkeit gegen eine Karotisarterienthrombose bei Ratten getestet:
    • Karotisarterienthrombose bei Ratten
  • Männliche Sprague-Dawley-Ratten (300 bis 450 g) werden mit Natriumpentabarbital i.p. 30 mg/kg betäubt. Ein Einschnitt in der Mitte des Halses wird vorgenommen, durch den die Trachea, Drosselvene und Karotisarterie freigelegt und isoliert werden. In die Trachea wird eine Kanüle eingeführt und das Tier O&sub2;-angereicherte Raumluft einatmen gelassen. In die Drosselvene wird eine Kanüle für i.v.-Infusion eingeführt. Die Scheide der Karotisarterie und alle Vagusfasern in einer Länge von 1,5 bis 2,0 cm werden entfernt, und am proximalen Ende wird eine geeignet bemessene elektromagnetischen Durchflußsonde von Carolina Medical Electronics angebracht. Die Aufzeichnung des Blutdurchflusses erfolgt auf einem Gould-Recorder über den Durchflußmesser von Carolina Medical Electronics. Ein mechanischer Null- Durchfluß wird durch momentanes Abklemmen der Arterie distal von der Durchflußsonde bestimmt. Einige mm distal von der Durchflußsonde wird eine bipolare Elektrode auf die Arterie gesetzt und so positioniert, daß sie nur die Arterie berührt.
  • Nach 15 min Stabilisierung nach chirurgischer Präparation wird eine i.v.-Infusion der gewünschten Peptid-Dosis in die Drosselvene begonnen (unter Verwendung einer Harvard-Infusionspumpe) und 5 min laufen gelassen, wonach der Durchflußmesser abgeschaltet und ein elektrischer Strom von 2,5 mA an die externe Arterienwand 5 min angelegt wird (Grass-Stimulator und Gleichstromeinheit). Die Peptid-Infusion wird während des Testzeitraums von 30 min laufen gelassen.
  • Sofort nach dem Abschalten des elektrischen Stroms wird der Durchflußmesser eingeschaltet und erfolgen Messungen der Durchflußamplitude. Zum Zeitpunkt einer 20 % Verringerung des systolischen Durchflusses hat die Thrombusbildung eingesetzt, und die Zeit vom Ende des Stroms bis zur 20 % Verringerung des Durchflusses wird aufgezeichnet. Dies ist die "Zeit in Minuten bis zum Einsetzen der Thrombusbildung". Wenn der Durchfluß auf den vorherbestimmten Null-Durchfluß zurückgeht, wird die Zeit in Minuten vom Einsetzen des Thrombus aufgezeichnet, und diese Zeit wird als "Zeit in Minuten bis zum Null-Durchfluß vom Beginn des Thrombus" bezeichnet. Die Summe dieser Zeiten wird als "Zeit von der Verletzung bis zum Null-Durchfluß" bezeichnet. Die letztere Zeit (oder Zeit bis zur Okklusion) für die Testverbindung verglichen mit jener des bekannten Inhibitors Arg-Gly-Asp-Ser ist in der folgenden Tabelle IV angegeben. Tabelle IV Peptid (infundierte Dosis) Anzahl der Tiere Zeit bis zur Okklusion (Minuten) Kochsalzlösung RGDS (mg/kg/min) RGD-(O-Methyl-Tyr)-NH&sub2; (mg/kg/min) Tieren * Sogar 30 min nach Beendigung der Infusion trat keine Okklusion auf.
  • Die neuen Tetrapeptid-Derivate dieser Erfindung können zur verabreichung an Menschen auf herkömmliche Weise, vorzugsweise in Formulierungen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln oder Trägern verabreicht werden. Der bevorzugte Verabreichungsweg als Plättchenaggregations-Inhibitor ist parenteral, insbesondere intravenös. Die intravenöse Verabreichung der Tetrapeptid-Derivate in Lösung mit normaler physiologischer Kochsalzlösung, Humanalbumin und anderen derartigen Verdünnungsmitteln und Trägern dient der Erläuterung. Andere geeignete Formulierungen der aktiven Tetrapeptid-Derivate in pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln und Trägern in therapeutischer Dosierungsforin können durch Bezugnahme auf allgemeine Literatur auf dem pharmazeutischen Gebiet, wie beispielsweise Remington's Pharmaceutical Sciences, Hrg. Arthur Osol, 16.Aufl., 1980, Mack publishing Co., Easton, pennsylvania, hergestellt werden.

Claims (18)

1. Tetrapeptid-Derivat, welches eine Inhibitorwirksamkeit gegen Plättchenaggregation aufweist und ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
X-Gly-Asp-Y,
worin X = H&sub2;N -NH-(CH&sub2;)n- H-COOH oder Ac-Arg, Z = H, NH&sub2; oder NH-Acyl, n = 1 bis 4,
worin Y =
Tyr-NH&sub2; oder Phe-NH&sub2;,
R&sub1; = H, Alkyl, Phenyl oder Phenylalkyl, R&sub2; = H, COOH, CONH&sub2;, COCH&sub3;, CH&sub2;OH, CH&sub2;NH&sub2;, C(NH)CH&sub3; oder C(NH)NH&sub2;, R&sub3; = Phenyl, Biphenyl oder Naphthyl, jeweils substituiert mit 1 bis 3 Alkyl- oder Alkoxygruppen oder einer unsubstituierten Naphthyl- oder Pyridylgruppe, m = Null bis 2, wobei Alkyl und Alkoxy jeweils 1 bis 4 Kohlenstoffatome aufweisen, vorausgesetzt, daß, wenn Y die Bedeutung Tyr-NH&sub2; oder Phe-NH&sub2; hat, X Ac-Arg darstellt, und ferner vorausgesetzt, daß, wenn Z NH&sub2; oder NH-Acyl ist, X in der D- oder L-Aminosäure-Stereokonfiguration vorliegt.
2. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid aufweist.
3. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Arg-Gly-Asp-(O-Ethyltyrosin)-amid aufweist.
4. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Acetyl-Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid aufweist.
5. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Acetyl-(D-Arg)-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid aufweist.
6. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Arg-Gly-Asp-(4-Methoxy-1-naphthylalanin)-amid aufweist.
7. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Arg-Gly-Asp-(2,6-Dimethyl-O-methyltyrosin)-amid aufweist.
8. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Desamino-Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid aufweist.
9. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Desamino-(Homoarginin)-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid aufweist.
10. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Arg-Gly-Asp-(p-Phenylphenylalanin)-amid aufweist.
11. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Acetyl-Arg-Gly-Asp-Tyr-amid aufweist.
12. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, zur Verwendung in einem Verfahren zur Inhibierung der Plättchenaggregation in einem warmblütigen Säuger, welches Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Tetrapeptid-Derivats nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger an den Säuger umfaßt.
13. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid aufweist, zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 12.
14. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, zur Verwendung in einem Verfahren zur Inhibierung der Thrombusbildung in einem warmblütigen Säuger, welches Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge des Tetrapeptid-Derivats nach Anspruch 1 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger an den Säuger umfaßt.
15. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, welches die Sequenz Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid aufweist, zur Verwendung im Verfahren nach Anspruch 14.
16. Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1, in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
17. Zusammensetzung, welche ein Tetrapeptid-Derivat nach Anspruch 1 und einen für die Verabreichung der Zusammensetzung an einen Säuger annehmbaren Träger zur Inhibierung der Plättchenaggregation oder der Thrombusbildung umfaßt.
18. Zusammensetzung nach Anspruch 17, worin das Tetrapeptid-Derivat die Sequenz Arg-Gly-Asp-(O-Methyltyrosin)-amid aufweist.
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