JPH04230299A - 新規血小板凝集阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【従来の技術】本発明は、血小板凝集阻害剤としての潜
在的インビボ活性を有する新規ミメチック（ｍｉｍｅｔ
ｉｃ）化合物に関する。フィブリノーゲンは、血液プラ
ズマの正常成分として存在するグルコプロテインである
。これは、血液凝固機構において、血小板凝集及びフィ
ブリン形成に役割をはたしている。

【０００２】血小板は、血液凝固に役割をはたし全血中
に見出される細胞成分である。血小板と結合するフィブ
リノーゲンは、血液凝固機構における正常血小板機能に
とって重要である。血管が損傷した時、フィブリノーゲ
ンに結合している血小板は凝集を開始し、血栓を形成す
る。

【０００３】細胞外の重要な蛋白である、フィブロネク
チンと呼ばれる、もうひとつの大きなグリコプロテイン
は、フィブリノーゲン及びフィブリン、並びにアチクン
、コラーゲン及びプロテオグリカンのような他の構造蛋
白と相互作用を行なう。フィブロネクチンの細胞結合ド
メイン中の比較的大きなポリペプチドフラグメントのい
くつかが、細胞付着活性を有していることが見出されて
いる。米国特許第４，５１７，６８６号、４，５８９，
８８１号及び４，６６１，１１１号を参照。

【０００４】これらのポリペプチドは、内部アミノ酸配
列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ（ＲＧＤＳ）を含む
。同分子由来のある比較的短いペプチドフラグメントが
、基質上に固定化された場合は基質への細胞付着を促進
し、或いは、溶解若しく懸濁の形態の場合は、付着を阻
害することが分かっている。米国特許第４，５７８，０
７９及び４，６１４，５１７号参照。

【０００５】これらペプチドを次のように定める。 Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｒ−Ｙ ここで、Ｘ＝Ｈ又はアミノ酸、 Ｒ＝Ｔｈｒ又はＣｙｓ；そして、 Ｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｙここで、Ｘ＝
Ｈ又はアミノ酸 Ｙ＝ＯＨ又はアミノ酸。

【０００６】米国特許第４，６８３，２９１号において
、血小板機能の阻害について、血小板に結合するフィブ
リノーゲンの高親和性拮抗剤である合成ペプチドととも
に開示されている。これら合成ペプチドは、Ｃ−末端に
、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｖａｌ又はＡｒｇ−Ｇｌｙ
−Ａｓｐ−Ｓｅｒを有する１６以下のアミノ酸残基を有
する。

【０００７】同様の、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ配列を含
む合成ペプチド及び血小板へのフィブリノーゲン結合の
阻害剤としての使用は、Ｋｏｃｚｅｗｉａｋ等、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．２３，１７６７−１７７４（１９８４）；Ｐ
ｌｏｗ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８
２，８０５７−８０６１（１９８５）；Ｒｕｇｇｅｒｉ
等、Ｉｂｉｄ．８３，５７０８−５７１２（１９８６）
；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
０（７）、３９３１−３９３６（１９８５）；Ｈａｖｅ
ｒｓｔｉｃｋ等、Ｂｌｏｏｄ６６（４）、９４６−９５
２（１９８５）；及びＲｕｏｓｌａｈｔ；及びＰｉｅｒ
ｓｃｈｂａｃｈｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３８、４９１−
４９７（１９８７）に開示されている。

【０００８】更に、他のこのような阻害ペプチドがＥＰ
特許出願第２７５，７４８号及び２９８，８２０号に開
示されている。米国特許第４，８５７，５０８号におい
て、ある新規なテトラペプチド誘導体が開示されており
、これは、血小板擬集の阻害剤としての強力な活性を有
している。

【０００９】これらのテトラペプチド誘導体は、配列Ｘ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｙ、ここでＸ及びＹは、有機部分（
ｍｏｉｅｔｙ）から成る、を含む。好ましい例としては
、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（Ｏ−メチル−Ｔｙｒ）−
ＮＨ２　である。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明によって、新規ペ
プチドミメチック化合物が提供され、これは、血小板凝
集の阻害剤としての潜在的インビボ活性を有する。この
阻害剤は、フィブリノーゲン及び／又は細胞外マトリッ
クス蛋白と血小板ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩ　ａレセプターと
の相互作用に拮抗するように働くと考えられている。

【００１１】本発明の新規阻害化合物は、Ｎ−末端にグ
アノジノ基を持ち、鎖中にシュードペプチド（ｐｓｅｕ
ｄｏｐｅｐｔｉｄｅ）又はペプチドミメチック結合を、
そして、Ｃ−末端にフェニルアラニン基を有する。この
ペプチドミメチック化合物は、次の化学構造：

【化１】 によって示される。

【００１２】そのシステマチック名は、Ｎ−〔８−〔（
アミノイミノメチル）アミノ〕−１−オキソオクチル〕
−Ｎ−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニンで
あるが、以下、便宜に、８−グアニジノオクタノイル−
アスパルチル−フェニルアラニン又は、より短い用語に
より８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅと呼ぶ。

【００１３】本発明の新規８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅペ
プチドミメチック化合物は、種々のインビトロ及びイン
ビボテストで得られた次の結果により、優れた血小板凝
集阻害活性を有することが示された。

【００１４】・トロンビン活性化ヒト血小板への　１２
５Ｉ−フィブリノーゲンの結合を直接阻害する。 ・トロンビン、コラーゲン、ＡＤＰといった種々のプロ
アグレゲートリースチミュリ（ｐｒｏａｇｇｒｅｇａｔ
ｏｒｙ　　ｓｔｉｍｕｌｉ）へのヒト及びイヌ血小板の
凝集を阻害する。 ・定常静脈注入時の持続した抗血小板効果を誘導する。 ・治療状況に応じて、抗血小板効果を迅速に終了させう
る比較的短い活性時間を有する。

【００１５】・ヒト中性染色エラスターゼ分泌又は脱顆
粒反応に対して効果を示さない。 ・イヌでの血小板凝集の９０％阻害を達成する必要なと
きの１０倍の拡散速度において、急性血行力学的又は心
電計上の効果を示さない。 ・マウスでの、ラットの抗血小板ＥＤ５０よりも２０倍
大量の投与後０．５、１、２及び２４時間後において、
ＣＮＳ効果を示さない。

【００１６】米国特許第４，８７９，３１３号に開示さ
れており密接な関連を有する８−グアニジノ−オクタノ
イル−Ａｓｐ−２−（４−メトキシフェニル）−エチル
アミド（８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ）と比較すると、こ
の新規８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、意外にも実質的に
増大した溶解性及び効力を有する。８−ＧＯ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅは、驚くべきことに、８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ
よりも、インビボで約５−１５倍の効力を、インビボで
約５倍の活性を有する。

【００１７】前記の試験結果に基づいて、８−ＧＯ−Ａ
ｓｐ−Ｐｈｅは、種々の治療媒体として有用である。例
えば、ポスト線維素溶解治療、血栓溶解治療、血管形成
及び冠状動脈バイパス手術のような再疎通手法に伴なう
再閉塞の防止に有用である。

【００１８】他の潜在的な用途としては、心筋梗塞、再
発心筋梗塞、不定アンギナ、未梢動脈疾患、脳虚血、発
作及び血小板の超凝集性の防止、及び、血液透析におけ
る閉塞の防止、シャント及びアテロームの進行の防止等
がある。

【００１９】新規８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、イヌで
の血栓溶解剤、ｔ−ＰＡの投与によるクロットの溶解後
の再パーフュージョン時間を実質的に短縮し且つ再閉塞
を達成する時間を実質的に延長させることをも又見出し
た。

【００２０】

【課題を達成するための手段】本明細書は、本発明を形
成する主題を特に指摘し、且つ明確にクレームする請求
の範囲を有する一方、以下の説明的図面とともに発明の
好ましい実施例の詳細な説明の記述から、よりよく理解
されるであろう。

【００２１】血小板凝集阻害化合物８−ＧＯ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅは、種々の従来の手法により製造することが可能
である。従って、Ｃ−末端４−メトキシフェニルエチル
アミドをフェニルアラニンで置き換えることの外に、８
−グアニジノ−オクタノイル−Ａｓｐ−２−（４−メト
キシフェニル）エチルアミド（８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰ
Ｅ）を製造する米国特許第４，８７９，３１３で記述さ
れた方法に類似の固相法及び液相法によっても製造する
ことができる。

【００２２】ひとつの通常の方法では、血小板凝集阻害
化合物８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅを８−グアニジノオク
タン酸をアスパルチルフェニルアラニンメチルエステル
（アスパルテーム）でカップリングし、このメチルエス
テルを水酸化ナトリウムで鹸化した。生成物を冷水性メ
タノール（ｐＨ４．０）で結晶化し、ひき続いて水性メ
タノールで再結晶化した。最終収率は７３％であった。 実験室的製造では、８−グアニジノオクチル酸を８−ア
ミノオクチル酸と３、５−ジメチルピラゾ−ル−１−カ
ルボキシアミジンとの反応によるか又は、グアニジンと
８−ブロモオクチル酸から製造した。

【００２３】特定の製造方法をここに記述するが、本発
明の８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、いかなる特定の製造
方法に制限されるものではない。

【００２４】以下の実施例により、本発明を更に詳細に
説明するが、本発明は、これらの特定の実施例に限定さ
れるものではない。

【００２５】

【実施例】実施例１ Ａ．８−グアニジノ−オクチル酸（８−ＧＯ）３、５−
ジメチル−ピラゾール−１−カルボキシアミジン（１０
０ｇ；０．５モル）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチル
アミン（ＤＩＥＡ）（６５ｇ；０．５モル）を、ジオキ
サン（３００ｍｌ）及び水（１１５ｍｌ）中に懸濁した
。８−アミノ−オクチル酸（４８ｃｇ；０．３モル）を
攪拌しながらその混合物に添加した。その後無色溶液を
２日間還流した。生成物をろ過し、水（３×５０ｍｌ）
で洗條した。

【００２６】乾燥物質重量　　６０ｇ；ＦＡＢ−ＭＳ：
（Ｍ＋Ｈ）＝２０２。 Ｂ．８−グアニジノ−オクチル酸・ＨＣｌ（８−ＧＯ・
ＨＣｌ）０．１Ｍ　　ＨＣｌの１当量中に溶解させた８
−ＧＯを凍結乾燥させて８−ＧＯ・ＨＣｌを製造した。

【００２７】実施例２ ８−グアニジノオクチル酸・ＨＣｌ（３９ｇ；１９５ミ
リモル）、ジスクシニミジルカーボネート（５０ｇ；１
９５ミリモル）及び４−ジメチルアミノピリジン（２ｇ
）をピリジン／ＤＭＦ（１：２；３５０ｍｌ）中に溶か
した。反応混合物を室温で１晩攪拌した。この攪拌した
溶液中に、Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ（５０ｇ；１６９ミ
リモル）及び重炭酸ナトリウム（１５ｇ；１６９ミリモ
ル）の水（１５０ｍｌ）サスペンジョンを添加した。カ
ップリング反応は、分析用ＨＰＬＣでの確認により２０
時間で完了した。

【００２８】混合物を真空で蒸留して、油状残渣を得、
これをメタノール（１５０ｍｌ）に溶解させた。この溶
液（３５０ｍｌ）に、氷溶中で攪拌しつつ、２．５Ｎ　
　ＮａＯＨ（２８０ｍｌ）を加え、そしてこの攪拌を、
４Ｎ　　ＨＣｌ（１８５ｍｌ）でｐＨ４に酸性化させて
、５時間続けた。得られた溶液を冷却して結晶化し、固
体生成物を濾過により収集し、空気乾燥した。生成物を
、穏やかに攪拌しながら水（１．０リットル）にサスペ
ンドし、メタノール（４００ｍｌ）を透明な溶液が得ら
れるまで添加した。生成物を室温に冷却して結晶化し、
濾過して収集した。この物質を真空下、五酸化リン上で
乾燥し、８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ生成物６４ｇを得た
。

【００２９】結晶生成物の一部をアナリティカルキャラ
クタライゼーション用プレパラティブ逆相クロマトグラ
フィーにより精製した。

【００３０】プレパラティブ逆相クロマトグラフィーを
４．５×３０ｃｍカラム〔１５−２０μ粒径、μ−ボン
ダパック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）〕を使った。Ｗａｔｅｒ
ｓ　　ＰｒｅｐＬＣ−３０００システムを用いて実施し
た。 １０ｍｌの飽和ＮａＨＣＯ３　中に溶解した８−ＧＯ−
Ａｓｐ−Ｐｈｅのサンプル０．５ｇをカラムにかけ、流
速８０ｍｌ／分で、３０分間、５−２０％ＣＨ３　ＣＮ
（０．０５％ＴＦＡ）の溶媒勾配を与えた。生成物を含
むフラクションをプールし凍結乾燥した。生成物の回収
は、約９０％であった。

【００３１】分析ＨＰＬＣ（Ｖｙｄａｃ　　Ｃ−１８カ
ラム、３００Å孔径；１５−４０％ＣＨ３　ＣＮ／Ｈ２
　Ｏ／０．０５％ＴＦＡ勾配２５分間、１．５ｍｌ／分
の流速）、２１５ｎＭでのＵＶ検出により、９９＋％の
ＵＶ吸収物質を構成する生成物を得た。

【００３２】ＦＡＢ−ＭＳにより、生成物のＭＷを４６
３．５４と同定した。 ２−Ｄ　　ＮＭＲ　　共鳴アサインメント（５００ＭＨ
ｚ　、ＤＭＳＯ−ｄ６）は、完全に構造と一致し、表１
に示す。

【００３３】アミノ酸分析は、サンプルの９１重量％が
、等モル比でフェニルアラニンとアスパラギン酸を含む
ことを示した。 元素分析：理論値Ｃ２２Ｈ３３Ｎ５　Ｏ６　；Ｃ：５７
．０，Ｈ：７．１７，Ｎ：１５．１；実測値：Ｃ：５６
．８，Ｈ：７．０８，Ｎ：１５．０。

【化２】

【表１】表　　１８−グアニジノ、オクタノイル−アス
パルチル−フェニルアラニンの、３０℃、ＤＭＳＯ　　
ｄ−６＊　中での化学シフトアサインメント

【００３４
】実施例３ ８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅを血小板凝集阻害剤として評
価し、以下のインビトロ及びインビボアッセイにより、
８−グアニジノ−オクタノイル−ＡＳＰ−２−（４−メ
トキシフェニル）−エチルアミド（８−ＧＯ−Ａｓｐ−
ＭＰＥ）及び／又はＲＧＤＳと比較した。

【００３５】フィブリノーゲン結合アッセイフィブリノ
ーゲン結合を、Ｐｌｏｗ等、Ｂｌｏｏｄ　　７０，１１
０−１１５（１９８７）の記述と実質的に同様に実施し
た。簡単に述べれば、前２週間にいかなる抗血小板薬剤
も服用しなかったヒトのボランテイアからの血液を、１
／１０容量のＣＣＤバッファー（１００ｍＭクエン酸ナ
トリウム、１３６ｍＭグルコース、ｐＨ６．５）に収集
した。この血液を３分間、１０００×ｇで遠沈し、血小
板リッチなプラズマをプラスチックピペットを備え氷上
に置いたプラスチックチューブに移した。１５分後、１
／２容量の氷冷ＣＣＤバッファーを添加し、サンプルを
２℃で９００×ｇ、１０分間遠沈した。

【００３６】上澄液をデカントし、血小板ペレットを穏
やかに氷冷した修正Ｔｙｒｏｄｅバッファー（１３７ｍ
Ｍ　　ＮａＣｌ，２．６ｍＭ　　ＫＣｌ，１２ｍＭ　Ｎ
ａＨＣＯ３　，５．５ｍＭグルコース，１５ｍＭ　　Ｈ
ＥＰＥＳ，０．５％　　ＢＳＡ，ｐＨ７．４）の最初の
容量の１／２中に再サスペンドした。３７℃で３０分間
インキユベートした後、血小板カウントを修正Ｔｙｒｏ
ｄｅバッファーにより、４×１０８　血小板／ｍｌに調
整した。血小板サンプル（１×１０８　血小板／ｍｌ）
に、ＡＤＰ（１０μＭ）、ＣａＣｌ２　（１ｍＭ）、供
試化合物、及び１２５　Ｉ−フィブリノーゲン（０．３
μＭ）を２００μＭの容量で前記最終濃度まで順に添加
した。

【００３７】このサンプルを３７℃で４０分間インキュ
ベートし、５０μｌのアリコートを２０％サッカロース
パッド（４００μｌ）を通して８０００×ｇで遠沈した
。チューブを急速凍結し、血小板ペレットを含むチップ
を切断し、ガンマシンチレーションカウンターにより１
２５　Ｉ−フィブリノーゲン結合をアッセイした。特異
的結合を各テストにおいて、６０倍過多の非ラベルのフ
ィブリノーゲンの存在下、１２５　Ｉ−フィブリノーゲ
ン結合の量を、全結合から控除して決定した。テスト化
合物の効力（ＩＣ５０）を１２５　Ｉ−フィブリノーゲ
ン結合の５０％を阻害するのに必要な化合物濃度として
決定した。

【００３８】ＰＲＰでのインビトロヒト血小板凝集少く
とも２週間如何なる抗血小板薬剤を服用しなかった健常
男女ドナーを、血液を採取するのに先立ち８時間絶食さ
せ、それからバタフライニードル及び３ｍｌの０．１２
９Ｍバッファークエン酸ナトリウム（３．８％）を有す
る３０ｃｃプラスチックシリンジを用いて３０ｍｌを全
血を収集した。血液が抜かれてクエン酸と混合するよう
にシリンジを注意深く回転させた。

【００３９】血小板リッチなプラズマ（ＰＲＰ）を、室
温で１００×ｇ、１０分間遠沈して製造した。この際、
遠沈は、ブレーキをかけず停止させた。ＰＲＰをプラス
チックピペットで血液から取り出し、室温に保った、プ
ラスチックキャップのついた５０ｍｌのコーニング円錐
殺菌遠心分離用チューブ中に入れた。

【００４０】血小板プアプラズマ（ＰＰＰ）を、室温で
、ブレーキをかけず遠沈を停止させ、２０００×ｇ、１
５分間；残りの血液を遠沈して製造した。ＰＲＰをＰＰ
Ｐで２−３×１０８　血小板／ｍｌのカウントに調整し
た。４００μｌのＰＲＰプレパレーションと５０μｌの
供試化合物又は食塩水をＰａｙｔｏｎアグレゴメーター
（Ｐａｙｔｏｎ　　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，
バッファロー、ニューヨーク）で３７℃で１分間プレイ
ンキュベートした。

【００４１】５０μｌのアデノシン５´ジホスフェート
（ＡＤＰ）（５０μＭ）をキュベットに加え、凝集を１
分間モニターした。全化合物を２反覆テストした。結果
は、下記のとおり計算した。 コントロールの％＝〔（化合物の最大ＯＤ−出発ＯＤ）
／（コントロール食塩水の最大ＯＤ−出発ＯＤ）〕×１
００。 ％阻害＝１００−（コントロールの％）。

【００４２】インビボラット血小板減少症雄ラット〔Ｃ
ｈａｒｌｅｓ　　Ｒｉｖｅｒ，ＣＲＬ：ＣＤ（ＳＤ），
４００−４５０ｇ〕を用いた。ラットをＮａペントバル
ビタル（６５ｍｇ／ｋｇ，Ｖｅｔ　　Ｌａｂｓ，Ｌｉｍ
ｉｔｅｄ，Ｉｎｃ．，レネクサ、カンザス）で麻酔した
。２つの切開を行ない、両方の頸静脈を出した。注入ポ
ンプ（Ｈａｒｖａｒｄ　　Ａｐｐａｒａｔｕｓ，サウス
ナチック、マサチューセッツ）及び１９ｇバタフライを
備えた５ｃｃシリンジを用いて、供試化合物又はビーク
ルを０．３９ｍｌ／分の速度で３分間、左頸静脈に注入
した。

【００４３】化合物／ビークル注入の２分後、コラーゲ
ン（６０μｇ／ｋｇ）（ＨｅｌｅｎａＬａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ，バーモント、テキサス）を１ｍｌシリンジで
右頸静脈に注入した。体腔を開き、大静脈を血液サンプ
リング用に取り出した。コラーゲン注入の１分後、化合
物注入を停止させ、０．３ｍｇの４．５％ＥＤＴＡ／Ｔ
ｒｉｓ（０．１Ｍ）（ｐＨ７．３５）及び１５０μＭイ
ンドメタシンを含んだ３ｃｃシリンジにより、（３０秒
以内に）大静脈から血液を採取した。血小板リッチプラ
ズマ（ＰＲＰ）を、血液を１２６×ｇ１０分間遠沈する
ことにより製造した。５μｌのＰＲＰをＣｏｕｌｔｅｒ
カウンターの２０ｍｌのイソトン（商標）（Ｉｓｏｔｏ
ｎ　ＩＩＩ）（Ｃｏｕｌｔｅｒ、アイソトニック溶液）
中でカウントした。

【００４４】コラーゲン誘導凝集の％阻害を（ａ）コラ
ーゲンの与えられていない（非凝集コントロール）動物
の血小板カウント及び（ｂ）ビークル及びコラーゲンを
与えられた（凝集コントロール）動物の血小板カウント
を有する供試化合物及びコラーゲンで処置された動物の
血小板カウントを比較することにより計算した。ＥＤ５
０は、静脈内投与（ｉ．ｖ）供試化合物を計算した。

【００４５】これらのアッセイの結果は、以下のとおり
である。

【００４６】結果 Ａ．血小板へのフィブリノーゲンの結合８−ＧＯ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅは、ＡＤＰ刺激洗條ヒト血小板への１２５　
Ｉ−フィブリノーゲン結合を阻害した。図１は、ＩＣ５
０６．０×１０−７Ｍで阻害したことを示す。

【００４７】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、血小板への
フィブリノーゲンの結合を阻害する上で、８−ＧＯ−Ａ
ｓｐ−ＭＰＥよりも約１５倍も効力があり、ＰＧＤＳよ
りも約７０倍効力があった。結合阻害カーブは３化合物
全て類似していた。

【００４８】Ｂ．インビトロ血小板凝集の阻害血小板リ
ッチプラズマ（ＰＲＰ）をヒト又はイヌの新鮮取出し血
液サンプルから調整した。ＰＲＰをそれから８−ＧＯ−
Ａｓｐ−Ｐｈｅ又は８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥで、３７
℃でアグレゴメーターキュベット中で２分間インキュベ
ートし、それからＡＤＰ（図２のヒトＰＲＰで、説明さ
れているように）又はコラーゲン（図３のイヌＰＲＰで
説明されている）のどちらかを加えた。

【００４９】凝集の程度をＰＲＰ溶液を通過する光線透
過を測定してモニターした。両方の化合物はヒト又はイ
ヌにおいて、それぞれＡＤＰ及びコラーゲンに反応して
、濃度に依存して、血小板凝集を阻害した。

【００５０】ヒト及びイヌのＰＲＰにおいて、８−ＧＯ
−Ａｓｐ−Ｐｈｅは８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥよりも約
５倍効力が高かった。

【００５１】ヒトＰＲＰは、又、凝集アッセイに先立っ
て、プラズマ蛋白を除去するために洗條の操作にかけた
。洗條した血小板を、それからキュベット中で供試化合
物とインキュベートし、トロンビンと凝集させた（結果
を図４、表２に示す）。

【００５２】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、洗條血小板
てのトロンビン誘導凝集において、８−ＧＯ−Ａｓｐ−
ＭＰＥよりも５倍効力が高かった。

【００５３】

【表２】表　　２インビトロでの８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅ及び８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥによる血小板擬集の
インビトロ活性阻害の要旨：ＩＣ５０（Ｍ）

【００５４
】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅがインビトロで活性がある
と判明したすべてのケースで、凝集が阻害された。一方
、種々のアゴニストに反応して血小板形態変化はブロッ
クされなかった。従って、この化合物は、血小板活性化
のプロセスに干渉するのではなく、むしろ、その後のフ
ィブリノーゲン結合段階の凝集プロセスをブロックする
。

【００５５】Ｃ．インビボでの血小板凝集の阻害ラット
におけるコラーゲン誘導血小板減少症 コラーゲンの静注後、ラットから取り出された血液中の
血小板の数は、正常の数と比べて明らかに減少する。血
液中におけるコラーゲンの存在は、血小板の活性化及び
凝集をもたらす。これらの凝集した血小板の量は、微少
血管のエントラプメント（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）によ
り、循環から除かれ、血小板数の減少の原因となる。８
−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ、８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ又
はＲＧＤＳをコラーゲン注射に先立つ２分間、ラットの
静脈内に注入し、コラーゲン注射後、更に１分間継続し
、血小板数への影響を決定した（図５）。

【００５６】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、ＥＤ５００
．０５ｍｇ／ｋｇで、投与量に依存して、コラーゲン（
６０μｇ／ｋｇ）誘導血小板減少症を阻害した。８−Ｇ
Ｏ−Ａｓｐ−ＭＰＥも又ＥＤ５００．０７ｍｇ／ｋｇで
有効であった。 これに対して、ＲＧＤＳは５０％による凝集を、１０ｍ
ｇ／ｋｇまでの投与量で阻害しなかった。

【００５７】０．１０ｍｇ／ｋｇの８−ＧＯ−Ａｓｐ−
Ｐｈｅ（２×ＥＤ５０）の静注投与は、３分注入の終り
から１５分後最大の活性を示し、コラーゲン誘導血小板
減少症の９０％阻害を導いた（図６）。

【００５８】０．１ｍｇ／ｋｇ８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈ
ｅ（２×ＥＤ５０でのｔ１／２）後の血小板凝集阻害活
性は、１２分の半減期で減少した。これに対して、０．
１４ｍｇ／ｋｇ８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ（２×ＥＤ５
０）は、４３分のｔ１／２で７０％の減少を導いた。

【００５９】Ｄ．イヌでのエクスビボ、コラーゲン誘導
血小板凝集の阻害 イヌを麻酔し、８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅの静注をした
。化合物の注入前、中、後の種々の投与量で、血液サン
プルを取り、ＰＲＰを調整し、コラーゲンに対する血小
板の凝集反応をアグレゴメータで評価した。

【００６０】別の研究により、８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈ
ｅをボーラスとして１分以上（図７）投与し、又は２時
間注入して（図８）、安定した血小板反応を得た。

【００６１】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、イヌでのど
ちらのプロトコールでもコラーゲン誘導血小板凝集の投
与量に依存する阻害を行なった。ボーラス注入では、８
−ＧＯ−Ａｓｐ−ＰｈｅのＥＤ５０は、０．６ｍｇ／ｋ
ｇであり、これに対し、注射後５分に評価した８−ＧＯ
−Ａｓｐ−ＭＰＥのＥＤ５０は１．７ｍｇ／ｋｇであっ
た（８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅの短い半減期の故に、活
性を投与後２分でも又評価した。８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐ
ｈｅは、注入後２分で測定した時、ＥＤ５００．３０ｍ
ｇ／ｋｇを有した。）安定な阻害（４５分から２時間ま
での反応を平均して決定）は、０．００７５ｍｇ／ｋｇ
／分であった（これに対し、８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ
は、０．０３ｍｇ／ｋｇ／分）。

【００６２】実施例４ ８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅは、イヌでの血栓溶解剤、組
織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）の投与
によるクロットの溶解後の再パーフュージョンする時間
を短縮しかつ再閉塞を達成する時間を延長する。以下の
操作をこのテストのため採用した。

【００６３】約２５ｋｇ体重のイヌをペントバルビター
ル３０ｍｇ／ｋｇ　　ｉ．ｖ．で麻酔した。左頸静脈を
単離し、カニューレを挿入し、ｉ．ｖ．注射用のルート
を設けた。左頸動脈に血圧測定用にカニューレを挿入し
た。第５肋間スペースを通して左開胸術をほどこした。

【００６４】囲心腔を開き、心臓を囲む離被架を００シ
ルク縫糸を用いて構築した。左前下行冠状動脈（ＬＡＤ
ＣＡ）を少なくとも約３ｃｍの長さ、そのシース（Ｓｈ
ｅａｔｈ）を切開した。１つの大きなブランチを除いて
、全てのサイドブランチを４−０、又は５−０　　シル
ク縫糸で結紮した。単離したＬＡＤＣＡのセグメントの
近位端に適切な大きさの電磁気的フロープルーブを施し
た。 保持したサイドブランチに２３ｇニードルアダプタ−及
び３方向栓をつけたＰＥ−５０カテーテルでカニューレ
を挿入した。

【００６５】ワイヤを包むべく作られた２ｍｍ巾のプラ
スチック器具をセグメントの遠位端に取りつけた。除去
可能な数個のシルク縫糸、大きさが２−０及び４−０（
約１０個）を、ループをベッセルの回りでしめた後、流
量を調整するためプラスチックバンドのループ内に設置
した。

【００６６】セグメントを通る流れは、プラスチックバ
ンドをしめることにより減少させ、シルク結紮糸セグメ
ントを除去することによって調整し４０−５０％の流量
減少が、得られた。充血を避けるのを確実にするために
、機械的閉塞を実施した。

【００６７】クロットが形成されているセグメントをデ
バケイ（Ｄｅｂａｋｅｙ）鉗子を用いて３ないし４回圧
縮して傷つけた。セグメントを単離し、リークを防止す
るために、プラスチックで覆われた鋸歯状を有する非常
に細かいモスキトクランプをフロープルーブの遠位でプ
ラスチックオクルーダー（ｏｃｃｌｕｄｅｒ）の近位に
施した。血液をカニューレを挿入されたサイドブランチ
から取り出した。

【００６８】もし、単離されたセグメント中に、いく分
か血液が残留していれば、遠位オクルーダーの側のクラ
ンプを開くことによって、食塩水でフラッシュする。カ
ニューレを挿入したサイドブランチを使って、０．１ｍ
ｌのトロンビン（１０００Ｕ／ｍｌ）を単離したセグメ
ントに注入し、その後、０．３ｍｌの血液を頸静脈から
除去した。クロットは１５分間でキュア（ｃｕｒｅ）と
なった。

【００６９】血液サンプルをＰＴ（プロトロンビン時間
）及びＡＰＴＴ（活性部分トロンボプラスチン時間）の
測定用に取った。１５分の期間の終りに、モスキートク
ランプを、最初近位のクランプ、後で遠位のクランプを
はずした。

【００７０】もし、流れ計が、流れ０を記録して、閉塞
クロットの存在を示しているならば、５０００Ｕのヘパ
リンをｉ．ｖ．投与し、サイドブランチカテーテルを除
去し、サイドブランチをゆるめる。ヘパリンの最初の投
与後１時間毎のインターバルで、更に１０００Ｕのヘパ
リンをｉ．ｖ．投与する。

【００７１】ヘパリンの最初の投与の直後、及び以下に
示す時期に、血小板の反応性、ＰＴ及びＡＰＰＴの測定
用に、血液サンプルを取った。更に３０分経過後、この
間にクロットの閉塞性が確認され；供試化合物を投与し
（ボーラス投与か又はインフュージョンを始めるかどち
らかによって、適切に且つ適切なルートにより）、及び
、０．２５ｍｇ／ｋｇ　　ｔ−ＰＡの注入を、ｉ．ｖ．
ボーラスインジェクションにより投与する。

【００７２】ｔ−ＰＡの投与は１時間又は再パーフュー
ジョンが起るまで１５分毎に反覆する。再パーフュージ
ョンを、クロットの形成に先立ちベッセル中の流量の５
０％の再樹立と定義する。再パーフュージョン時間は、
最初のｔ−ＰＡ注入時から測定する。凝固ファクター及
び血小板反応性の測定用に、血液サンプルを、再パーフ
ュージョンの時間で採取する。

【００７３】再閉塞は、ベッセル中の流れ０ｍｌ／分へ
のリターンと定義し、再閉塞時間を再パーフュージョン
時間から測定する。最後の血液サンプルを凝固ファクタ
ー及び血小板反応性の測定用に得る。

【００７４】動物は、身体的状況に応じて溶解後１−２
時間観察する。化合物は、再パーフュージョンする時間
の短縮する能力、再閉塞時間を延長する能力及びその両
方に関して評価する。

【００７５】化合物の最大効果とは、テスト期間中にお
いて、再閉塞しないものと定義する。化合物が溶解後再
閉塞を起こすのに必要な時間をかなり延長するならば、
化合物は、最大効果より小さいものである。このような
薬剤は、別の投与レジメを用いて、再テストが考慮され
る。

【００７６】上記テストの結果を臨床的に入手可能なＧ
ｅｎｅｎｔｅｃｈ　　Ａｃｔｉｖａｓｅ　　ｔ−ＰＡを
用いて以下の表３及び図９に掲げる。

【表３】

【００７７】本発明の新規ペプチドミメチック化合物は
、非経口又は経口投与法、好ましくは、薬学的に容認さ
れる稀釈剤又はキャリアを有する製剤のような、従来の
方法により哺乳動物ホストに投与するのに使用すること
ができる。血小板凝集阻害剤としての好ましい投与ルー
トは、非経口、例えば、静脈内的である。

【００７８】通常の生理食塩水、ヒトアルブミン及び他
の稀釈剤及びキャリアを含む溶液中のこのペプチドミメ
チック化合物の静脈内投与は、説明済である。薬学的に
容認可能な稀釈剤、及びキャリア中の、治療的投与量で
の、この活性なペプチドミメチック化合物の他の適切な
製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａ
ｃｅｎｔｉｃａｌ　　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｄ．Ａｒｔ
ｈｕｒ　　Ｏｓａｌ，第１６版、１９８０、Ｍａｃｋ　
　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　　Ｃｏ．イーストン，ペンシ
ルベニア、のような一般的なテキストを参照することに
よって、製造することができる。

【００７９】イヌでの、血小板凝集を完全に阻害するの
に必要とされるインフュージョン速度は、およそ２０−
３０μｇ／ｋｇ／分であった。血小板反応性の完全な阻
害が望ましいと仮定すれば、もし、イヌでの血小板投与
量反応が、直接ヒトにスケールすると、約４３ｍｇ／ｋ
ｇの薬剤がインフュージョンの２４時間の期間に必要と
されるであろう（〜３ｇ／ｄａｙ、全体投与量）。治療
の期間は、１から数週間まで変動しうる。

【００８０】種々の他の実施例は、当業者であれば、本
明細書の開示を読んだ後は、本発明の精神及び範囲を離
れることなく明白になしうるであろう。このような実施
例の全てが、請求の範囲の中に含まれるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】各阻害剤、８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（　　□
）、８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ（■）、及びＲＧＤＳ（
Ｘ）によるヒト洗條血小板へのフィブリノーゲン結合の
阻害。ここで、コントロール（阻害剤無し）と比較して
のフィブリノーゲン結合の％が、阻害剤のモル濃度（Ｍ
）に対してプロットされる。

【図２】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（　　□）及び８−
ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ（■）による、ヒト血小板リッチ
プラズマ中のＡＤＰ−誘導血小板凝集の阻害。コントロ
ール（阻害剤無し）に比較しての血小板凝集の％を、阻
害剤のモル濃度（Ｍ）に対してプロットしている。

【図３】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（　　□）及び８−
ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ（■）によるイヌ血小板リッチプ
ラズマ中のコラーゲン誘導血小板凝集の阻害を、図２と
同様にプロットする。

【図４】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（　　□）及び、８
−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ（■）による洗條ヒト血小板で
のトロンビン誘導血小板凝集の阻害を図２と同様にプロ
ットする。

【図５】各阻害剤、８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（　　□
）、８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ（■）及びＲＧＤＳ（Ｘ
）によるラットでのコラーゲン誘導血小板減少症の阻害
を示す。ここで、コントロール（阻害剤無し）に比較し
ての血小板減少症の％阻害（血小板カウントの減少）を
阻害剤の投与量（ｍｇ／ｋｇ）に対してプロットする。

【図６】８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（　　□）、及び８
−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ（■）によるラットでのコラー
ゲン誘導血小板減少症の阻害の時間経路を示す。ここで
、％阻害を時間（分）に対してプロットする。

【図７】イヌでのエクスビボコラーゲン誘導血小板凝集
に対するＩＶボーラスによる８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ
（□）及び８−ＧＯ−Ａｓｐ−ＭＰＥ（■）の効果を示
す。ここで、コントロール（阻害剤無し）に比較して血
小板サンプルの阻害％を、阻害剤の投与量（ｍｇ／ｋｇ
）に対してプロットする。

【図８】イヌでのエクスビボコラーゲン誘導血小板凝集
に対する８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ（□）及び８−ＧＯ
−Ａｓｐ−ＭＰＥ（■）のＩＶインフュージョンの効果
を、図７と同様にプロットして示す。

【図９】コントロール（８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ無し
）及びＡＳＡと比較してイヌでのｔ−ＰＡとの共一投与
したときの再パーフュージョン（溶解）及び再閉塞に対
する８−ＧＯ−Ａｓｐ−Ｐｈｅの効果を時間（分）で示
す。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　Ｎ−〔８−〔（アミノイミノメチル）
   アミノ〕−１−オキソオクチル〕−Ｎ−Ｌ−αーアスパ
   ルチル−Ｌ−フェニルアラニン。
2. 【請求項２】　　温血哺乳動物に、薬学的に容認しうる
   キャリア中の請求項１の化合物の血小板凝集阻害有効量
   を投与することからなる温血哺乳動物の血小板凝集を阻
   害する方法。
3. 【請求項３】　　温血哺乳動物に、薬学的に容認しうる
   キャリア中の請求項１の化合物の血栓形成阻害有効量を
   投与することからなる温血哺乳動物の血栓形成阻害方法
   。
4. 【請求項４】　　薬学的に容認しうるキャリア中の請求
   項１の化合物。
5. 【請求項５】　　再パーフュージョン時間を短縮し及び
   再閉塞達成時間を延長するのに適した請求項１の化合物
   の有効量を共−投与することからなる温血哺乳動物に投
   与された組織プラスミノーゲンアクチベーターの血栓溶
   解活性を強化する方法。