ES3053014T3 - Use of antibody-producing murine mammals to generate high affinity antibodies - Google Patents

Abstract

La invención proporciona animales transgénicos no humanos que comprenden un ácido nucleico que codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, siendo dicha cadena ligera humana, similar a la humana o humanizada. El ácido nucleico está provisto de un mecanismo que lo hace resistente a reordenamientos del ADN y/o hipermutaciones somáticas. En una realización, el ácido nucleico comprende un casete de expresión para la expresión de una molécula deseada en células durante una etapa específica de desarrollo en células que se convierten en linfocitos B maduros. La invención también proporciona métodos para producir una inmunoglobulina a partir del animal transgénico no humano. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

[0001] DESCRIPCIÓN

[0002] Uso de mamíferos murinos productores de anticuerpos para generar anticuerpos de alta afinidad

[0003] Campo de la invención

[0004] La invención se refiere al uso de mamíferos murinos transgénicos para producir anticuerpos de alta afinidad, que se expresan a partir de ácidos nucleicos al menos parcialmente exógenos (transgenes). Se divulgan transgenes para producir dichos mamíferos murinos transgénicos y métodos para producir dichos anticuerpos heterólogos; métodos y vectores para producir dichos mamíferos murinos transgénicos. La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

[0005] Antecedentes de la invención

[0006] Los linfocitos B median en la inmunidad humoral produciendo anticuerpos específicos. La subunidad estructural básica de un anticuerpo (Ab, por sus siglas en inglés) es una molécula de inmunoglobulina (Ig). Las moléculas de Ig consisten en un complejo de dos cadenas polipeptídicas pesadas (H, por sus siglas en inglés) y dos ligeras (L, por sus siglas en inglés) idénticas. En el extremo amino de cada cadena H y L hay una región que varía en la secuencia de aminoácidos denominada región variable (V). La porción restante de las cadenas H y L es relativamente constante en la secuencia de aminoácidos y se denomina región constante (C). En una molécula de Ig, las regiones V de las cadenas H y L (VH y VL) se yuxtaponen para formar el sitio potencial de unión a antígeno. Los genes que codifican las regiones V de las cadenas H y L se ensamblan somáticamente a partir de segmentos de ADN de la estirpe germinal durante la diferenciación de los linfocitos B precursores (pre-B): segmentos génicos V, D y J para la cadena H y segmentos génicos V y J para la cadena L. Dentro de las regiones V de Ig hay tres regiones de mayor variabilidad de secuencias de aminoácidos que interactúan para formar el sitio de reconocimiento de antígeno, por lo que se denominan regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés).

[0007] El segmento génico V codifica la mayor parte del dominio de la región V, incluyendo CDR1 y CDR2. La diversidad en CDR1 y CDR2 deriva de la heterogeneidad de secuencias entre múltiples segmentos V codificados en la estirpe germinal diferentes. CDR3 está codificada por secuencias que se forman por la unión de los segmentos génicos H, D y J de la cadena H y los segmentos V y J de la cadena L, y por mecanismos que crean heterogeneidad de secuencia de nucleótidos cuando se combinan estos segmentos. Una diversidad adicional puede derivar del emparejamiento de diferentes regiones V de las cadenas H y L. En conjunto, estos procesos producen un repertorio primario de anticuerpos codificados por segmentos génicos de la estirpe germinal y expresados por linfocitos B recién formados. Además de la diversidad generada por la recombinación de segmentos génicos de Ig, se impone una fuente adicional de diversidad de anticuerpos. Los linfocitos B son capaces de introducir mutaciones en las regiones V de anticuerpo que expresan, un proceso llamado hipermutación somática. Por lo tanto, cuando un animal se encuentra por primera vez con un antígeno, el antígeno se une a un linfocito B específico que resulta ser portadora de anticuerpos que tienen un dominio V que se une al antígeno. Esta respuesta primaria puede activar este linfocito B para que continúe secretando el anticuerpo afín. Estos linfocitos B activados también pueden dirigir ahora un proceso de mutación somática a sus segmentos génicos de anticuerpos reordenados y permitir de este modo la producción de células hijas que producen variantes de los anticuerpos de la respuesta primaria. Un proceso de selección amplifica aquellos descendientes de linfocitos B variantes que producen un anticuerpo de afinidad mejorada del antígeno. En los linfocitos B, las hipermutaciones somáticas se dirigen a una región genómica restringida que incluye ambos genes VH y VL reordenados. Por lo tanto, la mutación somática permite la maduración de afinidad (la producción y selección de anticuerpos de alta afinidad). Por lo tanto, la mutación somática es importante para la generación de anticuerpos de alta afinidad.

[0008] La exquisita especificidad y alta afinidad de los anticuerpos y el descubrimiento de la tecnología de hibridoma que permite la generación de anticuerpos monoclonales (mAb) ha generado grandes expectativas para su utilización como terapias dirigidas para enfermedades humanas. Los mAb son idénticos porque son producidos por un único linfocito B y su progenie. Los mAb se fabrican fusionando las células del bazo de un ratón que se ha inmunizado con el antígeno deseado con células de mieloma para generar hibridomas inmortalizados. Uno de los principales impedimentos a los que se enfrenta el desarrollo de aplicacionesin vivode mAb en seres humanos es la inmunogenicidad intrínseca de las Ig no humanas. Los pacientes responden a dosis terapéuticas de mAb de ratón produciendo anticuerpos contra las secuencias de Ig de ratón (Anticuerpos humanos anti-ratón (Human Anti Mouse Antibodies); HAMA), provocando toxicidad aguda, alterando su biodistribución y acelerando su eliminación, reduciendo de este modo la eficacia de las administraciones posteriores (Mirick,et al., (2004)Q. Nucl.Med.Mol.Imaging48, 251-257).

[0009] Para evitar la generación de HAMA, se han desarrollado métodos de humanización de anticuerpos en un intento de producir mAb con menor inmunogenicidad cuando se aplican a seres humanos. Estos esfuerzos han producido diversos enfoques basados en ADN recombinante destinados a aumentar el contenido de secuencias de aminoácidos humanas en los mAb, conservando al mismo tiempo la especificidad y la afinidad del anticuerpo no humano parental. La humanización comenzó con la construcción de mAb quiméricos de ratón-humanos (Morrison, S. L.,et al., (1984).Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 81, 6851-5), en los que las regiones C de Ig de los mAb murinos se reemplazaron por regiones C humanas. Los mAb quiméricos contienen el 60-70 % de secuencias de aminoácidos humanas y son considerablemente menos inmunogénicos que sus homólogos murinos cuando se inyectan en seres humanos, aunque se siguió observando una respuesta de anticuerpos antiquiméricos humanos (Hwang, W. Y.,et al.(2005).Methods, 36, 3-10).

[0011] En los intentos de humanizar adicionalmente los mAb murinos, se desarrolló el injerto de CDR. En el injerto de CDR, los anticuerpos murinos se humanizan injertando sus CDR en los marcos de VL y VH de las moléculas de Ig humanas, conservando al mismo tiempo los restos del marco murino que se consideran esenciales para la especificidad y la afinidad (Jones, P.T.,et al., (1986).Nature, 321, 522). En general, los anticuerpos con injerto de CDR consisten en más del 80 % de secuencias de aminoácidos humanas (Queen, C.et al.(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 86, 10029; Carter, P.et al.(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.89, 4285). A pesar de estos esfuerzos, se demostró que los anticuerpos humanizados con injerto de CDR, seguían evocando una respuesta de anticuerpos contra la región V injertada (Hwang, W. Y.,et al.(2005).Methods, 36, 3).

[0013] Posteriormente al injerto de CDR, se han desarrollado métodos de humanización basados en diferentes paradigmas tales como la remodelación de la superficie (Padlan, E. A.,et al., (1991).Mol.Immunol., 28, 489), la superhumanización (Tan, P., D. A.,et al., (2002)J. Immunol., 169, 1119), la optimización del contenido de cadenas humanas (Lazar, G. A.,et al., (2007).Mol.Immunol., 44, 1986) y la humanización (humaneering) en un intento de disminuir adicionalmente el contenido de secuencias no humanas en los mAb terapéuticos (Almagro, J. C.,et al., (2008).Frontiers in Bioscience13, 1619). Como en los enfoques de injerto de CDR, estos métodos se basan en el análisis de la estructura del anticuerpo y en la comparación de secuencia de los mAb humanos y no humanos con el fin de evaluar la repercusión del proceso de humanización en la inmunogenicidad del producto final. Cuando se compara la inmunogenicidad de los anticuerpos quiméricos y humanizados, la humanización de las regiones variables parece disminuir adicionalmente la inmunogenicidad (Hwang, W. Y.,et al.(2005).Methods, 36, 3-10).

[0015] La desinmunización es otro enfoque desarrollado para reducir la inmunogenicidad de los anticuerpos quiméricos o de ratón. Implica la identificación de epítopos de linfocitos T lineales en el anticuerpo de interés, usando bioinformática, y su posterior reemplazo por mutagénesis dirigida al sitio a secuencias humanas o no inmunogénicas (documento WO09852976A1). Aunque los anticuerpos desinmunizados presentaron una inmunogenicidad reducida en primates, en comparación con sus homólogos quiméricos, se observó cierta pérdida de afinidad de unión (Jain, M.,et al., (2007).Trends in Biotechnol.25, 307).

[0017] El desarrollo de la tecnología de presentación en fagos complementó y amplió los enfoques de humanización en los intentos de obtener mAb menos inmunogénicos para la terapia en seres humanos. En la presentación en fagos, se expresan grandes colecciones ("bibliotecas") de regiones VH y VL de anticuerpos humanos en la superficie de partículas filamentosas de bacteriófagos. De estas bibliotecas, se seleccionan los fagos raros mediante la interacción con el antígeno; se expresan fragmentos de anticuerpos solubles a partir de bacterias infectadas y la afinidad de unión de los anticuerpos seleccionados se mejora mediante mutación (Winter, G.,et al.(1994).Annu.Rev. Immunol.12, 433). El proceso imita la selección inmunitaria y se han aislado anticuerpos con muchas especificidades de unión diferentes usando este enfoque (Hoogenboom, H. R.,et al.(2005).Nat. Biotechnol., 23, 1105). Se han utilizado diversas fuentes de regiones V de las cadenas H y L para construir bibliotecas de presentación en fagos, incluyendo las aisladas de donantes no inmunes o inmunes. Además, se han construido bibliotecas de presentación en fagos de regiones V que contienen regiones CDR sintéticas aleatorizadas artificialmente con el fin de crear una diversidad adicional. Con frecuencia, los anticuerpos obtenidos a partir de bibliotecas de presentación en fagos se someten a maduración de afinidadin vitropara obtener anticuerpos de alta afinidad (Hoogenboom, H. R.,et al.(2005).Nat. Biotechnol., 23, 1105).

[0019] La creación de cepas de ratones transgénicos que producen anticuerpos humanos en ausencia de anticuerpos de ratón ha proporcionado otra plataforma tecnológica para la generación de mAb humanos específicos y de alta afinidad para su aplicación en seres humanos. En estos animales transgénicos, la maquinaria de anticuerpos endógena del ratón se inactiva y se reemplaza por locus de Ig humanos para reproducir sustancialmente el sistema inmunitario humoral humano en ratones (Jakobovits, A.,et al.(2007).Nat. Biotechnol. 25, 1134. Lonberg, N. (2005).Nat. Biotechnol. 23, 1117). El desarrollo de los linfocitos B, así como la diversificación de Ig por recombinación de segmentos génicos, se reproduce fielmente en estos ratones, conduciendo a un repertorio diverso de linfocitos B murinos que expresan Igs humanas. Al inmunizar estos ratones con antígenos, se demostró además que estos animales transgénicos acumulaban mutaciones somáticas en las regiones V de las cadenas tanto pesadas como ligeras para producir una amplia diversidad de mAb humanos de alta afinidad (Lonberg, N. (2005).Nat. Biotechnol.

[0020] 23, 1117).

[0022] La pregunta, si los mAb "totalmente humanos", tales como los derivados de bibliotecas de presentación en fagos o de ratones transgénicos, son menos inmunogénicos que los mAb humanizados, aún no se ha respondido, porque sólo se dispone de datos de inmunogenicidad completos de dos mAb humanos. Un mAb antifactor de necrosis tumoral, desarrollado a partir de bibliotecas humanas con fagos presentados, indujo respuestas de anticuerpos en el 12 % de los pacientes, en el extremo superior de la incidencia de respuestas anti-anticuerpo de los anticuerpos humanizados (Hwang, W. Y.,et al.(2005).Methods, 36, 3-10).

[0023] La evaluación de la inmunogenicidad del primer mAb humano registrado generado mediante el enfoque transgénico demostró que el tratamiento con mAb dio como resultado la generación de anticuerpos en aproximadamente el 5,5 % de los pacientes con cáncer tratados (Jakobovits, A.,et al.(2007).Nat. Biotechnol. 25, 1134, Lofgren, J. A.,et al.(2007).J. Immunol.178, 7467).

[0024] El documento EP0814159 divulga un experimento teórico para la producción de un ratón transgénico para la producción de anticuerpos, que comprende un dominio V humano reordenado unido a un dominio constante de cadena ligera humana. No se han producido ratones transgénicos.

[0025] Por lo tanto, siguen siendo necesarios métodos y medios para producir anticuerpos que sean específicos para sus dianas, pero sean menos inmunogénicos. Como se describe en el presente documento, la reducción de la inmunogenicidad se consigue, al menos parcialmente, proporcionando un mamífero murino transgénico que comprende, al menos en su linaje de linfocitos B, un ácido nucleico que codifica al menos una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde la secuencia codificante de cadena ligera está provista de un medio que la hace resistente a reordenamientos y/o hipermutaciones somáticas del ADN, preferentemente un mamífero murino de este tipo es un roedor, más específicamente, un ratón. El ácido nucleico codifica una región VL humana reordenada de una inmunoglobulina humana.

[0026] Sumario de la invención

[0027] Como se reivindica, la presente invención se refiere al uso de un mamífero murino transgénico que comprende integrado en su genoma un ácido nucleico reordenado que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, en donde dicha región variable de cadena ligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamífero murino, de manera que la variedad en la especificidad de los anticuerpos se conserva a través de reordenamientos e hipermutaciones en las cadenas pesadas, para la generación de anticuerpos de alta afinidad que comprendan dicha región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, en donde los anticuerpos están codificados por genes VH que han experimentado hipermutación somática tras la inmunización y el gen VL humano reordenado no mutado integrado en el genoma.

[0028] Descripción detallada de la invención

[0029] En el resto de la memoria descriptiva se usan normalmente ratones como ejemplos de los mamíferos murinos. Los hospedadores murinos transgénicos son capaces de montar una respuesta inmunitaria a un antígeno, donde la respuesta produce anticuerpos que tienen regiones variables de cadena ligera humana. Se han utilizado ratones para la producción de linfocitos B para inmortalización para la producción de anticuerpos. Puesto que los ratones son fáciles de manipular, pueden criarse en grandes cantidades y se sabe que tienen un amplio repertorio inmunitario, los ratones serán por lo general el animal elegido. Por lo tanto, en el siguiente análisis, el análisis se referirá a ratones, pero se describe que debe entenderse que otros animales murinos, pueden sustituir fácilmente a los ratones, siguiendo los mismos procedimientos.

[0030] La razón para impedir los reordenamientos y la hipermutación es que de esta manera puede elegirse de antemano un polipéptido no inmunogénico sabiendo que esta cadena polipeptídica seguirá siendo no inmunogénica. Por lo tanto, al menos la cadena ligera de la inmunoglobulina resultante es menos inmunogénica. El anticuerpo resultante debe tener (por lo general) una cadena ligera y una pesada. Por lo tanto, la cadena no inmunogénica debe ser capaz de emparejarse con la otra cadena. La otra cadena puede ser una cadena endógena, una cadena exógena o un híbrido de ambas. Para la terapia humana, la cadena no inmunogénica debe ser lo más parecida posible a la humana. Un medio para hacer que un gen que codifica una cadena (o cadenas) de inmunoglobulina sea resistente a la reordenación y/o mutación del ADN es, por supuesto, la eliminación de todos los elementos genéticos responsables de dicha reordenación y/o mutación. El inconveniente de la misma es que se elimina la variabilidad de las dos cadenas, mientras que el mamífero murino utilizado de acuerdo con la invención conserva la variabilidad en la cadena pesada e inhibe y/o impide la reordenación-mutación de la cadena ligera.

[0031] Los elementos de reordenación y/o hipermutación caracterizados hasta ahora se ubican dentro de los locus para inmunoglobulinas. Por lo tanto, el medio para hacer que la secuencia codificante de inmunoglobulina sea resistente a la reordenación y/o mutación del ADN es insertar el gen en un locus fuera de los locus de inmunoglobulina.

[0032] Por lo tanto, de acuerdo con la invención se usa un mamífero murino transgénico en donde la secuencia codificante de cadena ligera está integrada en el genoma del mamífero murino en un locus fuera de los locus de inmunoglobulina. En una realización, la inserción está en un locus que es resistente al silenciamiento génico. De acuerdo con una realización de la invención, la integración se produce en el locus Rosa o en un locus comparable.

[0033] Se prefiere proporcionar un casete de expresión que pueda insertarse en un locus Rosa o en un locus comparable con un medio que permita la expresión de la cadena o cadenas de inmunoglobulina esencialmente limitada a las células del linaje de linfocitos B, preferentemente con un medio que permita la expresión del ácido nucleico codificante de cadena ligera durante una fase determinada del desarrollo de los linfocitos B. La expresión "expresión esencialmente limitada" indica que la expresión es predominantemente en células del linaje de linfocitos B, pero que son posibles niveles de expresión más bajos en otras células, en comparación con el nivel de expresión en linfocitos B. En una realización preferida, la expresión "expresión esencialmente limitada" indica que la expresión está presente exclusivamente en células del linaje de linfocitos B. Dichos medios incluyen normalmente y preferentemente promotores específicos de linfocitos B (fase de desarrollo) tales como CD19, CD20, µHC (todos los genes V), VpreB 1, VpreB2, VpreB3, λ5, Igα, Igβ, κLC (todos los genes), λLC (todos los genes), BSAP (Pax5). Aunque es muy posible dirigir la expresión de la cadena resistente a la reordenación y/o mutación del ADN mediante dichos promotores, son relativamente débiles. Normalmente se necesitará un promotor potente para garantizar una expresión en superficie adecuada del receptor de linfocitos B (formado por las cadenas H y L de Ig unidas a la membrana) y para competir con la expresión y el emparejamiento de las cadenas endógenas (si están presentes) mediante exclusión alélica. Un promotor de este tipo, sin embargo, por lo general no es específico de tejido. Para conferir especificidad de tejido, se prefiere un sistema indirecto que emplee Cre/lox o similares. La cadena deseada se pone bajo el control de un promotor fuerte inhibido por un elemento que puede ser eliminado por la acción de una proteína Cre, conduciendo a la activación del gen codificador de inmunoglobulina deseado. Este sistema se describe en detalle en Wunderlich F. T. (2004), "Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice",Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln; http://deposit.ddb.de/cgi-bin/dokserv?idn= 97557230x&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=97557230x.pdf.

[0034] La cadena ligera de inmunoglobulina es capaz de emparejarse con diferentes cadenas pesadas codificadas por el mamífero murino. La cadena ligera será entonces la misma (y menos inmunogénica) en todos los anticuerpos, pero la variedad en la especificidad se mantiene a través de reordenamientos e hipermutaciones en las cadenas pesadas. En este caso puede ser preferible silenciar al menos uno de los locus endógenos que codifican una cadena ligera, aunque la exclusión alélica puede hacer esto innecesario.

[0035] De acuerdo con esta realización, preferentemente el locus de cadena ligera kappa (κ) endógeno está silenciado funcionalmente.

[0036] Si el locus de cadena ligera κ endógeno está silenciado, pero también por otras razones, se prefiere que la cadena ligera resistente sea una cadena ligera κ, preferentemente una cadena ligera que tenga una secuencia similar a la estirpe germinal. De acuerdo con la invención, una cadena ligera de este tipo conduciría a un anticuerpo con inmunogenicidad reducida. La secuencia de estirpe germinal preferida se basa en IGKV1-39 humana (012) ya que esta cadena ligera se observa muy frecuentemente en el repertorio humano (de Wildtet al.1999.J. Mol. Biol.

[0037] 285(3):895) y tiene una estabilidad termodinámica, un rendimiento y una solubilidad superiores (Ewertet al.2003.J. Mol. Biol.325(3):531).

[0038] A continuación se proporcionan realizaciones más específicas del casete de expresión con el que puede proporcionarse el mamífero murino para su uso de acuerdo con la invención. Esto normalmente es ventajoso para las inmunoglobulinas.

[0039] Por lo tanto, en una realización específica, la invención usa un mamífero murino transgénico en donde el ácido nucleico codificante de cadena ligera comprende en dirección 5'-3': un promotor específico de linfocitos B, un líder, un gen V humano reordenado, opcionalmente un potenciador MoEκi, una región constante (κ) y opcionalmente un potenciador MoEκ3' (truncado). Neuberger identificó y examinó un potenciador específico de linfocitos B novedoso ubicado en dirección 3' de la región constante kappa (documento EP004690251). Se ha demostrado que este potenciador desempeña una función crucial en la expresión de los genes kappa, ya que la eliminación del potenciador de 808 pb redujo fuertemente la expresión. La deleción del potenciador kappa 3' también redujo fuertemente el nivel de hipermutaciones somáticas (SHM, por sus siglas en inglés). En estudios transgénicos y de expresión celular se ha revelado que los potenciadores 3' kappa reducidos, mutados o suprimidos no sólo redujeron los niveles de expresión, sino que también disminuyeron el nivel de hipermutaciones somáticas. En la actualidad, no puede determinarse si el potenciador kappa 3' está implicado en procesos de SHM, regulación de la expresión o ambos (revisar Odegard, V. H.,et al.(2006).Nat. Rev. Immunol.6, 573; Inlay, M.,et al.(2002).Nat. Immunol.3, 463).

[0040] Los estudios de expresión detallados usando variantes modificadas por ingeniería genética del potenciador kappa 3' indicaron que una región de 50 nucleótidos es suficiente para impulsar la expresión. Sin embargo, para una expresión adecuada, se prefiere una secuencia reducida de 145 nucleótidos (documento EP04690251; Meyer, K. B.,et al.(1990)Nucleic Acids Res.18(19):5609-15)

[0041] Por lo tanto, la invención en un aspecto proporciona en el contexto del uso reivindicado un ácido nucleico para la inserción en el genoma de un mamífero murino que es un casete de expresión para la expresión de una molécula proteínica deseada en células que se desarrollan en linfocitos B maduros durante una fase determinada de desarrollo, comprendiendo dicho casete medios para impedir el silenciamiento de la expresión de la molécula proteínica deseada después de su introducción en una célula hospedadora, y medios para sincronizar la expresión de la molécula proteínica deseada con la fase de desarrollo deseada de la célula hospedadora.

[0042] Un casete de expresión se define como un ácido nucleico que se ha dotado de medios para su introducción en el genoma de una célula hospedadora, tales como secuencias que permiten la recombinación homóloga con un sitio determinado en el genoma. Por lo general, el ácido nucleico será ADN, normalmente bicatenario. Normalmente, el casete de expresión se proporcionará a la célula en un vector desde el que se transfiere al genoma de la célula. El casete de expresión comprende además todos los elementos necesarios para la expresión del gen en una célula hospedadora, aunque en determinados aspectos algunos de dichos elementos pueden estar presentes en un segundo ácido nucleico que ha de introducirse, por lo que estos elementos actúan en trans. Los elementos necesarios para la expresión en una célula hospedadora incluyen promotores, potenciadores y otros elementos reguladores. Sólo son necesarios los elementos que la célula hospedadora no proporciona.

[0043] Es importante que la expresión del gen de interés no se silencie en el genoma de la célula hospedadora, especialmente no en la fase de desarrollo en la que se requiere expresión. Esto puede realizarse por diversos medios, tal como la inserción en el locus endógeno, o proporcionando al casete elementos de ácido nucleico que impidan el silenciamiento (Kwakset al.(2006)Trends Biotechnol.24(3), págs.137-142). Se prefiere que el casete de expresión se inserte en un locus que no esté silenciado en las células hospedadoras (documento EP 01439234).

[0044] Dichos medios para impedir el silenciamiento comprenden secuencias anti-represión STabilizing (secuencias STAR<®>) y regiones de fijación a la matriz (MAR, por sus siglas en inglés). Una secuencia STAR es una secuencia de ácido nucleico que comprende una capacidad para influir en la transcripción de genes en cis. Normalmente, aunque no necesariamente, una secuencia STAR no codifica por sí misma un elemento proteico funcional. En una realización se usa un elemento STAR. Preferentemente, sin embargo, se usa más de un elemento STAR. De acuerdo con una realización particularmente preferida, un casete de expresión para su uso de acuerdo con la invención está provisto de dos secuencias STAR; una secuencia STAR en el lado 5' de la secuencia codificante del gen de inmunoglobulina y una secuencia STAR en el lado 3' de la secuencia codificante del gen de inmunoglobulina. Las MAR son secuencias de ADN que intervienen en el anclaje del ADN/cromatina a la matriz nuclear y se han descrito en especies tanto de mamíferos como de plantas. Las MAR poseen una serie de características que facilitan la abertura y el mantenimiento de la eucromatina. Las MAR pueden aumentar la expresión del transgén y limitar los efectos de posición.

[0045] De acuerdo con un aspecto de la invención, es importante que la expresión desde el casete sólo se produzca durante un determinado período en el desarrollo de una célula, en particular, un linfocito B en desarrollo, más en particular, un linfocito B en un mamífero murino transgénico, en particular, un ratón. En este caso particular, el período de desarrollo se elige de manera que la expresión de la cadena ligera no interfiera significativamente con la diferenciación y/o maduración normales de la célula y cuando sea aplicable, permite emparejar la cadena polipeptídica producida con su homóloga.

[0046] Esto puede conseguirse, en una realización, proporcionando un ácido nucleico útil para la invención, en donde dicho medio para sincronizar la expresión es un promotor cuya actividad se limita esencialmente a una fase determinada de desarrollo. En un linfocito B en desarrollo, que, por ejemplo, después de la inmunización está madurando y/o diferenciándose, la expresión del gen de interés, que es la región VL humana reordenada de una inmunoglobulina humana, no debe interferir (significativamente) con dicha maduración y/o diferenciación y debe sincronizarse de manera que el polipéptido resultante pueda emparejarse con sus homólogos. Por lo tanto, se describe un ácido nucleico útil para la invención en donde dicha fase determinada comienza en una fase inmediatamente anterior o coincidente con el inicio de la expresión de moléculas de cadena ligera por dichas células en una fase determinada de desarrollo en un linfocito B maduro.

[0047] Esto puede conseguirse seleccionando un promotor que sólo sea activo durante dicho período adecuado. Un promotor de este tipo puede ser un promotor CD19, el promotor Ig-α, el promotor Ig-β, el promotor µhc (todos los genes), el promotor Vk o análogos u homólogos de los mismos.

[0048] El promotor, como se ha divulgado anteriormente, puede no impulsar la expresión del gen de interés directamente. En su lugar, impulsa la expresión de un gen cuyo producto activa in trans la expresión del gen de interés. Un gen activador de este tipo puede ser un gen que codifique una denominada recombinasa Cre o proteína similar a Cre. El casete de expresión para el gen de interés, por ejemplo, puede estar provisto de una secuencia que inhiba la expresión del gen de interés. Dicha secuencia puede eliminarse por la acción de la recombinasa Cre, que está bajo el control del promotor deseado (activo durante la fase adecuada del desarrollo). Puede ser necesario un conjunto de casetes de expresión. Por lo tanto, se describe un conjunto de ácidos nucleicos que son casetes de expresión, en donde un ácido nucleico comprende un casete de expresión que codifica una proteína similar a Cre bajo el control de un promotor activo durante la fase deseada del desarrollo de la célula hospedadora y el segundo ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una molécula proteínica deseada bajo el control de un promotor constitutivo que puede activarse por la acción de una proteína similar a Cre. Dicha activación puede conseguirse mediante la eliminación de una secuencia de parada flanqueada por sitios loxP. El sistema Cre/lox se describe en detalle en Rajewskyet al.(1996)J. Clin.Invest.98, págs.

[0049] 600-603. Dichos sistemas se revisan en Wunderlich F. T. (2004), "Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice",Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät der Universität zu Köln; http://deposit.ddb.de/cgibin/dokserv?idn=97557230x&dok_var=d1&dok_ext=pdf&filename=97557230x.pd.

[0050] La invención usa un mamífero murino transgénico al que se le ha proporcionado un casete de expresión descrito en el presente documento, en donde la molécula proteínica deseada es una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada. Un polipéptido preferido es una cadena ligera de estirpe germinal o similar a la estirpe germinal. Uno de los polipéptidos más preferidos es O12, preferentemente la cadena ligera kappa de estirpe germinal reordenada IGKV1-39*0 1/ IGKJ1*01 (nomenclatura de acuerdo con la base de datos IMGT, http://www.imgt.org).

[0051] La región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada se vuelve incapaz de reordenarse y de excluirse de cualquier modificación de secuencia tal como la que opera normalmente en la Ig durante el proceso de maduración de afinidad de linfocitos B. Por lo tanto, la invención puede usar un mamífero murino transgénico al que se le haya proporcionado un casete de expresión, en donde dicho reordenamiento y modificaciones de secuencia se impiden por la ausencia de elementos al menos parcialmente responsables de hipermutación somática tales como, por ejemplo, el potenciador MoEκi.

[0052] Un casete de expresión puede comprender medios para impedir el silenciamiento. En un aspecto, dichos medios para impedir el silenciamiento son medios para la inserción en un locus del genoma de la célula hospedadora que es resistente al silenciamiento. Dichos medios para la inserción son preferentemente medios para recombinación homóloga en dicho sitio resistente al silenciamiento. Un locus preferido cuando el mamífero murino es un ratón es el locus rosa.

[0053] Un casete de expresión preferido adicional comprende en dirección 5'-3': un promotor Vκ, un líder de ratón, un gen V humano, opcionalmente un potenciador MoEκi, una región constante de rata (Cκ) y opcionalmente un potenciador MoEκ3' (truncado).

[0054] Otro casete de expresión preferido adicional comprende en dirección 5'-3': un promotor Vκ, un líder humano, un gen V humano, opcionalmente un potenciador MoEκi, una región constante de rata (Cκ) y opcionalmente un potenciador MoEκ3' (truncado).

[0055] Por supuesto, el objetivo último de la invención es producir anticuerpos para usarse en terapias humanas. Por lo tanto, en el presente documento se describe un método para producir un anticuerpo deseado que comprende exponer un mamífero murino utilizado de acuerdo con la invención a un antígeno de manera que se induzca una respuesta de anticuerpo y aislar los anticuerpos específicos para el antígeno.

[0056] Se describe además un método para producir un anticuerpo deseado que comprende exponer un mamífero murino utilizado de acuerdo con la invención a un antígeno de manera que se induzca una respuesta de anticuerpo y aislar células que produzcan dichos anticuerpos, cultivar y opcionalmente inmortalizar dichas células y recoger dichos anticuerpos.

[0057] Se describe además un método para producir un anticuerpo deseado que comprende exponer un mamífero murino utilizado de acuerdo con la invención a un antígeno de manera que se induzca una respuesta de anticuerpo y aislar un ácido nucleico que codifique al menos parte de dicho anticuerpo de este tipo, insertar dicho ácido nucleico o una copia o un derivado del mismo en un casete de expresión y expresar dicho anticuerpo en una célula hospedadora. Los métodos para producir anticuerpos a partir de ratones transgénicos son conocidos por un experto en la materia. Se prefieren particularmente métodos para la producción de mezclas de anticuerpos a partir de una célula, por lo que los ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos se han derivado de ratones de acuerdo con la invención.

[0058] Los denominados oligoclónicos se divulgan en los documentos WO04106375 y WO05068622.

[0059] La presente invención usa mamíferos murinos transgénicos, preferentemente ratones, capaces de generar anticuerpos híbridos de ratón-humanos específicos y de alta afinidad con regiones variables de cadena ligera (VL) de inmunoglobulina humana en configuración de estirpe germinal o casi y, preferentemente, regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina murina (VH) que puedan haber acumulado mutaciones somáticas durante el proceso de maduración de afinidad impulsada por antígenos. Se prevé que las regiones VH murinas de los anticuerpos híbridos puedan someterse a procedimientos de humanización para producir mAb que tengan inmunogenicidad reducida cuando se apliquen en seres humanos basados en regiones VL de estirpe germinal o casi germinal y regiones VH murinas que se hayan humanizo.

[0060] En particular, se ha demostrado en la presente invención que ratones transgénicos que albergan una construcción de expresión de ADN que codifica una región VL humana reordenada bajo el control de elementos genéticos de acción cis que proporcionan una expresión oportuna y regulada del transgén en una proporción significativa de linfocitos B durante el desarrollo de linfocitos B, pero carecen de elementos que dirijan la maquinaria de hipermutación somática al transgén, son capaces de generar anticuerpos híbridos de ratón-humanos específicos y de alta afinidad con cadenas L esencialmente no mutadas. Se demuestra que el transgén humano reordenado es capaz de emparejarse con una diversidad de cadenas de inmunoglobulina H murinas endógenas para formar inmunoglobulinas híbridas de ratónhumanas expresadas en la superficie de los linfocitos B y facilitar suficientemente el desarrollo de linfocitos B murinos para obtener un compartimento de linfocitos B periférico medible y diverso.

[0061] En una realización preferida, la construcción de expresión transgénica para su uso de acuerdo con la invención alberga las secuencias codificantes de una región V de cadena L reordenada humana bajo el control de un promotor VL humano para dirigir la expresión específica de linfocitos B. Además, la construcción alberga la secuencia del potenciador Ck 3' murino para la expresión específica e inducible de linfocitos B y de alto nivel del transgén. Asimismo, la construcción se diseña para carecer de elementos reguladores que faciliten el reclutamiento de la maquinaria de hipermutación somática al transgén, tal como el potenciador del intrón y el potenciador C-kappa 3'.

[0062] En una realización relacionada, el gen VL humano reordenado para su uso de acuerdo con la invención se inserta en el locus Rosa26 murino por integración específica de sitio. El locus Rosa26 es útil en el contexto del enfoque de "transgénesis dirigida" para la generación eficiente de organismos transgénicos (tales como ratones) con un patrón de expresión transgénica predecible.

[0063] En una realización preferida, la región VL humana reordenada para su uso de acuerdo con la invención se selecciona por su capacidad de emparejarse con al menos dos genes VH murinos diferentes para garantizar la generación de una población de linfocitos B con un repertorio de genes VH diverso. Un método de obtención de dichas regiones VL comprende amplificar un repertorio de genes VH reordenados de los linfocitos B de ratones y un repertorio de regiones VL de la estirpe germinal humana reordenadas de los linfocitos B de seres humanos y clonarlas en vectores de presentación en fagémidos para preparar diversas bibliotecas de inmunoglobulinas híbridas en bacterias. Mediante el análisis de secuencia de nucleótidos de las colecciones de pares VH/VL no seleccionados y seleccionados por antígeno, se identifican genes VL de la estirpe germinal humana que se emparejan con muchos genes VH murinos diferentes. Se describe una colección de genes VL de estirpe germinal humana con esta capacidad.

[0064] Se demuestra que tras la inmunización con antígeno, los linfocitos B son capaces de montar una respuesta inmunitaria, conduciendo a la generación de linfocitos B que secretan anticuerpos híbridos con alta especificidad y afinidad. Las regiones V que codifican estos anticuerpos se caracterizan por la cadena ligera transgénica humana que no alberga ninguna o muy pocas mutaciones y una cadena pesada murina que alberga un número variable de mutaciones introducidas por la maquinaria de hipermutación somática.

[0065] Se contemplan estrategias para obtener anticuerpos monoclonales híbridos de alta afinidad a partir de los ratones transgénicos mediante hibridoma y tecnologías de presentación, así como procedimientos para humanizar las regiones VH murinas con el fin de obtener anticuerpos menos inmunogénicos para su aplicación en seres humanos.

[0066] En una realización, la invención hace uso de una construcción transgénica de cadena L de inmunoglobulina que comprende secuencias de ADN que codifican una región VL de inmunoglobulina humana en combinación con una región constante de cadena ligera (CL) de una proteína de inmunoglobulina animal, secuencias que están unidas operativamente a secuencias reguladoras de la transcripción que, cuando se integran en un mamífero murino transgénico, producen un polipéptido VL-CL de Ig con una región VL humana que no está o está marginalmente sujeta a hipermutación somática. La VL de Ig es capaz de emparejarse con polipéptidos VH-CH reordenados que se generan durante el desarrollo de linfocitos B en el mamífero murino transgénico, conservando dichos polipéptidos VH-CH la capacidad de experimentar hipermutación somática tras la estimulación. La región CL puede ser de cualquier especie animal y generalmente es capaz de emparejarse con las regiones CH del mamífero murino transgénico.

[0067] También se describe el uso de una construcción transgénica como se ha descrito anteriormente para producir un mamífero murino transgénico capaz de la producción de anticuerpos híbridos que consisten en polipéptidos VL-CL y polipéptidos VH-CH en los que la región VL es de origen humano y las CL, VH y CH pueden ser de cualquier especie animal, incluyendo la humana. Tras la inmunización, estos animales transgénicos son capaces de generar anticuerpos de alta afinidad codificados por genes VH hipermutados somáticamente y el gen VL humano reordenado no mutado codificado por el transgén.

[0068] En otro aspecto, se describe un proceso para la producción de un mamífero murino transgénico capaz de la producción de anticuerpos híbridos en respuesta a una exposición antigénica, que comprende alterar funcionalmente el locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógeno e insertar en el genoma animal una construcción transgénica como se describe.

[0069] La invención incluye el uso de un mamífero murino transgénico obtenible mediante este proceso en la producción de linfocitos B que producen inmunoglobulina que tiene cadena ligera VL humana como se define en las reivindicaciones. Se describe un proceso para la producción de linfocitos B que producen inmunoglobulina que tiene VL humana y se une a un antígeno seleccionado, que comprende exponer un mamífero murino obtenible mediante un proceso como el anterior a dicho antígeno y cribar linfocitos B de dicho animal que se unan a dicho antígeno. Se describen además linfocitos B obtenibles mediante este proceso e hibridomas obtenibles inmortalizando dichos linfocitos B, por ejemplo, hibridomas obtenidos por fusión de linfocitos B como anteriormente con células de mieloma. También se describe un proceso para producir anticuerpos monoclonales que comprenden cultivar un hibridoma de este tipo. Se describe además el uso de los linfocitos B anteriores en la producción de un hibridoma o anticuerpo monoclonal correspondiente.

[0070] Se describe adicionalmente un proceso para la producción de inmunoglobulina que tiene cadena VL humana y se une a un antígeno seleccionado, que comprende exponer un mamífero murino obtenible como anteriormente a dicho antígeno y obtener inmunoglobulina a partir del mismo.

[0072] En una estrategia, como etapa individual, en la estirpe germinal de ratón se introduce una región VL reordenada codificada por segmentos génicos V y J de estirpe germinal humana y una región constante de cadena ligera de cualquier especie animal, pero preferentemente una región constante murina. El ADN transgénico puede introducirse en los pronúcleos de ovocitos fecundados o células madre embrionarias. La integración puede ser aleatoria u homóloga dependiendo de la estrategia particular que ha de emplearse. Por ejemplo, el transgén VL puede introducirse mediante inserción aleatoria, dando como resultado ratones que portan una o múltiples copias del transgén en el genoma. Como alternativa, el transgén de VL humano puede dirigirse a un locus genómico específico usando recombinación específica de sitio, como se describe en la técnica.

[0074] En una realización preferida, el transgén VL para su uso de acuerdo con la invención se dirige al locus ROSA26 murino que es un sitio de integración adecuado que permite una expresión fuerte y predecible de los transgenes insertados (documento EP 1439234). El vector de direccionamiento permite la inserción de una única copia de un casete de expresión génica, evitando de este modo la modulación de la expresión transgénica mediante el ordenamiento de múltiples copias. Eligiendo el locus Rosa26 autosómico como sitio de inserción, el patrón de expresión del transgén insertado en el mamífero murino es predecible. Asimismo, se evita la inactivación de X aleatoria y/o la modulación por efectos de posición cromosómica. Esto también elimina la necesidad de generar y analizar múltiples cepas transgénicas para cualquier transgén dado. Por último, el vector Rosa26 para la integración específica de sitio puede usarse para múltiples casetes de expresión génica. Por lo tanto, puede preverse que se inserten en el locus Rosa26 2 o más regiones VL humanas de estirpe germinal reordenadas diferentes para aumentar adicionalmente la diversidad del repertorio de anticuerpos híbridos o humanos.

[0076] En otra realización, una región VL humana reordenada para su uso de acuerdo con la invención puede dirigirse al locus de cadena ligera kappa o lambda de Ig murino para inactivar funcionalmente el locus endógeno o ratones que contengan la región VL humana reordenada pueden criarse con ratones que carezcan de locus de Ig kappa o lambda funcionales o ambos. Por lo tanto, mediante el uso de transformación, usando etapas repetitivas o en combinación con la cría, pueden obtenerse mamíferos murinos transgénicos que son capaces de producir anticuerpos que albergan el transgén de VL humano en ausencia sustancial de cadenas ligeras de inmunoglobulina del hospedador endógenas.

[0077] En una realización, un transgén VL humano para su uso de acuerdo con la invención se selecciona por su capacidad de emparejarse con una porción sustancial de regiones VH murinas para formar un repertorio diverso de anticuerpos híbridos de ratón-humanos funcionales expresados en la superficie de linfocitos B. Por una porción sustancial de regiones VH murinas se quiere decir que la VL humana se empareja al menos con el 0,1 % de las regiones VH murinas generadas durante el desarrollo de los linfocitos B, más preferentemente con al menos el 1 % y mucho más preferentemente con al menos el 10 %. Los métodos para identificar genes VL humanos con esta característica incluyen el emparejamiento aleatorio de un repertorio de regiones VL humanas con un repertorio de regiones VH murinas, la coexpresión de las regiones VH y VL en vectores de expresión eucarióticos o procarióticos adecuados y la selección de regiones VL humanas que se emparejan con una porción sustancial de regiones VH murinas. Pueden usarse vectores fagémidos para dirigir la expresión de fragmentos de anticuerpos de ratón-humanos en células bacterianas o a la superficie de fagos filamentosos y el análisis de la capacidad de unión de los fragmentos de anticuerpos mediante métodos conocidos en la técnica.

[0079] En otra realización, un transgén VL humano para su uso de acuerdo con la invención se selecciona por su capacidad de emparejarse con una porción sustancial de regiones VH humanas para formar un repertorio diverso de anticuerpos humanos expresados en la superficie de linfocitos B. Por una porción sustancial de regiones VH humanas se quiere decir que la VL humana se empareja al menos con el 0,1 % de las regiones VH humanas generadas durante el desarrollo de los linfocitos B, más preferentemente con al menos el 1 % y mucho más preferentemente con al menos el 10 %.

[0081] Los ratones transgénicos de VL humana pueden cruzarse con ratones que alberguen locus de inmunoglobulina de cadena H humanos reordenados o no reordenados funcionales y locus de Ig de cadena H endógenos inactivados funcionalmente, como se describe en la técnica. La inactivación funcional de las dos copias de cada uno de los tres locus de Ig del hospedador (cadena pesada, cadena ligera kappa y lambda), donde el hospedador contiene la IgH humana y el transgén VL humano reordenado permitiría la producción de moléculas de anticuerpos puramente humanas sin la producción de anticuerpos quiméricos hospedadores o humanos hospedadores. Una cepa hospedadora de este tipo, mediante inmunización con antígenos específicos, respondería con la producción de linfocitos B de ratón productoras de anticuerpos humanos específicos, linfocitos B que se fusionan posteriormente con células de mieloma de ratón o se inmortalizan de cualquier otra manera para la producción estable y continua de anticuerpos monoclonales humanos. Como alternativa, dicha población de linfocitos B se usa como fuente de regiones VH que pueden obtenerse construyendo bibliotecas de ADNc o mediante amplificación por PCR usando cebadores para regiones VH humanas como se sabe en la técnica.

[0082] Se reconstruye un gen VL humano reordenado en un microorganismo eucariota o procariota adecuado y los fragmentos de ADN resultantes pueden introducirse en pronúcleos de ovocitos de ratón fecundados o células madre embrionarias. Se han descrito en la técnica diversas construcciones que dirigen la expresión específica de linfocitos B de transgenes VL y tienen el siguiente formato general: una secuencia líder y secuencias en dirección 5' pertinentes para dirigir la expresión específica de linfocitos B del transgén, una secuencia codificante de un transgén de VL humano, una secuencia potenciadora que dirige la expresión específica de linfocitos B y de alto nivel del transgén y un gen de región constante murino. En un formato preferido, el potenciador es el potenciador 3' C-kappa porque dirige la expresión de alto nivel en células de linaje B, pero no recluta hipermutación somática cuando se usa en construcciones transgénicas.

[0084] Se aíslan y se analizan mamíferos murinos, preferentemente ratones, que comprenden una o múltiples copias del transgén en el genoma para su expresión estable. Se seleccionan mamíferos murinos que muestran una expresión estable del transgén durante períodos de tiempo más largos, preferentemente en linfocitos B. Si se requiere, diferentes estirpes murinas que comprenden inserciones independientes de una o múltiples copias del transgén, preferentemente en cromosomas diferentes, se cruzan para obtener mamíferos murinos con diferentes inserciones de una o múltiples copias del transgén para aumentar la expresión del transgén en mamíferos murinos, preferentemente en linfocitos B.

[0085] Se describe adicionalmente una progenie de un mamífero murino transgénico utilizado de acuerdo con la invención, comprendiendo la progenie, al menos en su linaje de linfocitos B, una secuencia codificante de cadena ligera junto con un medio que hace que la secuencia sea resistente a reordenamientos y/o hipermutaciones somáticas del ADN.

[0086] Se describe adicionalmente una progenie de un mamífero murino transgénico utilizado de acuerdo con la invención, comprendiendo la progenie un casete de expresión para la expresión de una molécula proteínica deseada en células durante una determinada fase de desarrollo en células que se desarrollan en linfocitos B maduros.

[0088] Se describe adicionalmente una célula que se aísla de un mamífero murino transgénico utilizada de acuerdo con la invención, comprendiendo la célula una secuencia codificante de cadena ligera junto con un medio que hace que la secuencia sea resistente a reordenamientos y/o hipermutaciones somáticas del ADN. También se describe una célula que se aísla de un mamífero murino transgénico utilizada de acuerdo con la invención, comprendiendo la célula un casete de expresión para la expresión de una molécula proteínica deseada en células durante una determinada fase de desarrollo en células que se desarrollan en linfocitos B maduros. Una célula, preferentemente un linfocito B productor de anticuerpos o una célula que es capaz de diferenciarse o madurar en un linfocito B productor de anticuerpos, puede usarse para la producciónin vitrode anticuerpos, como sabe el experto en la materia, por ejemplo, de Gascanet al.1991.J. Exp.Med.173: 747-750. Los métodos para la inmortalización de una célula descritos en el presente documento son conocidos en la técnica e incluyen la generación de hibridomas, por ejemplo, mediante fusión con una célula de mieloma, la transformación con el virus de Epstein Barr; la expresión del transductor de señales de activación y transcripción (STAT), la activación a través de la señalización de los receptores CD40 e IL4, y/o expresión de Bcl6 (Shvartset al.2002.Genes Dev16: 681-686).

[0090] En una etapa separada, los locus de las cadenas ligeras Kappa y Lambda endógenas de ratón se vuelven esencialmente no funcionales, de manera que al menos la mayoría de los linfocitos B de los ratones transgénicos portan receptores de Ig que contienen la región VL humana transgénica. La inactivación de los locus de inmunoglobulina de ratón endógenos se consigue mediante la disrupción dirigida de los locus adecuados mediante recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Dicha alteración dirigida comprende la alteración de la secuencia genómica de manera que no se produce sustancialmente ninguna cadena ligera Kappa y/o Lambda de inmunoglobulina de ratón endógena funcional. La expresión "sustancialmente ninguna inmunoglobulina de ratón endógena funcional" indica que los locus de cadena ligera Kappa y/o Lambda endógenos están silenciados funcionalmente de manera que el nivel de expresión proteica funcional de los locus de cadena ligera Kappa y/o Lambda endógenos, preferentemente el locus de cadena ligera Kappa endógeno, se reduce a aproximadamente el 20 % del nivel de expresión en un ratón de referencia, más preferentemente a aproximadamente el 10 %, más preferentemente a aproximadamente el 5 %, más preferentemente a aproximadamente el 2 % y más preferentemente a aproximadamente el 1 %. En una realización mucho más preferida, el nivel de expresión proteica funcional de los locus de cadena ligera Kappa y/o Lambda endógenos se reduce al 0 %. El nivel de expresión proteica funcional puede determinarse por medios conocidos por el experto, incluyendo la transferencia Western y el emparejamiento con una cadena pesada de ratón. Dicho ratón de referencia es un ratón en el que los locus de cadena ligera Kappa y/o Lambda endógenos no están alterados. Dicha alteración comprende la mutación y/o deleción de secuencias génicas que son necesarias para la expresión funcional de los genes de inmunoglobulinas endógenos. Como alternativa, dicha alteración comprende la inserción de un ácido nucleico en los locus de cadena ligera Kappa y/o Lambda de inmunoglobulina de ratón endógenos, de manera que se reduce la expresión funcional de los genes de inmunoglobulina endógenos. En un aspecto, dicho ácido nucleico comprende un elemento silenciador que da como resultado el silenciamiento transcripcional del gen de inmunoglobulina endógeno. En otro aspecto, o adicionalmente, dicho ácido nucleico comprende una secuencia que altera el corte y empalme y/o la traducción del gen de inmunoglobulina endógeno, por ejemplo, introduciendo un exón que provoca un desplazamiento de marco en la secuencia codificante, o que comprende un codón de parada prematuro. En cada caso se generan animales quiméricos que derivan en parte de las células madre embrionarias modificadas y son capaces de transmitir las modificaciones genéticas a través de la estirpe germinal. El apareamiento de cepas de ratón con locus de inmunoglobulina humanos con cepas con locus de ratón inactivados produce animales que producen anticuerpos que comprenden esencialmente sólo cadenas ligeras humanas.

[0091] Se prepara una construcción para la recombinación homóloga por medios conocidos en la técnica y se elimina cualquier secuencia no deseable, por ejemplo, secuencias procariotas. Puede emplearse cualquier técnica conveniente para introducir una construcción para la recombinación homóloga en una célula diana. Estas técnicas incluyen la fusión de esferoplastos, la lipofección, la electroporación, la transferencia de ADN mediada por fosfato de calcio o la microinyección directa. Después de la transformación o transfección de las células diana, las células diana se seleccionan por medio de marcadores positivos y/o negativos, por ejemplo, por resistencia a la neomicina y/o al aciclovir y/o al ganciclovir. Las células que muestren el fenotipo deseado podrán analizarse después mediante análisis de restricción, electroforesis, análisis de Southern, PCR o similares. Mediante la identificación de fragmentos que muestren la presencia de la lesión o lesiones en el locus diana, se identifican células en las que se ha producido recombinación homóloga para inactivar una copia del locus diana.

[0092] Asimismo, se demuestra que tras la inmunización, las regiones VH murinas y humanas de los ratones transgénicos mencionados anteriormente, pero no las regiones VL, son capaces de experimentar hipermutaciones somáticas para generar anticuerpos de alta afinidad. Ventajosamente, se prevé que estos anticuerpos codificados por regiones VL de estirpe germinal contribuyan a una menor inmunogenicidad cuando se aplican en seres humanos y den como resultado anticuerpos más estables, que sean menos propensos a la agregación y, por lo tanto, más seguros para su uso terapéutico en seres humanos.

[0093] Todos los mAb derivados del mamífero murino transgénico mencionado anteriormente comparten las mismas regiones VL humanas idénticas. Se ha descrito que los mAb que comparten la misma región VL idéntica pueden coexpresarse en una única célula clonal para la producción de mezclas de anticuerpos recombinantes con sitios de unión funcionales (véanse los documentos WO04106375 y WO05068622). Por lo tanto, el mamífero murino transgénico adecuado para su uso de acuerdo con la invención proporciona una plataforma para la generación de mAb específicos y de alta afinidad que constituyen la base para mezclas de mAb producidas por células clonales.

[0094] Se prefiere que los mAb derivados del mamífero murino transgénico mencionado anteriormente se dirijan contra dianas celulares. Las dianas preferidas son proteínas humanas expresadas en superficie o solubles o moléculas de carbohidrato. Otras dianas preferidas son proteínas expresadas en superficie o moléculas de carbohidrato que se expresan en la superficie de bacterias, virus y otros patógenos, especialmente de seres humanos.

[0095] Más específicamente, las dianas preferidas incluyen citocinas y quimiocinas, incluyendo, pero sin limitación, Interleucina 1beta (IL1beta), IL2, IL4, IL5, IL7, IL8, IL12, IL13, IL15, IL18, IL21, IL23 y quimiocinas tales como, por ejemplo, quimiocinas CXC, quimiocinas CC, C (o y quimiocinas) tales como XCL1 (linfotactina-α) y XCL2 (linfotactina-B), y quimiocinas CX3C. Se incluyen además como dianas preferidas las moléculas receptoras de las citocinas y quimiocinas, incluyendo receptores de citocinas de tipo I tales como, por ejemplo, el receptor de IL-2, receptores de citocinas de tipo II tales como, por ejemplo, receptores de interferón, receptores de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig), familia de receptores del factor de necrosis tumoral, incluyendo los receptores para CD40, CD27 y CD30, receptores de serina/treonina-proteína cinasa, tales como los receptores de TGF beta, receptores acoplados a proteína G, tales como CXCR1-CXCR7, y tirosina cinasa receptoras, tales como miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento de fibroblastos (FGFR), miembros de la familia de receptores del EGF, incluyendo erbB 1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3) y erbB4 (HER4), miembros de la familia de receptores de insulina, incluyendo IGF-R1 e IGF-RII, miembros de la familia de receptores del PDGF, miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento de hepatocitos incluyendo c-Met (HGF-R), miembros de la familia de receptores de Trk, miembros de la familia de receptores de AXL, miembros de la familia de receptores de LTK, miembros de la familia de receptores de TIE, miembros de la familia de receptores de ROR, miembros de la familia de receptores de DDR, miembros de la familia de receptores de KLG, miembros de la familia de receptores de RYK, miembros de la familia de receptores de MuSK y miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR). Otras dianas preferidas son las que se sobreexpresan o se expresan selectivamente en tumores tales como, por ejemplo, VEGF, CD20, CD38, CD33, CEA, EpCAM, PSMA, CD54, Lewis Y, CD52, CD40, CD22, CD51/CD61, CD74, MUC-1, CD38, CD19, CD262 (TRAIL-R2), RANKL, CTLA4 y CD30; dianas que están implicadas en la inflamación crónica tales como, por ejemplo, CD25, CD11a, TNF, CD4, CD80, CD23, CD3, CD14, IFNgamma, CD40L, CD50, CD122, TGFbeta y TGFalfa.

[0096] Las proteínas expresadas en superficie o las moléculas de carbohidrato preferidas que se expresan en la superficie de bacterias, virus y otros patógenos parasitarios, especialmente de seres humanos, incluyen marcadores de superficie de los virus de la gripe A y B tales como la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA), filovirus tales como el virus del Ébola, la rabia, el sarampión, la rubéola, las paperas, flavivirus tales como los tipos 1-4 del virus del Dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del Nilo Occidental, virus de la encefalitis japonesa y virus de la fiebre amarilla, Paramixovirus incluyendo Paramixovirus tales como Parainfluenza 1, 3, Rubulavirus tales como el virus de las paperas y Parainfluenza 2, 4, Morbillivirus y Pneumovirus tales como el virus respiratorio sincitial, vaccinia, viruela, coronavirus, incluyendo el virus del Síndrome Respiratorio Agudo Grave (SARS), el virus de la hepatitis (A, B y C, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus del herpes, incluyendo el citomegalovirus, el virus de Epstein Barr, el virus del herpes simple y virus de la varicela zóster, parvovirus tales como, por ejemplo, B19;Legionella pneumophila;Listeria monocytogenes;Campylobacter jejuni;Staphylococcus aureus;E. coliO157:H7;Borrelia burgdorferi;Helicobacter pylori;Ehrlichia chaffeensis;Clostridium difficile;Vibrio cholera;Salmonella entericaSerotipoTyphimurium;Bartonella henselae;Streptococcus pyogenes(estreptococo del Grupo A);Streptococcus agalactiae(estreptococo del Grupo B);S. aureusresistente a múltiples fármacos (por ejemplo, MRSA);Chlamydia pneumoniae;Clostridium botulinum;Vibrio vulnificus;Parachlamydia pneumonia;Corynebacterium amycolatum;Klebsiella pneumonia; enterococos resistentes al linezolid (E. faecalisyE. faecium); yAcinetobacter baumanniiresistente a múltiples fármacos.

[0097] Son dianas mucho más preferidas la IL-6 y su receptor, IL-6Ralfa, la glicoproteína denominada gp130, RSV, especialmente las proteínas de superficie F, G y SH y las proteínas no estructurales tales como N y M, y tirosina cinasas receptoras, en particular erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3), erbB4 (HER4), IGF-R1 e IGF-RII, c-Met (HGF-R).

[0098] Por lo tanto, el mamífero murino adecuado para su uso de acuerdo con la invención proporciona una plataforma para la generación de mAb específicos y de alta afinidad contra las dianas mencionadas anteriormente que constituyen la base para mezclas de mAb producidas por células clonales. En un aspecto preferido, dichos mAb específicos y de alta afinidad comprenden mAb que se dirigen contra diferentes epítopos en al menos una de las dianas. En una realización preferida adicional, dichos mAb específicos y de alta afinidad comprenden mAb que se dirigen contra diferentes dianas, tales como, por ejemplo, uno o más miembros de la familia de receptores del EGF, incluyendo erbB1 (EGF-R; HER1), erbB2, (HER2), erbB3 (HER3) y erbB4 (HER4).

[0099] A menos que se definan de otro modo, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados comúnmente entendidos por los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular y química de proteínas y oligo o polinucleótidos y de hibridación descritas en el presente documento son las conocidas y utilizadas comúnmente por los expertos en la materia. Se usan técnicas convencionales para ADN recombinante, la síntesis de oligonucleótidos y el cultivo y la transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante o como se realizan comúnmente en la técnica o como se describen en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores pueden realizarse generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrooket al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3.ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica de síntesis y química médica y farmacéutica que se describen en el presente documento son los conocidos y comúnmente utilizados en la técnica. Se usan técnicas convencionales para las síntesis químicas, los análisis químicos, las preparaciones farmacéuticas, la formulación y la administración, y el tratamiento de pacientes.

[0100] Leyendas de las figuras

[0101] Figura 1

[0102] Un mapa topológico de las localizaciones de hibridación de los cebadores de VH específicos de ratón y la posición de los sitios de restricción requeridos que son introducidos por secuencias salientes en el extremo 3' de los cebadores.

[0103] Figura 2

[0104] Etapas de amplificación por PCR (Amplificación, Intermedia e Introducción en el sitio). La ubicación y los nombres de los cebadores de amplificación de VH de ratón (y las mezclas de cebadores) se indican por etapa.

[0105] Figura 3

[0106] Topología del vector MV1043. Este vector se usa para la clonación de fragmentos VH humanos o murinos. 012 (IGKV1-39) se indica como el gen VL. Los productos de este vector en combinación con fagos auxiliares en células deE. colipermiten la generación de fagos que presentan fragmentos Fab en la superficie de las partículas de fagos como producto de fusión a la proteína g3 y la presencia del vector en el fago como contenido genético (ORI F1). Figura 4

[0107] Topología del locus de Ckappa de ratón en dirección 3' de los segmentos J. Se indican tanto los potenciadores como la región Ckappa. La flecha inferior indica la región que se elimina con el fin de silenciar el locus.

[0108] Figura 5

[0109] Topología del locus C-lambda de ratón. Se indican las tres regiones V activas (Igl-V1, V2 y V3) al igual que los segmentos J (Igl-J1, Igl-J2, Igl. J3, Igl-J4 y el pseudosegmento Igl-J3p) y regiones constantes (Igl-C1, Igl-C2, Igl-C3 e Igl-C4). Las regiones que se suprimen con el fin de silenciar el locus se indican mediante marcadores de deleción. Estas deleciones incluyen todos los genes V activos (1, 2 y 3) y el segmento intergénico entre V2 y V3.

[0110] Figura 6

[0111] Topología de la construcción de IGKV1-39/J-Ck con un intrón ubicado en el marco de lectura abierto (ORF) del líder.

[0112] Figura 7

[0113] Topología de la construcción de IGLV2-14/J-Ck con un intrón ubicado en el marco de lectura abierto (ORF) del líder.

[0114] Figura 8

[0115] Topología de la construcción de VkP-IGKV1-39/J-Ck (VkP-012). El promotor se origina a partir del gen IGKV1-39 y se coloca directamente delante de los elementos necesarios para una transcripción y una traducción eficientes. Las secuencias intergénicas (incluidos los potenciadores) derivan de ratones y se obtienen a partir de clones de BAC. La secuencia C-kappa codifica la región constante kappa de rata.

[0116] Figura 9

[0117] Topología de la construcción de VkP-IGLV2-14/J-Ck (VkP-2a2). El promotor se origina a partir del gen IGKV1-39 y se coloca directamente delante de los elementos necesarios para una transcripción y una traducción eficientes. Las secuencias intergénicas (incluidos los potenciadores) derivan de ratones y se obtienen a partir de clones de BAC. La secuencia C-kappa codifica la región constante kappa de rata.

[0118] Figura 10

[0119] La topología de la construcción de VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1 (VkP-O12-del1) es idéntica a la de VkP-IGKV1-39/J-Ck de la figura 9, excepto por que se ha eliminado la región potenciadora del intrón.

[0120] Figura 11

[0121] La topología de la construcción de VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2 VkP-O12-del2) es idéntica a VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1 de la figura 10, excepto por que un gran trozo de la región intergénica entre el gen Ck y el potenciador 3' está suprimido. Además, el potenciador 3' se reduce en tamaño de 809 pb a 125 pb.

[0122] Figura 12

[0123] Visión general de las secuencias utilizadas o a las que se hace referencia en esta solicitud.

[0124] Figura 13

[0125] Generación del alelo Rosa26-IgVk1-39 KI. (A) Dibujo esquemático del vector de direccionamiento pCAGGS-IgVK1-39. (B) Secuencia de nucleótidos del vector de direccionamiento pCAGGS-IgVK1-39. (C) Estrategia de direccionamiento.

[0126] Figura 14

[0127] (A) Análisis por transferencia Southern del ADN genómico de clones de ES (células madre embrionarias, por sus siglas en inglés) que comprenden una inserción del vector de direccionamiento pCAGGS-IgVK1-39. El ADN genómico de 4 clones independientes se digirió con AseI y se sondeó con 5e1 indicando el borde 5' del vector de direccionamiento. Todos los clones comprenden una inserción correcta del vector de direccionamiento en el extremo 5'.

[0128] (B) Análisis por transferencia Southern del ADN genómico de clones de ES que comprenden una inserción del vector de direccionamiento pCAGGS-IgVK1-39. El ADN genómico de 4 clones independientes se digirió con MscI y se sondeó con 3e1 indicando el borde 3' del vector de direccionamiento. Todos los clones comprenden una inserción correcta del vector de direccionamiento en el extremo 3'.

[0129] (C) Análisis por transferencia Southern del ADN genómico de clones de ES que comprenden una inserción del vector de direccionamiento pCAGGS-IgVK1-39. El ADN genómico de 4 clones independientes se digirió con BamHI y se sondeó con una sonda Neo interna indicando el borde 5' del vector de direccionamiento. Todos los clones comprenden una inserción única correcta del vector de direccionamiento.

[0130] Figura 15

[0131] Generación del alelo Rosa26-IgVI2-14 KI. (A) Dibujo esquemático del vector de direccionamiento pCAGGS-IgVL2-14. (B) Secuencia de nucleótidos del vector de direccionamiento pCAGGS-IgVL2-14 que contiene el inserto de expresión de CAGGS basado en la región V lambda de IGLV2-14/J de estirpe germinal reordenada (IGLV2-14/J-Ck). (C) Estrategia de direccionamiento.

[0132] Figura 16

[0133] Perfil de Epibase<®>de los restos 1-107 de IGKV1-39. La subfigura A muestra la fuerza de unión de los alotipos DRB1, mientras que C muestra la fuerza de unión para DRB3/4/5, alotipos DQ y DP. Los valores de la figura representan las constantes de disociación (Kd) y se representan en una escala logarítmica en el intervalo 0,01 µM - 0,1 pM (los ligantes muy fuertes pueden haberse salido del gráfico). Para péptidos de unión media, sólo se proporcionan valores cualitativos, y no se muestran los ligantes débiles ni los nulos. Los valores se trazan sobre el primer resto del péptido en la secuencia diana (el péptido en sí se extiende otros 9 restos). De manera destacada, sólo se muestra el receptor de unión más fuerte para cada péptido: los alotipos de reacción cruzada con menor afinidad no son visibles en este gráfico. El receptor de unión más fuerte se indica con su nombre serotipico. Por último, cualquier péptido filtrado por estirpe germinal aparece con un color más claro en el mapa de epítopos (en este caso, no se encontraron epítopos no propios). La subfigura B muestra la promiscuidad de unión a HLA para cada péptido decamérico (eje Y: el número de alotipos de HLA que reconocen epítopos críticos en cada uno de los péptidos que comienzan en el resto indicado mostrado en el eje X). La promiscuidad se mide como el número de alotipos del total de 47 para los que el péptido es un ligante crítico. Las columnas blancas se refieren a los péptidos propios y las columnas negras (ausentes en este caso) a los péptidos no propios.

[0134] Figura 17

[0135] Mapa de epítopos de IGKV1-39 que muestra la presencia de ligantes peptídicos predichos en la secuencia de IGKV1-39 por serotipo en el formato de 15-mero. Cada 15-mero está numerado como se indica en la parte superior de la figura. La secuencia completa del 15-mero correspondiente se enumera en la Tabla 7. Los recuadros negros indican la presencia de uno o más epítopos críticos propios en el 15-mero para el serotipo enumerado a la izquierda. Los epítopos críticos se definen operativamente como ligantes fuertes o medios de DRB1 y ligantes fuertes de DRB3/4/5 o DP o DQ.

[0136] Figura 18

[0137] Inactivación (KO, por sus siglas en inglés) constitutiva del locus kappa de Ig. (A) Estrategia de direccionamiento. (B) Dibujo esquemático del vector de direccionamiento pIgKappa.

[0138] Figura 19

[0139] KO constitutiva del locus lambda de Ig. (A) Primera etapa de la estrategia de direccionamiento. (B) Segunda etapa de la estrategia de direccionamiento.

[0140] Figura 20

[0141] Dibujo esquemático de los vectores de direccionamiento. (A) pVkP-O12 (VkP-IGKV1-39/J-Ck); (B) pVkP-O12-del1 (VKP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1); (C) pVkP-O12-del2 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2).

[0142] Figura 21

[0143] Estrategias de direccionamiento para la inserción de transgenes en el locus Rosa26 mediante transgénesis dirigida usando RMCE. (A) VkP-O12 (VkP-IGKV1-39/J-Ck); (B) VkP-O12-del1 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1); (C) VkP-O12-del2 (VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2).

[0144] Figura 22

[0145] Topología del vector MV1057. Reemplazando el fragmento de relleno indicado por un fragmento de VH se obtiene un vector de expresión que puede transfectarse a células eucariotas para la producción de anticuerpos IgG1 con cadenas ligeras que contienen un gen VL 012 (IGKV1-39).

[0146] Figura 23

[0147] Falta de expresión de la cadena ligera Vk1 humana transgénica en poblaciones de células no B del bazo.

[0148] Figura 24

[0149] La cadena ligera Vk1 humana transgénica se expresa en todas las poblaciones de linfocitos B del bazo.

[0150] Figura 25

[0151] La cadena ligera Vk1 humana transgénica se expresa en los linfocitos B1 de la cavidad peritoneal.

[0152] Figura 26

[0153] La cadena ligera Vk1 humana transgénica no se expresa en los linfocitos pro y pre-B, sino en las poblaciones inmaduras y recirculantes de linfocitos B de la médula ósea. (A) Activación de células de médula ósea. (B) Histogramas de expresión transgénica con superposición desde un control WT (de tipo silvestre, por sus siglas en inglés).

[0154] Figura 27

[0155] La cadena ligera Vk1 humana transgénica está directamente correlacionada con la cadena ligera endógena y la expresión de IgM en linfocitos B circulantes en sangre.

[0156] Ejemplos.

[0157] Ejemplo 1

[0158] Clones del gen V de cadena ligera humana

[0159] En este ejemplo se describen los fundamentos detrás de la elección de dos genes V- de cadena ligera humanos, un gen del tipo kappa y un gen del tipo lambda, que se usan como prueba de concepto para ratones transgénicos que expresan cadenas ligeras. De Wildtet al.1999 (de Wildtet al.(1999)J. Mol.Biol.285(3):895) analizaron la expresión de cadenas ligeras humanas en linfocitos B positivos para IgG periféricos. Basándose en estos datos, se eligieron IGKV1-39 (012) e IGLV2-14 (2a2) como cadenas ligeras por estar bien representadas en el repertorio de linfocitos B. La secuencia del segmento J de las cadenas ligeras se ha elegido basándose en las secuencias presentadas en GenBank ABA26122 para IGKV1-39 (Rabquer,B.J., Smithson, S.L., Shriner, A.K. y Westerink, M.A.J.) y GenBank AAF20450 para IGLV2-14 (Ignatovich, O., Tomlinson, I.M., Popov, A.V., Bruggemann, M. y Winter, G.J. Mol. Biol.294 (2), 457-465 (1999)).

[0160] Todos los segmentos del marco se convierten en secuencias de aminoácidos de estirpe germinal para proporcionar la menor inmunogenicidad posible en posibles aplicaciones clínicas.

[0161] Ejemplo 2

[0162] Obtención de genes V de cadena pesada de ratón que se emparejan con el segmento génico IGKV1-39 humano para formar sitios de unión a anticuerpos funcionales

[0163] Este ejemplo describe la identificación de genes V de cadena pesada de ratón que son capaces de emparejarse con una única región IGKV1-39/J de estirpe germinal humana reordenada. Se clonó un repertorio de VH de bazo de ratones que se inmunizaron con toxoide tetánico en un vector Fab de presentación en fagos con una única cadena ligera kappa IGKV1-39-C humana y se sometió a un paneo contra el toxoide tetánico. Se analizó la especificidad de unión de los clones obtenidos después de una única ronda de paneo. Los genes VH murinos que codifican fragmentos Fab específicos de toxoide tetánico se sometieron a análisis de secuencias para identificar clones únicos y asignar la utilización de VH, DH y JH.

[0164] Muchos de los protocolos descritos en el presente documento son protocolos convencionales para la construcción de bibliotecas de presentación en fagos y el paneo de fagos para la unión a un antígeno de interés y se describen enAntibody Phage Display: Methods and Protocols(editor(es): Philippa M. O'Brien, Robert Aitken).

[0165] Inmunizaciones

[0166] Ratones BALB/c recibieron una inmunización con toxoide tetánico y se reforzaron después de 6 semanas con toxoide tetánico.

[0167] Aislamiento de esplenocitos

[0168] Preparación de la suspensión de células de bazo. Después de la disección, el bazo se lavó con PBS y se transfirió a una placa de 60 mm con 20 ml de PBS. Se usó una jeringa tapada con 20 ml de PBS y una aguja G20 para lavar abundante y repetidamente el bazo. Después de lavar las células lavadas abundantemente con PBS, las células se pusieron cuidadosamente en suspensión usando 20 ml de PBS y se dejaron en un banco durante 5 minutos para separar los esplenocitos de los desechos y los cúmulos celulares. La suspensión de esplenocitos se transfirió a la parte superior de un tubo lleno de Ficoll-Paque<™>PLUS y se procesó de acuerdo con los procedimientos del fabricante para el aislamiento de linfocitos (Amersham Biosciences).

[0169] Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

[0170] Después del aislamiento y la sedimentación de los linfocitos, las células se suspendieron en reactivo TRIzol LS (Invitrogen) para el aislamiento del ARN total de acuerdo con el protocolo adjunto del fabricante y se sometieron a la reacción de transcripción inversa usando 1 microgramo de ARN, Superscript III RT junto con dT20 de acuerdo con los procedimientos del fabricante (Invitrogen).

[0171] Amplificación por PCR de ADNc

[0172] El ADNc se amplificó en una reacción de PCR usando combinaciones de cebadores que permiten la amplificación de aproximadamente 110 genes V murinos diferentes pertenecientes a 15 familias de VH (tabla 1; RefSeq NG_005838; Thiebeet al., 1999.European Journal of Immunology29: 2072 - 2081). En el primer ciclo, se usaron combinaciones de cebadores que se unen al extremo 5' de los genes V y al extremo 3' de las regiones J. En el segundo ciclo, los productos de PCR que se generaron con el cebador MJH-Rev2 se amplificaron con el fin de introducir modificaciones en la región 3' que permitieran una clonación eficiente de los productos. En la última ronda de amplificación, todos los productos de PCR se amplificaron usando cebadores que introducen un sitio de restricción SfiI en el extremo 5' y un sitio de restricción BstEII en el extremo 3' (véanse las figuras 1 y 2, y la tabla 1).

[0173] Condiciones de reacción para la 1.ª ronda de PCR: 4 reacciones diferentes combinando los 25 cebadores directos (MVH1 a MVH25, tabla 1 y figura 2) y 1 cebador inverso por reacción (MJH-Rev1, MJH-Rev2, MJH-Rev3 o MJH-Rev4; véase la tabla 1 y la figura 2). Los volúmenes de PCR de 50 microlitros se compusieron de 2 microlitros de ADNc (procedentes de reacciones de RT), 10 microlitros de tampón 5* Phusion polimerasa HF, 40 nM de cada uno de los 25 cebadores directos (concentración total de 1 micromolar), cebador inverso 1 micromolar, 1 microlitro de solución madre de dNTP 10 mM, 1,25 unidad de polimerasa Phusion y agua MQ estéril. El programa del termociclador consistió en un programa detouch down: 1 ciclo de 98 °C durante 30 segundos, 30 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 58 °C disminuyendo 0,2 °C por ciclo durante 10 segundos, 72 °C durante 20 segundos y 1 ciclo de 72 °C durante 3 minutos. El programa de PCR de la segunda ronda se estableció sólo para los productos de la 1.ª PCR que contienen el cebador MJH-Rev2: 2 reacciones diferentes que combinan los cebadores ExtMVH-1 o ExtMVH-2 (tabla 1 y figura 2) en combinación con el cebador inverso ExtMJH-Rev2int (tabla 1 y figura 2). Los volúmenes de PCR de 50 microlitros se compusieron de 50 ng de producto de PCR (de la primera ronda de PCR), 10 microlitros de tampón 5* Phusion polimerasa HF, 500 nM de cada cebador directo, cebador inverso 1 micromolar, 1 microlitro de solución madre de dNTP 10 mM, 1,25 unidad de polimerasa Phusion y agua MQ estéril. El programa del termociclador consistió en un programa detouch downseguido de una etapa de amplificación normal: 1 ciclo de 98 °C durante 30 segundos, 10 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 65 °C disminuyendo 1,5 °C por ciclo durante 10 segundos, 72 °C durante 20 segundos, 10 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 10 segundos, 72 °C durante 20 segundos y 1 ciclo de 72 °C durante 3 minutos. El programa de PCR de tercera ronda se configuró como se describe en la figura 2. Los volúmenes de PCR de 50 microlitros se compusieron de 50 ng de producto de PCR (de rondas de PCR anteriores, figura 2), 10 microlitros de tampón 5* Phusion polimerasa HF, cebador directo 1 micromolar (tabla 1 y figura 2), cebador inverso 1 micromolar, 1 microlitro de solución madre de dNTP 10 mM, 1,25 unidad de polimerasa Phusion y agua MQ estéril. El programa consiste en un programa detouch downseguido de una etapa de amplificación normal: 1 ciclo de 98 °C durante 30 segundos, 10 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 65 °C disminuyendo 1,5 °C por ciclo durante 10 segundos, 72 °C durante 20 segundos, 10 ciclos de 98 °C durante 10 segundos, 55 °C durante 10 segundos, 72 °C durante 20 segundos y 1 ciclo de 72 °C durante 3 minutos. Después de las amplificaciones por PCR, todos los productos de PCR se purificaron en gel usando Qiaex II de acuerdo con los protocolos del fabricante.

[0174] Digestiones con enzimas de restricción

[0175] Los productos purificados se digirieron con BstEII y SfiI en dos etapas. En primer lugar, se digirió 1 microgramo de ADN en reacciones de 100 microlitros que consistieron en 10 microlitros de tampón NEB 310* (New England Biolabs), 1 microlitro de 100* BSA, 12,5 unidad de BstEII y agua estéril durante 6 horas a 60 °C en una estufa. Los productos se purificaron usando el kit de purificación por PCR Qiaquick de Qiagen siguiendo las instrucciones del manual y se eluyeron en 40 microlitros de agua. A continuación, todos los productos se volvieron a digerir con SfiI en reacciones de 100 microlitros que consistieron en 10 microlitros de tampón NEB 210* (New England Biolabs), 1 microlitro de 100* BSA, 12,5 unidades de SfiI y agua estéril durante 12 horas a 50 °C en una estufa. Los fragmentos digeridos se purificaron mediante el kit de extracción en gel Qiaquick después de la separación en gel en un gel TBE de agarosa al 1,5 % más bromuro de etidio de 20 cm a 80 V. Se digirieron 100 microgramos del vector aceptor (MV1043, figuras 3 y 12) con 50 unidades Eco91I en 600 microlitros en condiciones convencionales (tampón Tango) y a continuación se purificaron en un gel de agarosa al 0,9 %. Después de una segunda etapa de digestión en las condiciones prescritas con 400 unidades de SfiI en 500 microlitros durante 12 horas, se añadieron 100 unidades de BsrGI durante 3 horas a 50 °C.

[0176] Ligaduras

[0177] Cada producto de PCR se ligó por separado de acuerdo con el siguiente esquema: 70 ng de productos de PCR digeridos, 300 ng de vector aceptor digerido, 100 unidades de Ligasa T4 (NEB), 1* tampón de ligasa en 30 microlitros durante 16 horas a 12 °C. Las reacciones de ligadura se purificaron con extracciones de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico seguidas de precipitaciones de glucógeno (Sigma-Aldrich n.º G1767) de acuerdo con el protocolo del fabricante y por último se disolvieron en 25 microlitros de agua estéril.

[0178] Transformaciones y almacenamiento en biblioteca

[0179] Los productos de ligadura purificados se transformaron mediante electroporación usando 1200 microlitros de bacterias electrocompetentes TG1 (Stratagene n.º 200123) por lote de ligadura y se sembraron en placas de LB carbenicilina que contenían glucosa al 4 %. Las bibliotecas se cosecharon raspando las bacterias en 50 ml de LB carbenicilina. Después de centrifugar a 2000g durante 20 minutos a 4 °C, los sedimentos bacterianos se resuspendieron cuidadosamente en 2 ml de 2*TY/glicerol al 30 % helado en agua helada y se congelaron en hielo seco/etanol antes de almacenarlos a -80 °C.

[0180] Amplificación de bibliotecas

[0181] Las bibliotecas se cultivaron y recogieron de acuerdo con los procedimientos descritos por Krameret al.2003 (Krameret al.2003.Nucleic Acids Res.31(11): e59) usando VCSM13 (Stratagene) como cepa de fago auxiliar.

[0182] Selección de fagos en inmunotubos recubiertos

[0183] Se disolvió toxoide tetánico en PBS en una concentración de 2 µg/ml y se aplicó como recubrimiento en el tubo MaxiSorp Nunc-Immuno Tube (Nunc 444474) durante la noche a 4 °C. Después de desechar la solución de recubrimiento, los tubos se bloquearon con leche desnatada al 2 % (ELK) en PBS (tampón de bloqueo) durante 1 hora a TA. En paralelo, se mezclaron 0,5 ml de la biblioteca de fagos con 1 ml de tampón de bloqueo y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de bloquear los fagos, la solución de fago se añadió a los tubos recubiertos con toxoide tetánico y se incubó durante 2 horas a TA en una plataforma que giraba lentamente para permitir la unión. A continuación, los tubos se lavaron 10 veces con PBS/Tween-20 al 0,05 % seguido de la elución de los fagos mediante una incubación con 1 ml de glicina 50 mM-HCl pH 2,210 min a TA en rueda giratoria y directamente seguido de la neutralización del eluyente recogido con 0,5 ml de Tris 1 M-HCl pH 7,5.

[0184] Recogida de clones de fagos

[0185] Se añadieron 5 ml de cultivo XL1-Blue MRF (Stratagene) a una D.O. 0,4 a la solución de fagos recogidos y se incubaron durante 30 minutos a 37 °C sin agitación para permitir la infección de los fagos. Las bacterias se sembraron en placas de Carbenicilina/Tetraciclina glucosa al 4 % 2*TY y se cultivaron durante la noche a 37 °C.

[0186] Producción de fagos

[0187] Los fagos se cultivaron y se procesaron como se describe en Krameret al.2003 (Krameret al.2003.Nucleic Acids Res.31(11): e59) usando VCSM13 como cepa de fago auxiliar.

[0188] ELISA de fagos

[0189] Se recubrieron placas de ELISA con 100 microlitros de toxoide tetánico por pocillo a una concentración de 2 microgramos/ml en PBS durante la noche a 4 °C. Se usaron como control negativo placas recubiertas con 100 microlitros de tiroglobulina en PBS. Los pocillos se vaciaron y se secaron dando golpecitos en una toalla de papel, se llenaron completamente con PBS-leche desnatada al 4 % (ELK) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente para bloquear los pocillos. Después de desechar la solución de bloqueo, se añadieron minipreparaciones de fagos premezcladas con 50 µl de solución de bloqueo y se incubaron durante 1 hora a TA. Los 5 lavados siguientes con PBS-Tween-20 al 0,05 % eliminaron los fagos no unidos. Los fagos unidos se detectaron incubando los pocillos con 100 microlitros de conjugado de anticuerpo anti-M13-HRP (diluido 1/5000 en tampón de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo libre se eliminó repitiendo las etapas de lavado como se ha descrito anteriormente, seguido de incubación en sustrato TMB hasta que el desarrollo del color fuera visible. La reacción se detuvo añadiendo 100 microlitros de H<2>SO<4>2 M por pocillo y se analizó en un lector de ELISA a 450 nm de longitud de onda de emisión (Tabla 2). Los números más altos indican señales más fuertes y, por lo tanto, una mayor incidencia de la unión específica del complejo fago-Fab.

[0190] Secuenciación

[0191] Los clones que proporcionaron señales al menos 3 veces superiores a la señal de fondo (Tabla 2) se propagaron, se usaron para procedimientos de minipreparación de ADN (véanse los procedimientos del manual Qiagen miniPrep) y se sometieron a un análisis de secuencia de nucleótidos. La secuenciación se realizó de acuerdo con el manual de acompañamiento del kit Big Dye 1.1 (Applied Biosystems) usando un cebador inverso (CH1_Rev1, tabla 1) que reconoce una secuencia 5' de la región CH1 de la cadena pesada de IgG1 humana (presente en el vector de presentación de Fab MV1043, figuras 3 y 12). Las secuencias de VH de ratón de 28 clones de unión al toxoide tetánico se muestran en la Tabla 3. Los resultados muestran que los genes VH murinos seleccionados pertenecen a diferentes familias de genes, y que diferentes miembros individuales de estas familias de genes son capaces de emparejarse con la región VH de IGKV1-39/J humana reordenada para formar sitios de unión de anticuerpos específicos de toxoide tetánico funcionales. A partir de los análisis de secuencias, se concluyó que las regiones VH murinas utilizan una diversidad de segmentos génicos DH y JH.

[0192] Ejemplo 3

[0193] Silenciamiento del locus de cadena ligera kappa de ratón

[0194] Este ejemplo describe el silenciamiento del locus de cadena ligera kappa endógena de ratón. El locus kappa endógeno se modifica por recombinación homóloga en células ES, seguido de la introducción de células ES modificadas genéticamente en embriones de ratón para obtener una descendencia genéticamente adaptada.

[0195] Un vector que comprende una secuencia de nucleótidos ensamblada que consiste en una parte que comprende la región J hasta 338 pb en dirección 3' del segmento génico J5 fusionado a una secuencia que termina a 3' del potenciador CK 3' se usa para la recombinación homóloga en células ES. La secuencia ensamblada se usa para suprimir un fragmento de ADN genómico que abarca desde 3' de la región JK hasta justo 3' del potenciador CK 3'. Como consecuencia de este procedimiento, el gen constante CK, el potenciador 3' y algunas regiones intergénicas se eliminan (véanse las figuras 4 y 18).

[0196] Construcción del vector de direccionamiento

[0197] Se usó un vector que recibió brazos flanqueantes de 4,5-8 kb en los extremos 3' y 5' fusionados al segmento de deleción para recombinación homóloga dirigida en una estirpe celular ES. Ambos brazos se obtuvieron por medios de PCR garantizando la máxima homología. La estrategia de direccionamiento permite la generación de un alelo KO constitutivo. La secuencia genómica de ratón que abarca el potenciador intrónico de Igk, la región constante de Igk y el potenciador Igk 3' se reemplazaron por un casete PuroR, que se flanqueó por sitios F3 y se insertaron en dirección 3' de los elementos Jk. La eliminación mediada por Flp del marcador de selección dio como resultado un alelo KO constitutivo. Es probable que el reemplazo de la región genómica Igk MiEk-Igk C-Igk 3'E (aprox.10 kb) por un casete F3-Puro (aprox.3 kb) disminuyera la eficiencia de la recombinación homóloga. Por lo tanto, los brazos de homología se extendieron en consecuencia y se analizaron más colonias de células ES después de la transfección con el fin de identificar clones recombinantes homólogos.

[0198] Generación de células ES que portan el fragmento kappa suprimido

[0199] La generación de células ES modificadas genéticamente se realizó esencialmente como se describe (Seibleret al. Nucleic Acids Res.15 de febrero de 2003; 31(4):e 12). Véase también el ejemplo 14 para una descripción detallada. Generación de ratones ES por complementación de embriones tetraploides.

[0200] La producción de ratones mediante complementación de embriones tetraploides usando células ES modificadas genéticamente se realizó esencialmente como se describe (Egganet al.,PNAS98, 6209-6214; Seibler J,et al. Nucleic Acids Res.15 de febrero de 2003; 31(4):e12; Hoganet al., (Summary of mouse development. Manipulating the Mouse Embryo, (1994) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), págs.253-289.)).

[0201] Ejemplo 4

[0202] Silenciamiento del locus de cadena ligera lambda de ratón

[0203] Este ejemplo describe el silenciamiento del locus de cadena ligera lambda endógena de ratón. El locus lambda endógeno se modifica mediante recombinación homóloga en células ES, seguida de la introducción de células ES modificadas genéticamente en embriones de ratón para obtener una descendencia genéticamente adaptada.

[0204] Dos regiones del locus lambda murino que juntas contienen todas las regiones V lambda funcionales se someten a deleción.

[0205] La primera región diana para la deleción basada en recombinación homóloga es una región que está ubicada 408 pb en dirección 5' del sitio de inicio del segmento génico IGLV2 y que termina 215 pb en dirección 3' del segmento génico IGLV3, incluyendo el tramo de secuencia intergénica entre estos segmentos génicos IGLV. La segunda región que es objeto de una deleción implica el segmento génico IGLV1 que consiste en un fragmento que abarca desde 392 pb en dirección 5' hasta 171 pb en dirección 3' del segmento génico IGLV1. Como consecuencia de estas dos etapas de deleción, se suprimen todos los segmentos funcionales de genes V-lambda, haciendo que el locus sea funcionalmente inactivo (figuras 5 y 19).

[0206] Construcción de los vectores de direccionamiento

[0207] Se usaron vectores que recibieron brazos flanqueantes de 3-9,6 kb en los extremos 3' y 5' fusionados al segmento de deleción para recombinación homóloga dirigida en una estirpe celular ES. Ambos brazos se obtuvieron por medios de PCR garantizando la máxima homología. En una primera etapa, la secuencia genómica de ratón que abarca las regiones V2-V3 de Igl se reemplazó por un casete PuroR flanqueado por sitios F3, que produce un alelo KO constitutivo después de la eliminación mediada por Flp del marcador de selección (véase la figura 19A). En una segunda etapa, la secuencia genómica de ratón que abarca la región V1 de Igl se reemplazó por un casete Neo en clones de células ES que ya portaban una deleción de las regiones V2-V3 de Igl (véase la figura 19B). El marcador de selección (NeoR) se flanqueó por sitios FRT. Se obtuvo un alelo KO constitutivo después de la eliminación mediada por Flp de los marcadores de selección.

[0208] Generación de células ES que portan el fragmento lambda suprimido

[0209] La generación de células ES modificadas genéticamente se realizó esencialmente como se describe (Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, Heimann C, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kühn R, Schwenk F.Nucleic Acids Res.15 de febrero de 2003; 31(4):e12). Véase también el ejemplo 14 para una descripción detallada. Para demostrar que ambos eventos de direccionamiento se produjeron en el mismo cromosoma, se seleccionaron varios clones dirigidos dobles para la deleciónin vitrocon pCMV C31deltaCpG. Los clones se expandieron bajo presión antibiótica en una capa de alimentación mitóticamente inactivada comprendida por fibroblastos embrionarios de ratón en medio DMEM con alto contenido en glucosa que contenía FCS al un 20 % (PAN) y factor inhibidor de leucemia 1200 u/ml (Millipore ESG 1107). Se electroporaron 1x10<7>células de cada clon con 20 µg de pCMV C31deltaCpG circular a 240 V y 500 µF y se sembraron en cuatro placas de 10 cm cada una.2 3 días después de la electroporación las células se recogieron y se analizaron mediante PCR. Lo cebadores utilizados fueron:

[0210] 2005_5: CCCTTTCCAATCTTTATGGG

[0211] 2005_7: AGGTGGATTGGTGTCTTTTTCTC

[0212] 2005_9: GTCATGTCGGCGACCCTACGCC

[0213] Las reacciones de PCR se realizaron en mezclas que comprendían 5 µl de tampón de PCR 10x (Invitrogen), 2 µl de MgCl<2>(50 mM), 1 µl de dNTPs (10 mM), 1 µl de primer cebador (5 pM), 1 µl de segundo cebador (5 pM), 0,4 µl de Taq (5 U/ul, Invitrogen), 37,6 µl de H<2>O y 2 µl de ADN. El programa utilizado fue 95 °C durante 5'; seguido de 36 ciclos de 95 °C durante 30"; 60 °C durante 30"; 72 °C durante 1'; seguido de 72 °C durante 10'.

[0214] Generación de ratones ES por complementación de embriones tetraploides.

[0215] La producción de ratones mediante complementación de embriones tetraploides usando células ES modificadas genéticamente se realizó esencialmente como se describe (Egganet al.,PNAS98, 6209-6214; Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kühn R, Schwenk F.Nucleic Acids Res. 15 de febrero de 2003; 31(4):e12; Hoganet al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), págs.253-289).

[0216] Ejemplo 5

[0217] Construcción del inserto de expresión de CAGGS basado en un gen IGKV1-39/J-Ck de estirpe germinal humana reordenado (IGKV1-39/J-Ck)

[0218] Este ejemplo describe la construcción de un casete de expresión de CAGGS que incorpora la región IGKV1-39/J de estirpe germinal humana reordenada. Este casete de expresión insertado abarca sitios de clonación, una secuencia Kozak, una secuencia líder que contiene un intrón, un marco de lectura abierto de la región IGKVI-39 reordenada, una región constante CK de rata del alelo a y una secuencia de parada traduccional (IGKV1-39/J-Ck; figura 6). La construcción primaria consiste en secuencias de origen natural y se ha analizado y optimizado mediante la eliminación de elementos de acción cis no deseados, como cajas TATA internas, señales de poli adenilación, sitios chi, sitios de entrada ribosómica, tramos de secuencias ricas en AT o ricas en GC, elementos de secuencia ARE, INS y CRS, secuencias de repetición, estructuras secundarias de ARN, sitios donantes y aceptores de corte y empalme (crípticos) y puntos de bifurcación de corte y empalme (GeneArt GmbH). Además, el uso de codones en las regiones marco de lectura abierto está optimizado para la expresión en ratones. La secuencia del intrón no se ha modificado y, por lo tanto, representa la secuencia idéntica a la parte codificante del intrón líder de IGKV1-39 humano.

[0219] En el extremo 5' del casete de expresión, se introdujo un sitio NotI y en el sitio 3' un sitio NheI. Ambos sitios se usan para clonar en el módulo de expresión de CAGGS. Después del ensamblaje de genes de acuerdo con los métodos utilizados por GeneArt, el inserto se digiere con NotI-NheI y se clona en el módulo de expresión que contiene un promotor CAGGS, una secuencia de detención flanqueada por sitios LoxP ("floxeada"), una secuencia señal de poliadenilación y, en los extremos 5' y 3', secuencias para facilitar la recombinación homóloga en el locus Rosa26 de estirpes celulares ES de ratón. Se amplificaron promotores y/o fragmentos de ADNc mediante PCR, se confirmaron mediante secuenciación y/o se clonaron directamente a partir de los plásmidos suministrados en un vector de intercambio RMCE que contenía las características indicadas. En las figuras 13A y 13B se muestra un dibujo esquemático y la secuencia confirmada del vector de direccionamiento final pCAGGS-IgVK1-39. La estrategia de direccionamiento se representa en la figura 13C.

[0220] Ejemplo 6

[0221] Inserto de expresión de CAGGS basado en la región V lambda de IGLV2-14/J de estirpe germinal reordenada (IGLV2-141J-Ck)

[0222] Este ejemplo describe la secuencia y la inserción de un casete de expresión que incorpora la región V lambda de IGLV2-14/J de estirpe germinal reordenada. Este inserto abarca sitios de clonación, una secuencia Kozak, una secuencia líder que contiene un intrón, un marco de lectura abierto de la región IGLV2-14/J reordenada, una región constante CK de rata del alelo a y una secuencia de parada traduccional (IGLV2-141J-Ck; figura 7). La construcción primaria consiste en secuencias de origen natural y se ha analizado y optimizado mediante la eliminación de elementos de acción cis no deseados, como: cajas TATA internas, señales de poli adenilación, sitios chi, sitios de entrada ribosómica, tramos de secuencias ricas en AT o ricas en GC, elementos de secuencia ARE, INS y CRS, secuencias de repetición, estructuras secundarias de ARN, sitios donantes y aceptores de corte y empalme (crípticos) y puntos de bifurcación de corte y empalme (GeneArt GmbH). Además, el uso de codones en las regiones marco de lectura abierto estaba optimizado para la expresión en ratones. La secuencia del intrón no se ha modificado y, por lo tanto, representa la secuencia idéntica al intrón líder de IGKV1-39 humano.

[0223] En el extremo 5' del casete de expresión, se introdujo un sitio NotI y en el sitio 3' un sitio NheI. Ambos sitios se usan para clonar en el módulo de expresión de CAGGS como se describe por TaconicArtemis. Después del ensamblaje de genes de acuerdo con los métodos utilizados por GeneArt, el inserto se digirió con NotI-NheI y se clonó en el módulo de expresión que contenía un promotor CAGGS, una secuencia de detención flanqueada por sitios LoxP ("floxeada"), una secuencia señal de poliadenilación y, en los extremos 5' y 3', secuencias para facilitar la recombinación homóloga en el locus Rosa26 de estirpes celulares ES de ratón. Para construir el vector de direccionamiento ROSA26 RMCE final, se amplificaron promotor y/o fragmentos de ADNc mediante PCR. Los productos amplificados se confirmaron mediante secuenciación y/o se clonaron directamente a partir de los plásmidos suministrados en un vector de intercambio RMCE que contenía las características indicadas. En las figuras 15A y 15B se muestra un dibujo esquemático y la secuencia confirmada del vector de direccionamiento final pCAGGS-IgVL2-14. La estrategia de direccionamiento se representa en la figura 15C.

[0224] Ejemplo 7

[0225] Expresión de IGKV1-39/J-Ck en estirpes celulares HEK293 (pSELECT-IGKV1-39/J-Ck)

[0226] En este ejemplo se describe un método para verificar que las construcciones IGKV1-39/J-Ck descritas en el ejemplo 5 permiten la expresión y la detección de la cadena L de IGKV1-39/J-Ck en células HEK293. El inserto de IGKV1-39/J (figura 6) se modificó en el extremo 5' cambiando el sitio NotI por un sitio SalI. Este cambio es necesario para clonar el producto en el plásmido de casete de expresión pSELECT-hygro (InvivoGen). El inserto de expresión de CAGGS IGKV1-39/J-Ck y pSELECT-hygro se digirieron con Sall y NheI, se ligaron y se usaron para transformar células XL1-Blue competentes usando técnicas convencionales. Las colonias se recogieron y el ADN se purificó usando columnas Qiagen Midi-prep de acuerdo con los procedimientos del fabricante. El vector de expresión de cadena ligeras (CL) resultante, denominado 0817676_pSELECT_0815426, se usó para transfectar células HEK293 con Fugene6 (Roche) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los sobrenadantes se cribaron para detectar la presencia de cadenas ligeras de IGKVI-39/J-Ck mediante ELISA y transferencia western usando anticuerpos anti-Ck de rata (Beckton Dickinson n.º 550336 y 553871) y protocolos utilizados en la técnica.

[0227] El VH de la IgG anti-toxoide tetánico (TT) MG1494 se clonó en el vector de expresión de IgG MV1056 usando los sitios de restricción SfiI y BatEII. Se verificó la secuencia del clon resultante. Se transfectaron células HEK293T con cinco combinaciones diferentes de vectores, como se muestra en la Tabla 4 (véase el ejemplo 8 para consultar detalles del vector 0817878_pSELECT_0815427). Se recogieron los sobrenadantes y se determinaron las concentraciones de IgG (véase la Tabla 4). No pudo detectarse IgG en los sobrenadantes A y B que sólo contenían cadena ligera como era de esperar (el anticuerpo de detección reconocía la parte Fc de la IgG). La concentración de IgG en los sobrenadantes C y D fue comparable a la del sobrenadante E de control positivo, lo que indica una expresión correcta de las construcciones de cadena ligera.

[0228] La unión a TT se analizó mediante ELISA para comprobar la funcionalidad de los anticuerpos producidos, usando hemoglobina como antígeno de control negativo. En los sobrenadantes A y B que sólo contenían cadena ligera no pudo detectarse ninguna unión específica de TT, como cabía esperar. La unión específica de TT de los sobrenadantes C y D fue al menos tan buena como la del sobrenadante E de control positivo, confirmando la expresión correcta de las construcciones de cadena ligera y el ensamblaje funcional con la cadena pesada. Los anticuerpos se detectaron no sólo usando un anticuerpo secundario IgG antihumano, sino también un anticuerpo secundario anti-cadena ligera Ckappa de rata. Los resultados confirman que el anticuerpo anti-Ckappa de rata (BD Pharmingen n.º 553871, clon MRK-1) reconoce la cadena ligera expresada por los vectores pSELECT.

[0229] Los sobrenadantes se analizaron mediante SDS-PAGE no reductor y transferencia Western (no se muestra). La detección usando un anticuerpo anti-cadena pesada de IgG humana no mostró bandas para los sobrenadantes A y B que contenían cadena ligera solamente, como cabía esperar. Los resultados para los sobrenadantes C y D fueron comparables a los del sobrenadante E de control positivo, con una banda cercana al marcador de 170 kD, como se espera para la IgG intacta. Se observaron adicionalmente bandas de menor peso molecular en los sobrenadantes C, D y E, que podrían representar productos de degradación, fragmentos de IgG resultantes de la reducción (parcial) y/o bandas de proteínas irrelevantes debidas a la unión no específica del anticuerpo de detección.

[0230] La detección usando un anticuerpo anti-cadena ligera Ckappa de rata mostró una banda próxima al marcador de 26 kD para los sobrenadantes A y B, como cabía esperar sólo para la cadena ligera. Esta banda era mucho más intensa para A que para B, lo que indica que la cadena ligera IGKV1-39 libre puede expresarse mejor y/o ser más estable que la cadena ligera IGLV2-14 libre. No se detectaron bandas en el sobrenadante de control E, como cabía esperar, puesto que la IgG expresada contiene una cadena ligera Ckappa humana. Para los sobrenadantes C y D, se observaron las bandas esperadas cercanas al marcador de 170 kD; también se observaron bandas de menor peso molecular, pero en menor medida que en el caso anterior usando el anticuerpo IgG anti-humano.

[0231] En conclusión, la transfección de las construcciones de expresión de cadena ligera combinadas con la cadena pesada de IgG anti-toxoide tetánico (TT) MG 1494 dio como resultado una producción de IgG comparable a la de la construcción de control positivo para las construcciones de cadena ligera tanto kappa como lambda pSELECT. Ambas producciones de IgG produjeron señales de ELISA en un ELISA TT mejores o comparables a las de la IgG de control. Los análisis por SDS-PAGE y transferencia Western confirmaron la presencia de IgG intacta. El anticuerpo antiCkappa de rata sometido a ensayo funcionó eficientemente tanto en ELISA como en transferencia Western. El sobrenadante de cultivo de células transfectadas únicamente con construcciones de cadena ligera no dio como resultado una producción detectable de IgG ni una unión detectable específica de TT, mientras que la cadena ligera libre se detectó en transferencia Western.

[0232] Ejemplo 8

[0233] Expresión de IGLV2-14/J-Ck en estirpes celulares HEK293 (pSELECT-IGLV2-14/J-Ck)

[0234] En este ejemplo se describe un método para verificar que las construcciones IGLV2-14/J descritas en el ejemplo 6 permiten la expresión y la detección de la cadena L de IGLV2-14/J-Ck en células HEK293. El inserto de IGLV2-14/J-Ck (figura 7) se modificó en el extremo 5' cambiando el sitio NotI por un sitio SalI. Este cambio es necesario para clonar el producto en el plásmido de casete de expresión pSELECT-hygro (InvivoGen). El inserto de expresión de CAGGS IGLV2-14/J-Ck y pSELECT-hygro se digirieron con SalI y NheI, se ligaron y se usaron para transformar células XL1-Blue competentes usando técnicas convencionales. Las colonias se recogieron y el ADN se purificó usando columnas Qiagen Midi-prep de acuerdo con los procedimientos del fabricante. El vector de expresión de cadena ligeras (CL) resultante, denominado 0817678_pSELECT_0815427, se usó para transfectar células HEK293 con Fugene6 (Roche) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Los sobrenadantes se cribaron para detectar la presencia de cadenas ligeras de IGLV2-14/J-Ck mediante ELISA y transferencia western usando anticuerpos anti-Ck de rata (Becton Dickinson n.º 550336 y 553871) y protocolos utilizados en la técnica. Véase el ejemplo 7 para consultar detalles y resultados.

[0235] Ejemplo 9

[0236] Construcción de una construcción de expresión impulsada por el promotor VK que contenía un inserto de IGKV1-39/J y múltiples elementos potenciadores derivados del locus CK murino (VkP-IGKV1-39/J-Ck; VkP-O12)

[0237] Este ejemplo describe la construcción de un casete de expresión que contiene elementos pertinentes para permitir la expresión específica de linfocitos B y de fase de desarrollo/diferenciación de la región VK de IGKV1-39 humana reordenada, basándose en la región promotora VK de IGKV1-39, líder que contiene un intrón, gen V de estirpe germinal, CDR3, segmento IGKJ, región intergénica de ratón ubicada entre Jk y CK, alelo Ck de rata un marco de lectura abierto, y un fragmento intergénico de ratón desde el extremo 3' del gen CK de ratón que termina justo en 3' del potenciador CK 3'.

[0238] Se usaron marcos de lectura abiertos optimizados del líder, gen reordenado IGKV1-39 y gen de alelo a de CK de rata, como se describe en el ejemplo 5, para la construcción del casete de expresión. La región promotora VK se obtuvo mediante procedimientos de síntesis génica (GeneArt, GmbH) y es casi idéntica a la secuencia de la región IGKV1-39 humana entre -500 pb y el ATG (sitio de inicio) del gen. La única desviación de la secuencia natural es la introducción de una secuencia Kozak GCCACCATGG en el sitio ATG (inicio) con el fin de promover la traducción. Se usa un fragmento genómico de un clon BAC de ratón (TaconicArtemis) como base para la introducción de elementos individuales. Este fragmento es idéntico a la secuencia del locus VK de ratón empezando por el sitio donante del intrón ubicado directamente en 3' de la región JK5 y terminando justo en 3' del potenciador CK 3' y cubre aproximadamente 12,5 kb.

[0239] La construcción final contiene desde el extremo 5' al 3' los siguientes elementos: promotor genómico humano IGKV1-39 (500 pb), una secuencia Kozak, un líder de IGKV1-39 humano parte 1 (optimizado), un intrón líder de IGKV1-39 humano, un líder de IGKV1-39 humano parte 2 (optimizado), un gen de estirpe germinal de IGKV1-39 humano (optimizado), una región J humana (optimizada), una región intergénica de ratón que incluye el elemento potenciador del intrón, una región constante kappa de rata (Rattus norvegicus) (optimizada) y una región intergénica de ratón que incluye el potenciador kappa 3'. Los elementos de este casete de expresión se muestran en la Figura 8 y se denominan VkP-IGKV1-39/J-Ck (VkP-O12). En las figuras 20A y 21A se muestra un esquema del vector pVkP-O12 y de la estrategia de direccionamiento. El vector se introdujo en células ES siguiendo procedimientos convencionales (véase el ejemplo 14).

[0240] Ejemplo 10

[0241] Construcción de una construcción de expresión dirigida por el promotor VK que contiene un clon IGLV2-14/J y múltiples elementos potenciadores derivados del locus CK (VkP-IGLVL2-14/J-Ck; VkP.2a2).

[0242] Este ejemplo describe la misma construcción que se describe en el ejemplo 9, excepto por que el gen IGKV1-39 y la región J se reemplazan por el gen optimizado de la estirpe germinal humana IGLV2-14 que incluye una región V-J única (VkP-IGLV2-141J-Ck; VkP-2a2; figura 9).

[0243] Ejemplo 11

[0244] Construcción de una construcción de expresión impulsada por el promotor VK que contiene un clon IGKV1-39 que carece del elemento potenciador del intrón CK (VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1; VkP-O12-del1)

[0245] La construcción descrita en el ejemplo 9 se modificó eliminando el elemento potenciador del intrón CK, ubicado en la región intergénica entre la región J humana y la región CK de rata mediante metodologías convencionales de modificación por PCR y clonación de ADN (GeneArt, GmBH). El casete de expresión resultante se muestra en la Figura 10 y se denomina VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ1 (VkP-O12-del1).

[0246] En las figuras 20B y 21B se muestra un esquema del vector pVkP-O12-del1 y de la estrategia de direccionamiento. El vector se introdujo en células ES siguiendo procedimientos convencionales (véase el ejemplo 14).

[0247] Ejemplo 12

[0248] Construcción de una construcción de expresión impulsada por el promotor VK que contiene un clon IGKV1-39 que carece del elemento potenciador del intrón CK y un elemento potenciador CK 3' truncado (VKP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2; VkP-O12-del2)

[0249] La construcción descrita en el ejemplo 11 se modificó truncando el elemento potenciador CK 3' y suprimiendo parte de la región intergénica 3' del gen Ck de rata, para eliminar posibles elementos inhibidores. Esto se consiguió eliminando la secuencia intergénica entre un sitio EcoRV (ubicado 3' del gen Ck de rata) y el sitio NcoI presente en el potenciador 3' (5993 pb) y eliminando además la secuencia entre el sitio BstXI del potenciador 3' y el sitio BatXI 3' del potenciador 3' (474 pb) usando métodos convencionales. El casete de expresión resultante se muestra en la Figura 11 y se denomina VkP-IGKV1-39/J-Ck-Δ2 (VkP-O12-del2).

[0250] En las figuras 20C y 21C se muestra un esquema del vector pVkP-O12-del2 y de la estrategia de direccionamiento. El vector se introdujo en células ES siguiendo procedimientos convencionales (véase el ejemplo 14).

[0251] Ejemplo 13

[0252] Expresión de construcciones de Vk en estirpes celulares

[0253] Se somete a ensayo la capacidad de las construcciones descritas en el ejemplo 9-12 para producir proteínas de cadena ligera en las estirpes celulares de mieloma MPC11 (ATCC CCL167), linfoma de linfocitos B WEHI231 (ATCC CRL-1702), el linfoma de linfocitos T EL4 (ATCC TIB-39) y en HEK293 (ATCC CRL1573). Los elementos potenciadores y promotores en la construcción permiten la expresión en las estirpes de linfocitos B, pero no en estirpes celulares derivadas de otros tejidos. Después de la transfección de las estirpes celulares usando ADN lineal purificado y Fugene6 (Roche) las células se cultivan para su expresión transitoria. Las células y el sobrenadante se recogen y se someten a un análisis por SDS-PAGE seguido de transferencia Western usando un anticuerpo anti-C-kappa de rata específico. Los sobrenadantes se analizan en ELISA para cadenas L secretadas usando el anticuerpo anti-CK de rata (Beckton Dickinson n.º 550336).

[0254] Ejemplo 14

[0255] Generación de estirpes ES transgénicas

[0256] Todas las construcciones como se describen en los ejemplos 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 y 12 se usaron para generar estirpes ES transgénicas estables individuales por medio de recombinación homóloga. Los métodos de generación de estirpes ES transgénicas mediante recombinación homóloga son conocidos en el campo (por ejemplo, Egganet al.,PNAS98, 6209-6214; Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rode A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kühn R, Schwenk F.Nucleic Acids Res. 15 de febrero de 2003; 31(4):e12; Hoganet al.(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY.), págs.253-289).

[0257] Para todas las construcciones descritas en los ejemplos 5-6, y en los ejemplos 9-12, la estirpe celular ES RMCE (derivada de la cepa de ratón 129S6B6F1-Gt(ROSA)26Sortm10Arte) se cultivó en una capa de alimentación mitóticamente inactivada comprendida por fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en medio DMEM con alto contenido en glucosa que contenía FBS al 15 % (PAN 1302-P220821). Se añadió al medio Factor Inhibidor de Leucemia (Chemicon ESG 1107) a una concentración de 900 U/ml. Para la manipulación, se colocaron 2x10<5>células ES en placas de 3,5 cm en 2 ml de medio. Directamente antes de la transfección, se añadieron 2 ml de medio fresco a las células. Se mezclaron 3 ul de reactivo Fugene6 (Roche; N.º de catálogo 1814443) con 100 ul de medio sin suero (OptiMEM I con Glutamax I; Invitrogen; N.º de catálogo 51985-035) y se incubaron durante 5 min. Se añadieron 100 ul de la solución Fugene/OptiMEM a 2 ug de vector circular y 2 ug de CAGGS-Flp y se incubaron durante 20 min. Este complejo de transfección se añadió gota a gota a las células y se mezcló. Al día siguiente se añadió medio fresco a las células. A partir del día 2, el medio se reemplazó diariamente por otro que contenía G418250 ug/ml (Geneticin; Invitrogen; N.º de catálogo 10131-019). Siete días después de la transfección, los clones individuales se aislaron, se expandieron y se analizaron molecularmente mediante transferencia Southern de acuerdo con los procedimientos convencionales.

[0258] Para cada construcción, el análisis de múltiples clones mediante digestión con enzimas de restricción del ADN genómico de clones individuales seguida de hibridación con sondas 5', sondas 3' y sondas internas dio como resultado clones que comprendían una inserción única correcta en la posición correcta en el locus Rosa26. En la figura 14 se proporciona un ejemplo.

[0259] Ejemplo 15

[0260] Generación de cepas de ratones transgénicos

[0261] Todas las estirpes de células ES que se generaron y se verificaron para determinar sus modificaciones como se describe en el ejemplo 14 se usaron para generar ratones transgénicos estables por medio de recombinación tetraploide. Los métodos se conocen en el campo. En general, después de la administración de hormonas, hembras Balb/c superovuladas se aparearon con machos Balb/c. Los blastocistos se aislaron del útero en el dpc 3,5. Para la microinyección, se colocaron blastocistos en una gota de DMEM con FCS al 15 % bajo aceite mineral. Se usó una pipeta de microinyección con punta plana y accionamiento piezoeléctrico con un diámetro interno de 12-15 micrómetros para inyectar 10-15 células ES C57BL/6 N.tac en cada blastocisto. Después de la recuperación, los blastocistos inyectados se transfirieron a cada cuerno uterino de hembras NMRI pseudopreñadas 2,5 días post coito. El quimerismo se midió en las quimeras (G0) por la contribución del color del pelaje de las células ES al hospedador Balb/c (blanco/negro). Se cruzaron ratones altamente quiméricos con hembras de la cepa C57BL/6. Dependiendo de las necesidades del proyecto, las parejas de apareamiento C57BL/6 son no mutantes (W) o mutantes para la presencia de un gen recombinasa (Flp-Deleter o Cre-deleter o CreER inducible deleter o combinación de Flp-deleter/CreER). La transmisión germinal se identificó por la presencia de descendencia (G1) de color negro, cepa C57BL/6.

[0262] Por ejemplo, Se inyectó el clon de ESC IgVK1-3926838 (véanse los ejemplos 5 y 14) en un total de 62 blastocistos en 3 experimentos independientes. Se obtuvieron 3 camadas con un total de 6 crías. Todas las crías eran quiméricas. Se obtuvieron 3 crías descendientes heterocigotas que se usaron para cruces posteriores.

[0263] Se inyectó el clon de ESC Kappa 2692 A-C10 (véanse los ejemplos 3 y 14) en un total de 54 blastocistos en 3 experimentos independientes. Se obtuvieron 3 camadas con un total de 11 crías, de las cuales 10 eran quiméricas. Se obtuvieron 8 crías descendientes heterocigotas que se usaron para cruces posteriores.

[0264] Se inyectó el clon de ESC Kappa 2692 B-C1 (véanse los ejemplos 3 y 14) en un total de 51 blastocistos en 3 experimentos independientes. Se obtuvieron 2 camadas con un total de 6 crías, de las cuales 4 eran quiméricas. Se obtuvieron 3 crías descendientes heterocigotas que se usaron para cruces posteriores.

[0265] Ejemplo 16

[0266] Reproducción

[0267] En este ejemplo se describe la reproducción para obtener ratones que contienen casetes de expresión transgénica como se describe en el ejemplo 14 y ratones con inactivación en los que se han silenciado los locus lambda y kappa endógenos. La localización de V-lambda en el cromosoma 16 y de CD19 en el cromosoma 7 permite procedimientos de reproducción convencionales. La reproducción del locus Vk co-localizado y el locus Rosa26 en el cromosoma 6 con una distancia de aproximadamente 24 cM requiere una atención especial durante el cribado, ya que sólo un porcentaje de la descendencia muestra cruzamiento de manera que ambas modificaciones se reúnen en un cromosoma.

[0268] Los cuatro locus tienen que combinarse en una única cepa de ratón que sea homocigota o heterocigota para CD19-cre (no descrito) y el transgén Rosa26 modificado y homocigota para los otros locus. La reproducción se realiza mediante técnicas convencionales de reproducción y selección, según proceda, ofrecidas por empresas comerciales de reproducción (por ejemplo, TaconicArtemis).

[0269] Ejemplo 17

[0270] Inmunizaciones de los ratones

[0271] La inmunización primaria y de refuerzo de los ratones se realiza usando protocolos convencionales.

[0272] Para validar la expresión transgénica de cadenas ligeras V<K>012 humana (IGKV1-39) - C<K>de rata reordenadas (véase el ejemplo 5, 14-16) en linfocitos B de ratones CD19-HuVκ1 y evaluar su repercusión en el tamaño del repertorio de VH, la diversidad del uso de la familia VH y la recombinación V(D)J después de la inmunización, los ratones transgénicos CD19-HuVκ1 se inmunizan con la vacuna de toxina tetánica (vacuna TT) y se compara la diversidad de secuencias VH de clones escogidos aleatoriamente de ratones CD18-HuVκ1 con ratones wt inmunizados con TT y con compañeros de camada negativos para CD19-Cre HuVk1. Se obtienen datos sobre la frecuencia de SHM del transgén humano Vκ 012 en los ratones inmunizados. Se recupera una colección diversa de al menos 40 mAb específicos de TT, sin relación clonal, que contienen el Vκ 012 humano, a partir de ratones CD19-HuVx1 mediante presentación en fagos.

[0273] Para ello, tres ratones adultos CD19-HuVκ1 se vacunan con la vacuna TT usando procedimientos de inmunización convencionales. Después de la inmunización, los títulos séricos se miden usando ELISA específico de TT (TT: Statens Serum Institute, N.º de Art.2674) y suspensiones de bazo sometidas a clasificación celular mediante el procedimiento de FACS después de la tinción con un anticuerpo monoclonal específico de Cκ de rata para aislar linfocitos B transgénicos (clon RG7/9.1; BD Pharmingen n.º 553901), Lote n.º 06548). Se extrae ARN de linfocitos B positivos para Cx de rata y el material de ADNc resultante se usa para la construcción de bibliotecas y el análisis de SHM.

[0274] El anticuerpo de ratón anti-Cκ de rata monoclonal patrón (clon RG7/9.1; BD Pharmingen n.º 553901), Lote n.º 06548) se usa en el análisis por FACS de linfocitos B que expresan transgenes (Meyeret al., 1996,Int. Immunol., 8: 1561). El anticuerpo RG7/9.1 clon reacciona con un determinante monotípico (común) de cadena kappa. Este anticuerpo anti-Cκ de rata (clon RG719.1 (BD Pharmingen n.º 553901, Lote n.º 06548) se marca con R-ficoeritrina (PE) usando el kit de conjugación rápida LYNX de acuerdo con las instrucciones del fabricante para el análisis y la clasificación por FACS. El anticuerpo marcado se somete a ensayo primero mediante citometría de flujo para la unión a proteínas de cadena ligera funcionales que contienen Cκ de rata producidas en células HEK-293T transfectadas transitoriamente; el anticuerpo no conjugado sirve como control positivo. Se someten a ensayo otros dos anticuerpos que han demostrado unirse a Cκ de rata mediante ELISA y transferencia Western (véase el ejemplo 7) también mediante citometría de flujo.

[0275] La construcción de la biblioteca de Fab-presentación en fagos se realiza con un conjunto de cebadores de PCR degenerados optimizados diseñados para amplificar los genes VH de C57BL/6; el tamaño mínimo de la biblioteca es de 10<6>clones y la frecuencia mínima de inserción es del 80 %. El vector utilizado, MV1043 (figuras 3 y 12), contiene el Vκ 012 humano fusionado a una región Cx humana. Por lo tanto, la Cκ de rata se intercambia por el homólogo humano en el proceso de generación de bibliotecas.

[0276] Antes de la selección, se realiza la secuenciación de VH de 96 clones escogidos aleatoriamente para validar la diversidad del repertorio de VH que se compara con la diversidad obtenida de una biblioteca no seleccionada generada previamente usando los mismos procedimientos a partir de ratones BALB/c inmunizados con TT. Una biblioteca de ratones C57Bl/6 wt inmunizados de la misma manera permite comparar la diversidad entre dos bibliotecas preseleccionadas que comparten la misma vacuna y el mismo fondo genético.

[0277] Se realizan varias selecciones independientes en TT aplicados como recubrimiento en inmunotubos. Las variables que pueden incluirse son selecciones que usan antígenos biotinilados en solución o selecciones en TT capturados. Basándose en el número y la diversidad de los clones positivos para ELISA obtenidos en las primeras selecciones, se toman decisiones sobre rondas de selección adicionales. Los clones se consideran positivos cuando son > 3x positivos con respecto a un clon de control negativo. Los clones positivos se analizan mediante ELISA frente a un panel de antígenos de control negativo para verificar la especificidad del antígeno. El objetivo es identificar al menos 40 regiones VH únicas, a partir de secuencias de CDR3 únicas y reordenamientos de V<H>DJ<H>.

[0278] La amplificación del material de ADNc de linfocitos B clasificados positivos para Cκ de rata se realiza con un cebador directo de PCR específico para la secuencia líder humana y un cebador inverso de PCR específico para la secuencia de Cκ de rata, en una región no redundante con la secuencia de Cx de ratón, como se publica en un estudio reciente (Bradyet al., 2006,JIM, 315: 61). Las combinaciones de cebadores y las temperaturas de hibridación se someten a ensayo primero con ADNc procedente de células HEK-293T transfectadas con 0817676_pSELECT_0815426 = vector pSELECT con casete de ADN IGKV1-39 (véase el ejemplo 7).

[0279] Los productos de amplificación se clonan en el vector pJET-1 y después de la transformación con XL1-blue, se secuencian 96 colonias para evaluar la frecuencia de SHM de VL por comparación directa con la secuencia de la estirpe germinal de Vκ 012 (IGKV1-39). El método de la relación R/S, como se describe en el estudio de los presentes inventores sobre anticuerpos específicos de TT humanos (de Kruifet al., 2009,J. Mol. Biol., 387: 548) permite discriminar entre mutaciones aleatorias y mutaciones inducidas por antígenos que se produjeron en secuencias de VL.

[0280] Ejemplo 18

[0281] Análisis inmunofluorescente de poblaciones de linfocitos B en estirpes de ratones transgénicos.

[0282] Este ejemplo describe el uso de anticuerpos y citometría de flujo para analizar poblaciones de linfocitos B en órganos linfoides primarios (médula ósea) y secundarios (bazo, peritoneo) y en sangre. Los métodos y reactivos se describen en Middendorpet al.(2002)J. Immunol.168:2695 y Middendorpet al.(2004)J. Immunol.172:1371. Para el análisis del desarrollo temprano de linfocitos B en la médula ósea, las células se tiñeron en superficie con combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) específicos para B220, CD19, CD25, IgM, IgD, Ckappa de ratón, Clambda de ratón y Ckappa de rata para detectar células pro-B, linfocitos pre-B, linfocitos pre-B grandes, linfocitos B inmaduros tempranos y tardíos y poblaciones de linfocitos B recirculantes que expresan el transgén en su superficie. Se incluyó la tinción DAPI (Invitrogen) para excluir las células muertas del análisis y el bloqueo por FC (Becton Dickinson) para inhibir la interacción del anticuerpo con los receptores de Fc de las células mieloides. Para el análisis de la expresión transgénica de superficie en poblaciones de linfocitos B en órganos linfoides periféricos y sangre, las células se tiñeron con combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) específicos para B220, CD5, CD19, CD21, CD23, IgM, IgD, Ckappa de ratón, Clambda de ratón y Ckappa de rata. Se incluyó la tinción DAPI para excluir las células muertas del análisis y el bloqueo por FC para inhibir la interacción del anticuerpo con los receptores de Fc de las células mieloides. Además, se incluyeron combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) específicos para CD3, CD4, CD11b, CD11c y NK1.1 para determinar si la expresión transgénica se producía en tipos celulares fuera del compartimento de linfocitos B.

[0284] Se analizaron tres ratones heterocigotos para el transgén humano IGKV1-39/Ckappa de rat y heterocigotos para el transgén CD19-Cre sobre un fondo C57BL6 (HuVk1/CD19-Cre). Como controles para el análisis por FACS, se incluyeron tres ratones de camada de tipo silvestre para el transgén humano IGKV1-39/Ckappa de rata y heterocigotos para el transgén CD19-Cre en un fondo C57BL6 (CD19-Cre) y dos ratones C57BL6/NTac (Wt). A todos los animales se les permitió aclimatarse en el animalario durante 1 semana antes del análisis y todos los ratones eran machos y tenían 6 semanas de edad. Se aislaron linfocitos de los fémures, bazos, cavidad peritoneal y sangre de los ratones mediante técnicas convencionales como se describió anteriormente (Middendorpet al.(2002)J. Immunol.168:2695 y Middendorpet al.(2004)J. Immunol.172:1371). Los anticuerpos se pre-combinaron como se indica en la Tabla 10 y la tinción se realizó en placas de 96 pocillos. La incubación con el anticuerpo anti-C kappa de rata conjugado con PE (como se ha descrito anteriormente) se realizó antes de la tinción con los anticuerpos de rata anti-murinos para evitar uniones inespecíficas. Una vez finalizada la tinción celular, las células marcadas se analizaron en una máquina FACS LSR II de Becton Dickinson y los datos obtenidos se analizaron con el software FlowJo (v6.4.7).

[0286] Los ratones transgénicos tenían un peso, un aspecto y una actividad similares a los de ratones de tipo silvestre. No se observaron alteraciones anatómicas macroscópicas durante la recogida de tejidos. No se observaron diferencias en el número de linfocitos B en la médula ósea (MO) y el bazo (Tabla 11) ni en el número de linfocitos B, linfocitos T y células mieloides en órganos periféricos entre ratones transgénicos y de tipo silvestre. Además, la frecuencia o proporción de las células en las diferentes vías de desarrollo de los linfocitos no se alteró en los ratones transgénicos en comparación con los ratones de tipo silvestre. Por lo tanto, en los ratones doblemente transgénicos (HuVk1/CD19-Cre) y transgénicos (CD19-Cre), el desarrollo linfoide y, lo que es más importante, el de los linfocitos B, fue indistinguible del de los ratones de tipo silvestre.

[0288] En los órganos linfoides periféricos, la tinción con el anticuerpo específico de transgén (anti-Ckappa de rata-PE) sólo se observó en las poblaciones de linfocitos B. Las poblaciones de linfocitos T, células mieloides y linfocitos NK fueron todas negativas para la expresión en superficie del transgén en el bazo (Figura 23). Por el contrario, en células teñidas con los marcadores de linfocitos pan B B220 y CD19 todas las células se desplazaron hacia la derecha en el gráfico de FACS indicando la expresión del transgén en la superficie celular (Figura 24). Se midió una tinción específica de transgén similar en los linfocitos B1 CD5<+>del peritoneo, una población de linfocitos B diferenciada por su desarrollo (Figura 25).

[0290] La diferenciación de los linfocitos B de precursores multilinaje a linfocitos B maduros se produce en la médula ósea. En los linfocitos analizados de la médula ósea, la expresión extracelular y transgénica no era detectable en los progenitores de linfocitos B más tempranos, los linfocitos pro y pre-B, coherente con el patrón de expresión normal de la cadena ligera (Figura 26). La expresión transgénica se detecta por primera vez en los linfocitos B inmaduros, la fase de desarrollo en la que la cadena ligera murina de la estirpe germinal experimenta un reordenamiento y se expresa en la superficie celular en el contexto de la cadena pesada preseleccionada (Figura 26). En consonancia con la tinción en el bazo, también se detecta expresión de cadena ligera transgénica en linfocitos B maduros recirculantes (Figura 26). Por lo tanto, la expresión del transgén impulsada por CD19-Cre es coherente con el patrón normal de expresión de cadena ligera. La tinción con el anticuerpo endógeno específico de cadena ligera es más intensa que la del anticuerpo transgénico específico de cadena ligera. Esto puede indicar un mayor nivel de expresión de la cadena ligera endógena, una tinción más sensible con el anticuerpo específico de cadena ligera endógena o una combinación de ambos. De manera destacada, la intensidad de la expresión en superficie de la cadena ligera transgénica se correlaciona tanto con la expresión en superficie de la cadena ligera endógena como con la de la IgM, como se observa en la tinción de los linfocitos B circulantes en la sangre (Figura 27).

[0292] Por lo tanto, en conjunto, este análisis demuestra que la expresión del transgén IGKV1-39/Ckappa humano está restringida al compartimento de linfocitos B y que la regulación temporal de su expresión es similar a la de las cadenas ligeras kappa y lambda endógenas, dando como resultado un desarrollo normal de todas las poblaciones de linfocitos B. El aparente menor nivel de expresión del transgén podría explicarse por la fuerza del promotor en comparación con el promotor y los potenciadores presentes en los genes de cadenas ligeras endógenas o por un retraso en la expresión del transgén que proporciona a las cadenas ligeras endógenas una ventaja competitiva en el emparejamiento con la cadena pesada reordenada. Esto es coherente con la observación de que a medida que maduran los linfocitos B aumenta la intensidad relativa de la tinción transgénica en comparación con las cadenas ligeras endógenas. Además, la observación de que el número de linfocitos B es normal y que cada linfocito B Ig+ de superficie co-expresa una cadena ligera endógena y transgénica respalda la conclusión de que la región variable de IGKV1-39 es capaz de emparejarse con un repertorio normal de diferentes regiones variables de cadenas pesadas murinas. A partir de este análisis se concluye que la inserción del transgén IGKV1-39/Ckappa de rata dirigido por el promotor CAGGS activado por CD19-Cre en el locus Rosa facilita la expresión oportuna y específica de linfocitos B del transgén y que el transgén es capaz de emparejarse con un repertorio normal de cadenas pesadas murinas.

[0293] Ejemplo 19

[0294] Perfil de epítopos de linfocitos T Epibase<®>para IGKV1-39.

[0295] Se analizó la secuencia proteica de IGKV1-39 (figura 12, Proteína IGKV1-39/J de estirpe germinal humana) para determinar la presencia de supuestos epítopos restringidos a HLA de clase II, también conocidos como epítopos T<H>. Para ello, se aplicó la plataforma Epibase<®>de Algonomics a IGKV1-39. En resumen, la plataforma analiza las especificidades de unión a HLA de todos los posibles péptidos de 10-meros derivados de una secuencia diana (Desmetet al. Nature1992, 356:539-542; Desmetet al. FASEB J.1997, 11:164-172; Desmetet al. Proteins2002, 48:31-43; Desmetet al. Proteins2005, 58:53-69). El perfil se realiza a nivel de alotipo para 20 DRB1, 7 DRB3/4/5, 13 DQ y 7 DP, es decir, 47 receptores de HLA de clase II en total (véase la Tabla 5). Epibase<®>calcula una estimación cuantitativa de la energía libre de unión ΔG<unión>de un péptido para cada uno de los 47 receptores de HLA de clase II. Después, estos datos se procesaron de la siguiente manera:

[0296] ● Las energías libres se convirtieron en valores de Kd mediante ΔG<unión>= RT In(Kd).

[0297] ● Los péptidos se clasificaron como ligantes fuertes (S), medios (M), débiles y nulos (N). Se aplicaron los siguientes puntos de corte:

[0298] S: ligante fuerte: Kd < 0,1 µM.

[0299] M: ligante medio: 0,1 µM 5 Kd < 0,8 µM.

[0300] N: ligante débil y nulo: 0,8 µM ≤ Kd.

[0301] ● Los péptidos correspondientes a los péptidos propios se trataron por separado. La lista de péptidos propios se tomó de 293 secuencias de la estirpe germinal de anticuerpos. Se denominan péptidos "filtrados por la estirpe germinal".

[0302] Los péptidos S y M se asignan a la secuencia diana en los denominados mapas de epítopos; las afinidades S se representan cuantitativamente; los valores M se presentan cualitativamente. Como visión general de los resultados, la Tabla 6 enumera el número de ligantes fuertes y medios en las proteínas analizadas, para los grupos de receptores de HLA de clase II correspondientes a los genes DRB1, DQ, DP y DRB3/4/5. El recuento se realizó por separado para los ligantes de afinidad fuerte y media. Los péptidos que se unen a múltiples alotipos del mismo grupo se contaron como uno. Los valores entre paréntesis se refieren a péptidos filtrados por estirpe germinal. En la Tabla 7, la secuencia se muestra en un formato adecuado para el trabajo experimental. La secuencia se descompone en 15-meros consecutivos que se solapan en 12 restos. Para cada 15mero, se enumera la promiscuidad (el número de alotipos de un total de 47 para los que el 15-mero contiene un ligante crítico), así como los serotipos implicados. El perfil Epibase<®>y los mapas de epítopos se muestran en las figuras 16 y 17.

[0303] Se llegó a la conclusión de que IGKV1-39 no contiene ligantes de DRB1 fuertes no propios. Normalmente, se encontraron significativamente más ligantes para DRB1 que para otros genes de HLA. Esto concuerda con las pruebas experimentales de que los alotipos pertenecientes al grupo DRB1 son ligantes de péptidos más potentes. Se espera que los epítopos de fuerza media para los alotipos DRB1 contribuyan a la respuesta de la población, y no pueden descartarse. De nuevo, no se encontraron ligantes de DRB1 no propios en IGKV1-39.

[0304] En la respuesta humoral suscitada contra un antígeno, la activación/proliferación de linfocitos T<H>observada se interpreta generalmente en términos de la especificidad de DRB1. Sin embargo, no puede ignorarse la posible contribución de los genes DRB3/4/5, DQ y DP. Dados los niveles de expresión más bajos de estos genes en comparación con DRB1, la atención se centró en la clase de epítopos fuertes para DRB3/4/5, DQ y DP. Los "epítopos críticos" son aquellos epítopos que son ligantes fuertes para cualquier alotipo de DRB1, DRB3/4/5, DQ o DP o son ligantes medios para DRB1, IGKV1-39 no contiene ligantes no propios fuertes o medios para DRB3/4/5, DQ o DP. Algunos péptidos también están presentes en las secuencias de estirpe germinal (valores entre paréntesis en la Tabla 6). Dichos péptidos pueden unirse muy bien a HLA pero se supone que son propios y, por ende, no inmunogénicos. En total, en IGKV1-39 se encontraron 6 ligantes de DRB1 fuertes y 16 medios filtrados por estirpe germinal. La región marco conservada 1 hasta la región marco conservada 3 coincide exactamente con el segmento V de la estirpe germinal VKI 2-1-(1) 012 (VBase), también conocido como IGKV1-39*01 (IMGT). La región marco conservada 4 coincide exactamente con el segmento J JK1 (base V) de la estirpe germinal, también conocido como IGKJ1*01(IMGT). No es de extrañar que estos segmentos no contengan ningún epítopo no propio.

[0305] Ejemplo 20

[0306] Características de producción de IGKV1-39

[0307] Existe una gran demanda de plataformas de descubrimiento de anticuerpos que produzcan anticuerpos terapéuticos termodinámicamente estables y que proporcionen buenos rendimientos de expresión. Estas características son importantes para garantizar la estabilidad del fármaco durante la producción y después de la inyección del medicamento en el paciente. Además, un buen rendimiento de expresión repercute directamente en el coste de fabricación del fármaco y, por lo tanto, en su precio, en el acceso de los pacientes y en la rentabilidad. Prácticamente todos los anticuerpos terapéuticos de uso clínico en la actualidad están compuestos por regiones constantes kappa e IgG1 humanas, pero usan regiones variables de cadena pesada y ligera diferentes que les confieren especificidad. Los dominios de cadena pesada y ligera variables humanos pueden dividirse en familias que tienen una divergencia de secuencia superior al 80 %. Cuando se combinan ejemplos reordenados de estas familias en configuración de estirpe germinal y se comparan en cuanto a estabilidad y rendimiento, queda claro que las familias de genes no son iguales en términos de propiedades biofísicas. En particular V<H>3, V<H>1 y V<H>5 tienen una estabilidad favorable para las cadenas pesadas y Vk1 y Vk3 tienen la mejor estabilidad y rendimiento de cadenas ligeras. Además, cuando se introducen mutaciones como parte del proceso de hipermutación somática, pueden interferir con el emparejamiento V<H>/V<L>. Para evaluar el efecto que diferentes genes de cadena ligera con tasas de mutación diferentes tienen sobre las características de producción de una cadena V<H>fija, se construyó una biblioteca de presentación en fagos con Fab de cadenas ligeras (kappa y lambda) de seis donantes sanos sin exposición previa junto con un panel de 44 cadenas pesadas de unión a TT de donantes inmunizados. Después de una ronda de selección, se aislaron clones de Fab de unión a TT. Varios de ellos compartían el mismo gen V<H>que el clon de TT PG1433 en combinación con diferentes cadenas ligeras. Los fragmentos de cadena ligera de Fab se reclonaron en un vector de expresión de kappa y se transfectaron en combinación con ADN que codifica la cadena pesada de PG1433 en células 293 y se midió la producción específica de IgG mediante ELISA. Como se demuestra en la tabla 8, los clones seleccionados que contenían V<H>de PG1433 junto con diferentes cadenas ligeras tenían entre 5 y 10 veces menos expresión proteica de V<H>de PG1433 combinado con IGKV1-39. Obsérvese que todas las cadenas ligeras contenían mutaciones aminoacídicas dentro de sus regiones codificantes que podrían alterar el emparejamiento de V<H>y reducir la estabilidad de la producción. Por lo tanto, además de reducir las posibilidades de inmunogenicidad no deseada, se espera que el uso de la cadena ligera IGKV1-39 sin mutaciones contribuya a mejorar la estabilidad de la producción y los rendimientos de diversos genes V<H>que contribuyen a la especificidad. De hecho, los clones estables generados mediante la transfección de diferentes genes V<H>, todos emparejados con IGKV1-39, son susceptibles de pases extensivos y aún conservar características de producción robustas como se muestra en la tabla 9.

[0308] Ejemplo 21

[0309] Generación de ratones que expresan regiones VH y VL totalmente humanas. Los ratones transgénicos adecuados para su uso de acuerdo con la invención se cruzan con ratones que ya contienen un locus de VH humano. Se divulgan ejemplos de ratones adecuados que comprenden un locus de VH humano en Tayloret al.(1992).Nucleic Acids Res20: 6287-95; Lonberget al.(1994).Nature368: 856-9; Greenet al.(1994).Nat Genet7: 13-21; Dechiaraet al.(2009).Methods Mol Biol530: 311-24).

[0310] Después de cruzar y seleccionar ratones que son al menos heterocigotos para el transgén IGKV1-39 y el locus de VH humano, se inmunizan ratones seleccionados con una diana. Los genes VH se recogen como se ha descrito anteriormente en el presente documento. Este método tiene la ventaja de que los genes VH ya son totalmente humanos y, por lo tanto, no requieren humanización.

[0311] Ejemplo 22

[0312] Aislamiento, caracterización, formateo de oligoclónicos y producción de anticuerpos dirigidos contra la IL6 humana para el tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas tales como artritis reumatoide

[0313] Un repertorio de VH de bazo de ratones transgénicos que están inmunizados con IL6 recombinante humana se clona en un vector de Fab de presentación en fagos con una única cadena ligera kappa de IGKV1-39-C humana (idéntica al transgén de ratón) y se somete a paneo contra la IL6 humana inmunógena. Los clones que se obtienen después de dos o cuatro rondas de paneo se analizan para determinar su especificidad de unión. Los genes VH que codifican fragmentos Fab específicos de IL6 se someten a análisis de secuencia para identificar clones únicos y asignar la utilización de VH, DH y JH. Los fragmentos Fab se reformatean como moléculas de IgG1 y se expresan transitoriamente. A continuación, los clones únicos se agrupan basándose en la no competencia en los ensayos de unión y se someten a análisis funcionales y de afinidad. Los mAb IgG1 anti-IL6 más potentes se expresan posteriormente como combinaciones de dos, tres, cuatro o cinco cadenas pesadas que comprenden diferentes regiones VH en el formato de oligoclónicos, junto con una cadena ligera kappa basada en IGKV1-39-C y se someten a ensayoin vitropara determinar la formación de complejos con IL-6. Los oligoclónicos también se someten a ensayoin vivopara el aclaramiento de IL-6 humana de ratones. Se elige un oligoclónico con la actividad de aclaramiento más potente y se humanizan los genes VH murinos de acuerdo con métodos convencionales. Las IgG 1 humanizadas se transfectan en una estirpe celular de mamífero para generar un clon estable. Se selecciona un subclon óptimo para la generación de un banco celular maestro y la generación de material para ensayos clínicos.

[0314] Muchos de los protocolos que se describen en el presente documento son protocolos convencionales para la construcción de bibliotecas de presentación en fagos y el paneo de fagos para la unión a un antígeno de interés y se describen, por ejemplo, enAntibody Phage Display: Methods and Protocols. 2002. Editor(es): Philippa M. O'Brien, Robert Aitken. Humana Press, Totowa, Nueva Jersey, EE. UU.

[0315] Inmunizaciones

[0316] Los ratones transgénicos reciben tres inmunizaciones con IL6 humana cada dos semanas usando el adyuvante Sigma titerMax de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

[0317] Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

[0318] Tres días después de la última inmunización, se extraen el bazo y los ganglios linfáticos de los ratones y se hacen pasar a través de un filtro de 70 micrómetros a un tubo que contiene PBS pH 7,4 para generar una suspensión unicelular. Después del lavado y la precipitación de los linfocitos, las células se suspenden en reactivo TRIzol LS (Invitrogen) para el aislamiento del ARN total de acuerdo con el protocolo del fabricante y se someten a la reacción de transcripción inversa usando 1 microgramo de ARN, Superscript III RT en combinación con dT20 de acuerdo con los procedimientos del fabricante (Invitrogen).

[0319] La generación de bibliotecas de presentación en fagos con Fab se realiza como se describe en el Ejemplo 2.

[0320] Selección de fagos en inmunotubos recubiertos

[0321] Se disuelve IL6 recombinante humana en PBS en una concentración de 5 µg/ml y se aplicó como recubrimiento en el tubo MaxiSorp Nunc-Immuno Tube (Nunc 444474) durante la noche a 4 °C. Después de desechar la solución de recubrimiento, los tubos se bloquean con leche desnatada al 2 % (ELK) en PBS (tampón de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente (TA). En paralelo, se mezclan 0,5 ml de la biblioteca de fagos con 1 ml de tampón de bloqueo y se incuban durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de bloquear los fagos, la solución de fago se añade a los tubos recubiertos con IL6 y se incuba durante 2 horas a TA en una plataforma que gira lentamente para permitir la unión. A continuación, los tubos se lavan 10 veces con PBS/Tween-20 al 0,05 % seguido de la elución de los fagos incubando con 1 ml de glicina 50 mM-HCl pH 2,2 10 min a TA en rueda giratoria y directamente seguido de la neutralización del eluyente recogido con 0,5 ml de Tris 1 M-HCl pH 7,5.

[0322] Recogida de clones de fagos

[0323] Un cultivo de 5 ml de XL1-Blue MRF (Stratagene) a una D.O. 0,4 se añade a la solución de fagos recogidos y se incuba durante 30 minutos a 37 °C sin agitación para permitir la infección de los fagos. Las bacterias se siembran en placas de Carbenicilina/Tetraciclina glucosa al 4 % 2*TY y se cultivan durante la noche a 37 °C.

[0324] Producción de fagos

[0325] Los fagos se cultivan y se procesan como se describe en Krameret al.2003 (Krameret al.2008.Nucleic Acids Res.

[0326] 31(11): e59) usando VCSM13 como cepa de fago auxiliar.

[0327] ELISA de fagos

[0328] Se recubren placas de ELISA con 100 microlitros de IL6 recombinante humana por pocillo a una concentración de 2,5 microgramos/ml en PBS durante la noche a 4 °C. Se usan como control negativo placas recubiertas con 100 microlitros de tiroglobulina a una concentración de 2 microgramos/ml en PBS. Los pocillos se vacían y se secan dando golpecitos en una toalla de papel, se llenaron completamente con PBS-leche desnatada al 4 % (ELK) y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente para bloquear los pocillos. Después de desechar la solución de bloqueo, se añaden minipreparaciones de fagos premezcladas con 50 µl de solución de bloqueo y se incuban durante 1 hora a TA. Los fagos no unidos se eliminan posteriormente mediante 5 etapas de lavado con PBS-Tween-20 al 0,05 %. Los fagos unidos se detectan incubando los pocillos con 100 microlitros de conjugado de anticuerpo anti-M13-HRP (diluido 1/5000 en tampón de bloqueo) durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo libre se elimina repitiendo las etapas de lavado como se ha descrito anteriormente, seguido de incubación en sustrato TMB hasta que el desarrollo del color fuera visible. La reacción se detiene añadiendo 100 microlitros de H2SO42 M por pocillo y se analiza en un lector de ELISA a 450 nm de longitud de onda de emisión.

[0329] Secuenciación

[0330] Los clones que proporcionan señales al menos 3 veces superiores a la señal de fondo se propagan, se usan para procedimientos de minipreparación de ADN (véanse los procedimientos del manual Qiagen miniPrep) y se someten a un análisis de secuencia de nucleótidos. La secuenciación se realiza de acuerdo con el manual de acompañamiento del kit Big Dye 1.1 (Applied Biosystems) usando un cebador inverso (CH1_Rev1, tabla 1) que reconoce una secuencia 5' de la región CH1 de la cadena pesada de IgG1 humana (presente en el vector de presentación de Fab MV1043, figuras 3 y 12). Las secuencias de las regiones VH murinas se analizan para determinar la diversidad de los segmentos génicos DH y JH.

[0331] Construcción y expresión de IgG1 quimérica

[0332] El vector MV1057 (figuras 12 y 22) se generó clonando el fragmento de cadena L del transgén (IGKV1-39) en un derivado del vector pcDNA3000Neo (Crucell, Leiden, Países Bajos) que contiene las regiones constantes kappa y IgG1 humanas. Las regiones VH se clonan en MV1057 y las secuencias de nucleótidos para todas las construcciones se verifican de acuerdo con técnicas convencionales. Las construcciones resultantes se expresan transitoriamente en células HEK293T y se obtienen y purifican sobrenadantes que contienen IgG1 quimérica usando procedimientos convencionales como se ha descrito anteriormente (Throsby, M.2006.J Virol80: 6982-92).

[0333] Análisis de unión y competencia de IgG1

[0334] Los anticuerpos IgG1 se titulan en ELISA usando placas recubiertas con IL6 como se ha descrito anteriormente y un conjugado de peroxidasa anti-IgG humana. Los ELISA de competencia para agrupar anticuerpos basándose en el reconocimiento de epítopos se realizan incubando fagos con Fab junto con IgG1 o con anticuerpos comerciales contra IL6 (por ejemplo, n.º de cat. de Abcam ab9324) en placas recubiertas con IL6, seguido de la detección del fago con Fab unido usando un conjugado de peroxidasa anti-M13.

[0335] Mediciones de la afinidad de IgG1

[0336] Las afinidades de los anticuerpos a la IL6 se determinan con el protocolo de cinética cuantitativa en el Octet (ForteBio). Los anticuerpos se capturan en un biosensor de captura de Fc de IgG antihumana, se exponen a IL6 libre y se analizan usando un software patentado para calcular la Kd de cada anticuerpo.

[0337] Actividad funcional de los anticuerpos IL6

[0338] Para someter a ensayo la capacidad de los anticuerpos seleccionados para inhibir la unión entre la IL6 y el receptor de IL6 (IL6R), se usa un ensayo basado en ELISA. Se mezclan diversas concentraciones de anticuerpos con una concentración fija (10 ng/ml) de IL6 biotinilada como describen Naokoet al.2007,Can. Res.67: 817-875. El complejo inmunitario IL6-anticuerpo se añade al IL6R inmovilizado. La unión de IL6 biotinilada a IL6R se detecta con estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. La reducción de la señal de ELISA es una medición de la inhibición. Como control positivo para la inhibición de la unión entre IL6 e IL6R se usó anticuerpo anti-IL6R (n.º de cat. de Abcam ab34351; clon B-R6) o anticuerpo anti IL6 (n.º de cat. de Abcam ab9324). La actividad de bloqueoin vitrode los anticuerpos anti-IL6 seleccionados se mide en un ensayo de proliferación usando la estirpe celular 7TD1 dependiente de IL6. En resumen, se incuban células con diferentes concentraciones de IL6 humana con o sin el anticuerpo anti-IL6. La cantidad disponible de IL6 determina el grado de proliferación. Por lo tanto, si un anticuerpo añadido bloquea la unión de IL6, la lectura de la proliferación se reduce en comparación con un control de anticuerpo no de unión. La proliferación se mide mediante la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en el ADN usando el kit de proliferación de BrdU (n.º de cat. de Roche 11444611001) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Generación de oligoclónicos anti-IL6

[0339] Los anticuerpos anti-IL6 más potentes se seleccionan de cada grupo de epítopos. Las construcciones de expresión que expresan estos anticuerpos se transfectan en células HEK293T en grupos no competidores de tres en relaciones diferentes (1:1:1; 3:1:1; 1:3:1; 1:1:3; 3:3:1; 1:3:3; 3:1:3; 10:1:1; 1:10:1; 1:1:10; 10:10:1; 1:10:10; 10:1:10; 3:10:1; 10:3:1; 1:10:3; 3:1:10; 10:1:3; 1:3:10). Los sobrenadantes que contienen anticuerpos se recogen, se purifican y se caracterizan como se ha indicado anteriormente.

[0340] Formación de complejos y aclaramientoin vivode oligoclónicos anti-IL6

[0341] Para medir la capacidad de los oligoclónicos anti-IL6 para formar complejos inmunitarios y analizar estos complejos se usa la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) de acuerdo con el enfoque divulgado por Min-Soo Kimet al.(2007)JMB374: 1374-1388 para caracterizar los complejos inmunitarios formados con diferentes anticuerpos frente al TNFa. Se mezclan diferentes relaciones molares de los oligoclónicos anti-IL6 con IL6 humana y se incuban durante 20 horas a 4 °C o 25 °C. La mezcla se analiza en un sistema de HPLC equipado con una columna de exclusión por tamaño; los diferentes tiempos de elución se correlacionan con el peso molecular usando un patrón de peso molecular. La capacidad de los anticuerpos para formar complejos con IL6 está correlacionada con su capacidad para aclarar rápidamente la citocina de la circulaciónin vivo. Esto se confirma midiendo el aclaramiento de IL6 radiomarcada desde ratones. En resumen, se obtienen ratones Balb/c hembras de entre 6 y 8 semanas de edad y, 18 horas antes del experimento, se inyecta a los animales por vía intravenosa (IV) a través de la vena lateral de la cola diferentes dosis de oligoclónicos anti-IL6 purificados. El día 0 se inyecta a los ratones por vía intravenosa 50 microlitros de IL-6 radiomarcada (1x10E7 cpm/ml) en las mismas condiciones. Se recogen muestras de sangre (aproximadamente 50 microlitros) a varios intervalos de tiempo y se almacenan a 4 °C. Las muestras se centrifugan durante 5 minutos a 4000 xg y se determina la radiactividad del suero. Todos los experimentos farmacocinéticos se realizan simultáneamente con tres animales para cada tratamiento.

[0342] Generación de clones estables de oligoclónicos anti-IL6 y desarrollo preclínico

[0344] Se selecciona un oligoclónico anti-IL6 líder basándose en la potenciain vitroein vivocomo se ha determinado anteriormente. Los genes VH murinos se humanizan de acuerdo con métodos convencionales y se combinan con la cadena ligera IGKV1-39 totalmente humana en un vector de expresión como se ha descrito anteriormente. Los ejemplos de métodos de humanización incluyen los basados en paradigmas tales como la remodelación de la superficie (Padlan, E. A.,et al., (1991).Mol.Immunol., 28, 489), la superhumanización (Tan, P., D. A.,et al., (2002)J. Immunol., 169, 1119) y la optimización del contenido de cadenas humanas (Lazar, G. A.,et al., (2007).Mol.Immunol., 44, 1986). Las tres construcciones se transfectan en células PER.C6 en la relación óptima predeterminada (descrita anteriormente) bajo la presión selectiva de G418 de acuerdo con métodos convencionales. Se selecciona un clon oligoclónico anti-IL6 estable de alta producción y se genera un banco de células maestras operativo y cualificado.

[0346] Tabla 1 Lista de cebadores

[0348]

[0351] Tabla 2

[0353] Niveles de señal de ELISA de fagos medidos a 450 nm. Las placas recubiertas con TT representan placas que se recubrieron con toxoide tetánico. Se usan placas recubiertas con tiroglobulina como controles negativos. 10/10 y 15/15 indican el número de etapas de lavado con PBS-Tween durante los procedimientos de paneo. Las placas 10/10 de toxoide tetánico y 10/10 de tiroglobulina y las placas 15/15 de toxoide tetánico y 15/15 de tiroglobulina son duplicados entre sí, excepto por el agente de recubrimiento. Los valores de DO superiores a 3 veces el fondo se consideran específicos.

[0354] Placa recubierta con TT 10/10 lavados

[0355] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0,139 0,093 0,089 0,121 0,117 0,598 0,146 0,115 0,18 0,155 0,543 0,601 B 0,136 0,404 0,159 0,187 0,489 0,134 0,216 0,092 0,222 0,108 0,181 0,484 (continuación)

[0356] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 C 0,197 0,526 0,09 0,213 0,395 0,155 0,108 0,12 0,183 0,136 0,092 0,866 D 0,143 0,258 0,101 0,422 0,088 0,243 0,485 0,251 0,304 0,198 0,478 0,091 E 0,445 0,169 0,526 0,481 0,206 0,285 0,111 0,119 0,128 0,2 0,118 0,098 F 0,237 0,291 0,594 0,139 0,206 0,565 0,543 0,091 0,136 0,227 0,228 0,099 G 0,459 0,102 0,152 0,659 0,203 0,452 0,152 0,133 0,094 0,102 0,375 0,098 H 0,341 0,623 0,745 0,415 0,682 0,527 0,655 0,114 0,258 0,284 0,685 0,113 Placa recubierta con TT 15/15 lavados

[0357] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0,247 0,582 0,421 0,428 0,133 0,082 0,262 0,079 0,343 0,414 0,095 0,292 B 0,065 0,364 0,073 0,042 0,049 0,071 0,046 0,103 0,078 0,057 0,048 0,155 C 0,081 0,044 0,066 0,082 0,225 0,444 0,203 0,362 0,122 0,047 0,052 0,309 D 0,092 0,11 0,59 0,22 0,33 0,544 0,058 0,159 0,047 0,174 0,086 0,05 E 0,469 0,577 0,206 0,304 0,13 0,749 0,431 0,062 0,167 0,049 0,056 0,049 F 0,846 0,07 0,561 0,656 0,882 0,094 0,383 0,13 0,152 0,098 0,134 0,048 G 0,537 0,052 0,49 0,105 0,337 0,193 0,514 0,294 0,068 0,35 0,525 0,05 H 0,061 0,306 0,157 0,853 0,054 0,534 0,102 0,235 0,441 0,412 0,565 0,061 Placa recubierta con tiroglobulina 10/10 lavados

[0358] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0,047 0,051 0,045 0,043 0,051 0,044 0,046 0,042 0,047 0,048 0,049 0,05 B 0,042 0,042 0,042 0,042 0,043 0,041 0,041 0,042 0,043 0,045 0,042 0,046 C 0,044 0,043 0,043 0,044 0,043 0,044 0,043 0,042 0,043 0,041 0,044 0,046 D 0,045 0,044 0,044 0,044 0,045 0,046 0,045 0,056 0,045 0,049 0,048 0,73 E 0,046 0,045 0,046 0,044 0,045 0,044 0,044 0,044 0,047 0,046 0,047 0,926 F 0,048 0,045 0,044 0,046 0,044 0,043 0,044 0,046 0,046 0,046 0,046 0,792 G 0,051 0,048 0,045 0,045 0,044 0,043 0,048 0,045 0,048 0,051 0,045 0,053 H 0,064 0,05 0,049 0,047 0,05 0,051 0,047 0,046 0,047 0,047 0,047 0,056 Placa recubierta con tiroglobulina 15/15 lavados

[0359] 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0,036 0,049 0,045 0,044 0,046 0,047 0,046 0,042 0,042 0,043 0,042 0,041 B 0,045 0,042 0,041 0,043 0,043 0,043 0,045 0,045 0,047 0,048 0,044 0,045 C 0,049 0,047 0,047 0,046 0,046 0,046 0,045 0,047 0,046 0,045 0,045 0,052 D 0,047 0,049 0,048 0,048 0,048 0,048 0,047 0,052 0,048 0,046 0,048 0,456 E 0,049 0,047 0,047 0,047 0,047 0,049 0,047 0,048 0,047 0,046 0,048 0,412 F 0,05 0,047 0,046 0,046 0,046 0,046 0,046 0,046 0,046 0,047 0,048 0,528 G 0,05 0,048 0,045 0,045 0,046 0,049 0,048 0,046 0,053 0,049 0,05 0,057 H 0,057 0,05 0,046 0,045 0,047 0,049 0,047 0,047 0,046 0,047 0,053 0,048

[0361] Tabla 3

[0363]

[0364] continuación

[0366]

[0368] Tabla 4

[0370]

[0372] Tabla 5. Alelotipos de HLA considerados en el perfil de epítopos de T<H>. Se muestran los serotipos correspondientes, así como las frecuencias alotípicas en la población caucásica (Klitzet al. Tissue Antigens2003, 62:296-307; Gjertson y Terasake (eds) en:HLA1997; Gjertson y Terasake (eds) en:HLA1998; Castelliet al. J. Immunol.2002, 169:6928-6934). Las frecuencias pueden sumar más del 100 %, puesto que cada individuo tiene 2 alelos para cada gen. Si se conocieran todas las frecuencias alélicas de un único gen, sumarían algo menos del 200 % debido a los individuos homocigotos.

[0373] Tipo de HLA Serotipo % de Población Tipo de HLA Serotipo % de Población DRB1*0101 DR1 17,4 DRB4*0103 DR53 21 DRB1*0102 DR1 4,9 DRB5*0101 DR51 15,8 DRB1*0301 DR17 (3) 21,2 DRB5*0202 DR51 5,7 DRB1*0401 DR4 11,5 DQA1*0101/DQB1*0501 DQ5 (1) 20,5 DRB1*0402 DR4 3,1 DQA1*0102/DQB1*0502 DQ5 (1) 2,6 DRB1*0404 DR4 5,5 DQA1*0102/DQB1*0602 DQ6 (1) 26,5 DRB1*0405 DR4 2,2 DQA1*0102/DQB1*0604 DQ6 (1) 6,7

[0374] (continuación)

[0375] Tipo de HLA Serotipo % de Población Tipo de HLA Serotipo % de Población DRB1*0407 DR4 <2 DQA1*0103/DQB1*0603 DQ6 (1) 11 DRB1*0701 DR7 23,4 DQA1*0104/DQB1*0503 DQ5 (1) 4 DRB1*0801 DR8 3,3 DQA1*0201/DQB1*0202 DQ2 20,9 DRB1*0802 DR8 <2 DQA1*0201/DQB1*0303 DQ9 (3) 7,2 DRB1*0901 DR9 <2 DQA1*0301/DQB1*0301 DQ7 (3) 12,5 DRB1*1101 DR11 (5) 17 DQA1*0301/DQB1*0302 DQ8 (3) 18,3 DRB1*1104 DR11 (5) 5,7 DQA1*0401/DQB1*0402 DQ4 4,5 DRB1*1201 DR12 (5) 3,1 DQA1*0501/DQBL*0201 DQ2 24,6 DRB1*1301 DR13 (6) 15,4 DQA1*0501/DQB1*0301 DQ7 (3) 20,9 DRB1*1302 DR13 (6) 10,8 DPA1*0103/DPB1*0201 DPw2 19,9 DRB1*1401 DR14 (6) 4,2 DPA1*0103/DPB1*0401 DPw4 65,1 DRB1*1501 DR15 (2) 13,2 DPA1*0103/DPB1*0402 DPw4 24,3 DRB1*1601 DR16 (2) 5,5 DPA1*0201/DPB1*0101 DPw1 6,3 DRB3*0101 DR52 24,6 DPA1*0201/DPB1*0301 DPw3 <2 DRB3*0202 DR52 43 DPA1*0201/DPB1*0501 DPw5 <2 DRB3*0301 DR52 10 DPA1*0201/DPB1*0901 - 2,4 DRB4*0101 DR53 25,5

[0377] Tabla 6. Recuentos de epítopos de T<H>para IGKV1-39. Los péptidos que se unen a múltiples HLA del mismo grupo (DRB1, DRB3/4/5, DP, DQ) se cuentan como uno. Los valores entre paréntesis se refieren a péptidos filtrados por estirpe germinal.

[0379] DRB1 DRB3/4/5 DQ DP

[0380] Fuerte Medio Fuerte Medio Fuerte Medio Fuerte Medio IGEKV1-39 de Merus 0 (+6) 0 (+16) 0 (+0) 0 (+5) 0 (+3) 0 (+9) 0 (+0) 0 (+9)

[0381] Tabla 7. Mapeo de las predicciones de Epibase<®>para IGKV1-39 de Merus en el formato clásico de péptido 15-mero. Esta tabla muestra el recuento de alotipos de epítopos críticos y serotipos implicados para cada uno de los 15-meros que abarcan la secuencia IGKV1-39 de Merus.

[0383] 15mer Posición

[0384] de inicio Secuencia de 15-mero Recuento

[0385] de alotipos Serotipos implicados

[0386] 1 1 DIQMTOSPSSLSASV 6 DR1, DR4, DR7, DR9

[0387] 2 4 MTQSPSSLSASVGDR 5 DR1, DR4, DR9

[0388] 3 7 SPSSLSASVGDRVTI 0

[0389] 4 10 SLSASVGDRVTITCR 0

[0390] 5 13 ASVGDRVTITCRASQ 0

[0391] 6 16 GDRVTITCRASQSIS 2 DR11(5), DR7

[0392] 7 19 VTITCFASQSISSYL 4 DQ2, DR11(5), DR4, DR7

[0393] 8 22 TCRASQSISSYLNWY 2 DQ2, DR4

[0394] 9 25 ASQSISSYLNWYQQK 5 DR13(6), DR15(2), DR4

[0395] 10 28 SISSYLNWYQQKPGK 8 DR12(5), DR13(6), DR15(2), DR16(2), DR4,

[0396] DR8

[0397] 11 31 SYLNWYQQKPGKAPK 10 DR1, DR12(5), DR16(2), DR4, DR51, DR8 12 34 NWYQQKPGRAPKLLI 9 DR1, DR15(2), DR4, DR51, DR8

[0398] 13 37 QQKPGKAPKLLIYAA 7 DQ4, DR1, DR11(5), DR15(2), DR51, DR8 14 40 PGKAPKLLIYAASSL 7 DQ4, DR1, DR11(5), DR4, DR8

[0399] 15 43 APKLLIYAASSLQSG 15 DR1, DR11(5), DR12(5), DR13(6), DR14(6),

[0400] DR15(2), DR4, DR51, DR8, DR9

[0401] 16 46 LLIYAASSLQSGVPS 15 DR1, DR11(5), DR12(5), DR13(6), DR14(6),

[0402] DR15(2), DR4, DR51, DR8, DR9

[0403] 17 49 YAASSLQSGVPSRFS 1 DR15 (2)

[0404] 18 52 SSLOSGVPSRFSGSG 1 DR15 (2)

[0405] 19 55 QSGVPSRFSGSGSGT 0

[0406] 20 58 VPSRFSGSGSGTDFT 0

[0407] 21 61 RFSGSGSGTDFTLTI 0

[0408] 22 64 GSGSGTDFTLTISSL 1 DR52

[0409] 23 67 SGTDFTLTISSLQPE 4 DR4, DR52, DR7, DR9

[0410] 24 70 DFTLTISSLQPEDFA 4 DQ2, DR4, DR7, DR9

[0411] 25 73 LTISSLQPEDFATYY 1 DQ2

[0412] 26 76 SSLQPEDFATYYCQQ 0

[0413] 27 79 QPEDFATYYCQQSYS 1 DR4

[0414] (continuación)

[0415] 15mer Posición Secuencia de 15-mero Recuento Serotipos implicados

[0416] de inicio de alotipos

[0417] 28 82 DFATYYCQQSYSTPP 5 DR4, DR51, DR7

[0418] 29 85 TYYCQQSYSTPPTFG 4 DR4, DR51, DR7

[0419] 30 88 CQQSYSTPPTFGQGT 0

[0420] 31 91 SYSTPPTFGQGTKVE 0

[0421] 32 94 TPPTFGQGTKVEIK 0

[0423] Tabla 8: El gen V<H>de PG1433 emparejado con diversos genes de cadena ligera con diferentes tasas de mutación de aminoácidos se comparó para determinar los niveles de producción con el clon original que contenía el gen IGKV1-

[0424] 39.

[0426]

[0427]

[0430] 

[0431]

[0432]

[0435] 

[0436]

[0437]

[0440] 

[0441]

[0442]

[0445] 

[0446]

[0447]

[0450] 

[0451]

[0452]

[0453]

[0454]

[0455] Tabla 11 Número de linfocitos recogidos de la médula ósea y el bazo de ratones de tipo silvestre y transgénicos

[0456]

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

1. Uso de un mamífero murino transgénico que comprende integrado en su genoma un ácido nucleico reordenado que codifica una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, en donde dicha región variable de cadena ligera es capaz de emparejarse con al menos dos cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamífero murino, de manera que la variedad en la especificidad de los anticuerpos se conserva a través de reordenamientos e hipermutaciones en las cadenas pesadas, para la generación de anticuerpos de alta afinidad que comprendan dicha región variable de cadena ligera de inmunoglobulina humana reordenada, en donde los anticuerpos están codificados por genes VH que han experimentado hipermutación somática tras la inmunización y el gen VL humano reordenado no mutado integrado en el genoma.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho ácido nucleico codifica además una región constante de cadena ligera animal.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho anticuerpo se dirige contra una diana celular.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha diana celular es una proteína humana expresada en superficie o soluble o molécula de carbohidrato.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha diana celular es una proteína expresada en superficie o una molécula de carbohidrato que se expresa en la superficie de bacterias, virus y otros patógenos, especialmente de seres humanos.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde dicha diana incluye citocinas y quimiocinas, moléculas receptoras para citocinas y quimiocinas, receptores de la superfamilia de las inmunoglobulinas (Ig), receptores de la familia del factor de necrosis tumoral, serina/treonina-proteína cinasas receptoras, tirosina cinasas receptoras, miembros de la familia de receptores del EGF, miembros de la familia de receptores de la insulina, miembros de la familia de receptores del PDGF, miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento de hepatocitos, miembros de la familia de receptores de Trk, miembros de la familia de receptores de AXL, miembros de la familia de receptores de LTK, miembros de la familia de receptores de TIE, miembros de la familia de receptores de ROR, miembros de la familia de receptores de DDR, miembros de la familia de receptores de KLG, miembros de la familia de receptores de RYK, miembros de la familia de receptores de MuSK y miembros de la familia de receptores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR).

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho anticuerpo se dirige contra una diana que se sobreexpresa o se expresada selectivamente en tumores.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en donde la diana es VEGF, CD20, CD38, CD33, CEA, EpCAM, PSMA, CD54, Lewis Y, CD52, CD40, CD22, CD51/CD61, CD74, MUC-1, CD38, CD19, CD262 (TRAIL-R2), RANKL, CTLA4 o CD30.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho anticuerpo se dirige contra una diana que está implicada en la inflamación crónica.

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la diana es CD25, CD11a, TNF, CD4, CD80, CD23, CD3, CD14, IFNgamma, CD40L, CD50, CD122, TGFbeta o TGFalfa.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 o 5, en donde dicha diana incluye marcadores de superficie de los virus de la gripe A y B tales como la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa (NA), filovirus tales como el virus del Ébola, la rabia, el sarampión, la rubéola, las paperas, flavivirus tales como los tipos 1-4 del virus del Dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus del Nilo Occidental, virus de la encefalitis japonesa y virus de la fiebre amarilla, Paramixovirus incluyendo Paramixovirus tales como Parainfluenza 1, 3, Rubulavirus tales como el virus de las paperas y Parainfluenza 2, 4, Morbillivirus y Pneumovirus tales como el virus respiratorio sincitial, vaccinia, viruela, coronavirus, incluyendo el virus del Síndrome Respiratorio Agudo Grave (SARS), el virus de la hepatitis (A, B y C, el virus de la inmunodeficiencia humana, el virus del herpes, incluyendo el citomegalovirus, el virus de Epstein Barr, el virus del herpes simple y virus de la varicela zóster, parvovirus tales como, por ejemplo, B19;Legionella pneumophila;Listeria monocytogenes;Campylobacter jejuni;Staphylococcus aureus;E. coli0157:H7;Borrelia burgdorferi;Helicobacter pylori;Ehrlichia chaffeensis;Clostridium difficile;Vibrio cholera;Salmonella entericaSerotipoTyphimurium;Bartonella henselae;Streptococcus pyogenes(estreptococo del Grupo A);Streptococcus agalactiae(estreptococo del Grupo B);S. aureusresistente a múltiples fármacos (por ejemplo, MRSA);Chlamydia pneumoniae;Clostridium botulinum;Vibrio vulnificus;Parachlamydia pneumonia;Corynebacterium amycolatum;Klebsiella pneumonia; enterococos resistentes al linezolid (E. faecalisyE. faecium); yAcinetobacter baumanniiresistente a múltiples fármacos.

12. El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde se aísla un gen VH que ha experimentado hipermutación somática y que codifica la VH de un anticuerpo de alta afinidad como se genera en una

cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y en donde dicho gen VH aislado o copia del mismo se integra en un casete de expresión y dicho anticuerpo de alta afinidad se expresa en una célula hospedadora.