ES2905301T3 - Anticuerpos anti-PD-1 - Google Patents

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ES2905301T3 ES15824277T ES15824277T ES2905301T3 ES 2905301 T3 ES2905301 T3 ES 2905301T3 ES 15824277 T ES15824277 T ES 15824277T ES 15824277 T ES15824277 T ES 15824277T ES 2905301 T3 ES2905301 T3 ES 2905301T3
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Abstract

Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une a PD-1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 133; y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-PD-1
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos y a fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a PD-1, y a métodos de uso de dichos anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno.
ANTECEDENTES
El receptor 1 de muerte programada (PD-1) se expresa principalmente en linfocitos y tiene dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. PD-1 es una proteína de 55 kDa codificada por un gen Pdcd1 y se mostró que regulaba por disminución la transducción de señales de receptores de antígeno impulsada por su interacción con ligando (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman, et. al. (2001) Nat Immunol 2:261 -8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43). El PD-1 pertenece a la superfamilia de las inmunoglobulinas, que incluye miembros tales como CD28, CTLA-4, ICOS y BTLA. El PD-1 es la glucoproteína transmembranaria de tipo I que contiene un dominio de tipo variable (tipo V) de Ig para la unión al ligando y una cola citoplásmica para la unión de moléculas señal. El PD-1 contiene dos motivos de transducción de señales basados en tirosina citoplásmica, una estructura tirosínica inhibidora de los inmunorreceptores basado en tirosina (ITIM) y una estructura tirosínica de cambio de los inmunorreceptores (ITSM). Tras la estimulación de linfocitos T, el PD-1 atrae la tirosina fosfatasa SHP-2 hacia el motivo ITSM dentro de su cola citoplásmica, que conduce a la desfosforilación de moléculas efectoras, tales como CD3 Zeta, PKC theta y ZAP70 que participan en la cascada de transducción de señales de linfocitos T CD3. A diferencia, los ligandos de PD-1 (PD-L1 y PD-L2) tienen dos regiones citoplásmicas cortas sin funciones conocidas. Los ligandos tienen una región extracelular que contiene dominios de tipo IgV e IgC y se expresan constitutivamente o pueden ser inducidos en una variedad de tipos de células, que incluyen tejidos no hematopoyéticos, así como diversos tipos de tumor. El PD-L1 no solo se expresa en linfocitos B, T, células mieloides y dendríticas (DC), sino también en células periféricas, como células endoteliales microvasculares y órganos no linfoides como el corazón, el pulmón etc. A diferencia, el PD-L2 solo se encuentra en macrófagos y DC. El patrón de expresión de ligandos de PD-1 indica una función de PD-1 en el mantenimiento de la tolerancia periférica y pueden servir para regular las respuestas autorreactivas de linfocitos T y B en la periferia. Hasta la fecha, numerosos estudios han mostrado que la interacción de PD-1 con sus ligandos conduce a la inhibición de la proliferación de linfocitos in vitro e in vivo. Se ha mostrado que la alteración de la interacción PD-1/PDL1 aumenta la proliferación de linfocitos T y promueve la producción de citocinas. El documento de patente US 2011/008369 describe proteínas de unión al PD-1.
Por lo tanto, existe una función importante para la vía de PD-1/PD-L1 en controlar las respuestas inmunitarias. La disfunción de la transducción de señales de PD-1/PD-L1 parece estar correlacionada con el inicio y el desarrollo de enfermedades, tales como el cáncer y la infección viral. El análisis de animales con desactivación génica ha conducido al entendimiento de las funciones de PD-1 principalmente en inducir y regular la tolerancia periférica. Por lo tanto, el bloqueo terapéutico de la vía de PD-1 sería útil en vencer la tolerancia inmunitaria y en el tratamiento del cáncer o infección, así como en el refuerzo de la inmunidad durante la vacunación (ya sea profiláctica o terapéutica). Existe una necesidad en la técnica de métodos mejorados para bloquear la vía de PD-1.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define según las reivindicaciones adjuntas. Los siguientes aspectos no son reivindicados y se presentan únicamente para fines de ilustración. En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen al receptor 1 de muerte programada (PD-1). En algunos aspectos, los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unen a PD-1 humana. En algunos aspectos, los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos se unen a PD-1 y bloquean la unión de PD-L1 y/o PD-L2 a PD-1. En aspectos adicionales, los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos de los mismos se unen a PD-1 y alteran la vía de PD-1/PD-L1 o PD1/PD-L2. En un aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo es un anticuerpo monoclonal, scFv, fragmento Fab, fragmento Fab', fragmento F(ab)', anticuerpo biespecífico, inmunoconjugado, o una combinación de los mismos.
En un aspecto, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo del mismo comprende una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera según SEQ ID NO: 115, 116, 117, respectivamente, y una CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada según SEQ ID NO: 110, 111, y 112, respectivamente.
En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos anti-PD-1 que comprenden una cadena ligera variable de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 7A4 y 7A4D y una cadena pesada variable del anticuerpo 7A4. Por lo tanto, en un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 133 y una región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 131; o una región variable de la cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 152 y una región variable de la cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 131.
En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera según SEQ ID NO: 133 y un aminoácido de la región variable de la cadena pesada según SEQ ID NO: 131; o que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera según SEQ ID NO: 152 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada según SEQ ID NO: 131; en donde el anticuerpo anti-PD-1 tiene una CE50 de unión al PD-1 de aproximadamente 200 ng/ml o menos, o aproximadamente 150 ng/ml o menos, o aproximadamente 100 ng/ml o menos, o aproximadamente 80 ng/ml o menos, o aproximadamente 60 ng/ml o menos, como se mide por ELISA o FACS. En otro aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera según SEQ ID NO: 133 y un aminoácido de la región variable de la cadena pesada según SEQ ID NO: 131; o que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera según SEQ ID NO: 152 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada según SEQ ID NO: 131; en donde el anticuerpo anti-PD-1 tiene una CI50 de bloqueo del PD-L1 de aproximadamente 1000 ng/ml o menos, o aproximadamente 800 ng/ml o menos, o aproximadamente 600 ng/ml o menos, o aproximadamente 500 ng/ml o menos, o aproximadamente 400 ng/ml o menos, o aproximadamente 300 ng/ml o menos, o aproximadamente 200 ng/ml o menos, o aproximadamente 100 ng/ml o menos, o aproximadamente 60 ng/ml o menos, o aproximadamente 30 ng/ml o menos, o aproximadamente 25 ng/ml o menos, o aproximadamente 20 ng/ml o menos, o aproximadamente 10 ng/ml o menos, como se mide por ELISA o FACS. En otro aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 proporcionado en el presente documento es un anticuerpo humanizado que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera según SEQ ID NO: 133 y un aminoácido de la región variable de la cadena pesada según SEQ ID NO: 131; o que tiene una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera según SEQ ID NO: 152 y una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada según SEQ ID NO: 131; en donde el anticuerpo anti-PD-1 tiene una afinidad por PD-1 de aproximadamente 1 nM o menos, o aproximadamente 0,5 nM o menos, o aproximadamente 0,1 nM o menos, o aproximadamente 0,05 nM o menos. En un aspecto particular, el anticuerpo anti-PD-1 humanizado tiene una afinidad por PD-1 de aproximadamente 0,1 nM.
En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos de los mismos proporcionados se unen a PD-1 en linfocitos T, alterando la interacción PD-1/PD-L1 y produciendo un aumento en la activación de linfocitos T. En un aspecto adicional, los anticuerpos y fragmentos de los mismos se unen a PD-1 y producen un aumento en la proliferación de linfocitos T y/o la producción de citocinas. En aún un aspecto adicional, los anticuerpos y fragmentos de los mismos se unen a PD-1 y producen un aumento de una o más citocinas seleccionadas del grupo que consiste en IL-2, IPNy, TNF, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, IL-13, IL-17 y GM-CSF. Por lo tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de modulación de una respuesta inmunitaria que comprenden poner en contacto linfocitos T con el anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo. En un aspecto, la modulación de una respuesta inmunitaria por los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos proporcionados en el presente documento se puede medir en una reacción de linfocitos mixtos (MLR). En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 proporcionados en el presente documento aumentan el nivel de producción de citocinas de linfocitos en una MLR. En un aspecto adicional, los anticuerpos anti-PD-1 aumentan el nivel de producción de IL-2 y/o producción de IPNy en una MLR. En todavía un aspecto adicional, los anticuerpos anti-PD-1 aumentan el nivel de producción de IL-2 y producción de IPNy en una MLR. En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 potencian las respuestas de memoria de linfocitos T. En un aspecto adicional, los anticuerpos anti-PD-1 potencian las respuestas de memoria de linfocitos T como se mide por un aumento en la producción de IPNy de linfocitos T de memoria.
La presente invención también proporciona polinucleótidos aislados que codifican los anticuerpos y fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento. También están englobados en la invención vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos aislados y células hospedadoras que comprenden dichos vectores de expresión.
En una realización, la presente invención proporciona inmunoconjugados de anticuerpos anti-PD-1. Por lo tanto, la presente invención proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a PD-1 y que se une o conjuga con un agente terapéutico. Los agentes terapéuticos que se pueden unir o conjugar con el anticuerpo anti-PD-1 pueden incluir, pero no se limitan a, fármacos citotóxicos, isótopos radiactivos, inmunomoduladores o anticuerpos.
En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones que comprenden uno o más anticuerpos anti-PD-1 o fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo proporcionado en el presente documento para su uso en un método de tratamiento del cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de la invención. En una realización adicional, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, leucemia, melanoma, glioma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de huesos, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer rectal, cáncer testicular, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de tiroides, cáncer tímico, cáncer epitelial, cáncer de cabeza o cuello, cáncer gástrico, cáncer pancreático, o una combinación de los mismos.
En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo proporcionado en el presente documento para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad infecciosa en un sujeto en necesidad del mismo, que comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento de la invención. En una realización adicional, la enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en candidiasis, candidemia, aspergilosis, neumonía estreptocócica, afecciones cutáneas estreptocócicas y bucofaríngeas, septicemia por gramnegativos, tuberculosis, mononucleosis, gripe, enfermedades respiratorias provocadas por el virus respiratorio sincitial, malaria, esquistosomiasis y tripanosomiasis.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Las Figuras 1A y 1B son gráficos que muestran el bloqueo del ligando de PD-1, PD-L1 y PD-L2, que se une a PD-1 por anticuerpos anti-PD-1 murinos como se mide por FACS. La Figura 1A muestra el bloqueo de la unión de PD-L1 por anticuerpos anti-PD-1 murinos y la Figura 1B muestra el bloqueo de la unión de PD-L2 por anticuerpos anti-PD-1 murinos. Los paneles superiores de la Figura 1A y Figura 1B muestran la MFI durante un intervalo de concentraciones de anticuerpo. Las CI50 de bloqueo para los anticuerpos anti-PD-1 se muestran en los paneles de la Figura 1A y Figura 1B.
La Figura 2 es un gráfico que muestra la producción de IL-2 (pg/ml) en una MLR en respuesta a diferentes concentraciones de anticuerpos anti-PD-1 murinos. Los anticuerpos anti-PD-1 probados fueron, de izquierda derecha, mIgG1 de control, 22A5-mIgG1, 6E1-mIgG1, 10D1-mIgG1, 4C10-mIgG1, 7D3-mIgG1, 13F1-mIgG1, 14A6-mIgG1, 15H5-mIgG1, 5A8-mIgG1 y 7A4-mIgG1. Como se muestra en el eje x, cada anticuerpo se probó a 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 3 es un gráfico que muestra la producción de IFN-y (pg/ml) en una MLR en respuesta a diferentes concentraciones de anticuerpos anti-PD-1 murinos. Los anticuerpos anti-PD-1 probados fueron, de izquierda a derecha, mIgG1 de control, 22A5-mIgG1, 6E1-mIgG1, 10D1-mIgG1,4C10-mIgG1, 7D3-mIgG1, 13F1-mIgG1, 14A6-mIgG1, 15H5-mIgG1, 5A8-mIgG1 y 7A4-mIgG1. Como se muestra en el eje x, cada anticuerpo se probó a 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 4 es un gráfico que muestra la producción de IL-2 (pg/ml) en una MLR en respuesta a diferentes concentraciones de anticuerpos anti-PD-1 quiméricos. Los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos probados fueron, de izquierda a derecha, hIgG4 de control, 4C10-hIgG4 quimérico, 6E1-hIgG4 quimérico, 7A4-hIgG4 quimérico, 13F1-hIgG4 quimérico, 15H5-hIgG4 quimérico, 22A5-hIgG4 quimérico y 7D3-hIgG4 quimérico. Como se muestra en el eje x, cada anticuerpo se probó a 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 5 es un gráfico que muestra la producción de IFN-y (pg/ml) en una MLR en respuesta a diferentes concentraciones de anticuerpos anti-PD-1 quiméricos. Los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos probados fueron, de izquierda a derecha, hIgG4 de control, 4C10-hIgG4 quimérico, 6E1-hIgG4 quimérico, 7A4-hIgG4 quimérico, 13F1-hIgG4 quimérico, 15H5-hIgG4 quimérico, 22A5-hIgG4 quimérico y 7D3-hIgG4 quimérico. Como se muestra en el eje x, cada anticuerpo se probó a 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 6 muestra la CE50 de unión de anticuerpos anti-PD-1 13F1 humanizado (Figura 6A) y 7A4 humanizado (Figura 6B) como se mide por ELISA. El panel superior de la Figura 6A muestra la absorbancia a lo largo de un intervalo de concentraciones de 13F1 quimérico, 13F1-hIgG1 humanizado (h13F1-IgG1), 13F1-hIgG4 humanizado (h13F1-IgG4) o hIgG4 de control. El panel inferior de la Figura 6A muestra la CE50 calculada de cada uno de los anticuerpos de prueba. El panel superior de la Figura 6B muestra la absorbancia a lo largo de un intervalo de concentraciones de 7A4-hIgG1 quimérico, 7A4-hIgG4 quimérico, 784-hIgG1 humanizado (h7A4hIgG1), 7A4-hIgG4 humanizado (h7A4hIgG4) o hIgG4 de control. El panel inferior de la Figura 6B muestra la CE50 calculada de cada uno de los anticuerpos de prueba.
La Figura 7 muestra la CE50 de unión de anticuerpos anti-PD-1 13F1 humanizado (Figura 7A) y 7A4 humanizado (Figura 7B) como se mide por FACS. El panel superior de la Figura 7A muestra la intensidad media de fluorescencia (MFI) a lo largo de un intervalo de concentraciones de hIgG4 de control, 13F1-hIgG4 quimérico, 13F1-hIgG1 humanizado (h13F1-hIgG1) o 13F1-hIgG4 humanizado (h13F1-hIgG4). El panel inferior de la Figura 7A muestra la CE50 calculada de cada uno de los anticuerpos de prueba. El panel superior de la Figura 7B muestra la MFI a lo largo de un intervalo de concentraciones de hIgG4 de control, 7A4- hIgG4 quimérico, 7A4-quimérico-IgG1 quimérico, 7A4-IgG4 humanizado (h7A4-hIgG4) o 7A4-IgG1 humanizado (h7A4-hIgG1). El panel inferior de la Figura 7B muestra la CE50 calculada de cada uno de los anticuerpos de prueba.
La Figura 8 muestra el bloqueo de la unión de PD-L1 por anticuerpos anti-PD-1 13F1 humanizado (Figura 8A) y 7A4 humanizado (Figura 8B) como se mide por ELISA. La Figura 8A muestra la absorbancia a lo largo de un intervalo de concentraciones de hIgG4 de control, 13F1 quimérico, 13F1 -h IgG 1 humanizado o 13F1 -hIgG4 humanizado. La Figura 8B muestra la absorbancia a lo largo de un intervalo de concentraciones de hIgG4 de control, 7A4-hIgG1 quimérico, 7A4-hIgG4 quimérico, 784-hIgG1 humanizado o 7A4-hIgG4 humanizado. La Figura 8C muestra la CI50 de bloqueo de PD-L1 calculada de los anticuerpos 13F1 y 7A4 quiméricos y humanizados.
La Figura 9 muestra el bloqueo de la unión de PD-L1 por anticuerpos 13F1 y 7A4 humanizados como se mide por FACS. El panel superior de la Figura 9 muestra la MFI a lo largo de un intervalo de concentraciones de anticuerpo. La CI50 de bloqueo para los anticuerpos humanizados se muestra en el panel inferior de la Figura 9.
La Figura 10 muestra los datos de unión para anticuerpos monoclonales humanizados contra PD-1 h13F1 (panel izquierdo superior) y h7A4 (panel derecho superior), como se mide por el ensayo Biacore. El panel inferior proporciona los datos de unión cuantificados como se mide por el ensayo Biacore.
La Figura 11 es un gráfico que muestra la producción de IL-2 (pg/ml) en una reacción MLR en presencia de hIgG4 de control, 13F1-mIgG1 murino (13F1-mIgG1), 13F1-hIgG1 humanizado, 13F1-hIgG4 humanizado o 7A4-hIgG4 quimérico en las siguientes concentraciones: 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 12 es un gráfico que muestra la producción de IFN-y (pg/ml) en una reacción MLR en presencia de hIgG4 de control, 13F1-mIgG1 murino (13F1-mIgG1), 13F1 -hIgG 1 humanizado, 13F1-hIgG4 humanizado o 7A4-hIgG4 quimérico en las siguientes concentraciones: 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 13 es un gráfico que muestra la producción de IL-2 (pg/ml) en una reacción MLR en presencia de hIgG4 de control, 7A4-hIgG1 quimérico, 7A4-hIgG4 quimérico, 7A4-hIgG1 humanizado o 7A4-hIgG4 humanizado en las siguientes concentraciones: 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 14 es un gráfico que muestra la producción de IFN-y (pg/ml) en una reacción MLR en presencia de hIgG4 de control, 7A4-hIgG1 quimérico, 7A4-hIgG4 quimérico, 7A4-hIgG1 humanizado o 7A4-hIgG4 humanizado en las siguientes concentraciones: 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 15 muestra el efecto de anticuerpos anti-PD-1 humanizados sobre las respuestas de memoria de linfocitos T recordados por la toxina tetánica, como se mide por la producción de IFN-y (pg/ml). Se probaron los anticuerpos hIgG4 de control negativo, 13F1 -hIgG 1 humanizado, 13F1-hIgG4 humanizado, 7A4-hIgG1 humanizado y 7A4-hIgG4 humanizado en las siguientes concentraciones: 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 16 muestra la producción de IFN-y (pg/ml) de linfocitos T en respuesta a la coestimulación con DC autólogas y anticuerpo anti-CD3, en presencia de 10 pg/ml de anticuerpos anti-PD-1 humanizados (h13F1-hIgG1, h13F1-hIgG4, h7A4-hIgG1 o h7A4-hIgG4), anticuerpo de control de isotipo (hIgG4), o sin anticuerpo.
Las Figuras 17A y 17B muestran los datos de unión basados en Biacore (Figura 17A) y el bloqueo basado en FACS (Figura 17B) para anticuerpos monoclonales humanizados contra PD-1 h7A4 y h7A4D. Para la Figura 17A, arriba izquierda indica h7A4 y arriba derecha indica 7A4D, y el panel inferior de la Figura 17A proporciona los datos de unión cuantificada como se mide por análisis Biacore. La Figura 17B indica la CI50 de bloqueo de la unión de PD-L1 a células 293T-PD1 por el anticuerpo 7A4D-hIgG4.
La Figura 18 es un gráfico que muestra la producción de IL-2 (pg/ml) en una reacción MLR en presencia de hIgG4 de control, 7A4-hIgG4 humanizado o 7A4D-hIgG4 humanizado en las siguientes concentraciones: 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
La Figura 19 es un gráfico que muestra la producción de IFN-y (pg/ml) en una reacción MLR en presencia de hIgG4 de control, 7A4-hIgG4 humanizado o 7A4D-hIgG4 humanizado en las siguientes concentraciones: 20 pg/ml, 2 pg/ml, 0,2 pg/ml, 0,02 pg/ml y 0,002 pg/ml.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
El receptor 1 de muerte programada (PD-1) es un receptor del punto de regulación del sistema inmunitario. Se expresa principalmente en linfocitos T y B activados, pero también ocurre en monocitos y linfocitos T doble negativo CD4-CD8-y células NK-T en el desarrollo tímico (Agata et al., supra; Okazaki et al. (2002) Curr. Opin. Immunol. 14: 391779­ 82; Bennett et al. (2003) J Immunol 170:711-8). El Pd -1 tiene dos ligandos, PD-L1 y PD-L2. Se ha mostrado que la interacción de PD-1 con cualquiera de los dos ligandos atenúa las respuestas de linfocitos T in vitro e in vivo, que pueden, sin embargo, ser invertidas inhibiendo la interacción local de PD-1 con PD-L1, y el efecto es aditivo cuando se bloquea también la interacción de PD-1 con PD-L2 (Iwai et al. (2002) Proc. Nat'l. Acad Sci. USA 99: 12293-7; Brown et al. (2003) J. Immunol. 170:1257-66).
Se ha encontrado que PD-1 tiene una correlación con el crecimiento y el desarrollo del cáncer debido a su función en proteger las células tumorales de la eficiente destrucción inmunitaria. Se ha revelado que su ligando, PD-L1, tiene una expresión significativa en varios tumores de ratón y humanos, que se propone que media en la evasión inmunitaria (Iwai, Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 12293-12297 (2002); Strome S. E. et al., Cancer Res., 63:6501-6505 (2003); Dong et al. (2002) Nat. Med. 8:787-9). En seres humanos, se ha encontrado la expresión de PD-1 (en linfocitos infiltrantes de tumor) y/o PD-L1 (en células tumorales) en varias biopsias de tumor primario como se evalúa por inmunohistoquímica. Dichos tejidos incluyen cánceres de pulmón, hígado, ovario, cuello uterino, piel, colon, glioma, vejiga, mama, riñón, esófago, estómago, de células escamosas bucales, de células uroteliales y de páncreas, así como tumores de cabeza y cuello (Brown J. A.et al., J. Immunol. 170: 1257-1266 (2003); Dong H. et al., Nat. Med. 8: 793-800 (2002); Wintterle et al., Cancer Res. 63:7462-7467 (2003); Strome S. E. et al., Cancer Res., 63: 6501-6505 (2003); Thompson R. H. et al., Cancer Res. 66: 3381-5(2006); Thompson et al., Clin. Cancer Res. 13: 1757-61(2007); Nomi T. et al., Clin. Cancer Res. 13: 2151-7. (2007)). Más sorprendentemente, la expresión de ligandos de PD-1 en células tumorales se ha correlacionado con un mal pronóstico de pacientes con cáncer en múltiples tipos de tumores (revisado en OkaZaki y Honjo, Int. Immunol. 19: 813-824 (2007)).
Mientras que la interacción entre PD-1 y PD-L1 produce una disminución en los linfocitos infiltrantes de tumor, una disminución en la proliferación mediada por receptores de linfocitos T y la evasión inmunitaria por las células cancerosas (Dong et al. (2003) J. Mol. Med. 81:281-7; Blank et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54:307-314; Konishi et al. (2004) Clin. Cancer Res. 10:5094-100), se mostró, por consiguiente, que el bloqueo de la interacción PD-1/PD-L1 potenció la inmunidad de linfocitos T específica de tumor y fue útil en la depuración de células tumorales por el sistema inmunitario. En un modelo murino de cáncer pancreático de gran malignidad, por ejemplo, Nomi T., et al. (Clin. Cancer Res. 13: 2151-2157, 2007) mostraron la eficacia terapéutica del bloqueo de PD-1/PD-L1. La administración de anticuerpo dirigido contra PD-1 o PD-L1 inhibió significativamente el crecimiento tumoral. El bloqueo del anticuerpo promovió eficazmente la infiltración de linfocitos T CD8+ reactivos con el tumor en el tumor, produciendo la regulación por incremento de efectores antitumorales que incluían IFN-y, granzima B y perforina. Además, los autores mostraron que el bloqueo de PD-1 se puede combinar eficazmente con quimioterapia dando un efecto sinérgico. En otro estudio, usando un modelo de carcinoma de células escamosas en ratones, el bloqueo de los anticuerpos de PD-1 o PD-L1 inhibió significativamente el crecimiento tumoral (Tsushima F. et al., Oral Oncol. 42:268-274 (2006)).
Además, la transfección de una línea de mastocitoma murino con PD-L1 condujo a la reducción de la lisis de las células tumorales cuando se cocultivó con un clon de CTL específico de tumor. La lisis se restauró cuando el mAb anti-PD-L1 se añadió (Iwai Y. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 12293-12297 (2002)). In vivo, se mostró que el bloqueo de la interacción PD1/PD-L1 aumentaba la eficacia de la terapia de transferencia adoptiva de linfocitos T en un modelo de tumor de ratón (Strome S. E. et al., Cancer Res. 63:6501-6505 (2003)). Pruebas adicionales para la función de PD-1 en el tratamiento del cáncer proceden de experimentos realizados con ratones con desactivación génica en PD-1. Las células de mieloma que expresan PD-L1 crecieron solo en animales genéticamente intactos (produciendo el crecimiento tumoral y la muerte asociada del animal), pero no en ratones deficientes en PD-1 (Iwai Y., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 12293-12297(2002)). En estudios humanos, R. M. Wong et al. (Int. Immunol. 19:1223-1234 (2007)) mostraron que el bloqueo de PD-1 usando un anticuerpo anti-PD-1 completamente humano aumentó las cifras absolutas de linfocitos T CD8+ (CTL) específicos de tumor en los ensayos de estimulación ex vivo usando antígenos de vacuna y células de individuos vacunados. En un estudio similar, el bloqueo de anticuerpos de PD-L1 produjo una actividad citolítica potenciada de linfocitos T citotóxicos específicos de antígeno asociados a tumor y la elevada producción de citocinas por linfocitos TH específicos de tumor (Blank C. et al., Int. J. Cancer 119: 317-327 (2006)). Los mismos autores mostraron que el bloqueo de PD-L1 aumenta las respuestas de linfocitos T específicas de tumor in vitro cuando se usan en combinación con bloqueo anti-CTLA-4. En general, la vía PD-1/PD-L1 es una diana para el desarrollo de anticuerpos terapéuticos para el tratamiento del cáncer. Los anticuerpos anti-PD-1 también pueden ser útiles en infección viral crónica. Los linfocitos T CD8+ de memoria generados después de una infección vírica aguda son altamente funcionales y constituyen un componente importante de inmunidad protectora. A diferencia, las infecciones crónicas se caracterizan frecuentemente por grados variables de deterioro funcional (agotamiento) de respuestas de linfocitos T específicos de virus, y este defecto es un motivo principal para la incapacidad del hospedador para eliminar el patógeno persistente. Aunque los linfocitos T efectores funcionales se generan inicialmente durante las fases tempranas de la infección, gradualmente pierden la función durante el transcurso de una infección crónica. Barber et al. (Barber et al., Nature 439: 682-687 (2006)) mostraron que los ratones infectados con una cepa de laboratorio de LCMV desarrollaron infección crónica, produciendo elevados niveles de virus en la sangre y otros tejidos. Estos ratones desarrollaron inicialmente una robusta respuesta de linfocitos T, pero con el tiempo sucumbieron a la infección tras el agotamiento de los linfocitos T. Los autores encontraron que la disminución en el número y la función de linfocitos T efectores en ratones crónicamente infectados podría ser invertida inyectando un anticuerpo que bloqueara la interacción entre PD-1 y PD-L1.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos o fragmentos de unión al antígeno de los mismos que se unen a muerte celular programada 1 (PD-1). PD-1. En un aspecto, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a PD-1 humana. En otro aspecto, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a PD-1 humana y de macaco cangrejero. En otro aspecto, los anticuerpos o fragmentos de los mismos bloquean la interacción de PD-1 en linfocitos T con su ligando PD-L1. En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de preparación y uso de los anticuerpos anti-PD-1 o fragmentos de los mismos, y composiciones que comprenden anticuerpos anti-PD-1 o fragmentos de los mismos, que incluyen composiciones farmacéuticas.
Como se usa en el presente documento, el término "anticuerpo" se refiere a una proteína de unión que tiene al menos un dominio de unión al antígeno. Los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención pueden ser anticuerpos completos o cualquier fragmento de los mismos. Por lo tanto, los anticuerpos y fragmentos de la invención incluyen anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos y variantes de anticuerpo o fragmentos de las mismas, así como inmunoconjugados. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)', fragmentos Fv, regiones CDR aisladas, moléculas Fv de cada única (scFv) y otros fragmentos de anticuerpos conocidos en la técnica. Los anticuerpos y los fragmentos de los mismos también pueden incluir polipéptidos recombinantes, proteínas de fusión y anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos de los mismos desvelados en el presente documento pueden ser de un isotipo de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4. El término "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo codificada por la región constante de la cadena pesada genes. En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos de los mismos desvelados en el presente documento son de isotipo IgG1 o IgG4. Los anticuerpos contra PD-1 y fragmentos de los mismos de la presente invención pueden derivar de cualquier especie que incluye, pero no se limita a, ratón, rata, conejo, primate, llama y humano. Los anticuerpos contra PD-1 y fragmentos de los mismos pueden ser anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos. En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 son anticuerpos murinos. En otro aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 son anticuerpos quiméricos. En un aspecto adicional, los anticuerpos quiméricos son anticuerpos quiméricos de ratónhumano. En otro aspecto, los anticuerpos derivan de ratones y se humanizan.
Un "anticuerpo quimérico" es un anticuerpo que tiene al menos una porción de la región variable de la cadena pesada y al menos una porción de la región variable de la cadena ligera derivada de una especie; y al menos una porción de una región constante derivada de otra especie. Por ejemplo, en un aspecto, un anticuerpo quimérico puede comprender regiones variables murinas y una región constante humana.
Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que contiene regiones determinantes de la complementariedad (CDR) que derivan de un anticuerpo no humano; y regiones estructurales, así como regiones constantes que derivan de un anticuerpo humano. Por ejemplo, los anticuerpos anti-PD-1 proporcionados en el presente documento pueden comprender CDR derivadas de uno o más anticuerpos murinos y regiones estructurales y constantes humanas. Por lo tanto, en un aspecto, el anticuerpo humanizado proporcionado en el presente documento se une al mismo epítope en PD-1 que el anticuerpo murino del que derivan las CDR del anticuerpo. Se proporcionan en el presente documento anticuerpos humanizados a modo de ejemplo. Los anticuerpos anti-PD-1 adicionales que comprenden las CDR de cadena pesada y ligera proporcionadas en el presente documento, o variantes de las mismas, se pueden generar usando cualquier secuencia de la región estructural humana, y también están englobados en la presente divulgación. En un aspecto, las secuencias de la región estructural adecuadas para su uso en la presente divulgación incluyen las secuencias de la región estructural que son estructuralmente similares a las secuencias de la región estructural proporcionadas en el presente documento. Se pueden hacer modificaciones adicionales en las regiones estructurales para mejorar las propiedades de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Dichas modificaciones adicionales de la región estructural pueden incluir modificaciones químicas; mutaciones puntuales para reducir la inmunogenicidad o retirar los epítopes de linfocitos T; o retromutación al residuo en la secuencia original de la estirpe germinal.
En algunos aspectos, dichas modificaciones de la región estructural incluyen las correspondientes a las mutaciones ejemplificadas en el presente documento, que incluyen retromutaciones a la secuencia de estirpe germinal. Por ejemplo, en un aspecto, uno o más aminoácidos en las regiones estructurales humanas de VH y/o VL de los anticuerpos humanizados proporcionados en el presente documento se retromutan al aminoácido correspondiente en el anticuerpo murino parental. Como un ejemplo, como para VH y VL de 7A4 y 13F1, varios sitios del aminoácido de la región estructural del anticuerpo humano de molde anteriormente mencionado se retromutaron a las secuencias de aminoácidos correspondientes en el anticuerpo 7A4 y 13F1 de ratón. En un aspecto, el aminoácido en las posiciones 40 y/o 45 y/o 70 y/o 72 de la región variable de la cadena ligera se retromuta al aminoácido correspondiente encontrado en esa posición en la región variable de la cadena ligera de 7A4 o 13F1 de ratón. En otro aspecto, el aminoácido en las posiciones 2 y/o 26 y/o 46 y/o 48 y/o 49 y/o 67 y/o 70 y/o 71 de la región variable de la cadena pesada se retromuta al aminoácido correspondiente encontrado en esa posición en la región variable de la cadena pesada de 7A4 o 13F1 de ratón. En un aspecto, el anticuerpo humanizado 7A4 comprende una región variable de la cadena ligera en donde el aminoácido en la posición 40 está mutado de Tyr (Y) a Phe (F) y el aminoácido en la posición 72 está mutado de Gly (G) a Arg (R); y una región variable de la cadena pesada en donde el aminoácido en la posición 2 está mutado de Val (V) a Ile (I), el aminoácido en la posición 46 está mutado de Glu (E) a Lys (K), y el aminoácido en la posición 70 está mutado de Phe (F) a Ile (I). En un aspecto, el anticuerpo 13F1 humanizado comprende una región variable de la cadena ligera en donde el aminoácido en la posición 45 está mutado de Leu (L) a Pro (P) y el aminoácido en la posición 70 está mutado de Phe (F) a Tyr (Y); y una región variable de la cadena pesada en donde el aminoácido en la posición 26 está mutado de Gly (G) a Tyr (Y), el aminoácido en la posición 48 está mutado de Ile (I) a Met (M), el aminoácido en la posición 49 está mutado de Gly (G) a Ala (A), el aminoácido en la posición 67 está mutado de Val (V) a Ile (I), y el aminoácido en la posición 71 está mutado de Val (V) a Arg (R). Se pueden hacer retromutaciones adicionales o alternas en las regiones estructurales de los anticuerpos humanizados proporcionados en el presente documento para mejorar las propiedades de los anticuerpos.
La presente divulgación también engloba anticuerpos humanizados que se unen a PD-1 y comprenden modificaciones de la región estructural correspondientes a las modificaciones a modo de ejemplo descritas en el presente documento con respecto a cualquier secuencia adecuada de la región estructural, así como otras modificaciones de la región estructural que de otro modo mejoran las propiedades de los anticuerpos. Por ejemplo, en algunos aspectos, los anticuerpos proporcionados en el presente documento comprenden una o más mutaciones para retirar uno o más sitios de desamidación o uno o más sitios de oxidación. Por ejemplo, en un aspecto, los anticuerpos proporcionados en el presente documento comprenden una mutación de uno o más restos de asparagina para retirar uno o más sitios de desamidación; y/o la mutación de uno o más restos de metionina para retirar uno o más sitios de oxidación.
En otros aspectos, los anticuerpos proporcionados en el presente documento comprenden una o más mutaciones para mejorar la estabilidad, mejorar la solubilidad, alterar la glucosilación y/o reducir la inmunogenicidad, tales como, por ejemplo, por cambios de aminoácidos seleccionados que reducen la desamidación u oxidación, reducen la isomerización, optimizan el núcleo hidrófobo y/o cargan restos de grupos, retiran restos hidrófobos de la superficie, optimizan restos implicados en las interfases entre las cadenas pesadas variables y ligeras variables, y/o modifican el punto isoeléctrico.
Como se usa en el presente documento, el término "derivado", cuando se usa para referirse a una molécula o polipéptido con respecto a un anticuerpo de referencia u otra proteína de unión, significa una molécula o polipéptido que es capaz de unirse con especificidad al mismo epítope que el anticuerpo de referencia u otra proteína de unión.
Los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos desvelados en el presente documento son específicos para PD-1. En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos son específicos para PD-1 humana. En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos proporcionados en el presente documento se unen a PD-1 humana o de primate, pero no a PD-1 de cualquier otro mamífero. En un aspecto adicional, los anticuerpos y fragmentos de los mismos no se unen a PD-1 de ratón. Los términos "PD-1 humana", "hPD-1" y "huPD-1" y similares se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a PD-1 humana y variantes o isoformas de PD-1 humana. Por "específico para" se indica que los anticuerpos y fragmentos de los mismos se unen al receptor de PD-1 con mayor afinidad que cualquier otra diana. En un aspecto, los anticuerpos contra PD-1 y fragmentos proporcionados en el presente documento son específicos para PD-1 y no reaccionan de forma cruzada con CTLA4, ICOS o CD28. Como se usa en el presente documento, el término "CE50" se refiere a la concentración eficaz, 50% de respuesta máxima del anticuerpo. Como se usa en el presente documento, el término "CI50" se refiere a la concentración inhibidora, 50 % de respuesta máxima del anticuerpo. Tanto CE50 como CI50 se pueden medir por análisis de ELISA o FACS, o cualquier otro método conocido en la técnica.
En un aspecto, los anticuerpos anti-PDl y fragmentos o variantes de los mismos tienen una afinidad (KD) para PD-1 en el intervalo de aproximadamente 0,001 nM a aproximadamente 100 nM, aproximadamente 0,002 nM a aproximadamente 50 nM, aproximadamente 0,005 nM a aproximadamente 5 nM, aproximadamente 0,01 nM a aproximadamente 1 nM, o aproximadamente 0,05 nM a aproximadamente 0,1 nM. En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos tienen una afinidad (KD) para PD-1 de aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos, aproximadamente 20 nM o menos, aproximadamente 15 nM o menos, aproximadamente 10 nM o menos, aproximadamente 8 nM o menos, aproximadamente 6 nM o menos, aproximadamente 4 nM o menos, aproximadamente 2 nM o menos, aproximadamente 1 nM o menos, aproximadamente 0,9 nM o menos, aproximadamente 0,8 nM o menos, aproximadamente 0,7 nM o menos, aproximadamente 0,6 nM o menos, aproximadamente 0,5 nM o menos, aproximadamente 0,4 nM o menos, aproximadamente 0,3 nM o menos, aproximadamente 0,2 nM o menos, aproximadamente 0,1 nM o menos, aproximadamente 0,09 nM o menos, aproximadamente 0,08 nM o menos, aproximadamente 0,07 nM o menos, aproximadamente 0,06 nM o menos, aproximadamente 0,05 nM o menos, aproximadamente 0,04 nM o menos, aproximadamente 0,03 nM o menos, aproximadamente 0,02 nM o menos, aproximadamente 0,01 nM o menos, aproximadamente 0,009 nM o menos, aproximadamente 0,008 nM o menos, aproximadamente 0,007 nM o menos, aproximadamente 0,006 nM o menos, aproximadamente 0,005 nM o menos, aproximadamente 0,004 nM o menos, aproximadamente 0,003 nM o menos, aproximadamente 0,002 nM o menos, o aproximadamente 0,001 nM o menos. En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos tienen una afinidad (KD) para PD-1 de aproximadamente 10 nM, aproximadamente 9 nM, aproximadamente 8 nM, aproximadamente 7 nM, aproximadamente 6 nM, aproximadamente 5 nM, aproximadamente 4 nM, aproximadamente 3 nM, aproximadamente 2 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 0,9 nM, aproximadamente 0,8 nM, aproximadamente 0,7 nM, aproximadamente 0,6 nM, aproximadamente 0,5 nM, aproximadamente 0,4 nM, aproximadamente 0,3 nM, aproximadamente 0,2 nM, aproximadamente 0,1 nM, aproximadamente 0,09 nM, aproximadamente 0,08 nM, aproximadamente 0,07 nM, aproximadamente 0,06 nM, aproximadamente 0,05 nM, aproximadamente 0,04 nM, aproximadamente 0,03 nM, aproximadamente 0,02 nM, aproximadamente 0,01 nM, aproximadamente 0,009 nM, aproximadamente 0,008 nM, aproximadamente 0,007 nM, aproximadamente 0,006 nM, aproximadamente 0,005 nM, aproximadamente 0,004 nM, aproximadamente 0,003 nM, aproximadamente 0,002 nM, o aproximadamente 0,001.
En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos proporcionados en el presente documento comprenden una cadena ligera y una cadena pesada, cada una de las cuales comprende tres regiones CDR. Las secuencias de cadena ligera a modo de ejemplo de CDR (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) para los anticuerpos contra PD-1 de la divulgación se proporcionan a continuación en la Tabla 1. Las secuencias de CDR de cadena pesada a modo de ejemplo (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) para anticuerpos contra PD-1 de la divulgación se proporcionan a continuación en la Tabla 2. Las regiones variables a modo de ejemplo y las secuencias completas de anticuerpos para anticuerpos contra PD-1 de la divulgación se proporcionan a continuación en la Tabla 3.
Tabla 1. Secuencias de CDR de la cadena ligera
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Tabla 2. Secuencias de CDR de la cadena pesada
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En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos anti-PD-1 que comprenden las CDR de la cadena ligera y las CDR de la cadena pesada de los anticuerpos 10D1,4C10, 7D3, 13F1, 15h 5, 14A6, 22A5, 6E1,5A8 y/o 7A4. El experto en la técnica entenderá que las CDR de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos proporcionados en el presente documento se pueden seleccionar independientemente, o mezclar y emparejar, para formar un anticuerpo o fragmento de unión del mismo que comprende cualquier CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera; y cualquier CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por lo tanto, la divulgación proporciona anticuerpos anti-PD-1 que comprenden una CDR1 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 24, 34, 45, 55, 65, 75, 85, 95, 105 y 115; una CDR2 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 25, 35, 46, 56, 66, 76, 86, 96, 106 y 116; una CDR3 de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 26, 36, 47, 57, 67, 77, 87, 97, 107 y 117; una CDR1 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 19, 29, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 y 110; una CDR2 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 20, 30, 41, 51, 61,71,81, 91, 101 y 111; y una CDR3 de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 21,31,42, 52, 62, 72, 82, 92, 102 y 112. En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-PD-1 que comprenden regiones CDR de la cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen al menos 75 %, al menos 80 %, al menos al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de homología con las CDR1, CDR2, o CDR3 de la cadena ligera o pesada correspondiente proporcionadas en el presente documento. En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-PD-1 que comprenden regiones CDR de la cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que tienen 1,2, 3, 4, 5 o 6 sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos con respecto a las CDR1, CDR2, o CDR3 de la cadena ligera o pesada correspondientes proporcionadas en el presente documento.
En un aspecto, la divulgación proporciona anticuerpos anti-PD-1 que comprenden una cadena ligera variable de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 10D1,4C10, 7D3, 13F1, 15H5, 14A6, 22A5, 6E1, 5A8, 7A4 y 7A4D y una cadena pesada variable de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en 10D1,4C10, 7D3, 13F1, 15H5, 14A6, 22A5, 6E1,5A8 y 7A4. En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos proporcionados en el presente documento comprenden una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de homología con una región variable de la cadena ligera según SEQ ID NO: 23, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 133, 143 y 152. En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos proporcionados en el presente documento comprenden una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 23, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 133, 143, 152, o una variante de los mismos, en donde la variante comprende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 sustituciones o deleciones de aminoácidos, o una combinación de las mismas. En un aspecto adicional, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservativas. En otro aspecto, las sustituciones de aminoácidos mejoran las propiedades de los anticuerpos como se proporciona en el presente documento, por ejemplo, retirando un sitio de desamidación. Por ejemplo, en un aspecto, un resto de asparagina (Asn; N) está mutado. En un aspecto adicional, la Asn está mutada a ácido aspártico (Asp; D). En aún un aspecto adicional, la Asn en la posición 85 en la región estructural 3 de la región variable de la cadena ligera está mutada a Asp. En una realización, la presente divulgación proporciona un anticuerpo humanizado 7A4D, que comprende la misma secuencia de aminoácidos que el anticuerpo humanizado 7A4 excepto por una mutación en la región estructural 3 (posición 85) de la cadena ligera para retirar el sitio de desamidación.
En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos proporcionados en el presente documento comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75 %, al menos 80 %, al menos al menos 81 %, al menos 82 %, al menos 83 %, al menos 84 %, al menos 85 %, al menos 86 %, al menos 87 %, al menos 88 %, al menos 89 %, al menos 90 %, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de homología con una región variable de la cadena ligera según SEQ ID NO: 18, 28, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 131 y 141, o 84. En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos proporcionados en el presente documento comprenden una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 18, 28, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 131, 141, o una variante de los mismos, en donde la variante comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más sustituciones, inserciones o deleciones de aminoácidos, o una combinación de los mismos. En un aspecto adicional, las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservativas. En otro aspecto, las sustituciones de aminoácidos mejoran las propiedades de los anticuerpos como se proporciona en el presente documento, por ejemplo, retirando un sitio de desamidación. Por ejemplo, en un aspecto, un resto de asparagina (Asn; N) está mutado. En un aspecto adicional, la Asn está mutada a ácido aspártico (Asp; D).
Los anticuerpos anti-PD-1 desvelados en el presente documento que tienen uno o más sustituciones, inserciones, deleciones de aminoácidos, o combinación de las mismas, en la CDR o región de la cadena ligera o pesada variable retienen la actividad biológica del anticuerpo anti-PD-1 correspondientes que no tiene una sustitución, inserción o deleción de aminoácidos. Por lo tanto, los anticuerpos anti-PD-1 de variante proporcionados en el presente documento retienen la unión a PD-1. El porcentaje de homología, como se usa en el presente documento, se refiere al número de secuencias de aminoácidos idénticas compartidas por dos secuencias de referencia, dividido entre el número total de posiciones de aminoácidos, multiplicado por 100.
En algunos aspectos, los anticuerpos anti-PD-1 proporcionados en el presente documento comprenden sustituciones de aminoácidos conservativas. El experto en la técnica reconocerá que una sustitución de aminoácidos conservativa es una sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas similares, tales como, por ejemplo, una cadena lateral similar. Las sustituciones conservativas a modo de ejemplo se describen en la técnica, por ejemplo, en Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Bengamin/Cummings Publication Company, 4a ed. (1987).
El experto entenderá que las cadenas ligeras variables y pesadas variables se pueden seleccionar independientemente, o mezclar y emparejar, a partir de los anticuerpos proporcionados en el presente documento. Por lo tanto, la presente divulgación proporciona anticuerpos anti-PD-1 que comprenden una región variable de la cadena ligera que tiene al menos 80 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 23, 33, 44, 54, 64, 74, 84, 94, 104, 114, 133, 143 y 152; y una región variable de la cadena pesada que tiene al menos 80 % de homología con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 18, 28, 39, 49, 59, 69, 79, 89, 99, 109, 131 y 141.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítope que uno cualquiera de los anticuerpos a modo de ejemplo desvelados en el presente documento. Por lo tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos que compiten por la unión a PD-1 con los anticuerpos a modo de ejemplo proporcionados en el presente documento.
Los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento pueden comprender además modificaciones de la región Fc para alterar las funciones efectoras. Las modificaciones de Fc pueden ser inserciones, deleciones o sustituciones de aminoácidos, o pueden ser modificaciones químicas. Por ejemplo, las modificaciones de la región Fc se pueden hacer para aumentar o disminuir la unión al complemento, para aumentar o disminuir la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo, o para aumentar o disminuir la semivida del anticuerpo. Algunas modificaciones de Fc aumentan o disminuyen la afinidad del anticuerpo por un receptor de Fcy , tal como Fcy RI, Fcy RII, Fcy RIII o FcRn. Se han descrito en la técnica diversas modificaciones de Fc, por ejemplo, en Shields et al., J Biol. Chem 276; 6591 (2001); Tai et al. Blood 119; 2074 (2012); Spiekermann et al. J Exp. Med 196; 303 (2002); Moore et al. mAbs 2:2; 181 (2010); Medzihradsky Methods in Molecular Biology 446; 293 (2008); Mannan et al. Drug Metabolism and Disposition 35; 86 (2007); e Idusogie et al. J Immunol 164; 4178 (2000). En algunos aspectos, los patrones de glucosilación de la región Fc están alterados. En otros aspectos, la región Fc se modifica por pegilación (por ejemplo, haciendo reaccionar el anticuerpo o fragmento del mismo con polietilenglicol (PEG)).
En una realización, los anticuerpos o fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento son inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo y que comprenden además un agente seleccionado del grupo que incluye un agente terapéutico adicional, un agente citotóxico, una molécula de inmunoadhesión y un agente de obtención de imágenes. En algunos aspectos, el agente de obtención de imágenes se selecciona del grupo que consiste en una radiomarca, una enzima, una marca fluorescente, una marca luminiscente, una marca bioluminiscente, una marca magnética y biotina. En algunos aspectos, el agente de obtención de imágenes es una radiomarca seleccionada del grupo que consiste en: 3H, 14C, 35S, 62, 64Cu, 89Zr, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho y 153Sm. En algunos aspectos, el agente terapéutico o agente citotóxico se selecciona del grupo que incluye un agente quimioterapéutico, un agente inmunosupresor, un agente inmunoestimulante, un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente antiangiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, una toxina y un agente apoptósico. En algunos aspectos, la proteína de unión está conjugada directamente con el agente. En otros aspectos, la proteína de unión está conjugada con el agente por un conector. Los conectores adecuados incluyen, pero no se limitan a, conectores de aminoácido y polipeptídicos desvelados en el presente documento. Los conectores pueden ser escindibles o no escindibles.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos específicos para PD-1 y al menos otro antígeno o epítope. Los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento se pueden probar para su unión a PD-1 usando los ensayos de unión proporcionados en el presente documento, o cualquier otro ensayo de unión conocido en la técnica.
A menos que se establezca de otro modo, la práctica de la presente invención emplea técnicas convencionales de biología molecular, biología celular, bioquímica e inmunología que se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Methods in Molecular Biology, Humana Press; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Sambrook et al., 1989), Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Immunobiology (C. A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Phage display: a laboratory manual (C. Barbas III et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001); y Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow y D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999).
En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de un sujeto para una enfermedad o afección sensible a mejorar, estimular o provocar una respuesta inmunitaria. Como se usa en el presente documento, los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren a tanto el tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Los sujetos en necesidad de tratamiento incluyen los sujetos que ya tienen la enfermedad o afección, así como aquellos que pueden desarrollar la enfermedad o afección y en los que el objeto es prevenir, retrasar o disminuir la enfermedad o afección. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" indica un mamífero, tal como un roedor, un felino, un canino y un primate. Preferentemente, un sujeto según la invención es un ser humano.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de un compuesto o composición que es necesaria para proporcionar un beneficio terapéutico y/o preventivo al sujeto.
En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno de los mismos son útiles en el tratamiento de tumores sólidos o no sólidos. Por lo tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para el tratamiento de cáncer. "Cáncer", como se usa en el presente documento, se refiere a la condición fisiológica en mamíferos que normalmente se caracteriza por crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma (incluyendo liposarcoma, sarcoma osteogénico, angiosarcoma, endoteliosarcoma, leiomiosarcoma, cordoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, rabdomiosarcoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, condrosarcoma), tumores neuroendocrinos, mesotelioma, sinovioma, schwanoma, meningioma, adenocarcinoma, melanoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Más ejemplos particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de células escamosas epiteliales), linfoma de Hodgkin; linfomas no hodgkiniano (linfoma de Burkitt, linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica, micosis fungoide, linfoma de células del manto, linfoma folicular, linfoma difuso de linfocitos B grandes, linfoma de la zona marginal, leucemia de células pilosas y leucemia linfoplasmacítica), tumores de células precursoras de linfocitos, que incluyen leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B/linfoma y leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T/linfoma, timoma, tumores de los linfocitos T y NK maduros, que incluyen leucemias periféricas de linfocitos T, leucemia de linfocitos T del adulto/linfomas de linfocitos T y leucemia linfocítica granular grande, histocitosis de células de Langerhans, neoplasias mieloides, tales como leucemias mielógenas agudas, que incluyen AML con maduración, AML sin diferenciación, leucemia promielocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda y leucemias monocíticas agudas, síndromes mielodisplásicos y trastornos mieloproliferativos crónicos, que incluyen leucemia mielógena crónica, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B/linfoma, leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T/linfoma, cáncer de pulmón, que incluye cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso del pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago que incluye cáncer gastrointestinal, cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón o renal, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma de pene, cáncer testicular, cáncer de esófago, tumores de las vías biliares, tumor de Ewing, carcinoma de células basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glándulas sudoríparas, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma de células renales, hepatoma, carcinoma de las vías biliares, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, carcinoma de pulmón, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craneofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, leucemia, linfoma, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, enfermedad mielodisplásica, enfermedad de las cadenas pesadas, tumores neuroendocrinos, schwanoma y otros carcinomas, así como cáncer de cabeza y cuello.
En una realización, los anticuerpos y fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento son útiles en el tratamiento de enfermedades provocadas por agentes infecciosos. Los agentes infecciosos incluyen, pero no se limitan a, agentes bacterianos, micológicos, parasíticos y víricos. Los ejemplos de dichos agentes infecciosos incluyen los siguientes: estafilococo, Staphylococcus aureus resistente a meticilina, Escherichia coli, streptococcaceae, neisseriaaceae, cocos, enterobacteriaceae, enterococos, enterococos resistentes a vancomicina, criptococos, histoplasmosis, aspergilus, pseudomonadaceae, vibrionaceae, campylobacter, pasteurellaceae, bordetella, francisella, brucella, legionellaceae, bacteroidaceae, bacilos gramnegativos, clostridium, corynebacterium, propionibacterium, bacilos grampositivos, carbunco, actinomyces, nocardia, mycobacterium, treponema, borrelia, leptospira, mycoplasma, ureaplasma, rickettsia, chlamydiae, candida, micosis sistémica, micosis oportunista, protozoos, nematodos, trematodos, céstodos, adenovirus, virus del herpes (que incluyen, por ejemplo, virus del herpes simple y virus de Epstein Barr, y virus del herpes zóster), poxvirus, papovavirus, virus de la hepatitis (que incluyen, por ejemplo, virus de la hepatitis B y virus de la hepatitis C), virus del papiloma, orthomyxovirus (que incluyen, por ejemplo, gripe A, gripe B y gripe C), paramyxovirus, coronavirus, picornavirus, reovirus, togavirus, flavivirus, bunyaviridae, rhabdovirus, rotavirus, virus respiratorio sincitial, virus de la inmunodeficiencia humana y retrovirus. Las enfermedades infecciosas a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, candidiasis, candidemia, aspergilosis, neumonía estreptocócica, afecciones cutáneas estreptocócicas y bucofaríngeas, septicemia por gramnegativos, tuberculosis, mononucleosis, gripe, enfermedades respiratorias provocadas por el virus respiratorio sincitial, malaria, esquistosomiasis y tripanosomiasis.
En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento son útiles en el tratamiento de enfermedades mediadas por linfocitos T de tipo T cooperador 2 (Th2), tales como, por ejemplo, asma, alergia o enfermedad injerto contra huésped.
En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos proporcionados en el presente documento son útiles en la estimulación de una respuesta inmunitaria en un sujeto en necesidad de la misma. Por ejemplo, en un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos de los mismos se pueden administrar junto con un antígeno de interés con el fin de provocar una respuesta inmunitaria a dicho antígeno. Un antígeno de interés puede ser un antígeno asociado a un patógeno, tal como un virus o bacteria. Por lo tanto, en un aspecto, la presente divulgación proporciona una vacuna que comprende un anticuerpo anti-PD-1 y un antígeno, en donde la vacuna provoca una respuesta inmunitaria específica de antígeno.
En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 proporcionados en el presente documento modulan la función de linfocitos T reguladores. Los linfocitos T reguladores CD4+ CD25+ son linfocitos que suprimen o reducen los efectos de las funciones de los linfocitos T efectores. Los términos "linfocito T regulador" y "Treg" se usan indistintamente en el presente documento. En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 proporcionados en el presente documento previenen o invierten los efectos inhibidores de los linfocitos T reguladores sobre la producción de citocinas por linfocitos T efectores. Por ejemplo, en un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 proporcionados en el presente documento restauran la capacidad de producción de IPNy a los linfocitos T efectores en contacto con linfocitos T reguladores.
En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos desvelados en el presente documento se pueden administrar al sujeto por al menos una vía seleccionada de parenteral, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intrarticular, intrabronquial, intrabdominal, intracapsular, intracartilaginosa, intracavitaria, intracelial, intracerebelosa, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intrahepática, intramiocárdica, intraóstea, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarrectal, intrarrenal, intrarretiniana, intraespinal, intrasinovial, intratorácica, intratimpánica, intrauterina, intravesical, intravítrea, bolo, subconjuntiva, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal, intratumoral y transdérmica.
En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos desvelados en el presente documento se pueden administrar a un sujeto en necesidad de los mismos en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales. En un aspecto, los anticuerpos y fragmentos de los mismos se pueden administrar a un sujeto antes, durante y/o después de la administración al sujeto del agente terapéutico adicional. En un aspecto, el agente terapéutico adicional es un agente quimioterapéutico, agente radioterapéutico, citocina, anticuerpo o fragmento del mismo, o cualquier otro terapéutico adicional que se indica para la enfermedad que se va a tratar. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 y el agente terapéutico adicional presentan sinergia terapéutica cuando se administran juntos, tanto simultáneamente como uno detrás de otro. En un aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 y el agente terapéutico adicional se administran en formulaciones separadas. En otro aspecto, el anticuerpo anti-PD-1 y el agente terapéutico adicional se administran en la misma formulación. En un aspecto, los anticuerpos anti-PD-1 y fragmentos proporcionados en el presente documento potencian el efecto inmunomodulador del uno o más agentes terapéuticos adicionales. En otro aspecto, el uno o más agentes terapéuticos adicionales potencian el efecto del anticuerpo anti-PD-1 o fragmento del mismo.
La presente invención proporciona anticuerpos aislados y fragmentos de unión al antígeno de los mismos, y ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos y fragmentos, así como composiciones que comprenden dichos anticuerpos aislados, fragmentos y ácidos nucleicos. El término "aislado" se refiere a un compuesto de interés (por ejemplo, un anticuerpo o ácido nucleico) que se ha separado de su entorno natural. La presente invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos aislados o fragmentos de los mismos, o ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos o fragmentos, y que comprenden además uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, excipientes, diluyentes, materiales de encapsulación, cargas, tampones, u otros agentes.
El uso del singular incluye el plural, a menos que se establezca específicamente de otro modo. La palabra "un" o "una" significa "al menos uno", a menos que se establezca específicamente de otro modo. El uso de "o" significa "y/o", a menos que se establezca de otro modo. El significado de la expresión "al menos uno" es equivalente al significado de la expresión "uno o más". Además, el uso del término "que incluye", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido," no es limitante. Por tanto, términos tales como "elemento" o "componente" engloban tantos elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos o componentes que comprenden más de una unidad, a menos que se establezca específicamente de otro modo.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 - Inmunización de ratones y producción de anticuerpos de ratón contra PD-1 humana
Para generar anticuerpos contra PD-1 humana, se obtuvieron por PCR ADNc que codificaban el marco de lectura abierto del dominio extracelular de hPD-1 fusionado con una marca de histidina (hPD-1 -marca His, SEQ ID NO: 1), Fc de ratón (hPD-L1-mFc, SEQ ID NO: 13) y marca de Fc humana (hPD-1-hFc, SEQ ID NO: 5) y se subclonaron en el vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen CAT N.°: V-790), respectivamente. Después de la expresión transitoria en células 293 FreeStyle, se purificó la marca hPD-1-His con la columna NTA (GE healthcare), se purificaron hPD-1-mFc y hPD-1-hFc con columna de proteína G (GE healthcare).
Para inmunizar los ratones necesarios para generar estirpes celulares de hibridoma, se mezclaron 100 pg de proteína de fusión de PD-1 humana-Fc de ratón o y un adyuvante completo de Freund en la misma cantidad, y la mezcla se administró por una inyección subcutánea a cada uno de cinco ratones BALB/c de 6 a 7 semanas de edad. Después de dos semanas, el antígeno (mitad de la cantidad previamente inyectada) se mezcló con un adyuvante incompleto de Freund usando el mismo método que se ha descrito anteriormente, y la mezcla se administró a cada ratón por inyección subcutánea. Después de una semana, se realizó el refuerzo final, y se recogió sangre de la cola de cada ratón después de tres días para obtener el suero. Entonces, se diluyó el suero a 1/1000 con PBS, y se realizó un ELISA para analizar si aumentaba el título del anticuerpo que reconocía PD-1 humana-mFc. Después, se seleccionaron los ratones en los que se obtuvo una cantidad suficiente de anticuerpo, y se realizó un proceso de fusión celular en los ratones seleccionados.
Tres días antes de un experimento de fusión celular, se administró una mezcla de 50 pg de PBS y proteína de fusión de PD-1 humana-mFc por una inyección intraperitoneal a cada ratón. Se anestesió cada ratón inmunizado, y entonces se extrajo su bazo situado en el lado izquierdo del cuerpo y se molió con una malla para aislar células, que se mezclaron con un medio de cultivo (RPMI1640) para preparar una suspensión de células del bazo. La suspensión se centrifugó para recoger una capa de células. Las células 1x108 obtenidas del bazo se mezclaron con 1,5 x107 células de mieloma (Sp2/0), y la mezcla se centrifugó para precipitar las células. El precipitado se dispersó lentamente y se trató con PEG Hybri-Max (Sigma Inc., CAT N.°: 7181). Las células mezcladas se distribuyeron en placas de 96 pocillos a 0,1 ml por pocillo y se incubaron en una estufa de incubación a 37 °C, 5 % de CO2. En el día 1, las células se alimentaron mediante la adición de 0,1 ml de medio adicional que contenía suero y HAT más 2xmetotrexato para cada pocillo. En el día 3 y día 7, se sustituyó 0,1 ml de medio de cada pocillo con 0,1 ml de medio HT fresco. El cribado ocurrió normalmente entre los días 9-14.
Ejemplo 2 -Selección de las células de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales contra la proteína PD-1 humana basada en análisis ELISA y FACS.
Se realizó el análisis de unión ELISA basado en la proteína PD-1 humano-hFc. Se recubrieron placas de 96 pocillos (Costar, Cat N.°: 9018) con 100 pl de 2 pg/ml de PD1 -hFc (CrownBio) en tampón de recubrimiento (PBS, Hyclone, Cat N.°: SH30256.01 B) durante la noche a 4 °C. Los pocillos se aspiraron y se bloquearon los sitios de unión no específica añadiendo 200 pl de tampón de bloqueo con 1 % (p/v) de albúmina de suero bovino (BSA, Roche, Cat N.°: 738328) e incubando durante 1 hora a 37 °C. Después de lavar las placas tres veces con tampón de lavado (PBS con 0,05 % (v/v) de Tween20 (Sigma, Cat N.°: P1379), se añadió 100 pl/pocillo de diluciones adecuadas de sobrenadante de hibridoma en tampón de bloqueo y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Las placas se lavaron y se incubaron con 100 pl/pocillo de IgG de cabra anti-ratón (H+L) (Thermo, Cat N.°: 31432) en tampón de bloqueo durante 60 min. Después de lavar las placas, se añadió 100 pl/pocillo de disolución de sustrato (TMB (eBioscience, Cat N.°: 00-4201-56) y las placas se incubaron durante 2 min a temperatura ambiente. Se añadió 100 pl/pocillo de disolución de parada (H2SO42 N) para detener la reacción. Las señales colorimétricas se desarrollaron y se leyeron a 450 nm usando un Auto Plate SpectraMax Plus (proveedor: Molecular Devices; modelo: MNR0643; software: SoftMax Pro v5.4). Durante todo este método, se seleccionaron de forma repetida estirpes celulares de hibridoma que producen anticuerpos que unen de forma muy específica con la proteína PD-1 humana.
Se realizó el análisis del bloqueo de ligandos basado en ELISA por bloqueo de la unión de PD-L1 humana-mFc biotinilado a PD-1 humano-hFc. Se suspendió el antígeno de PD-1 -mFc (CrownBio) en tampón PBS (Hyclone, Cat N.° :SH30256.01B) (2 ug/ml, 100 ul/pocillo) y se recubrió sobre la placa de 96 pocillos (Costar, Cat N.°: 9018) a 4 °C durante la noche. Las placas se lavaron 3 veces usando tampón de lavado: PBS 0,05 % de Tween 20 (Sigma, Cat N.°: P1379). Se añadieron 200 ul de tampón de bloqueo (PBS 1 % de BSA (Roche, Cat N.°: 738328)) a cada pocillo, se incubó a 37 °C durante 1 hora y se lavó 3 veces. Se añadieron diversas concentraciones (diluciones adecuadas de sobrenadante de hibridoma en PBS) del Ab anti-PD-1 a los pocillos (100 pl/pocillo) y se incubaron a 37 °C durante 1 hora. Se añadió ligando (0,1 ug/ml de PDL-1-mFc-biotina, 100 pl/pocillo), se incubó a 37 °C durante 2 h y se lavó 3 veces. Se añadió anticuerpo secundario (avidina HRP eBioscience Cat N.°: E07418-1632, 1:500, 100 ul/pocillo), se incubó a 37 °C durante 0,5 hora y se lavó 3 veces. Se añadió TMB (Sigma, Cat N.°: T0440, 100 ul/pocillo) y se incubó durante 3 min a TA. Para detener la reacción, se añadió H2SO4 2 N (100 ul/pocillo). Las señales colorimétricas se desarrollaron y leyeron a 450 nm usando un Auto Plate SpectraMax Plus (proveedor: Molecular Devices; modelo: MNR0643; software: SoftMax Pro v5.4).
Se realizó el análisis de unión a células de anticuerpos de anticuerpos basado en la estirpe celular hPD-1-293T. Se usaron 2x105 células 293T-PD-1 para cada reacción poniéndolas en cada pocillo de placas de cultivo de 96 pocillos. Las células se incubaron con el anticuerpo irradiado (20 ug/ml con la dilución de 1/5) a 4 °C durante 1 h. Las células se lavaron tres veces con tampón FACS. Se añadió un anticuerpo secundario (PE cabra anti-ratón: 1:200; PE ratón anti-humano: 1:10) a las células a 100 ul/pocillo, y se incubaron a 4 °C durante 40 min. Las células se lavaron tres veces con tampón FACS y se analizaron por matriz de FACS.
Se realizó el análisis basado en FACS del bloqueo de ligandos para determinar los anticuerpos de hibridoma anti-PD-1 en el bloqueo de PD-L1 humano biotinilado y PD-L2 que se une a células hPD-1-293T usando un ensayo de citometría de flujo. Se suspendieron células 293T que expresaban PD-1 en tampón FACS (PBS con 3 % de suero de ternero fetal). Se añadieron diversas concentraciones de los anticuerpos de hibridoma de prueba a la suspensión de células y se incubaron a 4 °C durante 60 minutos en placas de 96 pocillos. Se añadió la proteína PD-L1 marcada con biotina o la proteína PD-L2 marcada con biotina a los pocillos y se incubó a 4 °C durante 60 minutos. Las placas se lavaron 3 veces, y se añadió anticuerpo de ratón anti-biotina PE (Biolgend, cat N.° 409004). Los análisis de citometría de flujo se realizaron usando una matriz de FACS. Los resultados del estudio se representan en la Figura 1A (PD-L1) y Figura 1B (PD-L2). Los anticuerpos monoclonales anti PD-1 bloquearon la unión de PD-L1 o PD-L2 a células 293T transfectadas con PD-1 humano, como se mide por la intensidad media fluorescente (MFI) de la tinción. Estos datos mostraron que los anticuerpos anti-PD-1 bloquean la unión del ligando PD-L1 y PD-L2 a PD-1 de la superficie celular.
Ejemplo 3 - Subclonación para obtener clones de anticuerpo monoclonal y purificación de anticuerpos antihPD-1
La subclonación se basa en el procedimiento de dilución limitada, y se diseña para obtener clones de hibridoma individuales que producen anticuerpos monoclonales. Cada uno de los hibridomas se sometió a múltiples rondas (4 rondas) de dilución limitante. Para cada ronda de subclonación, los clones se probaron por análisis del bloqueo basados en ELISA y FACS.
Se realizó la purificación de anticuerpos para un total de veintidós anticuerpos de hibridoma anti-hPD-1. Las células de hibridoma se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (GIBCO; Invitrogen Corporation, Carlsbad, Calif.) que contenía 10 % de suero de ternero fetal, 1 % de penicilina/estreptomicina, 2 % de L-glutamina y 1 % de disolución ajustada de NaHCO3. Las células de hibridoma seleccionadas se adaptaron entonces en medio de cultivo sin suero y el anticuerpo se purificó del sobrenadante usando columna de proteína-G (GE healthcare). Después de lavar con PBS, los anticuerpos unidos se eluyeron usando glicina 0,1 M a pH 3,0, seguido por neutralización del pH usando Tris 2,0 M. Se usaron concentradores centrífugos Ultra-15 (Amicon) para el intercambio de tampón y la concentración de anticuerpo.
Ejemplo 4 - Caracterización de los anticuerpos anti-hPD-1 murino purificado en las actividades de bloqueo de la unión y de ligandos basada en análisis ELISA y FACS
Los anticuerpos de hibridoma purificados se caracterizaron aún más basándose en análisis ELISA y FACS. Los métodos usados fueron similares a los descritos anteriormente en el Ejemplo 2, excepto que, en estos casos, los anticuerpos purificados se midieron en cantidad y concentración, y los resultados se usaron para calcular valores de CE50 y CI50. Las siguientes tablas, Tablas 1-5, muestran los resultados de 10 anticuerpos.
Tabla 1. CE50 de unión basada en ELISA de 10 anticuerpos anti-PD-1 murinos
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Tabla 2. CI50 de bloqueo basada en ELISA de 10 anticuerpos anti-PD-1 murinos
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Tabla 3. CE50 de unión basada en FACS de 10 anticuerpos anti-PD-1 murinos
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Tabla 4. CI50 de bloqueo de PD-L1 basada en FACS de 10 anticuerpos anti-PD-1 murinos seleccionados
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Tabla 5. CI50 de bloqueo de PD-L2 basada en FACS de 10 anticuerpos anti-PD-1 murinos seleccionados
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Ejemplo 5: Análisis Biacore de los anticuerpos anti-PD-1 murinos
Para caracterizar aún más las características de unión de los anticuerpos, se obtuvieron los perfiles de 10 anticuerpos de hibridoma usando Biacore (Biacore 3000, GE) para explicar la cinética de unión y calcular las constantes de unión en equilibrio. Este ensayo se realizó por el método de captura, usando el kit de captura de anticuerpos de ratón (BR-1008-38, GE). Después de diluir el mAb anti-Fc de ratón hasta 25 pg/ml en tampón de inmovilización a pH 5,0, la inmovilización se realizó con los parámetros mostrados en la Tabla 6 a un caudal de 5 pl/min. Las series cinéticas se hicieron 1) inyectando el ligando durante los 0,5-1 min típicos a caudal de 10 pl/min; 2) inyectando los analitos de elección durante los 3 min típicos seguido por disociación en tampón de electroforesis (1X PBS-P20) durante los 5-10 min típicos a caudal de 30 pl/min; y 3) inyectando la disolución de regeneración glicina 10 mM a pH 1,7 durante los 1­ 2 min típicos a caudal de 10 pl/min
Tabla 6. Parámetros de Biacore
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Los resultados del estudio se muestran en la Tabla 7. Cada uno de los anticuerpos anti-PD1 humana presentó una constante de asociación (ka) en el intervalo de 1,11 E+051/Ms a 8,40E+05 1/Ms; una velocidad de disociación (kd) en el intervalo de 2,83E-05 1/s a 7,55E-05 1/s; una constante de asociación en equilibrio (KA) en el intervalo de 1,60E+10 1/M a 5,44E+10 1/M; y una afinidad (KD) en el intervalo de 1,84E-11 M a 6,23E-11 M (0,0184 nM a 0,0623 nM).
Tabla 7. Valores de KD de anticuerpos de hibridoma anti-PD-1.
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Ejemplo 6: Reactividad cruzada entre especies y entre moléculas similares
Para evaluar la reactividad cruzada entre especies de anticuerpos, se clonaron por PCR los receptores de PD-1 de ratón y de macaco cangrejero y se generaron células 293T-PD-1 establemente transfectadas. Los anticuerpos se probaron para su unión al receptor de macaco cangrejero usando ELISA basado en proteínas. Los resultados del estudio mostraron que los anticuerpos se unen con afinidad igual a PD-1 humana y de macaco cangrejero y bloquean la unión de hPD-L1/Fc y hPD-L2/Fc a PD-1 de macaco cangrejero con eficacia similar en comparación con PD-1 humana. Ninguno de los anticuerpos seleccionados se unió a PD-1 de ratón con afinidad detectable en ninguno de los ensayos usados. Ninguno reacciona de forma cruzada con CTLA4 humano, ICOS y CD28 (véase la Tabla 8).
Ejemplo 7: Efecto de los anticuerpos de hibridoma anti-PD-1 sobre la producción de citocinas en una reacción de linfocitos mixtos
Se usó una reacción de linfocitos mixtos para demostrar el efecto del bloqueo de la vía de PD-1 sobre células efectoras de linfocitos. Se probaron los linfocitos T en el ensayo para la proliferación, secreción de IFN-y y secreción de IL-2 en presencia o ausencia de un anticuerpo monoclonal murino anti-PD-1 humano. En el ensayo, se purificaron linfocitos T CD4+ humanos de CMSP usando una selección negativa de CD4+ (Miltenyi Biotech, cat N.° 130-091-155). Las células dendríticas maduras (DC) derivaron del cultivo de monocitos purificados (Miltenyi, Mo-DC Generation Toolbox, cat N.°130-093-568) con medio de diferenciación Mo-DC durante 7 días; luego se indujo la maduración de DC con maduración con Mo-Dc durante 2 días. Cada cultivo contuvo 105 linfocitos T purificados y 104 células dendríticas alógenas en un volumen total de 200 pl. El anticuerpo anti-PD-1 monoclonal 4C10, 5A8, 6E1, 7D3, 7A4, 10D1, 13F1, 14A6, 15H5 o 22A5 se añadió a cada cultivo en diferentes concentraciones de anticuerpo. Se usó o ningún anticuerpo o un anticuerpo de control de isotipo como control negativo. Las células se cultivaron durante 5 días a 37 °C. En el 5 día, se recogieron 50 pl de medio para la medición de IL-2 e IFN-y . Los niveles de IFN-y e IL-2 en el líquido de cultivo se midieron usando un kit de ELISA EIA hIFN-Y (R&D, cat N.° DY285) y el kit de ELISA de IL-2 (eBioscience). Los resultados del estudio se proporcionan en la Figura 2 (secreción de IL-2) y la Figura 3 (secreción de IFN-y) y muestran que los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 humana promovieron la proliferación de linfocitos T, la secreción de IFN-y y la secreción de IL-2 en un modo dependiente de la concentración. A diferencia, los cultivos que contienen el anticuerpo de control de isotipo no mostraron un aumento en la proliferación de linfocitos T, secreción de IFN-y o IL-2.
Ejemplo 8: Características de 10 anticuerpos murinos anti-hPD-1
Las características de 10 anticuerpos monoclonales anti-PD1 que se purificaron y caracterizaron se resumen en la Tabla 8. Estos anticuerpos se unieron fuertemente a PD-1 (con constantes de disociación en el intervalo de 20 uM a 3 nM) y fueron capaces de bloquear la interacción con tanto PD-L1 como PD-L2 con valores variables de CI50. Cada uno de los anticuerpos indujo la producción de IL2 y de IPNy . Ninguno de los 10 anticuerpos reaccionó de forma cruzada con CTLA4, ICOS o CD28. Cada uno de los anticuerpos se unió a PD-1 de macaco cangrejero. Cada uno de los anticuerpos, cuando se añadió en disolución, actuó de antagonistas de receptores, por último lugar potenció las respuestas de linfocitos T (véase el Ejemplo 5).
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Ejemplo 9: Clonación y humanización de secuencias de ADNc de anticuerpos anti-PD-1
Clonación de ADNc de inmunoglobulina
Se usó ARN total aislado de la estirpe celular de hibridoma productora de anticuerpo contra hPD-1 por el minikit RNeasy (Qiagen, CAT N.2: 74104) como molde para sintetizar la primera cadena de ADNc con la transcriptasa inversa SuperScript® II (Life Technology, CAT N.°: 18064-14) según las instrucciones del fabricante. El producto de ADNc se sometió entonces a PCR en una mezcla de reacción de 50 pl de volumen usando cebadores de IgG de ratón degenerada (Kettleborough CA, et al., European Journal of Immunology 23: 206-211 (1993), Strebe N, et al, Antibody Engineering 1:3-14 (2010)). La reacción se llevó a cabo en un ciclador térmico S1000™ (Bio-Rad, CAT N.°: 184-2000) con 30 ciclos de: 94 °C, 1,5 minutos para la desnaturalización; 50 °C, 1 minuto para la hibridación; y 72 °C, 1 minuto para la síntesis. Al final del 30° ciclo, la mezcla de reacción se incubó otros 7 minutos a 72 °C para la extensión.
La mezcla de PCR se sometió a electroforesis en un gel de 1 % de agarosa/Tris-borato que contenía 0,5 pg/ml de bromuro de etidio. Los fragmentos de ADN que tenían los tamaños esperados (aproximadamente 400 pb para la cadena pesada y la cadena ligera) se cortaron del gel y se purificaron, se clonaron 3 pl de producto purificado de PCR en el vector pMD-18T (Takara, CAT N.°: D101A) y se transformaron en E. co liquímicamente competente One Shot® TOP10 (Invitrogen, CAT N.°: C4040-03). Los clones se cribaron por PCR de colonias usando cebadores directos e inversos M13 universales, y se eligieron 10 clones positivos de cada reacción para la secuenciación de ADN en ambas direcciones usando cebadores M13 directos y M13 inversos.
Se amplificaron las secuencias de la región variable de los anticuerpos 4C10 (SEQ ID NO: 28, 33), 5A8 (SEQ ID NO: 99, 104), 6E1 (SEQ ID NO: 89, 94), 7D3 (SEQ ID NO: 39, 44), 7A4 (SEQ ID NO: 109, 114), 10D1 (SEQ ID NO: 18, 23), 13F1 (SEQ ID NO: 49, 54), 14A6 (SEQ ID NO: 69, 74), 15H5 (SEQ ID NO: 59, 64) y 22A5 (SEQ ID NO: 79, 84) a partir de los clones de hibridomas correspondientes. Estos anticuerpos mostraron las funciones deseadas, tales como el bloqueo de la unión de PD-1 a PD-L1 y la potenciada activación de linfocitos T y liberación de citocinas.
Construcción y expresión del anticuerpo 7A4 y 13F1 quimérico
Se construyeron las cadenas ligeras quiméricas de 7A4 y 13F1 (SEQ ID NO: 123 y 129, respectivamente) enlazando los ADNc clonados por PCR de regiones VL de ratón con kappa humana e IgG 1, respectivamente. Se construyeron cadenas pesadas de la IgG1 quimérica 7A4 y 13F1 (SEQ ID NO: 119 y 125, respectivamente) enlazando los ADNc clonados por PCR de las regiones VH de ratón con la región constante IgG 1 humana. Se construyeron las cadenas pesadas de IgG4 quimérica 7A4 y 13F1 (SEQ ID NO: 121 y 127, respectivamente) enlazando los ADNc clonados por PCR de regiones VH de ratón con la región constante de IgG4 humana. Los extremos 5' de las secuencias de ratón de ADNc se modificaron usando los cebadores de PCR diseñados para añadir una secuencia conductora a tanto la cadena ligera como la cadena pesada.
Se transfectaron células 293 FreeStyle (200 ml a 106/ml) con 100 pg de cada uno de los plásmidos de expresión quiméricos de cadena pesada y ligera y se cultivaron durante 6 días. El anticuerpo quimérico en el sobrenadante se purificó entonces con columna de proteína G (GE healthcare). La unión de los anticuerpos quiméricos con PD-1 se midió por ELISA y Biacore como se ha descrito anteriormente en los Ejemplos 2 y 5, y se mostró que se unía a PD-1 con afinidad comparable a la del anticuerpo parental murino. La Tabla 9 muestra la CE50 de unión de cada uno de los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos como se mide por ELISA. La Tabla 10 muestra la CI50 de bloqueo de PD-L1 de cada uno de los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos como se mide por ELISA. La Tabla 11 muestra la CE50 de unión de cada uno de los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos como se mide por FACS. La Tabla 12 muestra la CI50 de bloqueo de PD-L1 de cada uno de los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos como se mide por FACS.
Tabla 9. CE50 de la unión basada en ELISA de anticuerpos anti-PD-1 quiméricos
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Tabla 10. CI50 del bloqueo basado en ELISA de anticuerpos anti-PD-1 quiméricos
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Tabla 11. CE50 de la unión basada en FACS de anticuerpos anti-PD-1 quiméricos
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Tabla 12. CI50 del bloqueo de PD-L1 basado en FACS de anticuerpos anti-PD-1 quiméricos
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Se usaron reacciones de linfocitos mixtos como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 7 para determinar el efecto de los anticuerpos anti-PD-1 quiméricos sobre la secreción de IL-2 (Figura 4) y la secreción de IFN-y (Figura 5) de linfocitos T. Cada uno de los anticuerpos monoclonales anti-PD-1 quiméricos promovió la secreción de IL-2 y la secreción de IPNy en un modo dependiente de la concentración en el ensayo de MLR. A diferencia, el anticuerpo de control de isotipo (hIgG4) no provocó la secreción de IL-2 ni la secreción de IPNy en ninguna concentración probada.
Diseño de humanización de anticuerpos
Se humanizaron anticuerpos 7A4 y 13F1 usando un enfoque de injerto de CDR (patente de EE. UU. N.° 5.225.539). Se compararon las secuencias de cadena variable de la cadena ligera y cadena pesada del anticuerpo murino 7A4 y 13F1 con las disponibles en la base de datos de proteínas de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) accediendo a la base de datos de NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/igblast.cgi. Se generó el modelo de 7A4 y 13F1, respectivamente, basándose en la estructura de VH y VL con la mayor homología de secuencias.
Se seleccionaron los anticuerpos humanos molde a injertar con las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) en las VH y VL del anticuerpo 7A4 y 13F1 de ratón de estirpes germinales de anticuerpos humanos que tenían una secuencia de aminoácidos con elevada homología con el anticuerpo de ratón 7A4 y 13F1 accediendo a las bases de datos de estructuras 3D IMGT/Domain Gap Align 3D, http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi. Para 7A4, la VH humana molde seleccionado fue una combinación de IGHV2-5*10 y IGHJ4*01 y la VL humana molde seleccionada fue una combinación de IGKV1-33*01 y IGKJ2*01. Para 13F1, la VH humana molde seleccionado fue una combinación de IGHV3-21*04 y IGHJ4*01 y la VL humana molde seleccionada fue una combinación de IGKV7-3*01 y IGKJ2*01.
Las secuencias de aminoácidos de las CDR de los anticuerpos humanos molde anteriormente mencionados se sustituyeron por la secuencia de aminoácidos de la CDR del anticuerpo 7A4 y 13F1 de ratón. Además, las regiones estructurales de VH y VL del anticuerpo humano molde anteriormente mencionado se injertaron con las secuencias de aminoácidos necesarias de VH y VL del anticuerpo 7A4 y 13F1 de ratón para dar un anticuerpo humanizado funcional. En cuanto a VH y VL de 7A4 y 13F1, varios sitios del aminoácido de la región estructural del anticuerpo humano molde anteriormente mencionado se retromutaron a las secuencias de aminoácidos correspondientes en el anticuerpo 7A4 y 13F1 de ratón. Para la región variable de la cadena ligera del anticuerpo humanizado 7A4, el aminoácido en la posición 40 se mutó de Tyr (Y) a Phe (F) y el aminoácido en la posición 72 se mutó de Gly (G) a Arg (R); y para la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humanizado 7A4, el aminoácido en la posición 2 se mutó de Val (V) a Ile (I), el aminoácido en la posición 46 se mutó de Glu (E) a Lys (K) y el aminoácido en la posición 70 se mutó de Phe (F) a Ile (I). Para la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 13F1humanizado, el aminoácido en la posición 45 se mutó de Leu (L) a Pro (P) y el aminoácido en la posición 70 se mutó de Phe (F) a Tyr (Y); y para la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 13F1humanizado, el aminoácido en la posición 26 se mutó de Gly (G) a Tyr (Y), el aminoácido en la posición 48 se mutó de Ile (I) a Met (M), el aminoácido en la posición 49 se mutó de Gly (G) a Ala (A), el aminoácido en la posición 67 se mutó de Val (V) a Ile (I) y el aminoácido en la posición 71 se mutó de Val (V) a Arg (R).
Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras variables y pesadas variables del anticuerpo 13F1 humanizado se designaron SEQ ID NO: 143 y 141, respectivamente. Se diseñaron las secuencias de bases de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 140 y 142, respectivamente). Se diseñaron las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras variables y pesadas variables del anticuerpo 7A4 humanizado, SEQ ID NO: 133 y 131, respectivamente. Se diseñaron las secuencias de bases de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 130 y 132, respectivamente).
Se produjeron las versiones de IgG 1 e IgG4 de los anticuerpos 7A4 y 13F1 humanizados (h13F1 -IgG 1, h13F1 -IgG4, h7A4-IgG1 y h7A4-IgG4). La región constante de IgG 1 lleva la mutación D265A (Clynes R, et al., Nature Medicine 6: 443-446 (2000)), mientras que la región constante de IgG4 tiene la mutación doble F234A y L235A (Xu D, et al., Cellular Immunology 200: 16-26 (2000)). Las secuencias de la región constante se desvelan en SEQ ID NO: 150 y 151. Las secuencias de aminoácidos completas de las cadenas ligeras y pesadas para h13F1-IgG1 (SEQ ID NO: 149 y 145), h13F1-IgG4 (SEQ ID NO: 149 y 147), h7A4-IgG1 (SEQ ID NO: 139 y 135) y h7A4-IgG4 (SEQ ID NO: 139 y 137) se proporcionan anteriormente en la Tabla 3. Para retirar el posible sitio de desamidación en la cadena ligera de 7A4, Asn85 se muta a Asp (h7A4D). La región variable de la cadena ligera (SEQ ID NO: 152) y las secuencias de aminoácidos ligeras completas (SEQ ID NO: 153) también se proporcionan anteriormente en la Tabla 3.
Construcción y expresión de anticuerpos 7A4, 7A4D y 13F1 humanizados
Se sintetizó ADN que codifica la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo humanizado 7A4, 7A4D y 13F1 y se clonó en el vector de expresión pcDNA3.1 (Invitrogen, CAT N.°: V-790). Se transfectaron células 293 FreeStyle (200 ml a 106/mL) con 100 gg de cada uno de los plásmidos de expresión humanizados de cadena pesada y ligera y se cultivaron durante 6 días. Entonces se purificó el anticuerpo humanizado en el sobrenadante con columna de proteína G (GE Healthcare).
Ejemplo 10: Caracterización de anticuerpos anti-PD-1 humanizados en la actividad de unión y especificidad, y actividad de bloqueo de ligandos (PD-L1)
Después de la generación y purificación de anticuerpos 13F1-hIgG1, 13F1-hIgG4, 7A4-IgG1 y 7A4-hIgG4 humanizados, se determinaron la unión y la especificidad de los anticuerpos basándose en los análisis de unión basados en ELISA y de bloqueo de PD-1, así como los análisis de unión basados en FACS y de bloqueo de PD-L1. Los métodos usados fueron similares a los descritos anteriormente en los Ejemplos 2 y 4.
En los ensayos de unión basados en ELISA, los anticuerpos 13F1 humanizados hu-13F1 -hIgG1 y hu-13F1-hIgG4 presentaron unión similar a PD-1 en comparación con el anticuerpo quimérico 13F1-quimérico (Figura 6A, panel superior); y los anticuerpos 7A4 humanizados hu-7A4-D265A-hIgG1 y 7A4-huIgG4 presentaron unión similar a PD-1 en comparación con los anticuerpos 7A4 quiméricos (Figura 6B, panel superior). A diferencia, el anticuerpo hIgG4 de control de isotipo no presentó unión a PD-1. Los paneles superiores de la Figura 6A y Figura 6B muestran la CE50 para cada uno de los anticuerpos probados, calculados a partir de los datos de unión de ELISA, y muestra que los anticuerpos 13F1 y 7A4 humanizados presentaron unión a PD-1.
Similarmente, en los ensayos de unión basados en FACS, los anticuerpos 13F1 humanizados hu-13F1 -hIgG1 y hu-13F1-hIgG4 (Figura 7A, panel superior) y los anticuerpos 7A4 humanizados hu-7A4-D265A-hIgG1 y 7A4-huIgG4 (Figura 7B, panel superior) presentaron unión a PD-1. Las CE50 calculadas a partir de los datos de unión a FACS para los anticuerpos 13F1 y 7A4 humanizados se muestran en la Figura 7A y Figura 7B, respectivamente.
La Figura 8 muestra los resultados de los ensayos de bloqueo de ligandos basados en ELISA para los anticuerpos 13F1 humanizado y 7A4 humanizado. Como se muestra en la Figura 8A y la Figura 8B, los anticuerpos 13F1 y 7A4 humanizados, respectivamente, presentaron una actividad similar de bloqueo de ligandos con respecto al anticuerpo quimérico correspondiente. La cuantificación de CI50 para cada uno de los anticuerpos humanizados y quiméricos se muestra en la Figura 8C.
La Figura 9 muestra que cada uno de los anticuerpos 13F1 humanizado y 7A4 humanizado bloqueó la unión de PD-L1 como se mide por el ensayo de bloqueo de ligandos basado en FACS. El panel inferior de la Figura 9 proporciona la CI50 para cada uno de los anticuerpos humanizados.
Ejemplo 11: Análisis cinético Biacore de los anticuerpos anti-PD-1 13F1, 7A4 y 7A4D humanizados
Para caracterizar las características de unión de los anticuerpos humanizados, se midió la cinética de unión entre PD-1 y los anticuerpos contra PD-1 por Biacore3000 y se registraron con una tasa de recopilación de datos de 1 Hz. Se diluyó la IgG policlonal de conejo anti-ratón (GE, BR-1008-38) con acetato sódico 10 mM a pH 5,0 y se inmovilizó sobre las celdas de flujo de referencia y del experimento de un chip biosensor CM5 hasta aproximadamente 15000 UR usando un kit de acoplamiento de aminas (GE, BR10050). Al comienzo de cada ciclo, se inyectó el anticuerpo de prueba diluido (1,5 gg/ml) sobre la celda de flujo experimental durante 1 minuto para ser capturado. Se prepararon series de analitos PD-1 diluyendo las disoluciones madre con tampón de electroforesis hasta 100 nM, seguido por dilución sucesiva doble en el mismo tampón hasta 0,78 nM. Los analitos se inyectaron en serie sobre las celdas de flujo de referencia y del experimento durante 3 minutos a un caudal de 30 gl/minuto. Entonces se dejó que el tampón de electroforesis (PBS con 0,05 % de P20) circulara por encima durante 10 minutos a un caudal de 30 gl/minuto. Al final de cada ciclo, la superficie del biosensor se regeneró con 3 minutos de inyección de tampón glicina-HCl 10 mM a pH1,7 a un caudal de 10 gl/minuto. Para cada inyección de muestra de analito (es decir, cada ciclo), las respuestas de unión obtenidas de la superficie del biosensor experimental se referenciaron de forma doble restando simultáneamente las respuestas registradas de la superficie de referencia, seguido por la resta adicional de respuestas de un tampón referenciado único de la muestra de electroforesis. Las constantes de velocidad de asociación y de disociación (ka y kd) se determinaron simultáneamente ajustando los sensogramas doblemente referenciados de toda la serie de valoración al modelo de Langmuir (1:1) usando el software Biaevaluation 4.0. La constante de disociación, KD, se calculó a partir de las constantes de velocidad determinadas por la relación KD = kd/ka. Como se muestra en las Figuras 10 y 17A, los anticuerpos anti-PD-1 13F1, 7A4 y 7A4D humanizados se unieron a PD-1 humana con elevada afinidad. Las curvas de unión Biocore se muestran en las Figuras 10 y 17A, panel superior, y los datos de

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que se une a PD-1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo comprende una región variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 o SEQ ID NO: 133; y una región variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.
2. El anticuerpo aislado o fragmento del mismo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un scFv, un fragmento Fab, un fragmento Fab' y un fragmento F(ab)'.
3. Un anticuerpo o fragmento del mismo según la reivindicación 1 o 2, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo está unido o conjugado con un agente terapéutico, preferentemente en donde el agente terapéutico es un fármaco citotóxico, un isótopo radiactivo, un inmunomodulador o un anticuerpo.
4. Una composición que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
5. Un polinucleótido aislado que codifica el anticuerpo o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
6. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado según la reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión según la reivindicación 6.
8. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para su uso en un método de tratamiento de un cáncer o una enfermedad infecciosa en un sujeto en necesidad del mismo, comprendiendo el método administrar una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo aislado o fragmento del mismo al sujeto, preferentemente en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en linfoma, leucemia, melanoma, glioma, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de huesos, cáncer de ovario, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de estómago, cáncer rectal, cáncer testicular, cáncer de glándulas salivales, cáncer de tiroides, cáncer tímico, cáncer epitelial, cáncer de cabeza o cuello, cáncer gástrico, cáncer pancreático, o una combinación de los mismos; o en donde la enfermedad infecciosa se selecciona del grupo que consiste en candidiasis, candidemia, aspergilosis, neumonía estreptocócica, afecciones cutáneas estreptocócicas y bucofaríngeas, septicemia por gramnegativos, tuberculosis, mononucleosis, gripe, enfermedades respiratorias provocadas por el virus respiratorio sincitial, malaria, esquistosomiasis y tripanosomiasis.
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