ES2747928T3

ES2747928T3 - Compuestos coagonistas de GIP y GLP-1

Info

Publication number: ES2747928T3
Application number: ES16703620T
Authority: ES
Inventors: Jorge Alsina-Fernandez; Bengt Krister Bokvist; Tamer Coskun; Robert Chadwick Cummins
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 2015-01-09
Filing date: 2016-01-05
Publication date: 2020-03-12
Anticipated expiration: 2036-01-05
Also published as: IL252499A0; PL3242887T3; WO2016111971A1; EA201892057A1; CR20170310A; MA41315B1; TN2017000198A1; AU2016205435A1; PE20170954A1; JP6219534B2; ZA201703930B; CA2973352C; SI3242887T1; KR101957620B1; PH12017501252A1; IL276492A; NO2023005I1; IL281545A; SV2017005453A; CL2017001760A1

Abstract

Un compuesto de Fórmula: YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS; en la que X1 es Aib; X2 es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación al grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H en la que a es 1 a 2 y b es 10 a 20; X3 es Phe o 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está opcionalmente amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:11), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos coagonistas de GIP y GLP-1

La presente invención se refiere al campo de la medicina. Más particularmente, la presente invención se refiere compuestos miméticos de péptido de incretina dual que actúan como agonistas de los receptores tanto para el ^{polipéptido insulinotrópico}(GiP) ^{dependiente de glucosa humano como para el péptido-1 similar a glucagón (GLP-1),}y que pueden ser útiles para tratar la diabetes mellitus tipo 2 (T2D).

La T2D es la forma más común de diabetes que representa aproximadamente el 90% de toda la diabetes. La T2D se caracteriza por niveles altos de glucosa en la sangre causados por la resistencia a la insulina. El estándar de cuidado actual para la TD2 incluye dieta y ejercicio junto con medicamentos orales e inyectables para reducir la glucosa. Sin embargo, muchos pacientes con T2D aún permanecen controlados de manera inadecuada. Actualmente, los inhibidores de miméticos de incretina o dipeptidil peptidasa IV (DPP-IV) comercializados actualmente solo utilizan un único mecanismo de acción establecido para el control glucémico. Se necesita un compuesto para T2D que utilice un mecanismo de acción dual.

GIP es un péptido regulador gastrointestinal de 42 aminoácidos que cumple un papel fisiológico en la homeostasis de la glucosa mediante el estímulo de la secreción de insulina de las células beta pancreáticas en presencia de glucosa y la protección de las células beta pancreáticas. GLP-1 es un péptido de 37 aminoácidos que estimula la secreción de insulina, protege las células beta pancreáticas e inhibe la secreción de glucagón, el vaciado gástrico y la ingesta de alimentos, lo que lleva a la pérdida de peso. GIP y GLP-1 se conocen como incretinas; la señalización del receptor de incretina ejerce una acción fisiológicamente relevante crítica para la homeostasis de la glucosa. En la fisiología normal, GIP y GLP-1 se secretan del intestino después de una comida, y estas incretinas mejoran la respuesta fisiológica a los alimentos, que incluye la sensación de saciedad, secreción de insulina y eliminación de nutrientes. Los pacientes con diabetes tipo 2 tienen respuestas de incretina alteradas.

Se ha encontrado que la dosificación de los análogos de GLP-1 está limitada por efectos adversos, tal como náuseas y vómitos, y, como consecuencia, la dosificación con mayor frecuencia no puede alcanzar la eficacia total para el control glucémico y la pérdida de peso. El GIP solo tiene una capacidad reductora de glucemia modesta en seres humanos con diabetes tipo 2. Tanto el GIP nativo como el GLP-1 son inactivados rápidamente por la proteasa ubicua, DPP IV, y, por lo tanto, solo se pueden usar para control metabólico a corto plazo.

El glucagón es un péptido de 29 aminoácidos producido por el páncreas, y cuando se une al receptor de glucagón, señaliza al hígado para que libere glucosa, lo que lleva a un aumento de la glucosa en sangre. Es sabido que GLP-2, un péptido que al igual que GLP-1 se produce a partir del procesamiento del proglucagón, está asociado con la proliferación celular en el intestino. Por lo tanto, la estimulación de los receptores de glucagón y GLP-2 se debe minimizar durante el tratamiento crónico de pacientes con T2D para maximizar la reducción de la glucosa y reducir los posibles riesgos carcinogénicos a largo plazo.

Se ha descrito que ciertos análogos de GIP exhiben actividad tanto de GIP como de GLP-1 en los documentos WO 2013/164483, WO 2014/192284 y WO 2011/119657.

El DPP IV es de la clase de enzimas proteolíticas de exopeptidasa. La introducción de aminoácidos no naturales en una secuencia puede aumentar la estabilidad proteolítica de cualquier péptido dado. Si bien el uso de aminoácidos no naturales puede ayudar con la estabilidad de los péptidos contra la proteólisis DPP IV y otras formas de degradación, los solicitantes de la presente descubrieron como parte de la presente invención que los aminoácidos no naturales pueden tener efectos inesperados en el equilibrio de la actividad agonista entre GIP y GLP-1. Los aminoácidos no naturales también aumentan la probabilidad de que un péptido se pueda ver como extraño y desencadene reacciones inmunes indeseables, tal como inmunogenicidad humana y reacciones en el sitio de inyección.

Los ácidos grasos, a través de sus motivos de unión a la albúmina, pueden mejorar la farmacocinética de un péptido, por ejemplo, mediante la extensión de la vida media. Si bien el uso de ácidos grasos puede mejorar la vida media de los péptidos, los solicitantes de la presente han descubierto, como parte de la presente invención, que la longitud, composición y ubicación de la cadena de ácidos grasos y el conector entre el péptido y la cadena de ácidos grasos ^{puede tener efectos inesperados sobre el equilibrio de la actividad agonista de GIP y}gLP-1.

Se ha encontrado que la tolerabilidad de ciertos análogos de GLP-1 evita una dosis del análogo de GLP-1 que alcanza una mejor eficacia para el control glucémico y la pérdida de peso. Los efectos secundarios más comunes asignados a los análogos de GLP-1 son náuseas y vómitos, pero algunos compuestos también pueden afectar la frecuencia cardíaca. El eje HPA es parte de una respuesta de estrés fisiológico y se ha encontrado que GLP-1 estimula el eje HPA en ratas, lo que produce el aumento de los niveles de corticosterona y proporciona un vínculo potencial con los eventos adversos, tal como un aumento de la frecuencia cardíaca. Como parte de la presente invención, los solicitantes de la presente han encontrado inesperadamente que un compuesto de la presente invención no deriva en niveles elevados de corticosterona como se observó con semaglutida en un modelo de ratas y, por lo tanto, posiblemente se pueda dosificar a niveles de eficacia más altos que los agentes selectivos de GLP-1 R.

Aún existe la necesidad de proporcionar un compuesto que sea un coagonista equilibrado de los receptores GIP y GLP-1, pero que sea selectivo frente a los receptores de glucagón y GLP-2 relacionados. Además, aún se necesita proporcionar un compuesto con actividad coagonista equilibrada de los receptores GIP y GLP-1, lo que puede proporcionar pérdida de peso dada la actividad hallada en modelos animales. Además, aún es necesario proporcionar un compuesto con actividad coagonista equilibrada de los receptores GIP y GLP-1 que proporcione una estabilidad adecuada contra DPP IV y otras formas de degradación, pero todavía manteniendo un bajo potencial de inmunogenicidad. Además, aún es necesario proporcionar un compuesto con actividad coagonista equilibrada de los receptores GIP y GLP-1 que respalde la posible dosificación semanal en los seres humanos.

Por consiguiente, ciertos compuestos de la presente invención tienen un potencial menor para inmunogenicidad y reacciones en el sitio de inyección que ciertos compuestos coagonistas de GIP-GLP-1 en la técnica. Ciertos compuestos de la presente invención tienen potencial para producir pérdida de peso en pacientes sobre la base de los datos de gastos de energía en animales. Además, ciertos compuestos de la presente invención tienen una actividad coagonista equilibrada contra los receptores GIP y GLP-1 y selectividad contra los receptores de glucagón y GLP-2, bajo potencial de inmunogenicidad y características farmacocinéticas (PK) que apoyan la dosificación una vez a la semana en seres humanos.

Por consiguiente, una realización de la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I: YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS;

en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en el que a es 1 a 2 y b es 10 a 20; X³es Phe o 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está opcionalmente amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:11), o una de sus sales aceptable para uso farmacéutico.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en el que a es 1 a 2 y b es 10 a 18; X³es Phe; y el aminoácido del extremo terminal C está opcionalmente amidado como una amida primaria del extremo terminal C, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en el que a es 1 a 2 y b es 10 a 18; X³es 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está opcionalmente amidado como una amida primaria del extremo terminal C, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en el que a es 1 a 2 y b es 14 a 18; X³es Phe o 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está opcionalmente amidado como una amida primaria del extremo terminal C, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico. En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto en el que b es 16 a 18. En forma adicional, la presente invención proporciona un compuesto en el que b es 18.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral Kcon ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en el que a es 1 y b es 10 a 18; X³es Phe o 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está opcionalmente amidado como una amida primaria del extremo terminal C, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral Kcon ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en el que a es 2 y b es 10 a 18; X³es Phe o 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está opcionalmente amidado como una amida primaria del extremo terminal C, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de Fórmula I, en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en el que a es 1 a 2 y b es 10 a 18; X³es Phe o 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula:

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS;

en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)¹-CO-(CH²)18-CO²H; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:3), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS;

en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)²-CO-(CH²) i⁸-CO²H; X³es 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:4), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS;

en la que Xi es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)i-CO-(CH²) i⁶-CO²H; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:5), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS;

en la que Xi es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)²-CO-(CH²) i⁶-CO²H; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:6), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS

en la que Xi es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)²-CO-(CH²) i⁸-CO²H; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:7), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

YXiEGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS

en la que Xi es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)i-CO-(CH²) i⁶-CO²H; X³es i-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:8), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

YXiEGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que Xi es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)²-CO-(CH²) i⁶-CO²H; X³es i-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:9), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico. En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de la Fórmula:

YXiEGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que Xi es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)i-CO-(CH²) i⁸-CO²H; X³es i-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:i0), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

En una realización, la presente invención proporciona una composición que comprende un compuesto de la presente invención con un portador, diluyente o excipiente aceptable para uso farmacéutico.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento de diabetes mellitus tipo 2, que comprende administrar a un paciente necesitado de dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención. En una realización adicional, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento de diabetes mellitus tipo 2 que además comprende administrar en forma simultánea, separada y/o secuencial en combinación con una cantidad eficaz de uno o más agentes seleccionados de metformina, tiazolidinodionas, sulfonilureas, inhibidores de dipeptidil peptidasa 4, y cotransportadores de glucosa de sodio.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para mejorar el control glucémico en adultos con diabetes mellitus tipo 2, que comprende administrar a un paciente necesitado de dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención como un complemento de la dieta y ejercicio. En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para el manejo del peso crónico en adultos con un índice de masa corporal inicial > 27 y diabetes mellitus tipo 2, que comprende administrar a un paciente necesitado de dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención como complemento de una dieta baja en calorías y una mayor actividad física.

En una realización, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar el síndrome metabólico, que comprende administrar a un paciente necesitado de dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención. En una realización adicional, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar dislipidemia, obesidad, y/o esteatosis hepática asociada con resistencia a insulina y diabetes, que comprende administrar a un paciente necesitado de dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención. Adicionalmente, la presente invención proporciona un procedimiento para tratar fragilidad o aumentar la resistencia ósea, que comprende administrar a un paciente necesitado de dicho tratamiento, una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invención.

En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para uso en terapia. En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para usar en el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. En una realización adicional, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes seleccionados de metformina, tiazolidinodionas, sulfonilureas, inhibidores de dipeptidil peptidasa 4, y cotransportadores de glucosa de sodio para usar en el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2.

En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para uso en el control glucémico en adultos con diabetes mellitus tipo 2 como complemento de la dieta y el ejercicio. En una realización, la presente invención proporciona un compuesto de la presente invención para el manejo del peso crónico en adultos con un índice de masa corporal inicial >27 y diabetes mellitus tipo 2 como complemento de una dieta baja en calorías y una mayor actividad física.

En una realización, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2. En una realización adicional, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la presente invención en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes seleccionados de metformina, tiazolidinodionas, sulfonilureas, inhibidores de dipeptidil peptidasa 4, y cotransportadores de glucosa de sodio para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2.

La presente invención proporciona compuestos que presentan una actividad de GIP y GLP-1 equilibrada. La actividad equilibrada contra GIP y GLP-1 como se usa en la presente memoria se refiere a un compuesto que tiene afinidad por los receptores GIP y los receptores GLP-1 en un ensayo de unión in vitro en una relación molar cercana a 1:1, tal como 1:1 GLP-1/GIP, 2:1 GLP-1/GIP, 3:2 GLP-1/GIP, 1:2 GLP-1/GIP, o 2:3 GLP-1/GIP.

La presente invención proporciona compuestos que muestran selectividad para receptores GIP y GLP-1 versus receptores para glucagón y GLP-2. El término "selectividad" o "selectivo contra" cuando se usa en la presente memoria para hacer referencia a la actividad de GIP y GLP-1 en comparación con la actividad de glucagón, se refiere a un compuesto que muestra una potencia 1000, 500 o aproximadamente 100 veces mayor para GIP y GLP-1 respecto a glucagón cuando los datos se normalizan a partir de los respectivos ensayos de unión in vitro. El término "selectividad" o "selectivo contra" cuando se usa en la presente memoria para hacer referencia a la actividad de GIP y GLP-1 en comparación con la actividad de GLP-2, se refiere a un compuesto que muestra 250, 200, 100 o aproximadamente 50 veces más potencia para GIP y GLP-1 respecto a GLP-2 cuando los datos se normalizan a partir de los ensayos funcionales in vitro respectivos.

La presente invención proporciona un compuesto de la presente invención, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico, para uso en el tratamiento de la diabetes tipo 1. La presente invención también proporciona un compuesto de la presente invención, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico, para uso en el tratamiento de la diabetes tipo 1, en el que la administración es subcutánea. La presente invención también proporciona un compuesto de la presente invención, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más ingredientes activos adicionales en el tratamiento de la diabetes tipo 1. En una realización, el otro ingrediente o ingredientes activos están actualmente disponibles en fármacos para reducir la glucosa oral de una clase de fármacos que se considera previamente para administrar el estándar de cuidado según lo determinado por las pautas de la industria, tal como la American Diabetes Association.

Los compuestos de la presente invención utilizan un ácido graso químicamente conjugado con el grupo épsilon-amino de una cadena lateral de lisina. El ácido graso se conjuga con el grupo épsilon-amino de una cadena lateral de lisina a través de un conector. El conector comprende [2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a en el que a es 1 a 2. El ácido graso y el ácido gamma-glutámico en el conector actúan como aglutinantes de albúmina, y proporcionan el potencial para generar compuestos de acción prolongada. Los compuestos de la presente invención comprenden una lisina en la posición 20 que se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en el que a es 1 a 2 y b es 10 a 20. Como se muestra en las estructuras químicas de los Ejemplos 1 y 2, la primera unidad de [2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-acetil se conecta al grupo épsilon-amino de la cadena lateral de lisina. La segunda unidad de [2-(2-Aminoetoxi)-etoxi]-acetil posteriormente se une al grupo amino de la primera unidad de [2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil. Posteriormente, la primera unidad de yGIu se une al grupo amino de la segunda unidad de [2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil a través del grupo Y-carbonilo de la cadena lateral. Cuando a = 2, la segunda unidad de yGIu se une al grupo a-amino de la primera unidad de yGIu a través del grupo Y-carbonilo de la cadena lateral. Finalmente, el ácido graso simétrico se une al grupo a-amino de la primera (cuando a = 1) o segunda (cuando a = 2) unidad de YGlu.

Los compuestos de la invención se formulan preferentemente como composiciones farmacéuticas administradas por vías parenterales (por ejemplo, subcutánea, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o transdérmica). Dichas composiciones farmacéuticas y procedimientos para prepararlos son bien conocidos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, editor, 21° Edición, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006). La vía de administración preferida es la subcutánea.

Los compuestos de la presente invención pueden reaccionar con cualquiera de una serie de ácidos inorgánicos y orgánicos para formar sales de adición de ácido aceptables para uso farmacéutico. Las sales aceptables para uso farmacéutico y la metodología común para prepararlas son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2° Edición Revisada (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977. Las sales aceptables para uso farmacéutico de la presente invención incluyen sales de trifluoroacetato, clorhidrato y acetato.

Como se usa en la presente memoria, el término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad o dosis del compuesto de la presente invención, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico que, después de la administración de dosis única o múltiple al paciente, proporciona el efecto deseado en el paciente bajo diagnóstico o tratamiento. El médico encargado del diagnóstico, como alguien con experiencia en la técnica, puede determinar fácilmente una cantidad eficaz mediante el uso de técnicas conocidas y la observación de los resultados obtenidos en circunstancias análogas. Al determinar la cantidad eficaz para un paciente, el médico tratante considera una serie de factores, que incluyen, pero sin limitación; la especie de mamífero; su tamaño, edad y salud general; la enfermedad o trastorno específico involucrado; el grado de compromiso o gravedad de la enfermedad o trastorno; la respuesta del paciente individual; el compuesto particular administrado; el modo de administración; las características de biodisponibilidad de la preparación administrada; el régimen de dosis seleccionado; el uso de medicación concomitante; y otras circunstancias relevantes.

Como se usa en la presente memoria, el término "tratamiento" o "tratar" incluye restringir, lentificar, detener o revertir la progresión o la gravedad de un síntoma o trastorno existente.

Como se usa en la presente memoria, "semaglutida" se refiere a un análogo de GLP-1 sintetizado químicamente que tiene el esqueleto del péptido y la estructura del compuesto total que se encuentra en el número de registro CAS 910463-68-2.

Ciertos compuestos de la presente invención son generalmente efectivos en un amplio intervalo de dosificación. Por ejemplo, las dosis para una dosificación semanal pueden estar dentro del intervalo de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 30 mg por persona por semana. Ciertos compuestos de la presente invención se pueden administrar diariamente. Además, ciertos compuestos de la presente invención se pueden administrar una vez por semana.

Las secuencias de aminoácidos de la presente invención contienen los códigos estándar de una letra o tres letras para los veinte aminoácidos naturales. Además, "Aib" es ácido alfa amino isobutírico y "1-Nal" es 1-naftilalanina.

La presente invención también abarca nuevos intermediarios y procedimientos útiles para la síntesis de los compuestos de la presente invención, o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico. Los intermediarios y compuestos de la presente invención se pueden preparar mediante una variedad de procedimientos conocidos en la técnica. En particular, el procedimiento que usa síntesis química se ilustra en los siguientes ejemplos. Las etapas de síntesis para cada una de las vías descritas se pueden combinar de diferentes maneras para preparar compuestos de la presente invención, o sales de los mismos. Los reactivos y los materiales de partida están fácilmente disponibles para un experto en la técnica. Se entiende que estos ejemplos no pretenden limitar el alcance de la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que Xi es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:3)

sal de trifluoroacetato

La estructura anterior contiene el código de aminoácidos estándar de una letra con excepción de los residuos Aib2, Aib13 y K20 en los que las estructuras de estos residuos de aminoácidos se han expandido.

El péptido de acuerdo con la SEQ ID NO:3 de la presente invención se genera mediante síntesis de péptidos en fase sólida usando una estrategia Fmoc/t-Bu llevada a cabo en un sintetizador de péptidos automatizado Symphony (PTI Protein Technologies Inc.) a partir de la resina RAPP AM-Rink Amida y con acoplamientos que usan ⁶equivalentes de aminoácidos activados con diisopropilcarbodiimida (DIC) e hidroxibenzotriazol (HOBt) (relación molar 1:1:1) en dimetilformamida (DMF) durante 90 minutos a 25 °C.

Los acoplamientos extendidos (4 h cada uno) para Pro31, Trp25, Gln24, Val23, Phe22, Lys20, Gly4, Glu3 y Aib2 son necesarios para mejorar la calidad del péptido crudo. Se utiliza un bloque de construcción Fmoc-Lys (Alloc)-OH para el acoplamiento Lys20 (grupo protector ortogonal) para permitir la unión específica del sitio del resto de ácido graso más adelante en el procedimiento sintético. Las siguientes condiciones se utilizan para el acoplamiento de Fmoc-Ile-OH en la posición 12:Fmoc-Ile-OH ^{( 6}equiv.), PyBOP ^{( 6}equiv.) y DIEA (12 equiv.) en DMF durante 24 h a 25 °C. El residuo del extremo terminal N se incorpora como Boc-Tyr (tBu)-OH usando los protocolos DIC-HOBt descritos anteriormente.

Después de terminar el alargamiento de la resina peptídica descrita anteriormente, el grupo protector Alloc presente en Lys20 se elimina usando cantidades catalíticas de Pd (PPh³)⁴en presencia de PhSiH³como eliminador. Se usan ciclos adicionales de acoplamiento/desprotección mediante una estrategia de Fmoc/t-Bu para extender la cadena lateral Lys20 involucrada en Fmoc-NH-PEG²-CH²COOH (Catálogo ChemPep #280102), Fmoc-Glu (OH) -OtBu (Catálogo ChemPep #100703) y HOOC-(CH²)¹⁸-COOtBu. En todos los acoplamientos, se utilizan 3 equivalentes del bloque de construcción con PyBOP (3 equiv.) y DIEA ^{( 6}equiv.) en DMF durante 4 horas a 25 °C.

La escisión concomitante de la resina y la eliminación del grupo protector de la cadena lateral se llevan a cabo en una solución que contiene ácido trifluoroacético (TFA):triisopropilsilano:1,2-etanoditiol:agua:tioanisol 90:4:2:2:2 (v/v) durante 2 h a 25 °C seguido de precipitación con éter frío. El péptido crudo se purifica a > 99% de pureza (rendimiento purificado de 15-20%) mediante cromatografía de HPLC de fase inversa con gradiente de agua/acetonitrilo (que contiene 0,05% v/v TFA) en una columna C18, donde se mezclan las fracciones adecuadas y se liofilizan.

En una síntesis realizada esencialmente como se describió anteriormente, se examinó la pureza del Ejemplo 1 mediante HPLC analítica de fase inversa, y se confirmó la identidad usando LC/MS (observado: M+3H+/3 = 1605,2; M+3H+/calculado) 3 = 1605,5; observado: M+4H+/4 = 1204,3; Calculado M+4H+/4 = 1204,4).

Ejemplo 2

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([²-(²-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)²-CO-(CH²)18-CO²H; X³es 1 -NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:4)

sal de trifluoroacetato

La estructura anterior contiene el código estándar de aminoácidos de una letra con excepción de los residuos Aib2, Aib13, K20 y 1-Na122 en los que las estructuras de estos residuos de aminoácidos se han expandido.

El péptido de acuerdo con la SEQ ID NO:4 de la presente invención se sintetiza de un modo similar al que se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Las siguientes condiciones se usan para el acoplamiento de Fmoc-INaI-OH en la posición 22: Fmoc-INaI-OH (6 equiv.), PyBOP (6 equiv.), y DIEA (12 equiv.) en DMF durante 4 h a 25 °C.

Ejemplo 3

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)¹-CO-(CH²)16-CO²H; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:5)

sal de trifluoroacetato

El compuesto de acuerdo con la SEQ ID NO:5 de la presente invención se sintetiza de un modo similar al que se describió para el Ejemplo 1.

Ejemplo 4

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)²-CO-(CH²)16-CO²H; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:6)

sal de trifluoroacetato

El compuesto de acuerdo con la SEQ ID NO:6 de la presente invención se sintetiza de un modo similar al que se describió para el Ejemplo 1.

Ejemplo 5

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)²-CO-(CH²)18-CO²H; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:7)

sal de trifluoroacetato

El compuesto de acuerdo con la SEQ ID NO:7 de la presente invención se sintetiza de un modo similar al que se describió para el Ejemplo 1.

Ejemplo 6

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetN)2-(YGlu)1-CO-(CH2)16-CO2H; X³es 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:8) sal de trifluoroacetato

El compuesto de acuerdo con la SEQ ID NO:8 de la presente invención se sintetiza de un modo similar al que se describió para el Ejemplo 1.

Ejemplo 7

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)2-CO-(CH2)16-CO2H; X³es 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:9) sal de trifluoroacetato

El compuesto de acuerdo con la SEQ ID NO:9 de la presente invención se sintetiza de un modo similar al que se describió para el Ejemplo 1.

Ejemplo 8

YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS

en el que X¹es Aib; X²es Aib; K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H; X³es 1-NaI; y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:10) sal de trifluoroacetato

El compuesto de acuerdo con la SEQ ID NO:10 de la presente invención se sintetiza de un modo similar al que se describió para el Ejemplo 1.

Ensayos

A continuación, se proporcionan las condiciones y los datos para Ejemplos en varios ensayos: función y selectividad in vitro, perfil de inmunogenicidad, farmacocinética y modelos de diabetes tipo 1 in vivo.

Función y selectividad in vitro

Potencia de unión in vitro a receptores GLP-1 y GIP humanos

La potencia de unión in vitro de los compuestos de la presente invención a los receptores GIP y GLP-1 humanos se evalúa mediante la medición de las afinidades de unión, como Ki, usando membranas celulares crudas obtenidas de líneas celulares clonales que sobreexpresan el ADNc GLP1 R o ADNc de GIP-R humano.

El ensayo de unión al receptor del polipéptido insulinotrópico insulinodependiente humano utiliza hGIP-R (Usdin, T.B., Gruber, C., Modi, W. and Bonner, T i, GenBank: AAA84418.1) clonado en el plásmido pcDNA3.1 (Promega)-NeoR. El plásmido hGIP-R-pcDNA3.1/Neo se transfecta en células de ovario de hámster chino, CHO-S, para cultivos en suspensión y se selecciona en presencia de 500 pg/ml de Geneticina (Invitrogen).

Las membranas plasmáticas crudas se preparan usando células de cultivo en suspensión. Las células se lisan en hielo en tampón hipotónico que contiene Tris HCl 25 mM, pH 7,5, MgCh 1 mM, ADNasa1 20 p/ml e inhibidores Roche Complete TM sin e Dt A. La suspensión celular se homogeniza con un homogeneizador Dounce de vidrio con un pilón de Teflon® por 25 golpes. El homogenizado se centrifuga a 4 °C a 1800 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se recoge y el pellet se resuspende en tampón hipotónico y se homogeniza. La mezcla se centrifuga a 1800 x g durante 15 minutos. El segundo sobrenadante se combina con el primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados se vuelven a centrifugar a 1800 x g durante 15 minutos para clarificar. El sobrenadante clarificado se transfiere a tubos de alta velocidad y se centrifuga a 25000 x g durante 30 minutos a 4 °C. El pellet de membrana se resuspende en tampón de homogeneización y se almacena como alícuotas congeladas a -80 °C en el congelador hasta su uso. El GIP se radioyoda mediante el procedimiento de I-125-lactoperoxidasa (Markalonis, J.J., Biochem. J. 113:299 (1969)) y se purifica por HPLC de fase inversa (Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences NEX-402). La actividad específica es 2200 Ci/mmol. La determinación de Kd se realiza mediante competición homóloga utilizando hGIP frío en lugar de unión por saturación. El ensayo de unión al receptor se lleva a cabo utilizando un Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA) con perlas de aglutinina de germen de trigo (WGA) (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences) previamente bloqueadas con BSA libre de ácidos grasos 1% (Gibco, BSA 7,5%). El tampón de unión contiene HEPES 25 mM, pH 7,4, CaC^2,5 mM, MgCh 1 mM, BSA libre de ácidos grasos 0,1%, Tween20 0,003% e inhibidores Roche Complete™ sin EDTA. La hGIP y los compuestos de la presente invención se disuelven en DMSO 100% y se almacenan a -20 °C. Los compuestos se diluyen en serie en tampón de unión. A continuación, se transfieren 10 j l de compuesto diluido o DMSO 100% a placas de ensayo de fondo transparente Corning® 3632 que contienen 40 j l de tampón de unión de ensayo o GIP frío (NSB a 0,1 jM final). Posteriormente, se añaden 90 j l de membranas (3 jg/pocillo), 50 j l [125I] GIP (Perkin Elmer Life and Analytical Sciences a 0,15 nM final en reacción), y se añaden 50 j l de perlas WGA (150 jg/pocillo), se sellan, y se mezclan en un agitador de placas durante 1 minuto. Las placas se leen con un contador de centelleo MicroBeta® después de 12 horas de reposo a temperatura ambiente.

Los resultados se calculan como un porcentaje de unión específica de I-125-GIP en presencia de compuesto. La concentración absoluta de IC⁵⁰se obtiene por regresión no lineal del porcentaje de unión específica de I-125-GIP versus la concentración de compuesto añadido. La concentración de IC⁵⁰se convierte en Ki utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff.

El ensayo de unión al receptor GLP-1 utiliza el receptor del péptido 1 similar a glucagón humano clonado (hGLP-1 R) (Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196 (1): 141-6, 1993) aislado de membranas 293HEK. El ADNc de hGLP-1 R se subclona en el plásmido de expresión phD (Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5:1189-1192, 1987). Este ADN plasmídico se transfecta en células 293HEK y se selecciona con 200 jg/m l de higromicina.

Las membranas plasmáticas crudas se preparan usando células de cultivo en suspensión. Las células se lisan en hielo en tampón hipotónico que contiene Tris HCl 25 mM, pH 7,5, MgCh 1 mM, ADNAsa1 20 j/m l e inhibidores Roche Complete™ sin EDTA. La suspensión celular se homogeniza con un homogeneizador Dounce de vidrio con un pilón de Teflon® por 25 golpes. El homogenizado se centrifuga a 4 °C a 1800 x g durante 15 minutos. El sobrenadante se recoge y el sedimento se resuspende en tampón hipotónico y se vuelve a homogenizar. La mezcla se centrifuga a 1800 x g durante 15 minutos. El segundo sobrenadante se combina con el primer sobrenadante. Los sobrenadantes combinados se vuelven a centrifugar a 1800 x g durante 15 minutos para clarificar. El sobrenadante clarificado se transfiere a tubos de alta velocidad y se centrifuga a 25000 x g durante 30 minutos a 4 °C. El pellet de membrana se resuspende en tampón de homogenización y se almacena como alícuotas congeladas a -80 °C en el congelador hasta su uso.

El péptido 1 similar a glucagón (GLP-1) se radioyoda mediante el procedimiento de I-125-lactoperoxidasa (Markalonis, J.J., Biochem. J. 113:299 (1969)) y se purifica por HPLC de fase inversa (Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences NEX-402). La actividad específica es 2200 Ci/mmol. La determinación de Kd se realiza mediante competición homóloga en lugar de unión por saturación debido al alto contenido de propanol en el material 1-125 GLP-1. La KD se estima en 0,329 nM y se usa para calcular los valores de Ki para todos los compuestos analizados.

El ensayo de unión al receptor se lleva a cabo utilizando un Ensayo de Proximidad de Centelleo (SPA) con perlas de aglutinina de germen de trigo (WGA) previamente bloqueadas con BSA libre de ácidos grasos 1% (Gibco). El tampón de unión contiene HEPES 25 mM, pH 7,4, CaCl²2,5 mM, MgCh 1 mM, BSA libre de ácidos grasos 0,1%, Tween20 0,003% e inhibidores Roche Complete™ sin EDTA. El péptido 1 similar a glucagón (GLP-1) se disuelve en DMSO 10% y se almacenan a -20 °C en alícuotas de 30 jl. La alícuota del péptido 1 similar a glucagón se diluye y se usa en ensayos de unión dentro de una hora. El análogo del péptido se disuelve en DMSO 100% y se diluye en forma seriada en DMSO 100%. A continuación, se transfieren 10 j l de compuesto diluido o DMSO 100% a placas de ensayo de fondo transparente Corning® 3632 que contienen 40 j l de tampón de unión de ensayo o glucagón frío (NSB a 0,1 jM final). Posteriormente, se añaden 90 j l de membranas (5 jg/pocillo), 50 j l de péptido 1 similar a glucagón (0,15 nM final en reacción), y se añaden 50 j l de perlas WGA (150 jg/pocillo), se sellan, y se mezclan en un agitador de placas durante 1 minuto. Las placas se leen con un contador de centelleo PerkinElmer Life and Analytical Sciences Trilux MicroBeta® después de 12 horas de reposo a temperatura ambiente.

Los resultados se calculan como un porcentaje de la unión específica del péptido 1 similar a glucagón I-125 en presencia de compuestos. La concentración IC⁵⁰absoluta del compuesto se obtiene por regresión no lineal del porcentaje de unión específica del péptido 1 similar a glucagón I-125 versus la concentración del compuesto añadido. La concentración de IC⁵⁰se convierte en Ki usando la ecuación de Cheng-Prusoff.

En los experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, ciertos compuestos de la presente invención muestran una relación hGLP-1 R/hGIPR de aproximadamente 0,5-4,0 (Tabla 1). La relación de unión molar se normaliza a la relación molar correspondiente de una mezcla de GIP y GLP-1 nativo. Este factor de normalización es 4,53 sobre la base de los datos de unión para GIP (Ki = 0,175 nM) y GLP-1 (Ki = 0,793 nM). El valor de 1,48 demuestra la actividad coagonista equilibrada del Ejemplo 1.

Tabla 1: Afinidad de unión al receptor, Ki, nM (SEM, n)

Las medias se expresan como medias geométricas con el error estándar de la media (SEM) y el número de repeticiones (n) indicado entre paréntesis. Un calificador (>) indica que los datos no alcanzaron el 50% de inhibición y la Ki se calcula usando la concentración más alta probada en el ensayo.

Ensayos funcionales de hGIP-R, hGLP-1R y hGCGR

La actividad funcional in vitro hacia los receptores humanos GIP, GLP-1 y glucagón para los compuestos de la presente invención se determina en líneas celulares clonales HEK-293 que expresan estos receptores. Cada línea celular que sobreexpresa el receptor se trata con compuestos de la presente invención en DMEM (Gibco Cat# 31053) suplementado con IX GlutaMAX™ (Gibco Cat# 35050), FBS 0,25%, fracción V BSA 0,05%, IBMX 250 pM y HEPES 20 mM en un volumen de ensayo de 40pl. Después de una incubación de 60 minutos a temperatura ambiente, el aumento resultante en AMPc intracelular se determina cuantitativamente usando el kit de ensayo CisBio AMPc Dynamic 2 HTRF (Bedford, MA). Brevemente, los niveles de AMPc dentro de la célula se detectan mediante la adición del conjugado AMPc-d2 en el tampón de lisis celular (20 pl) seguido del anticuerpo anti-anti-AMPc-Eu3+-Criptato, también en el tampón de lisis celular (20 pl). El ensayo competitivo resultante se incuba durante al menos 60 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se detecta usando un instrumento PerkinElmer Envision® con excitación a 320 nm y emisión a 665 nm y 620 nm. Las unidades Envision (emisión a 665 nm/620 nm*10.000) son inversamente proporcionales a la cantidad de AMPc presente y se convierten en nM AMPc por pocillo usando una curva estándar de AMPc. La cantidad de AMPc generada (nM) en cada pocillo se convierte en un porcentaje de la respuesta máxima observada con GIP(1-42)NH2 humano, GLP-1(7-36) NH²humano o controles de glucagón humano. Se obtiene un valor de EC⁵⁰relativo y un porcentaje superior (Emax) mediante análisis de regresión no lineal usando el porcentaje de respuesta máxima versus la concentración del compuesto de la presente invención, ajustada a una ecuación logística de cuatro parámetros.

En los experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, ciertos compuestos de la presente invención demuestran actividad contra los receptores de GIP y GLP-1 humanos, mientras que también demuestran selectividad sobre el receptor de glucagón. En la Tabla 2, se muestra la potencia funcional contra los receptores para los controles de hGIP(1-42)NH2, hGLP-1(7-36)NH2 y hGlucagón nativos, y ciertos compuestos de la presente invención.

Tabla 2. Potencia funcional (EC ⁵⁰ ) contra los receptores humanos GIP, GLP-1, y glucagón

Las medias para EC⁵⁰se expresan como medias geométricas /-error estándar de la media (SEM) con el número de repeticiones (n) indicado entre paréntesis. Las medias para Emax se expresan como la media aritmética /-error estándar. ND significa que no se detectó actividad agonista. Un calificador (>) indica que no se pudo determinar una EC⁵⁰. Todos los valores mostrados son de tres dígitos significativos

Activación funcional de células hGIP-R para generar AMPc intracelular en líneas celulares secretoras de incretina

La actividad funcional de hGIP-R para los compuestos de la presente invención se demuestra por la capacidad de los compuestos para generar AMPc intracelular en células GLUTag, una línea celular enteroendocrina murina inmortalizada relativamente diferenciada estable que expresa el gen proglucagón y secreta los péptidos similares a glucagón de manera regulada. Las células se mantienen a 37 °C, CO²5%, humedad 95% en medio DMEM suplementado con glucosa 5,5 mM, FBS 10% y glutamina 2 mM. Antes del ensayo, las células se tripsinizan, se sedimentan y se siembran en placas de ensayo de cultivo de tejidos de 96 pocillos a una densidad de 20.000 células/pocillo. Se deja que las células se unan y se incuben durante 48 horas a 37 °C, CO²5%. El día del ensayo, los medios se decantan de las células y se añaden 50 pl de tampón EBSS (BSA 0,1%, glucosa 2 mM e IBMX 0,25 mM) que contiene una variedad de concentraciones de compuestos (0,001 -3 pM) a las células. La placa se incuba a 37 °C durante una hora y se determinan los niveles de AMPc utilizando el kit Cisbio Dynamic 2 AMPc HTRF (Bedford, MA). Se añaden 25 pl de anti-criptato de AMPc y 25 pl de AMPc d2 a cada pocillo y las placas se incuban durante una hora a temperatura ambiente. Las placas se leen a 620 nm y 665 nm en un Tecan Genios Pro. Los resultados se calculan a partir de la relación 665 nm/620 nm multiplicada por 10000, y se convierten en nM AMPc por pocillo utilizando una curva estándar de AMPc. Los datos se analizan con GraphPad utilizando un algoritmo logístico no lineal de 4 parámetros.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, ciertos compuestos de la presente invención muestran una acumulación de AMPc mejorada, dependiente de la dosis, de células GLUTag (Tabla 3). El control de GLP-1 nativo no puede inducir ningún cambio en AMPc en todas las concentraciones analizadas e indica que este sistema celular expresa exclusivamente el receptor GIP; por lo tanto, se puede demostrar que ciertos compuestos de la presente invención ejercen un efecto a través del receptor GIP.

Tabla 3: EC⁵⁰en células GLUTag

Medición de AMPc intracelular en células HEK293 que expresan transitoriamente el receptor GLP-2 humano

La actividad funcional de hGLP-2R en presencia de compuestos de la presente invención se demuestra mediante la medición de AMPc intracelular en células HEK293. Estas células se pasan en medio completo, se transfectan en suspensión con el reactivo Promega Fugene6 y el ADNc de GLP-2R humano de longitud completa en el vector de expresión pcDNA3.1, y se dejan adherir a matraces de cultivo de tejidos en un ambiente humidificado a 37 °C, CO²5%. Después de aproximadamente 48 horas de propagación, las células se levantan, se filtran y se criopreservan con congelación a velocidad controlada y DMSO 10% como crioprotector. En ensayos posteriores, se descongela un vial listo para ensayo único del mismo congelamiento celular para minimizar la variación entre ensayos. El día del ensayo celular, el medio de congelación se intercambia con DMEM Invitrogen 31053 que contiene FBS 0,5%.

Las células se recuentan para determinar la viabilidad y se equilibran durante aproximadamente una o dos horas a 37 °C antes del tratamiento. Los compuestos de la presente invención se solubilizan en DMSO y se diluyen inmediatamente en medio DMEM que contiene fracción V BSA 0,1% y el inhibidor no específico de fosfodiesterasa, IBMX. La duración del tratamiento es de 30 minutos a 37 °C. La concentración final de DMSO no supera 1,1%, y la concentración final de IBMX es de 250 pM. El AMP cíclico se mide utilizando el ensayo dinámico 2 con tecnología de fluorescencia resuelta en el tiempo homogénea (Cisbio Bioassays, Bedford, MA).

Las respectivas concentraciones de AMPc se deducen del procedimiento de cálculo de la relación y los estándares externos. Las respuestas de dosis sigmoidales de los compuestos analizados se examinan usando la ecuación logística de cuatro parámetros y se comparan con el ligando acilado C18 nativo.

En los experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el control GLP-2 humano acilado-C18 tiene un valor de EC⁵⁰para la activación del receptor de 1,71 nM, mientras que ciertos compuestos de la presente invención tienen valores de EC⁵⁰de aproximadamente 100x a 1000x más. Los valores de EC⁵⁰para ciertos compuestos de la presente invención demuestran selectividad contra el receptor GLP-2.

Tabla 4: Medición de actividad funcional de GLP-2R en células HEK293

Secreción de insulina de islotes de roedor

Para evaluar la acción de los compuestos de la presente invención en un sistema que representa los niveles de expresión de insulina de GLP-1 R y GIP-R fisiológicos, los compuestos se analizan para determinar los efectos sobre la secreción de insulina de los islotes de roedores de tipo salvaje.

Después de la canulación del conducto biliar común en ratones macho C57B1/6 (22-26 g) o ratas macho Sprague-Dawley (aprox. 250 g), el páncreas se distiende con tampón de Hank (3 ml para ratones o 10 ml para ratas, que contiene BSA 2% y 0,75 mg/ml de Clzyme colagenasa (VitaCyte). Posteriormente, los tejidos se digieren en tampón de Hank a 37 °C durante 11-13 minutos (ratones) o 14-16 minutos para pancreata de rata. Islotes purificados (Histopaque-1100 gradiente [Sigma-Aldrich], 18 minutos a 750x de gravedad) se cultivan durante la noche en medio RPMI-1640 (Invitrogen) que contiene FBS 10%, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 mg/ml, y se preacondicionan por inanición en la solución salina equilibrada de Earle (EBSS) suplementada con BSA 0,1% y glucosa 2,8 mM. Posteriormente, los islotes se incuban en EBSS (Invitrogen) suplementado con BSA 0,1%, glucosa 2,8-11,2 mM y niveles crecientes de compuesto (6 lotes de 4 islotes/condición). GLP-1 (7-36) amida (30 nM) se usa como control positivo La insulina se mide durante 90 minutos en el sobrenadante usando el ensayo de insulina MSD (Meso Scale, Gaithersburg, MD).

Ciertos compuestos de la presente invención aumentan de forma dependiente de la dosis la secreción de insulina tanto de los islotes de rata como de ratón como se representa en la Tabla 5.

Tabla 5. Secreción de insulina del islote de roedor

Perfil de inmunogenicidad

El riesgo de inmunogenicidad para los compuestos de la presente invención se evalúa usando programas de predicción in silico, tal como análisis in silico Epivax. El riesgo de inmunogenicidad para los compuestos de la presente invención también se evalúa mediante un procedimiento ex vivo para medir las respuestas de células T cultivadas (captación de 3H-timidina y secreción de citoquina IL-2) en presencia de compuestos de la presente invención.

Con las herramientas inmunoinformáticas Epivax, se realiza una evaluación in silico de los compuestos de la presente invención para predecir una respuesta inmune después de la administración. El análisis utiliza la probabilidad de que un marco de 9 mer se una a un alelo de antígeno leucocitario humano (HLA) dado y posteriormente la detección de estas Epi-Bars. Para el Ejemplo 1, una puntuación EpiMatrix de aproximadamente 1,13 indica un potencial mucho menor para inducir una respuesta inmune en comparación con el esqueleto del péptido GIP nativo con una puntuación EpiMatrix de 15,4. Un ejemplo de coagonista de GIP/GLP-1 del documento WO 2011/119657 tenía una puntuación de 29,5.

También se examina una medición de inmunogenicidad clínica predicha para los compuestos de la presente invención mediante el uso de la caracterización de la proliferación de células T CD4+ y la secreción de citoquinas IL-2 en una cohorte de 50 donantes sanos representativos de la población mundial de alotipos HLA. Ciertos compuestos de la presente invención demuestran un grado de estimulación de células T y secreción de IL-2 después de la exposición que no supera el umbral asociado con compuestos inmunogénicos conocidos o positivos, lo que indica un bajo riesgo de producir inmunogenicidad clínica.

Farmacocinética

Farmacocinética en monos cynomolgous

Las propiedades farmacocinéticas in vivo para los compuestos de la presente invención se demuestran usando monos cynomolgus. Los compuestos se administran mediante una dosis intravenosa o subcutánea única (0,2 mg/kg) en tampón de citrato 20 mM (pH 7,0) a un volumen de 0,21 ml/kg. Se recoge sangre de cada animal a las 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 204, 240 y 312 horas después de la dosificación. Las concentraciones plasmáticas de los compuestos de la presente invención se determinan mediante un procedimiento LC/MS. Brevemente, un compuesto de la presente invención se extrae de una muestra de plasma de mono al 100% (50 j l) diluida con IX PBS (150 j l) y se mezcla con N-butanol (400 jl). Se forman tres capas líquidas distintas con el compuesto ubicado en la capa superior. Se transfiere un volumen de 200 j l a una placa de 96 pocillos con fondo en V, se seca usando gas nitrógeno calentado y se reconstituye con 100 j l de acetonitrilo 30%/ácido fórmico al 0,1%. Se inyectan 20 j l de la muestra reconstituida en una columna Supelco Analytical Discovery bio wide C5 de 3 jm . El efluente de la columna se dirige a un espectrómetro de masas Thermo Q-Exactive para detección y cuantificación.

En los experimentos realizados esencialmente como se describe para este ensayo, el Ejemplo 1 alcanzó una concentración plasmática máxima media aproximadamente 8 horas después de la dosis subcutánea. La vida media es de 55 horas y la depuración media es de 0,73 ml/h/kg. La biodisponibilidad es aproximadamente del 83%. Estos datos respaldan el potencial de dosificación semanal para el Ejemplo 1. Los datos para otros compuestos de la presente invención se resumen en la Tabla 6.

Tabla 6: Parámetros farmacocinéticos medios después de una dosis subcutánea única de 0,2 mg/kg a monos Cynomolgus machos

Proyección de la potencia de dosis

La prueba de tolerancia a la glucosa intravenosa (ivGTT) en la rata se usa para estimar la potencia relativa de los compuestos de la presente invención en comparación con la semaglutida. Se administran dosis subcutáneas únicas (SC) de 0,1-10 nmol/kg de cada compuesto a las ratas y se administra una ivGTT a cada rata 16 horas después de la dosificación. La exposición se mide en el momento de la ivGTT, y para el modelado de la respuesta a la exposición, la AUC de insulina en respuesta a la ivGTT se usa como criterio de valoración primario.

Se utiliza un modelo Emax para comparar los perfiles de respuesta de exposición para el ejemplo 1 a semaglutida. En los experimentos realizados esencialmente como se describe para este ensayo, la exposición es esencialmente la misma para el Ejemplo 1 y semaglutida para los niveles de dosis con niveles de fármaco superiores al límite de cuantificación del ensayo. Ambos conjuntos de datos se ajustan simultáneamente y los valores E0 y Emax están obligados a ser los mismos para ambos compuestos. Solo los valores ED⁵⁰se ajustan por separado para los compuestos. El valor ED⁵⁰para semaglutida se estima en 0,6 /-0,2 nmol/kg. La potencia del Ejemplo 1 se estima como una potencia relativa para semaglutida, y es 1,7 /-0,6 veces la potencia de la semaglutida. Por el ajuste de las diferencias de CL/F (depuración aparente) entre las dos moléculas en los monos y también la diferencia en el peso molecular, la dosis equivalente humana media proyectada a 1 mg de semaglutida es de aproximadamente 1,3 mg/semana para el Ejemplo 1.

Diabetes tipo 2

Secreción de insulina in vivo de rata después de la glucosa intravenosa (IVGTT)

Las ratas Wistar machos (Harlan Labs, Indianápolis, IN) se aleatorizan por peso corporal y se tratan con 1,5 ml/kg s.c.

16 horas antes de la administración de glucosa y posteriormente en ayunas. Las dosis son vehículo, 0,1, 0,3, 1, 3 y 10 nmol/kg. Los animales se pesan y posteriormente se anestesian con pentobarbital de sodio (solución de nembutal de sodio; Ovation Pharmaceuticals), con dosificación i.p. (65 mg/kg, 30 mg/ml). Se recoge una muestra de sangre de tiempo cero en tubos de EDTA después de lo cual se administra glucosa (0,5 mg/kg, 5 ml/kg). Se recogen muestras de sangre a los 2, 4, 6, 10, 20 y 30 minutos después de la glucosa. Los niveles de glucosa en plasma se determinan usando un analizador Hitachi (Roche) y la insulina en plasma se mide mediante el ensayo de insulina MSD (Meso Scale, Gaithersburg, MD).

Como se muestra en la Tabla 7, ciertos compuestos de la presente invención aumentan la secreción de insulina de forma dependiente de la dosis después de la inyección i.v. de glucosa. La ED⁵⁰para la insulina y los aumentos máximos en la secreción de insulina (medidos como área bajo la curva de insulina) se dan en la Tabla 7.

Tabla 7. Aumento de la secreción de insulina en el ensayo IVGTT de rata

Efecto de la pérdida de peso, composición corporal y esteatosis hepática en ratones obesos inducidos con dieta (DIO)

Los efectos sobre la pérdida de peso, la composición corporal y la esteatosis hepática en ratones DIO para compuestos de la presente invención se evalúan en ratones C57/BL6 DIO. Estos animales, aunque no son diabéticos, muestran resistencia a la insulina, dislipidemia y esteatosis hepática, todas características del síndrome metabólico, después de ser colocados en una dieta rica en grasas (60% Kcal de grasa) durante 12 semanas.

En este estudio, se usan ratones machos C57/B16 con obesidad inducida por dieta (DIO) machos de 23-24 semanas de edad, cada uno con un peso de 41-49 g y tiene una masa de grasa inicial que varía de 10,5-17,5 g. Los animales se alojan individualmente en una instalación de temperatura controlada (24 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas a las 22:00), y acceso libre a alimentos y agua. Después de 2 semanas de aclimatación a la instalación, los ratones se aleatorizan a grupos de tratamiento (n = 5/grupo) en función del peso corporal, por lo que cada grupo tiene un peso corporal medio inicial similar.

El control del vehículo, los compuestos de la presente invención (con dosis que oscilan de 10 a 100 nmol/kg), o una semaglutida análogo de GLP1 de acción prolongada (30 nmol/kg), disueltos en el vehículo (tampón de citrato 20 mM a pH 7,0), se administran por inyección S^ca ratones DIO alimentados ad libitum 30-90 minutos antes del inicio del ciclo de oscuridad cada tres días durante 15 días. Las inyecciones SC se realizan los días 1, 4, 7, 10 y 13. El peso corporal diario y la ingesta de alimentos se miden durante todo el estudio. Los cambios absolutos en el peso corporal se calculan mediante la sustracción del peso corporal del mismo animal antes de la primera inyección de compuesto. En los días 0 y 14, la masa grasa total se mide por resonancia magnética nuclear (RMN) usando un instrumento Echo Medical System (Houston, TX).

El día 15, se mide la glucosa en sangre con el glucómetro Accu-Chek (Roche) de la sangre de la vena de la cola y posteriormente los animales se sacrifican y los hígados se extraen y congelan. Los triglicéridos hepáticos, determinados a partir de homogenizados de hígados recogidos en el sacrificio, y el colesterol en plasma se miden en un analizador clínico Hitachi Modular P. Las comparaciones estadísticas entre grupos se realizan mediante ANOVA de una vía seguido de la prueba de comparación múltiple de Dunnett. La ED⁵⁰para reducir la pérdida de peso se determina en GraphPad Prism utilizando la herramienta de ajuste no lineal.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, ciertos compuestos de la presente invención redujeron el peso corporal y la masa grasa de una manera dependiente de la dosis (Tabla 8-13), y en comparación con la semaglutida, pueden ser 3-5 veces más eficaces en la reducción del peso corporal. La ED50 del Ejemplo 1 en porcentaje de pérdida de peso corporal es 5,422 nmol/kg (niveles de intervalo de confianza de 95% [nmol/kg] = 2,2 a 13,6). Se encuentra que el peso corporal reducido se debe principalmente a la reducción de la masa grasa.

Tabla 8. Cambio porcentual de peso corporal o masa grasa en ratones DIO.

Tabla 9. Cambio porcentual de peso corporal o masa grasa en ratones DIO.

Tabla 10. Cambio porcentual de peso corporal o masa grasa en ratones DIO.

Tabla 11. Glucosa en sangre, colesterol plasmático y trig licéridos plasmáticos en ratones DIO.

Tabla 12. Glucosa en sangre, colesterol plasmático y trig licéridos plasmáticos en ratones DIO.

Tabla 13. Glucosa en sangre y colesterol plasmático en ratones DIO.

El efecto del metabolismo energético en ratones DIO

Los efectos sobre el metabolismo energético en ratones DIO para los compuestos de la presente invención se evalúan en ratones machos C57/B16 DIO de 26 semanas, que pesan 43-50 g. Los ratones se alojan individualmente en una instalación de temperatura controlada (24 °C) con un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (luces encendidas a las 22:00), y con acceso libre a los alimentos TD95217 (Teklad) y agua. Después de 2 semanas de aclimatación a la instalación, los ratones se aleatorizan a grupos de tratamiento (n = 6/grupo) sobre la base del peso corporal, por lo que cada grupo tiene un peso corporal medio inicial similar. Los animales se colocan en un calorímetro PhenoMaster/LabMaster (t Se Systems, Chesterfield, MO) durante 3 días de aclimatación. El control del vehículo (tampón de citrato 20 mM a pH 7,0, 10 ml/kg), los compuestos de la presente invención, o un análogo de GLP1 de acción prolongada, semaglutida, (30 nmol/kg) se administran por vía subcutánea a ratones DIO alimentados a voluntad 30-90 minutos antes del inicio del ciclo de oscuridad cada tres días durante 22 días. El calor y el cociente respiratorio (RER) se miden por calorimetría indirecta como se describe usando un sistema de calorimetría de circuito abierto. RER es la relación del volumen de CO²producido (Vco²) al volumen de O²consumido (Vo²). El calor se calcula teniendo en cuenta el peso corporal total:

V 02- FlujoML*(V1 + V2)/N2Rej'* Peso del animal *100)

VC02=FlujoML*dC02/Peso del animal *100)

Calor = (CV02 *VÜ2+CVC02 *VC02 j/WOO;

en la que CVO2=3,941; CVCO2=1,106

En los experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, los ratones tratados con el Ejemplo 1 aumentaron significativamente su tasa metabólica del 10 a 15% en comparación con el grupo control, a partir de la semana 2, y mantuvieron el efecto durante todo el período de tratamiento. La semaglutida, sin embargo, no tuvo efecto sobre la tasa metabólica. El aumento en la tasa metabólica para el Ejemplo 1 explica parcialmente la pérdida de peso adicional observada con el tratamiento del Ejemplo 1 en comparación con el tratamiento con semaglutida.

El efecto sobre el vaciado gástrico en ratones DIO

Los efectos sobre el vaciado gástrico en ratones DIO para compuestos de la presente invención se evalúan en ratones machos con obesidad inducida por dieta (DIO) de 23 semanas (Harlan). Los ratones están en ayunas durante 16-17 horas. Durante el inicio del período de ayuno, los ratones se dosifican por vía subcutánea con control de vehículo (tampón de citrato 20 mM a pH 7,0); dosis en aumento de compuestos de la presente invención (3, 10, 30 y 100 nmol/kg), o un análogo de GLP1 de acción prolongada, semaglutida, (30 nmol/kg). Al día siguiente, a los ratones se les administran 0,5 ml (0,5 gramos) de dieta semilíquida recién preparada (con 2 minutos de diferencia) por cebadura oral. El agua se elimina en este momento para evitar la dilución de la dieta administrada. Dos horas después de la administración de la dieta, los ratones se sacrifican con dos minutos de diferencia por gas CO². Se extrae el estómago mientras se sujeta en ambas aberturas cardíaca y pilórica, posteriormente se retiran las abrazaderas y se pesa el estómago completo en una bandeja para pesar. Posteriormente se realiza una incisión en el estómago y se retira el contenido.

El estómago se lava y se seca y se vuelve a pesar para evaluar el contenido de los alimentos en el estómago. El % de vaciado gástrico es igual a 100 x (1 -(comida restante en el estómago/comida administrada por vía oral)).

En los experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el Ejemplo 1 disminuyó la velocidad de vaciado gástrico de la dieta semilíquida de una manera dependiente de la dosis. La inhibición máxima del vaciado gástrico se observó a una dosis de 10 nmol/kg /-dosis (Tabla 14).

Tabla 14. Vaciado gástrico de una dieta semilíquida en ratones C57/BL6 DIO magros.

Mediciones de corticosterona de plasma en ratas Sprague Dawley

Como se sugiere en ciertos estudios publicados, los niveles de corticosterona plasmáticos elevados son un indicador de una posible tolerancia reducida para los análogos de GIP y GLP-1. Los niveles de corticosterona en plasma se evalúan usando ratas Sprague Dawley (Harlan, Indianápolis), que pesan aproximadamente 220 g y se aclimatan durante al menos 72 horas antes de la manipulación. Las ratas posteriormente se tratan con vehículo (tampón de citrato 20 mM, pH 7), semaglutida (10 nmol/kg) o compuestos de la presente invención a 3, 10 o 30 nmol/kg s.c. con 8 ratas por grupo de dosis. Las ratas se decapitan 16 horas después. La sangre se recoge en tubos de EDTA en hielo, posteriormente se centrifuga 5 minutos a 8000 RPM en una centrífuga de mesa Eppendorf 5402. El plasma se almacena a -80 °C hasta el análisis.

Para el análisis de corticosterona, los estándares de corticosterona (Sigma, 27840) se preparan mediante diluciones en serie en metanol grado HPLC, H2O y la adición de suero de rata tratado con carbón 5% (Bioreclamation, RATSRM-STRPD-HEV). Las muestras de plasma de rata se diluyen con PBS, se precipitan con metanol frío, se incuban durante 20 minutos a -20 °Cy posteriormente se centrifugan a 14,000 RPM con un Eppendorf 5417R a 4 °C. Los sobrenadantes se extraen, se evaporan bajo una corriente de gas N2 y se reconstituyen en una solución de MeOH/H2O (1:1). Las muestras se analizan en el LC/MS equipado con una columna de HPLC XSelect CSH C183,5 pm (2,1 mm x 30 mm) (Waters # 186005254).

En los experimentos realizados esencialmente como se describe para este ensayo, el Ejemplo 1 no demostró un aumento en los niveles de corticosterona en plasma en ninguna de las dosis analizadas mientras que la semaglutida tuvo un aumento de aproximadamente 4x sobre el control.

Tabla 15: Análisis de corticosterona plasmática en ratas Sprague Dawley

Secuencias de aminoácidos

SEQ ID NO:1 (GIP humano) YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ

SEQ ID NO:2 (Human GLP-1) HAEGTFTSDVSSILEGQAAKEFIAWLVKGR

SEQ ID NO:3 YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS en la que X¹es Aib; X²es Aib; K en la

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de Fórmula: YX¹EGTFTSDYSIX²LDKIAQKAX³VQWLIAGGPSSGAPPPS;

en la que

X¹es Aib;

X²es Aib;

K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación al grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con ([²-(²-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)²-(YGlu)a-CO-(CH²)b-CO²H en la que a es 1 a 2 y b es 10 a 20; X³es Phe o 1-NaI;

y el aminoácido del extremo terminal C está opcionalmente amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:11),

o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

2. El compuesto de la reivindicación 1, en el que X³es Phe.

3. El compuesto de la reivindicación 1, en el que X³es 1-NaI.

4. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que b es 14 a 18.

5. El compuesto de la reivindicación 4, en el que b es 16 a 18.

6. El compuesto de la reivindicación 5, en el que b es 18.

7. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en

el que a es 1.

8. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que a es 2.

9. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C.

10. El compuesto de la reivindicación 1, en el que

X¹es Aib

X²es Aib;

K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con [2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H;

X³es Phe;

y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como una amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:3),

o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

11. El compuesto de la reivindicación 1, en el que

X¹es Aib

X²es Aib;

K en la posición 20 se modifica químicamente a través de la conjugación con el grupo épsilon-amino de la cadena lateral K con([2-(2-Amino-etoxi)-etoxi]-acetil)2-(YGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H;

X³es 1-NaI;

y el aminoácido del extremo terminal C está amidado como amida primaria del extremo terminal C (SEQ ID NO:4), o una de sus sales aceptables para uso farmacéutico.

12. El compuesto de la reivindicación 1, en el que la Fórmula es:

13. Una composición farmacéutica que comprende el compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes con un portador, diluyente o excipiente aceptable para uso farmacéutico.

14. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, para uso en la terapia.

15. El compuesto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para uso en el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2.

16. El compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes seleccionados de metformina, tiazolidinodionas, sulfonilureas, inhibidores de dipeptidil peptidasa 4, y cotransportadores de glucosa de sodio en el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2.