KR101407775B1

KR101407775B1 - 신규 펩티드 및 그의 제조 방법 및 사용 방법

Info

Publication number: KR101407775B1
Application number: KR1020127025038A
Authority: KR
Inventors: 조지 알시나-페르난데즈; 크리스터 벵그트 보크비스트; 릴리 구오; 존 필립 메이어
Original assignee: 일라이 릴리 앤드 캄파니
Priority date: 2010-03-26
Filing date: 2011-03-23
Publication date: 2014-06-17
Also published as: ECSP12012181A; EA022489B1; AR080592A1; CA2794664A1; GT201200263A; CO6630128A2; TWI535450B; EA201270723A1; JP2013523647A; TW201201829A; PE20130523A1; DOP2012000244A; US8815811B2; AU2011232597A1; AU2011232597B2; BR112012024373A2; SG184289A1; CL2012002635A1; WO2011119657A1; MA34077B1

Abstract

본 발명은 당뇨병 치료 분야에 속하는 것으로, 글루코스-의존성 인슐린분비자극 펩티드 수용체 (GIP-R) 및 글루카곤-유사 펩티드-1 수용체 (GLP-1-R) 둘 모두에 대해 활성을 보이며, 글루카곤 수용체 (Gluc-R)에 대해 선택성인 펩티드에 관한 것이다. 구체적으로, GIP-R 및 GLP-1-R 둘 모두에 대한 활성을 조절하며, Gluc-R에 대한 선택성을 유지하도록 하는 아미노산 치환이 도입되어 있는 GIP 유사체를 제공한다.

Description

신규 펩티드 및 그의 제조 방법 및 사용 방법{NOVEL PEPTIDES AND METHODS FOR THEIR PREPARATION AND USE}

본 발명은 당뇨병 치료 분야에 속하는 것으로, 글루코스-의존성 인슐린분비자극(insulinotropic) 펩티드 수용체 (GIP-R) 및 글루카곤-유사 펩티드-1 수용체 (GLP-1-R) 둘 모두에 대해 활성을 보이며, 글루카곤 수용체 (Gluc-R)에 대해 선택성인 펩티드에 관한 것이다. 구체적으로, GIP-R 및 GLP-1-R 둘 모두에 대한 활성을 조절하며, Gluc-R에 대한 선택성을 유지하도록 하는 아미노산 치환이 도입되어 있는 GIP 유사체를 제공한다.

위 억제 펩티드 또는 글루코스-의존성 인슐린분비자극 펩티드, 이 둘 모두로 알려져 있는 GIP는 글루코스의 존재하에 췌장의 베타 세포로부터의 인슐린 분비를 자극함으로써 글루코스 항상성에 있어 생리학상 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 것인, 42개의 아미노산으로 된 위장관 조절 펩티드이다. GLP-1은 췌장의 베타 세포를 보호하고, 글루카곤 분비, 위의 공복 및 음식물 섭취를 억제시켜 체중 감소를 유도하는 것인, 37개의 아미노산으로 펩티드이다. GIP 및 GLP-1은 인크레틴인 것으로 알려져 있다. 인크레틴 수용체 신호 전달은 글루코스 항상성에 있어 중요한 생리학적으로 관련된 작용을 발휘한다. 글루카곤은 췌장에 의해 생산되는 것인, 29개의 아미노산으로 펩티드이다. 상기 호르몬은 글루코스를 방출하라는 신호를 간에 전달하여 혈당을 증가시킨다. 따라서, Gluc-R 자극은 당뇨병 환경하에서는 바람직하지 못하다.

건강한 대상체에서 관찰되는 것과의 차이는 제2형 당뇨병 인간에서는 GIP가 단독으로는 그리 대단하지 않은 글루코스-강하 효과를 발휘한다는 점이다. 그러나, 어느 정도 글루코스가 강하된 후에는 GIP 효능이 증가하게 되고, 정상 혈당 대상체에서 관찰되는 것에 가까워지게 된다. 한편, GLP-1은 건강한 대상체 및 당뇨병 대상체 둘 모두에서 글루코스를 강하시키는 데 효과가 있지만, 오심을 유발하는 바, 따라서, GLP-1의 완전한 효능이 영영 실현되지 못할 수 있다. 추가로, GIP 및 GLP-1 이 둘 모두는, 인슐린 분비를 자극할 수 없고, 이로써 오직 단기간의 대사 조절에만 사용될 수 있는 펩티드를 생산하는 도처에 존재하는 프로테아제, 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP IV)에 의해 빠르게 불활성화된다.

GIP 유사체 일부가 WO 2010/016940 및 WO 2010/016944에 기술되어 있다. GIP 및 GLP-1 활성 둘 모두를 보이는 글루카곤 유사체 일부가 WO 2010/011439에 기술되어 있다.

현 당뇨병 치료법은 인슐린 분비 촉진제, 예를 들어, 술포닐우레아 및 글리티니드를 포함하는데, 보통 이 효능은 점진적인 감소를 보이며, 제2형 당뇨병 환자에서는 저혈당증을 유발할 수 있다. 따라서, 지속적인 글루코스-의존성 방식으로 인슐린 분비를 강화시켜 주는 새로운 작용제를 찾아내야 할 필요가 있다. 오심없이 GLP-1의 글루코스-강하 효과를 가지는 새로운 작용제를 찾아내고, 추가로는 대사 안정성이 증가된 새로운 작용제를 찾아내는 것 또한 바람직할 수 있다.

본 발명은 GIP 및 GLP-1 둘 모두에 대한 활성을 조절하며, 동시에 글루카곤에 대한 선택성은 유지하도록 하는 아미노산 치환이 도입되어 있는, 효능이 강력하고 효과가 있는 새로운 펩티드를 제공한다. 본 발명은 GLP-1의 글루코스-강하 효과를 달성하고, GIP의 글루코스 자극에 의한 인슐린 분비 효과를 이용한다. 또한, 본 발명의 화합물 중 일부는 체중을 감소시키는 효과적인 치료법을 제공한다.

본 발명은 하기 서열을 포함하는 펩티드를 제공한다.

여기서, 22 위치의 Xaa¹은 Nal 또는 Phe이고; 43 위치의 Xaa²는 Cys이거나, 또는 부재하고; 44 위치의 Xaa³은 Cys이거나, 또는 부재하고; C-말단 아미노산은 임의로 아미드화되고; 단, 43 위치의 Xaa² 또는 44 위치의 Xaa³이 Cys이면, 그 중 하나 또는 그 둘 모두는 임의로 PEG화된다.

본 발명의 한 실시양태는 Xaa¹이 Phe인 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 Xaa¹이 Nal인 펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 한 실시양태는 Xaa² 및 Xaa³이 부재하는 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 Xaa² 및 Xaa³이 각각 Cys인 펩티드에 관한 것이다. 상기 실시양태에서, 44 위치의 Cys의 카르복실기가 아미드화된 것이 바람직하다.

본 발명의 추가의 바람직한 실시양태는 43 위치 및 44 위치의 Cys 중 어느 하나에서 20 kDa PEG 분자로 PEG화된 펩티드에 관한 것이다. 상기 실시양태에서, C-말단 Cys의 카르복실 기가 아미드화된 것이 바람직하다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 43 위치 및 44 위치의 Cys 둘 모두에서 20 kDa PEG 분자로 PEG화된 펩티드에 관한 것이다. 상기 실시양태에서, C-말단 Cys의 카르복실 기가 아미드화된 것이 바람직하다.

본 발명의 한 실시양태는 Xaa¹이 Phe이고; Xaa² 및 Xaa³이 부재하는 펩티드에 관한 것이다. 상기 실시양태에서, 42 위치의 C-말단 Gln의 카르복실 기가 아미드화된 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 Xaa¹이 Nal이고; Xaa² 및 Xaa³이 부재하는 펩티드에 관한 것이다. 상기 실시양태에서, 42 위치의 C-말단 Gln의 카르복실 기가 아미드화된 것이 바람직하다.

본 발명의 더욱 바람직한 실시양태는 Xaa¹이 Phe이고; Xaa² 및 Xaa³ 둘 모두가 Cys이고, 이 둘 모두가 임의로 PEG화되고, 44 위치의 Cys의 카르복실 기가 임의로 아미드화된 것인 펩티드에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 Xaa¹이 Nal이고; Xaa² 및 Xaa³이 Cys이고, 이들 Cys 중 하나 또는 둘 모두가 임의로 PEG화되고, 44 위치의 Cys의 카르복실 기가 임의로 아미드화된 것인 펩티드에 관한 것이다.

본 발명의 특히 바람직한 실시양태는

이고, 44 위치의 Cys가 아미드화된 것이다. 이러한 펩티드를 Aib², Aib¹³, Aib²⁹, Cys⁴³ (PEG20K), Cys⁴⁴ (PEG20K)-GIP라고 지칭한다.

본 발명의 가장 바람직한 실시양태는

이고, 44 위치의 Cys가 아미드화된 것이다. 이러한 펩티드를 Aib², Aib¹³, Nal²², Aib²⁹, Cys⁴³ (PEG20K), Cys⁴⁴ (PEG20K)-GIP라고 지칭한다.

본 발명은 또한 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 비-인슐린-의존성 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 비-인슐린-의존성 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 추가로 인슐린-의존성 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 펩티드를 투여하는 것을 포함하는, 환자에서 인슐린-의존성 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 비만, 대사 증후군, 관상 동맥 질환, 및 아테롬성동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태의 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 펩티드를 투여함으로써 상기 상태를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 체중 감소 유도 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 펩티드를 투여함으로써 체중 감소를 유도하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 노쇠 치료 또는 골 강도 증가를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 펩티드를 투여함으로써 노쇠를 치료하거나, 골 강도를 증가시키는 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은 요법에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 당뇨병 치료에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 본 발명은 비-인슐린-의존성 당뇨병 치료에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 본 발명은 인슐린-의존성 당뇨병 치료에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 비만 치료에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 추가로, 본 발명은 비만, 대사 증후군, 관상 동맥 질환, 및 아테롬성동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 본 발명은 추가로 체중 감소 유도에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다. 또한, 본 발명은 노쇠 치료 또는 골 강도 증가에 사용하기 위한 본 발명의 펩티드를 제공한다.

본 발명은 또한 당뇨병 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 비만 치료용 의약의 제조를 위한 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다. 본 발명은 추가로 대사 증후군, 관상 동맥 질환, 및 아테롬성동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태 치료용 의약의 제조를 위한 상기 기술된 펩티드의 용도를 제공한다. 본 발명은 추가로 체중 감소 유도용 의약의 제조를 위한 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 노쇠 치료용 또는 골 강도 증가용 의약의 제조를 위한 본 발명의 펩티드의 용도를 제공한다.

추가로, 본 발명은 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 본 발명의 펩티드를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 추가로, 본 발명은 당뇨병 치료를 위해 적합화된 제약 제제를 제공한다. 본 발명은 비-인슐린-의존성 당뇨병 치료를 위해 적합화된 제약 제제를 제공한다. 본 발명은 인슐린-의존성 당뇨병 치료를 위해 적합화된 제약 제제를 제공한다. 추가로, 본 발명은 비만 치료를 위해 적합화된 제약 제제를 제공한다. 본 발명은 또한 대사 증후군, 관상 동맥 질환, 및 아테롬성동맥경화증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 상태의 치료를 위해 적합화된 제약 제제를 제공한다. 본 발명은 체중 감소 유도를 위해 적합화된 제약 제제를 제공한다. 본 발명은 추가로 노쇠 치료 또는 골 강도 증가를 위해 적합화된 제약 제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 제제는 추가로 하나 이상의 다른 치료제를 포함한다.

본 발명은 또한 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 본 발명의 펩티드를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 조성물은 추가로 하나 이상의 다른 치료제를 포함한다.

본 발명은 추가로 DPPIV에 의해 빠르게 대사적으로 탈활성화될 가능성이 적은 안정한 분자를 제공한다.

본 발명의 서열은 천연적으로 발생된 20가지의 아미노산에 대한 표준 1문자 또는 3문자 아미노산 코드를 포함한다. 사용되는 다른 아미노산 코드는 하기와 같이 정의된다: Aib = 알파-아미노 이소부티르산; Nal = 1-나프틸알라닌.

"C-말단 아미노산"이라는 용어는 유리 카르복실 기를 함유하는 펩티드 서열 중 마지막 아미노산을 지칭한다. 본 발명의 C-말단 아미노산은 42 위치의 Gln, 43 위치의 Cys, 또는 44 위치의 Cys일 수 있다.

"폴리에틸렌 글리콜" 또는 "PEG"라는 용어는 커플링제 또는 커플링 또는 활성화 모이어티와의 유도체화를 포함하거나 포함하지 않는 폴리알킬렌 글리콜 화합물 또는 그의 유도체를 지칭한다. PEG의 전형적인 형태는 말단 히드록실 기를 가진 선형 중합체이며, 이는 화학식 HO-CH₂CH₂-(CH₂CH₂O) _n -CH₂CH₂-OH (여기서, n은 약 8 내지 4,000이다)를 가진다. mPEG는 모노메톡시-폴리에틸렌 글리콜이다. PEG는 전형적으로 그 분자량이 어느 정도 상이한 PEG 화합물의 혼합물로서 생성되고 사용되는 바, 당업자는 일반적으로 특정 PEG화된 화합물을 생성한 PEG화 반응에 사용된 PEG 시약의 평균 분자량을 기술함으로써 화합물에 부착된 PEG의 분자량을 기술한다. 당업계에는 많은 PEG 유도체가 존재한다. 본 발명의 펩티드에 공유적으로 부착된 PEG 분자는 10,000 달톤, 20,000 달톤, 30,000 달톤 또는 40,000 달톤일 수 있다. PEG 분자의 평균은 18,000 내지 22,000 달톤인 것이 바람직하다. 평균이 19,000 내지 21,000 달톤인 것이 더욱 바람직하다. 평균이 20,000 내지 21,000 달톤인 것이 가장 바람직하다. PEG 분자는 선형 또는 분지형일 수 있고, 단수로 또는 나란히 직렬로 존재할 수 있다. 본 발명의 PEG화된 펩티드는 직렬식 선형 PEG 분자가 펩티드의 C-말단에 부착되어 있는 것이 바람직하다. 특히, PEG 분자가 mPEG-20 kDa 말레이미드 (mPEG MAL) (I) 또는 mPEG-20 kDa 아이오도아세트아미드 (II) (여기서, n은 10 내지 2,500이다)에 의해 펩티드의 C-말단에서 두 시스테인 잔기에 부착되어 있는 것이 바람직하다. n이 350 내지 600인 것이 바람직하다. n이 425 내지 475인 것이 더욱 바람직하다.

본원에서 사용되는 바, "PEG화"라는 용어는 본 발명의 펩티드에 상기 기술되어 있는 바와 같은 하나 이상의 PEG 분자가 공유적으로 부착되는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드는 각 Cys의 티올 기에 공유적으로 연결된 20 kDa PEG 분자로 43 위치 및 44 위치의 Cys에서 PEG화된다.

하기 약어가 본원에서 사용된다: "t-Bu"는 tert-부틸을 지칭하고; "fmoc"는 플루오레닐메틸옥시카르보닐을 지칭하며; "Pbf"는 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐을 지칭하고; "Trt"는 트리틸 또는 트리페닐메틸을 지칭하며; "OtBu"는 tert-부톡실을 지칭하고; "Boc"는 tert-부톡시카르보닐을 지칭하며; "PyBOP"는 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트를 지칭하고; "DIEA"는 디이소프로필에틸아민을 지칭하고; "HEK"는 인간 배아 신장을 지칭하며; "트리스"는 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올을 지칭하고; "BSA"는 소 혈청 알부민을 지칭하며; "HEPES"는 2-[4-(2-히드록시에틸)피페라진-1-일]에탄술폰산을 지칭하고; "PBS"는 포스페이트 완충 염수를 지칭하며; "NSB"는 비-특이 결합을 지칭하고; "HBSS"는 행크스 완충 염 용액(Hank's buffered salt solution)을 지칭하며; "IBMX"는 1-메틸-3-(2-메틸프로필)-7H-퓨린-2,6-디온을 지칭하고; "DMSO"는 디메틸 술폭시드를 지칭한다.

펩티드 합성

본 발명의 모든 펩티드는 프로테인 테크놀로지스 인크. 심포니(Protein Technologies Inc. Symphony)® 자동 펩티드 합성기 상에서 고상 펩티드 합성에 의해 생성된다. 합성은 대략 0.7 mmol/g으로 치환된 Fmoc-링크(Fmoc-Rink) 아미드 폴리스티렌 수지 (랩프 폴리미어(Rapp Polymere: 독일 튜빙겐)) 상에서 수행된다. 합성은 Fmoc/t-Bu 고체 상 펩티드 합성을 사용하여 수행된다. 사용된 아미노산 측쇄 유도체는 하기와 같다: Arg(Pbf), Asp(OtBu), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), His(Trt), Lys(Boc), Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc) 및 Tyr(tBu). 실온에서 90분 동안 디메틸포름아미드 (DMF) 중, 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 히드록시벤조트리아졸 (HOBt)로 활성화된, 대략 6 당량의 아미노산 (1:1:1 몰비)을 사용하여 커플링을 수행한다. 22 위치에서의 Fmoc-(1-Nal)-OH의 커플링을 위해서는 하기 조건이 사용되었다: 실온에서 3 h 동안 DMF 중 Fmoc-(1-Nal)-OH (3 당량), PyBOP (3 당량), 및 DIEA (6 당량). 12 위치에서의 Fmoc-Ile-OH의 커플링을 위해서는 하기 조건이 사용되었다: 실온에서 10 h 동안 DMF 중 Fmoc-Ile-OH (6 당량), PyBOP (6 당량), 및 DIEA (12 당량).

실온에서 2 h 동안 트리플루오로아세트산 (TFA):트리이소프로필실란:1,2-에탄디티올:메탄올:티오아니솔 90:4:2:2:2 (v/v)를 함유하는 용액 중에서 수지로부터의 절단 및 측쇄 보호기 제거를 동시에 수행한다. 용액을 여과하고, 저온의 디에틸 에테르를 사용하여 침전시키고, 물 중 10% 아세토니트릴 30-40 mL에 다시 용해시키고, 18 mL/min의 유량으로 C₁₈ 역상 HPLC 칼럼 (전형적으로 워터스 시메트리프렙(Waters SymmetryPrep)™ 7 ㎛, 19 x 300 mm) 상에서 정제한다. 5분에 걸친 0 내지 18% B에 이어 110분에 걸친 18 내지 45% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/물 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴)로 샘플을 용리시킨다. 생성물은 일반적으로 28-35% 아세토니트릴에서 용리된다. 단일 사중극자 MS 검출기가 장착된 애질런트 1100 시리즈(Agilent 1100 Series) LC-MS 시스템 상에서 펩티드 순도 및 분자량을 확인한다. 15분에 걸친 6 내지 60% B로 이루어진 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/H₂O 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴 및 유량 = 1 mL/min)로 조르박스(Zorbax)® 이클립스(Eclipse)™ XDB-C8, 5 ㎛, 4.6 mm i.d. x 15 cm 칼럼 상에서 분석용 HPLC 분리를 수행한다. 모든 펩티드는 순도 > 95%로 정제되고, 1 amu 이내의 계산치에 상응하는 분자량을 가지는 것으로 확인된다.

실시예 1

실시예 2

중간체 1

중간체 2

mPEG - MAL -20 kDa 을 사용한 펩티드의 PEG 화

동결건조된 펩티드를 (전형적으로 30-50 mg) 칭량하였다. 2.1배 몰 당량의 mPEG-20 kDa 말레이미드 (CH₃O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₃NHCO(CH₂)₂-말레이미드) (NOF 선브라이트(SUNBRIGHT) ME-200MA) (mPEG MAL)를 칭량하고, 펩티드와 합하였다. 반응물을 50/50 (v/v) 물/아세토니트릴 혼합물에 용해시켜 펩티드 농도가 대략 20 mg/mL가 되도록 만들었다. 100 mM 아세트산암모늄, 10 mM EDTA (pH 7)를 사용하여 펩티드 용액을 2배로 희석시켰다. 생성된 혼합물을 실온에서 교반시켰다. 분석용 역상 HPLC (5분에 걸친 0 내지 30% B에 이어서, 후속하여 30 min에 걸친 30 내지 90% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/H₂O 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴 및 유량 = 1 ml/min)로 60℃에서 워터스 시메트리쉴드(Waters SymmetryShield)™ C18, 3.5 ㎛, 4.6 mm i.d. x 10 cm 칼럼 상에서 분석용 HPLC 분리를 수행)에 의해 반응 혼합물을 모니터링하였는데, 전형적으로 1-2 h의 반응 시간이 경과한 후, 펩티드 피크가 거의 완전하게 소실된 것으로 나타났다. 모노- 및 디-PEG화된 펩티드에 기인한 2개의 피크가 출현하였고, 디-PEG화된 펩티드는 전형적으로 피크 총면적의 90-95%를 구성하였다.

이어서, 전형적으로는 산성수 (0.05% TFA/물)를 사용하여 샘플을 약 40 mL로 희석하고, 15 min에 걸친 0 내지 25% B에 이어 100 min에 걸친 25 내지 55% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/물 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴)로 10 mL/min의 유량으로 C₁₈ 역상 HPLC 칼럼 (전형적으로 워터스 시메트리프렙™ 7 ㎛, 19 x 300 mm)에 의해 정제하였다. 생성물은 일반적으로 35 - 40% 아세토니트릴에서 용리되었다. 펩티드 서열에 기초한 몰 흡광 계수 계산치를 사용하여 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 정제된 펩티드를 정량하였다. 정제 후 수율은 전형적으로 출발 펩티드의 양 기준으로 70% 범위였다.

실시예 3

실시예 4

실시예 3 및 실시예 4의 펩티드는 mPEG-MAL을 사용하여 PEG화시켰다.

mPEG -아이오 도아세트아미드 -20 kDa 을 사용한 펩티드의 PEG 화

동결건조된 펩티드를 (전형적으로 30-50 mg) 칭량하였다. 2.1배 몰 당량의 mPEG-20 kDa 아이오도아세트아미드 (CH₃O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₃NHCOCH₂-I) (NOF 선브라이트 ME-200IA)를 칭량하고, 펩티드와 합하였다. 반응물을 수성 완충 용액 (pH 8.5) (붕산, 염화칼륨, 수산화나트륨 완충제 0.1 M + 10 mM EDTA) + 20% 아세토니트릴 (v/v)에 용해시켜 펩티드 농도가 대략 10 mg/mL가 되도록 만들었다. 이어서, 생성된 혼합물을 실온에서 교반시켰다. 분석용 역상 HPLC (5분에 걸친 0 내지 30% B에 이어서, 후속하여 30 min에 걸친 30 내지 90% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/H₂O 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴 및 유량 = 1 ml/min)로 60℃에서 워터스 시메트리쉴드™ C18, 3.5 ㎛, 4.6 mm i.d. x 10 cm 칼럼 상에서 분석용 HPLC 분리를 수행)에 의해 반응 혼합물을 모니터링하고, 전형적으로 18 h의 반응 시간이 경과한 후, 펩티드 피크가 거의 완전하게 소실된 것으로 나타났다. 모노- 및 디-PEG화된 펩티드에 기인한 2개의 피크가 출현하였고, 디-PEG화된 펩티드는 전형적으로 피크 총면적의 90-95%를 구성하였다.

이어서, 전형적으로는 산성수 (0.05% TFA/물)를 사용하여 샘플을 약 50 mL로 희석하고, 15 min에 걸친 0 내지 25% B에 이어 100 min에 걸친 25 내지 55% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/물 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴)로 10 mL/min의 유량으로 C₁₈ 역상 HPLC 칼럼 (전형적으로 워터스 시메트리프렙™ 7 ㎛, 19 x 300 mm)에 의해 정제하였다. 생성물은 일반적으로 35 - 40% 아세토니트릴에서 용리되었다. 펩티드 서열에 기초한 몰 흡광 계수 계산치를 사용하여 280 nm에서의 UV 흡광도에 의해 정제된 펩티드를 정량하였다. 정제 후 수율은 전형적으로 출발 펩티드의 양 기준으로 70% 범위였다.

별법으로, 동결건조된 펩티드를 (전형적으로 30-50 mg) 칭량하였다. 2.1배 몰 당량의 mPEG-20 kDa 아이오도아세트아미드 (CH₃O(CH₂CH₂O)_n-(CH₂)₃NHCOCH₂-I) (NOF 선브라이트 ME-200IA)를 칭량하고, 펩티드와 합하였다. 반응물을 수성 완충 용액 (pH 8.0) (0.1 M 비카르보네이트 완충제 + 10 mM EDTA) + 20% 아세토니트릴 (v/v)에 용해시켜 펩티드 농도가 대략 8 mg/mL가 되도록 만들었다. 이어서, 생성된 혼합물을 암실 실온하에서 교반시켰다. 분석용 역상 HPLC (5분에 걸친 0 내지 30% B에 이어서, 후속하여 30 min에 걸친 30 내지 90% B로 이루어진 2단계 선형 AB 구배 (여기서, A = 0.05% TFA/H₂O 및 B = 0.05% TFA/아세토니트릴 및 유량 = 1 ml/min)로 60℃에서 워터스 시메트리쉴드™ C18, 3.5 ㎛, 4.6 mm i.d. x 10 cm 칼럼 상에서 분석용 HPLC 분리를 수행)에 의해 반응 혼합물을 모니터링하고, 전형적으로 3 h의 반응 시간이 경과한 후, 펩티드 피크가 거의 완전하게 소실된 것으로 나타났다. 모노- 및 디-PEG화된 펩티드에 기인한 2개의 피크가 출현하였고, 디-PEG화된 펩티드는 전형적으로 피크 총면적의 90-95%를 구성하였다.

이어서, 전형적으로는 산성수 (0.05% TFA/물)를 사용하여 샘플을 약 50 mL로 희석하고, 상기 기술된 바와 같이 정제하였다. 정제 후 수율은 전형적으로 출발 펩티드의 양 기준으로 70% 범위였다.

실시예 5: 서열 3

실시예 5의 펩티드는 mPEG-아이오도아세트아미드를 사용하여 PEG화시켰다.

검정

시험관내

본원에서 예시된 화합물을 하기 기술하는 바와 같이 본질적으로 시험하였고, 이는 GIP-R 및 GLP-1-R에 대하여 100 nM보다 더 낮은 결합 친화도 (Ki) 및 Gluc-R에 대하여 100배 이상의 선택비를 나타내었다. 추가로, 본원의 화합물은 GIP-R 및 GLP-1-R에 대한 결합 검정에서 4:1 내지 1:2 (GIP-R:GLP-1-R) (4:1은 GIP-R에 대한 효능이 더 높다는 것을 나타내고; 1:2는 GLP-1-R에 대한 효능이 더 높다는 것을 나타낸다) 사이의 활성비를 나타내었다.

글루코스 -의존성 인슐린분비자극 펩티드 수용체 ( GIP -R) 결합 검정

인간 글루코스-의존성 인슐린분비자극 폴리펩티드 수용체 결합 검정은 pcDNA3.1 (프로메가(Promega))-NeoR 플라스미드로 클로닝된 hGIP-R (Usdin, T.B., Gruber, C., Modi, W. and Bonner, T.I., GenBank: AAA84418.1)을 사용하였다. 현탁 배양을 위해 hGIP-R-pcDNA3.1/Neo 플라스미드를 차이니즈 햄스터 난소 세포, CHO-S에 형질감염시키고, 500 ㎍/mL 제네티신(Geneticin) (인비트로젠(Invitrogen))의 존재하에서 선택하였다.

현탁 배양물로부터 얻은 세포를 사용하여 조 혈장 막을 제조하였다. 세포를 EDTA는 함유하지 않으면서, 25 mM 트리스 HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl₂, DNAse1, 20 μ/mL, 및 로슈 컴플리트™ 인히비터스(Roche Complete™ Inhibitors)를 함유하는 저장성 완충제 중에 얼음 상에서 용해시켰다. 25 스트로크 동안 테플론(Teflon)® 막자를 사용하는 유리 다운스(glass dounce) 균질화기를 사용하여 세포 현탁액을 균질화하였다. 균질물을 4℃에서 15분 동안 1,800 x g로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 저장성 완충제 중에 재현탁시키고, 다시 균질화하였다. 혼합물을 15분 동안 1,800 x g로 원심분리하였다. 2차 상청액을 1차 상청액과 함께 합하였다. 합한 상청액을 15분 동안 1,800 x g로 다시 원심분리하여 정화시켰다. 정화된 상청액을 고속 튜브로 옮기고, 4℃에서 30분 동안 25,000 x g로 원심분리하였다. 막 펠릿을 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 냉동 분취물로서 사용시까지 -80℃ 냉동 장치에서 보관하였다.

I-125-락토퍼옥시다제 방법 (문헌 [Markalonis, J.J., Biochem . J. 113:299 (1969)])에 의해 GIP를 방사성아이오딘화시키고, 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)/NEN (NEX-402)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 2,200 Ci/mmol이었다. 포화 결합 대신 저온의 hGIP를 사용하는 상동성 경쟁에 의해 K_D를 측정하였다. 1% 지방산 비함유 BSA (기브코(Gibco), 7.5% BSA)로 사전 차단된 밀 배아 응집소 (WGA) 비드 (지이 헬쓰 케어(GE Health Care))를 사용하여 섬광 근접 검정 (SPA) (문헌 [Sun, S., Almaden, J., Carlson, T.J., Barker, J. and Gehring, M.R. Assay development and data analysis of receptor-ligand binding based on scintillation proximity assay. Metab Eng . 7:38-44 (2005)])을 이용함으로써 수용체 결합 검정을 수행하였다. 결합 완충제는 EDTA는 함유하지 않으면서, 25 mM HEPES (pH 7.4), 2.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.1% 지방산 비함유 BSA, 0.003% 트윈20(Tween20), 및 로슈 컴플리트™ 인히비터스를 함유하였다. hGIP 및 펩티드 유사체를 PBS 중에 용해시키고, -80℃에서 보관하였다. 펩티드 유사체를 결합 완충제 중에 연속 희석시켰다. 이어서, 40 ㎕ 검정용 결합 완충제 또는 저온의 GIP (NSB, 최종 0.1 μM)를 함유하는 코닝(Corning)® 3632 투명 바닥 검정용 플레이트 내로 10 ㎕의 희석된 펩티드를 옮겨 놓았다. 이어서, 90 ㎕ 막 (4 ㎍/웰), 50 ㎕ [¹²⁵I] GIP (퍼킨 엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences), 반응물 중 최종 농도 0.15 nM), 및 50 ㎕의 WGA 비드 (150 ㎍/웰)를 첨가하고, 밀봉하고, 빙글빙글 회전시켜 혼합하였다. 실온에서 12시간의 정치 시간이 경과한 후, 마이크로베타(MicroBeta)® 섬광 계수기를 사용하여 플레이트를 판독하였다.

결과는 화합물의 존재하에서의 특이적 I-125-GIP 결합율(%)로서 계산하였다. 화합물의 절대 IC₅₀ 농도는 I-125-GIP의 특이 결합율(%) 대 첨가된 화합물의 농도에 관한 비-선형 회귀에 의해 도출하였다. 쳉-프루소프(Cheng-Prusoff) 등식 (여기서, K_D는 0.174 nM인 것으로 추정)을 사용하여 IC₅₀ 농도를 Ki로 전환시켰다 (문헌 [Cheng, Y., Prusoff, W. H., Biochem . Pharmacol . 22, 3099-3108, (1973)]).

<표 1>

상기 데이터를 통해 표 1의 펩티드가 GIP-R에 결합하여, 상기 수용체를 활성화시킴으로써 결국에는 GIP-의존성 생리학적 반응을 일으킬 수 있다는 것이 입증되었다.

글루카곤-유사-펩티드 1 ( GLP -1-R) 수용체 결합 검정

GLP-1 수용체 결합 검정은 293HEK 막으로부터 단리된 클로닝된 인간 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체 (hGLP-1-R)를 사용하였다 (문헌 [Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196(1): 141-6, 1993]). hGLP-1-R cDNA를 발현 플라스미드 phD에 서브클로닝시켰다 (문헌 [Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192, 1987]). 상기 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 200 ㎍/ml 히그로마이신을 사용하여 선택하였다.

현탁 배양물로부터 얻은 세포를 사용하여 조 혈장 막을 제조하였다. 세포를 EDTA는 함유하지 않으면서, 25 mM 트리스 HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl₂, DNAse1, 20 μ/mL, 및 로슈 컴플리트™ 인히비터스를 함유하는 저장성 완충제 중에서 얼음 상에서 용해시켰다. 25 스트로크 동안 테플론® 막자를 사용하는 유리 다운스 균질화기를 사용하여 세포 현탁액을 균질화하였다. 균질물을 4℃에서 15분 동안 1,800 x g로 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 저장성 완충제 중에 재현탁시키고, 다시 균질화하였다. 혼합물을 15분 동안 1,800 x g로 원심분리하였다. 2차 상청액을 1차 상청액과 함께 합하였다. 합한 상청액을 15분 동안 1,800 x g로 다시 원심분리하여 정화시켰다. 정화된 상청액을 고속 튜브로 옮기고, 4℃에서 30분 동안 25,000 x g로 원심분리하였다. 막 펠릿을 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 냉동 분취물로서 사용시까지 -80℃ 냉동 장치에서 보관하였다.

I-125-락토퍼옥시다제 절차에 의해 글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)을 방사성아이오딘화시키고, 퍼킨-엘머/NEN (NEX308)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 2,200 Ci/mmol이었다. I-125 GLP-1 물질 중 프로판올 함량이 높기 때문에 포화 결합 대신 상동성 경쟁에 의해 K_D를 측정하였다. K_D는 0.96 nM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.

1% 지방산 비함유 BSA (기브코)로 사전 차단된 밀 배아 응집소 (WGA) 비드를 사용하여 섬광 근접 검정 (SPA)을 이용함으로써 수용체 결합 검정을 수행하였다. 결합 완충제는 EDTA는 함유하지 않으면서, 25 mM HEPES (pH 7.4), 2.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.1% 지방산 비함유 BSA, 0.003% 트윈20, 및 로슈 컴플리트™ 인히비터스를 함유하였다. 글루카곤-유사 펩티드 1을 PBS 중에 1 mg/mL로 용해시키고, 30 ㎕ 분취량으로 -80℃에서 급속 냉동시켰다. 글루카곤-유사 펩티드 1 분취량을 희석시키고, 1시간 이내에 결합 검정에 사용하였다. 펩티드 유사체를 PBS 중에 용해시키고, 결합 완충제 중에 연속 희석시켰다. 이어서, 40 ㎕ 검정용 결합 완충제 또는 저온의 글루카곤 (NSB, 최종 1 μM)을 함유하는 코닝® 3632 투명 바닥 검정용 플레이트 내로 10 ㎕의 희석된 화합물 또는 PBS를 옮겨 놓았다. 이어서, 90 ㎕ 막 (1 ㎍/웰), 50 ㎕ I-125 글루카곤-유사 펩티드 1 (반응물 중 최종 농도 0.15 nM), 및 50 ㎕의 WGA 비드 (150 ㎍/웰)를 첨가하고, 밀봉하고, 빙글빙글 회전시켜 혼합하였다. 실온에서 12시간의 정치 시간이 경과한 후, 퍼킨 엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈 트리룩스 마이크로베타(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Trilux MicroBeta)® 섬광 계수기를 사용하여 플레이트를 판독하였다.

결과는 화합물의 존재하에서의 특이적 I-125-글루카곤-유사 펩티드 1 결합율(%)로서 계산하였다. 화합물의 절대 IC₅₀ 농도는 I-125-글루카곤-유사 펩티드 1의 특이 결합율(%) 대 첨가된 화합물의 농도에 관한 비-선형 회귀에 의해 도출하였다. 쳉-프루소프 등식을 사용하여 IC₅₀ 농도를 Ki로 전환시켰다.

<표 2>

상기 데이터를 통해 표 2의 펩티드가 GLP-1-R에 결합하고, 그에 따라, 상기 수용체를 활성화시킬 수 있으며, 결국에는 GLP-1-의존성 생리학적 반응을 일으킬 수 있다는 것이 입증되었다.

글루카곤 수용체 ( hGlucR ) 결합 검정

글루카곤 수용체 결합 검정은 293HEK 막으로부터 단리된 클로닝된 인간 글루카곤 수용체를 사용하였다 (문헌 [Lok, S, et. al., Gene 140 (2), 203-209 (1994)]). hGlucR cDNA를 발현 플라스미드 phD에 서브클로닝시켰다 (문헌 [Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., et. al., Bio / Technology 5: 1189-1192 (1987)]). 상기 플라스미드 DNA로 293HEK 세포를 형질감염시키고, 200 ㎍/ml 히그로마이신을 사용하여 선택하였다.

I-125-락토퍼옥시다제 절차에 의해 글루카곤을 방사성아이오딘화시키고, 퍼킨-엘머/NEN (NEX207)에서 역상 HPLC에 의해 정제하였다. 비활성은 2,200 Ci/mmol이었다. I-125 글루카곤 물질 중 프로판올 함량이 높기 때문에 포화 결합 대신 상동성 경쟁에 의해 K_D를 측정하였다. K_D는 2.62 nM인 것으로 추정되었고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산하였다.

1% 지방산 비함유 소 혈청 알부민 (BSA) (기브코, 7.5% BSA)으로 사전 차단된 밀 배아 응집소 (WGA) 비드를 사용하여 섬광 근접 검정 (SPA)을 이용함으로써 수용체 결합 검정을 수행하였다. 결합 완충제는 EDTA는 함유하지 않으면서, 25 mM 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 (HEPES) (pH 7.4), 2.5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0.1% 지방산 비함유 BSA, 0.003% 트윈20, 및 로슈 컴플리트™ 인히비터스를 함유하였다. 글루카곤을 0.01 N HCl 중에 1 mg/mL로 용해시키고, 30 ㎕ 분취량으로 -80℃에서 급속 냉동시켰다. 글루카곤 분취량을 희석시키고, 1시간 이내에 결합 검정에 사용하였다. 펩티드 유사체를 포스페이트 완충 염수 (PBS) 중에 용해시키고, 결합 완충제 중에 연속 희석시켰다. 이어서, 40 ㎕ 검정용 결합 완충제 또는 저온의 글루카곤 (비-특이 결합 (NSB), 최종 1 μM)을 함유하는 코닝® 3632 투명 바닥 검정용 플레이트 내로 10 ㎕의 희석된 화합물 또는 PBS를 옮겨 놓았다. 이어서, 90 ㎕ 막 (3 ㎍/웰), 50 ㎕ I-125 글루카곤 (반응물 중 최종 농도 0.15 nM), 및 50 ㎕의 WGA 비드 (150 ㎍/웰)를 첨가하고, 밀봉하고, 빙글빙글 회전시켜 혼합하였다. 실온에서 12시간의 정치 시간이 경과한 후, 퍼킨 엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈 트리룩스 마이크로베타® 섬광 계수기를 사용하여 플레이트를 판독하였다.

결과는 화합물의 존재하에서의 특이적 I-125-글루카곤 결합율(%)로서 계산하였다. 화합물의 절대 IC₅₀ 농도는 I-125-글루카곤의 특이 결합율(%) 대 첨가된 화합물의 농도에 관한 비-선형 회귀에 의해 도출하였다. 쳉-프루소프 등식을 사용하여 IC₅₀ 용량을 Ki로 전환시켰다.

<표 3>

상기 데이터를 통해 표 3의 펩티드는 Gluc-R에 대하여 선택성이 더 적고, 따라서, Gluc-R-매개 생리학적 반응을 개시하지 못한다는 것이 입증되었다.

세포내 cAMP 를 생성하는 hGIP -R 세포의 기능적 활성화

cAMP 기능 검정은 상기 기술된 hGIP-R 결합 검정을 위해 단리된 것과 동일한 클로닝된 GIP-R 세포주를 사용하였다. 펩티드로 세포를 자극시키고, 시스바이오(CisBio) cAMP 다이나믹(Dynamic) 2 HTRF® 검정 키트 (62AM4PEB)를 사용하여 세포내에서 생성된 cAMP를 정량하였다. 간략하면, 세포 용해 완충제의 존재하에서 cAMP-d2 포획 항체에의 결합에 의해 세포내에서 유도된 cAMP를 검출하였다. 2차 검출 항체인 항-cAMP 크립테이트(Cryptate)를 첨가하여 샌드위치를 형성한 후, 이어서, 퍼킨-엘머 라이프 사이언시즈 인비전(Perkin-Elmer Life Sciences Envision)® 기기를 사용하여 검출하였다.

효소 비함유 세포 해리 용액(Enzyme-Free Cell Dissociation Solution) (스페셜티 미디어(Specialty Media) 5-004-B)을 사용하여 서브-컨플루언트 조직 배양용 접시로부터 hGIP-R-CHO-S 세포를 수거하였다. 세포를 저속으로 펠릿화하고, cAMP 검정용 완충제 [0.1% 지방산 비함유 BSA (기브코, 7.5% BSA)와 함께 Mg 및 Ca를 함유하는, HBSS 중 25 mM Hepes (기브코, 14025-092), 500 μM IBMX]로 3회에 걸쳐 세척한 후, 최종 농도가 312,000개의 세포/ml가 되도록 희석시켰다. hGIP 및 펩티드를 5X 스톡 용액으로서 제조하고, cAMP 검정용 완충제 중에 연속 희석시킬 뿐만 아니라, -20℃에서 보관된 PBS 중 2,848 nM cAMP의 냉동 스톡으로부터 cAMP 표준 곡선도 작성하였다. 검정을 시작하기 위해, 40 ㎕의 세포 현탁액을 검은색의 비-조직 배양물로 처리된 ½ 웰 플레이트 (코스타(CoStar) 3694)로 옮겨 놓고, 이어서, 5X 펩티드 희석액 10 ㎕를 첨가하였다. 세포를 실온에서 1 h 동안 방치하였다. 시스바이오 용해 완충제로 희석된 cAMP-d2-포획 항체 (시스바이오) 25 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 타이터-텍(titer-tek) 진탕기에서 완만하게 혼합시켰다. 15분간의 용해 후, 25 ㎕의 검출용 항체인 항-cAMP 크립테이트 (시스바이오)를 첨가하고, 완만하게 혼합시켰다. 실온에서 1 h 경과 후, 퍼킨-엘머 인비전®을 사용하여 용해된 세포 및 항체 혼합물을 판독하였다. cAMP 표준 곡선을 사용하여 인비전® 단위를 cAMP 농도 (nM)/웰로 전환시켰다. 각 웰에서 생성된 cAMP (nmole)를 hGIP 대조군 사용시 관찰되는 최대 반응률(%)로 전환시켰다. 상대 EC₅₀ 값은 최대 반응률(%) 대 첨가된 펩티드의 농도에 관한 비-선형 회귀 분석에 의해 도출하였다.

<표 4>

상기 데이터를 통해 표 4의 펩티드는 GIP-R에 결합하여 그를 활성화시키고, 이로써 GIP-R-매개 생리학적 반응을 개시할 수 있다는 것이 입증되었다.

세포내 cAMP 를 생성하는 hGLP -1-R 세포의 기능적 활성화

cAMP 기능 검정은 pcDNA3.1/Neo (프로메가)로 클로닝되고 (문헌 [Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 1993 Oct 15;196(1): 141-6]), 293HEK 세포에 형질감염된 hGLR-1-R의 형질감염으로부터 단리된 hGLP-1-R 발현 세포의 클론주를 사용하였다. hGLP-1-R 세포를 펩티드로 자극시키고, 시스바이오 cAMP 다이나믹 2 HTRF® 검정 키트 (62AM4PEB)를 사용하여 세포내에서 생성된 cAMP를 정량하였다. 간략하면, 세포 용해 완충제의 존재하에서 cAMP-d2 포획 항체 (시스바이오)에의 결합에 의해 세포내에서 유도된 cAMP를 검출하였다. 2차 검출 항체인 항-cAMP 크립테이트 (시스바이오)를 첨가하여 샌드위치를 형성한 후, 이어서, 퍼킨-엘머 인비전(Perkin-Elmer Envision)® 기기를 사용하여 검출하였다.

효소 비함유 세포 해리 용액 (스페셜티 미디어 5-004-B)을 사용하여 서브-컨플루언트 조직 배양용 접시로부터 hGLP-1-R-293HEK 세포를 수거하였다. 세포를 저속으로 펠릿화하고, cAMP DMEM 검정용 완충제 [0.5% FBS 및 2 mM 글루타민을 함유하는, DMEM 중 10 mM Hepes (기브코-31053), 및 500 μM IBMX]로 3회에 걸쳐 세척한 후, 최종 농도가 50,000개의 세포/ml가 되도록 희석시켰다. hGLP-1 및 펩티드를 5X 스톡 용액으로서 제조하고, cAMP DMEM 검정용 완충제 중에 연속 희석시킬 뿐만 아니라, -20℃에서 보관된 PBS 중 2,848 nM cAMP의 냉동 스톡으로부터 cAMP 표준 곡선도 작성하였다. 검정을 시작하기 위해, 40 ㎕의 세포 현탁액을 검은색의 비-조직 배양물로 처리된 ½ 웰 플레이트 (코스타 3694)로 옮겨 놓고, 이어서, 5X 펩티드 희석액 10 ㎕를 첨가하였다. 세포를 실온에서 1 h 동안 방치하였다. 시스바이오 용해 완충제로 희석된 cAMP-d2-포획 항체 (시스바이오) 25 ㎕를 첨가하여 반응을 종결시킨 후, 타이터-텍 진탕기에서 완만하게 혼합시켰다. 15분간의 용해 후, 25 ㎕의 검출용 항체인 항-cAMP 크립테이트 (시스바이오)를 첨가하고, 완만하게 혼합시켰다. 실온에서 1시간 경과 후, 퍼킨-엘머 인비전®을 사용하여 용해된 세포 및 항체 혼합물을 판독하였다. cAMP 표준 곡선을 사용하여 인비전® 단위를 cAMP 농도 (nM)/웰로 전환시켰다. 각 웰에서 생성된 cAMP (nmole)를 hGLP-1 대조군 사용시 관찰되는 최대 반응률(%)로 전환시켰다. 상대 EC₅₀ 값은 최대 반응률(%) 대 첨가된 펩티드의 농도에 관한 비-선형 회귀 분석에 의해 도출하였다.

<표 5>

상기 데이터를 통해 표 5의 펩티드는 GLP-1-R에 결합하여 그를 활성화시키고, 이로써 GLP-1-R-매개 생리학적 반응을 개시할 수 있다는 것이 입증되었다.

생체내

식이-유도성 비만 ( DIO ) 마우스에서 먹이 섭취, 체중 및 신체 조성에 대해 미치는 효과

3 내지 4개월된 수컷, 식이-유도성 비만 (DIO) 마우스를 사용하였다. 동물은 명주기/암주기가 12시간씩 주기적으로 진행되는 (22:00에 점등) 온도 조절형 (24℃) 시설에서 개별적으로 하우징하였고, 동물들은 먹이 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 2주간의 상기 시설에의 순응 시간이 경과한 후, 마우스를 처리군 (n= 1군당 8-10마리)으로 무작위화하였고, 각 군의 평균 체중 및 지방량은 유사하였다. 실험 전, 비히클 용액을 마우스에 피하 (sc) 주사하고, 마우스가 본 절차에 순응하는 7일 동안 체중을 측정하였다.

2 내지 4주 동안 매 3일마다 암주기가 시작되기 30-90분 전, 임의로 자유롭게 먹이를 섭취한 DIO 마우스에 비히클, 또는 비히클 중에 용해된 펩티드 유사체 (용량 범위 10-100 nmol/Kg)를 sc 주사하여 투여하였다. 체중 및 먹이 + 호퍼의 중량을 동시에 측정하였다. 현재의 먹이 + 호퍼 중량을 전날의 것으로부터 감산하여 지난 24시간 동안 섭취한 먹이량을 계산하였다. 체중의 절대 변화는 1차 주사 이전의 동물의 체중을 감산함으로써 계산하였다. -1일째 및 14일째, 에코 메디컬 시스템(Echo Medical System: 미국 텍사스주 휴스턴) 기기를 사용하여 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 총 지방량을 측정하였다. 총 체중으로부터 지방량을 감산함으로써 제지방량을 계산하였다.

<표 6a>

<표 6b>

표 6a 및 6b의 데이터는 14일 동안 DIO 마우스에서 진행된 연구에서 비히클로 처리된 마우스와 비교하였을 때, 실시예 3, 4, 및 5의 펩티드가 누적 먹이 섭취량 및 체중을 감소시켰다는 것을 보여준다. 체중 감소는 주로 지방량 감소에 기인하는 것이었다. *p<0.01, **p<0.001 대 비히클 (던넷 검정(Dunnett's test)).

DIO 마우스에서 2주간의 처리 후 경구 내당능 검사 동안 혈당 변동에 미치는 효과

상기 DIO 연구에서 화합물 마지막 주사 후 56시간 경과하였을 때, 동물에서 경구 내당능 검사를 실시하였다. 요약하면, 내당능 검사를 개시하기 이전에 16시간 동안 마우스를 금식시켰다. 0 시점에서, 경구 위관 영양에 의해 2 g/kg 덱스트로스를 동물에게 투여하였다. 당부하 후 0, 15, 30, 60 및 120분째에 꼬리 출혈에 의해 채혈하여 혈액을 수집하였다. 혈당측정기에 의해 글루코스 농도를 측정하였다.

<표 7a>

<표 7b>

상기 표 7a 및 7b의 데이터는 실시예 3, 4, 및 5의 펩티드가 경구 당부하 후 글루코스 변동을 유의적으로 감소시켰다는 것을 나타낸다. 통계학상 유의도는 던넷 검정에 의해 평가하였다.

식이-유도성 비만 ( DIO ) 롱 에반스 ( Long Evans ) 래트에서 먹이 섭취, 체중 및 신체 조성에 대해 미치는 효과

4 내지 5개월된 수컷, 식이-유도성 비만 롱 에반스 래트를 사용하였다. 동물은 명주기/암주기가 12시간씩 주기적으로 진행되는 (22:00에 점등) 온도 조절형 (24℃) 시설에서 개별적으로 하우징하였고, 동물들은 먹이 (식이 TD95217) 및 물에 자유롭게 접근할 수 있었다. 적어도 2주 동안 동물을 상기 시설에 순응시켰다. 0일째 QNMR에 의해 신체 조성을 측정하고, 체중, 지방 (%), 및 제지방량 (%)에 기초하여 래트를 각 군 (n= 1군당 6마리)으로 무작위화하였다. 1, 4, 8, 11, 및 15일째 피하 주사를 통해 화합물을 투여하였다. 14일째 QNMR에 의해 신체 조성을 다시 측정하고, 16일째 동물의 체중을 측정하고, 샘플을 위해 꼬리 출혈에 의해 채혈하여 혈장 글루코스, 지질, 인슐린, 글루카곤, 및 PYY를 측정하였다. CO₂에 의해 안락사시킨 후, 노출 측정 분석을 위해 심장 스틱에 의해 혈액 샘플을 채취하였다.

16일 동안에 걸쳐 실시예 3 및 4의 펩티드를 투여한 결과, 비히클로 처리된 DIO 래트와 비교하였을 때, 제지방량의 비율(%) 증가 및 지방량의 비율(%) 감소를 통해 DIO 래트의 체중 및 신체 조성이 변화되었다. 예를 들어, 16일 동안에 걸친 10 nmol/Kg 용량의 실시예 3의 펩티드 투여 후, 제지방량은 0.6% 증가하였고, 지방량은 1.3% 감소하였다. 유사하게, 16일 동안에 걸친 30 nmol/Kg 용량의 실시예 3의 펩티드 투여 후, 제지방량은 1.3% 증가하였고, 지방량은 2.3% 감소하였다. 추가로, 16일 동안에 걸친 30 nmol/Kg 용량의 실시예 4의 펩티드 투여 후, 제지방량은 0.4% 증가하였고, 지방량은 1.8% 감소하였다. 유사하게, 16일 동안에 걸친 100 nmol/Kg 용량의 실시예 4의 펩티드 투여 후, 제지방량은 1.8% 증가하였고, 지방량은 3.2% 감소하였다.

실시예 3 및 4의 펩티드 투여는 비히클로 처리된 마우스와 비교하였을 때, DIO 래트에서 트리글리세리드 양 및 총 콜레스테롤량을 비롯한, 혈장 지질량을 강하시켰고, 유리 지방산의 양을 증가시켰다. 예를 들어, 10 nmol/Kg 용량의 실시예 3의 펩티드 투여 후, 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤은 각각 507.3 mg/dL 및 104 mg/dL (비히클)에서부터 262.1 mg/dL 및 91 mg/dL로 감소하였고, 유리 지방산은 0.69 mEq/L에서부터 0.94 mEq/L로 증가하였다. 유사하게, 30 nmol/Kg 용량의 실시예 3의 펩티드 투여 후, 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤은 각각 507.3 mg/dL 및 104 mg/dL (비히클)에서부터 233.5 mg/dL 및 94 mg/dL로 감소하였고, 유리 지방산은 0.69 mEq/L에서부터 1.01 mEq/L로 증가하였다. 추가로, 10 nmol/Kg 용량의 실시예 4의 펩티드 투여 후, 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤은 각각 808.1 mg/dL 및 127 mg/dL (비히클)에서부터 488.7 mg/dL 및 110 mg/dL로 감소하였다. 유사하게, 30 nmol/Kg 용량의 실시예 4의 펩티드 투여 후, 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤은 각각 808.1 mg/dL 및 127 mg/dL (비히클)에서부터 212.2 mg/dL 및 104 mg/dL로 감소하였고, 유리 지방산은 0.67 mEq/L에서부터 0.82 mEq/L로 증가하였다.

정상 래트에서 정맥내 내당능 검사 동안 혈당 변동에 미치는 효과

본 연구에서는 정상적인 위스타(Wistar) 수컷 래트 (225-250 g)를 사용하였다. 식후 체중 및 혈당에 기초하여 동물을 무작위화하였다. 검사 개시 16시간 전에 비히클 또는 펩티드 유사체 (용량 1 kg당 펩티드 내용물 3-400 ㎍)를 동물에게 주사하였다. 주사 시점에서는 먹이를 제거하였다. 검정 이전에 페노바르비탈 65 mg/kg을 i.p.로 투여하여 동물을 마취시키고, 카테터 2개 중 하나는 경정맥내로 및 나머지 하나는 경동맥내로 삽입하였다. 0 시점에 정맥 카테터를 통해 0.5 g의 글루코스/kg을 동물에게 투여하였다. 당부하 후 0 (전 글루코스), 2, 4, 6, 10, 20 및 30분째인 시점에 경동맥으로부터 혈액을 수집하였다. 혈당측정기에 의해 글루코스 농도를 측정하였다. 인슐린은 메소스케일(Mesoscale)®에 의해 측정하였다. 효능은 정맥내 당부하 후 글루코스 변동의 척도인 글루코스 곡선하 면적 뿐만 아니라, 인슐린 곡선하 총면적 (=t+0부터 30 min까지의 적분된 혈장 인슐린 값)의 증가로서 측정되었다.

비히클로 처리된 래트와 비교하였을 때 실시예 3 및 4의 펩티드 투여는 인슐린 AUC를 증가시키고, 글루코스 AUC를 감소시켰다. 예를 들어, 50 ㎍/Kg 용량의 실시예 3의 펩티드 투여 후, 인슐린 AUC는 55 ng*min/mL (비히클)에서부터 137 ng*min/mL로 증가하였고, 글루코스 AUC는 7,830 mg*min/dL (비히클)에서부터 6,780 mg*min/dL로 감소하였다. 유사하게, 200 ㎍/Kg 용량의 실시예 3의 펩티드 투여 후, 인슐린 AUC는 55 ng*min/mL (비히클)에서부터 183 ng*min/mL로 증가하였고, 글루코스 AUC는 7,830 mg*min/dL (비히클)에서부터 7,020 mg*min/dL로 감소하였다. 추가로, 50 ㎍/Kg 용량의 실시예 4의 펩티드 투여 후, 인슐린 AUC는 44 ng*min/mL (비히클)에서부터 150 ng*min/mL로 증가하였고, 글루코스 AUC는 8,010 mg*min/dL (비히클)에서부터 7,730 mg*min/dL로 감소하였다. 유사하게, 200 ㎍/Kg 용량의 실시예 4의 펩티드 투여 후, 인슐린 AUC는 44 ng*min/mL (비히클)에서부터 161 ng*min/mL로 증가하였고, 글루코스 AUC는 8,010 mg*min/dL (비히클)에서부터 7,420 mg*min/dL로 감소하였다.

50 ㎍/Kg 용량의 실시예 5의 펩티드 투여 후, 인슐린 AUC는 41 ng*min/mL (비히클)에서부터 133 ng*min/mL로 증가하였고, 글루코스 AUC는 7,739 mg*min/dL (비히클)에서부터 7,202 mg*min/dL로 감소하였다. 유사하게, 200 ㎍/Kg 용량의 실시예 5의 펩티드 투여 후, 인슐린 AUC는 41 ng*min/mL (비히클)에서부터 124 ng*min/mL로 증가하였고, 글루코스 AUC는 7,739 mg*min/dL (비히클)에서부터 7,351 mg*min/dL로 감소하였다.

골격 효과

난소가 절제된 (OvX; 문헌 [Endocrinology 144: 2008-2015] 참조), 6개월된 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 래트에서 실시예 4의 펩티드를 평가하였다. 수술 후 9일째를 시작으로 출발하여 0, 2.9, 9.7, 또는 29 nmol/kg의 용량을 매일 피하 주사하여 래트에게 투여하였다. 치료는 35일 동안 지속되었고, 실시예 4의 펩티드는 모의 수술군 OvX 래트와 비교하였을 때 먹이 섭취량 및 체중을 각각 최대 8%까지 감소시켰다. 체중 감소는 지방량 감소에 기인하는 것이었으며, OvX 래트에서는 제지방량 상의 어떤 변화도 관찰되지 않았다. 실시예 4의 펩티드는 OvX 래트에서 비-공복 혈청 글루코스 및 트리글리세리드를 감소시켰다. 화합물은 용량에 의존하는 방식으로 요추에서 OvX 유도성의 골 무기질 함량 및 골밀도 감소를 방해하였지만, 중간 대퇴골 피질골에서는 어떤 효과도 없었다. 실시예 4의 펩티드는 OvX 래트의 대퇴골 및 요추에서 골밀도 또는 골 무기질 함량에 악영향을 주지는 않았다. 체중 감소 (본 연구에서 8%)가 골 부피에 직접적인 영향을 줄 수 있다는 점에 주의하여야 한다. 골 강도는 하중에 의존하며, 체중 감소는 체중을 견뎌내는 골 상의 하중을 낮춰줌으로써 그 결과, 체중을 견뎌내는 골, 즉, 피지골의 골격 파라미터에 영향을 덜 미치는 것으로 관찰되었다. 통계학상 유의도는 일원 ANOVA 후 던넷 검정법에 의해 평가되었다.

<표 8>

<표 9>

표 8 및 9의 데이터는 실시예 4의 펩티드가 OvX 래트에서 BMC 및 BMD를 개선시켰다는 것을 보여준다.

본 발명의 화합물은 바람직하게 다양한 경로에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 상기 화합물이 비경구 투여용인 것인 가장 바람직하다. 상기 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, et. al., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995])를 참조한다.

본 발명의 화합물은 일반적으로 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 1주당 투여량은 1 내지 24 mg의 펩티드 접합체 또는 0.014 내지 0.343 mg/Kg (체중)의 범위에 포함된다. 일부 경우에, 상기 언급한 범위의 하한보다 낮은 투여량 수준이 충분한 것 그 이상일 수 있는 반면, 다른 경우에는 어떤 유해한 부작용도 일으키지 않으면서 훨씬 더 많은 용량이 사용될 수 있는 바, 따라서, 상기 투여량 범위가 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하고자 하는 것은 아니다. 화합물의 실제 투여량은 치료하고자 하는 상태, 선택된 투여 경로, 투여되는 실제 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 체중, 및 반응, 및 환자 증상의 중증도를 비롯한 관련 환경을 고려하여 의사에 의해 결정될 것이라는 것을 이해할 것이다.

본 발명의 범주로부터 벗어남 없는 본 발명의 다른 변형은 당업자에게 자명할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

하기 서열을 포함하는 펩티드.

여기서, 22 위치의 Xaa¹은 Nal 또는 Phe이고; 43 위치의 Xaa²는 Cys이거나, 또는 부재하고; 44 위치의 Xaa³은 Cys이거나, 또는 부재하고; C-말단 아미노산은 임의로 아미드화되고; 단, 43 위치의 Xaa² 또는 44 위치의 Xaa³이 Cys이면, 그 중 하나 또는 그 둘 모두가 임의로 PEG화된다.
제1항에 있어서, Xaa²및 Xaa³가 각각 Cys인 펩티드.
제2항에 있어서, 43 위치의 Cys 또는 44 위치의 Cys 중 어느 하나 또는 그 둘 모두가 18 내지 22 kDa PEG 분자로 PEG화된 것인 펩티드.
제3항에 있어서, 각각의 PEG가 선형인 펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 아미노산이 아미드화된 것인 펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열을 포함하는 펩티드.

여기서, 44 위치의 PEG화된 Cys의 카르복실 기는 아미드화되어 있다.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 서열을 포함하는 펩티드.

여기서, 44 위치의 PEG화된 Cys의 카르복실 기는 아미드화되어 있다.
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유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는, 환자에서 당뇨병을 치료하기 위한 제약 조성물.
유효량의 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 펩티드를 포함하는, 환자에서 체중 감소를 유도하기 위한 제약 조성물.
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