TWI535450B - 新穎胜肽及其製備方法及用途 - Google Patents

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TWI535450B TW100109463A TW100109463A TWI535450B TW I535450 B TWI535450 B TW I535450B TW 100109463 A TW100109463 A TW 100109463A TW 100109463 A TW100109463 A TW 100109463A TW I535450 B TWI535450 B TW I535450B
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Description

新穎胜肽及其製備方法及用途
本發明係關於糖尿病治療領域，且係關於對葡萄糖依賴性促胰島素胜肽受體(GIP-R)及高血糖素樣胜肽-1受體(GLP-1-R)二者表現活性且對高血糖素受體(Gluc-R)具有選擇性之胜肽。具體而言，本發明提供GIP類似物，其引入胺基酸取代以調節對GIP-R及GLP-1-R二者之活性並維持對Gluc-R之選擇性。
GIP稱作抑胃胜肽或葡萄糖依賴性促胰島素胜肽，其係42個胺基酸之胃腸調節性胜肽，已顯示其可在葡萄糖存在下刺激胰腺β細胞分泌胰島素，由此發揮在葡萄糖內穩態中之生理作用。GLP-1係37個胺基酸之胜肽，其保護胰腺β細胞並抑制高血糖素分泌、胃排空及食物攝入，從而引起體重降低。GIP及GLP-1稱作腸降血糖素。腸降血糖素受體信號傳導發揮對葡萄糖內穩態至關重要之生理相關作用。高血糖素係由胰腺產生之29個胺基酸之胜肽。此激素向肝傳導信號以釋放葡萄糖，從而使血糖升高。因此，在糖尿病背景中不期望刺激Gluc-R。
與在健康個體中所觀察到者不同，單獨之GIP在2型糖尿病人類中具有極低降糖效應。然而，在達成一定程度之降糖後，GIP之功效增強且變得與在血糖正常個體中所觀察到者接近。另一方面，GLP-1可在健康個體及糖尿病個體二者中有效降糖但引起噁心，因此，GLP-1可能不能發揮全部功效。此外，遍在蛋白酶二肽基肽酶IV(DPP IV)可使GIP及GLP-1二者快速失活，從而產生不能刺激胰島素分泌且因此僅可用於短期代謝控制之胜肽。
某些GIP類似物已闡述於WO 2010/016940及WO 2010/016944中。WO 2010/011439中已闡述某些高血糖素類似物可表現GIP及GLP-1二者之活性。
當前糖尿病治療包括胰島素促分泌劑，例如磺醯脲及格列奈(glitinide)，其功效經常表現進行性降低且在2型糖尿病患者中可引起低血糖症。因此，業內需要確定可以持續葡萄糖依賴性方式加強胰島素分泌之新穎藥劑。亦期望確定具有GLP-1之降糖效應且不引起噁心之新穎藥劑，及進一步確定代謝穩定性增強之新穎藥劑。
本發明提供新穎有力且有效之胜肽，其引入胺基酸取代以調節GIP及GLP-1兩種活性同時維持對高血糖素之選擇性。本發明達成GLP-1之降糖效應並利用GIP之葡萄糖刺激性胰島素分泌效應。此外，某些本發明化合物提供有效治療來降低體重。
本發明提供包含以下序列之胜肽：
Xaa2-Xaa3(SEQ ID NO:1)
其中22位之Xaa1係Nal或Phe；43位之Xaa2係Cys或不存在；44位之Xaa3係Cys或不存在；C末端胺基酸視需要經醯胺化；且前提係倘若43位之Xaa2或44位之Xaa3係Cys，則其一者或兩者視需要經聚乙二醇化。
本發明一實施例係關於胜肽，其中Xaa1係Phe。本發明一較佳實施例係關於胜肽，其中Xaa1係Nal。
本發明一實施例係關於胜肽，其中Xaa2及Xaa3不存在。本發明一較佳實施例係關於胜肽，其中Xaa2及Xaa3各自係Cys。在該實施例中，44位之Cys之羧基較佳經醯胺化。
本發明另一較佳實施例係關於胜肽，其中該胜肽在43及44位之任一Cys處經20 kDa PEG分子聚乙二醇化。在該實施例中，C末端Cys之羧基較佳經醯胺化。本發明另一較佳實施例係關於胜肽，其中該胜肽在43及44位之兩個Cys處經20 kDa PEG分子聚乙二醇化。在該實施例中，C末端Cys之羧基較佳經醯胺化。
本發明一實施例係關於胜肽，其中Xaa1係Phe；且Xaa2及Xaa3不存在。在該實施例中，42位之C末端Gln之羧基較佳經醯胺化。本發明一較佳實施例係關於胜肽，其中Xaa1係Nal；且Xaa2及Xaa3不存在。在該實施例中，42位之C末端Gln之羧基較佳經醯胺化。
本發明一更佳實施例係關於胜肽，其中Xaa1係Phe；Xaa2及Xaa3二者皆係Cys且二者皆視需要經聚乙二醇化且44位之Cys之羧基視需要經醯胺化。本發明一尤佳實施例係關於胜肽，其中Xaa1係Nal；Xaa2及Xaa3係Cys且任一或兩個Cys視需要經聚乙二醇化且44位之Cys之羧基視需要經醯胺化。
本發明一尤佳實施例係
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K)(SEQ ID NO: 2)
且44位之Cys經醯胺化。此胜肽稱作Aib2、Aib13、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44(PEG20K)-GIP。
本發明一最佳實施例係
Tyr-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Ile-Aib-Leu-Asp-Lys-Ile-Ala-Gln-Arg-Ala-Nal-Val-Gln-Trp-Leu-Ile-Ala-Aib-Lys-Gly-Lys-Lys-Gln-Glu-Trp-Lys-His-Gln-Ile-Thr-Gln-Cys(PEG20K)-Cys(PEG20K)(SEQ ID NO: 3)
且44位之Cys經醯胺化。此胜肽稱作Aib2、Aib13、Nal22、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44(PEG20K)-GIP。
本發明亦提供治療患者之糖尿病之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量之本發明胜肽。本發明另外提供治療患者之非胰島素依賴性糖尿病之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量之本發明胜肽。本發明另外提供治療患者之胰島素依賴性糖尿病之方法，其包含向需要該治療之患者投與有效量之本發明胜肽。
此外，本發明亦提供藉由向需要治療之患者投與有效量之本發明胜肽來治療選自由以下組成之群之病況之方法：肥胖症、代謝症候群、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。此外，本發明提供藉由向需要治療之患者投與有效量之本發明胜肽來誘導體重降低之方法。本發明亦提供藉由向需要治療之患者投與有效量之本發明胜肽來治療脆弱症或提高骨強度之方法。
此外，本發明提供用於治療之本發明胜肽。在一特定實施例中，本發明提供本發明胜肽，其用於治療糖尿病。本發明提供本發明胜肽，其用於治療非胰島素依賴性糖尿病。本發明提供本發明胜肽，其用於治療胰島素依賴性糖尿病。同樣，本發明提供本發明胜肽，其用於治療肥胖症。另外，本發明提供本發明胜肽，其用於治療選自由以下組成之群之病況：肥胖症、代謝症候群、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。本發明另外提供本發明胜肽，其用於誘導體重降低。本發明亦提供本發明胜肽，其用於治療脆弱症或提高骨強度。
本發明亦提供本發明胜肽之用途，其用於製造治療糖尿病之藥物。本發明亦提供本發明胜肽之用途，其用於製造治療肥胖症之藥物。本發明另外提供上述胜肽之用途，其用於製造治療選自由以下組成之群之病況之藥物：代謝症候群、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。本發明另外提供本發明胜肽之用途，其用於製造誘導體重降低之藥物。本發明亦提供本發明胜肽之用途，其用於製造治療脆弱症或提高骨強度之藥物。
另外，本發明提供醫藥調配物，其包含本發明胜肽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。此外，本發明提供適用於治療糖尿病之醫藥調配物。本發明提供適用於治療非胰島素依賴性糖尿病之醫藥調配物。本發明提供適用於治療胰島素依賴性糖尿病之醫藥調配物。此外，本發明提供適用於治療肥胖症之醫藥調配物。本發明亦提供適用於治療選自由以下組成之群之病況之醫藥調配物：代謝症候群、冠狀動脈疾病及動脈粥樣硬化。本發明提供適用於誘導體重降低之醫藥調配物。本發明另外提供適用於治療脆弱症或提高骨強度之醫藥調配物。在一特定實施例中，該調配物另外包含一或多種其他治療藥劑。
本發明亦提供醫藥組合物，其包含本發明胜肽及一或多種醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。在一特定實施例中，該組合物另外包含一或多種其他治療藥劑。
本發明另外提供對DPPIV之快速代謝失活較不敏感之穩定分子。
本發明序列含有用於二十種天然胺基酸之標準單字母或三字母胺基酸密碼。所用其他胺基酸密碼定義如下：Aib=α-胺基異丁酸；Nal=1-萘基丙胺酸。
術語「C末端胺基酸」係指胜肽序列中含有游離羧基之最後一個胺基酸。本發明C末端胺基酸可係42位之Gln、43位之Cys或44位之Cys。
術語「聚乙二醇」或「PEG」係指聚伸烷基二醇化合物或其衍生物，其具有或不具有偶聯劑，或經或未經偶聯或活化部分衍生。PEG之典型形式係具有末端羥基之直鏈聚合物且具有式HO-CH2CH2-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH，其中n係約8至4000。mPEG係單甲氧基-聚乙二醇。由於PEG通常係以PEG化合物之分子量在一定程度上變化之混合物形式來生成及使用，熟習此項技術者一般藉由闡述生成特定聚乙二醇化化合物之聚乙二醇化反應中所用PEG試劑之平均分子量來闡述附接至化合物之PEG之分子量。業內存在多種PEG衍生物。共價附接至本發明胜肽之PEG分子可為10,000道爾頓、20,000道爾頓、30,000道爾頓或40,000道爾頓。PEG分子之平均值較佳係18,000至22,000道爾頓。更佳地，平均值係19,000至21,000道爾頓。最佳地，平均值係20,000至21,000道爾頓。PEG分子可係直鏈或具支鏈且可單獨或串聯存在。本發明聚乙二醇化胜肽較佳具有附接至胜肽C末端之串聯直鏈PEG分子。具體而言，PEG分子較佳藉由mPEG-20 kDa馬來醯亞胺(mPEG MAL)(I)或mPEG-20 kDa碘乙醯胺(II)附接至胜肽C末端之兩個半胱氨酸殘基，其中n係10至2500。較佳地，n係350至600。更佳地，n係425至475。
本文所用術語「聚乙二醇化」意指一或多個上述PEG分子共價附接至本發明胜肽。舉例而言，本發明胜肽在43及44位之Cys處經與各Cys之硫醇基共價連接之20 kDa PEG分子聚乙二醇化。
在本文中使用以下縮寫：「t-Bu」係指第三丁基；「fmoc」係指芴基甲氧基羰基；「Pbf」係指2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基；「Trt」係指三苯甲基或三苯基甲基；「OtBu」係指第三丁氧基；「Boc」係指第三丁氧基羰基；「PyBOP」係指六氟磷酸(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯啶基鏻；「DIEA」係指二異丙基乙胺；「HEK」係指人類胚腎；「Tris」係指2-胺基-2-羥甲基-丙烷-1,3-二醇；「BSA」係指牛血清白蛋白；「HEPES」係指2-[4-(2-羥乙基)六氫吡嗪-1-基]乙磺酸；「PBS」係指磷酸鹽緩衝鹽水；「NSB」係指非特異性結合；「HBSS」係指漢克氏緩衝鹽溶液(Hank's buffered salt solution)；「IBMX」係指1-甲基-3-(2-甲基丙基)-7H-嘌呤-2,6-二酮；且「DMSO」係指二甲亞碸。
胜肽合成
所有本發明胜肽皆係在Protein Technologies公司之Symphony自動化胜肽合成儀上藉由固相胜肽合成來生成。合成係在具有約0.7 mmol/g取代之Fmoc-Rink醯胺聚苯乙烯樹脂(Rapp Polymere Tubingen,Germany)上進行。該合成係使用Fmoc/t-Bu固相胜肽合成來實施。所用胺基酸側鏈衍生物係：Arg(Pbf)、Asp(OtBu)、Cys(Trt)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、His(Trt)、Lys(Boc)、Ser(tBu)、Thr(tBu)、Trp(Boc)及Tyr(tBu)。在室溫下用約6當量經二異丙基碳二亞胺(DIC)及羥基苯并三唑(HOBt)活化之胺基酸(莫爾比係1:1:1)在二甲基甲醯胺(DMF)中經90分鐘來進行偶聯。使用以下條件在22位偶聯Fmoc-(1-Nal)-OH：Fmoc-(1-Nal)-OH(3當量)、PyBOP(3當量)及DIEA(6當量)，在DMF中，在室溫下，經3 h。使用以下條件在12位偶聯Fmoc-Ile-OH：Fmoc-Ile-OH(6當量)、PyBOP(6當量)及DIEA(12當量)，在DMF中，在室溫下，經10 h。
伴隨之自樹脂裂解及側鏈保護基團之移除係在含有三氟乙酸(TFA)：三異丙基矽烷：1,2-乙二硫醇：甲醇：茴香硫醚(90:4:2:2:2(v/v))之溶液中在室溫下經2 h來進行。過濾溶液並用冷二乙醚使胜肽沉澱，使其再溶解於30-40 mL存於水中之10%乙腈中，並在C18反相HPLC管柱(通常係Waters SymmetryPrepTM 7 μm，19×300 mm)上以18 mL/min之流速純化。用0至18% B經5 min及之後18%至45% B經110分鐘之二級線性AB梯度洗脫樣品，其中A=0.05% TFA/水且B=0.05% TFA/乙腈。一般在28-35%乙腈中洗脫出產物。在Agilent 1100 Series LC-MS系統上用單一四極MS檢測器確認胜肽純度及分子量。在Zorbax EclipseTM XDB-C8(5 μm，4.6 mm內徑x 15 cm)管柱上用6%至60% B經15分鐘之線性AB梯度實施分析型HPLC分離，其中A=0.05% TFA/H2O且B=0.05% TFA/乙腈，且流速為1 mL/min。所有胜肽皆純化至純度>95%且確認其分子量對應於在1 amu內之計算值。
實例1
(SEQ ID NO: 4)
實例2
(SEQ ID NO: 5)
中間體1
(SEQ ID NO: 6)
中間體2
(SEQ ID NO: 7)
mPEG-MAL-20 kDa對胜肽之聚乙二醇化
稱出凍乾胜肽(通常30-50 mg)。稱出2.1倍莫耳當量之mPEG-20 kDa馬來醯亞胺(CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCO(CH2)2-馬來醯亞胺)(NOF SUNBRIGHT ME-200MA)(mPEG MAL)並與胜肽合併。將反應物溶於50/50(v/v)水/乙腈混合物中至胜肽濃度為約20 mg/mL。用100 mM乙酸銨(10 mM EDTA,pH 7)將胜肽溶液稀釋兩倍。在室溫下攪拌所得混合物。藉由分析型反相HPLC(在60℃下在Waters SymmetryShieldTM C18(3.5 μm,4.6 mm內徑×10 cm)管柱上以0至30% B經5分鐘及之後30%至90% B經30 min之二級線性AB梯度實施分析型HPLC分離，其中A=0.05% TFA/H2O且B=0.05% TFA/乙腈且流速為1 mL/min)來監測反應混合物，且通常在1-2 h反應時間後顯示胜肽峰幾乎完全消失。因單-及二-聚乙二醇化胜肽而出現兩個峰，且二-聚乙二醇化胜肽通常佔總峰面積之90-95%。
通常隨後用酸化水(0.05% TFA/水)將樣品稀釋至約40 mL並藉由C18反相HPLC管柱(通常係Waters SymmetryPrepTM 7 μm,19×300 mm)以10 mL/min之流速及0至25% B經15 min之後25%至55% B經100 min之二級線性AB梯度加以純化，其中A=0.05% TFA/水且B=0.05% TFA/乙腈。一般在35-40%乙腈中洗脫出產物。在280 nm下使用基於胜肽序列計算之莫耳消光係數藉由UV吸光度來量化所純化胜肽。基於起始胜肽之量，純化後產率通常在70%範圍內。
實例3
Aib2、Aib13、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44(PEG20K)-GIP
實例4
Aib2、Aib13、Nal22、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44(PEG20K)-GIP
實例3及實例4之胜肽已使用mPEG-MAL聚乙二醇化。
mPEG-碘乙醯胺-20 kDa對胜肽之聚乙二醇化
稱出凍乾胜肽(通常30-50 mg)。稱出2.1倍莫耳當量之mPEG-20k Da碘乙醯胺(CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCOCH2-I)(NOF SUNBRIGHT ME-200IA)並與胜肽合併。將反應物溶於pH 8.5水性緩衝溶液(硼酸、氯化鉀、氫氧化鈉緩衝液0.1 M+10 mM EDTA)+20%乙腈(v/v)中至胜肽濃度為約10 mg/mL。然後在室溫下攪拌所得混合物。藉由分析型反相HPLC(在60℃下在Waters SymmetryShieldTM C18(3.5微米，4.6 mm內徑×10 cm)管柱上以0至30% B經5分鐘及之後30%至90% B經30 min之二級線性AB梯度實施分析型HPLC分離，其中A=0.05% TFA/H2O且B=0.05% TFA/乙腈且流速為1 mL/min)來監測反應混合物，且通常在18 h反應時間後顯示胜肽峰幾乎完全消失。因單-及二-聚乙二醇化胜肽而出現兩個峰，且二-聚乙二醇化胜肽通常佔總峰面積之90-95%。
通常隨後用酸化水(0.05% TFA/水)將樣品稀釋至約50 mL並藉由C18反相HPLC管柱(通常係Waters SymmetryPrepTM7 μm,19×300 mm)以10 mL/min之流速及0至25% B經15 min之後25%至55% B經100 min之二級線性AB梯度加以純化，其中A=0.05% TFA/水且B=0.05% TFA/乙腈。一般在35-40%乙腈中洗脫出產物。在280 nm下使用基於胜肽序列計算之莫耳消光係數藉由UV吸光度來量化所純化胜肽。基於起始胜肽之量，純化後產率通常在70%範圍內。
或者，稱出凍乾胜肽(通常30-50 mg)。稱出2.1倍莫耳當量之mPEG-20k Da碘乙醯胺(CH3O(CH2CH2O)n-(CH2)3NHCOCH2-I)(NOF SUNBRIGHT ME-200IA)並與胜肽合併。將反應物溶於pH 8.0水性緩衝溶液(0.1 M碳酸氫鹽緩衝液+10 mM EDTA)+20%乙腈(v/v)中至胜肽濃度為約8 mg/mL。然後在室溫及暗環境下攪拌所得混合物。藉由分析型反相HPLC(在60℃下在Waters SymmetryShieldTM C18(3.5微米，4.6 mm內徑x 10 cm)管柱上以0至30% B經5分鐘及之後30%至90% B經30 min之二級線性AB梯度實施分析型HPLC分離，其中A=0.05% TFA/H2O且B=0.05% TFA/乙腈且流速為1 mL/min)來監測反應混合物，且通常在3 h反應時間後顯示胜肽峰幾乎完全消失。因單-及二-聚乙二醇化胜肽而出現兩個峰，且二-聚乙二醇化胜肽通常佔總峰面積之90-95%。
通常隨後用酸化水(0.05% TFA/水)將樣品稀釋至約50 mL並如上文所述進行純化。基於起始胜肽之量，純化後產率通常在70%範圍內。
實例5：SEQ ID: 3
Aib2、Aib13、Nal22、Aib29、Cys43(PEG20K)、Cys44(PEG20K)-GIP
實例5之胜肽係使用mPEG-碘乙醯胺來聚乙二醇化。
分析 活體外
基本上如下文所述來測試本文所例示化合物且其所表現與GIP-R及GLP-1-R之結合親和性(Ki)低於100 nM且相對於Gluc-R之選擇性比率為至少100倍。此外，本文化合物在結合分析中所表現對GIP-R及GLP-1-R之活性比率介於4:1至1:2(GIP-R:GLP-1-R)之間(4:1表明對GIP-R具有較高效能；1:2表明對GLP-1-R具有較高效能)。
葡萄糖依賴性促胰島素胜肽受體(GIP-R)結合分析
人類葡萄糖依賴性促胰島素多肽受體結合分析使用選殖至pcDNA3.1(Promega)-NeoR質粒中之hGIP-R(Usdin,T.B.、Gruber,C.、Modi,W.及Bonner,T.I.，基因庫(GenBank)：AAA84418.1)。將hGIP-R-pcDNA3.1/Neo質粒轉染至中國倉鼠卵巢細胞CHO-S中以供懸浮培養，並在500 μg/mL遺傳黴素(Invitrogen)存在下進行選擇。
使用來自懸浮培養之細胞製備粗質膜。在冰上於含有25 mM Tris HCl(pH 7.5)、1 mM MgCl2、DNA酶1(20 μ/mL)及Roche CompleteTM無EDTA抑制劑之低滲緩衝液中溶解細胞。藉由杜恩斯玻璃勻漿器(glass dounce homogenizer)使用Teflon研棒使細胞懸浮液勻漿25個衝程。在4℃下將勻漿物以1800 x g離心15分鐘。收集上清液並使沉澱再懸浮於低滲緩衝液中並再次勻漿化。以1800 x g將混合物離心15分鐘。合併第二上清液與第一上清液。將經合併上清液以1800 x g再次離心15分鐘至澄清。將澄清上清液轉移至高速管中並在4℃下以25000 x g離心30分鐘。使膜沉澱再次懸浮於勻漿緩衝液中並以冷凍等份試樣儲存在-80℃冷凍器中直至使用。
藉由I-125-乳過氧化物酶程序(Markalonis,J.J.,Biochem. J. 113:299(1969))將GIP放射性碘化並在Perkin-Elmer/NEN(NEX-402)中藉由反相HPLC來純化。比活性為2200 Ci/mmol。藉由使用冷hGIP之同源競爭代替飽和結合來實施KD測定。使用閃爍迫近分析(SPA)(Sun,S.、Almaden,J.、Carlson,T.J.、Barker,J.及Gehring,M.R. Assay development and data analysis of receptor-ligand binding based on scintillation proximity assay. Metab Eng. 7:38-44(2005))以預先經1%無脂肪酸BSA(Gibco,7.5% BSA)封阻之麥胚凝集素(WGA)珠粒(GE Health Care)來實施受體結合分析。結合緩衝液含有25 mM HEPES(pH 7.4)、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.1%無脂肪酸BSA、0.003% Tween20及Roche CompleteTM無EDTA抑制劑。使hGIP及胜肽類似物溶於PBS中並儲存在-80℃下。將胜肽類似物連續稀釋至結合緩衝液中。隨後，將10 μL經稀釋胜肽轉移至含有40 μL分析結合緩衝液或冷GIP之Corning 3632透明底分析板中(NSB，在0.1 μM終濃度下)。隨後，添加90 μL膜(4 μg/孔)、50 μL[125I] GIP(Perkin Elmer Life and Analytical Sciences，反應終濃度為0.15 nM)及50 μL WGA珠粒(150 μg/孔)，密封，並翻轉混合。在室溫下沉降12小時時間後用MicroBeta閃爍計數器讀取板。
結果計算為在化合物存在下特異性I-125-GIP結合之百分比。藉由I-125-GIP之特異性結合百分比對所添加化合物濃度之非線性回歸來得出化合物之絕對IC50濃度。使用Cheng-Prusoff方程將IC50濃度轉換為Ki，其中KD之估計值係0.174 nM(Cheng,Y.、Prusoff,W. H.，Biochem. Pharmacol. 22,3099-3108,(1973))。
該等數據顯示，表1之胜肽與GIP-R結合且可活化該受體，繼而觸發GIP依賴性生理反應。
高血糖素樣-胜肽1(GLP-1-R)受體結合分析
GLP-1受體結合分析使用自293HEK膜分離之經選殖人類高血糖素樣胜肽1受體(hGLP-1-R)(Graziano MP、Hey PJ、Borkowski D、Chicchi GG、Strader CD,Biochem Biophys Res Commun. 196(1): 141-6,1993)。將hGLP-1-R cDNA亞選殖至表現質粒phD中(Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C,an antithrombotic factor. Grinnell,B.W.、Berg,D.T.、Walls,J.及Yan,S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192,1987)。將此質粒DNA轉染至293HEK細胞中並用200 μg/mL潮黴素進行選擇。
使用來自懸浮培養之細胞製備粗質膜。在冰上於含有25 mM Tris HCl(pH 7.5)、1 mM MgCl2、DNA酶1(20 μ/mL)及Roche CompleteTM無EDTA抑制劑之低滲緩衝液中溶解細胞。藉由杜恩斯玻璃勻漿器使用Teflon研棒使細胞懸浮液勻漿25個衝程。在4℃下將勻漿物以1800 x g離心15分鐘。收集上清液並使沉澱再懸浮於低滲緩衝液中並再次勻漿化。以1800 x g將混合物離心15分鐘。合併第二上清液與第一上清液。將經合併上清液以1800 x g再次離心15分鐘至澄清。將澄清上清液轉移至高速管中並在4℃下以25000 x g離心30分鐘。使膜沉澱再次懸浮於勻漿緩衝液中並以冷凍等份試樣儲存在-80℃冷凍器中直至使用。
藉由I-125-乳過氧化物酶程序將高血糖素樣胜肽1(GLP-1)放射性碘化並在Perkin-Elmer/NEN(NEX308)中藉由反相HPLC來純化。比活性為2200 Ci/mmol。由於I-125 GLP-1材料中具有高丙醇含量，故藉由同源競爭代替飽和結合來實施KD測定。KD之估計值係0.96 nM且使用其來計算所測試所有化合物之Ki值。
使用閃爍迫近分析(SPA)以預先經1%無脂肪酸BSA(Gibco)封阻之麥胚凝集素(WGA)珠粒來實施受體結合分析。結合緩衝液含有25 mM HEPES(pH 7.4)、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.1%無脂肪酸BSA、0.003% Tween20及Roche CompleteTM無EDTA抑制劑。將高血糖素樣胜肽1以1 mg/mL溶於PBS中並立即在-80℃下以30 μL等份試樣冷凍。稀釋高血糖素樣胜肽1等份試樣並在1小時內用於結合分析中。將胜肽類似物溶於PBS中並在結合緩衝液中連續稀釋。隨後，將10 μL經稀釋化合物或PBS轉移至含有40 μL分析結合緩衝液或冷高血糖素之Corning 3632透明底分析板中(NSB，在1 μM終濃度下)。隨後，添加90 μL膜(1 μg/孔)、50 μL I-125高血糖素樣胜肽1(0.15 nM反應終濃度)及50 μL WGA珠粒(150 μg/孔)，密封並翻轉混合。在室溫下沉降12小時時間後，用PerkinElmer Life and Analytical Sciences Trilux MicroBeta閃爍計數器讀取板。
結果計算為在化合物存在下特異性I-125-高血糖素樣胜肽1結合之百分比。藉由I-125-高血糖素樣胜肽1之特異性結合百分比對所添加化合物之濃度之非線性回歸來得出化合物之絕對IC50濃度。使用Cheng-Prusoff方程將IC50濃度轉換為Ki。
該等數據顯示，表2之胜肽與GLP-1-R結合且由此可活化該受體，繼而觸發GLP-1依賴性生理反應。
高血糖素受體(hGlucR)結合分析
高血糖素受體結合分析利用自293HEK膜分離之經選殖人類高血糖素受體(Lok,S等人，Gene 140(2),203-209(1994))。將hGlucR cDNA亞選殖至表現質粒phD中(Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C,an antithrombotic factor. Grinnell,B.W.等人，Bio/Technology 5: 1189-1192(1987))。將此質粒DNA轉染至293HEK細胞中並用200 μg/mL潮黴素來選擇。
使用來自懸浮培養之細胞製備粗質膜。在冰上於含有25 mM Tris HCl(pH 7.5)、1 mM MgCl2、DNA酶1(20 μ/mL)及Roche CompleteTM無EDTA抑制劑之低滲緩衝液中溶解細胞。藉由杜恩斯玻璃勻漿器使用Teflon研棒使細胞懸浮液勻漿25個衝程。在4℃下將勻漿物以1800 x g離心15分鐘。收集上清液並使沉澱再懸浮於低滲緩衝液中並再次勻漿化。以1800 x g將混合物離心15分鐘。合併第二上清液與第一上清液。將經合併上清液以1800 x g再次離心15分鐘至澄清。將澄清上清液轉移至高速管中並在4℃下以25000 x g離心30分鐘。使膜沉澱再次懸浮於勻漿緩衝液中並以冷凍等份試樣儲存在-80℃冷凍器中直至使用。
藉由I-125-乳過氧化物酶程序將高血糖素放射性碘化並在Perkin-Elmer/NEN(NEX207)中藉由反相HPLC來純化。比活性為2200 Ci/mmol。由於I-125高血糖素材料中具有高丙醇含量，故藉由同源競爭代替飽和結合來實施KD測定。KD之估計值係2.62 nM且使用其來計算所測試所有化合物之Ki值。
使用閃爍迫近分析(SPA)以預先經1%無脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)(Gibco,7.5% BSA)封阻之麥胚凝集素(WGA)珠粒來實施受體結合分析。結合緩衝液含有25 mM 4-(2-羥乙基)-1-六氫吡嗪乙磺酸(HEPES)(pH 7.4)、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.1%無脂肪酸BSA、0.003% Tween20及Roche CompleteTM無EDTA抑制劑。將高血糖素以1 mg/mL溶於0.01 N HCl中並立即在-80℃下以30 μL等份試樣冷凍。稀釋高血糖素等份試樣並在1小時內用於結合分析中。將胜肽類似物溶於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中並在結合緩衝液中連續稀釋。隨後，將10 μL經稀釋化合物或PBS轉移至含有40 μL分析結合緩衝液或冷高血糖素之Corning 3632透明底分析板中(非特異性結合(NSB)，在1 μM終濃度下)。隨後，添加90 μL膜(3 μg/孔)、50 μL I-125高血糖素(0.15 nM反應終濃度)及50 μL WGA珠粒(150 μg/孔)，密封並翻轉混合。在室溫下沉降12小時時間後，用PerkinElmer Life and Analytical Sciences Trilux MicroBeta閃爍計數器讀取板。
結果計算為在化合物存在下特異性I-125-高血糖素結合之百分比。藉由I-125-高血糖素之特異性結合百分比對所添加化合物之濃度之非線性回歸來得出化合物之絕對IC50濃度。使用Cheng-Prusoff方程將IC50劑量轉換為Ki。
該等數據顯示，表3之胜肽對Gluc-R之選擇性較低且因此並不引發Gluc-R介導之生理反應。
功能性活化hGIP-R細胞以生成細胞內cAMP
cAMP功能分析使用上文所述經分離用於hGIP-R結合分析之相同經選殖GIP-R細胞系。用胜肽刺激細胞並使用CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF分析套組(62AM4PEB)來量化細胞內生成之cAMP。簡言之，藉由在細胞溶解緩衝液存在下與cAMP-d2捕獲抗體結合來檢測在細胞內誘導之cAMP。添加第二檢測抗體抗cAMP穴狀化合物(Cryptate)以產生夾心化合物(sandwich)，隨後使用Perkin-Elmer Life Sciences Envision儀器對其進行檢測。
自近匯合組織培養皿用無酶細胞解離溶液(特製培養基5-004-B)收穫hGIP-R-CHO-S細胞。以低速使細胞沉澱並用cAMP分析緩衝液[存於含有Mg及Ca之HBSS中之25 mM Hepes(GIBCO,14025-092)，含有0.1%無脂肪酸BSA(Gibco,7.5% BSA)、500 μM IBMX]洗滌3次，隨後將其稀釋至終濃度為312,000細胞/mL。將hGIP及胜肽製備為5X原液並連續稀釋至cAMP分析緩衝液中，且自儲存在-20℃下之2,848 nM cAMP存於PBS中之冷凍原液製備cAMP標準曲線。為開始分析，將40 μL細胞懸浮液轉移至未經組織培養物處理之黑色半孔板(CoStar 3694)中，之後添加10 μL 5X胜肽稀釋液。使細胞在室溫下保持1 h。藉由添加25 μL稀釋至CisBio溶解緩衝液中之cAMP-d2捕獲抗體(CisBio)來終止反應，隨後在titer-tek振盪器中緩慢混合。在溶解15分鐘後，添加25 μL檢測抗體抗cAMP穴狀化合物(CisBio)並緩慢混合。在室溫下保持1 h後使用Perkin-Elmer Envision來讀取溶解細胞與抗體之混合物。使用cAMP標準曲線將Envision單位轉換為nM cAMP/孔。將每孔中生成之cAMP奈莫耳數轉換為用hGIP對照觀察到之最大反應百分比。藉由使用最大反應百分比對所添加胜肽之濃度之非線性回歸來得出相對EC50值。
該等數據顯示，表4之胜肽結合並活化GIP-R且由此可引發GIP-R介導之生理反應。
功能性活化hGLP-1-R細胞以生成細胞內cAMP
cAMP功能分析使用自選殖至pcDNA3.1/Neo(Promega)中((Graziano MP、Hey PJ、Borkowski D、Chicchi GG、Strader CD，Biochem Biophys Res Commun.，1993年10月15日；196(1):141-6))並轉染至293HEK細胞中之hGLR-1-R之轉染物分離之表現hGLP-1-R的細胞純系。用胜肽刺激hGLP-1-R細胞並使用CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF分析套組(62AM4PEB)來量化細胞內生成之cAMP。簡言之，藉由在細胞溶解緩衝液存在下與cAMP-d2捕獲抗體(CisBio)結合來檢測在細胞內誘導之cAMP。添加第二檢測抗體抗cAMP穴狀化合物(CisBio)以產生夾心化合物，隨後使用Perkin-Elmer Envision儀器對其進行檢測。
自近匯合組織培養皿用無酶細胞解離溶液(特製培養基5-004-B)收穫hGLP-1-R-293HEK細胞。以低速使細胞沉澱並用cAMP DMEM分析緩衝液[存於DMEM中之10 mM Hepes(Gibco-31053)，含有0.5% FBS及2 mM麩醯胺酸及500 μM IBMX]洗滌3次，隨後稀釋至終濃度為50,000細胞/mL。將hGLP-1及胜肽製備為5X原液並連續稀釋至cAMP DMEM分析緩衝液中，且自儲存在-20℃下之2,848 nM cAMP存於PBS中之冷凍原液製備cAMP標準曲線。為開始分析，將40 μL細胞懸浮液轉移至未經組織培養物處理之黑色半孔板(CoStar 3694)中，之後添加10 μL 5X胜肽稀釋液。使細胞在室溫下保持1 h。藉由添加25 μL稀釋至CisBio溶解緩衝液中之cAMP-d2捕獲抗體(CisBio)來終止反應，隨後在titer-tek振盪器中緩慢混合。在溶解15分鐘後，添加25 μL檢測抗體抗cAMP穴狀化合物(CisBio)並緩慢混合。在室溫下保持1小時後使用Perkin-Elmer Envision來讀取溶解細胞與抗體之混合物。使用cAMP標準曲線將Envision單位轉換為nM cAMP/孔。將每孔中生成之cAMP奈莫耳數轉換為用hGLP-1對照觀察到之最大反應百分比。藉由使用最大反應百分比對所添加胜肽之濃度之非線性回歸來得出相對EC50值。
該等數據顯示，表5之胜肽結合並活化GLP-1-R且由此可引發GLP-1-R介導之生理反應。
活體內 在膳食誘導肥胖(DIO)小鼠中對食物攝入、體重及身體組成之效應
使用三至四個月齡雄性膳食誘導肥胖(DIO)小鼠。將動物單獨飼養在具有12小時光/暗循環(在22:00時開燈)之溫度受控(24℃)設施中，且可自由獲得食物及水。在該設施中馴化2週後，將小鼠隨機分配至各治療組(n=8-10/組)中，從而使得每組具有相似之平均體重及脂肪量。在實驗前，向小鼠皮下(sc)注射媒劑溶液並經7天稱重以使其適應程序。
在2至4週內，每3天在暗循環開始前30-90分鐘時向隨意進食之DIO小鼠藉由皮下注射來投與溶於媒劑中之媒劑或胜肽類似物(劑量範圍係10-100 nmol/Kg)。在相同時間量測體重及食物加上儲料漏斗之重量。藉由自前一天之食物加儲料漏斗重量減去當前值來計算在過去24小時中消耗之食物。藉由減去第一次注射前之動物體重來計算體重之絕對變化。在第-1天及第14天，藉由核磁共振(NMR)使用Echo Medical系統(Houston,TX)儀器來量測總脂肪量。藉由自總體重減去脂肪量來計算非脂肪量。
表6a及6b之數據顯示，在14天之DIO小鼠研究中，實例3、4及5與媒劑治療小鼠相比可降低累積食物攝入及體重。體重主要係由於脂肪量減少而降低。相對於媒劑，*p<0.01，**p<0.001(鄧奈特測試(Dunnett's test))
在2週之治療後，在口服葡萄糖耐受測試期間對DIO小鼠血糖波動之效應
在上述DIO研究中最後一次注射化合物後56小時，對動物實施口服葡萄糖耐受測試。簡言之，使小鼠禁食16小時，之後開始葡萄糖耐受測試。在0時刻，藉由經口管飼給予動物2 g/kg右旋糖。藉由在葡萄糖激發後0、15、30、60及120分鐘實施尾部採血來收集血液。藉由血糖儀來量測葡萄糖濃度。
表7a及7b中之該等數據顯示，實例3、4及5在口服葡萄糖負荷後顯著降低葡萄糖波動。藉由鄧奈特測試來評估統計學顯著性。
在膳食誘導肥胖(DIO)Long Evans大鼠中對食物攝入、體重及身體組成之效應
使用四至五個月齡雄性膳食誘導肥胖Long Evans大鼠。將動物單獨飼養在具有12小時光/暗循環(在22:00時開燈)之溫度受控(24℃)設施中，且可自由獲得食物(膳食TD95217)及水。使動物在該設施中馴化至少2週。在第0天，藉由QNMR來測定身體組成並基於體重、脂肪%及瘦肉量%將大鼠隨機分配至各組(n=6/組)中。在第1、4、8、11及15天藉由皮下注射來投與化合物。在第14天再次藉由QNMR來測定身體組成且在第16天對動物進行稱重及尾部採血以獲得樣品來測定血糖、脂質、胰島素、高血糖素及PYY。在CO2安樂死後，藉由心臟刺入法採集血液樣品以供暴露測定分析。
經16天投與實例3及4，使DIO大鼠之體重及身體組成相對於媒劑治療DIO大鼠發生變化，其中瘦肉量百分比提高且脂肪量百分比降低。舉例而言，在經16天投與10 nmol/Kg劑量之實例3後，瘦肉量提高0.6%且脂肪量降低1.3%。類似地，在經16天投與30 nmol/Kg劑量之實例3後，瘦肉量提高1.3%且脂肪量降低2.3%。此外，在經16天投與30 nmol/Kg劑量之實例4後，瘦肉量提高0.4%且脂肪量降低1.8%。類似地，在經16天投與100 nmol/Kg劑量之實例4後，瘦肉量提高1.8%且脂肪量降低3.2%。
投與實例3及4使得相對於媒劑治療小鼠降低DIO大鼠之血脂含量，包括甘油三酸酯及總膽固醇，且提高游離脂肪酸含量。舉例而言，在投與10 nmol/Kg劑量之實例3後，甘油三酸酯及總膽固醇分別自507.3 mg/dL及104 mg/dL(媒劑)降低至262.1 mg/dL及91 mg/dL，且游離脂肪酸自0.69 mEq/L提高至0.94 mEq/L。類似地，在投與30 nmol/Kg劑量之實例3後，甘油三酸酯及總膽固醇分別自507.3 mg/dL及104 mg/dL(媒劑)降低至233.5 mg/dL及94 mg/dL，且游離脂肪酸自0.69 mEq/L提高至1.01 mEq/L。此外，在投與10 nmol/Kg劑量之實例4後，甘油三酸酯及總膽固醇分別自808.1 mg/dL及127 mg/dL(媒劑)降低至488.7 mg/dL及110 mg/dL。類似地，在投與30 nmol/Kg劑量之實例4後，甘油三酸酯及總膽固醇分別自808.1 mg/dL及127 mg/dL(媒劑)降低至212.2 mg/dL及104 mg/dL，且游離脂肪酸自0.67 mEq/L提高至0.82 mEq/L。
在靜脈內葡萄糖耐受測試期間對正常大鼠之血糖波動之效應
在研究中使用正常雄性Wistar大鼠(225-250 g)。基於進食體重及血糖將動物隨機分配至各組中。在開始測試前16小時向動物注射媒劑或胜肽類似物(劑量為3-400 μg胜肽含量/kg)。在注射時移除食物。在分析前，藉由腹膜內注射65 mg/kg苯巴比妥(Phenobarbital)來使動物麻醉，並插入兩個導管，一個插在頸靜脈中且另一個插在頸動脈中。在0時刻，經由靜脈導管給予動物0.5 g葡萄糖/kg。在0時刻(葡萄糖前)、在葡萄糖激發後2、4、6、10、20及30分鐘時自頸動脈收集血液。藉由血糖儀來量測葡萄糖濃度。藉由Mesoscale來量測胰島素。將功效量測為總胰島素曲線下面積(=自t+0至30 min之血漿胰島素積分值)以及葡萄糖曲線下面積的增加，其係靜脈內葡萄糖激發後葡萄糖波動之量度。
投與實例3及4相對於媒劑治療大鼠提高胰島素AUC且降低葡萄糖AUC。舉例而言，在投與50 μg/Kg劑量之實例3後，胰島素AUC自55 ng*min/mL(媒劑)提高至137 ng*min/mL且葡萄糖AUC自7830 mg*min/dL(媒劑)降低至6780 mg*min/dL。類似地，在投與200 μg/Kg劑量之實例3後，胰島素AUC自55 ng*min/mL(媒劑)提高至183 ng*min/mL且葡萄糖AUC自7830 mg*min/dL(媒劑)降低至7020 mg*min/dL。此外，在投與50 μg/Kg劑量之實例4後，胰島素AUC自44 ng*min/mL(媒劑)提高至150 ng*min/mL且葡萄糖AUC自8010 mg*min/dL(媒劑)降低至7730 mg*min/dL。類似地，在投與200 μg/Kg劑量之實例4後，胰島素AUC自44 ng*min/mL(媒劑)提高至161 ng*min/mL且葡萄糖AUC自8010 mg*min/dL(媒劑)降低至7420 mg*min/dL。
在投與50 μg/Kg劑量之實例5後，胰島素AUC自41 ng*min/mL(媒劑)提高至133 ng*min/mL且葡萄糖AUC自7739 mg*min/dL(媒劑)降低至7202 mg*min/dL。類似地，在投與200 μg/Kg劑量之實例5後，胰島素AUC自41 ng*min/mL(媒劑)提高至124 ng*min/mL且葡萄糖AUC自7739 mg*min/dL(媒劑)降低至7351 mg*min/dL。
骨骼效應
在6個月齡切除卵巢(OvX；參見Endocrinology 144: 2008-2015)之Sprague Dawley大鼠中評估實例4。在手術後9天開始以每日皮下注射形式給予大鼠0、2.9、9.7或29 nmol/kg之劑量。治療持續35天，且與經假手術OvX大鼠相比，實例4使食物消耗及體重劑量反應性地降低最高8%。體重係由於脂肪量降低而減少且在OvX大鼠中未觀察到瘦肉量變化。實例4在OvX大鼠中降低非禁食血清葡萄糖及甘油三酸酯。該化合物在腰椎中以劑量依賴性方式防止OvX誘導之骨礦物質含量降低及骨礦物質密度降低，但在股骨中段皮質骨中無效應。在OvX大鼠之股骨及腰椎中，實例4對骨礦物質密度或骨礦物質含量無不良影響。應注意，體重降低(在此研究中為8%)可直接影響骨量。骨強度具有負荷依賴性且體重降低會降低載重骨上之負荷，且因此觀察到對載重骨(即股骨皮質骨)之骨骼參數之影響較少。依次藉由單向ANOVA及鄧奈特測試來評估統計學顯著性。
表8及9中之數據顯示，實例4改良OvX大鼠之BMC及BMD。
本發明化合物較佳調配成可藉由多種途徑投與之醫藥組合物。最佳地，該等化合物用於非經腸投與。該等醫藥組合物及其製備方法為業內所熟知。例如，參見Remington: The Science and Practice of Pharmacy(A. Gennaro等人編輯，第19版，Mack Publishing公司1995)。
本發明化合物通常在較寬劑量範圍內有效。舉例而言，每週劑量在1至24 mg胜肽偶聯物或0.014至0.343 mg/Kg體重範圍內。在一些情形下，低於上述範圍下限之劑量量可能過量，而在其他情形下可使用更大劑量而不會引起任何有害副作用，且因此以上劑量範圍並非意欲以任何方式限制本發明之範圍。應理解，化合物之實際投與量將由醫師根據包括以下之相關情況來確定：欲治療之病況、所選投與途徑、實際投與之化合物、個別患者之年齡、體重及反應及患者症狀之嚴重程度。
熟習此項技術者可瞭解本發明之其他修改而不背離本發明之範圍。
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Claims (10)

  1. 一種胜肽，其具有以下序列： (SEQ ID NO：1)其中22位之Xaa1係Nal或Phe；43位之Xaa2係Cys或不存在；44位之Xaa3係Cys或不存在；C末端胺基酸係經醯胺化或不經醯胺化；且前提係倘若43位之Xaa2或44位之Xaa3係Cys，則其一者或兩者經聚乙二醇化。
  2. 如請求項1之胜肽，其中43位之Cys或44位之Cys或二者經18至22 kDa之PEG分子聚乙二醇化。
  3. 如請求項2之胜肽，其中該PEG分子係20 kDa。
  4. 如請求項2之胜肽，其中每一PEG皆係直鏈。
  5. 如請求項1之胜肽，其包含以下序列： (SEQ ID NO：2)其中該44位之聚乙二醇化Cys之羧基經醯胺化。
  6. 如請求項1之胜肽，其包含以下序列： (SEQ ID NO：3)其中該44位之聚乙二醇化Cys之羧基經醯胺化。
  7. 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至6中任一項之胜肽及醫藥上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  8. 如請求項7之醫藥調配物，其包含一或多種其他治療藥劑。
  9. 一種如請求項1至6中任一項之胜肽之用途，其用於製造治療糖尿病之藥物。
  10. 一種如請求項1至6中任一項之胜肽之用途，其用於製造誘導體重降低之藥物。
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