KR20210145311A - Ｇｉｐ 및 ｇｌｐ-1 공효능제 화합물 - Google Patents

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KR20210145311A
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조르즈 알시나-페르난데즈
벵트 크리스터 보크비스트
태머 코스쿤
로버트 채드윅 커민스
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일라이 릴리 앤드 캄파니
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Abstract

본 발명은 인간 글루코스-의존성 인슐린분비자극 폴리펩티드 (GIP) 및 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 둘 모두에 대한 수용체에 대하여 효능작용하는 이중 인크레틴 펩티드 모방체 화합물에 관한 것이고, 제2형 당뇨병 (T2D)을 치료하는 데 유용할 수 있다.

Description

ＧＩＰ 및 ＧＬＰ-1 공효능제 화합물 {GIP AND GLP-1 CO-AGONIST COMPOUNDS}
본 발명은 의약 분야에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 인간 글루코스-의존성 인슐린분비자극 폴리펩티드 (GIP) 및 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1), 둘 모두에 대한 수용체에 대하여 효능작용하는 이중 인크레틴 펩티드 모방체 화합물에 관한 것이고, 이는 제2형 당뇨병 (T2D)을 치료하는 데 유용할 수 있다.
T2D는 전체 당뇨병 중 대략 90%를 차지하는 가장 일반적인 형태의 당뇨병이다. T2D는 인슐린-저항성에 의해 유발되는 고 혈당 수준을 특징으로 한다. T2D에 대해 수행되는 현 표준 치료는 이용가능한 경구용 및 주사용 글루코스 강하 약물과 함께 식이 및 운동을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 다수의 T2D 환자들은 여전히 적절히 제어되지 않고 있다. 현재 시판되는 인크레틴 모방체 또는 디펩티딜 펩티다제 IV (DPP-IV) 억제제는 혈당 제어를 위해 오직 확립된 단일의 작용 기전만을 사용한다. 이중 작용 기전을 이용하는 T2D용 화합물이 요구된다.
GIP는 글루코스의 존재에서 췌장 베타 세포로부터의 인슐린 분비를 자극시키고, 췌장 베타 세포를 보호함으로써 글루코스 항상성에서 생리학상 중요한 역할을 하는 42-아미노산 위장관 조절 펩티드이다. GLP-1은, 인슐린 분비를 자극시키고, 췌장 베타 세포를 보호하고, 체중 감소를 유도하는 글루카곤 분비, 위 배출 및 음식물 섭취를 억제시키는 37-아미노산 펩티드이다. GIP 및 GLP-1은 인크레틴으로서 공지되어 있고; 인크레틴 수용체 신호전달은 글루코스 항상성에 중요한 생리학적으로 관련된 작용을 한다. 정상적인 생리에서, GIP 및 GLP-1은 식사 후 소화관으로부터 분비되고, 이들 인크레틴은 포만감, 인슐린 분비, 및 영양분 처리를 비롯한 음식물에 대한 생리학적 반응을 증진시킨다. T2D 환자는 손상된 인크레틴 반응을 보인다.
GLP-1 유사체 투약은 유해한 효과, 예컨대, 구역 및 구토로 인해 제한되는 것으로 나타났고, 그 결과, 투약은 가장 빈번하게는 혈당 제어 및 체중 감소에 대해 완전한 효능에 도달하지 못한다. GIP 단독으로는 제2형 당뇨병을 앓는 인간에서 얼마 되지 않는 글루코스 강하 능력을 가진다. 천연 GIP 및 GLP-1, 둘 모두는 편재성 프로테아제인 DPP IV에 의해 신속하게 불활성화되는 바, 이에 단기간 대사 제어를 위해서만 사용될 수 있다.
글루카곤은 글루카곤 수용체가 결합하였을 때, 췌장에 의해 생산되는 29-아미노산 펩티드이고, 이는 글루코스를 방출하도록 간에 신호를 전달하여 혈당 증가를 유도한다. GLP-1과 유사한 펩티드인 GLP-2는 프로글루카곤의 프로세싱으로부터 생산되고, 이는 소화관에서의 세포 증식과 연관이 있는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 글루코스 강하를 최대화시키고, 잠재적인 장기간의 발암 위험을 감소시키기 위해서는 T2D 환자의 만성 치료 동안에 글루카곤 및 GLP-2 수용체 자극은 최소화되어야 한다.
GIP 및 GLP-1 활성, 둘 모두를 보이는 특정 GIP 유사체가 WO 2013/164483, WO 2014/192284, 및 WO 2011/119657에서 기술되었다.
DPP IV는 엑소펩티다제 부류의 단백질분해 효소에 포함된 것이다. 서열 중 비-천연 아미노산의 도입은 임의의 주어진 펩티드의 단백질분해 안정성을 증가시킬 수 있다. 비-천연 아미노산의 사용이 DPP IV 단백질분해 및 다른 형태의 분해로부터의 펩티드의 안정성에 도움을 줄 수는 있지만, 본 출원인들에 따르면 본 발명의 일부로서 비-천연 아미노산이 GIP와 GLP-1 사이의 효능제 활성의 균형에 대하여 예상치 못한 영향을 줄 수 있다는 것을 발견하게 되었다. 비-천연 아미노산은 또한 펩티드가 외래 물질로서 인식될 수 있어, 바람직하지 못한 면역 반응, 예컨대, 인간 면역원성 및 주사 부위 반응을 유발할 수 있는 가능성을 증가시킨다.
지방산은 그의 알부민 결합 모티프를 통해 예를 들어, 반감기를 연장시킴으로써 펩티드의 약동학적 성질을 개선시킬 수 있다. 지방산 사용이 펩티드 반감기를 개선시킬 수는 있지만, 본 출원인들에 따르면 본 발명의 일부로서 지방산 쇄, 및 펩티드와 지방산 쇄 사이의 링커의 길이, 조성 및 배치가 GIP 및 GLP-1 효능제 활성의 균형에 대하여 예상치 못한 영향을 줄 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
GLP-1 유사체의 내약성은 혈당 제어 및 체중 감소에 대하여 더욱 우수한 효능을 달성하는 GLP-1 유사체 투약을 막는 것으로 나타났다. GLP-1 유사체가 원인인 가장 일반적인 부작용은 구역 및 구토이지만, 일부 화합물은 또한 심박동수에도 영향을 줄 수 있다. HPA 축이 생리학적 스트레스 반응의 일부이며, GLP-1은 래트에서 HPA 축을 자극시켜 코르티코스테론 수준을 증가시킴으로써 예컨대, 심박동수 증가와 같은 유해 사례와의 잠재적인 연관성을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 일부로서, 본 출원인들은 예상 밖으로 본 발명의 화합물이 래트 모델에서 세마글루티드의 경우에 관찰되는 것과 같은 코르티코스테론 수준 상승을 유도하지 않고, 이로써, 가능하게는 GLP-1R-선택적 작용제보다 더 높은 효능 수준으로 투약될 수 있다는 것을 발견하게 되었다.
GIP와 GLP-1 수용체에 대한 균형 잡힌 공효능제이지만, 관련된 글루카곤 및 GLP-2 수용체에 대해서는 선택성을 띠는 화합물 제공이 여전히 요구되고 있다. 또한, 동물 모델에서 발견되는 체중 감소라는 주어진 활성을 제공할 수 있는 GIP와 GLP-1 수용체에 대하여 균형 잡힌 공효능제 활성을 가진 화합물을 제공하는 것도 여전히 요구되고 있다. 추가로, DPP IV 및 다른 형태의 분해에 대해 적절한 안정성을 전달함과 동시에, 낮은 면역원성 잠재능은 그대로 유지시키는, GIP와 GLP-1 수용체에 대하여 균형 잡힌 공효능제 활성을 가진 화합물을 제공하는 것도 여전히 요구되고 있다. 또한, 인간에서 잠재적인 주 1회 투약을 지원하는 GIP와 GLP-1 수용체에 대하여 균형 잡힌 공효능제 활성을 가진 화합물을 제공하는 것도 여전히 요구되고 있다.
따라서, 본 발명의 특정 화합물은 관련 기술분야에서 특정의 GIP-GLP-1 공효능제 화합물보다 면역원성 및 주사 부위 반응에 대해 더 낮은 잠재성을 가진다. 본 발명의 특정 화합물은 동물 에너지 소비 데이터에 기초하여 환자에서 체중을 감소시킬 수 있는 잠재능을 가진다. 추가로, 본 발명의 특정 화합물은 GIP와 GLP-1 수용체에 대하여 균형 잡힌 공효능제 활성, 및 글루카곤 및 GLP-2 수용체, 둘 모두에 대한 선택성, 낮은 면역원성 잠재성, 및 인간에서 주 1회 투약을 지원하는 약동학적 (PK) 특징을 가진다.
따라서, 본 발명의 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 (서열식별번호(SEQ ID NO): 11), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
<화학식 I>
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS;
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고, 여기서, a는 1 내지 2이고, b는 10 내지 20이고; X3은 Phe 또는 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 임의적으로 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고, 여기서, a는 1 내지 2이고, b는 10 내지 18이고; X3은 Phe이고; C-말단 아미노산은 임의적으로 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고, 여기서, a는 1 내지 2이고, b는 10 내지 18이고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 임의적으로 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고, 여기서, a는 1 내지 2이고, b는 14 내지 18이고; X3은 Phe 또는 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 임의적으로 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 b가 16 내지 18인 것인 화합물을 제공한다. 추가로, 본 발명은 b가 18인 것인 화합물을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고, 여기서, a는 1이고, b는 10 내지 18이고; X3은 Phe 또는 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 임의적으로 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고, 여기서, a는 2이고, b는 10 내지 18이고; X3은 Phe 또는 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 임의적으로 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고, 여기서, a는 1 내지 2이고, b는 10 내지 18이고; X3은 Phe 또는 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된 것인, 화학식 I의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (서열식별번호: 3), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS;
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (서열식별번호: 4), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS;
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (서열식별번호: 5), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS;
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (서열식별번호: 6), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS;
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (서열식별번호: 7), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (서열식별번호: 8), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (서열식별번호: 9), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 하기 화학식의 화합물 (서열식별번호: 10), 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다:
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체, 희석제, 또는 부형제와 함께 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제2형 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 유효량의, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 술포닐우레아, 디펩티딜 펩티다제 4 억제제, 및 소듐 글루코스 공수송체로부터 선택되는 하나 이상의 작용제와 함께 조합하여 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 혈당 제어 개선을 필요로 하는 환자에게 식이 및 운동에 대한 부가물로서 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 제2형 당뇨병을 앓는 성인에서 혈당 제어를 개선시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 만성 체중 관리를 필요로 하는 환자에게 칼로리가 감소된 식이 및 증가된 신체 활동에 대한 부가물로서 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 초기 체질량 지수가 ≥ 27이고, 제2형 당뇨병을 앓는 성인에서의 만성 체중 관리 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 대사 증후군 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 대사 증후군을 치료하는 방법을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 인슐린 저항성 및 당뇨병과 연관된 이상지질혈증, 비만, 및/또는 간 지방증 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병과 연관된 이상지질혈증, 비만, 및/또는 간 지방증를 치료하는 방법을 제공한다. 추가로, 본 발명은 허약 치료 또는 골 강도 증가를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 허약을 치료하거나, 또는 골 강도를 증가시키는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 제2형 당뇨병 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 제2형 당뇨병치료에서 사용하기 위한, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 술포닐우레아, 디펩티딜 펩티다제 4 억제제, 및 소듐 글루코스 공수송체로부터 선택되는 하나 이상의 작용제와 함께 동시, 개별 또는 순차적으로 조합되는 본 발명의 화합물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제2형 당뇨병을 앓는 성인에서의 혈당 제어에서 식이 및 운동에 대한 부가물로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명은 초기 체질량 지수가 ≥ 27이고, 제2형 당뇨병을 앓는 성인에서의 만성 체중 관리에서 칼로리가 감소된 식이 및 증가된 신체 활동에 대한 부가물로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제2형 당뇨병 치료용 의약 제조를 위한 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다. 추가의 실시양태에서, 본 발명은 제2형 당뇨병 치료용 의약 제조를 위한, 메트포르민, 티아졸리딘디온, 술포닐우레아, 디펩티딜 펩티다제 4 억제제, 및 소듐 글루코스 공수송체로부터 선택되는 하나 이상의 작용제와 함께 동시, 개별 또는 순차적으로 조합되는 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 균형 잡힌 GIP 및 GLP-1 활성을 보이는 화합물을 제공한다. 본원에서 사용되는 바, GIP 및 GLP-1에 대하여 균형 잡힌 활성이란, 시험관내 결합 검정법에서 GIP 수용체 및 GLP-1 수용체에 대한 화합물의 친화도가 1:1에 가까운 몰비, 예컨대, 1:1 GLP-1/GIP, 2:1 GLP-1/GIP, 3:2 GLP-1/GIP, 1:2 GLP-1/GIP, 또는 2:3 GLP-1/GIP인 것을 지칭한다.
본 발명은 글루카곤 및 GLP-2에 대한 수용체 대비 GIP 및 GLP-1 수용체에 대하여 선택성을 보이는 화합물을 제공한다. 본원에서 글루카곤 활성과 비교하여 GIP 및 GLP-1 활성을 언급하는 경우에 사용될 때, "선택성" 또는 "~에 대해 선택적"이라는 용어는 화합물이, 데이터가 각각의 시험관내 결합 검정법으로부터 정규화될 때, 글루카곤에 비하여 GIP 및 GLP-1에 대하여 1000, 500, 또는 약 100배 더 높은 효능을 보인다는 것을 지칭하는 것이다. 본원에서 GLP-2 활성과 비교하여 GIP 및 GLP-1 활성을 언급하는 경우에 사용될 때, "선택성" 또는 "~에 대해 선택적"이라는 용어는 화합물이, 데이터가 각각의 시험관내 기능 검정법으로부터 정규화될 때, GLP-2에 비하여 GIP 및 GLP-1에 대하여 250, 200, 100, 또는 약 50배 더 높은 효능을 보인다는 것을 지칭하는 것이다.
본 발명은 제2형 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 제2형 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하고, 여기서, 투여는 피하 투여인 것인, 환자에서 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 제2형 당뇨병 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을, 및 유효량의 하나 이상의 다른 활성 성분을 동시에, 개별적으로, 또는 순차적으로 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 다른 활성 성분 또는 성분들은 예컨대, 미국 당뇨병 학회(American Diabetes Association)와 같은 산업상 가이드라인에 의해 결정되는 투여 이전의 표준 치료로 간주되는 약물 부류로부터의 현재 이용가능한 경구용 글루코스 강하 약물이다.
본 발명의 화합물은 리신 측쇄의 엡실론-아미노 기에 화학적으로 접합된 지방산을 이용한다. 지방산은 링커를 통해 리신 측쇄의 엡실론-아미노 기에 접합된다. 링커는 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a를 포함하고, 여기서, a는 1 내지 2이다. 지방산 및 링커 중의 감마-글루탐산은 알부민 결합제로서의 작용을 하고, 장시간 작용하는 화합물을 생성할 수 있는 잠재성을 제공한다. 본 발명의 화합물은 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H (여기서, 여기서, a는 1 내지 2이고, b는 10 내지 20이다)로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되는 20번 위치의 리신을 포함한다. 실시예 1 및 2의 화학 구조식에 제시된 바와 같이, [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸의 제1 단위는 리신 측쇄의 엡실론-아미노 기에 연결된다. 이어서, [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸의 제2 단위는 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸의 제1 단위의 아미노-기에 부착되었다. 이어서, γGlu의 제1 단위는 측쇄의 γ-카르복실 기를 통해 [2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸의 제2 단위의 아미노-기에 부착되었다. a = 2일 때, γGlu의 제2 단위는 측쇄의 γ-카르복실 기를 통해 γGlu의 제1 단위의 α-아미노-기에 부착된다. 마지막으로, 대칭 지방산은 γGlu의 제1 (a = 1일 때), 또는 제2 (a = 2일 때) 단위의 α-아미노-기에 부착된다.
본 발명의 화합물은 바람직하게는 비경구 경로 (예컨대, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 또는 경피)에 의해 투여되는 제약 조성물로서 제제화된다. 상기 제약 조성물 및 그를 제조하는 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy (D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006] 참조). 바람직한 투여 경로는 피하이다.
본 발명의 화합물은 다수의 무기산 및 유기산 중 임의의 것과 반응하여 제약상 허용되는 산 부가 염을 형성할 수 있다. 제약상 허용되는 염 및 그를 제조하는 일반 방법론은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예컨대, 문헌 [P. Stahl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011)]; [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, January 1977]을 참조할 수 있다. 본 발명의 제약상 허용되는 염으로는 트리플루오로아세테이트, 히드로클로라이드, 및 아세테이트 염을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "유효량"이라는 용어는 환자에게 단일 또는 다회 용량으로 투여되었을 때, 진단 또는 치료하에 환자에서 원하는 효과를 제공하는, 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양 또는 용량을 지칭한다. 유효량은 공지 기술을 사용함으로써 및 유사 환경하에서 수득한 결과를 관찰함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자로서 주치의 진단의에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 환자에 대한 유효량을 결정할 때, 포유동물 종; 그의 크기, 연령 및 일반적인 건강 상태; 연루된 구체적인 질환 또는 장애; 질환 또는 장애의 연루 정도 또는 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 특정 화합물; 투여 모드; 투여되는 제제의 생체이용성 특징; 선택된 투약 요법; 동시 약물처치 사용; 및 다른 관련된 환경을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다수의 인자가 주치의 진단의에 의해 고려된다.
본원에서 사용되는 바, "치료하는" 또는 "치료하기 위해"라는 용어는 현 증상 또는 장애의 진행 또는 중증도를 저지시키거나, 저속화하거나, 정지시키거나, 또는 역전시키는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "세마글루티드"란, CAS 등록 번호 910463-68-2에서 발견되는 것의 펩티드 백본 및 전체 화합물 구조를 가지는 화학적으로 합성된 GLP-1 유사체를 지칭한다.
본 발명의 특정 화합물은 일반적으로 광범위한 투여량 범위에 걸쳐 효과적이다. 예를 들어, 주 1회 투약을 위한 투여량은 주당 1인당 약 0.05 내지 약 30 mg 범위 내에 포함될 수 있다. 본 발명의 특정 화합물은 매일 투약될 수 있다. 추가로, 본 발명의 특정 화합물은 주 1회로 투약될 수 있다.
본 발명의 아미노산 서열을 20종의 천연적으로 발생된 아미노산에 대한 표준 1 문자 또는 3 문자 코드를 포함한다. 추가로, "Aib"는 알파 아미노 이소부티르산이고, "1-Nal"은 1-나프틸알라닌이다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 합성하는 데 유용한 신규 중간체 및 방법을 포함한다. 본 발명의 중간체 및 화합물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 특히, 화학적 합성법을 사용하는 방법은 하기 실시예에 예시되어 있다. 기술된 각 경로에 대한 구체적인 합성 단계는 본 발명의 화합물, 또는 그의 염 제조를 위해 다른 방식으로 조합될 수 있다. 시약 및 출발 물질은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 쉽게 이용가능하다. 본 실시예는 어느 방식으로든 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해한다.
실시예 1
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 3), 트리플루오로아세테이트 염
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다
Figure pat00001
.
상기 구조는 표준 1 문자 아미노산 코드를 포함하며, 단, 예외적으로, 잔기 Aib2, Aib13 및 K20의 경우, 이들 아미노산 잔기의 구조는 확장되었다.
본 발명의 서열식별번호: 3에 따른 펩티드는, RAPP AM-링크 아미드(Rink Amide) 수지로부터 출발하여, 25℃에서 90 min 동안 디메틸포름아미드 (DMF) 중에서 디이소프로필카르보디이미드 (DIC) 및 히드록시벤조트리아졸 (HOBt)로 활성화된 6 당량의 아미노산 (1:1:1 몰비)을 사용하여 커플링하여 심포니(Symphony) 자동 펩티드 합성 장치 (PTI 프로테인 테크놀러지지즈 인크.(PTI Protein Technologies Inc.)) 상에서 수행되는 Fmoc/t-Bu 전략법을 이용하여 고체상 펩티드 합성에 의해 생성된다.
Pro31, Trp25, Gln24, Val23, Phe22, Lys20, Gly4, Glu3 및 Aib2에 대한 확장된 커플링 (각 4h씩)은 조 펩티드의 품질을 개선시키는 데 필요하다. Fmoc-Lys(Alloc)-OH 빌딩 블록은 추후 합성 프로세스에서 지방산 모이어티의 부위 특이적인 부착을 허용하는 Lys20 커플링을 위해 사용된다 (직교성 보호기). 하기 조건은 12번 위치에서의 Fmoc-Ile-OH의 커플링을 위해 사용된다: 25℃에서 24 h 동안 DMF 중 Fmoc-Ile-OH (6 equiv), PyBOP (6 equiv), 및 DIEA (12 equiv). N-말단 잔기는 상기 기술된 바와 같은 DIC-HOBt 프로토콜을 사용하여 Boc-Tyr(tBu)-OH로서 도입된다.
상기 기술된 펩티드-수지의 신장 종료 후, PhSiH3의 존재하에 촉매량의 Pd(PPh3)4를 스캐빈저로서 사용하여 Lys20에 존재하는 Alloc 보호기를 제거한다. Lys20 측쇄 확장을 위해 Fmoc/t-Bu 전략법을 사용하는 추가의 커플링/탈보호 사이클은 Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH (켐펩(ChemPep) 카탈로그 번호 280102), Fmoc-Glu(OH)-OtBu (켐펩 카탈로그 번호 100703) 및 HOOC-(CH2)18-COOtBu를 포함하였다. 모든 커플링에서, 3 당량의 빌딩 블록을 25℃에서 4 h 동안 DMF 중 PyBOP (3 equiv) 및 DIEA (6 equiv)와 함께 사용한다.
동시의, 수지로부터의 절단 및 측쇄 보호기 제거는 25℃에서 2 h 동안 트리플루오로아세트산 (TFA): 트리이소프로필실란: 1,2-에탄디티올: 물: 티오안니솔 90:4:2:2:2 (v/v)를 함유하는 용액 중에서 수행되고, 이어서, 냉 에테르를 이용한 침전이 이어진다. C18 칼럼 상에서 물/아세토니트릴 (0.05% v/v TFA 함유) 구배를 이용하여 역상 HPLC 크로마토그래피에 의해 조 펩티드를 > 99% 순도 (15-20% 정제 수율)로 정제하고, 여기서, 적합한 분획을 풀링하고, 동결건조시킨다.
본질적으로 상기 기술된 바와 같이 수행된 합성에서, 실시예 1의 순도는 분석적 역상 HPLC에 의해 조사하였고, 아이덴티티는 LC/MS를 사용하여 확인하였다 (관측치: M+3H+/3 =1605.2; 계산치 M+3H+/3 =1605.5; 관측치: M+4H+/4 =1204.3; 계산치 M+4H+/4 =1204.4).
실시예 2
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 4), 트리플루오로아세테이트 염
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다
Figure pat00002
.
상기 구조는 표준 1 문자 아미노산 코드를 포함하며, 단, 예외적으로, 잔기 Aib2, Aib13, K20 및 1-Nal22의 경우, 이들 아미노산 잔기의 구조는 확장되었다.
본 발명의 서열식별번호: 4에 따른 펩티드는 상기 실시예 1에 기술된 바와 유사한 방식으로 합성된다. 22번 위치에서의 Fmoc-1Nal-OH 커플링을 위해 하기 조건이 사용된다: 25℃에서 4 h 동안 DMF 중 Fmoc-1Nal-OH (6 equiv), PyBOP (6 equiv), 및 DIEA (12 equiv).
실시예 3
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 5), 트리플루오로아세테이트 염
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
본 발명의 서열식별번호: 5에 따른 화합물은 상기 실시예 1에 기술된 바와 유사한 방식으로 합성된다.
실시예 4
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 6), 트리플루오로아세테이트 염
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
본 발명의 서열식별번호: 6에 따른 화합물은 상기 실시예 1에 기술된 바와 유사한 방식으로 합성된다.
실시예 5
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 7), 트리플루오로아세테이트 염
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
본 발명의 서열식별번호: 7에 따른 화합물은 상기 실시예 1에 기술된 바와 유사한 방식으로 합성된다.
실시예 6
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 8), 트리플루오로아세테이트 염
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
본 발명의 서열식별번호: 8에 따른 화합물은 상기 실시예 1에 기술된 바와 유사한 방식으로 합성된다.
실시예 7
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 9), 트리플루오로아세테이트 염
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
본 발명의 서열식별번호: 9에 따른 화합물은 상기 실시예 1에 기술된 바와 유사한 방식으로 합성된다.
실시예 8
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS (서열식별번호: 10), 트리플루오로아세테이트 염
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
본 발명의 서열식별번호: 10에 따른 화합물은 상기 실시예 1에 기술된 바와 유사한 방식으로 합성된다.
검정법
여러 검정법: 시험관내 기능 및 선택성, 면역원성 프로파일링, 약동학적 성질, 및 생체내 제2형 당뇨병 모델에서의 실시예를 위한 조건 및 데이터는 하기에 제공한다.
시험관내 기능 및 선택성
인간 GLP-1 및 GIP 수용체에의 시험관내 결합 효능
인간 GLP1R cDNA 또는 인간 GIP-R cDNA를 과다발현하는 클론성 세포주로부터 수득된 조 세포 막을 사용하여 결합 친화도 Ki를 측정함으로써 본 발명의 화합물의 인간 GIP 및 GLP-1 수용체에 의해 시험관내 결합 효능을 평가한다.
인간 글루코스-의존성 인슐린분비자극 폴리펩티드 수용체 결합 검정법은 pcDNA3.1 (프로메가(Promega))-NeoR 플라스미드로 클로닝된 hGIP-R (Usdin,T.B., Gruber,C., Modi,W. and Bonner,T.I., 진뱅크: AAA84418.1)을 사용하였다. hGIP-R-pcDNA3.1/Neo 플라스미드를 현탁 배양을 위해 차이니즈 햄스터 난소 세포 CHO-S 내로 형질감염시키고, 500 ㎍/mL 제네티신(Geneticin) (인비트로겐(Invitrogen))의 존재하에서 선별한다.
현탁 배양물로부터의 세포를 사용하여 조 원형질막을 제조한다. 세포를 25 mM 트리스(Tris) HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl2, DNAse1, 20 μ/mL, 및 EDTA 무함유 로슈 컴플리트(Roche Complete)™ 억제제를 함유하는 저장성 완충제(hypotonic buffer) 중 얼음 상에서 용해시킨다. 세포 현탁액을 25 스트로크를 위해 테플론(Teflon)® 막자를 사용하여 유리 다운스 균질기로 균질화시킨다. 균질액을 4℃에서 15분 동안 1800 x g로 원심분리한다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 저장성 완충제 중에 재현탁시키고, 재균질화시킨다. 혼합물을 15분 동안 1800 x g로 원심분리한다. 제2 상청액을 제1 상청액과 조합한다. 조합된 상청액을 15분 동안 1800 x g로 원심분리하여 정화시킨다. 정화된 상청액을 고속 튜브로 옮기고, 4℃에서 30분 동안 25,000 x g로 원심분리한다. 막 펠릿을 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 사용시까지 냉동 분취물로서 -80℃ 냉동기에서 보관한다.
GIP를 I-125-락토퍼옥시다제 방법 (Markalonis, J.J., Biochem. J. 113:299 (1969))에 의해 아이오딘으로 방사성 표지하고, 역상 HPLC (퍼킨-엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈(Perkin-Elmer Life and Analytical Sciences) NEX-402)에 의해 정제한다. 비활성(specific activity)은 2,200 Ci/mmol이다. 포화 결합 대신 냉 hGIP를 이용한 상동성 경쟁에 의해 KD 측정을 수행한다. 앞서 1%의 지방산 무함유 BSA (기브코(Gibco), 7.5% BSA)로 차단된 소맥 배아 응집소 (WGA) 비드 (퍼킨 엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈)를 이용하여 섬광 근접 검정법 (SPA)을 사용함으로써 수용체 결합 검정법을 수행한다. 결합 완충제는 25 mM HEPES (pH 7.4), 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1% 지방산 무함유 BSA, 0.003% 트윈20(Tween20), 및 EDTA 무함유 로슈 컴플리트™ 억제제를 함유한다. hGIP 및 본 발명의 화합물을 100% DMSO 중에 용해시키고, -20℃에서 보관한다. 화합물을 결합 완충제에 연속적으로 희석시킨다. 이어서, 10 ㎕ 희석된 화합물 또는 100% DMSO를 40 ㎕ 검정 결합 완충제 또는 냉 GIP (NSB, 최종 0.1 μM)를 함유하는 코닝(Corning)® 3632 투명 바닥 검정용 플레이트로 옮긴다. 이어서, 90 ㎕의 막 (3 ㎍/웰), 50 ㎕ [125I] GIP (퍼킨 엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈, 반응에서 최종 0.15 nM), 및 50 ㎕의 WGA 비드 (150 ㎍/웰)를 첨가하고, 실링하고, 1분 동안 플레이트 진탕기 상에서 혼합한다. 실온에서 12시간의 침강 시간 후, 플레이트를 마이크로베타(MicroBeta)® 섬광 계수기로 판독한다.
결과를 화합물의 존재하에서 특이적인 I-125-GIP 결합의 백분율로서 계산한다. 첨가된 화합물 농도 대비 I-125-GIP의 특이적인 결합 비율(%)의 비선형 회귀에 의해 절대 IC50 농도를 도출해 낸다. 청-프루소프(Cheng-Prusoff) 방정식을 이용하여 IC50 농도를 Ki로 변환시킨다.
GLP-1 수용체 결합 검정법은 293HEK 막으로부터 단리된 클로닝된 인간 글루카곤-유사 펩티드 1 수용체 (hGLP-1R) (Graziano MP, Hey PJ, Borkowski D, Chicchi GG, Strader CD, Biochem Biophys Res Commun. 196(1): 141-6, 1993)를 이용한다. hGLP-1R cDNA를 발현 플라스미드 phD로 서크클로닝한다 (Trans-activated expression of fully gamma-carboxylated recombinant human protein C, an antithrombotic factor. Grinnell, B.W., Berg, D.T., Walls, J. and Yan, S.B. Bio/Technology 5: 1189-1192, 1987). 상기 플라스미드 DNA를 293HEK 세포 내로 형질감염시키고, 200 ㎍/mL 히그로마이신을 이용하여 선별한다.
현탁 배양물로부터의 세포를 사용하여 조 원형질막을 제조한다. 세포를 25 mM 트리스 HCl (pH 7.5), 1 mM MgCl2, DNAse1, 20 μ/mL, 및 EDTA 무함유 로슈 컴플리트™ 억제제를 함유하는 저장성 완충제 중 얼음 상에서 용해시킨다. 세포 현탁액을 25 스트로크를 위해 테플론® 막자를 사용하여 유리 다운스 균질기로 균질화시킨다. 균질액을 4℃에서 15분 동안 1800 x g로 원심분리한다. 상청액을 수집하고, 펠릿을 저장성 완충제 중에 재현탁시키고, 재균질화시킨다. 혼합물을 15분 동안 1800 x g로 원심분리한다. 제2 상청액을 제1 상청액과 조합한다. 조합된 상청액을 15분 동안 1800 x g로 원심분리하여 정화시킨다. 정화된 상청액을 고속 튜브로 옮기고, 4℃에서 30분 동안 25,000 x g로 원심분리한다. 막 펠릿을 균질화 완충제 중에 재현탁시키고, 사용시까지 냉동 분취물로서 -80℃ 냉동기에서 보관한다.
글루카곤-유사 펩티드 1 (GLP-1)을 I-125-락토퍼옥시다제 방법에 의해 아이오딘으로 방사성 표지하고, 퍼킨-엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈의 역상 HPLC (NEX308)에 의해 정제한다. 비활성은 2,200 Ci/mmol이다. I-125 GLP-1 물질 중의 높은 프로파놀 함량에 기인하여 포화 결합 대신 상동성 경쟁에 의해 KD 측정을 수행한다. KD는 0.329 nM인 것으로 추정되고, 이를 사용하여 시험된 모든 화합물에 대한 Ki 값을 계산한다.
앞서 1%의 지방산 무함유 BSA (기브코)로 차단된 소맥 배아 응집소 (WGA) 비드를 이용하여 섬광 근접 검정법 (SPA)을 사용함으로써 수용체 결합 검정법을 수행한다. 결합 완충제는 25 mM HEPES (pH 7.4), 2.5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1% 지방산 무함유 BSA, 0.003% 트윈20, 및 EDTA 무함유 로슈 컴플리트™ 억제제를 함유한다. 글루카곤-유사 펩티드 1을 1 mg/mL로 100% DMSO 중에 용해시키고, 30 ㎕ 분취량으로 -20℃에서 냉동 보관한다. 글루카곤-유사 펩티드 1 분취물을 희석시키고, 1시간 이내에 결합 검정법에서 사용한다. 펩티드를 유사체를 100% DMSO 중에 용해시키고, 100% DMSO 중에서 연속하여 희석시킨다. 이어서, 10 ㎕의 희석된 본 발명의 화합물 또는 100% DMSO를 40 ㎕ 검정 결합 완충제 또는 냉 글루카곤 (NSB, 최종 1 μM)를 함유하는 코닝® 3632 투명 바닥 검정용 플레이트로 옮긴다. 이어서, 90 ㎕의 막 (0.5 ㎍/웰), 50 ㎕ I-125 글루카곤-유사 펩티드 1 (반응에서 최종 0.15 nM), 및 50 ㎕의 WGA 비드 (150 ㎍/웰)를 첨가하고, 실링하고, 1분 동안 플레이트 진탕기 상에서 혼합한다. 실온에서 12시간의 침강 시간 후, 플레이트를 퍼킨 엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈 트리룩스(Trilux) 마이크로베타® 섬광 계수기로 판독한다.
결과를 화합물의 존재하에서 특이적인 I-125-글루카곤-유사 펩티드 1 결합의 백분율로서 계산한다. 첨가된 화합물 농도 대비 I-125-글루카곤-유사 펩티드 1의 특이적인 결합 비율(%)의 비선형 회귀에 의해 절대 IC50 농도를 도출해 낸다. 청-프루소프 방정식을 이용하여 IC50 농도를 Ki로 변환시킨다.
본질적으로 본 검정법에 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 본 발명의 특정 화합물은 대략 0.5-4.0의 hGLP-1R/hGIPR 비를 나타낸다(하기 표 1). 몰 결합비를 천연 GIP 및 GLP-1의 혼합물의 상응하는 몰비로 정규화한다. 상기 정규화 계수는 GIP (Ki=0.175 nM) 및 GLP-1 (Ki=0.793 nM)에 대한 결합 데이터에 기초하여 4.53이다. 1.48이라는 값이 실시예 1의 균형 잡힌 공효능제 활성을 입증한다.
<표 1>
수용체 결합 친화도, Ki, nM (SEM, n)
Figure pat00003
평균은 괄호 안에 명시된 평균의 표준 오차 (SEM) 및 반복수 (n)와 함께 기하 평균으로서 표시되어 있다. 수식어 (>)는 데이터가 50% 억제에 도달하지 못하였음을 나타내고, Ki는 본 검정법에서 시험된 최고 농도를 사용하여 계산된 것이다.
기능적 hGIP-R, hGLP-1R, 및 hGCGR 검정법.
본 발명의 화합물에 대한 인간 GIP, GLP-1, 및 글루카곤 수용체에 관한 시험관내 기능적 활성을 상기 수용체를 발현하는 HEK-293 클론성 세포주에서 측정한다. 각 수용체를 과다발현하는 세포주를 40 ㎕ 검정 부피 중 1X 글루타MAX(GlutaMAX)™ (기브코 카탈로그 번호 35050), 0.25% FBS, 0.05% 분획 V BSA, 250 μM IBMX 및 20 mM HEPES로 보충된 DMEM (기브코 카탈로그 번호 31053) 중 본 발명의 화합물로 처리한다. 실온에서의 60분 동안의 인큐베이션 후, 시스바이오 cAMP 다이나믹 2 HTRF 검정용 키트(CisBio cAMP Dynamic 2 HTRF Assay Kit) (미국 매사추세츠주 베드포드)를 사용하여 생성된 세포내 cAMP 증가를 정량적으로 측정한다. 간략하면, 세포 용해 완충제 (20 ㎕) 중 cAMP-d2 접합체를 첨가한 후, 또한 세포 용해 완충제 (20 ㎕) 중 항체 항-cAMP-Eu3+-크립테이트를 첨가하여 세포 내의 cAMP 수준을 검출한다. 생성된 경쟁 검정을 실온에서 적어도 60분 동안 인큐베이션시킨 후, 320 nm에서의 여기 및 665 nm 및 620 nm에서의 방출을 이용하여 퍼킨엘머 인비전(PerkinElmer Envision)® 장치를 사용함으로써 검출한다. 인비전 단위 (665 nm/620 nm*10,000에서의 방출)는 cAMP 존재량에 반비례하고, 이를 cAMP 표준 곡선을 이용하여 웰당 cAMP (nM)으로 변환시킨다. 각 웰의 cAMP 생성량 (nM)을 인간 GIP(1-42)NH2, 인간 GLP-1(7-36)NH2, 또는 인간 글루카곤 대조군 경우에 관찰되는 최대 반응에 대한 퍼센트로서 변환시킨다. 4-파라미터 로지스틱 방정식으로 피팅된 본 발명의 화합물의 농도 대비의 최대 반응률(%)을 이용하여 비-선형 회귀 분석에 의해 상대적인 EC50 값 및 최고 비율(%) (Emax)을 도출해 낸다.
본질적으로 본 검정법에 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 본 발명의 특정 화합물은 글루카곤 수용체에 대한 선택성 또한 입증함과 동시에, 인간 GIP 및 GLP-1 수용체에 대하여 활성을 입증한다. 하기 표 2에는 천연 hGIP(1-42)NH2, hGLP-1(7-36)NH2, 및 h글루카곤 대조군, 및 본 발명의 특정 화합물의, 수용체에 대한 기능적 효능이 제시되어 있다.
<표 2>
인간 GIP, GLP-1, 및 글루카곤 수용체에 대한 기능적 효능 (EC 50 )
Figure pat00004
EC50 평균은 괄호 안에 명시된 반복수 (n)와 함께 기하 평균 +/- 평균의 표준 오차 (SEM)로서 표시되어 있다. E-max 평균은 산술 평균 +/- 표준 오차로서 표시되어 있다. ND는 효능제 활성이 검출되지 않았음을 나타낸다. 수식어 (>)는 EC50이 측정될 수 없다는 것을 나타낸다. 제시된 값은 모두 세자리까지 유효 숫자이다.
인크레틴-분비 세포주에서 세포내 cAMP를 생성하는 hGIP-R 세포의 기능적 활성화
조절된 방식으로 프로글루카곤 유전자를 발현하고, 글루카곤-유사 펩티드를 분비하는 안정된 무한증식의 비교적 분화된 뮤린 장내분비 세포주인 GLUTag 세포에서 세포내 cAMP를 생성할 수 있는 화합물의 능력에 의해 본 발명의 화합물에 대한 hGIP-R의 기능적 활성을 입증한다. 세포를 37℃, 5% CO2, 95% 습도에서 5.5 mM 글루코스, 10% FBS, 및 2 mM 글루타민으로 보충된 DMEM 배지 중에서 유지시킨다. 검정하기 전, 세포를 트립신으로 처리하고, 펠릿화하고, 20,000개의 세포/웰인 밀도로 96-웰 조직 배양 검정용 플레이트에 시딩한다. 세포를 부착시키고, 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션시킨다. 검정 당일, 세포로부터 배지를 경사분리시키고, 다양한 농도의 화합물 (0.001 - 3 μM)을 함유하는 50 ㎕ EBSS 완충제 (0.1% BSA, 2 mM 글루코스 및 0.25 mM IBMX)를 세포에 첨가한다. 플레이트를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시키고, 시스바이오 다이나믹 2 cAMP HTRF 키트(Cisbio Dynamic 2 cAMP HTRF kit) (미국 매사추세츠주 베드포드)를 사용하여 cAMP 수준을 측정한다. 25 ㎕의 항-cAMP 크립테이트 및 25 ㎕ cAMP d2를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 테칸 게니오스 프로(Tecan Genios Pro) 상에서 620 nm 및 665 nm에서 플레이트를 판독한다. 665 nm/620 nm 비에 10,000을 곱하여 결과를 계산하고, cAMP 표준 곡선을 사용하여 웰당 cAMP (nM)로 변환시킨다. 4-파라미터 비-선형 로지스틱 알고리즘을 이용하여 그래프패드(GraphPad)로 데이터를 분석한다.
본질적으로 본 검정법에 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 본 발명의 특정 화합물은 GLUTag 세포의 용량-의존적인 증진된 cAMP 축적을 보인다 (하기 표 3). 천연 GLP-1 대조군은 시험된 모든 농도에서 cAMP의 어떤 변화도 유도하지 못했고, 이는 상기 세포 시스템이 오직 배타적으로 GIP 수용체만을 발현한다는 것을 시사하며; 따라서, 본 발명의 특정 화합물은 GIP 수용체를 통하여 효과를 발휘한다고 볼 수 있다.
<표 3>
GLUTag 세포에서의 EC50
Figure pat00005
인간 GLP-2 수용체를 일시적으로 발현하는 HEK293 세포에서의 세포내 cAMP 측정
HEK293 세포에서의 세포내 cAMP를 측정함으로써 본 발명의 화합물의 존재하에서의 hGLP-2R의 기능적 활성을 입증한다. 상기 세포를 완전 배지 중에서 계대접종하고, pcDNA3.1 발현 벡터 중 인간 전장의 GLP-2R cDNA 및 프로메가 퓨진6(Fugene6) 시약을 이용하여 현탁액 중에서 형질감염시키고, 습윤화된 37℃ 5% CO2 환경에서 조직 배양 플라스크에 부착시킨다. 대략 48시간 동안 증식시킨 후, 세포를 리프팅하고, 여과하고, 냉동보존제로서 10% DMSO를 사용하고, 냉동 속도를 조절하면서 냉동보존시킨다. 후속 검정에서, 검정간 변동을 최소화하기 위해 같은 세포 냉동고로부터의 단일 검정용 즉석 바이알을 해동시킨다. 세포 검정 당일, 냉동 배지를 0.5% FBS를 함유하는 인비트로겐 31053 DMEM으로 교체한다.
생존가능성에 대해 세포를 계수하고, 처리 전 대략 1 내지 2시간 동안 37℃에서 평형화시킨다. 본 발명의 화합물을 DMSO 중에 가용화시키고, 0.1% 분획 V BSA 및 비-특이적인 포스포디에스테라제 억제제, IBMX를 함유하는 DMEM 배지 중에서 즉시 희석시킨다. 처리 지속 기간은 37℃에서 30분이다. DMSO의 최종 농도는 1.1%를 초과하지 않고, IBMX 최종 농도는 250 μM이다. 균질한 시분해 형광 기술을 이용하는 다이나믹 2 검정법 (시스바이오 바이오어세이즈(Cisbio Bioassays: 미국 매사추세츠주 베드포드)을 사용하여 시클릭 AMP를 측정한다. 비 계산 방법 및 외부 표준으로부터 각 cAMP 농도를 추론한다. 4 파라미터 로지스틱 방정식을 사용하여 시험된 화합물의 S자형 용량 반응을 조사하고, 천연 C18-아실화된 리간드와 비교한다.
본질적으로 본 검정법에 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 수용체 활성화에 대한 C18-아실화된 인간 GLP-2 대조군의 EC50 값은 1.71 nM인 반면, 본 발명의 특정 화합물의 EC50 값은 대략 100x 내지 1,000x 더 높다. 본 발명의 특정 화합물에 대한 EC50 값이 GLP-2 수용체에 대한 선택성을 입증한다.
<표 4>
HEK293 세포에서의 GLP-2R 기능적 활성 측정
Figure pat00006
설치류 섬 인슐린 분비
생리학적 GLP-1R 및 GIP-R 발현 수준 인슐린 분비를 나타내는 시스템에서 본 발명의 화합물의 작용을 사정하기 위해 야생형 설치류 섬으로부터의 인슐린 분비에 미치는 효과에 대하여 화합물을 시험한다.
수컷 C57Bl/6 마우스 (22-26 g) 또는 수컷 스프래그 다우리(Sprague-Dawley) 래트 (대략 250 g)에서 총담관 캐뉼레이션을 수행한 후, 2% BSA 및 0.75 mg/ml 클자임(Clzyme) 콜라게나제 (비타사이트(VitaCyte))를 함유하는 행크스 완충제 (마우스의 경우, 3 ml, 또는 래트의 경우, 10 ml)를 사용하여 췌장을 팽창시킨다. 이어서, 조직을 행크스 완충제 중에서 37℃하에 11-13분 (마우스) 또는 14-16분 (래트 췌장) 동안 분해시킨다. 정제된 섬 (히스토파크(Histopaque)-1100 구배 [시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)], 750x 중력 가속도로 18 min)을 10% FBS, 100 U/ml 페니실린 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 함유하는 RPMI-1640 배지 (인비트로겐) 중에서 밤새도록 배양하고, 0.1% BSA 및 2.8 mM 글루코스로 보충된 얼스 평형 염 용액 (Earle's Balanced Salt Solution: EBSS) 중에서 고갈에 의해 미리 조절한다. 이어서, 섬을 화합물 수준을 증가시키면서 0.1% BSA, 2.8-11.2 mM 글루코스로 보충된 EBSS (인비트로겐) 중에서 인큐베이션시킨다 (4개의 섬/조건으로 이루어진 6개의 배치). GLP-1(7-36)아미드 (30 nM)를 양성 대조군으로서 사용한다. MSD 인슐린 검정법 (메조 스케일(Meso Scale: 미국 메릴랜드주 게이더스버그))를 이용하여 상청액 중 인슐린을 90분 동안에 걸쳐 측정한다.
본 발명의 특정 화합물은 하기 표 5에 제시된 바와 같이, 래트 및 마우스 섬, 둘 모두로부터의 인슐린 분비를 용량에 의존하는 방식으로 증가시킨다.
<표 5>
설치류 섬 인슐린 분비
Figure pat00007
면역원성 프로파일링
예컨대, 에피박스(Epivax) 인실리코 분석과 같은 인실리코 예측 프로그램을 사용하여 본 발명의 화합물에 대한 면역원성의 위험을 사정한다. 또한 본 발명의 화합물의 존재하에서 배양된 T 세포 반응 (3H-티미딘 흡수 및 IL-2 시토카인 분비)을 측정하는 생체외 방법에 의해 본 발명의 화합물에 대한 면역원성의 위험을 사정한다.
에피박스 면역-정보 도구를 이용하여, 본 발명의 화합물에 관한 인실리코 사정을 수행함으로써 투여 이후의 면역 반응을 예측한다. 본 분석은 9-mer 프레임이 주어진 인간 백혈구 항원 백혈구 항원 (HLA) 대립유전자에 결합할 확률, 및 이어서, 상기 에피-바(Epi-Bar)의 검출을 이용한다. 실시예 1의 경우, 대략 +1.13이라는 에피매트릭스(EpiMatrix) 점수는 에피매트릭스 점수가 +15.4인 천연 GIP 펩티드 백본과 비교하였을 때, 면역 반응을 유도할 수 있는 잠재능이 훨씬 더 낮다는 것을 시사한다. WO 2011/119657로부터의 GIP/GLP-1 공효능제 실시예의 점수는 +29.5이다.
전 세계 HLA 알로타입 집단을 나타내는 50명의 건강한 공여자로 이루어진 코호트에서 CD4+ T-세포 증식 및 IL-2 시토카인 분비의 특징 규명을 이용하여 본 발명의 화합물에 대하여 예측되는 임상적 면역원성에 대한 척도 또한 조사한다. 본 발명의 특정 화합물은 노출 이후 공지된 또는 양성 면역원성 화합물과 연관된 임계값을 초과하지 않는 정도의 T-세포 자극 및 IL-2 분비를 나타내며, 이는 임상적 면역원성을 일으킬 위험이 낮다는 것을 시사한다.
약동학적 성질
시노몰구스 원숭이(Cynomolgus Monkey)에서의 약동학적 성질
시노몰구스 원숭이를 사용하여 본 발명의 화합물에 대한 생체내 약동학적 특성을 입증한다. 화합물을 0.21 ml/kg의 부피로 20 mM 시트레이트 완충제 (pH 7.0) 중에서 단일 정맥내 또는 피하 용량 (0.2 mg/kg)에 의해 투여한다. 투여 후 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 204, 240, 및 312시간째에 각 동물로부터 혈액을 수집한다. LC/MS 방법에 의해 본 발명의 화합물의 혈장 농도를 측정한다. 간략하면, 1X PBS (150 ㎕)로 희석되고, N-부탄올 (400 ㎕)과 혼합된 100% 원숭이 혈장 샘플 (50 ㎕)로부터 본 발명의 화합물을 추출한다. 상층에 위치하는 화합물과 함께 3개의 상이한 액체 층이 형성된다. 200 ㎕ 부피를 v-바닥 96-웰 플레이트로 옮기고, 가열된 질소 가스를 이용하여 건조시키고, 100 ㎕의 30% 아세토니트릴/0.1% 포름산으로 재구성한다. 20 ㎕의 재구성된 샘플을 수펠코 애널리티컬 디스커버리(Supelco Analytical Discovery) 바이오 와이드 C5 3 ㎛ 칼럼 상에 주입한다. 검출 및 정량화를 위해 칼럼 용출액을 써모 Q-이그젝티브(Thermo Q-Exactive) 질량 분석계로 유도한다.
본질적으로 본 검정법에 대해 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 실시예 1은 피하 투약 후 대략 8시간 경과하였을 때, 평균 최대 혈장 농도에 도달하였다. 평균 반감기는 55시간이고, 평균 제거율은 0.73 mL/hr/kg이다. 생체이용률은 대략 83%이다. 본 데이터는 실시예 1의 경우, 주 1회 투약의 효능을 뒷받침한다. 본 발명의 다른 화합물에 대한 데이터는 하기 표 6에 요약되어 있다.
<표 6>
수컷 시노몰구스 원숭이에게 0.2 mg/kg 용량으로 단일 피하 투여한 이후의 평균 약동학적 파라미터
Figure pat00008
n = 2, AUC0-inf = 시점 0부터 무한대까지의 곡선하 면적, CL/F = 제거율/생체이용률, Tmax = 최대 농도까지의 소요 시간, Cmax = 최대 혈장 농도, T1/2 = 반감기.
용량 효능 추정
래트에서의 정맥내 글루코스 내성 시험 (ivGTT)을 사용하여 세마글루티드와의 비교로 본 발명의 화합물의 상대적인 효능을 추정한다. 래트에게 각 화합물을 0.1-10 nmol/kg의 용량으로 단일 피하 (SC) 투여하고, 투여 후 16시간째에 각 래트에 대하여 ivGTT를 수행한다. ivGTT 시점에 노출량을 측정하고, 노출 반응 모델링을 위하여 ivGTT에 대한 반응으로 인슐린 AUC를 1차 종점으로서 사용한다.
Emax 모델을 사용하여 실시예 1에 대한 노출 반응 프로파일을 세마글루티드와 비교한다. 본질적으로 본 검정법에 대해 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 약물 수준이 검정의 정량 한계를 초과한 용량 수준인 경우, 실시예 1 및 세마글루티드에 대한 노출량은 본질적으로 동일하다. 두 데이터 세트를 모두 동시에 피팅하고, 두 화합물 모두에 대하여 E0 및 Emax 값이 동일하도록 제한한다. 화합물에 대해 오직 ED50 값만을 별개로 피팅한다. 세마글루티드에 대한 ED50 값은 0.6 +/- 0.2 nmol/kg인 것으로 추정된다. 실시예 1에 대한 효능을 세마글루티드에 대비의 상대적인 효능으로서 추정하고, 이는 세마글루티드 효능의 1.7 +/- 0.6배이다. 원숭이에서의 두 분자 사이의 CL/F (겉보기 제거율) 차이 및 또한 분자량 차이에 대하여 조정한 바, 1 mg 세마글루티드 대비로 추정된 실시예 1에 대한 평균 인간 등가 용량은 대략 1.3 mg/주이다.
제2형 당뇨병
정맥내 글루코스 후의 래트 생체내 인슐린 분비 (IVGTT)
수컷 위스타(Wistar) 래트 (할런 랩스(Harlan Labs: 미국 인디애나주 인디애나폴리스))를 체중에 의해 무작위화하고, 글루코스를 투여하기 16시간 전에 1.5 ml/kg s.c. 투약 후, 금식시킨다. 용량은 비히클, 0.1, 0.3, 1, 3 및 10 nmol/kg이다. 동물의 체중을 측정한 후, 소듐 펜토바르비탈 (넴뷰탈 소듐(Nembutal Sodium) 용액; 오베이션 파마슈티칼즈(Ovation Pharmaceuticals))를 i.p. (65 mg/kg, 30 mg/ml) 투약하여 마취시킨다. 시점 0에 혈액 샘플을 EDTA 튜브로 수집한 후, 글루코스 (0.5 mg/kg, 5 ml/kg)를 투여한다. 혈액 샘플을 글루코스 후 2, 4, 6, 10, 20, 및 30분째에 수집한다. 히타치(Hitachi) 분석기 (로슈)를 사용하여 혈장 글루코스 수준을 측정하고, MSD 인슐린 검정법 (메조 스케일: 미국 메릴랜드주 게이더스버그))에 의해 혈장 인슐린을 측정한다.
하기 표 7에 제시된 바와 같이, 본 발명의 특정 화합물은 글루코스의 i.v. 주사 후, 용량에 의존하는 방식으로 인슐린 분비를 증진시킨다. 인슐린에 대한 ED50 및 최대 인슐린 분비 증가 (인슐린 곡선하 면적으로 측정)는 하기 표 7에 제시되어 있다.
<표 7>
래트 IVGTT 검정법에서 인슐린 분비 증진
Figure pat00009
식이 유도 비만 (DIO) 마우스에서의 체중 감소, 신체 조성 및 간 지방증에 미치는 효과
DIO 마우스에서의 본 발명의 화합물이 체중 감소, 신체 조성 및 간 지방증에 미치는 효과를 C57/BL6 DIO 마우스에서 평가한다. 상기 동물은 12주 동안의 고지방 (지방으로부터 60% Kcal) 식이 상태에 놓이게 되면 그 이후에, 비록 당뇨병은 아니지만, 인슐린 저항성, 이상지질혈증, 및 간 지방증을 보인다.
본 연구에서는 각 체중이 41-49 g이고, 초기 체지방량 범위가 10.5-17.5 g인, 23-24주령된 수컷 식이 유도 비만 (DIO) C57/Bl6 수컷 마우스를 사용한다. 12시간 명기/암기 사이클 (22:00에 점등)로 진행되고, 사료 및 물에 자유롭게 접근할 수 있는, 온도 제어식 (24℃) 시설에서 동물을 개별적으로 하우징한다. 2주 동안의 시설에의 순응기 후, 각 군의 출발 평균 체중이 유사하도록 마우스를 체중에 기초하여 처리군 (n=5/군)으로 무작위화한다.
15일 동안 매 3일에 한번씩 암주기 사이클 개시 30-90분 전에 비히클 대조군, 비히클 (20 mM 시트레이트 완충제 (pH 7.0))에 용해된 본 발명의 화합물 (용량 범위 10 내지 100 nmol/kg), 또는 장시간 작용하는 GLP1 유사체 세마글루티드 (30 nmol/kg)를 SC 주사에 의해 임의 섭식을 제공받은 DIO 마우스에게 투여한다. SC 주사는 1, 4, 7, 10, 및 13일째에 수행한다. 연구 진행 전 기간 동안에 걸쳐 매일 체중 및 사료 섭취량을 측정한다. 화합물 1차 주사 이전에 같은 동물의 체중을 감산함으로써 체중의 절대 변화량을 계산한다. 0일 및 14일째, 에코 메디컬 시스템(Echo Medical System: 미국 텍사스주 휴스턴) 장치를 이용하여 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 총 체지방량을 측정한다.
15일째, 아큐-첵(Accu-Chek) 혈당 측정기 (로슈)를 이용하여 꼬리 정맥혈로부터 혈당을 측정한 후, 동물을 희생시키고, 간을 제거하고, 냉동시킬 수 있다. 희생시에 수집된 간 균질액으로부터 간 트리글리세리드를 측정하고, 히타치 모듈라 P(Hitachi Modular P) 임상 분석기 상에서 혈장 콜레스테롤을 측정한다. 일원 ANOVA에 이어서, 던네트(Dunnett) 다중 비교 검정에 의해 군들 간의 통계학적 비교를 수행한다. 비-선형 피트 도구를 이용하여 그래프패드 프리즘으로 체중 감소 저하에 대한 ED50을 측정한다.
본질적으로 본 검정법에 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 본 발명의 특정 화합물은 용량에 의존하는 방식으로 체중 및 체지방량을 감소시켰고 (하기 표 8-13), 세마글루티드와 비교하였을 때, 체중을 감소시키는 데 있어서 3-5x 더 큰 효능이 있을 수 있다. 체중 감소율(%)에 있어서 실시예 1의 ED50은 5.422 nmol/kg (95% 신뢰 구간 수준 [nmol/kg] = 2.2 내지 13.6)이다. 체중 감소는 주로 체지방량 감소에 기인하는 것으로 나타난다.
<표 8>
DIO 마우스에서의 체중 또는 체지방량 변화율(%)
Figure pat00010
대조군으로부터의 **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 (일원 ANOVA, 던네트). 본 결과는 각 군당 마우스 5마리에 대한 평균 ± SEM으로서 표시된 것이다.
<표 9>
DIO 마우스에서의 체중 또는 체지방량 변화율(%)
Figure pat00011
**** 대조군으로부터 p<0.0001 (일원 ANOVA, 던네트). 본 결과는 각 군당 마우스 5마리에 대한 평균 ± SEM으로서 표시된 것이다.
<표 10>
DIO 마우스에서의 체중 또는 체지방량 변화율(%)
Figure pat00012
**** 대조군으로부터의 p<0.001 (일원 ANOVA, 던네트). 본 결과는 각 군당 마우스 5마리에 대한 평균 ± SEM으로서 표시된 것이다.
<표 11>
DIO 마우스에서의 혈당, 혈장 콜레스테롤 및 혈장 트리글리세리드
Figure pat00013
대조군으로부터 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 (일원 ANOVA, 던네트). 본 결과는 각 군당 마우스 5마리에 대한 평균 ± SEM으로서 표시된 것이다.
<표 12>
DIO 마우스에서의 혈당, 혈장 콜레스테롤 및 간 트리글리세리드
Figure pat00014
대조군으로부터 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 (일원 ANOVA, 던네트). 본 결과는 각 군당 마우스 5마리에 대한 평균 ± SEM으로서 표시된 것이다.
<표 13>
DIO 마우스에서의 혈당 및 혈장 콜레스테롤
Figure pat00015
대조군으로부터 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001 (일원 ANOVA, 던네트). 본 결과는 각 군당 마우스 5마리에 대한 평균 ± SEM으로서 표시된 것이다.
DIO 마우스에서 에너지 대사에 미치는 효과
본 발명의 화합물이 DIO 마우스에서의 에너지 대사에 미치는 효과를 43-50 g인, 26주령된 C57/Bl6 DIO 수컷 마우스에서 평가한다. 12시간 명기/암기 사이클 (22:00에 점등)로 진행되고, 사료 TD95217 (테크래드(Teklad)) 및 물에 자유롭게 접근할 수 있는, 온도 제어식 (24℃) 시설에서 마우스를 개별적으로 하우징한다. 2주 동안의 시설에의 순응기 후, 각 군의 출발 평균 체중이 유사하도록 마우스를 체중에 기초하여 처리군 (n=6/군)으로 무작위화한다. 동물을 3일의 순응기 동안 페노마스터(PhenoMaster)/랩마스터(LabMaster) 열량계 (TSE 시스템즈(TSE Systems: 미국 미주리주 체스터필드))에 배치한다. 22일 동안 매 3일에 한번씩 암주기 사이클 개시 30-90분 전에 비히클 대조군 (20 mM 시트레이트 완충제 (pH 7.0), 10 ml/kg), 본 발명의 화합물, 또는 장시간 작용하는 GLP1 유사체인 세마글루티드 (30 nmol/kg)를 임의 섭식을 제공받은 DIO 마우스에게 피하로 투여한다. 개방 회로 열량 측정 시스템을 사용하여 기술된 바와 같이 간접 열량 측정법에 의해 열 및 호흡률 (RER)을 측정한다. RER은 발생된 CO2 부피 (Vco2) 대 소비된 O2 부피 (Vo2)의 비이다. 열은 전체 체중을 고려하여 계산된다:
VO2=　 유량ML*(V1+V2)/N2Ref*동물 체중*100)
VCO2= 유량ML*dCO2/동물 체중*100)
열=　(CVO2*VO2+CVCO2*VCO2)/1000;
여기서, CVO2=3.941; CVCO2=1.106이다.
본질적으로 본 검정법에 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 대조군과 비교하였을 때, 실시예 1로 처리된 마우스는 2주째를 시작으로, 그의 대사율을 유의적으로 10 내지 15% 증가시켰고, 처리 기간 내내 상기 효과를 지속시켰다. 그러나, 세마글루티드는 대사율에는 어떤 영향도 미치지 않았다. 실시예 1에서의 대사율 증가는 부분적으로는 세마글루티드 처리와 비교하였을 때 실시예 1 처리에서 관찰된 추가의 체중 감소가 원인이 된다.
DIO 마우스에서의 위 배출에 미치는 효과
본 발명의 화합물이 DIO 마우스에서의 위 배출에 미치는 효과를 23주령된 식이 유도 비만 (DIO) 수컷 마우스 (할런)에서 평가한다. 마우스를 16-17시간 동안 금식시킨다. 금식기를 시작하는 동안, 비히클 대조군 (20 mM 시트레이트 완충제 (pH 7.0)); 점증 용량의 본 발명의 화합물 (3, 10, 30 및 100 nmol/kg), 또는 장시간 작용하는 GLP1 유사체인 세마글루티드 (30 nmol/kg)를 마우스에 피하로 투약한다. 다음날, 새로 제조된 반액체 식이 0.5 ml (0.5 그램)를 (2분 간격을 두고) 경구적 위관영양에 의해 마우스에 투여한다. 이 시점에는 투여되는 식이가 희석되는 것을 막기 위해 물은 제거한다. 식이 투여 후 2시간이 경과하였을 때, 2분 간격을 두고 CO2 가스에 의해 마우스를 안락사시킨다. 분문구 및 유문구, 둘 모두에서 클램핑하면서 위를 떼어낸 후, 클램프를 제거하고, 중량 보트에서 위 전체의 중량을 측정한다. 이어서, 위를 절개하고, 내용물을 제거한다. 위를 세척하고, 건조시키고, 중량을 다시 측정하여 위 내의 사료 함량을 사정한다. 위 배출률(%)은 100 x (1 - (위 내에 남아있는 사료량/경구적으로 투여된 사료량))과 같다.
본질적으로 본 검정법에 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 실시예 1은 용량에 의존하는 방식으로 반액체 식이의 위 배출률을 저속화시켰다. 10 nmol/kg +/- 용량으로 투약하였을 때 위 배출이 최대로 억제된 것이 관찰되었다 (하기 표 14).
<표 14>
마른 C57/BL6 DIO 마우스에서의 반액체 식이의 위 배출
Figure pat00016
일원 ANOVA에 이어서, 던네트 다중 비교 검정에 의해 군들 간의 통계학적 비교를 수행한다. 대조군으로부터의 *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. 본 결과는 각 군당 마우스 4-5마리에 대한 평균 ± SEM으로서 표시된 것이다.
스프래그 다우리 래트에서의 혈장 코르티코스테론 측정
특정의 공개된 연구에서 제안된 바와 같이, 혈장 코르티코스테론 수준 상승은 가능하게는 GIP 및 GLP-1 유사체에 대한 내약성이 감소되었음을 나타내는 지표가 된다. 체중이 대략 220 g이고, 처리 전 적어도 72시간 동안 순응시킨 스프래그 다우리 래트 (할런: 미국 인디애나폴리스)를 사용하여 혈장 코르티코스테론 수준을 평가한다. 이어서, 투약군당 래트 8마리씩으로 래트에 비히클 (20 mM 시트레이트 완충제 (pH 7)), 세마글루티드 (10 nmol/kg), 또는 본 발명의 화합물 (3, 10 또는 30 nmol/kg)을 s.c.로 투약한다. 16시간 경과 후, 래트를 참수시킨다. 얼음 상에서 EDTA 튜브로 혈액을 수집한 후, 에펜도르프(Eppendorf) 5402 테이블톱 원심분리기에서 8000 RPM으로 5분 동안 원심분리시킨다. 혈장을 분석시까지 -80℃에서 보관한다.
코르티코스테론 분석을 위해, HPLC-등급의 메탄올, H2O 중에서 연속 희석하고, 5% 목탄 제거 래트 혈청 (바이오레클러메이션(Bioreclamation), RATSRM-STRPD-HEV)을 첨가함으로써 코르티코스테론 표준 (시그마, 27840)을 제조한다. 래트 혈장 샘플을 PBS로 희석시키고, 냉 메탄올로 침전시키고, -20℃에서 20분 동안 인큐베이션시킨 후, 4℃에서 에펜도르프 5417R을 이용하여 14,000 RPM으로 원심분리시킨다. 상청액을 추출하고, N2 가스 기류하에 증발시키고, MeOH/H2O (1:1) 용액 중에서 재구성한다. X셀렉트(XSelect) CSH C18 3.5 ㎛ HPLC 칼럼 (2.1 mm x 30 mm) (워터스(Waters) #186005254)이 장착된 LC/MS 상에서 샘플을 분석한다.
본질적으로 본 검정법에 대해 기술된 바와 같이 수행된 연구에서, 실시예 1은 시험된 어느 용량에서도 혈장 코르티코스테론 수준 증가를 보이지 않은 반면, 세마글루티드는 대조군에 비하여 대략 4x 정도의 증가를 나타내었다.
<표 15>
스프래그 다우리 래트에서의 혈장 코르티코스테론 분석
Figure pat00017
아미노산 서열
서열식별번호: 1 (인간 GIP)
YAEGTFISDYSIAMDKIHQQDFVNWLLAQKGKKNDWKHNITQ
서열식별번호: 2 (인간 GLP-1)
HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR
서열식별번호: 3
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 4
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 5
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 6
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 7
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAFVQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 8
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 9
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)2-CO-(CH2)16-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 10
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)1-CO-(CH2)18-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고; X3은 1-Nal이고; C-말단 아미노산은 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
서열식별번호: 11
YX1EGTFTSDYSIX2LDKIAQKAX3VQWLIAGGPSSGAPPPS
상기 식에서, X1은 Aib이고; X2는 Aib이고; 20번 위치의 K는 ([2-(2-아미노-에톡시)-에톡시]-아세틸)2-(γGlu)a-CO-(CH2)b-CO2H로 K 측쇄의 엡실론-아미노 기에의 접합을 통해 화학적으로 변형되고, 여기서, a는 1 내지 2이고, b는 10 내지 20이고; X3은 Phe 또는 1-Nal;이고; C-말단 아미노산은 임의적으로 C-말단 1급 아미드로서 아미드화된다.
SEQUENCE LISTING <110> Eli Lilly and Company <120> GIP AND GLP-1 CO-AGONIST COMPOUNDS <130> X20448 <150> 62/101488 <151> 2015-01-09 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys 1 5 10 15 Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys 20 25 30 Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln 35 40 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly 1 5 10 15 Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg 20 25 30 <210> 3 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys at position 20 is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the K side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)1-CO-(CH2)18-CO2 H <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 3 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ile Ala Gln Lys Ala Phe Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 4 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys at position 20 is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the K side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)2-CO-(CH2)18-CO2 H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is 1-Nal <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 4 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ile Ala Gln Lys Ala Xaa Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 5 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Aib 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the epsilon-amino group of the K side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)2-CO-(CH2)18-CO2 H <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 7 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ile Ala Gln Lys Ala Phe Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 8 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys at position 20 is chemically modified through conjugation to the epsilon-amino group of the K side-chain with 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K side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)2-CO-(CH2)16-CO2 H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is 1-Nal <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at position 39 is amidated as a C-terminal primary amide <400> 9 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ile Ala Gln Lys Ala Xaa Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35 <210> 10 <211> 39 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> Xaa at position 2 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Aib <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> Xaa at position 13 is nonnaturally occurring amino acid 2-Aminoisobutyric Acid <220> <221> MOD_RES <222> (13)..(13) <223> Aib <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Lys at position 20 is chemically modified through conjugation to the 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through conjugation to the epsilon-amino group of the K side-chain with ([2-(2-Amino-ethoxy)-ethoxy]-acetyl)2-(gamma-Glu)a-CO-(CH2)b-CO2H wherein a is 1 to 2 and b is 10 to 20 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (22)..(22) <223> Xaa at position 22 is either Phe or 1-Nal <220> <221> MOD_RES <222> (39)..(39) <223> Ser at position 39 is optionally amidated as a C-terminal primary amide <400> 11 Tyr Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Ile Xaa Leu Asp Lys 1 5 10 15 Ile Ala Gln Lys Ala Xaa Val Gln Trp Leu Ile Ala Gly Gly Pro Ser 20 25 30 Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser 35

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  1. 인간을 치료하는 방법.
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