TW202302624A - 含內醯胺橋的多肽化合物 - Google Patents
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Abstract
一類含內醯胺橋的多肽化合物，及其在製備治療相關病症的藥物中的應用，具體公開了式（I）所示序列的多肽。
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSG
0（I）
Description
本發明涉及一類含內醯胺橋的多肽化合物，及其在製備治療相關病症的藥物中的應用，具體涉及式（I）所示序列的多肽。
中國預估有1.1億糖尿病患者，占全世界糖尿病患者的24%。隨著經濟發展與生活方式的改變，中國糖尿病患病率增加至12.8%（部分省市高達19.9%），這些患者通常並伴有肥胖或心血管疾病（CVD）。
GLP-1在胰島中發揮保護胰島β細胞的作用，以葡萄糖依賴的方式刺激胰島β細胞釋放胰島素，有效控制餐後血糖的作用。因其獨特的作用機制，低血糖風險大降低。雖然GLP-1R激動劑在臨床中展現了優秀的降糖效果，但還是有很多二型糖尿病人未達到降糖及減重目標。因此，將GLP-1R激動劑與其它降糖靶點結合如GIP及GCG是一個迫切且有前景的需求。
GIP是由小腸的神經內分泌K細胞分泌的多肽。由GIPR介導其生理作用，主要為非葡萄糖依賴的促胰島素分泌、增強胰高血糖素分泌、增強脂質代謝等。雖然GIPR激動劑的有益作用似乎在2型糖尿病患者的高血糖症狀中減弱，但研究表明，GIP減弱的促胰島素分泌作用可以在血漿葡萄糖水平恢復正常一段時間後完全恢復。
胰高血糖素(GCG)是由胰腺分泌的，與胰高血糖素受體（GCGR）結合產生生理功能的激素。胰高血糖素通過增加糖異生及糖原分解的方式促進血糖的升高。另外，GCG還可以減少肝臟脂肪組織中的脂肪酸合成，促進脂肪的分解。藥物中引入GCG激動活性能夠更有利於患者在降糖基礎上進一步控制體重。因此，GLP-1/GIP/GCG三重激動劑對於治療糖尿病，肥胖及相關疾病將具有協同作用。
本申請主張如下優先權：
CN202110680696.7，申請日：2021年06月18日；
CN202210138364.0，申請日：2022年02月15日；
CN202210626502.X，申請日：2022年06月02日。
本發明提供了式（I）所示序列的多肽（SEQ ID NO: 7），
YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSG
0（I）
其具有以下修飾：
1）上述第17位或第24位的胺基酸有且只有一個被替換為K
0；且
2）上述式（I）所示序列的0-2個天然胺基酸被替換；且
3）第17和第20位置的胺基酸之間或第20和第24位置的胺基酸之間形成內醯胺橋；
其中，
Aib的結構為
；
G
0選自
和
；
K
0表示離胺酸，且該離胺酸側鏈上的胺基與-X
0相連；
X
0選自
；
p為1、2或3；
s為1或2；
t為8、9或10。
在本發明的一些方案中，上述的多肽，其具有如下序列SEQ ID NO: 1-6，
SEQ ID NO: 1：YAibEGT FTSDY SIAibLD KK
0AQK AFVEW LIAGG PSSG-NH
2；
SEQ ID NO: 2：YAibEGT FTSDY SIAibLD KK
0AQK EFVEW LIAGG PSSG-NH
2；
SEQ ID NO: 3：YAibEGT FTSDY SIAibLD KK
0AQK AFIEW LIAGG PSSG-NH
2；
SEQ ID NO: 4：YAibEGT FTSDY SIAibLD KEAQK AFVK
0W LIAGG PSSG-NH
2；
SEQ ID NO: 5：YAibEGT FTSDY SIAibLD KEAQK EFVK
0W LIAGG PSSG-NH
2；
SEQ ID NO: 6：YAibEGT FTSDY SIAibLD KEAQK AFIK
0W LIAGG PSSG-NH
2；
其中，
第17和20位置的胺基酸之間或第20和24位置的的胺基酸之間形成內醯胺橋；
Aib和K
0如本發明定義，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述p為2，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述s為1，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述t為9，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述-X
0選自
，其他變量如本發明所定義。
在本發明的一些方案中，上述-X
0選自
，其他變量如本發明所定義。
本發明還有一些方案由上述變量任意組合而來。
本發明還提供了下式所示多肽，
。
本發明還提供了下式所示多肽，
。
本發明還提供了上述藥物組合物，包括作為活性成分的治療有效量根據上述的多肽化合物或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的載體。
在本發明的一些方案中，上述多肽化合物或其藥學上可接受的鹽或者上述的組合物在製備治療糖尿病的藥物上的應用。
技術效果
本發明化合物對GLP-1R/GIPR/GCGR具有很強的激動活性。
定義和說明
除非另有說明，本文所用的下列術語和短語旨在具有下列含義。一個特定的術語或短語在沒有特別定義的情況下不應該被認為是不確定的或不清楚的，而應該按照普通的含義去理解。當本文中出現商品名時，意在指代其對應的商品或其活性成分。
這裡所採用的術語「藥學上可接受的」，是針對那些化合物、材料、組合物和/或劑型而言，它們在可靠的醫學判斷的範圍之內，適用於與人類和動物的組織接觸使用，而沒有過多的毒性、刺激性、過敏性反應或其它問題或併發症，與合理的利益/風險比相稱。
術語「藥學上可接受的鹽」是指本發明化合物的鹽，由本發明發現的具有特定取代基的化合物與相對無毒的酸或鹼製備。當本發明的化合物中含有相對酸性的功能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的鹼與這類化合物接觸的方式獲得鹼加成鹽。藥學上可接受的鹼加成鹽包括鈉、鉀、鈣、銨、有機胺或鎂鹽或類似的鹽。當本發明的化合物中含有相對鹼性的官能團時，可以通過在純的溶液或合適的惰性溶劑中用足夠量的酸與這類化合物接觸的方式獲得酸加成鹽。藥學上可接受的酸加成鹽的實例包括無機酸鹽，所述無機酸包括例如鹽酸、氫溴酸、硝酸、碳酸，碳酸氫根，磷酸、磷酸一氫根、磷酸二氫根 、硫酸、硫酸氫根、氫碘酸、亞磷酸等；以及有機酸鹽，所述有機酸包括如乙酸、丙酸、異丁酸、馬來酸、丙二酸、苯甲酸、琥珀酸、辛二酸、反丁烯二酸、乳酸、扁桃酸、鄰苯二甲酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、檸檬酸、酒石酸和甲磺酸等類似的酸；還包括胺基酸（如精胺酸等）的鹽，以及如葡糖醛酸等有機酸的鹽。本發明的某些特定的化合物含有鹼性和酸性的官能團，從而可以被轉換成任一鹼或酸加成鹽。
本發明的藥學上可接受的鹽可由含有酸根或鹼基的母體化合物通過常規化學方法合成。一般情況下，這樣的鹽的製備方法是：在水或有機溶劑或兩者的混合物中，經由游離酸或鹼形式的這些化合物與化學計量的適當的鹼或酸反應來製備。
「胺基酸」是指天然存在的和合成的胺基酸，以及起到與天然存在的胺基酸類似的作用的胺基酸類似物和胺基酸模擬物。天然存在的胺基酸是由遺傳密碼編碼的那些胺基酸，以及後來修飾的那些胺基酸，例如，羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸和O-磷酸絲胺酸。胺基酸類似物是指具有與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構(例如與氫、羧基基團、胺基基團和R基團結合的α碳)的化合物，例如高絲胺酸、正白胺酸、甲硫胺酸亞碸、甲硫胺酸甲基鋶。這樣的類似物可以具有修飾的R基團(例如，正白胺酸)或修飾的肽骨架，但保留與天然存在的胺基酸相同的基本化學結構。胺基酸模擬物是指其結構不同於一般的胺基酸化學結構，但起到與天然存在的胺基酸相似的作用的化學化合物。
本文所述的A或Ala表示丙胺酸，結構為
；R或Arg表示精胺酸，結構為
；N或Asn表示天冬醯胺酸，結構為
；D或Asp表示天冬胺酸，結構為
；C或Cys表示半胱胺酸，結構為
；Q或Gln表示麩胺醯胺酸，結構為
；E或Glu表示麩胺酸，結構為
；G或Gly表示甘胺酸，結構為
；H或His表示組胺酸，結構為
；I或Ile表示異白胺酸，結構為
；L或Leu表示白胺酸，結構為
；K或Lys表示離胺酸，結構為
；M或Met表示甲硫胺酸，結構為
；F或Phe表示苯丙胺酸，結構為
；P或Pro表示脯胺酸，結構為
；S或Ser表示絲胺酸，結構為
；T或Thr表示蘇胺酸，結構為
；W或Trp表示色胺酸，結構為
；Y或Tyr表示酪胺酸，結構為
；V或Val表示纈胺酸，結構為
；Fmoc-AEEA-OH表示
。
術語「治療」包括抑制、減緩、停止或逆轉現有症狀或病患的進展或嚴重程度。
除非另有說明，術語「異構體」意在包括幾何異構體、順反異構體、立體異構體、對映異構體、旋光異構體、非對映異構體和互變異構體。
本發明的化合物可以存在特定的幾何或立體異構體形式。本發明設想所有的這類化合物，包括順式和反式異構體、(-)-和(+)-對映體、(
R)-和(
S)-對映體、非對映異構體、(
D)-異構體、(
L)-異構體，及其外消旋混合物和其他混合物，例如對映異構體或非對映體富集的混合物，所有這些混合物都屬於本發明的範圍之內。烷基等取代基中可存在另外的不對稱碳原子。所有這些異構體以及它們的混合物，均包括在本發明的範圍之內。
除非另有說明，術語「對映異構體」或者「旋光異構體」是指互為鏡像關係的立體異構體。
除非另有說明，術語「順反異構體」或者「幾何異構體」系由因雙鍵或者成環碳原子單鍵不能自由旋轉而引起。
除非另有說明，術語「非對映異構體」是指分子具有兩個或多個手性中心，並且分子間為非鏡像的關係的立體異構體。
除非另有說明，“(+)”表示右旋，“(-)”表示左旋，“(±)”表示外消旋。
除非另有說明，用楔形實線鍵（
）和楔形虛線鍵（
）表示一個立體中心的絕對構型，用直形實線鍵（
）和直形虛線鍵（
）表示立體中心的相對構型，用波浪線（
）表示楔形實線鍵（
）或楔形虛線鍵（
），或用波浪線（
）表示直形實線鍵（
）或直形虛線鍵（
）。
除非另有說明，術語「富含一種異構體」、「異構體富集」、「富含一種對映體」或者「對映體富集」指其中一種異構體或對映體的含量小於100%，並且，該異構體或對映體的含量大於等於60%，或者大於等於70%，或者大於等於80%，或者大於等於90%，或者大於等於95%，或者大於等於96%，或者大於等於97%，或者大於等於98%，或者大於等於99%，或者大於等於99.5%，或者大於等於99.6%，或者大於等於99.7%，或者大於等於99.8%，或者大於等於99.9%。
除非另有說明，術語「異構體過量」或「對映體過量」指兩種異構體或兩種對映體相對百分數之間的差值。例如，其中一種異構體或對映體的含量為90%，另一種異構體或對映體的含量為10%，則異構體或對映體過量（ee值）為80%。
可以通過的手性合成或手性試劑或者其他常規技術製備光學活性的(
R)-和(
S)-異構體以及
D和
L異構體。如果想得到本發明某化合物的一種對映體，可以通過不對稱合成或者具有手性助劑的衍生作用來製備，其中將所得非對映體混合物分離，並且輔助基團裂開以提供純的所需對映異構體。或者，當分子中含有鹼性官能團（如胺基）或酸性官能團（如羧基）時，與適當的光學活性的酸或鹼形成非對映異構體的鹽，然後通過本領域所公知的常規方法進行非對映異構體拆分，然後回收得到純的對映體。此外，對映異構體和非對映異構體的分離通常是通過使用色譜法完成的，所述色譜法採用手性固定相，並任選地與化學衍生法相結合（例如由胺生成胺基甲酸鹽）。
本發明的化合物可以在一個或多個構成該化合物的原子上包含非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素標記化合物，比如氚（
3H），碘-125（
125I）或C-14（
14C）。又例如，可用重氫取代氫形成氘代藥物，氘與碳構成的鍵比普通氫與碳構成的鍵更堅固，相比於未氘化藥物，氘代藥物有降低毒副作用、增加藥物穩定性、增強療效、延長藥物生物半衰期等優勢。本發明的化合物的所有同位素組成的變換，無論放射性與否，都包括在本發明的範圍之內。
當所列舉的連接基團沒有指明其連接方向，其連接方向是任意的，例如，
中連接基團L為-M-W-，此時-M-W-既可以按與從左往右的讀取順序相同的方向連接環A和環B構成
，也可以按照與從左往右的讀取順序相反的方向連接環A和環B構成
。所述連接基團、取代基和/或其變體的組合只有在這樣的組合會產生穩定的化合物的情況下才是被允許的。
除非另有規定，當某一基團具有一個或多個可連接位點時，該基團的任意一個或多個位點可以通過化學鍵與其他基團相連。當該化學鍵的連接方式是不定位的，且可連接位點存在H原子時，則連接化學鍵時，該位點的H原子的個數會隨所連接化學鍵的個數而對應減少變成相應價數的基團。所述位點與其他基團連接的化學鍵可以用直形實線鍵（
）、直形虛線鍵（
）、或波浪線（
）表示。例如-OCH
3中的直形實線鍵表示通過該基團中的氧原子與其他基團相連；
中的直形虛線鍵表示通過該基團中的氮原子的兩端與其他基團相連；
中的波浪線表示通過該苯基基團中的1和2位碳原子與其他基團相連。
本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的常規方法來確認結構，如果本發明涉及化合物的絕對構型，則該絕對構型可以通過本領域常規技術手段予以確證。例如單晶X射線繞射法（SXRD），把培養出的單晶用Bruker D8 venture繞射儀收集繞射強度數據，光源為CuKα輻射，掃描方式：φ/ω掃描，收集相關數據後，進一步採用直接法(Shelxs97)解析晶體結構，便可以確證絕對構型。
本發明的化合物可以通過本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的多種合成方法來製備，包括下面列舉的具體實施方式、其與其他化學合成方法的結合所形成的實施方式以及本發明所屬技術領域具有通常知識者所熟知的等同替換方式，優選的實施方式包括但不限於本發明的實施例。
本發明所使用的溶劑可經市售獲得。
本發明採用下述縮略詞：aq代表水；eq代表當量、等量；DCM代表二氯甲烷；PE代表石油醚；DMSO代表二甲亞碸；MeOH代表甲醇；BOC代表三級丁氧羰基是一種胺保護基團；r.t.代表室溫；O/N代表過夜；THF代表四氫呋喃；Boc
2O代表二三級丁基二碳酸酯；TFA代表三氟乙酸；DIEA代表二異丙基乙基胺；DMF代表
N,N-二甲基甲醯胺；HBTU代表苯並三氮唑-
N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯；HOBT代表1-羥基苯並三唑；DIC代表
N,N'-二異丙基碳二亞胺；PhSiH
3代表苯矽烷；Pd(PPh
3)
4代表四三苯基膦鈀。
下面通過實施例對本發明進行詳細描述，但並不意味著對本發明任何不利限制。本文已經詳細地描述了本發明，其中也公開了其具體實施例方式，對本發明所屬技術領域具有通常知識者而言，在不脫離本發明精神和範圍的情況下針對本發明具體實施方式進行各種變化和改進將是顯而易見的。
實施例1
1.秤取1.10 g Rink Amide MBHA Resin(替代度Sub=0.28 mmol/g)，加入到反應柱中，再加入DMF(20.0 mL)至反應柱氮氣鼓氣體2h，排廢，直至沒有液體流出，加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
2.加入20%的哌啶/DMF(20.0 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
3.胺基酸的偶聯
3.1 Fmoc-Gly-OH的偶聯
1. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
2. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.2 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.3 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.4 Fmoc-Pro-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Pro-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.5 Fmoc-Gly-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，四氯苯醌檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.6 Fmoc-Gly-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.7 Fmoc-Ala-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入HOBT(3.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入DIC(3.00 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應過夜，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.8 Fmoc-Ile-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Ile-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.9 Fmoc-Leu-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Leu-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.10 Fmoc-Trp(Boc)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。四氯苯醌檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Trp(Boc)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.11 Fmoc-Glu(OAll)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Glu(OAll)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.12 Fmoc-Val-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Val-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.13 Fmoc-Phe-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Phe-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.14 Fmoc-Ala-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.15 Fmoc-Lys(Alloc)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Lys(Alloc)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.16 Fmoc-Gln(Trt)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Gln(Trt)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.17 Fmoc-Ala-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Ala-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.18 Fmoc-Lys(Dde)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Lys(Dde)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.19 Fmoc-Lys(Boc)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Lys(Boc)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.20 Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸和HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.21 Fmoc-Leu-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Leu-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.22 Fmoc-Aib-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Aib-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.23 Fmoc-Ile-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Lys(Dde)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.24 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.25 Fmoc-Tyr(tBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.26 Fmoc-Asp(OtBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Asp(OtBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.27 Fmoc-Ser(tBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Ser(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HBTU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應2 h，茚三酮檢測，樹脂藍色。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.28 Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Thr(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸後溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.29 Fmoc-Phe-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Phe-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.30 Fmoc-Thr(tBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Thr(tBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.31 Fmoc-Gly-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Gly-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.32 Fmoc-Glu(OtBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入HOAT(3.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入DIC(3.00 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應過夜，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1min，排廢，直至沒有液體流出。
3.33 Fmoc-Aib-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Aib-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.34 Boc-Tyr(tBu)-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Boc-Tyr(tBu)-OH(6.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(12.0 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(5.70 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.35 脫Alloc和OAll
1. 加入PhSiH
3(20.0 eq)和DCM(10 mL)至反應柱中，氮氣鼓起後加入Pd(PPh
3)
4(0.2 eq)，氮氣鼓起20 min，反應二次，排廢，直至沒有液體流出。
2. 用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.36 醯胺關環
1. 加入DIEA(3.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待溶解後加入HATU(1.5 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
2. 在25℃的環境中反應0.5 h,用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3. 重複上述1和2操作，再關環一次。茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.37脫Dde
1. 加入3%的水合肼/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
3.38 Fmoc-AEEA-OH的偶聯
1. 秤取Fmoc-AEEA-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
2. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
3. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.39 Fmoc-AEEA-OH的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-AEEA-OH(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.40 Fmoc-Glu-OtBu的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取Fmoc-Glu-OtBu(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
3.41 C20DA的偶聯
1. 加入20%的哌啶/DMF(50 mL)至反應柱中，氮氣鼓起20 min，排廢，直至沒有液體流出。加入DMF(50 mL)洗滌5次,每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。茚三酮檢測，樹脂藍色。
2. 秤取C20DA(3.0 eq)加入到上述樹脂中，加入DIEA(6.00 eq)補加10 mL DMF至反應柱中，鼓氮氣，待胺基酸溶解後加入HATU(2.85 eq)。調節好氮氣使樹脂均勻鼓起。
3. 在25℃的環境中反應0.5 h，茚三酮檢測，樹脂無色透明。
4. 抽掉反應液，用DMF洗滌5次(50 mL每次)，每次1 min，排廢，直至沒有液體流出。
5. 用MeOH(50 mL)收縮樹脂，每次3 min，排廢，直至沒有液體流出，將樹脂倒出乾燥，備用。
4.切割及粗肽乾燥
4.1．按如下體積配置切割液
將乾燥後的肽樹脂加入到配好的切割液中，在搖床震盪2.5 h，過濾，濾液加入到10倍體積冰異丙醚中，離心，再用異丙醚洗滌3次。在真空乾燥2 h得到粗肽，純化。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值為4361.9，檢測值為4362.0。
| 試劑 | 比例% |
| TFA | 91 |
| Tis | 3 |
| H 2O | 3 |
| Mpr | 3 |
實施例2
參考001的合成，在3.14步驟中將Fmoc-Ala-OH更換為Fmoc-Glu(OtBu)-OH得到002。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值為4420.0，檢測值為4419.3。
實施例3
參考001的合成，在3.12步驟中將Fmoc-Val-OH更換為Fmoc-Ile-OH得到003。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值為4420.0，檢測值為4419.3。
實施例4
參考001的合成，得到004。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值為4361.9，檢測值為4361.7。
實施例5
參考001的合成，得到005。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值為4420.0，檢測值為4419.3。
實施例6
參考001的合成，得到006。多肽分子量經ESI-MS進行確認，計算值為4376.0，檢測值為4375.5。
生物測試數據
實施例1：體外GLP-1R/GIPR/GCGR激動活性測試
A：主要材料：
1) 細胞株
該細胞株由上海藥明康德構建。詳情見下表。
2) 試劑與耗材
3) 儀器
| 靶點 | 宿主細胞 | 克隆 |
| GLP-1R | HEK293 | N/A |
| GCGR | HEK293 | N/A |
| GIPR | CHO | N/A |
| 名稱 | 批次. | 貨號 | 廠家 |
| cAMP 檢測盒 | 29F | 62AM4PEJ | Cisbio |
| 1M HEPES | 2120919 | 15630-106 | Invitrogen |
| Hanks平衡鹽溶液(HBSS) | 2185775 | 14025 | Invitrogen |
| 人血清白蛋白(HSA) | SLCF7301 | A1653-10G | 西格瑪 |
| 酪蛋白 | SLCC9458 | C4765-10 mL | 西格瑪 |
| 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX) | STBF6061V | I5879-5G | 西格瑪 |
| ECHO qualified 384 孔板 | 0006433672 | PP-0200 | Labcyte |
| OptiPlate-384 | 8210-19481 | 6007299 | 珀金埃爾默 |
| 名稱 | 型號 | 廠家 |
| EnVision | envision2014 | 珀金埃爾默 |
| Vi-cell counter | Vi-CELL™ XR Cell Viability Analyzer | 貝克曼 |
| Bravo | Bravo V11 | 安捷倫 |
| ECHO | ECHO 555 | Labcyte |
| Centrifuge | Allegra™ 25R Centrifuge | 貝克曼 |
B. 方法
1) 實驗材料
實驗緩衝
液
檢測試劑
製備
2) 實驗方法
a) 製備化合物板：
待測化合物做10個點4倍稀釋，起始濃度為30 μM，Bravo完成稀釋
b) 轉移化合物：
1) 使用Echo轉移100 nL化合物至OptiPlate-384 plate。
2) 將OptiPlate-384 plate在1000 rpm離心5 s。
c) 細胞懸液的製備
1) 將一支GLP-1R/GIPR/GCGR細胞凍存管迅速置於37℃溫水中解凍。
2) 將細胞懸液轉移至Transfer 15 mL離心管中，用10 mL HBSS輕柔沖洗。
3) 將離心管在1000 rpm室溫離心1 min。
4) 棄去上清。
5) 輕柔打散底部細胞並再用10 mL HBSS輕柔沖洗，離心沉降細胞，最後用實驗緩衝液重懸細胞。
6) 利用Vi-cell測量細胞密度與活度。
7) 用實驗緩衝液將GLP-1R/GCGR細胞濃度稀釋至2.0×10
5/mL。
8) 在OptiPlate-384 plate中轉入100 nL稀釋好的細胞懸液。
9) 室溫孵育30 min。
d) 加入檢測試劑：
1) 在OptiPlate-384 plate空孔中加入10 μL 800 nM梯度稀釋好的cAMP標準品。
2) 加入10 μL cAMP檢測試劑。
3) 用TopSeal-A film覆蓋OptiPlate-384 plate，室溫孵育60 min。
揭去TopSeal-A，在EnVision讀數。
| 試劑 | 儲存濃度 | 體積 | 終濃度 |
| Hanks平衡鹽溶液 | 1× | 48.7 mL/ 44.7 mL | ≈1× |
| HEPES緩衝液 | 1 mol/L | 250 μL | 5 mmol/L |
| 5%酪蛋白溶液(HEPES)/ 10%人血清白蛋白溶液(HSA) | 5%/ 10% | 1000 μL/ 5000 μL | 0.10%/ 1% |
| 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX) | 500 mmol/L | 50 μL | 0.5 mmol/L |
| 試劑 | 儲存濃度 | 體積 | 終濃度 |
| 細胞裂解液 | 1× | 9.5 mL | ≈1× |
| D2-cAMP溶液 | 40× | 250 μL | 1× |
| cAMP-抗體溶液 | 40× | 250 μL | 1× |
C 實驗結果
結論：本發明化合物對GLP-1R/GIPR/GCGR具有很強的激動活性。
| ID | 活性測試結果 | ||
| GLP-1 EC 50(nM) | GIP-1 EC 50(nM) | GCG EC 50(nM) | |
| WX001 | 0.043 | 0.17 | 23.2 |
無
Claims (10)
- 一種下式（I）所示序列的多肽， YAibEGT FTSDY SIAibLD KKAQK AFVEW LIAGG PSSG 0（I） 其具有以下修飾： 1）上述第17位或第24位的胺基酸有且只有一個被替換為K 0；且 2）上述式（I）所示序列的0-2個天然胺基酸被替換；且 3）第17和第20位置的胺基酸之間或第20和第24位置的胺基酸之間形成內醯胺橋； 其中， Aib的結構為； G 0選自
和
； K 0表示離胺酸，且該離胺酸側鏈上的胺基與-X 0相連； X 0選自
； p為1、2或3； s為1或2； t為8、9或10。
- 如請求項1所述的多肽，其具有如下序列SEQ ID NO: 1-6， SEQ ID NO: 1：YAibEGT FTSDY SIAibLD KK 0AQK AFVEW LIAGG PSSG-NH 2； SEQ ID NO: 2：YAibEGT FTSDY SIAibLD KK 0AQK EFVEW LIAGG PSSG-NH 2； SEQ ID NO: 3：YAibEGT FTSDY SIAibLD KK 0AQK AFIEW LIAGG PSSG-NH 2； SEQ ID NO: 4：YAibEGT FTSDY SIAibLD KEAQK AFVK 0W LIAGG PSSG-NH 2； SEQ ID NO: 5：YAibEGT FTSDY SIAibLD KEAQK EFVK 0W LIAGG PSSG-NH 2； SEQ ID NO: 6：YAibEGT FTSDY SIAibLD KEAQK AFIK 0W LIAGG PSSG-NH 2； 其中， 第17和20位置的胺基酸之間或第20和24位置的的胺基酸之間形成內醯胺橋； Aib和K 0如請求項1所定義。
- 如請求項1或2所述的多肽，其中，p為2。
- 如請求項1或2所述的多肽，其中，s為1。
- 如請求項1或2所述的多肽，其中，t為9。
- 如請求項1或2所述的多肽，其中，-X 0選自。
- 如請求項6所述的多肽，其中，-X 0選自。
- 一種下式所示多肽，
。
- 一種藥物組合物，包括作為活性成分的治療有效量的如請求項1~8任意一項所述的多肽化合物或其藥學上可接受的鹽以及藥學上可接受的載體。
- 如請求項1~8任意一項所述的多肽化合物或其藥學上可接受的鹽或者如請求項9所述的組合物在製備治療糖尿病藥物上的應用。
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