ES2636753T3

ES2636753T3 - Neuregulina para tratar la insuficiencia cardíaca

Info

Publication number: ES2636753T3
Application number: ES12839344.4T
Authority: ES
Inventors: Mingdong Zhou
Original assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Current assignee: Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Priority date: 2011-10-10
Filing date: 2012-10-08
Publication date: 2017-10-09
Anticipated expiration: 2032-10-08
Also published as: AU2019284050B2; EP2766390A4; KR20190093690A; RU2014118584A; AU2017251758A1; US20140364366A1; CN109010801A; BR112014008446A2; JP2021098729A; AU2012323711B9; JP2017206527A; JP7209382B2; US20170326204A1; WO2013053076A1; KR20230119049A; RU2646481C2; AU2017251758B2; EP3135685A1; AU2022203800A1; JP6162128B2

Abstract

Neuregulina para usar en un método para tratar la insuficiencia cardíaca crónica, en donde el método comprende: a) realizar un ensayo del nivel plasmático de prohormona N-terminal del péptido natriurético (NT-proBNP) de cada paciente antes del tratamiento; y b) administrar la neuregulina al paciente cuando el nivel plasmático de NT-proBNP está entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml.

Description

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DESCRIPCION

Neuregulina para tratar la insuficiencia cardfaca

1. Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a una protema neuregulina para usar en un metodo para prevenir, tratar o retrasar la insuficiencia cardfaca en seres humanos. En particular, la presente invencion proporciona una neuregulina para usar en la prevencion, el tratamiento o el retraso de la insuficiencia cardfaca, en poblaciones espedficas de pacientes con insuficiencia cardfaca cronica.

2. Antecedentes de la invencion

La insuficiencia cardfaca afecta aproximadamente a cinco millones de americanos, y mas de 550.000 pacientes se diagnostican con la afeccion cada ano. La terapia farmacologica actual para la insuficiencia cardfaca se dirige principalmente a los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE, de sus siglas en ingles), que son vasodilatadores que causan la expansion de los vasos sangumeos, reduciendo la presion sangumea y reduciendo la carga de trabajo del corazon. Aunque el porcentaje de reduccion de la mortalidad ha sido significativo, la actual reduccion en la mortalidad con inhibidores ACE, ha sido solo del 3%-4% en promedio, y existen varios efectos secundarios potenciales. Se han asociado limitaciones adicionales con otras opciones para prevenir o tratar la insuficiencia cardfaca. Por ejemplo, el trasplante de corazon es claramente mas caro e invasivo que el tratamiento farmacologico, y esta limitado ademas por la disponibilidad de corazones de los donantes. El empleo de dispositivos mecanicos, tales como los marcapasos ventriculares, son invasivos y caros de manera similar. Por tanto, existe una necesidad de nuevas terapias, dado las deficiencias en las terapias actuales.

Una nueva terapia prometedora implica la administracion de una neuregulina (aqu en lo sucesivo referida como “NRG”) a un paciente que padece o que corre el riesgo de desarrollar una insuficiencia cardfaca. Las NRGs, una familia similar a los factores de crecimiento EGF (factor de crecimiento epitelial), comprende a una familia relacionada estructuralmente con los factores de crecimiento y diferenciacion, que incluyen la NRG1, NRG2, NRG3 y NRG4 y las isoformas de las mismas, implicadas en un conjunto de respuestas biologicas: estimulacion de la diferenciacion celular del cancer de mama y secrecion de protemas de la leche; induccion de la diferenciacion de celulas de la cresta neural a celulas Schwann; estimulacion de la smtesis de receptores de acetilcolina en celulas del musculo esqueletico; y promocion de celulas miocardicas supervivientes, y smtesis de ADN. En estudios in vivo dirigidos a genes de neuregulina de embriones de raton homocigoticos con graves defectos en la formacion trabecular y ventricular, y en el desarrollo de los ganglios de la rafz dorsal, indican que la neuregulina es esencial para el desarrollo neural y cardfaco.

Las NRGs se unen al receptor de la familia de EGF, el cual comprende EGFR, ErbB2, ErbB3 y ErbB4, cada uno de los cuales juega un papel importante en multiples funciones celulares, que incluyen el crecimiento, la diferenciacion y la supervivencia celular. Existen receptores de la protema tirosina quinasa, que consiste en un dominio que se une al ligando extracelular, un dominio de quinasa transmembrana y un dominio de tirosina quinasa citoplasmatico. Despues de que la NRG se haya unido al dominio extracelular de ErbB3 o ErbB4, se induce un cambio conformacional que conduce a la formacion del heterodfmero entre ErbB3, ErbB4 y ErbB2, o la formacion del homodfmero entre ErbB4 consigo mismo, que da como resultado una fosforilacion del dominio C-terminal del receptor dentro de la membrana celular. El dominio intracelular fosforilado se une despues a protemas senal adicionales dentro de la celula, que activan la correspondiente ruta senalizacion descendente AKT o ERK, e induce una serie de reacciones celulares, tales como la estimulacion o supresion de la proliferacion celular, diferenciacion celular, apoptosis celular, migracion celular o adhesion celular. Entre estos receptores, en el corazon se expresan principalmente ErbB2 y ErbB4.

Se ha demostrado que los dominios de NRG-1 similares a EGF, que oscilan en un tamano de 50 a 64 aminoacidos, son suficientes para unir y activar a estos receptores. Estudios anteriores han demostrado que la neuregulina-113 (NRG-113) puede unirse directamente a ErbB3 y ErbB4 con una alta afinidad. El receptor huerfano, ErbB2, puede formar el heterodfmero con ErbB3 y ErbB4 con una afinidad mayor que los homodfmeros ErbB3 o ErbB4. La investigacion en el desarrollo neuronal ha indicado que la formacion del sistema nervioso simpatico requiere de un sistema de senalizacion de NRG-113, ErbB2 y ErbB3 intacto. La alteracion de la diana del NRG-113 o ErbB2 o ErbB4 conduce a la muerte embrionaria debido al desarrollo de defectos cardfacos. Estudios recientes destacaron tambien los papeles del NRG-113, ErbB2 y ErbB4, en el desarrollo cardiovascular, asf como en el mantenimiento de las funciones cardfacas normales del adulto. El NRG-113 ha demostrado mejorar la organizacion sarcomera de los cardiomiocitos del adulto. La administracion de un NRG-113 recombinante de dominio similar a EGF mejora o protege significativamente frente un deterioro del rendimiento miocardico en distintos modelos, asf como en ensayos clmicos, de animales con insuficiencia cardfaca. Estos resultados hacen que la NRG-1 sea prometedora como un compuesto principal para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca. Sin embargo, aun existe una necesidad de mas pruebas de si el tratamiento con NRG-1 puede proporcionar beneficios a largo plazo en los pacientes con insuficiencia cardfaca, y si los beneficios se pueden proporcionar en todos los pacientes con insuficiencia cardfaca cronica o solo en algunas subpoblaciones.

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3. Compendio de la invencion

El solicitante descubrio que evaluar la clasificacion funcional cardfaca de la New York Heart Association (NYHA) o medir el nivel plasmatico de NT-proBNP o BNP en los pacientes en ensayos clmicos de neuregulina en humanos para tratar la insuficiencia cardfaca, permitfa la seleccion de los pacientes con insuficiencia cardfaca que recibinan significativamente los beneficios del tratamiento de la neuregulina. Tales beneficios incluyen una reduccion significativa en la tasa de mortalidad.

El solicitante ha descubierto que la NRG mejora la diferenciacion de celulas musculares cardfacas y la organizacion de la estructura sarcomerica y del citoesqueleto, asf como la adhesion celular. El solicitante tambien ha descubierto que la NRG mejora o protege significativamente frente al deterioro del rendimiento del miocardio en diferentes modelos y ensayos clmicos de animales con insuficiencia cardfaca. La neuregulina, polipeptido de neuregulina, o derivados de neuregulina, entran dentro del alcance de la presente invencion.

Por tanto, en un primer aspecto, se proporciona una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de neuregulina para tratar a pacientes con insuficiencia cardfaca cronica, y los pacientes recibieron beneficios significativos de la composicion farmaceutica. El beneficio puede ser la reduccion significativa de la tasa de mortalidad. El beneficio puede ser la reduccion significativa de la re-hospitalizacion. El beneficio puede ser la mejora de los niveles de biomarcadores que indican la mejora de la insuficiencia cardfaca. La composicion farmaceutica se puede administrar a los pacientes mediante un regimen de induccion, aqu en lo sucesivo referido en la solicitud como regimen de introduccion. En algunos ejemplos optimizados, el regimen de introduccion incluye una administracion de la composicion farmaceutica durante al menos 3, 5, 7 o 10 dfas consecutivos. En algunos ejemplos optimizados, la composicion farmaceutica se administra a los pacientes durante un regimen de mantenimiento durante al menos 3, 6 o 12 meses despues del regimen de introduccion. En algunos ejemplos optimizados, el regimen de mantenimiento incluye la administracion de la composicion farmaceutica cada 3, 5, 7 o 10 dfas.

En un segundo aspecto, en la presente memoria se divulga un metodo para mejorar la supervivencia o reducir la mortalidad de los pacientes con insuficiencia cardfaca cronica, que comprende administrar una composicion farmaceutica que comprende una cantidad eficaz de neuregulina a los pacientes con insuficiencia cardfaca cronica. En algunos ejemplos, la composicion farmaceutica se administra a los pacientes durante un regimen de introduccion. En algunos ejemplos optimizados, el regimen de introduccion incluye la administracion de la composicion farmaceutica durante al menos 3, 5, 7 o 10 dfas consecutivos. En algunos ejemplos optimizados, la composicion farmaceutica se administra a los pacientes durante un regimen de mantenimiento durante al menos 3, 6 o 12 meses despues del regimen de introduccion. En algunos ejemplos optimizados, el regimen de mantenimiento incluye una administracion de la composicion farmaceutica cada 3, 5, 7 o 10 dfas.

En un tercer aspecto, segun la invencion, se emplea una cantidad de neuregulina eficaz farmaceuticamente para tratar a pacientes con insuficiencia cardfaca cronica cuyo nivel de NT-proBNP plasmatico esta dentro de una zona de tratamiento favorita antes del tratamiento con neuregulina.

Espedficamente, la presente invencion proporciona una neuregulina para usar en un metodo para tratar la insuficiencia cardfaca cronica, en donde el metodo comprende:

a) realizar un ensayo del nivel plasmatico de pro-hormona N-terminal del peptido natriuretico cerebral (NT- proBNP) de cada paciente antes del tratamiento; y

b) administrar la neuregulina al paciente cuando el nivel plasmatico de NT-proBNP esta entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml.

La presente invencion proporciona ademas un metodo para seleccionar un paciente con insuficiencia cardfaca para tratar mediante neuregulina, en donde el metodo comprende:

(i) realizar un ensayo in vitro del nivel plasmatico de prohormona N-terminal del peptido natriuretico (NT- proBNP) en el paciente antes del tratamiento, y

(ii) decidir si el resultado del ensayo es indicativo para el tratamiento mediante neuregulina, en donde el resultado del ensayo es indicativo para el tratamiento mediante neuregulina cuando el nivel plasmatico de NT-proBNP esta entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml.

La zona de tratamiento favorito esta entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml. En una realizacion preferida, el nivel plasmatico se mide mediante inmunoensayo.

En un cuarto aspecto, una cantidad de neuregulina eficaz farmaceuticamente se usa para tratar a pacientes con insuficiencia cardfaca cronica que tiene una clase espedfica de funcion cardfaca clasificada mediante la clasificacion funcional cardfaca de la NYHA. La clase espedfica de funcion cardfaca puede ser la clase II de la NYHA. La clase espedfica de funcion cardfaca puede ser la clase III de la NYHA.

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En un quinto aspecto, la invencion caracteriza un metodo para seleccionar un paciente con insuficiencia cardfaca para el tratamiento mediante neuregulina. Este metodo comprende un ensayo in vitro para medir el nivel plasmatico de NT-proBNP en el paciente. Un nivel de entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml es indicativo de que el paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neregulina.

En un sexto aspecto, la descripcion caracteriza un metodo para seleccionar un paciente con insuficiencia cardfaca para el tratamiento mediante neuregulina. Este metodo comprende evaluar la clase funcional cardfaca mediante la clasificacion de la funcion cardfaca de la NYHA. La clase II de la NYHA puede ser indicativo de que el paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neuregulina. Alternativamente, la clase III de la NYHA puede ser indicativo de que el paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neuregulina.

En un septimo aspecto, la descripcion caracteriza unos kits de diagnostico para seleccionar a un paciente con insuficiencia cardfaca para el tratamiento mediante neuregulina. Los kits de diagnostico pueden comprender reactivos de inmunoensayo para medir el nivel plasmatico de NT-proBNP en un paciente con insuficiencia cardfaca, en donde un nivel de no mas de 4000 fmol/ml es indicativo de que el paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neuregulina. Un nivel de entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml puede ser indicativo de que el paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neuregulina. Un nivel de no mas de 1600 fmol/ml puede ser indicativo de que el paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neuregulina.

En un octavo aspecto, se proporciono el uso de una protema neuregulina para la preparacion de una medicacion. La medicacion se puede proporcionar a pacientes con insuficiencia cardfaca cronica para beneficios a largo plazo. En una realizacion, el beneficio a largo plazo es la mejora de la supervivencia. En una realizacion, el beneficio a largo plazo es la reduccion de la re-hospitalizacion. En otra realizacion, el beneficio a largo plazo es la mejora de los biomarcadores que indican el pronostico a largo plazo de la insuficiencia cardfaca cronica. En algunas realizaciones, la medicacion se administra a los pacientes durante un regimen de introduccion. En algunas realizaciones optimizadas, el regimen de introduccion incluye la administracion de medicacion durante al menos 3, 5, 7 o 10 dfas consecutivos. En algunas realizaciones optimizadas, la medicacion se administra a los pacientes durante un regimen de mantenimiento durante al menos 3, 6 o 12 meses despues del regimen de introduccion. En algunas realizaciones optimizadas, el regimen de mantenimiento incluye una administracion de la medicacion cada 3, 5, 7 o 10 dfas.

En un noveno aspecto segun la invencion, se proporciono un ensayo de diagnostico complementario para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante una protema neuregulina. La prohormona N-terminal del peptido natriuretico (NT-proBNP) se usa como un biomarcador para el ensayo de diagnostico complementario. Un nivel de entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml es indicativo de que el paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neuregulina.

En un decimo aspecto, se proporciona un metodo para tratar la insuficiencia cardfaca cronica empleando neuregulina. El metodo comprende un procedimiento de evaluacion antes del tratamiento y decidir si cada paciente es adecuado para recibir el tratamiento de neuregulina segun el resultado de la evaluacion. El procedimiento de evaluacion puede incluir la clasificacion de la funcion cardfaca de la NYHA de un paciente con insuficiencia cardfaca cronica. El procedimiento de evaluacion puede incluir el ensayo plasmatico de NT-proBNP o BNP para cada paciente con insuficiencia cardfaca cronica.

En un undecimo aspecto, se proporciona un kit de diagnostico complementario para decidir si un paciente con insuficiencia cardfaca cronica es adecuado para recibir el tratamiento con protema neuregulina. El kit de diagnostico complementario comprende un kit de ensayo NT-proBNP o BNP plasmatico, y las instrucciones de como usar el kit y como determinar si el sujeto es adecuado para el tratamiento con protema neuregulina segun el resultado del ensayo.

4. Descripcion detallada de la invencion

La presente invencion proporciona una neuregulina para usar en un metodo para tratar una insuficiencia cardfaca cronica, en donde el metodo comprende:

a) realizar un ensayo del nivel plasmatico de prohormona N-terminal del peptido natriuretico (NT-proBNP) de cada paciente antes del tratamiento; y

Segun algunas de las realizaciones, el nivel plasmatico de NT-proBNP se mide mediante inmunoensayo.

Segun algunas de las realizaciones, la insuficiencia cardfaca cronica es causada por factores isquemicos, congenitos, reumaticos, idiopaticos, virales o toxicos.

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Segun algunas de las realizaciones, el metodo comprende ademas administrar al menos un farmaco contra la insuficiencia ca^aca.

Segun algunas de las realizaciones, el al menos un farmaco contra la insuficiencia cardfaca se selecciona del grupo que consiste en: inhibidores de la ACE, 13-bloqueantes, ARBs, diureticos, y digitalicos.

Segun algunas de las realizaciones, el beneficio a largo plazo del metodo se indica mediante el nivel de expresion de un biomarcador para el diagnostico o pronostico de la insuficiencia cardfaca.

Segun algunas de las realizaciones, el biomarcador es NT-proBNP o BNP.

Segun algunas de las realizaciones, la neuregulina se administra a los pacientes durante un regimen de introduccion.

Segun algunas de las realizaciones, el regimen de introduccion incluye una administracion de neuregulina durante al menos 3, 5, 7, o 10 dfas consecutivos.

Segun algunas de las realizaciones, le neuregulina se administra a los pacientes durante un regimen de mantenimiento despues del regimen de introduccion.

Segun algunas de las realizaciones, el regimen de mantenimiento incluye una administracion de neuregulina cada 3, 5, 7 o 10 dfas.

La presente invencion proporciona ademas un metodo para seleccionar un paciente con insuficiencia cardfaca para el tratamiento mediante neuregulina, en donde el metodo comprende:

(ii) decidir si el resultado del ensayo es indicativo para el tratamiento mediante neuregulina,

en donde el resultado del ensayo es indicativo para el tratamiento mediante neuregulina cuando el nivel plasmatico de NT-proBNP esta entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml.

Para mayor claridad de la divulgacion, y no a modo de limitacion, la descripcion detallada de la invencion se divide aqu en lo sucesivo dentro de las siguientes subsecciones.

A. Definiciones

A menos que se defina de otra manera, todos los terminos tecnicos y cientfficos que se emplean en la presente memoria tienen el mismo significado al que se entiende normalmente por cualquier experto en la tecnica a la que pertenece esta invencion. Si una definicion establecida en esta seccion es contraria o incompatible de otra manera con una definicion establecida en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas u otras publicaciones que se citan en la presente memoria por referencia, la definicion establecida en esta seccion prevalece sobre la definicion que se cita en la presente memoria por referencia.

Como se emplea en la presente memoria, las formas en singular “un”, “uno”, y “el” significan “al menos uno” o “uno o mas” a menos que el contexto lo determine claramente de otra manera.

Como se emplea en la presente memoria, “neuregulina” o “NRG” empleado en la presente invencion se refiere a las protemas o peptidos que se pueden unir y activar a ErbB2, ErbB3, ErbB4 o a combinaciones de los mismos, que incluyen pero no se limitan a todas las isoformas de neuregulina, neuregulina con dominio similar a EGF en solitario, polipeptidos que comprenden neuregulina con dominio similar a EGF, neuregulinas mutantes o derivados, y cualquier tipo de producto genetico similar a neuregulina que active tambien a los receptores anteriores que se describen en detalle a continuacion. Neuregulina tambien incluye a las protemas NRG-1, NRG-2, NRG-3 y NRG-4, peptidos, y fragmentos. La neuregulina empleada en la presente invencion, puede activar los receptores ErbB anteriores y modular sus reacciones biologicas, por ejemplo, estimular la smtesis del receptor de acetilcolina en las celulas musculares esqueleticas; y/o mejorar la supervivencia y diferenciacion del cardiomiocito, y la smtesis de ADN. La neuregulina tambien incluye a aquellas variantes con sustituciones de aminoacidos conservadoras que no alteran sustancialmente su actividad biologica. Sustituciones de aminoacidos conservadoras adecuadas son bien conocidas por los expertos en esta tecnica, y se pueden realizar generalmente sin alterar la actividad biologica de la molecula resultante. Los expertos en esta tecnica reconoceran que, en general, sustituciones de un unico aminoacido en regiones no esenciales de un polipeptido no alteran sustancialmente la actividad biologica (vease, por ejemplo, Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4a Edicion, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub.co.,p.224). En realizaciones preferidas, la neuregulina empleada en la presente invencion se une y activa heterodfmeros ErB2/ErbB4 o ErbB2/ErbB3, por ejemplo, pero no con propositos de restriccion, peptidos que incluyen de 177-237 restos de la isoforma 132 de NRG-1 que contiene la secuencia de aminoacidos:

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SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ (SEQ ID NO:1). Los peptidos que incluyen de 177-237 restos de la isoforma 132 de NRG-1 comprende el dominio similar a EGF, el cual se ha demostrado ser suficiente para unirse y activar a los receptores.

Como se emplea en la presente memoria, “dominio similar al factor de crecimiento epidermico” o “dominio similar a EGF” se refiere a un polipeptido codificado por un gen de neuregulina que se une y activa a ErbB2, ErbB3, ErbB4, o a combinaciones de las mismas, y que soporta una estructura similar a la del dominio de union al receptor EGF como se divulga en WO 00/64400, Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); Patentes US Nos 5.530.109 y 5.716.930; Hijazi et al., Int J. Oncol., 13:1061-1067 (1998); Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997); Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997); Higashiyama et al., J. Biochem., 122:675-680 (1997); y WO 97/09425. En determinadas realizaciones, el dominio similar a EGF se une y activa a heterodfmeros ErbB2/ErbB4 o ErbB2/ErbB3. En determinadas realizaciones, el dominio similar a EGF comprende la secuencia de aminoacidos del receptor que se une al dominio de NRG-1. En algunas realizaciones, el dominio similar a EGF comprende la secuencia de aminoacidos que corresponde a los restos aminoacidos 177-226, 177-237, o 177-240 de la NRG-1. En determinadas realizaciones, el dominio similar a EGF comprende la secuencia de aminoacidos del receptor que se une al dominio de NRG-2. En determinadas realizaciones, el dominio similar a EGF comprende la secuencia de aminoacidos del receptor que se une al dominio de NRG-3. En determinadas realizaciones, el dominio similar a EGF comprende la secuencia de aminoacidos del receptor que se une al dominio de NRG-4. En determinadas realizaciones, el dominio similar a EGF comprende la secuencia de aminoacidos de Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro, como se describe en la patente US N° 5.834.229.

La formulacion, dosis y via de administracion de una protema neuregulina, preferiblemente en la forma de composiciones farmaceuticas, se puede determinar segun los metodos conocidos en la tecnica (vease, por ejemplo, Remington; The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, Abril 1997; Therapeutic Peptides and Proteins; Formulation, Processing, and Delivery Systems, Banga, 1999; y Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, Hovgaard y Frkjr (Ed.), Taylor & Francis, Inc., 2000; Medical Applications of Liposomes, Lasic and Papahadjopoulos (Ed.), Elsevier Science, 1998; Textbook of Gene Therapy, Jain, Hogrefe & Huber Publishers, 1998; Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy, Vol. 15, Seth, Landes Bioscience, 1999; Biopharmaceutical Drug Design and Development, Wu-Pong and Rojanasakul (Ed.), Humana Press, 1999; Therapeutic Angiogenesis: From Basic Science to the Clinic, Vol. 28, Dole et al., (Ed.), Springer-Verlag Nueva York, 1999).

La protema neuregulina, se puede formular para administracion oral, rectal, topica, inhalatoria, bucal (por ejemplo, sublingual), parenteral (por ejemplo, subcutanea, intramuscular, intradermica, o intravenosa), transdermica o cualquier otra via de administracion adecuada. La via mas adecuada en cualquier caso, dependera de la naturaleza y de la gravedad de la afeccion que se esta tratando, y de la naturaleza de la protema neuregulina en particular que se esta empleando. La protema neuregulina se puede administrar en solitario. De forma alternativa y preferiblemente, la protema neuregulina se co-administra con un transportador o excipiente aceptable farmaceuticamente. En el presente metodo se puede emplear cualquier transportador o excipiente adecuado aceptable farmaceuticamente (vease, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro (Editor) Mack Publishing Company, Abril 1997).

Segun la presente invencion, la protema neuregulina, en solitario o en combinacion con otros agentes, transportadores o excipientes, se puede formular para cualquier via de administracion adecuada, tal como la inyeccion intracavernosa, inyeccion subcutanea, inyeccion intravenosa, inyeccion intramuscular, inyeccion intradermica, administracion oral o topica. El metodo puede emplear formulaciones para administracion inyectable en forma de dosis unitaria, en ampollas o en recipientes multiples, con un conservante adicional. Las formulaciones pueden adoptar tales formas como suspensiones, disoluciones o suspensiones en vehmulos acuosos u oleosos, y pueden contener agentes formuladores tales como agentes de suspension, estabilizantes y/o agentes dispersantes. Alternativamente, el ingrediente activo puede ser en forma de polvo para reconstitucion con un vehmulo adecuado, agua esteril apirogena u otros disolventes, antes de su uso. La administracion topica en la presente invencion puede emplear el uso de una espuma, gel, crema, pomada, parche transdermico, o pasta.

Composiciones y metodos aceptables farmaceuticamente para su administracion que se pueden emplear para usar en esta invencion incluyen, pero no se limitan a los descritos en las Patentes U.S. Nos 5.736.154; 6.197.801 B1; 5.741.511; 5.886.039; 5.941.868; 6.258.374 B1; y 5.686.102.

La magnitud de una dosis terapeutica en el tratamiento o prevencion variara con la gravedad de la afeccion a tratar y de la via de administracion. La dosis, y quizas la frecuencia de la dosis, variara tambien segun la edad, peso corporal, afeccion y respuesta del paciente en particular.

Conviene senalar que el medico responsable sabra como y cuando terminar, interrumpir o ajustar la terapia a la dosis mas baja debido a la toxicidad, o a los efectos adversos. Por otro lado, el medico sabra tambien como y cuando ajustar el tratamiento a los niveles mas altos si la respuesta clmica no es la adecuada (evitando los efectos toxicos secundarios).

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Se puede emplear cualquier via de administracion adecuada. Las formas de dosificacion incluyen comprimidos, pastillas, papelillos, dispersiones, suspensiones, disoluciones, capsulas, parches, y similares. Vease, Pharmaceutical Sciences de Remington. En casos practicos, la protema neuregulina, en solitario o en combinacion con otros agentes, se puede combinar como el activo en mezcla mtima con un transportador o excipiente farmaceutico, tal como beta-ciclodextrina y 2-hidroxi-propil-beta-ciclodextrina, segun tecnicas de elaboracion farmaceuticas convencionales. El transportador puede adoptar una forma amplia de preparacion requerida para la administracion, topica o parenteral. En la preparacion de composiciones para formas de dosificacion parenteral, tal como inyeccion intravenosa o infusion, se puede emplear un medio farmaceutico similar, agua, glicoles, aceites, tampones, azucar, conservantes, liposomas, y similares, conocidos por los expertos en la tecnica. Ejemplos de tales composiciones parenterales incluyen, pero no se limitan a, dextrosa 5% p/v, disoluciones normales salinas u otras disoluciones. La dosis total de la protema neuregulina, en solitario o en combinacion con otros agentes para administrarse, se puede administrar en un vial de fluido intravenoso, que oscila de a aproximadamente 1 ml a 2000 ml. El volumen del fluido de dilucion variara segun la dosis total administrada.

Los kits pueden llevar a cabo los regfmenes terapeuticos. Tales kits comprenden en uno o mas recipientes, cantidades de la protema neuregulina eficaces terapeuticamente, en solitario o en combinacion con otros agentes, en la forma aceptable farmaceuticamente. Formas farmaceuticas preferidas estaran en combinacion con una disolucion esteril salina, una disolucion de dextrosa, o una disolucion tampon, u otro fluido esteril aceptable farmaceuticamente. Alternativamente, la composicion se puede liofilizar o desecar; en este caso, el kit comprende ademas opcionalmente en un recipiente, una disolucion aceptable farmaceuticamente, preferiblemente esteril, para reconstituir el complejo para formar una disolucion para inyeccion. Ejemplos de disoluciones aceptables farmaceuticamente son la disolucion salina y la dextrosa.

En otro aspecto, un kit comprende ademas una aguja o jeringa, preferiblemente envasada en forma esteril, para inyectar la composicion, y/o una gasa envasada con alcohol. Se incluyen opcionalmente las instrucciones para la administracion de la composicion por un medico o por el paciente.

Como se emplea en la presente memoria, “tratar” y “tratamiento” se refiere a cualquier manera en la que se mejoran o se modifican de otra manera beneficiosa, los smtomas de una afeccion, trastorno o enfermedad. El efecto puede ser profilactico en terminos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o smtoma de la misma y/o puede ser terapeutica en terminos de una cura parcial o completa de una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El tratamiento tambien abarca cualquier uso farmaceutico de las composiciones de la presente memoria.

Como se emplea en la presente memoria, “insuficiencia cardfaca” significa una anormalidad de la funcion cardfaca donde el corazon no bombea sangre al ritmo necesario para los requerimientos de los tejidos metabolizadores. La insuficiencia cardfaca incluye una amplia variedad de estados de la enfermedad, tal como, la insuficiencia cardfaca congestiva, infarto de miocardio, taquiarritmia, cardiomiopatfa hipertrofica familiar, enfermedad cardfaca isquemica, cardiomiopatfa dilatada idiopatica, miocarditis y similares. La insuficiencia cardfaca se puede producir por un numero indefinido de factores que incluyen, sin limitacion, formas isquemicas, congenitas, reumaticas, virales, toxicas o idiopaticas. La hipertrofia cardfaca cronica es un significativo estado de la enfermedad, que es precursor de la insuficiencia cardfaca congestiva y de la parada cardfaca.

Como se emplea en la presente memoria, “protema” es sinonimo de “polipeptido” o “peptido”, a menos que el contexto lo determine claramente de otra manera.

Como se emplea en la presente memoria, “plasma” es sinonimo de “suero” a menos que el contexto lo determine claramente de otra manera.

Como se emplea en la presente memoria, “beneficio a largo plazo” significa un beneficio causado por un tratamiento o intervencion que no se puede observar en un corto periodo de tiempo despues del tratamiento o intervencion. Para pacientes con insuficiencia cardfaca cronica, el beneficio a largo plazo puede ser una mejora de la supervivencia, una reduccion de la re-hospitalizacion o una mejora de los biomarcadores que indican el pronostico a largo plazo. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo para la observacion del beneficio es aproximadamente 6 meses. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo para la observacion del beneficio es aproximadamente 1 ano. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo para la observacion del beneficio es aproximadamente 2 anos. Y en otras realizaciones, el periodo de tiempo para la observacion del beneficio es aproximadamente 3 anos, 5 anos, 10 anos o mas.

Como se emplea en la presente memoria, “supervivencia” significa el tiempo o probabilidad de que un sujeto pueda permanecer vivo o con vida. Se podna expresar como el tiempo de supervivencia o la tasa de supervivencia. El tiempo de supervivencia es el periodo de tiempo desde el comienzo del diagnostico o tratamiento hasta el final de la vida. La tasa de supervivencia significa el porcentaje de gente que sobrevive durante un periodo de tiempo dado, despues del diagnostico o tratamiento. Para cada sujeto, el tiempo de supervivencia prolongado por un tratamiento o intervencion, podna considerarse como un beneficio. Para un grupo de sujetos o de grandes poblaciones, un tiempo de supervivencia media prolongada o una tasa de supervivencia aumentada, podna considerarse como un beneficio.

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Como se emplea en la presente memoria, “re-hospitalizacion” significa los tiempos o frecuencia en los que se ingresa al paciente en el hospital en un periodo de tiempo dado. El ingreso en el hospital puede ser causado por todas las afecciones, o estar causado solo por la misma afeccion que se esta tratando. Para cada sujeto, una reduccion de los tiempos de re-hospitalizacion en un penodo de tiempo dado, podna considerarse como un beneficio. Y para un grupo de sujetos o grandes poblaciones, una reduccion del tiempo total o del tiempo medio de las re-hospitalizaciones, podna considerarse como un beneficio.

Como se emplea en la presente memoria, el “peptido natriuretico cerebral N-terminal” o “NT-proBNP” significan la proBNP N-terminal inactiva remanente, la ultima es la prohormona del BNP, el cual es un peptido natriuretico activo hormonalmente que se libera principalmente a partir de los cardiomicitos en la pared ventricular izquierda. En la reaccion de contraccion y dilatacion de la pared del miocardio, la prohormona proBNP se divide mediante ruptura proteofftica, en BNP y en la NT-proBNP remanente, inactiva hormonalmente.

Los niveles plasmaticos de BNP y NT-proBNP son herramientas prometedoras en el manejo diario de sospechas o establecimientos de la insuficiencia cardfacas. Muchos estudios en el uso de BNP y de NT-proBNP en la practica clmica han abordado sus propiedades diagnosticas, y esta disponible una cantidad cada vez mas creciente de pruebas que apoyan el valor pronostico de la BNP y NT-proBNP. Como la NT-proBNP tiene aproximadamente una vida media en sangre aproximadamente 6 veces mayor que la BNP, es el marcador de diagnostico o pronostico de la insuficiencia cardfaca mas ampliamente utilizado. El nivel plasmatico de NT-proBNP se puede analizar mediante kits comerciales. Con propositos ejemplarizantes, pero no como limitacion, estan disponibles los kits comerciales de Roche o Biomedica. En los ejemplos de la presente invencion, el nivel de NT-proBNP se detecto mediante un kit de Biomedica (Austria).

Tanto los niveles de BNP como de NT-proBNP en la sangre se emplean para el cribado y diagnostico de la insuficiencia cardfaca, y son utiles para establecer el pronostico de la insuficiencia cardfaca, ya que ambos marcadores se encuentran normalmente aumentados en los pacientes con peores resultados. Y, se descubrio en la presente invencion que el nivel plasmatico de BNP o NT-proBNP es indicativo de que el paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neuregulina. De hecho, cualquier marcador para el diagnostico o pronostico de la insuficiencia cardfaca se puede emplear para determinar si un paciente es adecuado para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca mediante neuregulina. El nivel plasmatico de NT-proBNP identificado en esta invencion se debera emplear como orientacion, y no como una limitacion para la seleccion de los pacientes con insuficiencia cardfaca que recibiran los beneficios significativos del tratamiento con neuregulina. Por ejemplo, empleando un nivel plasmatico de 5000 fmol/ml aun sera capaz de seleccionar a los pacientes con insuficiencia cardfaca que recibiran los beneficios del tratamiento con neuregulina, pero algunos de estos pacientes recibiran los beneficios del tratamiento en un menor grado.

Como se emplea en la presente memoria, la clasificacion de la funcion cardfaca de la “New York Heart Association” o “NYHA”, es una manera simple de clasificar la extension de la insuficiencia cardfaca. Esta situa a los pacientes en una de las cuatro categonas en base a como se ven limitados durante la actividad ffsica; las limitaciones/smtomas se refieren a la respiracion normal y a distintos grados de dificultad respiratoria y/o dolor anginoso: I, no hay smtomas y no hay limitacion en la actividad ffsica normal, por ejemplo, dificultad respiratoria cuando camina, sube las escaleras, etc; II, smtomas leves (leve dificultad respiratoria y/o angina) y escasa limitacion durante la actividad normal; III, marcada limitacion en la actividad debido a los smtomas, incluso durante una actividad menor a la normal, por ejemplo, caminando cortas distancias (20-100 m), comodo solo con descanso; y IV, limitaciones graves, experimentan smtomas incluso mientras descansan, principalmente los pacientes encamados.

Como se emplea en la presente memoria, “unidad de actividad” o “EU” o “U” significa la cantidad de producto estandar que puede inducir el 50% de la reaccion maxima. En otras palabras, para determinar la unidad de actividad de un agente activo dado, se debera medir la EC50. Por ejemplo, si la EC50 para el lote de un producto fuese 0,1 |jg, que sena una unidad. Ademas, si se esta empleando 1 |jg del producto, entonces se estanan empleando 10 EU (1/0,1). La EC50 se puede determinar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo el metodo empleado por los inventores. Esta determinacion de la unidad de actividad es importante para el control de calidad de los productos modificados geneticamente y los farmacos empleados clmicamente, permite que el producto a partir de diferentes farmacos y/o numeros de lote diferentes, se cuantifiquen con criterios uniformes.

El siguiente ejemplo es un metodo cuantitativo rapido, sensible, de alto flujo, para la determinacion de la actividad biologica de la nRG-1 a traves de la combinacion de NRG con la molecula ErbB3/ErbB4 de la superficie celular y la mediacion indirecta de la fosforilacion de ErbB2 (vease, por ejemplo, D. Sadick et al., 1996, Analytical Biochemitsry, 235:207-214 y WO03/099300).

Brevemente, el ensayo, llamado ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzima por activacion del receptor quinasa (KIRA-ELISA), consiste en dos placas de microtitulacion separadas, una para el cultivo celular, estimulacion del ligando, y la lisis celular/solubilizacion del receptor, y la otra placa, para la captura del receptor y de la ELISA fosfotirosina. El ensayo se desarrollo por analisis de NRG inducido por la activacion de ErbB2 y utiliza la estimulacion del receptor intacto en la lmea celular de carcinoma de mama adherente, MCF-7. Las protemas de membrana se solubilizan a traves de Triton X-100 de lisis y el receptor se captura en los pocillos ELISA recubiertos

con anticuerpos espedficos para ErbB2 sin reaccion de entrecruzamiento para ErbB3 o ErbB4. Despues se cuantifico el grado de fosforilacion del receptor mediante ELISA antifosfotirosina. Se genero una curva estandar reproducible con un EC50 de aproximadamente 360pM para heregulina beta 1 (177-244). Cuando se analizan muestras identicas de HRG beta 1 (177-244) por KIRA-ELlSA y se cuantifica la antifosfotirosina por analisis Western 5 Blot, los resultados correlativos estan muy proximos el uno con el otro. El ensayo descrito en este informe es capaz de cuantificar espedficamente la fosforilacion de tirosina de ErbB2 que resulta de la interaccion de HRG con ErbB3 y/o ErbB4.

Ya que muchos de los medicamentos modificados geneticamente son protemas y polipeptidos, su actividad se puede determinar mediante sus secuencias de aminoacidos o el centro de actividad formado por su estructura 10 espacial. El tftulo de actividad de la protema y del polipeptido no es compatible con su calidad absoluta, por lo tanto, no se puede determinar con unidades de peso como la de los farmacos qmmicos. Sin embargo, la actividad biologica de los medicamentos modificados geneticamente es generalmente compatible con su farmacodinamica y un sistema de determinacion del tftulo establecido a traves de una actividad biologica dada, puede determinar su unidad de tftulo. Por lo tanto, la determinacion de la actividad biologica puede ser parte de un proceso de titulacion 15 de la sustancia con actividad biologica y es un componente importante del control de calidad de un producto geneticamente modificado. Es importante determinar los criterios de actividad biologica para el control de calidad de un producto modificado geneticamente y para los farmacos empleados cftnicamente.

Cuantificar un producto estandar que puede inducir el 50% de la reaccion maxima se define como una unidad de actividad (1 EU). Por consiguiente, se puede cuantificar el producto de diferentes medicamentos y de numeros de 20 lote diferentes, con criterios uniformes.

Ejemplos

Ejemplo 1: El efecto de la administracion de Neucardin™ por vfas diferentes, sobre la tasa de supervivencia de ratas con insuficiencia cardfaca.

Introduccion:

25 En este estudio, se empleo un modelo de insuficiencia cardfaca inducido por la ligadura de la arteria coronaria (CAL, de sus siglas en ingles) para investigar si la administracion de Neucardin™ por goteo intravenoso, IV, empleando una bomba de micro-inyeccion o mediante bolo subcutaneo (SC), tema algun efecto en la tasa de supervivencia y en la hemodinamica cardfaca, 120 dfas despues del inicio de la administracion de Neucardin™ 4 semanas despues de la CAL. Tambien se emplearon el ecocardiograma y la remodelacion cardfaca para determinar la funcion cardfaca y 30 la recuperacion de la cAl.

2. Metodos:

2.1. Animales de ensayo:

Cepa, Origen: ratas Wistar, Shanghai SLAC Laboratory Animal CO. LTD; Peso, 200 ± 10 g, macho;

2.2 Producto de ensayo:

35 2.2.1. Neucardin™

Identificacion: Neuregulina 1 humana recombinante para inyeccion (rhNRG-1, Neucardin™)

Numero de Lote: 200607009 Fabricante: Zensun (Shanghai) Sci & Tech Co., Ltd Forma de dosificacion: Polvo liofilizado 40 Apariencia: Blanco o blanquecino

Contenido de rhNRG-1 marcado: 250 pg/vial Actividad espedfica: 4897 U/vial Condiciones de almacenamiento: 2~8°C

2.2.2 Vedculo:

45 Identificacion: Placebo para neuregulina-1 humana recombinante

Forma de dosificacion: Polvo liofilizado Apariencia: Blanco o blanquecino

Composicion: Albumina serica humana, manitol, fosfato, NaCI Condiciones de almacenamiento: 2~8°C 2.3 Procedimiento:

2.3.1 Establecer el modelo de rata con insuficiencia cardfaca:

5 Se ligo el LAD de las ratas. Brevemente, las ratas se anestesiaron con ketamina hidrocloruro (100 mg/kg, IP) y se les afeito y esterilizo el pecho. Se intubo a las ratas endotraquealmente y se les ventilo mecanicamente con aire de la habitacion (tasa respiratoria 60 respiraciones/min, volumen corriente 20 ml). Despues se les realizo una toracotoirna izquierda entre el 4° y 5° espacio intercostal y a continuacion se realizo una incision a lo largo del borde izquierdo del esternon. Despues se corto la cuarta costilla proxima al esternon. Se perforo el saco del pericardio y el 10 corazon quedo expuesto. El LAD se ligo aproximadamente 2 mm desde su origen empleando hilo de seda de sutura de calibre 6-0. Posteriormente, se elimino el aire dentro del torax y el pecho se cerro en tres bordes (costillas, musculos y a continuacion la piel). Despues se permitio a las ratas retomar la respiracion espontanea, y recuperarse de la anestesia, y despues se les devolvio a sus jaulas. Las ratas se mantuvieron durante un periodo de 4 semanas, despues se evaluo el ecocardiograma, incluido en el estudio formal si mostraba un valor EF% de 30-45%. Se 15 alojaron 5 animales por caja de todos los grupos, se les alimento a voluntad con una dieta estandar y tuvieron acceso libre a agua pura. La temperatura ambiente se mantuvo a 21 ± 1°C y en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas.

2.3.2 Bomba de micro-inyeccion a traves de goteo IV:

El metodo del goteo IV del vehfculo de Neucardin™ fue a traves de la vena caudal. Para este procedimiento, se 20 empleo un dispositivo de inmovilizacion de la rata apropiado segun el peso del animal. La rata se coloco cerca del dispositivo de inmovilizacion y se le coloco con cuidado en el aparato. Normalmente las ratas entran en el dispositivo de inmovilizacion sin ayuda. Posteriormente, se frota la cola de la rata con una gasa empapada en alcohol para incrementar el flujo sangumeo a la vena caudal y al estrato corneo. Se localizaron las dos venas caudales laterales (en los lados) y con el bisel de la aguja hacia arriba, con la aguja casi paralela a la vena, la aguja se inserto 2 mm en 25 la vena caudal a 2-3 cm del final de la cola. Para confirmar que la aguja se hubiese insertado con exito, se extrajo sangre en el centro de la aguja. La aguja se fijo en la cola usando un cinta adhesiva medica. Se inicio la infusion del farmaco o vehuculo a la velocidad adecuada (0,2-0,4 ml/h) mediante bomba de micro-inyeccion o inyeccion en bolo.

2.3.3 Bolo SC

El Bolo SC del vehuculo o Neucardin™ se realizo desde la espalda de la rata. Para este procedimiento, se empleo un 30 dispositivo de inmovilizacion de la rata apropiado segun el peso del animal. Se froto la espalda de la rata con una gasa empapada en alcohol para esterilizar la piel. Con el bisel de la aguja hacia arriba, con la aguja casi paralela a la piel, la aguja se inserto subcutaneamente 3-4 cm en la espalda de la rata. La aguja se fijo en la espalda usando una cinta adhesiva medica y se conecto al tubo de perfusion. Despues, la rata se coloco cerca del dispositivo de inmovilizacion y se coloco con cuidado en el aparato. Normalmente las ratas entran en el dispositivo de 35 inmovilizacion sin ayuda. Tras sujetar el dispositivo de inmovilizacion, se inicio la inyeccion del bolo.

2.3.4 Grupos experimentales e infusion del farmaco:

Las ratas MI se distribuyeron mediante el valor EF% en cuatro grupos, como sigue:

Grupo A (Control negativo) para el bolo IV y el SC. n=58 ratas: goteo IV del vehuculo durante 10 dfas mediante bomba de micro-inyeccion a una velocidad de 0,2 ml/h durante 8 horas cada dfa durante los primeros 10 dfas, bolo 40 SC del vehuculo (igual volumen que el Neucardin™), cada 5 dfas hasta el Dfa 120;

Grupo B (Neucardin™ en bolo SC), n=58: goteo IV del vehuculo mediante bomba de micro-inyeccion a una velocidad de 0,2 ml/h durante 8 horas cada dfa durante los primeros 10 dfas, bolo SC de Neucardin™ (10 jgMa), cada 5 dfas hasta el Dfa 120;

Grupo C (goteo IV de Neucardin™), n=57: goteo IV de Neucardin™ (0,625 jg/kg/h) mediante bomba de micro- 45 inyeccion a una velocidad de 0,2 ml/h durante 8 horas cada dfa durante los primeros 10 dfas, bolo SC del vehfculo (igual volumen que el Neucardin™), cada 5 dfas hasta el Dfa 120;

Grupo D (goteo IV y bolo SC de Neucardin™), n=57: goteo IV de Neucardin™ (0,625 jg/kg/h) mediante bomba de micro-inyeccion a una velocidad de 0,2 ml/h durante 8 horas cada dfa durante los primeros 10 dfas, bolo SC del vehuculo (igual volumen que el Neucardin™), en el 1°, 6° y 11° dfa, y despues bolo Sc de Neucardin™ (10 jg/kg), 50 cada 5 dfas desde el dfa 16° hasta el final.

2.3.5 Adquisicion de datos

Tasa de supervivencia; Parametros del ecocardiograma; Parametros hemodinamicos;

3. Resultados

3.1 Tasa de supervivencia:

La Tabla 1 ilustra las tasas de supervivencia entre cada Grupo. Las tasas de supervivencia fueron del 48,3%, 62,1%, 64,9% y 82,5% en el goteo IV y el bolo SC del vehnculo en el Grupo A, bolo SC de Neucardin™ del 5 Grupo B, goteo IV de Neucardin™ del Grupo C y goteo IV y bolo SC de Neucardin™ del Grupo D,

respectivamente. Todas las tasas de supervivencia o tiempo medio de supervivencia de las mortalidades en los Grupos B, C y D eran mejores y mas prolongados en comparacion con el Grupo A, el Grupo D tema la mejor eficacia.

Tabla 1: Mortalidad, Tasa de supervivencia y Tiempo medio de supervivencia en los cuatro Grupos

Grupo: Tratamiento Numero inicial de ratas Muertes Numero de ratas supervivientes Tasa de supervivencia (%) Tiempo medio de supervivencia en el dfa S.E.

A: Vehfculo 58 30 28 48,3% 83,8±5,9

B: Bolo SC Neucardin™ 58 22 36 62,1% 91,4±5,5

C: Goteo IV Neucardin™ 57 20 37 64,9% 97,5±5,1

D: Bolo SC y goteo IV Neucardin™ 57 10 47 82,5% 107,5±4,1

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3.2 Parametros del ecocardiograma:

Los parametros del ecocardiograma se muestran en la Tabla 2. Cuatro semanas despues de la ligadura de la arteria coronaria y antes de la administracion del producto de ensayo, las ratas con insuficiencia cardfaca cronica se distribuyeron en cuatro Grupos segun sus valores EF%. Como se muestra en la Tabla 2, no hubo

15 diferencias significativas entre los cuatro grupos antes del tratamiento (BT). 120 dfas despues del inicio de la

administracion, los valores EF% fueron de 30,7 ± 3,1, 32,9 ± 4,1, 33,5 ± 3,4, 36,2 ± 4,8% en los Grupos del vehfculo, Neucardin™ a traves de bolo SC, Neucardin™ a traves de goteo IV y Neucardin™ de goteo IV mas bolo SC, respectivamente. Despues del tratamiento, EF% y FS% del Grupo B, C y D, fueron todos superiores a los del Grupo A.

20 Tabla 2: Parametros del ecocardiograma en los cuatro Grupos

Grupo: 1— 1— CD < N LVEDd (cm) LVEDs (cm) EF% (%) FS° (%)

A. Control Negativo: BT 58 0,987±0,083 0,829±0,088 38,0±5,5 16,2±

: AT 25 1,100±0,089 0,961±0,090 30,7±3,1 12,7±

B. Bolo SC NeucardinIM: BT 58 0,992±0,066 0,831±0,066 38,2±4,0 16,3±

: AT 33 1,104±0,063 0,952±0,070 33,1±4,1 13,9±

C. Goteo IV NeucardinTM: BT 57 0,985±0,061 0,824±0,068 38,5±4,4 16,3±

: AT 36 1,080±0,072 0,929±0,073 33,4±3,4 14,0±

D. Bolo SC y goteo IV Neucardin™: BT 57 0,979±0,065 0,818±0,066 38,7±4,3 16,5±

: AT 44 1,052±0,087 0,893±0,092 36,2±4,8 15,3±

BT: Antes del tratamiento; AT: Despues del tratamiento;

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3.3 Parametros hemodinamicos:

La Tabla 3 muestra los valores MAP, HR, ± dp/dt, LVEDP y LVSP como se midieron en los cuatro Grupos de los animales anestesiados en el d^a 121. Cuando se administro Neucardin™ solo por bolo SC o por goteo IV (Grupo B y C), Neucardin™ incremento significativamente dp/dt y -dp/dt mediante 19,6% y 27,1%, 22,5% y 29,8%, comparado con el Grupo A. Cuando Neucardin™ se administro tanto por goteo IV como por a traves de bolo SC (Grupo D), la presion arterial media aumenta significativamente (MAP, 112,3 ± 5,5 mmHg), la presion sistolica ventricular izquierda (LVSP, 139,4 ± 9,8 mmHg), +dp/dt (7012,1 ± 903,0 mmHg/s), -dp/dt (-4353,2 ±

847,6 mmHg/s) en comparacion con los obtenidos en el vehnculo. Curiosamente, estos valores de MAP, LVSP, +dp/dt y -dp/dt fueron del 10,6%, 9,2%, 38,5% y 37,8% superiores a los de las ratas tratadas con el vetnculo, respectivamente. Los resultados muestran que los parametros hemodinamicos de los Grupos B, C y D, eran todos mejores que los del Grupo A, y que el grupo D tema la mejor eficacia.

Tabla 3: Parametros hemodinamicos en los cuatro Grupos

Grupo Tratamiento: N SBP DBP MAP LVSP

: (mmHg) (mmHg) (mmHg) (mmHg)

A: Vehnculo 14 118,7±11,5 94,1±12,3 102,3±11,7 128,5±14,7

B: Bolo SC NeucardinIM 27 123,8±11,5 95,3±8,9 104,9±9,5 129,5±13,6

C: Goteo IV NeucardinIM 25 122,5±10,5 95,0±7,5 104,4±8,2 131,7±10,0

D: Bolo SC y goteo IV NeucardinIM 35 132,6±7,1 102,1±5,3 112,3±5,5 139,4±9,8

Grupo: Tratamiento N LVEDP (mmHg) dp/dt (mmHg/s) (-dp/dt) (mmHg/s) Ritmo card^aco (Latido/min)

A: Veh^culo 14 5,8±3,5 4995,6±532,2 3087,5±715,7 297,2±16,0

B: Bolo SC Neucardin'M 27 4,5±2,8 6050,9±1231,3 4013,8±838,3 292,6±23,0

C: Goteo IV Neucardin'M 25 4,0±3,2 6199,9±709,5 4098,9±823,5 296,3±13,5

D: Bolo SC y goteo IV NeucardinTM 35 3,9±2,5 7012,1±903,0 4353,2±847,6 292,5±19,1

4. Conclusion

Una administracion combinada de Neucardin™ por goteo IV y bolo SC o una administracion del peptido dado mediante cada via en solitario, incremento todas las tasas de supervivencia de las ratas con insuficiencia cardfaca cronica inducida mediante CAL y mejoro los parametros funcionales cardfacos en comparacion con las ratas tratadas con el vetnculo.

Ejemplo 2: Estudio controlado con placebo, aleatorio, doble ciego, y multicentrico para evaluar la eficacia y seguridad de la neuregulina 1 humana recombinante en pacientes con insuficiencia cardfaca cronica basado en un tratamiento estandar

Para evaluar la eficacia en la insuficiencia cardfaca cronica de la neuregulina-1 humana recombinante para inyeccion, se llevo a cabo un estudio en fase II, basado en un tratamiento estandar controlado con placebo, multicentrico, doble ciego, en varios centros clmicos en China. Se recluto y distribuyo un total de 195 pacientes con insuficiencia cardfaca cronica estable de Clase II o III segun la NYHA dentro de tres grupos: placebo, o con rhNRG-1 0,6 |jg/kg y 1,2 jg/kg. No hubo variaciones significativas en las terapias demograficas o antecedentes entre los

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grupos. Segun el programa, a los pacientes se les administro primero el farmaco durante 10 dfas consecutivos en el hospital, despues de finalizar el dfa 11 se les dio el alta del hospital, y se realizo el seguimiento. Se realizaron otros dos seguimientos en los dfas 30 y 90. Un ano despues de reclutar al ultimo paciente se realizo una entrevista telefonica.

Producto en investigacion:

Especificacion: Neucardin™, isoforma 132 de la Neuregulina-1 de dominio similar a EGF que comprende un polipeptido de 61 aminoacidos, con el peso molecular de 7054 Dal (1|jg=0,14 nmol). 250 |jg (5000 EU)/vial (1jg=20 EU).

Preparacion: Para inyeccion.

Modo de administracion: Goteo intravenoso.

Almacenamiento: en lugar seguro, con acceso limitado y protegido de la luz, a 3-8°C.

Placebo:

Especificacion: Excipiente para Neucardin™ (250 jg/vial sin protema neuregulina-1 humana recombinante activa). Grupos de dosificacion:

Dosis: 0jg/kg/dfa 0,6jg/kg/dfa 1,2jg/kg/dfa

Administracion: Infusion intravenosa

Volumen: 50 ml

Utilizacion: 10 horas por dfa, durante 10 dfas consecutivos

Procedimiento del estudio

Los criterios para la participacion en el estudio incluyeron a pacientes con insuficiencia cardfaca cronica (Clase II o III de la NYHA) con edades entre 18 y 65 anos, LVEF <40%, en una condicion clmica relativamente estable (que incluye signos y smtomas clmicos, y un tratamiento estandar aceptado para la insuficiencia cardfaca cronica en la dosis diana o dosis de maxima tolerancia de mas de 1 mes). Los criterios importantes de exclusion incluyen infarto de miocardio agudo, cardiomiopatfa hipertrofica, pericarditis constrictiva, enfermedad valvular significativa o enfermedad cardfaca congenita, hipertension pulmonar grave, presion sangumea sistolica <90mmHg o >160mmHg, arritmia ventricular grave, cirugfa ca^aca o un evento cerebrovascular dentro de los seis meses previos, claustrofobia o mujeres embarazadas. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito.

Los pacientes fueron asignados aleatoriamente en tres grupos, se trataron con placebo o rhNRG-1 (0,6 o 1,2 jg/kgMa) durante 10 dfas consecutivos, despues de finalizar el dfa 11 se realizo el seguimiento, y se les dio el alta del hospital. Se realizaron otros dos seguimientos en el dfa 30 y el dfa 90. Se tomaron muestras de sangre de cada paciente antes del tratamiento y en los dfas 11, 30 y 90. Se evaluo el NT-proBNP plasmatico en el laboratorio con ensayos NT-proBNP (kit de Biomedica). Un ano despues de reclutar al ultimo paciente, se realizo una entrevista telefonica para recoger la informacion de las re-hospitalizaciones, todas las entrevistas telefonicas se grabaron en una forma especial con la firma de los investigadores.

De los 48 pacientes con informacion de re-hospitalizacion disponible en el grupo placebo, 12 (25,0%) fueron re- hospitalizados al menos una vez por empeoramiento de la insuficiencia cardfaca. Para el grupo de 0,6 jg/kg, solo 4 (8,7%) de los 46 pacientes reingresaron en el hospital (P=0,05 en comparacion con el placebo); la tasa de re- hospitalizacion del grupo con 1,2 jg/kg fue del 22,0% (11/50). Los tiempos medios de re-hospitalizacion fueron de 0,458 (22/48) por paciente en el grupo placebo, mientras que se redujeron al 57,4% y 17,0% respectivamente en el grupo de 0,6 (8/41) y de 1,2 jg/kg (19/50).

En el grupo placebo, la NT-proBNP era casi la misma durante el estudio comparado con la referencia. En el dfa 11, la NT-proBNP era significativamente inferior en los grupos tratados con rhNRG-1 (de 1853±1512 a 2399±1841 fmol/ml en el grupo de 0,6 jg/kg, P<0,01; de 1562±1275 a 2774±1926 fmol/ml en el grupo de 1,2 jg/kg, P<0,01). Pero su incremento era transitorio y no fue causado por un empeoramiento de la funcion cardfaca, como se mostro en el aumento de la funcion cardfaca, la NT-proBNP descendio hasta el nivel de referencia en el dfa 30 y en el dfa 90 en el grupo de 1,2 jg/kg. Por otra parte, en el grupo de 0,6 jg/kg, la NT-proBNP se redujo significativamente en el dfa 30 (1323±1124 fmol/ml, P=0,01) y en el dfa 90 (1518±1403 fmol/ml, P=0,01) cuando se le compara a la referencia.

Estos resultados mostraron que el tratamiento con rhNRG-1 puede reducir las re-hospitalizaciones y el nivel plasmatico de NT-proBNP, que puede indicar que rhNRG-1 puede proporcionar beneficios a largo plazo en pacientes con insuficiencia cardfaca cronica.

Ejemplo 3: Estudio de supervivencia controlado con placebo, aleatorio, doble ciego y multicentrico de la neuregulina 5 1 humana recombinante en pacientes con insuficiencia cardfaca cronica basado en un tratamiento estandar

Para evaluar la eficacia en la insuficiencia cardfaca cronica de la neuregulina-1 humana recombinante para inyeccion, se llevo a cabo un estudio en fase II, basado en un tratamiento estandar controlado con placebo, multicentrico, doble ciego, en varios centros clmicos en China. Se recluto y distribuyo un total de 351 pacientes con insuficiencia cardfaca cronica estable de Clase III o IV segun la NYHA en el grupo placebo o en el grupo rhNRG-1 10 (0,6 pg/kg). No hubo variaciones significativas en las terapias demograficas o antecedentes entre los grupos. Segun

el programa, a los pacientes se les administro primero el farmaco durante 10 dfas consecutivos en el hospital, despues de finalizar el dfa 11 se les dio el alta del hospital, y se les administro el farmaco una vez a la semana de la 3a semana a la 25a semana como pacientes ambulatorios. Se tomaron muestras de sangre de cada paciente antes del tratamiento (referencia) y en cada seguimiento. Se evaluo el nivel plasmatico de NT-proBNP en el laboratorio con 15 ensayos de NT-proBNP (kit de Biomedica). La informacion sobre la supervivencia se tomo en la 52a semana del estudio.

Producto de investigacion:

Especificacion: Neucardin™, isoforma 132 de la Neuregulina-1 de dominio similar a EGF que comprende un polipeptido de 61 aminoacidos, con el peso molecular de 7054 Dal (1pg=0,14 nmol). 250 pg (5000 EU)/vial (1pg=20 20 EU).

Preparacion: Para inyeccion.

Modo de administracion: Goteo intravenoso o infusion.

Placebo:

25 Especificacion: Excipiente para Neucardin™. (250 pg/vial sin protema neuregulina-1 humana recombinante activa).

Dosificacion y regfmenes:

: Dfa 1-10 Semana 3-25

Dosis: 0,6 pg/kg/dfa rhNRG-1 o placebo 0,8 pg/kg/dfa rhNRG-1 o placebo

Via: Goteo intravenoso Infusion intravenosa

Regimen: 10 horas por dfa durante 10 dfas Infusion de 10 minutos a la semana

Los criterios para la participacion en el estudio incluyeron a pacientes con insuficiencia cardfaca cronica (Clase III o IV de la NYHA) con edades entre 18 y 80 anos, LVEF <40%, en una condicion clmica relativamente estable (que 30 incluye signos y smtomas clmicos, y un tratamiento estandar aceptado para la insuficiencia cardfaca cronica en la dosis diana o dosis de maxima tolerancia de mas de 1 mes). Los criterios importantes de exclusion incluyen infarto de miocardio agudo, cardiomiopatfa hipertrofica, pericarditis constrictiva, enfermedad valvular significativa o enfermedad cardfaca congenita, hipertension pulmonar grave, presion sangumea sistolica <90 mmHg o >160 mmHg, arritmia ventricular grave, cirugfa cardfaca o un evento cerebrovascular dentro de los seis meses previos, 35 claustrofobia o mujeres embarazadas. Todos los pacientes dieron su consentimiento por escrito.

La mortalidad en general en el grupo placebo en la semana 52 es del 15,91%, con 28 muertes en 176 pacientes, mientras que el numero es de 9,71% en el grupo rh-NRG-1, con 16 muertes en 175 pacientes terminado el ensayo (Cociente de riesgo=0,425, 95%CI 0,222-0,813, p=0,0097). Teniendo en cuenta la mortalidad a causa de acontecimientos cardiovasculares, el numero es de 14,77% en el grupo placebo en la semana 52, con 26 muertes 40 en 176 pacientes, y 9,71% en el grupo rh-NRG-1. A partir de los resultados encontramos alrededor del 40% de descenso de la mortalidad en el grupo con administracion de rhNRG-1 en comparacion con el grupo placebo, incluso cuando el grupo placebo manterna su tratamiento estandar previo para la insuficiencia cardfaca cronica.

Tambien se analizo la mortalidad en general en base a la clasificacion de la NT-proBNP de referencia. Cuando el nivel de NT-proBNP se clasifica en tres grupos como <1600 fmol/ml, >1600 fmol/ml y <4000 fmol/ml, o >4000 45 fmol/ml, la mortalidad del grupo rhNRG-1 frente al grupo placebo es 1,49% frente a 8,49%, 8,96% frente a 23,33%, y 26,67% frente a 28,00%, respectivamente. Y si el nivel de NT-proBNP se clasifica como <4000 fmol/ml o >4000 fmol/ml, la mortalidad del grupo de rhNRG-1 frente al grupo placebo es 5,22% frente 14,89% (p=0,0092), y 26,67%

frente 28,00%, respectivamente. Estos resultados muestran una relevancia estadfstica de que rhNRG-1 puede mejorar eficazmente la supervivencia de los pacientes con insuficiencia cardfaca cronica.

Ademas, los pacientes se clasificaron segun su clase de funcion ca^aca de referencia de la NYHA, por ser de la clase III o clase IV. La mortalidad en general de los pacientes de Clase III en el grupo rhNRG-1 o grupo placebo es 5 de 6,06% (8 muertes en 132 pacientes) y 15,49% (22 muertes en 142 pacientes), respectivamente, p=0,0189. Mientras que la mortalidad en general de los pacientes de clase IV en el grupo rhNRG-1 o grupo placebo es de 20,93% (9 muertes en 43 pacientes) y 17,65% (6 muertes en 34 pacientes), respectivamente, p=0,7789.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

REIVINDICACIONES

1. Neuregulina para usar en un metodo para tratar la insuficiencia cardfaca cronica, en donde el metodo comprende:

a) realizar un ensayo del nivel plasmatico de prohormona N-terminal del peptido natriuretico (NT-proBNP) de cada paciente antes del tratamiento; y

b) administrar la neuregulina al paciente cuando el nivel plasmatico de NT-proBNP esta entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml.
2. La neuregulina para el uso de la reivindicacion 1, en donde el nivel plasmatico de NT-proBNP se mide mediante inmunoensayo.
3. La neuregulina para el uso de la reivindicacion 1 o 2, en donde la insuficiencia cardfaca cronica es causada por factores isquemicos, congenitos, reumaticos, idiopaticos, virales o toxicos.
4. La neuregulina para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el metodo comprende ademas administrar al menos un farmaco para la insuficiencia cardfaca.
5. La neuregulina para el uso de la reivindicacion 4, en donde al menos un farmaco para la insuficiencia cardfaca se selecciona de un grupo que consiste en: inhibidores de la ACE, 13-bloqueantes, ARBs, diureticos, y digitalicos.
6. La neuregulina para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el beneficio a largo plazo del metodo se indica mediante el nivel de expresion de un biomarcador para el diagnostico o pronostico de la insuficiencia cardfaca.
7. La neuregulina para el uso de la reivindicacion 6, en donde el biomarcador es NT-proBNP o BNP.
8. La neuregulina para el uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la neuregulina se administra a los pacientes durante un regimen de introduccion.
9. La neuregulina para el uso de la reivindicacion 8, en donde el regimen de introduccion incluye una administracion de neuregulina durante al menos 3, 5, 7 o 10 dfas consecutivos.
10. La neuregulina para el uso de la reivindicacion 8 o 9, en donde la neuregulina se administra a los pacientes durante un regimen de mantenimiento despues del regimen de introduccion.
11. La neuregulina para el uso de la reivindicacion 10, en donde el regimen de mantenimiento incluye una administracion de neuregulina cada 3, 5, 7 o 10 dfas.
12. Un metodo para seleccionar un paciente con insuficiencia cardfaca para tratar mediante neuregulina, en donde el metodo comprende:

(i) realizar un ensayo in vitro del nivel plasmatico de prohormona N-terminal del peptido natriuretico (NT-proBNP) en el paciente antes del tratamiento, y

(ii) decidir si el resultado del ensayo es indicativo para el tratamiento mediante neuregulina, en donde el resultado del ensayo es indicativo para el tratamiento mediante neuregulina cuando el nivel plasmatico de NT-proBNP esta entre 1600 fmol/ml y 4000 fmol/ml.
13. El metodo de la reivindicacion 12, en donde el nivel plasmatico de NT-proBNP se mide mediante inmunoensayo.