CN1715926B - 神经调节蛋白突变体的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了筛选特异性激活ErbB受体的NRG突变体的方法，该方法包括：用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4复合物的三维结构；分子动力学模拟NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的构象和稳定性；MM/PBSA方法计算NRG与ErbB3或ErbB4的结合自由能；丙氨酸理论扫描计算方法确定NRG残基突变成丙氨酸后对NRG与受体亲合性变化，根据该变化确定特异性激活ErbB受体的NRG突变体方法。本发明还提供了NRG突变体、NRG突变体的应用及制备。
Description
技术领域：
本发明涉及特异性激活ErbB受体的NRG突变体、筛选方法及其应用。
背景技术：
神经调节蛋白(Neuregulins，NRGs)及受体ErbBs家族在神经、肌肉、上皮等组织、器官形成过程中细胞信号传导的作用已经有广泛的认识(Lemke，Mol.Cell.Neurosci.7：247-262，1996；Burden et al.，Neuron 18：847-855，1997)。
研究较深入的是NRG-1基因编码的蛋白质，约包括结构相同的15种不同的亚型(Lemke，Mol.Cell.Neurosci.7：247-262，1996 and Peles and Yarden，BioEssays 15：815-824，1993)。NRG-1亚型包括Neu Differentiation Factor(NDF；Peles et al.，Cell 69，205-216，1992及Wen et al.，Cell 69，559-572，1992)，Heregulin(HRG；Holmes et al.，Science 256：1205-1210，1992)，AcetylcholineReceptor Inducing Activity(ARIA；Falls et al.，Cell 72：801-815，1993)，以及glial growth factors GGF1，GGF2和GGF3(Marchionni et al.，Nature 362：312-8，1993)。
用同源克隆方法(Chang et al.，Nature 387：509-512，1997；Carraway et al.，Nature 387：512-516，1997；及Higashiyama et al.，J.Biochem.122：675-680，1997)及基因组方法发现了NRG-2基因(Busfield et al.，Mol.Cell.Biol.17：4007-4014，1997)。NRG-2基因编码的NRG-2亚型包括Neural-andThymus-Derived Activator of erbB Kinases(NTAK；Genbank Accession No.AB005060)，Divergent of Neuregulin(Don-1)以及Cerebellum-Derived GrowthFactor(CDGF；WO 97/09425)。表达ErbB4或ErbB2/ErbB4受体的细胞显示出对NRG-2有较强的应答效应(Pinkas-Kramarski et al.，Mol.Cell.Biol.18：6090-6101，1998)。研究显示NRG-3、NRG-4基因编码蛋白主要结合并激活ErbB4受体磷酸化，但NRG-3对ErbB4受体的生物应答效应较低，而NRG-4则不产生对ErbB4受体的生物应答效应(Zhang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：9562-9567，1997Hijazi et al.，Int.J.Oncol.13：1061-1067，1998；Hobbs et al.，Oncogene.，21(55)：8442-52，2002)。
EGF-like结构域是各种NRG的重要功能域，是NRG结合并激活ErbB受体家族功能域，ErbB家族属于生长因子家族，包括EGFR(或ErbB1)，ErbB2，ErbB3和ErbB4或称为HER1、HER2、HER3、HER4(Meyer et al.，Development 124：3575-3586，1997；Orr-Urtreger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1867-71，1993；Marchionni et al.，Nature 362：312-8，1993；Chen et al.，J.Comp.Neurol.349：389-400，1994；Corfas et al.，Neuron 14：103-115，1995；Meyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：1064-1068，1994；andPinkas-Kramarski et al.，Oncogene 15：2803-2815，1997)。
NRG在各种生命活动有非常重要的作用，除了在神经系统中有重要的作用外(Garratt et al.，Bioessays 22：987-996，2000；Jessen et al.，Microsc.Res.Tech.41：393-402，1998；Jessen et al.，Neurosci.22：402-410，1999；Vartanian et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：731-735，1999；Bermingham-McDonogh et al.，Mol.Cell.Neurosci.10：184-195，1997；Canoll et al.，Mol.Cell.Neurosci.13：79-94，1999)还在心脏发育及功能正常起重要的作用(Meyer et al，Nature 378：386-390，1995；Leeet al，Nature.378：394-398，1995；Gassmann et al，Nature 378：390-394，1995；Liuet al，Proc.Natl.Acad.Sci.，95：13024-13029.1998；Douglas et al，Circulation2002；105：1551-1554以及Crone et al，Nat Med 8(5)：459-465，2002)。NRG在心脏病的治疗有重要的作用(WO00/37095，WO0064400，USPN6444642)。
NRGs与ErbB3或ErbB4受体有较高的结合作用。这种配体-受体的结合导致ErbB3或ErbB4受体与其他ErbB受体形成二聚体，该二聚体激活特定酪氨酸基团磷酸化。研究发现rhNRG在激活ErbB4受体治疗心脏病的同时会激活其它ErbB受体产生副作用。本发明提供了特异性激活ErbB受体的NRG突变体、筛选方法及其应用。本发明提供的特异性激活ErbB受体的NRG突变体可避免激活其它ErbB受体引起的副作用。
发明概述：
本发明提供了筛选特异性激活ErbB受体的NRG突变体的方法，该方法包括：用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4复合物的三维结构；分子动力学模拟NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的构象和稳定性；MM/PBSA方法计算NRG与ErbB3或ErbB4的结合自由能； 丙氨酸理论扫描计算方法确定NRG残基突变成丙氨酸后对NRG与受体亲合性变化，根据该变化确定特异性激活ErbB受体的NRG突变体的筛选方法。本发明还提供了NRG突变体、NRG突变体的应用及制备方法。具体说，本发明提供了特异性激活ErbB3受体的NRG突变体和特异性激活ErbB4受体的NRG突变体以及上述NRG突变体的应用。
附图说明：
图1NRG-1β和NRG-1α的序列联配结果图。
图2(A)ErbB4和EGFR的序列联配结果图：在图中，“*”号，代表等同的残基；“：”，号代表保守的残基取代；“.”代表半保守的取代。联配结果为：等同性，47.7％；相似性，80.9％。(B)ErbB3和EGFR的序列联配结果图：在图中，“*”号，代表等同的残基；“：”，号代表保守的残基取代；“.”代表半保守的取代。联配结果为：等同性，44.9％；相似性，77.1％。
图3(A)NRG-1β(兰)与EGF(红)结构叠合立体图(B)ErbB3(兰)和EGFR(红)结构叠合立体图(C)ErbB4(兰)Cα链与EGFR(红)结构叠合产体图。
图4(A)NRG-1β/ErbB3的PROCHECK图
图4(B)NRG-1β/ErbB4的PROCHECK图
图5 NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4分子动力学模拟Cα(A)RMSD图和(B)RMSF图
图6NRG-1β/ErbB3(A)和NRG-1β/ErbB4(B)带状模型图：在复合物中NRG-1β部分显示为红色；复合物中受体结构域I、II、III和IV分别显示为：兰色、绿色、橙色和灰色。本图由MOLSCRIPT程序制作。
图7ErbB3(绿色)和NRG-1β(红)通过三个作用位点的相互作用图(A)在位点1间的配体/受体相互作用；(B)在位点2间的配体/受体相互作用；(C)在位点3间的配体/受体相互作用。在本图中只列出相互作用于残基的侧链，绿色的点代表氢键。
图8ErbB4(绿色)和NRG-1β(红)通过三个作用位点的相互作用图(A)在位点1间的配体/受体相互作用；(B)在位点2间的配体/受体相互作用；(C)在位点3间的配体/受体相互作用。在本图中只列出相互作用于残基的侧链，绿色的点代表氢键。
图9(A)NRG-1β的Arg31的侧链与ErbB3的Glu131的侧链形成氢键距离在分子动力学过程中的变化(B)NRG-1β的Asn47的侧链与ErbB3的Asp343 的侧链形成氢键距离在分子动力学过程中的变化
图10 NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4 MM-PBSA自由能计算结果表示图，负值的ΔΔGsubtotal表示取代会导致结合能力降低；正值的ΔΔGsubtotal表示取代会提高结合能力。
图11.NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4结合位点附近的MM-PBSA自由能计算对ΔΔGbinding中ΔΔEvdw、ΔΔGnonpolar和ΔΔEele+ΔΔGPB能量分解示意图.图中(o)代表ΔΔEvdw；(▲)代表ΔΔGnonpolar；(●)代表ΔΔEele+ΔΔGPB。(A)为NRG-1β/ErbB3；(B)为NRG-1β/ErbB4。
图12分子动力学模拟的蛋白质Cα的RMSD和RMSF图。(A)NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的RMSD图，(B)NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的RMSF图。
实施发明方式
为清楚公开发明内容而不是限制发明，分以下小节详细说明。
A.释义
除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其他出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。
在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。
在此所用“神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”、“NRG-1”、“NRG-2”、“NRG-3”、“NRG-4”的意思是指与ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3结合，可以激活上述受体的蛋白质或多肽。它能激活上述受体，并调控多种生物反应：如刺激乳腺癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为Schwann细胞；刺激骨胳肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞成活。常见神经调节蛋白可由如NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)编码的蛋白质或多肽。由于在多肽的非功能区域个别氨基酸的改变对其功能无影响(参见Watson等.Molecular Biology of theGene，4th Edition，1987，The Bejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)，这里，NRG也包括保留NRG保守氨基酸序列，但其生物学活性不变的NRG异构体。
在此所用“EGF样结构域”或“epidermal growth factor-like domain”或“EGF-like domain”是指与ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3结合，具有与EGF受体结合区域相同结构的多肽结构，常见“EGF样结构域”可由NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)编码。“EGF样结构域”包括α、β亚型。关于EGF样结构域参见WO 00/64400，Holmes等.，Science，256：1205-1210(1992)；美国专利Nos.5,530,109及5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，13：1061-1067(1998)；Chang等，Nature，387：509-512(1997)；Carraway等，Nature，387：512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochern.，122：675-680(1997)及WO 97/09425。
在此所用“功能片段或类似物”是指神经调节蛋白的功能片段或类似物保留对灵长类疾病的预防、治疗或延缓作用。通常，这些功能片段或类似物至少保留50％对预防、治疗或延缓灵长类疾病的作用，更好的情况下，这些功能片段或类似物至少保留60％，70％，80％，90％，95％，99％或100％预防、治疗或延缓灵长类疾病的作用。
在此所用“erb”指两种癌基因，erb A和erb B，与骨髓成红血细胞增多症病毒相关(一种急性的转化性逆转录病毒)。
在此所用“用于治疗特定疾病的化合物的有效用量”是指足以改善，或是以某种方式减少与该疾病相关的症状的用量。这样的用量可以作为单一剂量或者根据一个配方其可有效的服用剂量。这个用量可能治愈疾病，但是典型的情况是为了改善疾病症状而服用。为达到期望的症状改善，可能需要连续服用。
在此所用“治疗”的意思是使任何状态、不适或疾病的症状得到改善或存在有益变化的方法。治疗也包括其中组合物的任意药物治疗应用。
在此，通过服用特定的药物治疗组合物达到特定不适的症状“改善”是指任何的减轻，不管是永久的还是暂时的，持久的还是短暂，只要该减轻可以归功于或是与服用组合物有关系。
在此所用“重组方法生产”是指使用重组核酸方法的生产方法。本方法是以众所周知、用克隆化的核酸表达所编码的蛋白质的分子生物学方法。
在此所用“互补的”当是指两个核酸分子时，意思是两个核苷酸序列能杂交，优选是低于25％，更优选是低于15％，甚至更加优选是低于5％，最优选是在相对的核苷酸处不存在错误配对。优选在严格条件下，这两个分子杂交。
在此所用决定错误配对百分率的“杂交的严格性”如下规定：
高严格性：0.1xSSPE，0.1％SDS，65℃；
中等严格性：0.2xSSPE，0.1％SDS，50℃；(也指适度严格性)
低严格性：1.0xSSPE，0.1％SDS，50℃；
应理解为使用对等的缓冲液、盐和温度，可以获得相当的严格性。
“载体(质粒)”是指用于将外源DNA导入细胞进行表达或复制的不连续的元件。选择和使用此种载体在这种技术人员的技术范围内是广为人知的。表达载体包括能表达DNA的载体，其DNA有效地与调控序列，例如启动子区域，连接在一起。调控序列能影响该段DNA片段的表达。所以，一个表达载体是指重组DNA或RNA构成物，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其他载体，它们一旦导入适当的宿主细胞中，导致克隆的DNA表达。合适的表达载体对本领域的技术人员而言十分清楚，并且包括能在真核细胞和(或)原核细胞中复制的载体以及保持游离态或整合进宿主细胞基因组的载体。
在此所用“启动子区域或启动子元件”是指控制与其有效连接的DNA或RNA的转录DNA或RNA片段。启动子区域包含足以让RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列。启动子区域的这一部分是指启动子。并且，启动子区域还包括调节RNA聚合酶识别、结合和转录起始活动的序列。这些序列可以是顺式作用因子或对反式作用因子作出响应。依据调节的性质，启动子可以是组成型的或调节型的。考虑用于原核生物的典型的启动子包括噬菌体T7和T3启动子和相似的启动子。
在此所用“有效连接和有效结合”是指核苷酸效应序列和调节序列，例如启动子、增强子、转录和翻译终止位点和其他信号序列与DNA间的功能关系。举例而言，DNA和启动子的有效连接是指DNA和启动子间的物理和功能关系，该关系使专一识别、结合和转录该段DNA的RNA聚合酶能够从启动子处起始该段DNA的转录。为便于优化表达和(或)体外转录，有必 要去掉、增加或改变克隆的5′不翻译部分，以便消除多余的、潜在不适当替代性翻译起始密码子或其他不论是在转录或翻译水平上干扰或减少表达的序列。其他方法还有将核糖体结合位点共有序列紧接起始密码子的5′插入，可以增强表达。(参考实例，Kozak，生物化学杂志(J.Biol.Chem.，266：19867-19870(1991)。
B.筛选特异性激活ErbB受体的NRG突变体的方法
本发明提供了筛选特异性激活ErbB受体的NRG突变体的方法，该方法包括：用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4复合物的三维结构；分子动力学模拟NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的构象和稳定性；MM/PBSA方法计算NRG与ErbB3或ErbB4的结合自由能；丙氨酸理论扫描计算方法确定NRG残基突变成丙氨酸后对NRG与受体亲合性变化，根据该变化确定特异性激活ErbB受体的NRG突变体的筛选方法。
C.NRG突变体及其制备
本发明涉及编码NRG突变体的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点25突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点35突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点46突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点16突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点29突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点31突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点33突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点47突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。
核酸片段可以适当的形式存在。例如，分离的核酸片段包括DNA、RNA、PNA或其衍生物。此外，分离的核酸片段可以包含DNA和RNA或其衍生物。分离的核酸片段能够是单链形式并且适合杂交分析。另外，分离的核酸片段也能够是双链形式并在杂交分析前变性成单链结构。
分离的核酸片段可以包括包含遗传密码和(或)自然发生结构的任何一种寡聚核苷酸或核酸链。分离的核酸片段能够包括非自然结构，例如非自然碱基，例如次黄嘌呤和黄嘌呤，非自然糖类，例如2’-甲氧基核酸，或非自然磷酸二酯键，例如甲基膦酸酯、偶磷酯和多肽。
分离的核酸片段能用任何适合的方法产生。例如，分离的核酸片段由化学合成(参见，Ausubel，分子生物学流行方法(Current Protocols in MolecularBiology)，2.11.寡核苷酸的合成和纯化(Synthesis and purification ofoligonucleotides)，John Wiley & Sons公司(2000))，自然物中分离，由重组方法产生或由上述方法结合产生。优选地，用重组方法产生分离的核酸片段。
本发明还提供了包括上述核酸片段的质粒。同时，提供了包括上述质粒的细胞，包括任何适合的细胞，例如，细菌细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞和人细胞。
本发明涉及生产NRG突变体的方法，该方法包括培养表达NRG突变体的细胞，以及回收表达的NRG突变体。
本发明涉及NRG突变体的蛋白质或肽，NRG突变体包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点25突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点35突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点46突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点16突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点29突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点31突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点33突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点47突变成丙氨酸的氨基酸序列的蛋白质或肽。任何一种合适的方法能产生NRG突变体。例如，NRG突变体能化学合成、从自然材料中分离、用重组方法产生或由上述方法结合生产。优选地，用重组方法生产NRG突变体。
本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包括分离的核酸片段和药学上可以接受的载体或赋形剂，该核酸片段编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点25突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点35 突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点46突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点16突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点29突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点31突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点33突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。编码NRG突变体的核苷酸序列包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点47突变成丙氨酸的氨基酸序列的核酸片段。包括编码的氨基酸序列所对应的核苷酸序列或其互补链。
本发明涉及一种药物组合物，该药物组合物包括基本上纯化的蛋白质或肽和一种药学上可接受的载体或赋形剂，该蛋白质或肽包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点25突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点35突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点46突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点16突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点29突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点31突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点33突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点47突变成丙氨酸的氨基酸序列的蛋白质或肽。
D.NRG突变体的应用
在本发明中，特异性激活ErbB受体的NRG突变体，通过专一性激活ErbB2/ErbB4受体或专一性激活ErbB2/ErbB3受体途径预防、治疗或延缓哺乳动物疾病。
本发明中，筛选的NRG突变体在制备特异性激活ErbB2/ErbB3受体药物的应用。本发明中，筛选的NRG突变体在制备特异性激活ErbB2/ErbB4受体药物的应用。
本发明中，特异性激活ErbB受体的NRG突变体能用于预防、治疗或延缓任何哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔子、猫、狗、猪、奶牛、牛、绵羊、山羊、马和灵长类动物。
本发明中，哺乳动物疾病包括发生在骨、耳、眼睛、眼睑、头颈部、心脏、喉、下颚、下颚外侧髁、上颌骨、嘴、鼻咽、鼻子、口腔、胰腺、腮腺、耳廓、垂体、前列腺视网膜、唾液腺、皮肤、肌肉、脊髓、甲状腺、扁桃腺、神经系统、呼吸系统、消化系统、循环系统、生殖系统、泌尿系统、内分泌系统、心血管疾病、造血系统的疾病。
在本发明中，特异性激活ErbB2/ErbB3受体的NRG突变体，通过专一性激活ErbB2/ErbB3受体途径，预防、治疗或延缓哺乳动物神经系统疾病，其中神经系统疾病包括中枢神经系统疾病、周围神经系统疾病、脊髓疾病、脑膜疾病、脱髓鞘性疾病、锥体外系统疾病。这里特异性激活ErbB2/ErbB3受体的NRG突变体包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点25突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点35突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点46突变成丙氨酸的氨基酸序列，的蛋白质或肽。
在本发明中，特异性激活ErbB2/ErbB4受体的NRG突变体，通过专一性激活ErbB2/ErbB4受体途径，预防、治疗或延缓哺乳动物心脏病。这里特异性激活ErbB4受体的NRG突变体包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点16突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点29突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点31突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点33突变成丙氨酸的氨基酸序列，包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点47突变成丙氨酸的氨基酸序列的蛋白质或肽。本发明中，特异性激活ErbB2/ErbB4受体的NRG突变体，可预防、治疗或延缓哺乳动物心脏病如人的心力衰竭、心肌梗塞、扩张型心脏病及心肌炎。
NRG突变体用于预防、治疗或延缓哺乳动物疾病的配方、剂量和给药途径，尤其作为药物组合物时，可根据本技术领域所知的方法加以确定。(参见，例如，雷明顿：药剂学科学与实践(Remington：The Science and Practice ofPharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编者)，Mack出版社，1997年四月；治疗用肽和蛋白：配方、加工和传递系统(Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems)，Banga，1999；和肽和蛋白制药配方的发展(Pharmaceutical Formulation Development of Peptides andProteins)，Hovgaard和Frkjr(编者)，Taylor & Francis公司，2000；脂质体的 医学应用(Medical Applications of Liposomes)，Lasic和Papahadjopoulos(编者)，Elsevier Science，1998；基因治疗教程(Textbook of Gene Therapy)，Jain，Hogrefe & Huber出版社，1998；腺病毒：基因治疗的基本生物学(Adenoviruses：Basic Biology to Gene Therapy)，15卷，Seth，LandesBioscience，1999；生物制药的药物设计和发展(Biopharmaceutical Drug Designand Development)，Wu-Pong和Rojanasakul(编者)，Humana出版社，1999；治疗学上的血管发生：从基础科学到临床(Therapeutic Angiogenesis：FromBasic Science to the Clinic)，28卷，Dole等(编者)，Springer-Verlag New York，1999)。NRG突变体可配制成用于口服，直肠给药，局部用药，吸入法用药，口腔用药(例如舌下)，注射用药(例如，皮下的，肌内的，皮内的，静脉的)，经皮给药或其他适合的给药途径。在任何给定的情况下，最合适的给药途径将取决于要治疗情况的性质和严重程度以及所用的特定NRG突变体的性质。优选地，本发明中NRG突变体通过静脉注射给药。
NRG突变体能够单独使用。优选的方式是，NRG突变体与药物治疗上可接受的载体或者赋形剂共同使用。任何合适的药物治疗可以接受的载体或者赋形剂能用于本方法中(参见，例如，雷明顿：药剂学科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编者)，Mack出版社，1997年四月)。
根据本发明，无论单独或是与其它药剂、载体或赋形剂联合使用的NRG突变体或者编码NRG突变体的核酸，可以系统用于任何的给药途径，诸如海绵体内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、皮内注射、口服或局部用药。本方法可以使用以单位剂量形式、一次用量针剂或多剂量容器的含有添加的防腐剂的注射制剂。该配方可以采用油质或水质赋形剂中的悬浊液，溶液或乳浊液形式并且可以包含配方试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。活性成分也可以是粉状，以便在使用前与适合的载体、无菌不含热源的水或其他溶剂混合。本发明的局部用药可以采用泡沫状物、凝胶体、霜、药膏、透皮药膏或软膏。任何适合给药途径可以使用。剂量形式包括片剂、锭剂、扁囊剂、分散体、悬浊液、溶液、胶囊、药膏和类似形态(参考，雷明顿氏药物治疗科学)。优选地，本发明中NRG突变体或者编码NRG突变体的核酸是冻干粉方式。
治疗或预防中药物治疗剂量的大小将随治疗的状况的严重程度和给药途径变化。剂量和剂量频率根据病人自身年龄、体重、疾病状况和反应而变化。
主治医生应当知道怎样和何时由于药物毒性或不利的效应终止、中断或将治疗调整到低剂量。相反地，医生应当知道怎样和何时由于临床效应不足(排除了毒性副效应)，将治疗调整到高水平。
在实际应用中，无论单独或是与其它药剂联合使用的NRG突变体可以根据传统药物治疗混合技术作为活性成分与诸如β-环糊精和2-羟基-丙基-β-环糊精的药物治疗载体或赋形剂形成紧密添加混合物。载体根据期望使用方式，局部或注射用药，采取多种配制形式。在制备用于注射剂的组合物时，例如静脉注射或静脉灌输，相同的制药介质可以使用，水、乙二醇、油、缓冲液、糖、防腐剂、脂质体和其他具有本技术领域技能的人所知的介质。注射组合物的实例包括，但不限于，5％w/v的葡萄糖、正常生理盐溶液或其他溶液。待给药的NRG突变体总剂量可以在一小瓶含有体积从1毫升到2000毫升的静脉内液体中使用。根据所用总剂量，稀释液体体积将有所变化。
实施例 筛选特异性激活ErbB受体的NRG突变体
1.方法
NRG-1β的EGF样域能结合并激活受体执行生物功能。在本研究中，为了简化模型，配体选择NRG-1β的EGF样域(NRG-β177-229，残基1-52)，下面简称其为NRG-1β。由于目前缺乏NRG-1β和受体ErbB的三维结构信息，因此有必要用理论预测方法构建出它们的蛋白质三维结构，从而在微观上研究其配体/受体相互作用。另外，目前为止，在理论生物学研究上运用同源模建、分子动力学模拟和自由能计算在原子水平上研究蛋白质/小分子配体或者蛋白质/蛋白质相互作用已经有很多成功的例子12-17。同源蛋白模建方法在预测蛋白和模板蛋白序列同源性高于30％时可准确地构建预测蛋白的三维结构，而分子动力学方法可用于模拟蛋白质/小分子配体或者蛋白质/蛋白质在溶液中的构象变化15。而且，近年来，一种新的理论研究方法-MM/PBSA(the Molecular Mechanics Poisson Boltzmann Surface Area)，由于其同时兼有快速的计算和准确的结果两大优点引起了众多计算生物学家的注意并在研究中得到广泛的应用18-21。这种方法结合了用于连续溶液方法计算溶剂的分子力学能量和正则模式分析估计整个体系的自由能，它通过计算各个终态的自由能而无需考虑模拟中间状态，从而极大地减小了计算量。众所周知，丙氨酸扫描实验可以研究实验上配体与受体作用界面上残基对复合物中配体与受体亲合性的贡献。而基于MM/PBSA方法，丙氨酸扫描理论计算方法可以从 理论预测突变点残基对配体/受体结合的贡献，这种方法已经被应用于研究工作并取得了极大的成功21，22。
由于ErbB家族胞外区具有很高的序列同源性，如表3.1。因此，在本章的研究中，NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4复合物三维结构的构建是以EGF/EGFR复合物晶体结构(PDB号：livo)23和NRG-1α的NMR结构(EGF样域，PDB号：1haf)24作为模板结构。MM/PBSA方法用来分别估算NRG-1β与ErbB3或ErbB4的结合自由能。另外，丙氨酸理论扫描计算方法用来研究NRG-1β每一个残基突变成丙氨酸后对NRG-1β与受体亲合性变化情况。从而建立一个关于NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的理论模型，为下一步设计增加NRG-1β对ErbB4选择性结合的研究提供有意义的指导。
表3.1 ErbB家族间胞外区序列同源性比较图
3.3结果和讨论
3.3.1 ErbB3和ErbB4与NRG-1β三维结构的构建和评估
3.3.1.1 ErbB3和ErbB4三维结构的构建
通过Fasta和Blast搜索到与ErbB3或ErbB4序列同源性较高的蛋白结构主要有：ErbB家族中无配体的ErbB3晶体结构(pdb号：1m6b)25、未激活的EGF/EGFR晶体结构(pdb号：1nql)26以及人类表皮生长因子及其受体胞外区(EGF/EGFR)X射线晶体结构(PDB号：livo)23。虽然ErbB家族中无配体的ErbB3晶体结构具有与ErbB3完全一致的序列，但是，经配体活化后的含配体的ErbB3具有与之完全不同的构象。而在本章我们研究ErbB3或ErbB4与其配体NRG-1β间的相互作用，因此，综合上面因素，我们选取了EGF/EGFR的X射线晶体结构(PDB号：livo)23作为ErbB3和ErbB4模板结构。ErbB3、ErbB4和EGF的序列取自于Swiss-Prot/TrEMBL数据库。
在ErbB家族中，它的胞外区结构分为四个结构域(I-IV)。其中结构域II和结构域IV是半胱氨酸区，分别含有24和21个Cys27。由于在EGFR的晶体结构，由残基513-619的结构域IV是一个无序的结构。因此，在我们进行同源模建结构时不包含这个区域。所有的序列联配都是用InsightII的Homology模块分别对ErbB3和EGFR、ErbB4和EGFR与NRG-1β(NRG-β177-229)和NRG-1α序列联配后产生。具体参数为：Gap Penalty为6；Gap length Penalty为1.65。NRG-1β以NRG-1α的NMR结构为模板结构，而ErbB3和ErbB4以上述的EGFR晶体结构为模板结构。所有在模板结构中存在缺失原子的残基均用Sybyl的Biopolymer补齐其缺失的原子。在模板结构EGFR中几个与配体EGF残基存在疏水作用的关键残基Leu69、Leu98、Val350、Asp355和Phe357在ErbB3和ErbB4中均设定为保守残基23，27；另外，构成EGFR中甘氨酸堆积的残基(结构域I的39、63、85和122位及结构III中的343、379、404和435位)在ErbB3和ErbB4中也设定为保守残基；最后，在所有的模板中，构成二硫键的Cys设定成保守残基。最终的NRG-1β和NRG-1α的序列联配结果如图1、ErbB3和EGFR及ErbB4和EGFR联配结果如图2(A)和(B)。如图2，ErbB3的序列(残基8-511)、ErbB4的序列(残基25-533)与晶体结构EGFR(残基3-512)的序列同源性分别为44％和48％，而两者的序列相似性则高达约80％。构建好后ErbB3、ErbB4结构与EGFR模板结构的RMSD分别为 
和 
，如图3(B)、(C)所示。
3.3.1.2NRG-1β三维结构的构建
NRG-1β(NRG-β177-229，下文将其序号从1开始)以NRG-1α的NMR结构(EGF样域，PDB号：1haf)24为模板结构。NRG-1β、NRG-1α的序列取自于Swiss-Prot/TrEMBL数据库，它们间的序列同源性高达80％，如图1。由于NRG-1α的NMR结构中C末端(残基51-63)是一个柔性大的无序结构，而有研究表明28，NRG-1β的残基1至50就已能维持与受体结合并激活受体的正常生物功能。因此，在本章的研究中，我们选取了NRG-1β的剪切体(残基1-52)作为研究模型。从结构上看，它的N末端包括三条β折叠和一个α螺旋区以及C末端上有一个短的β折叠。同时，整个结构通过形成六个Cys形成三对二硫键(Cys6-Cys20、Cys14-Cys34和Cys36-Cys45)。
3.3.1.3 NRG-1β/ErbB复合物三维结构的构建
在NRG-1β、ErbB3和ErbB4最初的模型分别建立后，重要的一步是NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4复合物结构的构建。由于缺乏NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4复合物结构信息，因此，这两个复合物结构的构建以EGF/EGFR晶体结构为模板。从三维结构上看，NRG-1α的EGF样结构域与EGF/EGFR复合物中配体EGF的结构非常的相似，因而在我们研究NRG-1β结构与EGF结构极其相似，RMSD为 
如图3(A)。因此，复合物结构的构建是将NRG-1β结构重叠入EGF/EGFR中EGF结构的位置， 也即位于ErbB3或ErbB4的结构域I和结构域III之间，这与实验报道29认为NRG-1β与ErbB3发生作用的位点位于结构域I和III的结果相一致。同时，定点突变实验表明NRG-1β的N末端和C末端区域对于配体与受体的结合是极其重要的28。由于这两个区域在结构上相互距离很远，也即NRG-1β/ErbB之间的作用是多个区域联合作用的，这与同源模建得到的复合物结构结果是一致的。虽然NRG-1β结构与EGF结构非常相似，但它们结构上一个环区(NRG-1β中是残基21-33、EGF中是残基21-30)存在较大差别。但是，有实验证明当NRG-1β上的残基21-33被EGF上的残基21-30代替对它的配体/受体结合能力及激活受体磷酸化能力没有任何影响28。综上所述，NRG-1β与EGF结构上伸出的环区结构的不同对于构建复合物结构并不影响配体/受体的作用。因此，我们分别构建了NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的复合物结构。
3.3.1.4 ErbB3、ErbB4、NRG-1β及其复合物三维结构的评估
同源模建方法建立的结构必须经过一些方法对其结构进行检验以证明其结构的可靠性。所有的结构均经PROCHECK和Profiles-3D程序检验理论模建所得结构的立体化学及蛋白质结构的正确性。
(1)Profiles-3D相容性评估
在Profiles-3D的结构评估中，它对蛋白质中每一个残基进行相容性打分的测试。结果为表3.2。最后可以看出Profiles-3D评估得到了较好的结果。从表中可以看出，我们建立的这些结构的蛋白的相容性得分是相当高的，这说明了这些结构在溶液环境中相容性是很好的。
表3.2 ErbB3和ErbB4结构的Profiles-3D的结构评估结果表
PROCHECK立体化学评估
表3.3 NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4三维结构PROCHECK Ramachandran表
由于复合物结构是我们最终需要的结构，在这里我们仅对复合物结构进行评估，PROCHECK评估结果列于表3.3和图(A)和(B)。PROCHECK主要通过Ramachandran图分析蛋白质结构的立方化学性质(如主链的Ф和ψ角度)的合理性，以及通过将蛋白质划分成“有利区域”、“附加的可接受区域”、“一般情况下可接受区域”和“不利区域”四种区域，然后通过统计蛋白质中除甘氨酸和脯氨酸外残基位于不同区域的百分数以描述蛋白质结构的优劣。从结果上看，对于NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4复合物结构来说，位于“有利区域”和“可接受区域“的残基百数分别占96.2％和97.5％。而G因子，NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB的分别为-0.23和-0.18。对G因子来说，一般认为高于-0.5，蛋白质结构的立体化学性质是相当合理的。同时，从键长分析上看，100％的键长均符合正常范围；从键角分析上看，对NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4这一数字分别为97.7％和97.9％；从二面角分析上看，对NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4这一数字分别为94.1％和93.4％。通过立体化学验证，说明我们所建立的NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4结构是相当合理的。
综上所述，通过Profiles-3D相容性评估和PROCHECK立体化学评估，我们建立的NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4结构具有相当的准确性，它不仅在蛋白质结构上是合理的，而且它能初步反映一些实验信息，是基于知识的结构模建的结果，可以为我们下一步的分子动力学模拟和自由能计算提供一个良好的起点。
3.3.2、分子动力学模拟
在理论构建出复合物结构基础上，我们通过Sybyl6.8软件包用Amber力场进行能量最小化以优化结构。优化策略如下：先优化蛋白质结构的H原子，固定其它所有原子；接着优化所有的侧链原子，固定主链原子；再接着固定 保守区原子，优化结构变异区原子；最后，优化所有原子至收敛。能量最小化过程中用到的参数如下：Kollman-united-atom力场，非键cutoff为9.5A，介电常数为4.0，最后优化的模型用以做分子动力学模拟的初始点。
3.3.2.1 分子动力学模拟方法及策略
为了考察蛋白的构象变化以及配体与受体作用时的动态信息，我们采取了分子动力学方法来进行研究。分子动力学是在分子力学的基础上发展起来的，它采用牛顿第二运动方程来描述原子核的运动，所有电子的运动以及电子运动对核运动的影响都被忽略。整个分子动力学的计算流程如下：
●确定体系所有粒子的初始坐标 
和 
这里 
通常都是按照体系的初始温度根据波尔兹曼分布赋值。
●采用特定的力场参数和能量评价函数从 得到体系的势函数，由此计算每个粒子上的 再根据牛顿运动方程计算每个粒子的加速度 
●运用牛顿第一运动方程由 
积分计算 
●用 
作为输入，计算再下一步的 
不断重复上述2-4步骤。
在我们的模拟中，采用AMBER7.0分子动力学程序，全部蛋白质复合物的分子动力学模拟均通过AMBER7.0软件包及Parm99力场模拟。模拟中用TIP3P水来模拟蛋白质溶液环境；与氢原子相连的键都采用了SHAKE算法进行了限制；整个复合物结构外包10A的水，以保证复合物中任一原子离模拟系统盒子的边界至少10A；对于带电体系，加入适量的离子以中和整个体系；PME方法用以计算长程静电相互作用。所有的动力学模拟均基于下列同样的方法：首先，所有复合物原子先用最陡下降法进行200步的优化，然后接着用共轭梯度法优化，以达到最后对整个复合物-水体系优化500步。对于两个复合物体系的总原子数及其盒子的大小列表3.4中。
表3.4分子动力学模拟中体系的条件的描述
优化后的结构用以分子动力学模拟。整个体系分三个阶段在150ps从0K逐步升温300K，然后在300K平衡25ps，然后再进行数据采集，总的模拟过程对于NRG-1β/ErbB3进行了1100ps，对NRG-1β/ErbB4/进行了900ps。对于非键的cutoff设定为8A，非键相互作用设定为每25步更新一次。SHAKE 方法用以限制包括H原子内的共价键原子。每个模拟都应用Berendsen算法在300K和1.0个大气压下进行。对于温度浴和压力浴参数分别设定为0.2ps和0.05ps。进行分子动力学模拟的每一个步长定为2fs。在能量最小化和分子动力学模拟过程中，在各个方向上用周期性的边界条件。每个蛋白质的分子动力学的初始位置(t＝0ps)用以作研究模拟体系的稳定性及可能的结构涨落的Cα的RMSD的基准点。所有的模拟都在中国科学院上海药物研究所药物发现与设计中心的SGI3800和SGI3200上完成。
3.3.2.2 分子动力学模拟结果和讨论
对于分子动力学模拟后蛋白质结构的RMSD，见图5。在图中可以明显看到在轨迹的前100ps RMSD很快的上升，然后倾向于平衡。这些RMSD曲线的变化幅度，在数据收集阶段并没有太大变化，这表明这两个体系已经趋向于平衡。在NRG-1β/ErbB4体系中，经过前400ps的平衡后，它的平均RMSD约为 
而在NRG-1β/ErbB3体系中，这一数值为 
同时，对RMSF的分析表明，一方面，RMSD变化比较大的主要在末端及远离配体/受体作用位的结构域II，而配体/受体作用位点的变化比较小；另一方面，同RMSD变化的趋势相同，NRG-1β/ErbB3体系的RMSF的变化要大于NRG-1β/ErbB4体系。从分子动力学运动轨迹中各残基变化的幅度可以看出，在NRG-1β/ErbB3体系(残基243-256)和NRG-1β/ErbB4体系(残基265-278)构象变化的幅度较大。从无配体的ErbB3晶体结构上看，这些残基是结构域II中伸展开来20个A的β发夹式结构的一部分。在EGFR家族中，这个β发夹式结构是高度保守，不仅起着连接结构域II和结构域IV的作用，而且在受体/受体相互作用中起着重要作用23，25，26。由于我们选择经过剪切的配体受体1∶1作为我们的复合物模型RMSF，这个模型缺乏受体/受体相互作用导致缺乏结构域II和结构域IV的相互作用，因而在我们的模拟模型中，这个区域的RMSF比较大些。但是，整个结构的分析表明，我们的模型在分子动力学模拟过程中，结构上并没有很显著的变化，仍然保持一个比较稳定的结构。计算的步长为1ps。对于分子动力学模拟后配体与受体的相互作用用LIGPLOT程序来描述。
四、配体-受体相互作用
在我们研究的NRG-1β/ErbB这两个体系中，它们和EGF/EGFR类似，它们的配体/受体相互作用主要在三个位点存在(如图6)。其中，NRG-1β的残基20-35和Leu3与受体相互作用主要发生在受体结构域I的位点1；而NRG-1β的残基10-19和Arg44与受体相互作用主要发生在受体结构域III的 位点2；最后，NRG-1β在Tyr48后的C-末端残基与受体相互作用主要发生在受体结构域III的位点3。NRG-1β的这些残基通过各种各样的静电、疏水和氢键相互作用与受体结合。
在配体/受体相互作用的氢键作用分析中，我们主要列出了ErbB3/NRG-1β和ErbB4/NRG-1β配体受体间侧链形成的氢键。这些氢键主要列于表3.5。从表上可以看出，无论哪一个体系，NRG-1β上的Arg44和Tyr48(Arg41和Arg45在EGF中)都与受体有很强的氢键相互作用23，30。在氢键分析中可以看出，NRG-1β的Arg44分别与ErbB3的Asp352和ErbB4的Asp376形成盐桥。因此，如果将Arg44突变成Ala的话，将导致NRG-1β与ErbB3或ErbB4的结合活性显著下降。
NRG-1β的Arg44与ErbB3的Asp352的侧链存在氢键作用；而Tyr48则与Asn379的侧链存在氢键作用。而从图8来看，NRG-1β的Arg44与ErbB4的Asp376的侧链存在氢键作用；而Tyr48则与Asn403的侧链存在氢键作用。
除了氢键，如表3.5A，在配体NRG-1β和受体ErbB3或ErbB4的位点1、2和3中存在着广泛的疏水相互作用。
在ErbB3/NRG-1β复合物中，在位点1，ErbB3的Val47、Leu48、Met72、和Leu102的侧链原子和NRG-1β的Leu3、Val23、和Leu33存在较强的疏水作用(如图7A)。如图7B，在位点2中，ErbB3的结构域III的Trp354和NRG-1β的Phe13和Tyr32形成疏水作用。进一步，NRG-1β的Arg44的长且非极性的的侧链也与Trp354的侧链也有一定疏水作用。在位点3中，如图7C，ErbB3的结构域III的Tyr405，Phe409和Ile413与NRG-1β的Tyr48周围的残基形成一个大的疏水腔。
在ErbB4/NRG-1β复合物中可看到相似的疏水作用，作为这些疏水作用的结果，在ErbB4/NRG-1β的界面中形成了三个疏水腔。在图8A中，NRG-1β的Leu3，Val23和leu33的侧链与ErbB4的结构域I的位点1的Leu36，Leu91和Leu121的侧链构成第一个疏水腔。在图8B、8C中，NRG-1β的Phe13，Val15和Tyr48周围的残基分别于ErbB4的结构域III的位点2、位点3分别以相似的作用形成了另两个疏水腔。所有这些通过这两个模型的而得到的相互作用均与对NRG-1β和ErbB3及ErbB4的定点突变实验相吻合30，31。
表3.5配体NRG-1β和受体ErbB的氢键和疏水作用列表：(A)NRG-1β/ErbB在整个分子动力学模型过程中的氢键列表(图中黑体部分为NRG-1β形成氢键的残基，仅列出NRG-1β通过侧链形成氢键的残基；平均距离为整个动力学过程所有结构该氢键的平均距离(B)配体NRG-1β和受体的疏水作用列表
(B)配体NRG-1β和受体的疏水作用列表
3.3.3 NRG-1β与受体ErbB的MM-PBSA自由能计算
3.3.3.1方法
MM-PBSA是一个新发展起来的自由能计算方法，MM-PBSA/GBSA即用MM(Molecular Mechanics)，分子力学的方法计算配体和受体之间的静电和范德华相互作用能，用PB(Poisson-Boltzman)，泊松玻尔兹曼方程或GB(General Born)，波恩方程求溶剂化自由能的静电作用贡献32，33，用SA(solvent-accessibility surface areas)和疏水自由能之间的经验关系求溶剂化自由能中的疏水作用贡献34，35，从而得到配体和受体的结合自由能，如式1、2。
ΔGbind＝<Emm>+ΔGPB+ΔGNP-TS (1)
ΔGbind＝ΔGcomplex-[ΔGreceptor+ΔGligand] (2)
许多研究都表明MM-PBSA法可以有效地计算分子间的结合自由能，利用谐振子模型估算熵的条件下也可以较好地给出分子的绝对结合自由能。但是需要指出的是在对熵的估算还是非常粗略的。虽然这些近似的方法不如自由能微扰法那么严格，但是它们可以快速的大量地对分子的结合自由能进行排序和估算，大大加速药物分子的设计和发现过程。
在NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4研究体系中，我们采用的策略具体如下：首先，从分子动力学运动轨迹中每4ps取一个结构(snapshot)，总计从平衡后的400ps中取100个结构；然后，运用AMBER7.0的MM-PBSA模块中的delphi程序计算自由能。蛋白质的每一个结构通过上面方法取出后，然后计算出每一个复合物和受体、配体的自由能差值。由于在我们研究中，NRG-1β的突变体和野生型的NRG-1β的差别只有一个残基，因此，我们假设熵的影响对于不同NRG-1β突变体是相差很小的。从以前Massova和Kollman的计算人类p53的一个12肽和它的突变体的TΔS结果表明，这种假设是可行的36。因此，在下列的研究中，我们用不含TΔS的ΔG来估计不同NRG-1β突变体和ErbB3及ErbB4的结合能力的不同。因此，我们对NRG-1β的52个残基(除了N末端的Ser1、所有的Gly和保持蛋白质结构的形成二硫键的Cys)用MM-PBSA方法研究其每个残基对NRG-1β与受体的结合能力的贡献。
3.3.3.2结果与讨论
3.3.3.2.1配体/受体结合位点附近MM-PBSA自由能计算
表3.6分别列出了结合界面附近残基突变后NRG-1β与ErbB3和ErbB4的结合自由能的各能量项。表3.7列出了运用丙氨酸扫描的计算方法计算NRG-1β中约所有除Gly、Cys、Ala和Pro外共38个残基的突变分别对NRG-1β与ErbB3和ErbB4结合的影响。ΔΔGsubtotal值越负代表该取代会导致配体和受体的结合更弱。另一方面，也就是说ΔΔGsubtotal为正值的代表将该残基突变成Ala后NRG-1β突变体与受体的结合将增强。同时，图10也描述了运用丙氨酸扫描的计算方法对这两个体系的研究结果。从表3.7和图10可以看出，NRG-1β的几个位置的突变同时极大地减少了它与ErbB3或ErbB4的结合能力，尤其是在44、48和50位的突变。从图7A和表3.5A上可知，NRG-1β的Arg44与ErbB3的Asp352的侧链存在氢键作用；而Tyr48则与Asn379的侧链存在氢键作用。而从图8B和表3.5A来看，NRG-1β的Arg44与ErbB4的Asp376的侧链存在氢键作用；而Tyr48则与Asn403的侧链存在氢键作用。同时从ΔΔEele项可以看出，NRG-1β的Arg44和Tyr48结合能中主要成分来自于静电相互作用，因此，当这两个残基被非极性的Ala取代时，其NRG-1β突变体与受体结合的能力被严重削弱了。另外，从ΔΔEvdw上和表3.5B可以看出，Tyr48和Met50突变后结合能力降低的原因可能是范德华作用的急剧减小。同时，配体和受体的疏水相互作用包含了这些基团，这些结果和实验上的定点突变结果相当的一致30。理论预测的结果的可信性不仅验证了同源建模构建的蛋白质结构的可靠性，而且它为从原子水平上提供了更多实验上无法得到结构信息。从上述结果上看，Arg44、Tyr48和Met50的Ala的突变对配体和受体的结合是不利的。
前面生物背景部分讲到，NRG-1β通过与ErbB4的结合可以加强成人心肌细胞中的肌原组织、显著地提高或者保护心肌、避免心肌进一步恶化。因此，这些能提高NRG-1β与ErbB4结合的选择性的突变具有更大的意义。从表3.7和图10并结合实验信息30可以看出，属于这类的NRG-1β突变主要在31、47位的突变。从表3.5A上可知，NRG-1β的Arg31的侧链与ErbB3的Glu131的侧链存在很强的氢键作用；NRG-1β的Asn47的侧链与ErbB3的Asp343和Tyr405的侧链存在氢键作用。为了从动态上研究分子动力学过程中NRG-1β的Arg31和Asn47的氢键，我们对其氢键距离随动力学过程的变化作图。如图9A，可以看出，与ErbB3结合时，NRG-1β的Arg31的NH1和NH2分别与Glu131的OE1和OE2形成了一个很强的氢键网络，而这种 的氢键网络在NRG-1β与ErbB4结合时并不存在(在与ErbB4结合时，NRG-1β的Arg31对结合的贡献几乎可以忽略)。而对NRG-1β的Asn47来说，它的情况与Arg31类似。如图9B，Asn47的ND2和ErbB3的Asp343的侧链形成两根较强的氢键，另外它还与Tyr405形成一根较弱的氢键；而对它与ErbB4结合时，NRG-1β的Asn47仅参于了部分的疏水作用。因此，当这两个残基分别被非极性的Ala取代时，其NRG-1β突变体与受体ErbB3结合的能力被严重削弱了，而与受体ErbB4结合能力变化并不大30。
表3.6(A)NRG-1β/ErbB3的MM-PBSAa自由能计算结果例表
(B)NRG-1β/ErbB4的MM-PBSAa自由能计算结果例表
a上述表所列值单位为kcal mol-1；
b差值(Delta)＝Contribution(复合物)-Contribution(受体)-Contribution(配体)；
c400个结构的平均值(mean)；
d平均值的标准偏差(Std)。
表3.7.NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4结合位点附近的MM-PBSA自由能计算结果(ΔΔGsubtotal ＝ΔGwildtype-ΔGmutant)
为了进一步研究每一个残基的Ala突变后对结合能的影响，我们分析了每一个突变后的分子内的范德华作用和静电相互作用的变化。在MM-PBSA计算结果中，大多数情况下的分子内的静电能的变化和溶剂化能的变化相反。因此，综合考虑ΔΔGele和ΔΔGPB是非常重要的。从图11上看，ΔΔGnonpolar相对于自由能中其它能量项的变化来说几乎可以忽略不计。自由能中ΔΔEvdw 项大多为负，这表明进行Ala定点突变后，它与野生型相比，突变体减小了配体/受体结合界面的范德华作用。另一方面，大多数的残基进行Ala定点突变对能量项中ΔΔEele和ΔΔGPB之和是增加的，这其中一个例外是Arg44的。在NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的野生型复合物中，由于正电性的NRG-1β的Arg44与负电性的Asp(ErbB3中是Asp352，ErbB4中是Asp376)形成了很强的静电相互作用。类似的结果在NRG-1β的Arg31被Ala取代后与ErbB3相互作用变化的结果中可以看到，而由于NRG-1β/ErbB4体系的Arg31与受体不存在强的静电相互作用，因此，在NRG-1β/ErbB4体系则没有呈现出上述的现象。在NRG-1β/ErbB3中，当NRG-1β的Arg31突变成Ala 后，它破坏了原先存在的氢键作用。而对于当受体是ErbB4来说，NRG-1β的Arg31与受体并不存在氢键相互作用。它的突变体的自由能的变化主要是来自于范德华作用的丧失和ΔΔEele+ΔΔGPB的增加之间的平衡，从无论实验还是理论结果上看，它的这种突变是有利于NRG-1β和ErbB4间的结合，而极大地削弱了NRG-1β和ErbB3的亲合作用30。
3.3.4不同分子动力学轨迹下NRG-1β的R31A和N47A的ΔΔGbinding的比较研究
为了评估在Ala突变后，复合物体系构象变化的大小以及它对ΔΔGbinding 的影响，我们对NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的Arg31Ala和Asn47Ala都分别进行分子动力学的模拟。所有模拟的方法同上述部分野生型复合物的分子动力学模拟。选这两个位点的原因主要因为这两个位点的定点突变对NRG-1β/ErbB4这个体系来说结合能是增强的；而对NRG-1β/ErbB3体系来说结合能是减弱的。这些分子动力学的初始结构取自于同源模建得到的NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4结构，只不过这些结构中NRG-1β的Arg31或者Asn47突变成Ala。然后，我们同样有MM-PBSA方法计算了这几个突变体的ΔΔGbinding。如表3.8所示，用突变体重新做分子动力学模拟后计算的ΔΔGbinding与前面所计算得到的ΔΔGbinding的结果基本相似。在所有四个例子中，这两种不同方法得到的ΔΔGbinding能量相差不到1kcal/mol。这说明无论在NRG-1β/ErbB3还是在NRG-1β/ErbB4体系中，单个Ala突变对整个蛋白质的构象影响较小，从而，我们可以用同一套野生型复合物的分子动力学轨迹进行计算的Ala扫描模拟。
表3.8.(A)基于野生型NRG-1β/ErbB3分子动力学轨迹的Arg31Ala和Asn47Ala的MM-PBSA结果与基于Arg31Ala和Asn47Ala后分子动力学轨迹的MM-PBSA结果比较表
(B)基于野生型NRG-1β/ErbB4分子动力学轨迹的Arg31Ala和Asn47Ala的MM-PBSA结果与基于Arg31Ala和Asn47Ala后分子动力学轨迹的MM-PBSA结果比较表
a基于野生型的NRG-1β/ErbB分子动力学轨迹的Arg31Ala和Asn47Ala的MM-PBSA结果
b基于Arg31Ala和Asn47Ala分别突变后分子动力学轨迹的MM-PBSA结果
3.3.5分子动力学模拟研究NRG-1β/ErbB Pro29Ala选择性的差异
从丙氨酸扫描试验上看，当NRG-1β的Pro29Ala时，NRG-1β和受体ErbB3亲合性减弱了几倍；而NRG-1β和ErbB4的亲合性则得到了极大的增强。众所周知，Pro常位于蛋白质的拐角处，起着维持蛋白质结构稳定的作用。一方面，如果Pro突变成Ala后其蛋白质的结构可能发生大的变化；另一方面，由于我们上述所用的MM-PBSA方法不适用于直接将Pro突变成Ala后预测其自由能变化。因此，为了考察在Pro突变成Ala后，复合物体系结构变化的大小以及这种结构变化导致NRG-1β和不同受体结合能力的变化的原因，我们对NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4的Pro29Ala分别进行分子动力学模拟。所有模拟方法同上述分子动力学模拟部分策略一致，只不过为了能更详尽的研究这种结构上的变化，这部分研究的分子动力学模拟时间均为2ns。模拟的初始结构取自于同源模建得到的NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4结构，只不过这些结构中NRG-1β的Pro29突变成Ala。然后，我们同样用MM-PBSA方法计算了它们的ΔGsubtotal，并用Nmode方法预测了熵变，从而得到了总的ΔGbinding。
3.3.5.1分子动力学模拟结果和讨论
对于分子动力学模拟后蛋白质结构的RMSD，见图12(A)。在图中可以明显看到在轨迹的前100ps RMSD很快的上升，然后倾向于平衡。这些RMSD曲线的变化幅度，在数据收集阶段并没有太大变化，这表明这两个体系已经 趋向于平衡。在NRG-1β/ErbB4体系中，经过前400ps的平衡后，它的平均RMSD约为 
而在NRG-1β/ErbB3体系中，这一数值为 同时，对RMSF的分析表明(如图12(B)，RMSD变化比较大的主要在末端及远离配体/受体作用位的结构域II；但是，与野生型的NRG-1β/ErbB体系的分子动力学模拟的RMSF(如图5B)不同，它的配体结构的变化还是比较明显的(在ErbB3中，配体是残基469-520；在ErbB4中，配体是残基474-525)。另一方面，从分子动力学运动轨迹中NRG-1β各残基变化的幅度可以看出，无论NRG-1β/ErbB3还是NRG-1β/ErbB4体系，它们的构象变化的幅度较大。而且，这种变化趋势与RMSD变化的趋势相同，NRG-1β/ErbB4体系的中配体的RMSF的变化要大于NRG-1β/ErbB3体系。同时，对于突变的Pro29位附近的NRG-1β残基的RMSF明显比其它区域要大(两个末端除外)。
3.3.5.2配体受体相互作用
在对配体/受体相互作用的氢键作用分析中，我们主要列出了ErbB3/NRG-1β和ErbB4/NRG-1β配体侧链与受体形成的氢键。这些氢键主要列于表3.9中。从表上可以看出，无论哪一个体系，NRG-1β上的Asp25、Ser27、Arg31、Arg44和Tyr48都与受体有很强的氢键相互作用。同时，与野生型的NRG-1β/ErbB体系相同，NRG-1β的Arg44分别与ErbB3的Asp352和ErbB4的Asp376形成盐桥。这说明，Arg44在NRG-1β/ErbB体系是相当保守的。因此，如果将突变体NRG-1β的Arg44突变成Ala的话，将也可能导致NRG-1β与ErbB3或ErbB4的结合活性显著下降。
与野生型的NRG-1β/ErbB3体系相比，突变体NRG-1β与受体ErbB3结合在N末端得到加强。它新增了Asn16、Asp25和Ser27与受体形成氢键。但是，在原本形成很强的氢键的C末端，它的结合被严重削弱了。突变体NRG-1β与受体ErbB3结合在C末端的氢键少了Asn47与Asp343、Asn47与Tyr405和Asn38与Asn25的氢键。而Tyr48与Asn379的氢键虽然维持，但是其数目由它们的侧链原子互相作氢键受体供体形成的两根氢键(％occupied数分别为78.45和72.36)减至Tyr48的OH与Asn379的ND2一根氢键(％occupied数降至61.65)。另外，原本在野生型NRG-1β/ErbB3体系中存在的Tyr48与ErbB3的Tyr405氢键则消失了。虽然突变体NRG-1β的Arg44仍与ErbB3的Asp352的侧链存在氢键作用，但是，它只形成了三根氢键，而不象野生型NRG-1β的Arg44的NH1和NH2与ErbB3的Asp352的OD1和OD2形成一个氢键网络，它的氢键的强度显然减弱了。对NRG-1β的Arg31来说，突变后变化情况与Arg44类似；并且，它们的氢键％occupied 数从近100降至只有60左右。因此，综合考虑，由于NRG-1β的Pro29Ala后，它与受体ErbB3的结合构象发生了一些变化，虽然在N末端(靠近结构域I部分)可能结合更紧密了，但是原来形成很强的氢键网络的C末端则被削弱得更多。因此，从定性上可以认为当NRG-1β的Pro29Ala，其整体结合可能会减弱，这与丙氨酸扫描实验中NRG-1β的Pro29Ala时它与受体的结合减弱了几倍是一致的30。
而突变体NRG-1β和ErbB4的结合恰恰相反，从分子动力学模拟结果上看，NRG-1β的Pro29Ala的氢键网络得到了加强。首先，在C末端，虽然Tyr48与受体形成的氢键消失了，但是，Arg44和Asp376形成的盐桥得到了极大的加强。而且，它们的氢键％occupied数从80左右上升至约100％。同样，Glu39和Lys438不仅形成的氢键％occupied数上升了，而且，它的形成的氢键的数目也增加了。特别是，由于突变后蛋白质结构的变化，在NRG-1β和受体ErbB3结合中起着重要贡献而对NRG-1β和受体ErbB4结合没有特别大影响的Arg31也参与了NRG-1β和受体ErbB4的结合，而且，它形成了三根很强的氢键。而在原来形成氢键并不多的N端，NRG-1β的Asp25、Ser27与受体结合的氢键数不仅增加了，而且氢键％occupied数也上升至近90％。由于氢键作用在维系蛋白质/蛋白质相互作用中起着关键的作用，因此，由于NRG-1β的Pro29Ala后，配体与受体ErbB4结合的构象尤其是侧链的构象发生变化，导致NRG-1β与ErbB4结合时，无论与受体的结构域I还是结构域III的氢键网络得到了极大的加强，因此，这也从定性上与丙氨酸扫描实验中NRG-1β的Pro29Ala时它与受体的结合能力得到了很大的提高这一实验事实相符的。
除了氢键，和野生型的NRG-1β和受体ErbB存在的疏水作用相似，见表3.10，在突变体NRG-1β和受体ErbB3或ErbB4的位点1、2和3中存在着广泛的疏水相互作用。
在突变体ErbB3/NRG-1β复合物中，在位点1，ErbB3的Asn25、Met72、Leu102和Tyr104的侧链原子和NRG-1β的His2、Val23、和Asn38存在较强的疏水作用。在位点2中，ErbB3的结构域III的Trp354和NRG-1β的Phe13形成疏水作用；而且，NRG-1β的Arg44的长且非极性的的侧链也与Trp354的侧链也有一定疏水作用。在位点3中，如图8C，ErbB3的结构域III的Gln381、Lys415、Tyr436以及稍远一点(距离 
左右)的Tyr405和，Phe409与NRG-1β的Phe40和Tyr48周围的残基形成一个大的疏水腔。
在突变体ErbB4/NRG-1β复合物中也可以看到相似的疏水作用，作为这些疏水作用的结果，在ErbB4/NRG-1β的界面中形成了三个疏水腔。NRG-1β的Leu26、Pro37、Glu39和Asp43的侧链与ErbB4的结构域I的位点1的Glu33、 Lys35、Leu39、Ser40、Ala48、Tyr52、Phe120、Leu121和Gln151的侧链构成第一个疏水腔。NRG-1β的Val15、Arg44和Tyr48周围的残基分别于ErbB4的结构域III的位点2、位点3分别以相似的作用形成了另两个疏水腔。
综合NRG-1β/ErbB的Pro29Ala氢键和疏水作用分析，可以看出无论野生型还是突变体、无论受体是ErbB3还是ErbB4，配体/受体间存在着广泛的疏水相互作用，并没因为突变后有太大的变化。但是，在氢键方面，NRG-1β/ErbB3突变体的氢键强度有了少许减弱；而NRG-1β/ErbB4突变体不仅氢键强度得到了加强，而且它所形成的氢键数目也增加了，这可能正是实验上NRG-1β的Pro29/Ala后，NRG-1β呈现出与ErbB3和ErbB4结合能力变化不同的根本原因。
表3.9 NRG-1β/ErbB的Pro29/Ala和野生型复合物的氢键在整个分子动力学模型过程中比较(图中黑体部分为NRG-1β形成氢键的残基，这边仅列出NRG-1β通过侧链形成氢键的残基；表中％occupied为分子动力学模拟过程中可能有氢键作用结构数占总结构数的百分数)
表3.10 NRG-1β/ErbB的Pro29/Ala的疏水相互作用ligplot表(所有结构取自分子动力学平衡过程的平均结构，平衡结构以从400ps后开始计算)
3.3.5.3配体受体结合自由能
为了从结合自由能角度研究NRG-1β/ErbB3和NRG-1β/ErbB4体系中突变后，NRG-1β/ErbB的Pro29Ala和野生型复合物结合能力的变化，我们结合MM-PBSA和Nmode方法估计野生型和突变体的结合自由能。具体策略如下：首先，用MM-PBSA方法得到Gsubtotal，具体计算部分策略与前面所述策略一致。其次，用谐振子的正则分析Nmode计算蛋白质的熵效应TΔS部分，由于Nmode通过一阶和二阶导数进行简正模式分析，用于寻找局域最小值， 进行振动分析，需要相当多的计算资源，因此，只从MM-PBSA方法所取的100个结构中取出10个结构。由于，NMODE方法只能用于估算不到200个残基的蛋白。因此，我们在进行NMODE计算中切除了远离突变点Pro29的受体的结构域II和结构域III，从而估算出野生型复合物和突变体复合物的自由能，具体结果列于表3.13。
在NRG-1β/ErbB3方面(表3.11A)，与野生型复合物相比，突变体复合物的Evdw与之相差无几(野生型中是-144.02，突变体中是-148.71)，这与前面所做的疏水相互作用分析中是一致的。虽然，与野生型复合物相比，体系的静电作用的增加被体系的溶剂化能的减少给抵消了。另外，从熵效应上看，突变体的熵效应尤其是配体部分明显大于野生型复合物的熵效应，这与前面RMSF分析中，突变体的配体原子构象的变化明显大于野生型是一致的。而且，受体部分的熵变对野生型还是突变体的熵变效应变化并不太大，这说明NRG-1β/ErbB3的Pro29/Ala突变后主要是配体结构发生变化，导致了配体/受体结合能力的变化。从最后的结合自由能看，两者相差无几，这与实验中突变体的NRG-1β与ErbB3的结合能力是野生型的NRG-1β的80％的实验基本相符的30。
在NRG-1β/ErbB4方面(表3.11B)，与野生型复合物相比，突变体复合物的Evdw和NRG-1β/ErbB3情况大致相同(野生型中是-139.35，突变体中是-144.99)，但是，体系的静电作用大幅度增加(这与氢键分析中突变体复合物氢键强度和数量都增加相符)，虽然体系的溶剂化能的减少和熵效应抵消了对体系总结合自由能的贡献，但是，从最后的结果上看，突变体NRG-1β与ErbB4的结合自由能还是增加了2.73kcal/mol，这与实验上NRG-1β的Pro29Ala与ErbB4的结合是野生型NRG-1β与ErbB4约10倍是基本一致的。
表3.11(A)NRG-1β/ErbB3的Pro29/Ala的MM-PBSAa及Nmode自由能计算结果表
(B)NRG-1β/ErbB4的Pro29/Ala的MM-PBSAa及Nmode自由能计算结果表
备注：a上述表所列值单位为kcal mol-1；b差值(Delta)＝Contribution(复合物)-Contribution(受体)-Contribution(配体)；c400个结构的平均值(mean)；d平均值的标准偏差(Std)。eNmode计算熵效应，Nmode方法只取与MMPBSA计算方法同-套分子动力学运动轨迹的10个结构(即每40ps一个结构)，图中黑斜体部分为同样方法计算野生型NRG-1β/ErbB的熵值后体系的自由能。ΔGbinding＝Gsubtotal -TΔS(T＝298.15K)
序列表
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<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
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<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc 60
ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt 120
actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac 180
cag
<210>2
<211>61
<212>PRT(SEQ ID NO.1)
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val
5 10 15
Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asr Pro Ser
20 25 30
Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys
35 40 45
Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln
50 55 60
Claims (12)
1.NRG突变体在制备特异性激活ErbB3受体药物的应用，其中NRG突变体特征在于其包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点25或35或46突变成丙氨酸的氨基酸序列，并且在用如下方法筛选时，其NRG/ErbB3的ΔΔGsubtotal为正值，NRG/ErbB4的ΔΔGsubtotal为负值：
a)用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4复合物的三维结构；
b)分子动力学模拟NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的构象变化和稳定性；
c)MM/PBSA方法计算NRG与ErbB3或ErbB4的结合自由能；
d)丙氨酸理论扫描计算方法确定NRG残基突变成丙氨酸后对NRG与受体亲和性变化；
e)计算ΔΔGsubtotal＝ΔGwildtype-ΔGmutant。
2.根据权利要求1所述的应用，其中NRG突变体通过激活哺乳动物ErbB3受体，从而治疗、预防或延缓哺乳动物疾病。
3.根据权利要求2所述的应用，其中所述哺乳动物为人类。
4.根据权利要求2所述的应用，其中所述哺乳动物疾病包括发生在骨、耳、眼睛、眼睑、头颈部、心脏、喉、下颚、下颚外侧髁、上颌骨、嘴、鼻咽、鼻子、口腔、胰腺、腮腺、耳廓、垂体、前列腺、视网膜、唾液腺、皮肤、肌肉、脊髓、甲状腺、扁桃体、神经系统、呼吸系统、消化系统、循环系统、生殖系统、泌尿系统、内分泌系统、心血管系统、造血系统的疾病。
5.根据权利要求4所述的应用，其中神经系统疾病包括中枢神经系统疾病、周围神经系统疾病、脊髓疾病、脑膜疾病、脱髓鞘性疾病、椎体外系统疾病。
6.NRG突变体在制备特异性激活ErbB4受体药物的应用，其中NRG突变体特征在于其包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基位点16或29或31或33或47或8突变成丙氨酸的氨基酸序列，并且在用如下方法筛选时，其NRG/ErbB4的ΔΔGsubtotal为正值，NRG/ErbB3的ΔΔGsubtotal为负值：
a)用同源模建方法建立NRG、ErbB3、ErbB4、NRG/ErbB3和NRG/ErbB4复合物的三维结构；
b)分子动力学模拟NRG/ErbB3和NRG/ErbB4在溶液中的构象变化和稳定性；
c)MM/PBSA方法计算NRG与ErbB3或ErbB4的结合自由能；
d)丙氨酸理论扫描计算方法确定NRG残基突变成丙氨酸后对NRG与受体亲和性变化；
e)计算ΔΔGsubtotal＝ΔGwildtype-ΔGmutant。
7.根据权利要求6所述的应用，其中NRG突变体通过激活哺乳动物ErbB4受体，从而治疗、预防或延缓哺乳动物疾病。
8.根据权利要求6所述的应用，其中所述哺乳动物为人类。
9.根据权利要求7所述的应用，其中所述哺乳动物疾病包括发生在骨、耳、眼睛、眼睑、头颈部、心脏、喉、下颚、下颚外侧髁、上颌骨、嘴、鼻咽、鼻子、口腔、胰腺、腮腺、耳廓、垂体、前列腺、视网膜、唾液腺、皮肤、肌肉、脊髓、甲状腺、扁桃体、神经系统、呼吸系统、消化系统、循环系统、生殖系统、泌尿系统、内分泌系统、心血管系统、造血系统的疾病。
10.根据权利要求9所述的应用，其中心血管疾病包括心力衰竭、心肌梗死、快速心律失常、家族性心肌肥大型心肌病、缺血性心脏病、原发性扩张型心肌病和心肌炎。
11.根据权利要求10所述的应用，其中导致所述心力衰竭的原因为充血性心衰、心肌梗死、快速心律失常、家族性心肌肥大型心肌病、缺血性心脏病、扩张型心肌病和心肌炎。
12.根据权利要求9所述的应用，其中肌肉疾病包括平滑肌、骨骼肌、心肌疾病。
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