CN111840517A - 神经调节蛋白用于长效预防、治疗或延迟心脏损伤的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物心肌损伤的方法，进一步提供了神经调节蛋白在制备治疗心脏病和心力衰竭药物应用中新的作用机制。本发明发现使用纽兰格林的大鼠心肌细胞中脂肪酸代谢相关酶类转录水平下降，糖代谢相关基因转录水平上升。使用纽兰格林可优化心肌细胞的能量代谢，使得细胞在同等耗氧条件下产生更多的生物能。

Description

神经调节蛋白用于长效预防、治疗或延迟心脏损伤的方法

技术领域

本发明提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物心肌损伤的方法，进一步提供了神经调节蛋白在制备治疗心脏病和心力衰竭药物应用中新的作用机制。

背景技术

全球范围内，心血管对人们的生命和健康构成了严重威胁，心血管疾病包括多种疾病状态比如心力衰竭，心肌梗死，冠状动脉粥样硬化性心脏病，心律失常，心肌疾病，心脏瓣膜病，感染性心内膜炎，心胞疾病，缺血性心脏病，先天性心脏病等之类的。心血管疾病会导致心肌损伤并影响心脏的功能从而影响人类的健康。其中心肌梗死是一种严重危害人类健康的心血管疾病，随着人民生活水平的不断提高，缺血性心肌梗死的发病率也在不断上升。心肌梗死是心肌缺血性坏死，大多是在冠状动脉病变的基础上，由于冠状动脉的持续堵塞而导致的冠状动脉血供急剧减少或者中断，导致相应的心肌严重而持久的缺血所致。缺血性心肌梗死会导致心肌细胞坏死和瘢痕形成，进而影响心脏功能。心力衰竭(简称心衰)是由于任何心脏结构或功能异常导致心室充盈或射血能力受损的一组复杂临床综合征，其主要临床表现为呼吸困难和乏力(活动耐量受限)，以及液体潴留(肺淤血和外周水肿)。心衰为各种心脏疾病的严重和终末阶段，发病率高，是当今最重要的心血管病之一，被称为“心脏病最后的战场”。

根据从2009年至2012年的NHANES数据，美国约有570万成年人(≥20岁)患有心衰，至 2030年估计患病率会提高46％，将有超过800万的18岁以上成年患者。在2012年，与心衰相关的总支出估计高达307亿美元，其中68％可归于直接医疗费用。另据推测，2030年时这一数值将比2012年增长约127％，即697亿美元，这就意味着每个成年美国人为此将要花费约244美元。数据显示，心衰已成为全球性的负担，全球患者已达2300万人，而这种疾病的5年死亡率高达 50％，与不少恶性肿瘤相仿。

根据美国心脏病协会发布的统计数据，对于新诊断的心血管病人，其中44％患有心衰，仅有10％患有冠状动脉疾病。心衰通常的病因包括非缺血性心肌病、风湿性心脏病、先天性心脏病、高血压性心脏病、心内膜心肌纤维化，而缺血性心脏病仍相对较少见。

按照2014年《中国心力衰竭诊断和治疗指南》，依据左心室射血分数(LVEF)，心衰可分为LVEF降低的心衰(heart failure with reduced left ventricularejectionfraction，HF-REF)和 LVEF保留的心衰(heart failure with preserved leftventricular ejection fraction，HF-PEF)。一般来说，HF-REF指传统概念上的收缩性心衰，而HF-PEF指舒张性心衰。LVEF保留或正常的情况下收缩功能仍可能是异常的，部分心衰患者收缩功能异常和舒张功能异常可以共存。 LVEF是心衰患者分类的重要指标，也与预后及治疗反应相关。根据心衰发生的时间、速度、严重程度可分为慢性心衰和急性心衰。在原有慢性心脏疾病基础上逐渐出现心衰症状、体征的为慢性心衰。慢性心衰症状、体征稳定1个月以上称为稳定性心衰。慢性稳定性心衰恶化称为失代偿性心衰，如失代偿突然发生则称为急性心衰。急性心衰的另一种形式为心脏急性病变导致的新发心衰。

根据纽约心脏协会(NYHA)的心功能分级，心衰按照病情的严重程度可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级。心衰症状严重程度与心室功能的相关性较差，但与生存率明确相关，轻度症状的患者仍可能有较高的住院和死亡的绝对风险。

据我国部分地区42家医院，对10714例心衰住院病例回顾性调查发现，其病因以冠心病居首，其次为高血压，而风湿性心脏瓣膜病比例则下降；各年龄段心衰病死率均高于同期其他心血管病，其主要死亡原因依次为左心功能衰竭(59％)、心律失常(13％)和猝死(13％)。

心衰的主要发病机制之一为心肌病理性重构，导致心衰进展的两个关键过程，一是心肌死亡(坏死、凋亡、自噬等)的发生，如急性心肌梗死(AMI)、重症心肌炎等，二是神经内分泌系统过度激活所致的系统反应，其中肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)和交感神经系统过度兴奋起着主要作用。目前来说，切断这两个关键过程是心衰有效预防和治疗的基础。

根据心衰发生发展的过程，从心衰的危险因素进展成结构性心脏病，出现心衰症状，直至难治性终末期心衰，可分成前心衰、前临床心衰、临床心衰和难治性终末期心衰4个阶段。心衰是一种慢性、自发进展性疾病，很难根治，但可预防。心衰的阶段划分正是体现了重在预防的概念，其中预防患者从阶段A进展至阶段B，即防止发生结构性心脏病，以及预防从阶段B进展至阶段C，即防止出现心衰的症状和体征，尤为重要。

自20世纪90年代以来，人们对心力衰竭的认识有了很大的提高，对心力衰竭的诊断和治疗取得了很大的进步，对慢性心衰的治疗已有重大的转变：从旨在改善短期血液动力学状态转变为长期的修复性策略，以改变衰竭心脏的生物学性质；从采用强心、利尿、扩血管药物转变为神经内分泌抑制剂，并积极应用非药物的器械治疗。

目前，ACEI和β受体阻滞剂的两药联用称之为“黄金搭档”，可产生相加或协同的有益效应，使死亡危险性进一步下降。在上述ACEI和β受体阻滞剂黄金搭档基础上加用醛同酮受体拮抗剂，三药合用可称之为“金三角”，应成为慢性HF-REF的基本治疗方案。不能耐受ACEI的患者，ARB可代替应用，此时，ARB和β受体阻滞剂的合用，以及在此基础上再加用醛固酮受体拮抗剂，类似于“黄金搭档”和“金三角”。

然而研究表明，心力衰竭在发达国家仍然是发病率快速增长的唯一的心血管病。心力衰竭表现出患病率和发病率高，致死率和致残率高，医疗花费高的特点，是严重危害人类健康的重大社会问题。心衰的治疗目标不仅是改善症状、提高生活质量，更重要的是针对心肌重构的机制，防止和延缓心肌重构的发展，从而降低心衰的病死率和住院率。因此，开发预防和/或治疗心衰的新药物以及新方法，仍然非常有必要。目前已经有大量的研究表明通过对能量代谢的调节能够治疗或者延缓心力衰竭的进程。

新陈代谢是生命最基本的特征之一，其包括物质代谢和能量代谢两个方面。机体通过物质代谢，从外界摄取营养物质，同时经过体内分解吸收将其中蕴藏的化学能释放出来转化为组织和细胞可以利用的能量，人体利用这些能量来维持生命活动。通常将在物质代谢过程中所伴随的能量的释放、转移、贮存和利用称为能量代谢。机体从外界摄取的营养物质包括碳水化合物、脂肪、蛋白质、微量元素、水及维生素等，其中碳水化合物、脂肪和蛋白质是机体的主要能源。

心脏是一个高耗能的器官，心肌的收缩和舒张需要能量，每天需要消耗大量的ATP来满足心泵功能。心脏可以将储存在脂肪酸和葡萄糖中的化学能转化为心肌纤维中肌动蛋白和肌球蛋白相互作用的机械能。脂肪酸、葡萄糖、乳酸、丙酮酸等都是提供能量的底物。心脏对底物的选择具有极高的灵活性，可随循环中底物浓度及含氧量的变化进行灵活转换，这有利于心脏在面对压力超负荷和氧化应激时维持足够的ATP产出。在正常情况下，心肌所需能量的60％-90％来自游离脂肪酸的β氧化，长链脂肪酸借助肉毒碱脂酰转移酶进入线粒体进行β氧化，产生乙酰辅酶A，进入三羧酸循环产生ATP提供能量。另外10％-40％的能量则由葡萄糖、乳酸和丙酮酸等碳水化合物提供。葡萄糖经过糖酵解产生丙酮酸，乳酸则在乳酸脱氢酶的作用下产生丙酮酸，最后在丙酮酸脱氢酶作用下，转变成乙酰辅酶A，进入三羧酸循环提供能量。

人的心脏每天搏动约10万次，将8000L左右的血液泵到全身各处，为发挥其正常功能，它通过能量代谢将储存在脂肪酸或葡萄糖中的化学能转化为机械能。

在含氧量正常的情况下，心脏产生的ATP中有>95％是来源于线粒体内氧化磷酸化反应，余下5％则主要源自葡萄糖糖酵解。心脏将60％～70％ATP用于心肌收缩作用，而30％～40％ ATP用于各种离子泵，尤其是肌浆网中Ca2+-ATP酶。心脏的工作极大地依赖于ATP产生，一旦该过程受损，将会迅速导致收缩功能紊乱。

正常情况下，心脏维持收缩功能和基础代谢所需要的能量主要由脂肪酸(60％～90％) 和碳水化合物(10％～40％)氧化代谢产生的ATP提供，其能量代谢过程主要包括3个环节。第一环节是底物的利用过程。心肌细胞从血液中摄取脂肪酸、葡萄糖等底物进行β-氧化和糖酵解产生乙酰辅酶A，后者参与三羧酸循环生成还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)和二氧化碳。第二个环节是氧化-磷酸化过程，即线粒体呼吸链产生能量的过程。该机制下呼吸链复合物Ⅰ～Ⅳ将NADH的电子传递给氧，在线粒体内膜两侧形成了质子(H+)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和水的电化学梯度，这个梯度驱动Fl-FoATP合酶磷酸化二磷酸腺昔(ADP)生成三磷酸腺苷(ATP)。后者是心脏所有耗能反应的直接能量来源。第三环节则是ATP的转移和利用。ATP通过肌酸激酶能量往返机制，被转移给肌纤维ATP酶以及其它耗能反应，如细胞膜和肌浆网上的离子泵，为它们提供能量来源。

心脏在不同时期的代谢途径存在一定差异，在胎儿期由于循环中氧含量较低、游离脂肪酸含量较少以及葡萄糖和乳酸盐含量较多，胎儿时期的心脏主要依靠葡萄糖和乳酸盐进行无氧酵解来提供ATP，对脂肪酸的氧化供能极少。胎儿期这种缺氧和高糖代谢的特征有利于细胞脂质、氨基酸、核苷酸以及其他生物大分子的生物合成，对于维持细胞生长具有非常重要意义，特别适用于胎儿期心脏生长发育的特点，有助于胎儿时期心肌细胞的分化生长。在成人阶段，成人的心脏中线粒体占心肌细胞体积的1/3，在供氧充足的条件下，如上所述95％以上的ATP产生来自线粒体的氧化代谢，仅约不足5％的ATP来自糖酵解。成人期心肌细胞的能量来源主要以脂肪酸代谢为主，葡萄糖代谢为辅。

综上所述，心肌的能量代谢调控是一个精细的网络系统，任何环节出现障碍都可引起能量供应不足，导致心脏功能障碍，甚至心力衰竭(HF)。

慢性心力衰竭(CHF)是各种心脏疾患的终末状态。大量研究发现，心力衰竭(HF)心肌和正常心肌的能量代谢的特点有所不同。能量代谢障碍被认为是HF发展的关键因素。

一种很有前途的新的治疗手段涉及给心衰患者或有心衰风险的患者施用纽兰格林(此后称为“NRG”)。NRGs属于表皮生长因子样(EGF-like)家族，是一类结构上相似的生长分化因子，包括NRG1、NRG2、NRG3和NRG4及其异构体。NRGs涉及一系列生物学反应：刺激乳腺癌细胞分化和分泌乳汁蛋白；诱导神经嵴细胞分化成Schwann细胞；刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；并且促进心肌细胞成活和DNA合成。用纽兰格林基因严重缺陷的纯合子小鼠胚胎做活体研究证明纽兰格林对于心脏和神经发育是必须的。

NRGs与EFG受体家族的成员结合，该受体家族包括EGFR、ErbB2、ErbB3和ErbB4，其中每一个受体在多种细胞功能中都发挥重要的作用，包括细胞生长、分化和存活。它们都是蛋白酪氨酸激酶受体，由一个胞外配体结合域、跨膜激酶域和胞浆的酪氨酸激酶结构域组成。 NRG结合至ErbB3或ErbB4的细胞外结构域后，能够诱导构象改变从而引起ErbB3、ErbB4和 ErbB2之间形成异二聚体，或者ErbB4自身形成同源二聚体，这样就会导致受体细胞内C-末端结构域的磷酸化。然后磷酸化的胞内结构域与细胞内其他的信号蛋白结合，活化相应的下游AKT或ERK信号传导途径，并诱导一系列的细胞反应，比如刺激或抑制细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、细胞迁移或细胞粘附。在这些受体中，ErbB2和ErbB4主要在心脏表达。

已有研究表明NRG-1的EGF类似区，约50至64个氨基酸，足以结合并活化这些受体。以前的研究表明纽兰格林-1β(NRG-1β)能以高亲和力直接结合ErbB3和ErbB4。孤儿受体ErbB2能与ErbB3或ErbB4形成异源二聚体并且其亲和力比ErbB3或ErbB4同源二聚体要高。神经发育的研究结果提示交感神经系统的形成需要完整的NRG-1β、ErbB2和ErbB3信号传导系统。靶向破坏NRG-1β、或ErbB2或ErbB4后由于心脏发育缺陷而导致胚胎致死。最近的研究也突显了NRG-1β、ErbB2和ErbB4在心血管发育以及维持成年正常心脏功能方面具有重要作用。研究表明NRG-1β能增强成年心肌细胞的肌小节的组织结构。在心衰动物的生存率试验中，纽兰格林可使心衰动物死亡率大幅降低。更为重要的是，在已完成的中国、美国、澳大利亚多例受试者的多项临床试验证实，纽兰格林不仅具有良好安全性，可显著改善患者心功能、运动能力、生活质量及预后，且可以大幅降低目标患者死亡率与再入院率。因此，考虑到目前全球心衰发病率及死亡率居高不下的现状、心衰治疗领域存在巨大的未满足临床医疗需求、以及缺乏心肌细胞作用机制的心衰治疗药物市场与贫乏的国际在研产品管线等因素，纽兰格林作在治疗心力衰竭领域有非常巨大的应用前景。随着对纽兰格林治疗心衰研究的深入，纽兰格林作用机制也不断的被揭示，这将更有益于纽兰格林在临床中更好的应用。目前，我们已知纽兰格林在心脏发育过程中具有非常关键的作用，纽兰格林能够改善心肌肌节排列及心脏收缩单元结构，纽兰格林能够调节Ca²⁺循环，从而改善心脏的收缩和舒张功能等。但纽兰格林在长效预防、治疗或延迟心脏损伤的作用机制并不是很清楚，本发明通过心脏能量代谢的变化进行了解释。

发明内容

A.发明概述

本发明发现神经调节蛋白在制备用于预防、治疗或延迟哺乳动物心肌损伤的药物应用中新的作用机制。其中哺乳动物是人。神经调节蛋白能够改善对心肌损伤后的心脏功能并减轻其心脏重构。

多种心血管疾病例如心力衰竭，心肌梗死，冠状动脉粥样硬化性心脏病，心律失常，心肌炎，心脏瓣膜病，感染性心内膜炎，心胞疾病，缺血性心脏病，先天性心脏病等会导致心肌损伤。发生心肌损伤时会影响心脏的功能从而影响人类的健康。慢性心力衰竭(CHF)是各种心脏疾患的终末状态。大量研究发现，心力衰竭(HF)心肌和正常心肌的能量代谢的特点有所不同。能量代谢障碍被认为是心力衰竭发展的关键因素。

心衰时主要的病理生理变化是心肌重构和心肌纤维化。心肌重构是由一系列复杂的分子和细胞机制导致心肌重量、心室容量的增加和心室形态的改变，心肌重构使单位重量的心肌毛细血管数目减少，氧的弥散间距增大，因而心肌相对缺氧。在心衰早期，葡萄糖的利用增加，而游离脂肪酸的利用可以没有变化，或仅有轻度增加；重度心衰时，游离脂肪酸的利用明显减少，同时，由于重度心衰时可有胰岛素抵抗，葡萄糖的利用也会减少。另外，衰竭心肌中ATP酶的活性约降低20％～30％，ATP酶活性的降低使心肌能量利用发生障碍，心肌收缩力因而减弱。心衰时还可能有线粒体结构异常，氧化磷酸化过程受损，线粒体中电子转运链复合物活性和ATP的产生均降低或减少。严重心衰时，心肌中ATP水平可降低30％～40％，磷酸肌酸水平可降低30％～70％，同时肌酸转运体功能也降低。高能磷酸化合物减少和肌酸激酶系统活性降低，可导致转运至肌原纤维的能量减少，最终导致心肌的收缩储备降低。心肌重构的另一个重要特征是心肌细胞坏死和凋亡，细胞死亡导致心肌纤维化，加重重构。

心衰时的心脏代谢表现出一些变化，这种变化称为代谢重构，包括从底物利用改变到线粒体功能紊乱等，最终导致ATP缺乏和收缩功能受损。然而，在心衰期间，ATP缺乏并不是与代谢重构相关的唯一结果。通过为细胞提供结构单元和信号分子，代谢通路将控制细胞的必需过程，如细胞生长和再生等。因此，心脏代谢的变化还将通过非ATP机理影响心衰进程。心衰时的代谢重构不仅会导致心脏能量受损，还会导致心衰进展时的一些其它过程，如结构重构和氧化应激等。

在心肌脂肪酸代谢方面，多数研究表明心衰时，脂肪酸摄取的肉碱脂酰转移酶Ⅰ(CPT-1) 及β氧化的中链乙酰辅酶A脱氢酶活性下调，导致脂肪酸氧化率降低，心脏对于脂肪酸的利用会减少。

体内的脂肪酸代谢途径如下：在氧供给充足的条件下，脂肪酸可在体内分解成二氧化碳和水，释出大量能量。脂肪酸氧化的主要过程如下：1，脂肪酸的活化——脂酰CoA的生成； 2,脂酰CoA进入线粒体；3，脂酰CoA的脂酰基β-氧化：脂酰基进入线粒体基质后，从脂酰基的β-碳原子开始，经过脱氢、加水、再脱氢及硫解四步连续的反应，脂酰基断裂产生1分子乙酰CoA和1分子比原来少两个碳原子的脂酰CoA。催化这些反应的酶彼此结合形成多酶复合体，称脂肪酸氧化酶系。主要包括以下过程。

(1)脱氢：脂酰CoA在脂酰CoA脱氢酶的催化下，α、β碳原子各脱去一个氢原子，生成α,β-烯脂酰CoA，脱下的2H由FAD接受生成FADH2。一分子FADH2进入呼吸链通过氧化磷酸化产生1.5分子ATP。

(2)加水：在水化酶催化下，烯脂酰CoA加水生成β-羟脂酰CoA。

(3)再脱氢：在β-羟脂酰CoA脱氢酶催化下，β-羟脂酰CoA脱下2H，生成β-酮脂酰CoA，脱下的2H由NAD接受，生成NADH+H。一分子NADH+H进入呼吸链经氧化磷酸化产生2.5 分子ATP。

(4)硫解：β-酮脂酰CoA在硫解酶催化下，加入CoA使α、β碳原子之间化学键断裂，生成1分子乙酰CoA和1分子比原来少两个碳原子的脂酰CoA。

以上生成的比原来少2个碳原子的脂酰CoA可再进行脱氢、加水、再脱氢及硫解反应，如此反复进行，直至最后生成丁酰CoA，后者再进行一次β-氧化，即完成脂肪酸的β-氧化过程。

在脂肪酸代谢过程中，由脂酰CoA脱氢酶所催化的线粒体β氧化第一步反应是整个过程的限速反应，脂酰CoA脱氢酶的催化效率直接影响着机体内脂肪酸分解代谢的效率。脂酰CoA 脱氢酶家族(acyl—CoA dehydrogenase family,ACAD family)由一类以FAD为辅酶的核黄素蛋白组成，这些核黄素蛋白以硫酯为底物，催化硫酯底物碳链的α和β位之间的脱氢反应。该家族包含九个成员，其中有5个成员参与到线粒体脂肪酸β氧化过程，按照所催化底物碳链的长度将这5个成员分别命名为短链脂酰CoA脱氢酶(short chainacyl.CoAdehydrogenase，ACADS)，中链脂酰CoA脱氢酶(medium chain acyl—CoAdehydrogenase，ACADM)，长链脂酰CoA脱氢酶(10ng chain acyl.CoA dehydrogenase，ACADL)，极长链脂酰CoA脱氢酶I型(very long chain acyl-CoA dehydrogenase-1，ACADVL-1)以及近来发现的极长链脂酰CoA脱氢酶II型(也被称为ACAD-9)。另外4个成员在氨基酸氧化代谢过程中发挥作用，它们分别是参与亮氨酸代谢过程的3-异戊酰CoA脱氢酶，参与异亮氨酸代谢过程的2-异戊酰CoA脱氢酶，参与缬氨酸代谢过程的异丁酰CoA脱氢酶以及参与赖氨酸和色氨酸代谢过程的戊二酰CoA脱氢酶。

由于脂酰CoA脱氢酶所催化的线粒体β氧化第一步反应是整个过程的限速反应，因此脂酰CoA脱氢酶的催化效率直接影响着机体内脂肪酸分解代谢的效率，而上述提到的参与线粒体β氧化的五个脂酰CoA脱氢酶家族成员对于各自适宜底物的碳链长度呈现明显的选择性，例如，ACADS选择性的催化碳链长度为4至6的底物，且当底物的碳链长度为4时，ACADS的效率最高；ACADM可催化的底物范围较宽，它可选择性催化碳链长度6～12的底物，当底物碳链长度为8时该酶的催化效率最高；ACADL可以催化碳链长度为8至20的底物，当底物碳链长度为12时催化效率最高；ACADVL则可催化碳链长度为14至22的底物，当底物碳链长度为16时催化效率最高。虽然这五种酶在底物的选择上存在着差异，但它们的活性中心都有一个关键的高度保守的催化残基—谷氨酸，并且它们具有相同的催化机制，生成的产物烯脂酰CoA进入下一步反应峭¨，而反应过程生成的电子则依次通过脂酰CoA脱氢酶的天然电子受体一电子传递黄素蛋白(electron.transfer flavoprotein，ETF)和与膜结合的电子传递黄素蛋白.泛醌氧化还原酶的传递而进入线粒体电子呼吸链，参与ATP的生成峭引。酶活性中心处的谷氨酸是脂酰CoA脱氢酶催化底物脱氢的关键残基，其侧链羧基氧的一对自由电子吸引并结合底物脂酰CoA碳链α位的一个质子，紧接着底物碳链B位的一个质子被转移到与脂酰CoA脱氢酶结合的FAD的异咯嗪环的N5位置上，最终在底物的α和β位之间形成双键，生成的产物烯脂酰CoA作为β-氧化第二步反应的底物。

在心肌葡萄糖代谢方面，心衰时心脏对葡萄糖利用的研究数据之间就不太一致。在心肌收缩功能障碍的情况下，小鼠主动脉缩窄后观察到心脏对于葡萄糖的利用是减少的，而在大鼠心梗模型中对于葡萄糖的利用没有变化，在Dahl盐敏感性大鼠中对于葡萄糖的利用会增加。在心脏代偿性肥大阶段，腹主动脉缩窄模型中表现为糖酵解略有增强，而葡萄糖有氧氧化没有变化。在对大鼠主动脉缩窄模型中不同进展阶段的底物利用情况进行考察时发现，葡萄糖糖氧化在起始阶段趋向于增加，在代偿性肥大阶段没有变化，而在最终收缩功能紊乱阶段又有减少。伴随收缩功能紊乱时发生的葡萄糖氧化减少，可能在某种程度上是由于线粒体功能障碍，以及糖酵解和有氧氧化的相关基因表达减少，或者是由于丙酮酸脱氢酶复合物的大量减少。然而，也有报道中动物或人体试验的结果是相反的，表现出葡萄糖氧化会增强。这些差异不太可能解释为方法的不同。因此，与脂肪酸氧化不同，葡萄糖氧化与心衰时的收缩功能没有相关性，它的变化将同时取决于心衰的进展阶段和发病机制。在心衰早期，葡萄糖摄取率及糖酵解均增加。心衰晚期，血氧严重缺乏可发生胰岛素抵抗，葡萄糖利用率下降，供能方式向糖酵解转变，生成大量乳酸，导致心衰加重。由于丙酮酸脱氢酶复合体(PDH)能够调节脂肪酸氧化率，当脂肪酸代谢受抑制时，PDH活性增强，脂肪酸氧化率降低促进葡萄糖代谢。

体内葡萄糖代谢途径首先为糖酵解的发生，体内的糖酵解(glycolysis)是指1个葡萄糖分子转变为2个丙酮酸分子的过程。糖酵解过程的产物丙酮酸有多种分支去路。丙酮酸在有氧气和线粒体存在时进入线粒体，经丙酮酸脱氢酶复合体催化氧化脱羧产生NADH、CO2和乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进入三羧酸循环和氧化磷酸化彻底氧化为CO2和H2O，释放的能量在此过程中可产生大量ATP。这是糖的有氧氧化过程，是机体获得ATP的主要途径。乙酰辅酶A 彻底氧化释放能量的途径是三羧酸循环。三羧酸循环包括以下的途径：

(1)乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合为柠檬酸

此反应为三羧酸循环的关键反应之一，是由柠檬酸合成酶催化的不可逆反应，所需能量由乙酰CoA的高能硫酯键水解而供应。

(2)柠檬酸转变为异柠檬酸

柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步氧化脱羧作准备。

(3)异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸

异柠檬酸在异柠檬酸脱氢酶的催化下，氧化脱羧生成α-酮戊二酸，反应脱下的氢由NAD 接受生成NADH+H，脱羧使6碳化合物变为5碳化合物。这是三羧酸循环中第一次氧化脱羧生成CO2的反应。此反应不可逆，是三羧酸循环中的限速步骤。

(4)α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A

这是三羧酸循环的第二次氧化脱羧反应，此反应类似于丙酮酸的氧化脱羧，也是不可逆反应，生成的琥珀酰CoA含有高能硫酯键。催化此反应的α-酮戊二酸脱氢酶复合体是三羧酸循环的限速酶，它由三个酶(α-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酰基转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶)和五个辅助因子(TPP、硫辛酸、CoA、NAD、FAD)组成。

(5)琥珀酰辅酶A生成琥珀酸

琥珀酰CoA在琥珀酸硫激酶的作用下，高能硫酯键水解，能量转移给GDP生成GTP和琥珀酸。生成的GTP可直接利用，也可将其高能磷酸基团转移给ADP生成ATP。这是三羧酸循环中唯一的一次底物磷酸化反应。

(6)琥珀酸脱氢

琥珀酸在琥珀酸脱氢酶的催化下脱氢生成延胡索酸，脱下的氢由FAD接受生成FADH2。

(7)苹果酸生成

延胡索酸在延胡索酸酶催化下，加水生成苹果酸。

(8)草酰乙酸再生

苹果酸在苹果酸脱氢酶催化下脱氢生成草酰乙酸，脱下的氢由NAD接受生成NADH+H。再生的草酰乙酸可再次进入三羧酸循环用于柠檬酸的合成。

在心肌线粒体代谢方面，心衰时细胞内增加的ROS产生以及过多蓄积的ROS会造成线粒体结构和功能的损伤，引起心肌细胞凋亡，由此导致线粒体氧化呼吸链的功能障碍，增加ROS 的产生，从而形成恶性循环，心衰时复合体合成酶表达下调，电子传递速度和ADP的磷酸化偶联程度降低，ATP产生明显减少，会加重心衰进程；线粒体在心肌细胞上分布最多，心衰的心肌线粒体DNA突变率明显升高，加重心肌细胞凋亡与自噬，导致产能降低。

相对于脂肪酸代谢而言，糖代谢具备更高的氧效率，也就是使用同等量的氧，此代谢途径能生产更多的生物能量分子。和糖相比，氧化脂肪产生同等的ATP，需要消耗更多的氧气，优先选择糖代谢，降低脂肪酸代谢成为治疗心力衰竭的一个途径心力衰竭患者应用能量代谢调节药物增加葡萄糖氧化率，抑制脂肪酸代谢，减少心肌耗氧量，可以延缓心力衰竭的病情进展。调节脂肪酸代谢的药物，例如脂肪酸氧化酶抑制剂已在临床上用于治疗心力衰竭，其治疗缺血性心肌病导致的慢性心力衰竭机制是通过抑制脂肪酸β氧化代谢途径中相关酶活性，使脂肪酸氧化率降低，葡萄糖氧化率增加，增加心肌细胞供能；还可通过提高线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸脱氢酶的活性，使线粒体ATP合成增加，改善心功能。曲美他嗪是一种脂肪酸氧化抑制剂，目前用于治疗缺血性心肌病所致慢性心力衰竭效果较好。脂肪酸氧化酶抑制剂雷诺嗪可改善葡萄糖代谢，通过改变心脏代谢方式减少心脏需氧量，对心力衰竭也有一定改善作用。

本发明进一步涉及神经调节蛋白在制备用于预防、治疗或延迟哺乳动物心力衰竭药物应用中新的作用机制，通过改善心脏的能量代谢而起到长效作用，其中哺乳动物是人。

神经调节蛋白，神经调节蛋白多肽，神经调节蛋白衍生物，或那些有类似神经调节蛋白作用的化合物，在本发明中都可以描述为NRG。本发明是基于NRG对心脏发育至关重要，对成年心脏的功能维持也起到非常重要的作用的科学发现；基于NRG可以加强心肌细胞肌小节和细胞骨架以及细胞间连接的形成的科学发现；基于NRG在各种动物模型和临床试验中可以提高心衰动物或病人的心脏功能的科学发现；基于NRG在大脑缺血再灌注动物模型中显示对脑细胞的保护作用的科学发现；基于NRG在心脏缺血再灌注动物模型中显示对脑细胞的保护作用的科学发现。NRG，NRG多肽，NRG突变体或其它具有NRG样功能的复合物都属于本发明的范畴。

本发明的第一个方面，是提供了神经调节蛋白在制备治疗心脏疾病药物应用中新的作用机制。该作用机制包括神经调节蛋白具有抑制心脏组织的脂肪酸代谢以及促进葡萄糖代谢。具体的为神经调节蛋白可增强心脏组织中脂肪酸代谢相关酶在转录水平的表达以及降低葡萄糖代谢相关酶在转录水平的表达从而调节能量代谢治疗心脏疾病。

本发明的第二个方面，是提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物心肌损伤的方法。进一步提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物心力衰竭的方法，其中哺乳动物是人。包括对需要或希望预防、治疗或延迟心肌损伤的哺乳动物调节能量代谢途径，从而达到预防、治疗或延迟心肌损伤的效果。包括给予哺乳动物有效量的纽兰格林。包括给予哺乳动物有效量的纽兰格林和改善心脏耗氧量的药物。对需要或希望预防、治疗或延迟心肌损伤的哺乳动物调节能量代谢途径具体的为抑制心脏组织的脂肪酸代谢以及促进葡萄糖代谢途径。

本发明的第三个方面，是提供了一种预防、治疗或延迟哺乳动物心肌损伤的组合物。其中所述组合物包括有效量的纽兰格林和改善心脏耗氧量的药物。其中所述改善心脏耗氧量的药物包括脂肪酸氧化酶抑制剂。更优化的，其中所述改善心脏耗氧量的药物是雷诺嗪或曲美他嗪。

B.释义

除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。

除非特别指明，在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。

此处所用“心肌损伤”是指由心脏病理性疾病例如心力衰竭，心肌梗死，冠状动脉粥样硬化性心脏病，心律失常，心肌疾病，心脏瓣膜病，感染性心内膜炎，心胞疾病，缺血性心脏病，先天性心脏病导致的心肌损伤，心肌损伤往往会导致心脏功能的降低从而影响人类的健康。心肌损伤的机理涉及氧自由基的产生,钙离子超载，中性粒细胞损伤区浸润导致的炎症反应，心肌细胞的凋亡或者坏死，能量供应失调导致的组织代谢失调，心脏电信号传导的异常，胆固醇的累积，动脉粥样硬化斑块的形成等多重病理生理改变。

此处所用“心力衰竭”是指心脏不能以代谢的组织需要的速度泵血的心功能异常。心力衰竭包括多种疾病状态如充血性心衰、心肌梗死、快速性心律不齐、家族性心肌肥大症、缺血性心脏病、先天性扩张性心肌症、心肌炎等等。心力衰竭可以由多种因素引起，包括，但不限于：缺血的、先天的、风湿的、或原发形式。慢性心脏肥大是一种明显的疾病状态，是充血性心力衰竭和心脏停跳的前兆。

此处所用“神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”是指能够结合并激活ErbB2、ErbB3、 ErbB4或其异源或同源二聚体的蛋白或多肽，包括神经调节蛋白的异构体、神经调节蛋白中的EGF样功能域、包含神经调节蛋白EGF样功能域的多肽、神经调节蛋白的突变体或衍生物以及其它能够激活上述受体的神经调节蛋白样的基因产物。神经调节蛋白还包括NRG-1， NRG-2，NRG-3和NRG-4蛋白、多肽、片段以及具有NRG样功能的复合物。优选的，神经调节蛋白是可以结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体的蛋白或多肽。作为例子，但并非为了限制的目的，本发明的神经调节蛋白(重组人纽兰格林rhNRG)是NRG-1β2异构体的一个片段，即177-237位氨基酸片段，其中包含了EGF样功能域。该片段的氨基酸序列为：SHLVKCAEKEKTFCVNGGECFMVKDLSNPSRYLCKCPNEFTGDRCQNYVMASFYKAEELYQ(SEQ ID NO:1)。本发明所用神经调节蛋白可以激活上述受体并调节它们的生物学功能，比如刺激骨骼肌细胞合成乙酰胆碱受体；促进心肌细胞的分化、存活以及DNA合成。神经调节蛋白还包括那些具有并不实质性影响生物学功能的保守性突变的神经调节蛋白突变体。本技术领域中普通技术人员熟知，非关键区域的单个氨基酸的突变一般不会引起该蛋白或多肽的生物学功能的改变 (参见Watson等人,Molecular Biology of the Gene,4th Edition,1987,TheBejacmin/Cummings Pub.co.,p.224)。本发明所用神经调节蛋白可以从天然的来源分离得到，或者通过重组技术、人工合成或其它手段得到。

此处所用“EGF样功能域”或“EGF-like domain”是指由neuregulin基因所编码的可以结合并激活ErbB2、ErbB3、ErbB4或其异源或同源二聚体的多肽片段，并且与下述参考文献中描述的EGF受体结合区域具有结构相似性：WO 00/64400；Holmes等，Science, 256:1205-1210(1992)；美国专利5,530,109和5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol., 13:1061-1067(1998)；Chang等，Nature，387:509-512(1997)；Carraway等，Nature， 387:512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochem.,122:675-680(1997)；以及WO 97/09425。在某些实施方案中，EGF样功能域结合并激活ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3异源二聚体。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-1的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF 样功能域是指NRG-1的第177-226位、177-237位或177-240位氨基酸。在某些实施方案中， EGF样功能域包含NRG-2的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-3 的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含NRG-4的受体结合区氨基酸。在某些实施方案中，EGF样功能域包含美国专利5,834,229中描述的氨基酸序列：Ala Glu Lys Glu Lys ThrPhe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro。

神经调节蛋白，可被制成口服给药、直肠给药、局部给药、吸入给药、口腔给药(如舌下给药)、非肠道给药(如皮下注射、肌肉注射、皮内注射或静脉注射)、经皮给药或者其他合适的给药方式的制剂。在所有给药方式中，最合适的给药途径取决于治疗状况的性质和严重程度，以及所使用特殊神经调节蛋白的性质。神经调节蛋白可以单独给药。或者更适宜的，神经调节蛋白可以与一些药物可接受的载体或赋形剂共同给药。任何适宜的药物可接受载体或赋形剂能够用于目前的方法(参见如Remington:The Science and Practice ofPharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack Publishing Company,April1997)。

附图说明

图1：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心功能的变化

图2：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心肌细胞短链脂酰基CoA脱氢酶表达变化

图3：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心肌细胞中链脂酰基CoA脱氢酶表达变化

图4：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心肌细胞长链脂酰基CoA脱氢酶表达变化

图5：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心肌细胞超长链脂酰基CoA脱氢酶表达变化

图6：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心肌细胞β-羟脂酰CoA脱氢酶表达变化

图7：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心肌细胞丙酮酸脱氢酶表达变化

图8：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心肌细胞柠檬酸合成酶表达变化

图9：NRG连续尾静脉注射10天心衰大鼠心肌细胞α酮戊二酸脱氢酶表达变化

具体实施方式

实施例1 NRG抗大鼠心衰药效实验

1.实验目的

在左侧冠脉结扎致心衰大鼠模型上，用美敦力的胰岛素注射泵持续静脉滴注给予重组人纽兰格林(rhNRG)来验证药物对大鼠心衰模型的治疗作用。

2.实验材料

2.1实验动物

2.1.1品系、来源：Wistar大鼠，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供

2.1.2性别、体重、雄性，210～250g

2.2试剂药物

2.2.1赋形剂：上海泽生科技开发股份有限公司研制，剂型：冻干粉，规格：2mgAlb/瓶

2.2.2重组人纽兰格林(NRG)成品：上海泽生科技开发股份有限公司研制，剂型：冻干粉，规格：250μg/支

2.2.3异氟烷：瑞沃德生命科技有限公司，批号：217180101，规格：100ml/瓶

3.实验器材与设备

3.1麻醉机(异氟烷蒸发器)：MSS INTERNATIONAL LTD

3.2心脏超声检测仪：Vivid E95，探头型号：12S-D

3.5胰岛素泵：美敦力，型号：MMT-712EWS，MMT-722NAS/L

4.实验方法

4.1大鼠冠状动脉结扎致心力衰竭模型的建立

大鼠通过气体麻醉机用4％浓度的异氟烷麻醉，麻醉后仰卧固定，胸部去毛后用75％酒精消毒。胸部左前皮肤切开后，钝性分离胸部肌肉，暴露第4、5肋骨，用止血钳钝性分开4、5 肋的肋间肌，双手配合挤压，使心脏从胸腔内挤出，充分暴露心脏，观察肺充气及心跳情况，充分暴露左心耳和肺动脉圆锥，于二者之间用6-0手术缝线结扎左冠状动脉前降支。然后用力挤压胸部以排气，再缝合胸部肌肉和皮肤，术后放回笼内饲养，并密切观察大鼠状况，如发现急性心律失常发生，紧急进行心脏按摩3～5分钟。

4.2实验分组及给药

4.2.1实验分组情况

术后2、3、4周分别用B超机Vivid E95检测大鼠的心脏功能，第4周心超检测后挑选EF值在约30％-40％范围的大鼠进入下一步实验。这些大鼠根据心超结果随机分成3组，赋形剂组和NRG 6μg/kg组，每天应用胰岛素泵持续尾静脉给药8小时，连续给药10天，NRG给药剂量为0.75μg/kg/h，给药体积为5ml/kg，给药浓度为1.2μg/ml，假手术组只穿线不结扎冠脉，不做给药处理。

4.2.2配药方法

1)赋形剂：2mgAlb/瓶，每瓶加1ml生理盐水配成母液，取0.24ml的母液加入49.76ml的生理盐水稀释成9.6μg/ml的Alb溶液

2)NRG：250μgNRG/瓶，每瓶加1ml生理盐水配成母液，取0.24ml的母液加入49.76ml的生理盐水稀释成1.2μg/ml的NRG溶液

4.3观测指标

4.3.1心脏功能检测

通过气体麻醉机用4％异氟烷麻醉大鼠后，左侧卧位固定在手术板上。将大鼠头部固定气体麻醉机的呼吸面罩内，维持2％浓度的异氟烷。胸部去毛，用75％酒精消毒后，涂抹耦合剂，用大鼠心超探头检测大鼠左心室回声信号。选择“B-mode”,将心超探头放置胸骨左旁，探头示标指向2～3点钟，声束与心脏长轴方向垂直切割心脏，调整探头至两乳头肌水平，即可获得乳头肌水平左心室短轴切面，采集一段左心室乳头肌平面的动态图像并保存。选择“M-mode”，保持探头在乳头肌左心室短轴切面，调整M型取样线使其通过前壁搏动最弱处，调整焦距，采集一段M型曲线(应清晰显示左室腔和左室前后壁)，测量舒张末期及收缩末期左心室内径(D)，采用Teichholtz公式V＝7/(2.4+D)*D³计算左心室舒张末期及收缩末期容积 EDV、ESV，并计算出射血分数(Ejection Fraction,EF)值，EF＝(EDV-ESV)/EDV*100％。

4.4数据处理

所有实验数据用

表示，采用GraphPad Prism 6软件进行单因素方差分析，P<0.05 表明组间具有显著性差异,P<0.01表明组间具有极显著性差异。

5.实验结果

5.1心超结果

给药后NRG治疗组心衰大鼠的EF值在第10天有明显升高，与模型对照组相比，有显著差异(p<0.05)。图1。

6.结论

NRG对心衰大鼠有治疗作用。能够显著提高心衰大鼠的心脏功能。

实施例2 NRG给药对心衰大鼠心脏能量代谢的影响

1.实验目的

观察NRG给药对心衰大鼠心脏能量代谢相关酶的影响

2.实验材料

实验动物为实施例1中心衰造模给药后大鼠，在心超对各大鼠心功能检测后取材该心脏组织。离体分离各大鼠心脏组织中的原代心肌细胞。

3.实验方法

通过CHIP试剂盒，检测心肌细胞中组蛋白H3K27ac在基因组上的富集，通过RNA提取试剂盒提取心肌细胞中RNA。

3.1染色质免疫共沉淀CHIP实验方法

购买

Enzymatic Chromatin IP Kit(Magnetic Beads)#9003试剂盒。严格试剂盒说明书流程进行相关操作。

3.2 RNA提取试剂盒

购买

RNAsimple Total RNA Kit(总RNA提取试剂盒)货号：DP419.严格按照说明书流程进行相关操作。

3.3 RNAseq和Chipseq分析

将通过实验3.1以及3.2所获DNA与RNA交于华大基因进行相关RNAseq和Chipseq分析。

4.数据处理

所有实验数据用

表示，采用GraphPad Prism 6软件进行单因素方差分析，P<0.05 表明组间具有显著性差异,P<0.01表明组间具有极显著性差异。

5.实验结果

RNAseq的结果显示：通过对纽兰格林给药10天以及给药10天后停药30天的心衰大鼠心肌细胞转录组数据分析，我们发现纽兰格林给药以后，相对于模型组有208个基因能长期下调，且该下调能够在停药30天以后得以维持。这些基因主要富集在电子传递链系统复合物I，复合物IV，以及ATP合成酶即复合物V。多个催化脂肪酸β氧化的酶也处于下调状态，如催化脂肪酸降解第一步的短链(图2)、中链(图3)，长链(图4)、超长链脂酰基CoA脱氢酶(图5)，以及第三步β-羟脂酰CoA脱氢酶(图6)。催化糖代谢的酶：丙酮酸脱氢酶(图 7)、柠檬酸合成酶(图8)、α酮戊二酸脱氢酶(图9)处于上调状态。

6.结论

使用纽兰格林的大鼠心肌细胞中脂肪酸代谢相关酶类转录水平下降，糖代谢相关基因转录水平上升。纽兰格林可优化心肌细胞的能量代谢，使得细胞在同等耗氧条件下生产更多的生物能。

序列表

<110> 上海泽生科技开发股份有限公司

<120> 神经调节蛋白用于长效预防、治疗或延迟心脏损伤的方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 61

<212> PRT

<213> 人类(Homo sapiens)

<400> 1

Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn

1 5 10 15

Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr

20 25 30

Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr

35 40 45

Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln

50 55 60

Claims (10)

1.神经调节蛋白在制备治疗心脏疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其中所述神经调节蛋白具有抑制心脏组织的脂肪酸代谢以及促进葡萄糖代谢治疗心脏疾病。

3.根据权利要求1所述的应用，其中所述神经调节蛋白可增强心脏组织中脂肪酸代谢相关酶在转录水平的表达以及降低葡萄糖代谢相关酶在转录水平的表达从而调节能量代谢治疗心脏疾病。

4.根据权利要求1所述的应用，其中所述心脏疾病为心力衰竭。

5.根据权利要求1所述的应用，其中所述心脏疾病为心肌梗死。

6.一种预防、治疗或延迟哺乳动物心肌损伤的方法，该方法包括对需要或希望预防、治疗或延迟心肌损伤的哺乳动物施用调节能量代谢途径药物。

7.根据权利要求4所述的方法，其所述调节能量代谢药物为神经调节蛋白。

8.根据权利要求4所述的方法，其所述哺乳动物是人。

9.一种预防、治疗或延迟哺乳动物心肌损伤的组合物，其中所述组合物包括有效量的纽兰格林和改善心脏耗氧量的药物。

10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述改善心脏耗氧量的药物是雷诺嗪或曲美他嗪。

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