CN115341037A - 一种人脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒 - Google Patents

一种人脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种人脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒，具体涉及使用五种人脂肪酸代谢关键酶基因进行检测的方法。

Description

一种人脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒
本发明要求中国专利申请CN 202111073988.0的优先权，该优先权文件的说明书、说明书附图和权利要求书所记载的内容全文引入本发明的说明书并被作为本发明说明书原始记载的一部分。申请人进一步声明，申请人拥有基于该优先权文件修改本发明的说明书和权利要求书的权利。
技术领域
本发明涉及基因检测领域，特别是涉及一种人脂肪酸代谢关键酶基因检测方法以及试剂盒。
背景技术
代谢组学(Metabolomics/Metabonomics)是20世纪90年代末期发展起来的一门新兴学科，它是通过考察生物体系在遗传改变或受刺激或扰动后，其代谢产物的变化或其随时间的变化，来研究生物体系的一门科学。所谓代谢组(Metabolome)是基因组的下游产物也是最终产物，是一些参与生物体新陈代谢、维持生物体正常功能和生长发育的小分子化合物的集合，主要是相对分子质量小于1000的内源性小分子，这些内源性代谢小分子涉及糖代谢、能量代谢、脂代谢、氨基酸代谢、核酸代谢、辅酶代谢等。
正常状态下的生物体是一个完整的系统，生物体液、细胞和组织中的代谢物处于一个稳定的平衡状态。机体由于遗传或者后天原因发生了病理变化，这一平衡就被打破，代谢产物和代谢过程也产生了相应的变化。通过代谢组学分析了解小分子代谢在疾病过程中的变化，可以帮助人们寻找有关的生物标志物(biomarker)，可以辅助疾病的诊断，也可以帮助人们通过小分子物质本身涉及的代谢通路了解疾病的发病机制并为药物研发提供特异性的靶标。近年来，代谢组学在人类各类疾病的研究中在疾病的早期诊断中取得了诸多具有重大意义的研究成果，如心血管疾病、糖尿病和癌症，相关论文发表在学术期刊《Nature》、《Nature medicine》、《Journal of hepatology》和《Cancer research》上，展现了代谢小分子在人类疾病诊断中巨大的潜力与价值。
其中，脂肪酸代谢的研究越来越受到重视，脂肪酸是指一端含有一个羧基的长的脂肪族碳氢链，是机体主要能量来源之一。脂肪酸根据碳链的长短可分为短链、中链、长链脂肪酸；根据饱和度的不同可分为饱和、单不饱和、多不饱和脂肪酸。人和动物体内脂肪酸主要是长链脂肪酸，其来源一是机体自身合成，二是食物供给。脂肪酸在生命过程中具有非常重要的作用。研究表明，诸如高血压、血脂紊乱、肥胖、胰岛素抵抗、心脑血管疾病及肿瘤等多种疾病都与脂肪酸代谢异常有关。
目前，脂肪酸检测的分析方法多集中在气相色谱-质谱联用(GC-MS)方法，以及高效液相色谱与质谱联用(HPLC-MS)方法，然而上述方法具有定量不够准确，灵敏度欠佳，稳定性差、进样前需进行繁琐的预处理，费时、费力等缺点。临床医学上很多疾病和脂肪酸的变化有密切关系，机体器官生理和病理变化往往会引起体内脂肪酸成分的改变，检测机体中脂肪酸的水平，对研究不同条件下血脂代谢情况，诊断某种脂肪酸水平异常引起的疾病以及调整补充机体所需、改善营养疗效等方面具有重要意义。因此对脂肪酸代谢的检测对及时了解脂肪酸代谢疾病非常重要，更方便、快捷、准确的脂肪酸检测方法还有待研究者的进一步研究。
目前使用PCR等生物检测手段检测脂肪酸代谢的方法较少，一般均需要实验人员自行选择相关基因且需自行设计引物，而脂肪酸代谢通路基因较多，全部进行检测费时且成本高，选取部分基因又容易遗漏脂肪酸代谢检测的关键步骤，且自行设计的引物往往需要进行大量的检测及预实验才能找到合适的引物及实验条件，且目前市场上还没有相关的试剂盒。
发明内容
针对上述急需解决的技术问题，本发明的发明人经过多年对脂肪酸代谢的通路(脂肪酸氧化分解)的研究，综合文献并多次实验，找到脂肪酸代谢的关键基因，选择肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶为关键检测基因，即通过上述五个基因就能够检测出脂肪酸代谢水平，而不需要检测脂肪酸代谢的所有基因。对上述基因组合进行PCR检测，检测结果可靠准确，方便快捷。
本发明的第一方面，提供了一种脂肪酸代谢水平的检测方法，其特征在于，所述方法通过检测人脂肪酸代谢关键酶基因来指示脂肪酸代谢水平，所述人脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成。
在第二个方面中，本发明提供了一种人脂肪酸代谢关键酶基因在制备脂肪酸代谢水平的检测试剂盒中用途，其特征在于，所述人脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成。
在第三个方面中，本发明提供了一种检测脂肪酸代谢水平的试剂盒，其特征在于，通过检测人脂肪酸代谢关键酶基因来指示脂肪酸代谢水平，所述人脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成。
优选的，所述检测方法为PCR法。
优选的，所述试剂盒或所述方法中涉及的所述五个基因的PCR检测引物如下：
①肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)，CPT
CPT1a：Product size 201bp
Forward:CAACAAGCCAGACCCCTCAG
Reverse:GTCCTTGACTTATAATCCCCGTCT
CPT1b：product size 219bp
Forward:TTGCATCCAGAGATGCCTCC
Reverse:ACAGACTCTAGGTAAGCCCAG
CPT2：product size 210bp
Forward:AAGAAGCAGCAATGGGCCAG
Reverse:ACCCAACACCAAAGCCATCA
②脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)
ACSL3：product size 203bp
Forward:TGCAGTTGTCTACGCGGC
Reverse:ACGAATTCTGTATCGCTACGC
ACSL4：product size 250bp
Forward:AGAGAAAAAGAGGACATTTGCGT
Reverse:CAAGTGGACAGGCAGCAAAA
ACSL5：product size 213bp
Forward:AAGCTGGCCCAAGGAGAATAC
Reverse:GGCTTTGACTTGGTTTTGGCA
ACSL6：product size 200bp
Forward:TGTGCTCATCTCCTTCCTGC
Reverse:CCTGGCTGAAGATCTTGTCGT
③脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)
ACADVL:product size 205bp
Forward:CCGGAGAGATTCGGAGATGC
Reverse:TTTCCTGGTCAGAGCGTCAG
ACADM:product size 221bp
Forward:GGGTTCGGGCGATGCTG
Reverse:AGGGGGACTGGATATTCACCA
④烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)
ECH1:product size 201bp
Forward:TACTGACCCGGCGACTGA
Reverse:TGGCATTCCTCTTGTTGGGC
⑤β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)
HADHA:product size 249bp
Forward:CCAAGGGCTTCCTAGGTCGT
Reverse:CAAAGACGGCTCCGATGTCT
对比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)目前商品化的RT-PCR的引物有Taqman标签的引物，但这类引物成本(售价)较高，Taqman引物需要专门的PCR仪器，或者专门的通道，使用不方便。本技术方案在多次实验中，成功发现了q-PCR效果较好，并且本发明所筛选的引物产物单一且稳定，降低了成本提高了检测效率。
(2)本发明技术方案里包含了脂肪酸代谢中多个限速酶(关键基因)，可以帮助快速检测多个基因，而不需要从引物设计网站上设计的引物需要反复做预实验，避免产物不单一，PCR不稳定，需要重复实验的情况；
(3)尽管现在基因测序技术已经较为普遍，但是由于探针的结合问题，测序的结果往往不能覆盖研究人员想关注的所有基因，因此，需要RT-PCR进一步对这些感兴趣的关键基因进行检测。本发明包含的PCR产物可应用于不同的人源细胞提取的RNA(也可尝试用于从人组织中提取的RNA)进行RT-PCR检测。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1：脂肪酸代谢的通路关键基因位置图
图2：PCR反应条件
图3：肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)PCR检测结果
图4：脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)PCR检测结果
图5：脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)PCR检测结果
图6：烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)PCR检测结果
图7：β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)PCR检测结果
图8：PCR凝胶分析；其中“-”表示阴性对照
图9：CPT1a引物对扩增效果；
图10：CPT1b引物对扩增效果；
图11：CPT2引物对扩增效果；
图12：实时定量PCR的结果。*p<0.05；**p<0.01,****p<0.0001
图13：实时定量PCR的结果：RKO为人结直肠癌细胞系，U87为人脑胶质瘤细胞系。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1脂肪酸代谢的通路关键基因PCR引物的筛选
根据前期研究和文献调研，选择脂肪酸代谢通路关键酶基因——肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶，并分别对其PCR扩增引物进行开发。在相同的PCR程序条件下(图2)，我们通过软件为每种酶设计至少1-4种不同的引物并进行进一步筛选，使其满足qPCR的检测要求。
根据上述基因特点通过软件设计各基因的相关引物如下：
①肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)，CPT
CPT1a：Product size 201bp
Forward:CAACAAGCCAGACCCCTCAG
Reverse:GTCCTTGACTTATAATCCCCGTCT
CPT1b：product size 219bp
Forward:TTGCATCCAGAGATGCCTCC
Reverse:ACAGACTCTAGGTAAGCCCAG
CPT2：product size 210bp
Forward:AAGAAGCAGCAATGGGCCAG
Reverse:ACCCAACACCAAAGCCATCA
②脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)
ACSL3：product size 203bp
Forward:TGCAGTTGTCTACGCGGC
Reverse:ACGAATTCTGTATCGCTACGC
ACSL4：product size 250bp
Forward:AGAGAAAAAGAGGACATTTGCGT
Reverse:CAAGTGGACAGGCAGCAAAA
ACSL5：product size 213bp
Forward:AAGCTGGCCCAAGGAGAATAC
Reverse:GGCTTTGACTTGGTTTTGGCA
ACSL6：product size 200bp
Forward:TGTGCTCATCTCCTTCCTGC
Reverse:CCTGGCTGAAGATCTTGTCGT
③脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)
ACADVL:product size 205bp
Forward:CCGGAGAGATTCGGAGATGC
Reverse:TTTCCTGGTCAGAGCGTCAG
ACADM:product size 221bp
Forward:GGGTTCGGGCGATGCTG
Reverse:AGGGGGACTGGATATTCACCA
④烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)
ECH1:product size 201bp
Forward:TACTGACCCGGCGACTGA
Reverse:TGGCATTCCTCTTGTTGGGC
⑤β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)
HADHA:product size 249bp
Forward:CCAAGGGCTTCCTAGGTCGT
Reverse:CAAAGACGGCTCCGATGTCT
按照图2所示程序使用以上各组引物进行PCR反应，从而进一步筛选优选引物组。考虑到qPCR的特点，产物需控制在100-150bp，且与其他基因没有重复，以保证扩增产物单一。各组引物的扩增曲线和溶解曲线分别如图3-7所示。扩增曲线可展示引物是否可以扩增出产物，当扩增曲线(Amplification Curve)达到指数期时：说明扩增成功；而单一的溶解曲线可以说明PCR的产物中是否存在引物二聚体的干扰，当溶解曲线(Melting Curve)有唯一峰时：说明产物单一。
每个基因同时扩增一组以无菌水为模板的阴性对照组，当该组均无扩增曲线出现时，说明扩增的产物并非引物二聚体所致。
进一步的，通过对PCR的琼脂糖凝胶电泳图进行分析(图8)，可筛选获得产物在100-200bp之间的引物组(实时定量PCR要求)，同时，琼脂糖凝胶电泳图还可以显示出PCR结果是否为特异的(只有一条带，没有其他杂带和引物二聚体)。
以CPT1为例，CPT1a可以得到较好的扩增效率，且无引物二聚体产生(图9)，但是CPT1b的引物会产生大量的引物二聚体(图10)，而CPT2的引物无法得到单一条带的引物(图11)。因此我们最终选定将CPT1a作为CPT优选的引物序列。其他基因的引物也都经过如上的引物检测盒筛选，如ACSL3、ACADVL也为优选的引物序列。
实施例2利用筛选的引物来检测药物对脂质代谢的影响
脑组织是体内脂质含量最为丰富的器官之一，且脂质代谢活跃。我们前期的实验数据结果显示，临床常见的降脂药——非诺贝特(Fenofibrate)，在使用该药物之后，脑部脂质代谢会受到抑制，可以有效抑制人脑胶质瘤细胞U87的增殖，细胞周期，以及迁移能力。而与脂质代相关的关键酶(即本试剂盒中的引物所扩增的产物)其表达在RNA水平上也会下降。为了进一步确定加入非诺贝特(Fenofibrate)对脑部脂质代谢，特别是对脂质代谢中关键酶的影响，我们利用实施例1筛选的检测引物所制备的快速检测试剂盒进行实验：
将Fenofibrate药物以终浓度25μM加入人脑胶质瘤U87细胞系(购于钰博生物)培养基中，培养24h后提取total RNA，用实际盒中的引物及设定的程序检测所有引物的反应性和特异性。
PCR的结果显示(图12)：
1.所有的关键酶基因都可以得到扩增；
2.可以准确检测到加药前后其RNA水平上的变化。
为了检测该引物的特异性，将该引物同样以终浓度25μM加入人结直肠癌RKO细胞系(购于钰博生物)培养基中，培养24h后提取total RNA，用实际盒中的引物及设定的程序检测所有引物的反应性和特异性。PCR结果如图13所示，结果显示该试剂盒中所用引物对不同癌种有很好的区分度。

Claims (2)

1.一种检测脂肪酸代谢水平的试剂盒，其特征在于，通过检测人脂肪酸代谢关键酶基因来指示脂肪酸代谢水平，所述人脂肪酸代谢关键酶基因由肉碱脂酰转移酶、脂酰CoA合成酶、脂酰CoA脱氢酶、烯酰CoA水化酶、β-酮硫解酶组成，所述试剂盒中含有PCR检测所必需的试剂，其中，所述试剂盒中含有所述人脂肪酸代谢关键酶基因基因的PCR检测引物，所述引物如下：
①肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)，CPT
CPT1a：
Forward:CAACAAGCCAGACCCCTCAG
Reverse:GTCCTTGACTTATAATCCCCGTCT
②脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)
ACSL3：product size 203bp
Forward:TGCAGTTGTCTACGCGGC
Reverse:ACGAATTCTGTATCGCTACGC
③脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)
ACADVL:product size 205bp
Forward:CCGGAGAGATTCGGAGATGC
Reverse:TTTCCTGGTCAGAGCGTCAG
④烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)
ECH1:product size 201bp
Forward:TACTGACCCGGCGACTGA
Reverse:TGGCATTCCTCTTGTTGGGC
⑤β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)
HADHA:product size 249bp
Forward:CCAAGGGCTTCCTAGGTCGT
Reverse:CAAAGACGGCTCCGATGTCT。
2.一组人脂肪酸代谢关键酶基因在用于制备检测脂肪酸代谢变化的试剂盒中的应用，其特征在于，所述脂肪酸代谢关键酶基因及其检测引物包括：
①肉碱脂酰转移酶(carnitine acyl transferase)，CPT
CPT1a：
Forward:CAACAAGCCAGACCCCTCAG
Reverse:GTCCTTGACTTATAATCCCCGTCT
②脂酰CoA合成酶(acyl-CoA synthetase)
ACSL3：product size 203bp
Forward:TGCAGTTGTCTACGCGGC
Reverse:ACGAATTCTGTATCGCTACGC
③脂酰CoA脱氢酶(acyl CoA dehydrogenase)
ACADVL:product size 205bp
Forward:CCGGAGAGATTCGGAGATGC
Reverse:TTTCCTGGTCAGAGCGTCAG
④烯酰CoA水化酶(enoyl CoA hydratase)
ECH1:product size 201bp
Forward:TACTGACCCGGCGACTGA
Reverse:TGGCATTCCTCTTGTTGGGC
⑤β-酮硫解酶(beta-ketothiolase deficiency,BDK)
HADHA:product size 249bp
Forward:CCAAGGGCTTCCTAGGTCGT
Reverse:CAAAGACGGCTCCGATGTCT。
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