CN105969867A - Cpt1a在aml组织样品中表达水平的检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

CPT1A在AML组织样品中表达水平的检测方法及其应用。本发明提供了肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对，其中之一引物对的序列是gagagacagcaagcacatcg(SEQ ID NO：2)和cgtccaaaataggcctgacg(SEQ ID NO：3)或者它们的互补序列，本发明引物对用于检测肉毒碱棕榈酰基转移酶1A的表达高低，可进一步对急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估。本发明还提供了包含所述引物对的基因芯片和试剂盒。

Description

CPT1A在AML组织样品中表达水平的检测方法及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及急性髓系白血病基因的检测、危险度分层和临床预后评估，特别是涉及急性髓系白血病基因的检测引物、基因芯片和试剂盒。
背景技术
急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一种异质性极强的恶性血液病，占成人急性白血病的80％左右(参见MROZEK K,HEEREMA N A,BLOOMFIELD C D.,Cytogenetics in acute leukemia[J].Blood reviews,2004,18(2):115-36)，它包括许多具有不同遗传异常状况和临床特征的实体，预后具有高度的异质性。在NCCN(NationalComprehensive Cancer Network)危险度分层指南中，约有一半以上的AML被分在中危组(包括全部的正常核型急性髓系白血病Cytogenetically Normal AML,CN-AML)，现有技术缺乏用于危险度分层和临床预后评估的有效标志物，因此，目前临床上AML的分层诊断及个体化治疗非常困难，亟待找到有效的预后标志物来确认此类患者治疗的强度，以实现精准的个体化治疗，避免一部分预后良好的患者治疗强度过大，带来众多不必要的并发症，同样也避免另一部分预后不良的患者治疗强度不足，最终导致白血病复发。
有一部分AML内部存在致病的基因突变，这些基因突变具有对AML患者进行危险度分层和临床判断预后的价值，例如携带FLT3-ITD(参见WHITMAN S P,MAHARRY K,RADMACHERM D,et al.FLT3internal tandem duplication associates with adverse outcome andgene-and microRNA-expression signatures in patients 60years of age or olderwith primary cytogenetically normal acute myeloid leukemia:a Cancer andLeukemia Group B study[J].Blood,2010,116(18):3622-6)的正常核型AML患者属于高危组，而携带NPM1突变(参见DOHNER K,SCHLENK R F,HABDANK M,et al.Mutantnucleophosmin(NPM1)predicts favorable prognosis in younger adults with acutemyeloid leukemia and normal cytogenetics:interaction with other gene mutation[J].Blood,2005,106(12):3740-6)、CEBPA双突变(参见PASTORE F,KLING D,HOSTER E,etal.Long-term follow-up of cytogenetically normal CEBPA-mutated AML[J].Journalof hematology&oncology,2014,7)的患者具有相对较低的危险度和较好预后。CN104508143A公开了用于诊断、预测、治疗和处理急性髓系白血病的方法，该方法涉及预测患有急性髓系白血病患者的生存率，包括：分析从所述患者分离的遗传样品是否存在细胞遗传学异常，以及在基因FLT3、NPMI、DNMT3A、NRAS、CEBPA、TET2、WTI、IDHI、IDH2、KIT、RUNXI、MLL-PTD、 ASXLI、PHF6、KRAS、PTEN、P53、HRAS和EZH2中的至少一者中是否存在突变。
发明内容
本发明的目的是提供一种敏感性高，通用性好，特异性强的标志物，来检测AML细胞或组织样品，来帮助判断AML患者的危险度分层或临床预后，是基于以下的考虑：(1)基因突变不能覆盖所有的AML，而基因表达可以覆盖所有的AML患者；(2)AML发生、发展的分子机理目前仍不清楚，寻求新的临床预后标志物有助于理解AML的发病机理，并且能为AML的精准靶向治疗奠定基础。
本发明人发现CPT1A(carnitine palmitoyltransferase 1A,肉毒碱棕榈酰基转移酶1A)高表达可提示急性髓系白血病细胞的存在，并且可提示急性髓系白血病的不良预后。CPT1A是长链脂肪酸由胞浆转移到线粒体氧化供能的关键限速酶，位于线粒体外膜，催化长链脂肪酸从酰基辅酶A转移到肉毒碱上进而从胞浆进入线粒体内部，并且进一步在位于线粒体内膜上的肉毒碱棕榈酰转移酶2催化下进行β氧化。人类CPT1A基因定位于11q13.1～q13.5区，主要表达于肝、肾、肺组织。CPT1A基因全长约60kb，包括18个编码外显子。因此，本发明提供CPT1A作为AML标志物，其敏感性高，通用性好，特异性强，能用来帮助判断AML患者的危险度分层或临床预后。
一方面，本发明提供一种检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A表达高低的方法，特征在于，使用CPT1A基因的引物对或者探针。所述检测包括体外检测，包括非诊断目的检测。基于与正常对照细胞相比差异表达的CPT1A的急性髓系白血病癌症特异性特征(signature)的鉴定及其应用，设计特定CPT1A基因引物对或探针，来检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A的表达高低，通过检测CPT1A的表达高低来对AML患者进行危险度分层并分析临床预后。CPT1A高表达的AML样品具有较高的危险度分层和较差的临床预后。CPT1A低表达的AML样品具有较低的危险度分层和较好的临床预后。
第二方面，本发明提供一种检测急性髓系白血病细胞或组织样品中CPT1A表达高低的试剂盒，特征在于，其中包含CPT1A基因的引物对或者探针。
第三方面，本发明提供一种检测急性髓系白血病细胞或组织样品中CPT1A表达高低的基因芯片，特征在于，其中包括固相载体和CPT1A基因的引物对或者探针。
进一步地，本发明提供了CPT1A基因的引物对或者探针在制备通过检测CPT1A的表达高低而对急性髓系白血病进行危险度分层或预后评估的基因芯片或试剂盒中的用途。
更进一步地，由于本发明人发现急性髓系白血病与CPT1A基因差异表达相关，因此本发明提供CPT1A基因在设计或制备用于急性髓系白血病检测、危险度分层或预后评估的试剂或试剂 盒中的用途。
本发明还提供了CPT1A在筛选或制备用于治疗急性髓系白血病的药物中的用途。
在AML细胞或正常细胞中CPT1A差异表达的序列的鉴定以及导致不同预后结果的差异表达允许以许多方法使用该信息。例如，可评估特定的治疗方案(例如，确定化疗药物是否改善特定患者的长期预后)。此外，CPT1A基因表达谱(或个体基因)允许筛选抑制AML表达谱或将不良预后谱转变成更好的预后谱的药物候选物。
本发明也提供了测定AML受试者的预后的方法，其包括，测量来自受试者的受试样品中CPT1A基因产物的水平(其与AML的特定预后例如好的或积极的预后、差的或不利的预后相关)。根据这些方法，与对照样品中相应的CPT1A基因产物的水平相比，受试样品中与特定预后相关的CPT1A基因产物水平的改变，指示受试者患有具有特定预后的AML。CPT1A基因产物表达高与不利(即，差)预后相关。不利预后的实例包括、但不限于，低存活率和疾病快速进展。
在本发明的一个具体实施方案中，提供一种检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A表达高低的方法，特征在于，使用CPT1A基因的引物对，所述引物对的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3。
在本发明的另一个具体实施方案中，提供一种检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A表达高低的方法，特征在于，使用CPT1A基因的引物对，所述引物对的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6。
在本发明的又一个具体实施方案中，提供一种检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A表达高低的方法，特征在于，使用CPT1A基因的引物对，所述引物对的序列是下面的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9。
在本发明提供的一种检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A表达高低的试剂盒的一个具体实施方案中，所述试剂盒包含CPT1A基因的引物对，所述引物对的序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6
第三组引物对:
LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9。
在本发明提供的一种检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A表达高低的基因芯片的一个具体实施方案中，所述基因芯片包括固相载体和CPT1A基因的引物对，所述引物对的序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
第二组引物对:
LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6
第三组引物对：
LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9。
因此，优选地，本发明也提供了一组引物对，特征在于，其序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6
第三组引物对：
LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9。
在本发明更优选的技术方案中提供了一组引物对，所述引物是SEQ ID NO：2和SEQID NO：3的序列或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3。
优选地，本发明还提供了一种基因芯片，特征在于，其包括固相载体和上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列。本发明也提供了一种试剂盒，其包含上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列。本发明上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒用于检测细胞或组织中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低。在本发明的一个优选具体实施方案中，上述引物对、基因芯片、试剂盒用于检测急性髓系白血病细胞或组织中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低。在本发明的一个更优选的具体实施方案中，上述引物对、基因芯片、试剂盒用于非诊断目的检测急性髓系白血病细胞或组织中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低。
优选地，本发明还提供了一种检测细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。在本发明的一个更优选具体实施方案中，本发明提供了一种检测急性髓系白血病细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。在本发明的一个优选具体实施方案中，本发明提供了一种非诊断目的的检测急性髓系白血病细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。所述检测肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低是对离体细胞或组织样品的检测。
优选地，本发明提供了引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列在制备通过检测肉毒碱棕榈酰基转移酶1A的表达高低而对急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的基因芯片中的用途；以及上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3的序列或者它们的互补序列在制备通过检测肉毒碱棕榈酰基转移酶1A的表达高低而对急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的试剂盒中的用途。
更优选地，本发明提供了用于检测细胞或组织样品中CPT1A的表达高低的一组引物对，其序列是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
在一个具体实施方案中，所述CPT1A的序列是SEQ ID NO：1。PCR扩增产物大小是219，产物序列是SEQ ID NO：4。优选地，所述细胞或组织样品是AML细胞或组织样品，所述检测是非诊断目的的检测。
更优选地，本发明还提供了一种用于检测CPT1A的表达高低的基因芯片，特征在于，其包括固相载体和上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列。本发明也提供了一种用于检测CPT1A的表达高低的试剂盒，其包含上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列。在本发明的一个优选具体实施方案中，上述引物对SEQID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列、基因芯片、试剂盒用于检测急性髓系白血病细胞或组织中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低。在本发明的一个优选的具体实施方案中，上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列、基因芯片、试剂盒用于非诊断目的检测急性髓系白血病细胞或组织中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低。
更优选地，本发明还提供了一种非诊断目的的检测细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的方法，特征在于，使用本发明的上述引物对SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3的序列或者它们的互补序列、其基因芯片或试剂盒。更优选地，其中所述细胞或组织样品是急性髓系白血病细胞或组织样品。所述检测肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低是非诊断目的的，是对离体细胞或组织样品的检测。
在本发明的一个具体实施方案中，提供了用于通过检测CPT1A的表达高低而对急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的一组引物对，其序列是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
在一个具体实施方案中，所述CPT1A的序列是SEQ ID NO：1。PCR扩增产物大小是219，产物序列是SEQ ID NO：4。
在本发明一个具体实施方案中，提供了用于通过检测CPT1A的表达高低而对急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的基因芯片，其包括固相载体和引物，所述引物是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的序列或者它们的互补序列。本发明还提供了序列是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3或者它们的互补序列的引物在制备通过检测CPT1A的表达高低而对急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的基因芯片中的用途。
在本发明一个具体实施方案中，提供了用于通过检测CPT1A的表达高低而对急性髓系白血病患者进行危险度分层或临床预后评估的试剂盒，其包含序列是SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3的引物或者它们的互补序列。本发明还提供了序列是SEQ ID NO：2和SEQ IDNO：3或者 它们的互补序列的引物在制备通过检测CPT1A的表达高低而对急性髓系白血病患者进行危险度分层或预后的试剂盒中的用途。
在上面的具体实施方案中，使用的引物对可以用SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6代替，PCR扩增产物大小是203，扩增产物序列是SEQ ID NO：7。使用的引物对还可以是SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9，PCR扩增产物大小是182，扩增产物序列是SEQ ID NO：10。SEQ ID NO：1是CPT1A的序列，5260bp。
进一步地，本发明还提供了CPT1A基因在设计或制备用于急性髓系白血病检测、危险度分层或预后评估的试剂或试剂盒中的用途。
进一步地，本发明提供了CPT1A在筛选或制备用于治疗急性髓系白血病的药物中的用途。
本发明肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对序列或者它们的互补序列、包含载体和CPT1A引物对或探针的基因芯片、包含CPT1A引物对或探针的试剂盒、检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A表达高低的方法，可以用于临床或非临床检测CPT1A表达水平，可以用于诊断或非诊断目的。可以利用本发明提供的CPT1A基因引物对、芯片、试剂盒，检测急性髓系白血病细胞或组织中CPT1A表达高低的方法，通过对AML患者的细胞或组织样品检测CPT1A的表达高低来对AML患者进行危险度分层并分析临床预后。CPT1A高表达的AML患者具有较高的危险度分层和较差的临床预后。CPT1A低表达的AML患者具有较低的危险度分层和较好的临床预后。本发明提供的CPT1A基因引物、基因芯片、试剂盒还可以用于非临床或非诊断目的，包括但不限于实验室研究，细胞培养或组织培养中CPT1A的检测，血液制品检测、标准控制等等。
本发明CPT1A基因的引物对或探针可以通过本领域技术人员公知的方法进行设计，可以通过本领域公知的生物或化学合成技术制备本发明的引物或探针。可使用多种本领域技术人员熟知的技术测量基因产物的表达水平。例如使用RNA印迹分析，NorthernBlot，Southern Blot，Western Blot，或者荧光定量PCR检测，检测受试样品中基因产物的水平低于对照样品中相应的基因产物的水平，或者受试样品中基因产物的水平高于对照样品中相应的基因产物的水平。
附图简要描述
图1所示是CPT1A在CN-AML患者和正常人组织样本中的表达及与其它预后标志物之间的关系比较图。
图1A所示是CN-AML患者骨髓组织样品VS正常人骨髓组织样品CPT1A表达增高显示图。纵坐标是CPT1A表达水平。
图1B所示是CN-AML患者外周血组织样品VS正常人外周血组织样品CPT1A表达增高显示图。
图1C所示是已知预后标志物在CPT1A表达高低组分布情况进行比较的结果图。预后不良标志物倾向于在CPT1A高表达组中出现，预后良好标志物倾向于在CPT1A低表达组中出现。
图2所示是CPT1A在AML和CN-AML患者组织样品中的检测及预后分析显示图。
图2A所示是对全部CN-AML和欧洲白血病协作组(European Leukemia Network，ELN)分组的中危-Ⅰ患者组织样品进行CPT1A表达水平与总生存率(Overall Survival，OS)分析结果的显示图。CPT1Ahigh在全部CN-AML和ELN中危-I组中具有较短的OS(p＝0.042，p＝0.013)。纵坐标是总生存率；横坐标是生存时间(月)。
图2B所示是对全部CN-AML和ELN中危-Ⅰ组患者组织样品进行CPT1A表达水平和无事件生存率(EFS)分析结果的显示图。CPT1Ahigh在全部CN-AML和ELN中危-I组中具有较短的EFS(p＝0.037，p＝0.008)。纵坐标是无事件生存率；横坐标是生存时间(月)。
图2C所示是对全部AML患者和美国国立综合癌症协作组(NationalComprehensive Cancer Network，NCCN)中危AML患者组织样品进行CPT1A表达水平检测及预后分析的结果显示图，CPT1Ahigh在全部AML和NCCN中危AML患者组织样品中具有较短的OS(p＝0.008，p＝0.021)。纵坐标是总生存率；横坐标是生存时间(月)。
图2D所示是对全部AML患者和NCCN中危AML患者组织样品进行CPT1A表达水平检测及预后分析的结果显示图，CPT1Ahigh在全部AML和NCCN中危AML患者组织样品中具有较短的EFS(p＝0.002，p＝0.024)。纵坐标是无事件生存率；横坐标是生存时间(月)。
具体实施方式
CPT1A引物委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。以实时荧光定量PCR检测CPT1A表达高低。实时荧光定量PCR常用的荧光染料有Taqman探针、SYBR Green I等。SYBRGreen I是一种荧光染料，可以和任意的双链DNA结合，通过荧光信号的收集，反映模板拷贝数的多少。本发明主要采用SYBR Green I进行实时荧光定量PCR检测。
实施例1总RNA的提取
实验操作中，与RNA提取及检测有关的微量移液器、Tip枪尖、EP管等均需经过无RNase处理。
1、裂解细胞：向收集的细胞沉淀中加入1ml的QIAZOL试剂，振荡器震荡混匀，室温作用15分钟以上使其充分裂解。若加入QIAZOL试剂后不能立刻提取RNA，可将其放入-20℃保存，短期内可用。
2、按照氯仿：QIAZOL体积比为1:4的比例，加入约300μl氯仿，上下颠倒混匀1分钟，室 温静置5-10分钟，低温离心：4℃，12600rpm离心10分钟。
3、离心完毕后，EP管内液体分三层，上层为含有RNA的上清液，中下层为DNA和蛋白质。然后，将上清液转移至新的EP管中，并加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，低温静置10分钟，离心：4℃，12600rpm离心15分钟。
4、弃上清，白色沉淀即为RNA，加入1ml的75％乙醇(DEPC水配制)，轻轻颠倒混匀，常温离心：8000rpm离心5分钟。
5、溶解RNA：去上清，并将EP管倒扣于吸水纸上，吸干管口。再于离心机上空甩几秒，用加样枪将剩余的酒精全部吸出，风干3-5分钟。加入一定体积的无核酸酶的水溶解RNA。
6、紫外分光光度计检测RNA浓度。提取得到的RNA放-20℃保存，一个月内可用；置于-80℃则可保存相对较长时间。
实施例2RNA反转录
1、按照表1配制反转录体系，总反应体积为25μl(总RNA量为1μg)。以下操作均在冰上进行：
表1反转录体系的配制
2、将以上各反应组分配制到0.2ml的PCR反应管中后，放入PCR仪中进行逆转录反应，程序为37℃，2h；4℃，forever。反应结束后得到的产物即为cDNA，将反应产物取出后放于-20℃保存待用。
实施例3实时荧光定量PCR检测
1、按照表2配制real time PCR mix。
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，Nuclease-free water，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因肉毒碱棕榈酰基转移酶1A的引物对SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3和内参GAPDH的引物(甘油醛-3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)，轻轻混匀。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃，5s；60℃，20s；一共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物SEQ ID NO：4。
4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
表2real time PCR mix的配制
实施例4实时荧光定量PCR检测
1、按照表2配制real time PCR mix。
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，Nuclease-free water，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因肉毒碱棕榈酰基转移酶1A的引物对SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6和内参GAPDH的引物，轻轻混匀。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃，5s；60℃，20s；一共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物SEQ ID NO：7。
4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
表2real time PCR mix的配制
实施例5实时荧光定量PCR检测
1、按照表2配制real time PCR mix。
2、反应管中先配制2倍体积的2×SYBR GreenⅠ，Nuclease-free water，模板cDNA以及ROXⅡ混合物，混匀后分装至两个0.2ml的PCR反应管中，再分别加入目的基因肉毒碱棕榈酰基转移酶1A的引物对SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9和内参GAPDH的引物，轻轻混匀。
3、将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行PCR扩增，反应程序为95℃，1分钟；95℃，5s；60℃，20s；一共40个循环。然后95℃，1分钟；60℃，1分钟，95℃，30s。荧光收集点在60℃，反应结束后取出PCR产物SEQ ID NO：10。
4、将获得数据进行统计分析，以GAPDH作为内参照。
表2real time PCR mix的配制
实施例6CPT1A在CN-AML患者和正常人骨髓或外周血样品中的表达检测与比较及与其它AML预后标志物之间的比较
对原始细胞在70-97％的CN-AML患者骨髓样品115例和正常人骨髓样品5例进行基因芯片检测以获得CPT1A基因的表达水平，试验条件与实施例1－2相同，得到图1A，表明GSE1159(GSE1159是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo中样本集的索引号)中115例AML患者骨 髓组织样品(原始细胞在70-97％)VS 5例正常人骨髓组织样品CPT1A表达增高(p＝0.017)(图1A)。以原始细胞在70-97％的AML患者外周血样品7例，正常人外周血样品10例进行CPT1A表达检测，得到图1B，表明GSE9476中7例CN-AML患者外周血样品(原始细胞在70-97％)VS 10例正常人外周血样品CPT1A表达增高(p＝0)(图1B)。
实施例7CPT1A表达水平的测定及与其它已知CN-AML预后标志物之间的比较
根据实施例1－2的试验条件，利用高通量基因芯片获取基因表达水平，对CN-AML患者组织样品中CPT1A和其它预后标志物的表达水平进行了检测和比较，结果发现，已知预后不良标记物倾向于在CPT1A高表达患者中出现，预后良好标志物倾向于在CPT1A低表达组中出现(图1C)。
实施例8CPT1A的表达水平检测及与CN-AML其它指标的单因素和多因素分析
根据实施例1－2的试验条件，利用高通量基因芯片获取基因表达水平，基于156例初治CN-AML患者骨髓样本对CPT1A的表达水平和CN-AML其它指标进行单因素和多因素分析。
单因素检测及分析结果证实：在CPT1Ahigh组，1)更多的CN-AML患者属于M1(p＝0.03)；2)携带FLT3-ITD的比例更高(p＝0.05)；3)具有较高的ERG、BAALC、WT1、DNMT3B、DNMT3A、MAPKBP1、ITPR2、ATP1B1、RUNX1、TCF4和CXXC5的表达(均p＜0.05)(表3)。
多因素分析中同样证实：与其它预后不良因素比较，不管是在全部的CN-AML中还是CN-AML的ELN Intermediate-I分组中，CPT1Ahigh均为OS和EFS的高风险因子(表4)。
表3：CPT1A的表达水平与CN-AML相关指标的单因素分析
Variable CPT1Ahigh,n＝78 CPT1Alow,n＝78 P
Median age.y(range) 47.5(16-77) 53(18-77) 0.03
FAB subtype,no.
M0 0 3 0.25
M1 29 16 0.03
M2 20 12 0.16
M4 10 14 0.51
M5 16 23 0.62
M6 1 0 1
Other 2 10 0.03
Double CEBPA(No FLT3-ITD),no 6 8 0.78
NPM1(No FLT3-ITD),no 17 18 1
FLT3-ITD,no. 39 26 0.05
FLT3-TKD,no 9 11 0.81
High ERG,no. 52 26 <0.001
High BAALC,no. 46 32 0.04
High WT1,no. 51 27 <0.001
High DNMT3B,no 48 30 0.006
High DNMT3A,no 50 28 <0.001
High MAPKBP1,no 46 32 0.04
High ITPR2,no 51 27 <0.001
High ATP1B1,no 51 27 <0.001
High RUNX1,no 55 23 <0.001
High TCF4,no 49 29 0.002
High CXXC5,no 49 29 0.002
FAB,French-American-British classification；ITD,internal tandem duplication；TKD,tyrosine kinase domain.
表4：CPT1A的表达水平在整体CN-AML和ELN中危-I组CN-AML中预后评估的多因素分析
实施例9CPT1A高表达是AML及CN-AML患者的不良预后标志物
根据实施例1－2的试验条件，利用高通量基因芯片获取基因表达水平，对334例AML患者的组织样品进行表达水平检测，并进行预后分析。图2所示是CPT1A在AML或CN-AML患者组织样品中的预后分析显示图。在全部AML(334例)中，CPT1Ahigh具有较短OS(p＝0.008)和EFS(p＝0.002)(图2C、D)。在NCCN指南中危组AML中，CPT1Ahigh同样具有较短的OS(p＝0.0021)和EFS(p＝0.0024)(图2C、D)。
利用高通量基因芯片获取CPT1A基因的表达水平，基于CPT1A表达水平对156例CN-AML组织样品进行预后分析，在全部CN-AML患者中(156例)中，CPT1Ahigh具有较短的OS(p＝0.042)和EFS(p＝0.037)(图1A、B)。图2A所示是对全部CN-AML和欧洲白血病协作组(European Leukemia Network，ELN)分组的中危-Ⅰ患者组织样品进行CPT1A表达水平与总生存率(Overall Survival，OS)分析结果的显示图。CPT1Ahigh在全部CN-AML和ELN中危-I组中具 有较短的OS(p＝0.042，p＝0.013)。
图2B所示是对全部CN-AML和ELN分类中中危-Ⅰ组患者组织样品进行CPT1A表达水平和无事件生存率分析结果的显示图。CPT1Ahigh在全部CN-AML和ELN中危-I组中具有较短的EFS(p＝0.037，p＝0.008)。图2C所示是对全部AML患者和美国国立综合癌症协作组(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)中危AML患者组织样品进行预后分析的结果显示图，CPT1Ahigh在全部AML和NCCN中危AML患者组织样品中具有较短的OS(p＝0.008，p＝0.021)。图2D所示是对全部AML患者和NCCN中危AML患者组织样品进行预后分析的结果显示图，CPT1Ahigh在全部AML和NCCN中危AML患者组织样品中具有较短的EFS(p＝0.002，p＝0.024)。
结论：1)CPT1A高表达是AML患者的预后不良标志物；2)CPT1A高表达是CN-AML患者的预后不良产物；3)CPT1A高表达在AML的NCCN中危组和CN-AML的ELN中危-Ⅰ组中均是预后不良标志物，因此CPT1A高表达可以作为预后标志物进一步细化AML患者危险度分层和预后评估。CPT1A高表达的AML样品具有较高的危险度分层和较差的临床预后。CPT1A低表达的AML样品具有较低的危险度分层和较好的临床预后。
上述实施例只是为了详细说明本发明，而不是在任何方面限制本发明的保护范围。
。
序列表
SEQ ID NO：1：CPT1A的mRNA序列,5260bp：
ggacccgcctcagccaatccgctgctgccggcgtcgggtgcgctcggcctcgcccgcggc
cctccttccccggctcccgctcgccgctcgttcactccaccgccgccgccgccgccgccg
ctgccgctgccgctgccgcacctccgtagctgactcggtactctctgaagatggcagaag
ctcaccaagctgtggcctttcagttcacggtcactccggacgggattgacctgcggctga
gccatgaagctcttagacaaatctatctctctggacttcattcctggaaaaagaagttca
tcagattcaagaacggcatcatcactggcgtgtacccggcaagcccctccagttggctta
tcgtggtggtgggcgtgatgacaacgatgtacgccaagatcgacccctcgttaggaataa
ttgcaaaaatcaatcggactctggaaacggccaactgcatgtccagccagacgaagaacg
tggtcagcggcgtgctgtttggcaccggcctgtgggtggccctcatcgtcaccatgcgct
actccctgaaagtgctgctctcctaccacgggtggatgttcactgagcacggcaagatga
gtcgtgccaccaagatctggatgggtatggtcaagatcttttcaggccgaaaacccatgt
tgtacagcttccagacatcgctgcctcgcctgccggtcccggctgtcaaagacactgtga
acaggtatctacagtcggtgaggcctcttatgaaggaagaagacttcaaacggatgacag
cacttgctcaagattttgctgtcggtcttggaccaagattacagtggtatttgaagttaa
aatcctggtgggctacaaattacgtgagcgactggtgggaggagtacatctacctccgag
gacgagggccgctcatggtgaacagcaactattatgccatggatctgctgtatatccttc
caactcacattcaggcagcaagagccggcaacgccatccatgccatcctgctttacaggc
gcaaactggaccgggaggaaatcaaaccaattcgtcttttgggatccacgattccactct
gctccgctcagtgggagcggatgtttaatacttcccggatcccaggagaggagacagaca
ccatccagcacatgagagacagcaagcacatcgtcgtgtaccatcgaggacgctacttca
aggtctggctctaccatgatgggcggctgctgaagccccgggagatggagcagcagatgc
agaggatcctggacaatacctcggagcctcagcccggggaggccaggctggcagccctca
ccgcaggagacagagttccctgggccaggtgtcgtcaggcctattttggacgtgggaaaa
ataagcagtctcttgatgctgtggagaaagcagcgttcttcgtgacgttagatgaaactg
aagaaggatacagaagtgaagacccggatacgtcaatggacagctacgccaaatctctac
tacacggccgatgttacgacaggtggtttgacaagtcgttcacgtttgttgtcttcaaaa
acgggaagatgggcctcaacgctgaacactcctgggcagatgcgccgatcgtggcccacc
tttgggagtacgtcatgtccattgacagcctccagctgggctatgcggaggatgggcact
gcaaaggcgacatcaatccgaacattccgtaccccaccaggctgcagtgggacatcccgg
gggaatgtcaagaggttatagagacctccctgaacaccgcaaatcttctggcaaacgacg
tggatttccattccttcccattcgtagcctttggtaaaggaatcatcaagaaatgtcgca
cgagcccagacgcctttgtgcagctggccctccagctggcgcactacaaggacatgggca
agttttgcctcacatacgaggcctccatgacccggctcttccgagaggggaggacggaga
ccgtgcgctcctgcaccactgagtcatgcgacttcgtgcgggccatggtggacccggccc
agacggtggaacagaggctgaagttgttcaagttggcgtctgagaagcatcagcatatgt
atcgcctcgccatgaccggctctgggatcgatcgtcacctcttctgcctttacgtggtgt
ctaaatatctcgctgtggagtcccctttccttaaggaagttttatctgagccttggagat
tatcaacaagccagacccctcagcagcaagtggagctgtttgacttggagaataacccag
agtacgtgtccagcggagggggctttggaccggttgctgatgacggctatggtgtgtcgt
acatccttgtgggagagaacctcatcaatttccacatttcttccaagttctcttgccctg
agacggattctcatcgctttggaaggcacctgaaagaagcaatgactgacatcatcactt
tgtttggtctcagttctaattccaaaaagtaattccactggagctgctgggaaggaaaac
gagctcttctgatgcaaaccaaatgaaaaataggcattaatcctgaccttagctcgggat
gaaacactgctcttaaaaaaactcagttttccttccagaaaatgtgggtgtttttttttc
ctagaacagtatctctcccctgtgaagcataaccccactacttccagacttgccctccct
tgggggacatctgataaagtctcccctgatgtctccgcatcggcttggatttattaaggg
atgcaaatcttgttgagttaatgaaggaattagtagggttgtggcttcacacacagtgga
atggaaatggtgtgctttctcagtggcaaccgaaggcctagtgcttaagggcatttagca
tcatccaagcagggtaaacttttgttttgttaaaagaaaaatgtgttattcaagttggtg
tccccagttgtagctaacacatctggaatgcactaaccaaaatgctgtgctttggagacc
tgcttttgtcaccgtgggtaaccgttcccgtctggtccagtagcctgtgtttgcctctcc
acatttgaagcaagcaggatgcaaggtcttcagttttactgaccttgtatgtcttcaagt
cttcacaacccagtgccttaaaaatgaaaggccctaaatgtaagggagatggagagaaag
atttattttgtagagtctttgggtggaattgtgggtatactgttcccttcacaattgact
gagtatggataaccgtacataagcatttgctacaccccaccagccccctccccctcagaa
acaccagttccttcccaagggcagctgtgccagactcccctcccgggactgccttcttgt
catcataagcaacaaaagaaataacaggcacatgtcataaaaggggagcaagggccgtga
tggtcagataattcactcaagaataaaacatgacacgtgcctcaggaggatctctttccc
aaagtgacagcaaggagggcagggcatcggccaccaagcggggactagcaagtgaggaag
gggagggcagcccaccgtggtgaggagagagtggctccacgaccccaagggatggccttc
tcctcccacccggtgaggggaaagactcaccagagggtgatggagacagtatgccggctc
accttggtgaccagccaagatgtctcaagtgacagtgctaggtgttcacccagcctgtcc
ttcagataggagtgccttcacgaaagcgtctcatggaccacaaagcaattatgcactgag
tcatcttcagtatttaatgcaaaaatgaagcatcatggaatgaaattcccactgtctgtc
atgacaagcttagctgtccattgttttaaattgtgtatttatttttttgaccacttggtt
ctagttgggcctgactccttcagagtgctgcaccccgatagtacaacagcgatggctgaa
ctgttggagtcgatggaaggtgcttgccggagaacacgtgcctttttttttttttttttt
tttgagatggagtttcactcttgttgcccaggctggagtgcagtggtgcaatctcggctc
actgcagcatctgccttgcaggttcaagcgattctcctgtctcagcctcccaagtagctg
ggattacacgcccaacaccatgccctgctaatttttgtatttttagtagagacggggttt
catcatattggtcaggctggtctcgaactcctgacctcaggtgatccacctgcctcagcc
tcccaaagtgctgggattacaggcatgagccaccatgcgcggcccacatgcatgttttat
gtatgtatacttcatgatgtaaaaatcccacctttatgggccaaagattttttttctcct
gaaagcaagaaaaaatgaaaacaaaagacaaaaaaaaaaaaaaaagcgtccaggcgcggt
ggctcatgcgtgtaatcccagcactttgggaggccaaggcgggcggatcacgaggtcagg
agatggagaccatcctggctaacacggtgaaaccccgtctctactaaaaattcaaaaaat
gagccgggcgtggtggcgggcgcctgtagtcccagctactcaggaggctgaggcaggaga
atggcgtgaacccgggaggcggagcttgcagtgagccgagatcgctccactgcactccag
cctgggcgacagagcgagactccgtctaaaaaaaaaagcaaaaacaaaccaacaacaaaa
gcccctgactgtccgtcaagcaggcagcggggatgtagctctctctgccctgggcaagaa
tagcacttcccgttaaaagccagcagccggcgtcagtccctatcagagccagctagatca
tgcactgttgaccactgagcaatctgtgttacactagagttcacagggcattttgagtgt
agacgtgagtgcttaaacatatttgggtttctctctcaggttttaaatgtttcaaatgta
attgttgctcatcagtgcagttatcaatgcaattttatattccttgaggggagaaagagg
ggtcttattgtacatgtccaaggggggtgataagagtattatctgtttaatttaattgga
acaaaccattgtcttaacgcagccatggtttgaatttgttatcttgggctgaccggtgca
tgtaaatacagtatgctctttggatgtaaatcttagaaatgcagtgtgaatgtaggttat
cattaataaaacattaaccccagtctactacaaaaaaaaa
SEQ ID NO：2：CPT1A引物：
gagagacagcaagcacatcg
SEQ ID NO：3：CPT1A引物：
cgtccaaaataggcctgacg
SEQ ID NO：4：CPT1A的PCR扩增产物序列:
gagagacagcaagcacatcgtcgtgtaccatcgaggacgctacttcaaggtctggctcta 60
ccatgatgggcggctgctgaagccccgggagatggagcagcagatgcagaggatcctgga 120
caatacctcggagcctcagcccggggaggccaggctggcagccctcaccgcaggagacag 180
agttccctgggccaggtgtcgtcaggcctattttggacg 219
SEQ ID NO：5：CPT1A引物：
cagcatatgtatcgcctcgc 20
SEQ ID NO：6：CPT1A引物：
ctggacacgtactctgggtt 20
SEQ ID NO：7：CPT1A的PCR扩增产物序列:
cagcatatgtatcgcctcgccatgaccggctctgggatcgatcgtcacctcttctgcctttacgtggtg 69
tctaaatatctcgctgtggagtcccctttccttaaggaagttttatctgagccttggagattatcaaca 138
agccagacccctcagcagcaagtggagctgtttgacttggagaataacccagagtacgtgtccag 203
SEQ ID NO：8：CPT1A引物：
ctcacatacgaggcctccat 20
SEQ ID NO：9：CPT1A引物：
gcgaggcgatacatatgctg 20
SEQ ID NO：10：CPT1A的PCR扩增产物序列:
ctcacatacgaggcctccatgacccggctcttccgagaggggaggacggagaccgtgcgctcctgcacc 69
actgagtcatgcgacttcgtgcgggccatggtggacccggcccagacggtggaacagaggctgaagttg 138
ttcaagttggcgtctgagaagcatcagcatatgtatcgcctcgc 182

Claims (10)

1.一种用于检测急性髓系白血病细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的试剂盒，特征在于，其中包含肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对或者探针。
2.一种用于检测急性髓系白血病细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的基因芯片，特征在于，其中包括固相载体和肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对或者探针。
3.一种检测急性髓系白血病细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的方法，特征在于，使用肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对或者探针。
4.根据权利要求1的检测急性髓系白血病细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的试剂盒，特征在于，其中所述肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6
或者
第三组引物对：
LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9。
5.根据权利要求2的检测急性髓系白血病细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的基因芯片，特征在于，其中所述肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6
或者
第三组引物对：
LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9。
6.根据权利要求3的检测急性髓系白血病细胞或组织样品中肉毒碱棕榈酰基转移酶1A表达高低的方法，特征在于，其中所述肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对是下面任一组的 序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6
或者
第三组引物对：
LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9。
7.一组引物对，特征在于，其序列是下面任一组的序列或者它们的互补序列：
第一组引物对：
第一组引物对：
LEFT PRIMER gagagacagcaagcacatcg SEQ ID NO：2
RIGHT PRIMER cgtccaaaataggcctgacg SEQ ID NO：3
第二组引物对：
LEFT PRIMER cagcatatgtatcgcctcgc SEQ ID NO：5
RIGHT PRIMER ctggacacgtactctgggtt SEQ ID NO：6
或者
第三组引物对：
LEFT PRIMER ctcacatacgaggcctccat SEQ ID NO：8
RIGHT PRIMER gcgaggcgatacatatgctg SEQ ID NO：9。
8.肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因的引物对或者探针在制备通过检测肉毒碱棕榈酰基转移酶1A的表达高低而对急性髓系白血病进行危险度分层或预后评估的基因芯片或试剂盒中的用途。
9.肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因在设计或制备用于急性髓系白血病检测、危险度分层或预后评估的试剂、试剂盒或基因芯片中的用途。
10.肉毒碱棕榈酰基转移酶1A基因在筛选或制备用于治疗急性髓系白血病的药物中的用途。
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