CN1743006A - Mapk抑制剂的新用途及组合物 - Google Patents

Abstract

本发明发现PI3－K抑制剂、MAPK抑制剂可以明显改善哺乳动物心力衰竭心功能。本发明还发现PI3－K抑制剂、MAPK抑制剂与哺乳动物心力衰竭治疗药物rhNRG联合使用，可以明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，两者有协同作用。本发明提供了用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病的方法及组合物。具体说，本发明提供了PI3K抑制剂、MAPK抑制剂用于预防、治疗或延缓哺乳动物心脏病方法及组合物，该方法包括对需要或希望预防、治疗或延缓的哺乳动物施用有效量的PI3K抑制剂、MAPK抑制剂或与其它哺乳动物心脏病治疗药物联合使用，以预防、治疗或延缓所述心脏病。

Description

MAPK抑制剂的新用途及组合物

技术领域：

本发明发现PI3-K抑制剂、MAPK抑制剂可以明显改善哺乳动物心力衰竭心功能。本发明还发现PI3-K抑制剂、MAPK抑制剂与哺乳动物心力衰竭治疗药物rhNRG联合使用，可以明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，两者有协同作用。本发明提供了用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病的方法及组合物。具体说，本发明提供了PI3K抑制剂、MAPK抑制剂用于预防、治疗或延缓哺乳动物心脏病方法及组合物，该方法包括对需要或希望预防、治疗或延缓的哺乳动物施用有效量的PI3K抑制剂、MAPK抑制剂或与其它哺乳动物心脏病治疗药物联合使用，以预防、治疗或延缓所述心脏病。

背景技术：

有丝分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，属丝氨酸/苏氨酸残基激酶，广泛存在于真核细胞。MAPK超家族蛋白质的磷酸化-去磷酸化状态对生命过程起重要的调节作用。研究表明MAPK信号传导途径对细胞的生长、增殖、分裂、分化、迁移及死亡、炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号起重要的作用(Cobb，M.H.Prog.Biophys.Mol.Biol.71，479-500.1999；Garrington，T.P.and Johnson，G.L.Curr.Opin.Cell Biol.11，211-218，1999；Lewis，T.S.et al.Adv.Cancer Res.74，49-139，1998；Schaeffer，H.J.and Weber，M.J.Mol.Cell Biol.19，2435-2444，1999；Whitmarsh，A.J.andDavis，R.J.Trends Biochem.Sci.23，481-485，1998)。WO0039075发现MAPK信号传导途径与心肌细胞分化、心肌细胞中的肌原纤维节、细胞骨架结构、或心肌细胞间连接的重新构建有关。但抑制MAPK信号传导途径对心肌及心功能的影响未见报告。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphotidylinositol 3-kinase，PI3K)包括p85及110KD构成的异源二聚体复合物。PI3K催化磷脂酰肌醇(phosphotidylinositol，PI)形成3，4-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3，4 bisphosphate，PI(3，4)P2)和3，4，5-三磷酸肌醇(phosphatidylinositol 3，4，5 trisphosphate，PI(3，4，5)P3)，这两种磷酸肌醇可作为胞内信号蛋白从而引发相应的生物学效应。在PI3K细胞信号传导中胞外信号分子与细胞表面G蛋白耦联型受体结合，激活质膜上的磷脂酶C(PLC-β)，使质膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)两个第二信使。IP3与内质网上的IP3配体门钙通道结合，开启钙通道，使胞内Ca2+浓度升高，激活各类依赖钙离子的蛋白。因此，IP3在细胞内的钙调节起重要的作用。DG结合于质膜上，可活化与质膜结合的蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)，PKC以非活性形式分布于细胞溶质中，引发相应的生物学效应如细胞分泌、肌肉收缩、细胞增殖和分化等(Kazlauskas and Cooper Cell 58：1121.1989；Coughlin et al.Science 243，1191.1989；Whitman et al Nature 332，644.1988；Kaplan et al.Cell50：1021.1987；Fukui and Hanafusa Mol.Cell.Biol.9，1651.1989；Carpenter et al.J.Biol.Chem.265，19704.1990)。Kodama研究发现，由gp130介导的PI3K信号传导与心肌肥大有关(Kodama F，Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.279，1635.2000)。

许多疾病与细胞信号传导异常有关，原因可能是因为信息分子异常、受体信号传导异常、G蛋白信号传导异常、细胞内信号传导异常或多环节细胞信号传导异常引起。同时，由于人体内不同的细胞信号途径之间存在广泛交叉，不同刺激可引起相同的病理反应或疾病。例如心肌肥大的发病过程中，心肌负荷过重引起的机械刺激，神经体液调节产生的去甲肾上腺素、血管紧张素等，可通过不同的信号传导蛋白的传递，最终引起相同的病理反应-心肌肥大。而同一刺激也可作用于不同的受体，引起不同的反应导致不同的病理反应。因此针对细胞传导异常的不同原因，如调整细胞外信息分子的水平，或针对受体的过度激活或不足，可分别采用受体抑制剂或受体激动剂调节受体的结构和功能达到治疗目的。

本发明发现通过抑制PI3-K信号传导途径改善心力衰竭病情和预后是有益的。本发明还发现PI3-K抑制剂与哺乳动物心力衰竭治疗药物rhNRG联合使用，可以明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，两者有协同作用。从而提供了PI3-K抑制剂在用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病、心力衰竭的新用途及组合物。

本发明发现通过抑制MAPK信号传导途径改善心力衰竭病情和预后是有益的。本发明还发现MAPK抑制剂与哺乳动物心力衰竭治疗药物rhNRG联合使用，可以明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，两者有协同作用。从而提供了MAPK抑制剂在用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病、心力衰竭的新用途及组合物。

发明概述：

本发明发现PI3-K抑制剂可明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，可提高哺乳动物EF值。本发明还发现PI3-K抑制剂与哺乳动物心力衰竭治疗药物rhNRG联合使用，可明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，两者有协同作用。本发明提供了PI3-K抑制剂在用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病、心力衰竭的新用途及组合物。本发明涉及PI3-K抑制剂在用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病、心力衰竭药物的组合物。

本发明发现MAPK抑制剂可明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，可提高哺乳动物EF值。本发明还发现MAPK抑制剂与哺乳动物心力衰竭治疗药物rhNRG联合使用，可明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，两者有协同作用。本发明提供了MAPK抑制剂在用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病、心力衰竭的新用途及组合物。本发明涉及MAPK抑制剂在用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病、心力衰竭药物的组合物。

附图说明：

图1.Wortmannin对大鼠左心室细胞PI3K信号传导的抑制

选90-100g的雄性SD大鼠，尾静脉注射0.4mg/Kg的Wortmannin，在Wortmannin注射后15、30、60、120min分别处死大鼠，将大鼠左心室快速取出并剪碎，加入裂解液(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％TritonX-100，2mM sodium orthovanadate，50mM NaF，2mM phenylmethylsulfonylfluoride，protease inhibitor cocktail[Boeringher，Roche])，在冰浴中匀浆。测定蛋白质浓度后直接电泳，经过SDS-PAGE，所有蛋白被电转到PVDF膜上。经过牛奶或者BSA封闭，PVDF膜与抗体结合并最终显影。抗Akt，抗p-Akt抗体购自Cell Signaling Technology。

Wortmannin可以降低大鼠左心室的AKT的磷酸化水平。注射Wortmannin30分钟时，对Akt的抑制作用最强；注射Wortmannin 2小时后，抑制作用明显减弱。

图2.U0126对大鼠左心室细胞MAPK信号传导的抑制

选90-100g的雄性SD大鼠，尾静脉注射0.8mg/Kg的U0126，在U0126注射后15、30、60、120min分别处死大鼠，将大鼠左心室快速取出并剪碎，加入裂解液(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％Triton X-100，2mM sodium orthovanadate，50mM NaF，2mM phenylmethylsulfonyl fluoride，protease inhibitor cocktail[Boeringher，Roche])，在冰浴中匀浆。测定蛋白质浓度后直接电泳，经过SDS-PAGE，所有蛋白被电转到PVDF膜上。经过牛奶或者BSA封闭，PVDF膜与抗体结合并最终显影。抗erk1、抗p-erk抗体购自Santa Cruz Biotechnology。

U0126可以降低大鼠左心室的Erk1、2的磷酸化水平。注射U0126 15分钟时对Erk1、2的抑制作用最强。注射U0126 30分钟后抑制作用开始减弱。

图3.U0126、Wortmannin及rhNRG分别与U0126、Wortmannin联合用药对心力衰竭大鼠的心功能改善作用。

用药5天进行心超检测的结果显示，NRG实验组(D+N组)、U0126实验组(U组)、U0126+NRG实验组(U+N组)、Wortmannin实验组(W组)、Wortmannin+NRG实验组(W+N组)在用药后较用药前的EF值，两者比较具有显著性差异(P＜0.01)。用药前NRG实验组(D+N组)、U0126实验组(U组)、U0126+NRG实验组(U+N组)、Wortmannin实验组(W组)、Wortmannin+NRG实验组(W+N组)EF值分别为53.46±4.27％、54.43±3.75％、53.93±2.53％、53.93±2.71％、52.93±3.77％；用药后NRG实验组(D+N组)、U0126实验组(U组)、U0126+NRG实验组(U+N组)、Wortmannin实验组(W组)、Wortmannin+NRG实验组(W+N组)EF值分别为66.6±10.74％、71.17±12.75％、65.17±8.97％、67.46±5.56％、66.08±9.77％。

实施发明方式

为清楚公开发明内容而不是限制发明，分以下小节详细说明。

A.释义

除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利中请文献、公开的专利文献和其他出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。

在此所用“一个”的意思是“至少一个”或“一个或多于一个”。

在此所用“用于治疗特定疾病的化合物有效用量”是指足以改善或以某种方式减少与该疾病相关症状的用量。该用量可为单一剂量或根据疗程确定的有效剂量。这个用量可治愈疾病，但通常是减轻病情。为了减轻病情，可能需要连续服用。

在此所用“治疗”的意思是使任何临床症状、不适或疾病的症状得到改善或有益改变的方法。治疗也包括含药物有效成分的任何药物的使用。

在此，通过服用特定的药物有效成分治疗达到特定不适症状“改善”是指任何的减轻，不管是永久还是暂时，持续还是短暂，可归于或与服用药物有效成分有关系。

在此所用“重组方法生产”是指用重组核酸方法的生产方法。本方法是以众所周知的用克隆核酸表达其所编码蛋白质的分子生物学方法。

在此所用“互补的”当是指两个核酸分子的核苷酸序列能杂交，优选是低于25％，更优选是低于15％，更加优选是低于5％，最优选是在相对核苷酸处不存在错误配对。优选在严格条件下，这两个分子杂交。

在此所用决定错误配对百分率的“杂交的严格性”规定如下：

高严格性：0.1x SSPE，0.1％SDS，65℃；

中等严格性：0.2x SSPE，0.1％SDS，50℃；(也指适度严格性)

低严格性：1.0x SSPE，0.1％SDS，50℃；

应理解为使用对等的缓冲液、盐和温度，可以获得相当的严格性。

在此所用“载体(或质粒)”是指用于将外源DNA导入细胞进行表达或复制的不连续元件。本领域技术人员熟知选择及使用这些载体。表达载体包括DNA表达载体，该载体有效地与调控序列，例如启动子区域连接在一起调控该DNA片段的表达。所以，一个表达载体是指重组DNA或RNA构建物，例如质粒、噬菌体、重组病毒或其它载体，它们一旦导入适当的宿主细胞中，使克隆的DNA表达。本领域技术人员十分清楚适当的表达载体、能在真核细胞和(或)原核细胞中复制的载体以及保持游离态或整合进宿主细胞基因组的载体。

在此所用“启动子区域或启动子元件”是指调控DNA或RNA转录并与其有效连接的DNA片段或RNA片段。启动子区域是RNA聚合酶识别、结合和转录起始的特定序列，这部分启动子区域特指启动子。同时，启动子区域还包括调控RNA聚合酶识别、结合和转录起始活动的序列。这些序列可以对顺式作用因子或对反式作用因子作出响应。依据调控性质，启动子可以是组成型或调控型。用于原核生物典型的启动子包括噬菌体T7和T3启动子和类似的启动子。

在此所用“有效连接和有效结合”是指效应和调控核苷酸序列如启动子、增强子、转录和翻译终止位点和其他信号序列与DNA间的功能关系。例如，DNA和启动子的有效连接是指DNA和启动子间物质和功能关系。专一识别、结合和转录该段DNA的RNA聚合酶能够从启动子处起始该段DNA转录。为便于优化表达和(或)体外转录，有必要去掉、增加或改变克隆的5′不翻译部分，以便消除多余、潜在不适当替代性翻译(如起始)密码子或其他不论是在转录或翻译水平上干扰或减少表达的序列。其他方法还有将核糖体结合位点共有序列紧接起始密码子的5′插入，可以增强表达(参见，Kozak.生物化学杂志(J.Biol.Chem.)1991；266：19867-19870)。这一改止的愿望或需要可由经验来决定。

在此所用“有丝分裂原活化蛋白激酶”(mitogen-activated protein kinase，MAPK)，属丝氨酸/苏氨酸残基激酶，广泛存在于真核细胞。MAPK超家族蛋白质的磷酸化-去磷酸化状态对生命过程起重要的调节作用。研究表明MAPK信号传导途径对细胞的生长、增殖、分裂、分化、迁移及死亡、炎性细胞因子和多种类型的细胞应激信号起重要的作用(Cobb，M.H.Prog.Biophys.Mol.Biol.71，479-500.1999；Garrington，T.P.and Johnson，G.L..Curr.Opin.Cell Biol.11，211-218，1999；Lewis，T.S.et al.Adv.Cancer Res.74，49-139，1998；Schaeffer，H.J.and Weber，M.J.Mol.Cell Biol.19，2435-2444，1999；Whitmarsh，A.J.andDavis，R.J.Trends Biochem.Sci.23，481-485，1998)。

在此所用“磷脂酰肌醇3-激酶”(phosphotidylinositol 3-kinase，PI3K)是包括p85及110KD构成的异源二聚体复合物。PI3K催化磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)形成PI(3，4)P2和PI(3，4，5)P3，这两种磷酸肌醇可作为胞内信号蛋白从而引发相应的生物学效应。在PI3K细胞信号传导中胞外信号分子与细胞表面G蛋白耦联型受体结合，激活质膜上的磷脂酶C(PLC-β)，使质膜上4，5-二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)水解成1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)两个第二信使。IP3与内质网上的IP3配体门钙通道结合，开启钙通道，使胞内Ca2+浓度升高，激活各类依赖钙离子的蛋白。因此，IP3在细胞内钙调节起转运重要的作用(Kazlauskas and Cooper Cell 58：1121.1989；Coughlin et al.Science 243，1191.1989；Whitman et al Nature 332，644.1988；Kaplan et al.Cell 50：1021.1987；Fukui and Hanafusa Mol.Cell.Biol.9，1651.1989；Carpenter et al.J.Biol.Chem.265，19704.1990)。

在此所用“神经调节蛋白”或“neuregulin”或“NRG”的意思是指与ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3结合，可以激活上述受体的蛋白质或多肽。它能激活上述受体，并调控多种生物反应：如刺激乳房癌细胞分化和乳蛋白的分泌；诱导神经脊细胞分化为Schwann细胞；刺激骨胳肌细胞内乙酰胆碱受体的合成；以及促进心肌细胞成活和DNA合成。常见神经调节蛋白可由例如NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)编码的蛋白质或多肽。由于在多肽的非功能区域的个别氨基酸的改变对其功能无影响(see，e.g.，Watson等.Molecular Biology of the Gene，4th Edition，1987，TheBejacmin/Cummings Pub.co.，p.224)，这里，NRG也包括保留NRG保守氨基酸序列，但治疗作用不变的NRG异构体及突变体。rhNRG可通过基因工程方法获得，本领域技术人员熟知该方法。

在此所用“EGF样结构域”或“epidermal growth factor-like domain”或“EGF-like domain”是指与ErbB2/ErbB4或ErbB2/ErbB3结合，具有与EGF受体结合区域相同结构的多肽结构，常见“EGF样结构域”可由NRG-1、NRG-2、NRG-3，NRG-4基因或核酸(如cDNA)编码。关于EGF样结构域参见WO00/64400，Holmes等.，Science，256：1205-1210(1992)；U.S.Patent Nos.5,530,109and5,716,930；Hijazi等，Int.J.Oncol.，13：1061-1067(1998)；Chang等，Nature，387：509-512(1997)；Carraway等，Nature，387：512-516(1997)；Higashiyama等，J.Biochern.，122：675-680(1997)及WO 97/09425。

B.PI3-K抑制剂用于治疗、预防或延迟哺乳动物心脏病的方法及组合物

本发明发现PI3-K抑制剂可提高哺乳动物EF值，明显改善哺乳动物心力衰竭心功能。本发明还发现PI3-K抑制剂与哺乳动物心力衰竭治疗药物rhNRG联合使用，可明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，两者有协同作用。本发明提供了PI3-K抑制剂在用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病、心力衰竭的新用途及组合物。

PI3K催化PI的肌醇磷酸化形成PI3P(Whitman et al.Nature，(1988)322：664-646)；PI3K还可催化PI形成PI(3，4)P2和PI(3，4，5)P3(Auger et al.Cell，(1989)57：167-175)，PI3-K抑制剂是降低、阻断上述过程的物质。

PI3-K抑制剂包括但不仅限于渥曼青霉素(Wortmannin)、渥曼青霉素类似物、Ly294002、Ly294002类似物。本领域技术人员熟知PI3-K抑制剂，其中渥曼青霉素、Ly294002是PI3-K的专一性的抑制剂。关于Ly294002的化学性质可参阅J.Biol.，Chem.，269：5241-5248，1994。Ly294002是栎精的衍生物，与ATP竞争性结合PI3-K，是PI3-K强抑制剂。PI3-K抑制剂包括但不仅限于渥曼青霉素的醇或酯的衍生物，如在11位、17位或在11、17位同时取代的渥曼青霉素衍生物(参见U.S.Pat.No.5,480,906)。

PI3-K抑制剂包括但不仅限于绿胶霉素(viridin)、绿胶醇(viridiol)、脱甲基绿胶霉素(demethoxyviridin)、脱甲基绿胶醇(demethoxyviridiol)(参见，U.S.Pat.No.5,276,167)。当分离、纯化绿胶霉素(viridin)、绿胶醇(viridiol)、脱甲基绿胶霉素(demethoxyviridin)、脱甲基绿胶醇(demethoxyviridiol)或其它的PI3-K抑制剂时，本领域技术人员可通过下述方法获得其类似物或衍生物，如在U.S.Pat.No.5,276,167公式I所说明的方法，还可参见Grove etal.J.Chem.Soc.，(1965)June：3803-3811，Hanson et al.J.Chem.Soc.PerkinTrans.I：1311-1314(1985).Aldridge et al.J.Chem.Soc.Perkin Trans.I：943-945(1975)，及Blight et al.J.Chem.Soc.Perkin Trans I：1317-1322(1975)。

PI3-K抑制剂还可通过高通量药物筛选方法获得。利用细胞模型和已有的高通量药物筛选设备对组合化学自动合成所提供的小分子化合物及天然药物分离提纯物进行高通量、并行多靶点筛选，从而得到每一个被筛选对象的生物活性指纹谱，并通过利用生物信息学和化学信息学的手段从中挑选出有希望的候选化合物/分离提纯物，再利用生物芯片技术进行系统的跟踪分析，对被筛选对象进行进一步的评价。在本领域技术人员熟知高通量药物筛选方法，化合物库包括但不限于如多肽(参见，U.S.Pat.No.5,010,175，Furka Int.J.Pept.Prot.Res.，(1991)37：487-493，Houghton et al.Nature，(1991)354：84-88)。

本发明能用于任何哺乳动物的预防、治疗或延缓心脏病，例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、奶牛、牛、绵羊、山羊、马、猴子和其它非人的灵长类。本发明的方法优选用于人类心脏病的预防、治疗或延缓。

本发明能用于哺乳动物心脏病的预防、治疗或延缓，例如，心肌病、缺血性心脏病、心肌炎、肥大型心肌病、心肌梗塞、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心力衰竭的预防、治疗或延缓。本发明能用于由于高血压、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌炎、肥大型心肌病、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心律不齐、家族肥大型心肌病、自发扩张型心肌病和心脏毒性药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

本发明能用于因化疗药物、抗精神病药物、抗抑郁病药物、干扰素-α、白细胞介素-2、吐根碱及herceptin等心脏毒性药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

本发明能用于因ADM、柔红霉素、丝裂霉素、博莱霉素、环磷酰胺、氟脲嘧啶、放线菌素D、长春新碱等化疗药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

本发明能用于因氯丙嗪、奋乃静、三氟拉嗪等抗抑郁病药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

本发明能用于因氯丙咪嗪，阿米替林，多虑平等抗精神病药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

PI3K抑制剂能够单独使用。优选的方式是，PI3K抑制剂与药物治疗上可接受的载体或者赋形剂共同使用。任何合适的药物治疗可以接受的载体或者赋形剂能用于本方法中(参见，雷明顿：药剂学科学与实践(Remington：TheScience and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编者)，Mack出版社，1997年4月)。

PI3K抑制剂能够与其它预防、治疗或延缓心脏病的药物联合使用。任何适当的可以预防、治疗或延缓心脏病的药物能用于该组合物中。组合物包括PI3K抑制剂以及有效量的预防或治疗心脏病的药物组成。例如小剂量的阿司匹林或双嘧达莫。预防、治疗或延缓心心脏病和临床症状及其并发症的药物可以是溶血栓药如尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)或甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)等。心律失常治疗药物如利多卡因、美西律、普鲁卡因酰胺、溴苄铵、丙吡胺、妥卡尼、阿托品或奎尼丁肾上腺皮质激素、异丙肾上腺素或麻黄素等。血管收缩药：多巴胺、多巴酚丁胺、间羟胺(阿拉明)或去甲肾上腺素等。血管扩张药可选用硝酸甘油、硝普钠、酚妥拉明、二硝酸异山梨醇、硝苯地平或东莨菪碱等。β阻滞剂如阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔等。ACEI如卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利或喹那普利等。钙离子拮抗剂如硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫等。促进心肌代谢药物：维生素C、辅酶A、肌苷酸钠、细胞色素C、维生素B6等。以及洋地黄类、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等药物。透明质酸酶、吗啡或哌替啶和利尿剂糖皮质激素如甲基强的松龙。抗凝剂如肝素、华法林或双香豆素或苯茚二酮可以用于该组合物中。优选方式，该组合物包括PI3K抑制剂以及有效量的预防或治疗心脏病的药物rhNRG组成，NRG包括神经调节蛋白或含EGF样结构域的神经调节蛋白功能片段。优选方式是rhNRG_177-237。

C.MAPK抑制剂用于治疗、预防或延迟哺乳动物心脏病的方法及组合物

本发明发现MAPK抑制剂可提高哺乳动物EF值，明显改善哺乳动物心力衰竭心功能。本发明还发现MAPK抑制剂与哺乳动物心力衰竭治疗药物rhNRG联合使用，可明显改善哺乳动物心力衰竭心功能，两者有协同作用。本发明提供了MAPK抑制剂在用于预防、治疗或延缓哺乳动物尤其是人类心脏病、心力衰竭的新用途及组合物。

MAPK抑制剂包括但不仅限于PD098059、U0126、SB203580、FR167653、SCIO-469。本领域技术人员熟知MAPK抑制剂，优选MAPK抑制剂是PD098059、U0126。

本发明能用于任何哺乳动物的预防、治疗或延缓心脏病，例如小鼠、大鼠、兔、猫、狗、猪、奶牛、牛、绵羊、山羊、马、猴子和其它非人的灵长类。本发明的方法优选用于人类心脏病的预防、治疗或延缓。

本发明能用于哺乳动物心脏病的预防、治疗或延缓，例如，心肌病、缺血性心脏病、心肌炎、肥大型心肌病、心肌梗塞、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心力衰竭的预防、治疗或延缓。本发明能用于由于高血压、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌炎、肥大型心肌病、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心律不齐、家族肥大型心肌病、自发扩张型心肌病和心脏毒性药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

本发明能用于因化疗药物、抗精神病药物、抗抑郁病药物、干扰素-α、白细胞介素-2、吐根碱及herceptin等心脏毒性药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

本发明能用于因ADM、柔红霉素、丝裂霉素、博莱霉素、环磷酰胺、氟脲嘧啶、放线菌素D、长春新碱等化疗药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

本发明能用于因氯丙嗪、奋乃静、三氟拉嗪等抗抑郁病药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

本发明能用于因氯丙咪嗪，阿米替林，多虑平等抗精神病药物所导致的哺乳动物心力衰竭的预防、治疗或延缓。

MAPK抑制剂能够单独使用。优选的方式是，MAPK抑制剂与药物治疗上可接受的载体或者赋形剂共同使用。任何合适的药物治疗可以接受的载体或者赋形剂能用于本方法中(参见，雷明顿：药剂学科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编者)，Mack出版社，1997年4月)。

MAPK抑制剂能够与其它预防、治疗或延缓心脏病的药物联合使用。任何适当的可以预防、治疗或延缓心脏病的药物能用于该组合物中。组合物包括MAPK抑制剂以及有效量的预防或治疗心脏病的药物组成。例如小剂量的阿司匹林或双嘧达莫。预防、治疗或延缓心脏病和临床症状及其并发症的药物，可以是溶血栓药如尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)或甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)等。心律失常治疗药物如利多卡因、美西律、普鲁卡因酰胺、溴苄铵、丙吡胺、妥卡尼、阿托品或奎尼丁肾上腺皮质激素、异丙肾上腺素或麻黄素等。血管收缩药：多巴胺、多巴酚丁胺、间羟胺(阿拉明)或去甲肾上腺素等。血管扩张药可选用硝酸甘油、硝普钠、酚妥拉明、二硝酸异山梨醇、硝苯地平或东莨菪碱等。β阻滞剂如阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔等。ACEI如卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利或喹那普利等。钙离子拮抗剂如硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫等。促进心肌代谢药物：维生素C、辅酶A、肌苷酸钠、细胞色素C、维生素B6等。以及洋地黄类、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等药物。透明质酸酶、吗啡或哌替啶和利尿剂糖皮质激素如甲基强的松龙。抗凝剂如肝素、华法林或双香豆素或苯茚二酮可以用于该组合物中。优选方式，该组合物包括MAPK抑制剂以及有效量的预防或治疗心脏病的药物rhNRG组成，，NRG包括神经调节蛋白或含EGF样结构域的神经调节蛋白功能片段。优选是rhNRG_177-237。

D.MAPK抑制剂、PI3K抑制剂使用方法、剂量以及给药途径

MAPK抑制剂、PI3K抑制剂使用配方、剂量和给药途径，尤其作为药物组合物时，可根据本技术领域所知的方法加以确定。(参见，雷明顿：药剂学科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro，Mack出版社，1997年4月；治疗用肽和蛋白：配方、加工和传递系统(Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and DeliverySystems)，Banga，1999；肽和蛋白制药配方的发展(Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins)，Hovgaard和Frkjr(编者)，Taylor &Francis公司，2000；脂质体的医学应用(Medical Applications of Liposomes)，Lasic和Papahadjopoulos(编者)，Elsevier Science，1998；基因治疗教程(Textbook of Gene Therapy)，Jain，Hogrefe & Huber出版社，1998；腺病毒：基因治疗的基本生物学(Adenoviruses：Basic Biology to Gene Therapy)，15卷，Seth，Landes Bioscience，1999；生物制药的药物设计和发展(BiopharmaceuticalDrug Design and Development)，Wu-Pong和Rojanasakul(编者)，Humana出版社，1999；治疗学上的血管发生：从基础科学到临床(Therapeutic Angiogenesis：From Basic Science to the Clinic)，28卷，Dole等(编者)，Springer-Verlag NewYork，1999)。MAPK抑制剂、PI3K抑制剂，可配制成用于口服，直肠给药，局部用药，吸入法用药，口腔用药(例如舌下)，注射用药(例如，皮下的，肌内的，皮内的，静脉的)，经皮给药或其他适合的给药途径。在任何给定的情况下，最合适的给药途径将取决于要治疗情况的性质和严重程度以及所用的特定MAPK抑制剂、PI3K抑制剂的性质。

MAPK抑制剂、PI3K抑制剂能够单独使用。优选的方式是，MAPK抑制剂、PI3K抑制剂与药物治疗上可接受的载体或者赋形剂共同使用。任何合适的药物治疗可以接受的载体或者赋形剂能用于本方法中。(参见，雷明顿：药剂学科学与实践(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)，Alfonso R.Gennaro(编者)，Mack出版社，1997年4月)。

本方法能单独使用。或者，本方法能与其它疾病治疗方法联合使用。本方法也能与其它疾病治疗方法联合使用例如例如预防、治疗或延缓心脏病和临床症状及其并发症的药物可以是溶血栓药如尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)、甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)等。预防、治疗或延缓心脏病和临床症状及其并发症的药物可以是心律失常治疗药物如利多卡因、美西律、普鲁卡因酰胺、溴苄铵、丙吡胺、妥卡尼、阿托品或奎尼丁肾上腺皮质激素、异丙肾上腺素或麻黄素等。血管收缩药：多巴胺、多巴酚丁胺、间羟胺(阿拉明)、去甲肾上腺素等。血管扩张药可选用硝酸甘油、硝普钠、酚妥拉明、二硝酸异山梨醇、硝苯地平或东莨菪碱等。β阻滞剂如阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔等。预防、治疗或延缓心脏病和临床症状及其并发症的药物可以是ACEI如卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利或喹那普利等。钙离子拮抗剂如硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫等。促进心肌代谢药物：维生素C、辅酶A、肌苷酸钠、细胞色素C、维生素B6等。以及洋地黄类、胺碘酮、奎尼丁、安他唑啉等药物。透明质酸酶、吗啡或哌替啶和利尿剂糖皮质激素如甲基强的松龙。抗凝剂如肝素、华法林或双香豆素或苯茚二酮等其它心脏病治疗药剂。其它心脏病治疗或药剂能够用于MAPK抑制剂、PI3K抑制剂的之前、之中或之后使用。举实施例而言，MAPK抑制剂、PI3K抑制剂可与心脏病药剂共同使用。

根据本发明，无论单独或是与其它药剂、载体或赋形剂联合使用的MAPK抑制剂、PI3K抑制剂，可以系统用于任何的给药途径，诸如海绵体内注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、皮内注射、口服或局部用药。本方法可以使用以单位剂量形式、一次用量针剂或多剂量容器的含有添加的防腐剂的注射制剂。该配方可以采用油质或水质赋形剂中的悬浊液，溶液或乳浊液形式并且可以包含配方试剂，例如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。活性成分也可以是粉状，以便在使用前与适合的载体、无菌不含热源的水或其他溶剂混合。本发明的局部用药可以采用泡沫状物、凝胶体、霜、药膏、透皮药膏或软膏。

可能用于本发明的药物治疗可接受的组合物和方法包含在，但不仅仅限于美国专利Nos.5,736,154；6,197,801B1；5,741,511；5,886,039；5,941,868；6,258,374B1和5,686,102中。

治疗或预防中药物治疗剂量的大小将随治疗的状况的严重程度和给药途径变化。剂量和剂量频率也将根据病人自身年龄、体重、疾病状况和反应而变化。

主治医生应当知道怎样和何时由于药物毒性或不利的效应终止、中断或将治疗调整到低剂量。相反地，医生应当知道怎样和何时由于临床效应不足(排除了毒性副效应)，将治疗调整到高水平。

可以使用任何适合的给药途径。剂形包括片剂、锭剂、扁囊剂、分散体、悬浊液、溶液、胶囊、药膏和类似形态(参考，雷明顿氏药物治疗科学)。

在实际应用中，无论单独或是与其它药剂联合使用的MAPK抑制剂、PI3K抑制剂，可以根据传统药物治疗混合技术作为活性成分与诸如β-环糊精和2-羟基-丙基-β-环糊精的药物治疗载体或赋形剂形成紧密添加混合物。载体根据期望使用方式，局部或注射用药，采取多种配制形式。在制备用于注射剂的组合物时，例如静脉注射或静脉灌输，相同的制药介质可以使用，水、乙二醇、油、缓冲液、糖、防腐剂、脂质体和其他具有本技术领域技能的人所知的介质。注射组合物的实例包括，但不限于，5％w/v的葡萄糖、正常生理盐溶液或其他溶液。

实施例1.Wortmannin对大鼠左心室细胞PI3K信号传导的抑制

方法：选90-100g的雄性SD大鼠，尾静脉注射0.4mg/Kg的Wortmannin，在Wortmannin注射后15、30、60、120min分别处死大鼠，将大鼠左心室快速取出并剪碎，加入裂解液(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％TritonX-100，2mM sodium orthovanadate，50mM NaF，2mM phenylmethylsulfonylfluoride，protease inhibitor cocktail[Boeringher，Roche])，在冰浴中匀浆。测定蛋白质浓度后直接电泳，经过SDS-PAGE，所有蛋白被电转到PVDF膜上。经过牛奶或者BSA封闭，PVDF膜与抗体结合并最终显影。Western blot参照Kodama F，Circ.Res.81：656-663，1997方法。抗Akt，抗p-Akt抗体购自CellSignaling Technology。

结果

Wortmannin可以降低大鼠左心室的Akt的磷酸化水平。注射Wortmannin30分钟时，对Akt的抑制作用最强；注射Wortmannin 2小时后，抑制作用明显减弱。

实施例2.U0126对大鼠左心室细胞MAPK信号传导的抑制

方法：

选90-100g的雄性SD大鼠，尾静脉注射0.8mg/Kg的U0126，在U0126注射后15、30、60、120min分别处死大鼠，将大鼠左心室快速取出并剪碎，加入裂解液(50mM Tris，pH7.4，5mM EDTA，150mM NaCl，1％Triton X-100，2mM sodium orthovanadate，50mM NaF，2mM phenylmethylsulfonyl fluoride，protease inhibitor cocktail[Boeringher，Roche])，在冰浴中匀浆。测定蛋白质浓度后直接电泳，经过SDS-PAGE，所有蛋白被电转到PVDF膜上。经过牛奶或者BSA封闭，PVDF膜与抗体结合并最终显影。Western blot参照Kodama F，Circ.Res.81：656-663，1997方法。抗erk1、抗p-erk抗体购自Santa CruzBiotechnology。

结果：

U0126可以降低大鼠左心室的Erk1、2的磷酸化水平。注射U0126 15分钟时对Erk1、2的抑制作用最强。注射U0126 30分钟后抑制作用开始减弱。

实施例3.U0126、Wortmannin及rhNRG分别与U0126、Wortmannin联合用药对心力衰竭大鼠的心功能改善作用

方法：

大鼠腹腔注射氯胺酮100mg/kg。麻醉后，仰卧固定于鼠板，颈部及胸部去毛后用新洁尔灭消毒。颈部做正中切口，钝性分离颈前肌肉找到气管，用18G动静脉留置针于第3-5气管软骨间穿入气管后，退出针芯，将塑料套管推入气管内1-2cm，固定后接小动物呼吸机(潮气量约20ml，频率80次/分钟)。胸部左前皮肤切开后，钝性分离胸部肌肉，暴露第4、5肋骨，用弯头纹式止血钳从肋间穿透胸壁，分离肋骨下组织后剪断第4肋，接通呼吸机，暴露心脏，观察肺充气及心跳情况，撕开心包，将上部脂肪垫上翻，充分暴露左心耳和肺动脉圆锥，于二者之间用6/0医用无损伤缝合线结扎左冠状动脉前降支，可看到结扎后心肌梗死区(约8mm×8mm)局部呈现紫色，膨突，活动明显减弱，然后缝合胸壁，堵住呼吸机回气口使肺充盈后，用力挤压胸部以排气，再缝合胸部肌肉和皮肤。观察呼吸情况，有自主呼吸后去除呼吸机，放回笼内饲养。

术后4周，对大鼠进行心超检测，选用EF值下降到48-60％左右的大鼠，随机分为7组，每组6只，分别为假手术组(开胸后撕开心包，不结扎冠状动脉)、阴性对照组(D组)、NRG组(D+N组)、U0126组(U组)、U0126+NRG组(U+N组)、Wortmannin组(W组)、Wortmannin+NRG组(W+N组)。受试药组和阴性对照组给药均为尾静脉注射，每天一次(qd)，连续给药5天。第6天停药行心脏超声检测后，再连续给药3天，给药量，NRG为10μg/Kg，U0126为0.8mg/Kg，Wortmannin为0.4mg/Kg。每次给药容积为0.4ml/100g。第3天停药行心脏超声检测后，并解剖动物，称心重、测心室壁厚度、心脏病理检查及血液生化检测等。

结果：

用药5天进行心超检测的结果显示，D+N组、U组、U+N组、W组、W+N组在用药后较用药前的EF值，两者比较具有显著性差异(P＜0.01)。用药前D+N组、U组、U+N组、W组、W+N组的EF值分别为53.46±4.27％、54.43±3.75％、53.93±2.53％、53.93±2.71％、52.93±3.77％；用药后D+N组、U组、U+N组、W组、W+N组的EF值分别为66.6±10.74％、71.17±12.75％、65.17±8.97％、67.46±5.56％、66.08±9.77％。实验结果见表1、图3。

表1.U0126、Wortmannin及rhNRG分别与U0126、Wortmannin联合用药对心力衰竭大鼠的心功能改善作用

分组	给药方案	EF
					第1次给药前	第1次给药后	第2次给药后
		假手术组D组D+N组U组U+N组W组W+N组	不给药DMSONRGU0126U0126+NRGWortmanninWortmannin+NRG	93.85±1.58％54.59±4.55％53.46±4.27％54.43±3.75％53.93±2.53％53.92±2.71％52.93±3.77％				95.02±1.38％59.8±4.59％66.6±10.75％71.17±12.75％65.17±8.97％67.46±5.56％66.08±9.77％	88.03±0.08％53.7±0.83％60.00±3.96％64.17±15.15％67.37±10.86％74.25±6.8％72.84±7.29％

Claims (20)

1.有效量的MAPK抑制剂用于制备治疗、预防或延迟哺乳动物心脏病药物中的用途。

2.根据权利要求1的用途，其中所述MAPK抑制剂选自PD098059、U0126、SB203580、FR167653、SCIO-469。

3.根据权利要求2的用途，其中所述MAPK抑制剂是PD098059。

4.根据权利要求2的用途，其中所述MAPK抑制剂是U0126。

5.根据权利要求1的用途，其中所述哺乳动物是人。

6.根据权利要求1的用途，其中所述心脏病选自心肌病、缺血性心脏病、心肌炎、肥大型心肌病、心肌梗塞、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心力衰竭。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述心力衰竭是由于高血压、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌炎、肥大型心肌病、病毒性心肌炎、充血性心肌病、心律不齐、家族肥大型心肌病、自发扩张型心肌病和心脏毒性药物所导致。

8.根据权利要求7的用途，其中所述心脏毒性药物选自化疗药物、抗精神病药物、抗抑郁病药物、干扰素-α、白细胞介素-2、吐根碱及herceptin。

9.根据权利要求8的用途，其中所述化疗药物可以是ADM、柔红霉素、丝裂霉素、博莱霉素、环磷酰胺、氟脲嘧啶、放线菌素D、长春新碱。

10.根据权利要求8的用途，其中所述抗精神病药物可以是氯丙嗪、奋乃静、三氟拉嗪。

11.根据权利要求8的用途，其中所述抗抑郁病药物可以是氯丙咪嗪，阿米替林，多虑平。

12.根据权利要求1的用途，其中所述MAPK抑制剂是与药理学可接受载体或赋形剂配制使用的。

13一种组合物，该组合物包括MAPK抑制剂以及有效量的预防或治疗心脏病的药物组成。

14.根据权力要求13所述的组合物，其中预防或治疗心脏病的药物包括ACEI、β受体阻滞剂、钙离子拮抗剂、阿司匹林、阿托品、硝酸甘油、东莨菪碱、NRG以及溶栓类药物。

15.根据权力要求14所述的组合物，ACEI选自卡托普利、雷米普利、福辛普利、赖诺普利、依那普利、喹那普利、西拉普利(cilazapril)或培哚普利(perindopril)。

16.根据权力要求14所述的组合物，β受体阻滞剂选自阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔或塞吗洛尔。

17.根据权力要求14所述的组合物，钙离子拮抗剂选自硝苯地平、维拉帕米、阿罗地平或地尔硫。

18.根据权力要求14所述的组合物，溶栓类药物选自尿激酶、链激酶、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、单链尿激酶型纤溶酶原激活剂(SCUPA)或甲氧苯基化纤溶酶原链激酶复合物(APSAC)。

19.根据权力要求14所述的组合物，NRG包括神经调节蛋白或含EGF样结构域的神经调节蛋白功能片段。

20.根据权利要求13所述的组合物，包括药理学可接受载体或赋形剂。

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