ES2590150T3 - Inactivación viral por caprilato - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de preparación de albúmina a partir de una solución que comprende albúmina, que comprende: ajustar la concentración de proteínas de la solución a menos del 5% en peso; ajustar el pH de la solución a pH 5 o menos; añadir ácido caprílico (ácido octanoico) o caprilato de sodio; aumentar la temperatura de la solución a 27-30 °C; e incubar la solución durante 30 min a 120 min.

Description

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DESCRIPCION
Inactivacion viral por caprilato SECTOR TECNICO
La presente invencion se refiere a procedimientos de inactivacion viral utilizando caprilato durante la purificacion de albumina a partir de plasma.
ANTECEDENTES TECNICOS
La albumina de suero humana (en adelante albumina) es la proteina mas abundante en el plasma sanguineo humano. La albumina circulante es una proteina de 585 aminoacidos con un peso molecular de 67 kDa. La proteina tiene una semivida en suero aproximadamente de 20 dias y esta implicada en el transporte de varias hormonas, metabolitos y farmacos, asi como en el mantenimiento de la presion oncotica y el tamponamiento del pH de la sangre. La albumina se administra terapeuticamente para sustituir el fluido perdido y restaurar el volumen de sangre en pacientes con traumatismos, quemaduras y cirugias.
Cohn describio por primera vez la purificacion de albumina a partir de plasma humano mediante fraccionamiento diferencial. Vease Cohn y otros, J. Am. Chem. Soc. 68: 459-475 (1946); Cohn y otros, J. Am. Chem. Soc. 69: 17531761 (1947); Patentes de Estados Unidos Nos. 2.390.074 y 2.469.193. Estos procedimientos fueron mejorados por Gerlough. Vease las Patentes de Estados Unidos Nos. 2.710.293 y 2.710.294. Dichos procedimientos utilizan etanol frio y la manipulacion del pH, fuerza ionica, concentracion de proteinas y temperatura para precipitar las proteinas del plasma tales como albuminas.
El procedimiento de purificacion de albumina a partir de plasma humano para productos farmaceuticos incluye habitualmente una etapa de inactivacion viral para reducir el riesgo de transmitir virus transportados por la sangre. Estas etapas de inactivacion viral pueden incluir pasteurizacion por calor, disolventes organicos, o combinaciones de disolventes organicos y detergentes (por ejemplo, fosfato de tri-n-butilo y polisorbato 80). Ademas, el acido graso caprilato, o sal del mismo (por ejemplo, caprilato de sodio), ha sido utilizado eficazmente como agente de inactivacion viral. Vease la Patente de Estados Unidos No. 4.939.176; las Solicitudes de Patente Internacional Nos. WO 1998/024485 y WO 2000/056768; Lundblad y Seng, Vox Sang. 60:75-81 (1991); Johnston, Jonstone, y Wu, Biologicals 31: 213-221 (2003). Ademas, el caprilato tambien ha sido utilizado como agente estabilizador y como agente de reparto en la purificacion de albumina humana terapeutica. Veanse las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.250.663 y 5.561.115.
La albumina humana se purifica a partir del Efluente de la Fraccion IV-1 de Cohn o Fraccion V e incluye una etapa de secado con acetona para concentrar la albumina e inactivar los virus. El proceso con acetona es costoso y utiliza grandes cantidades de acetona, lo que crea un peligro de incendio o explosion. Por consiguiente, son deseables procedimientos alternativos de inactivacion viral y concentracion. En el presente documento se describe un procedimiento de purificacion de albumina a partir de plasma humano utilizando inactivacion viral por caprilato en condiciones de pH bajo y elevada temperatura seguido de ultrafiltracion/diafiltracion.
CARACTERISTICAS DE LA INVENCION
La presente invencion se refiere a procedimientos de inactivacion viral utilizando caprilato durante la purificacion de albumina a partir de plasma.
Una realizacion de la presente invencion es un procedimiento de preparacion de albumina a partir de una solucion que comprende albumina que comprende: ajustar la concentracion de proteinas de la solucion a menos del 5% en peso; ajustar el pH de la solucion hasta pH 5 o menos; anadir acido caprilico (acido octanoico) o caprilato de sodio;
min.
como minimo, durante
10 mM a 40 mM. 15 mM a 30 mM. 20 mM.
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, el pH es de 3,8 a 5.
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, el pH es de 5.
aumentar la temperatura de la solucion a 27-30 °C; e incubar la solucion entre 30 min y 120
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, la incubacion se realiza, aproximadamente 90 min.

En algunos aspectos descritos en la presente invencion, la concentracion de caprilato es de

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En algunos aspectos descritos en la presente invencion, el procedimiento ademas comprende: filtrar la solucion; llevar a cabo ultrafiltracion y diafiltracion; formular y envasar a granel la solucion; y esterilizar, llenar y pasteurizar la albumina.
Otra realizacion a la que se refiere la presente invencion es un procedimiento de inactivacion de virus en una solucion que comprende albumina, comprendiendo dicho procedimiento: ajustar la concentracion de proteinas de la solucion a menos del 5% en peso de proteinas; ajustar el pH de la solucion a menos de 5; anadir acido caprilico (acido octanoico) o caprilato de sodio; aumentar la temperatura de la solucion hasta 27 °C - 30 °C; e incubar la solucion, como minimo, durante 90 min.
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, los virus son virus con envoltura lipidica.
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, la concentracion de caprilato es de 15 mM a 30 mM.
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, la concentracion de caprilato es de 20 mM.
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, la incubacion se lleva a cabo durante 90 min.
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, la temperatura es de 30 °C.
En algunos aspectos descritos en la presente invencion, los virus son virus con envoltura lipidica que infectan a los humanos.
BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS
La figura 1 muestra los resultados de la inactivacion viral inducida por caprilato en suspensiones de pasta de albumina de 25 AU a 27 °C, pH 5,1 durante 1 hora. Las concentraciones de caprilato de 0, 10, 15 y 20 mM se evaluaron en intervalos de 0, 0,5 y 1 hora. Los resultados muestran que a 15 mM de caprilato se inactivan de forma eficaz el virus de la diarrea viral bovina y el virus de la estomatitis vesicular hasta el limite de deteccion en 1 hora a 27 °C.
La figura 2 muestra los resultados de la inactivacion viral inducida por caprilato a concentraciones de albumina de 25 o 65 AU, tanto a pH 4,5 o 5,1 en tres temperaturas bajas, 5, 12 y 20 °C durante un periodo de 6 horas. Los resultados muestran que a concentraciones mas bajas de albumina, 20 mM de caprilato fue eficaz como inactivador viral a 20 °C despues de 2 horas. Sin embargo, la inactivacion viral no fue robusta a bajas temperaturas y fue dependiente del pH, el tiempo de incubacion y la concentracion de albumina.
La figura 3 muestra las respuestas del diseno de experimento (DOE) y los valores de reduccion log predichos (LRV) para la concentracion de proteinas en funcion de la concentracion de caprilato (Panel A) a temperatura (27,5 °C) y pH (4,5) constantes. El Panel B muestra las respuestas y LRV predicho para el pH en funcion de la concentracion de caprilato a temperatura (27,5 °C) y concentracion de proteinas (11,5%) constantes.
La figura 4 muestra las respuestas del DOE y LRV predicho para el pH en funcion de la concentracion de proteinas a temperatura (27,5 °C) y concentracion de caprilato (20 mM) constantes.
La figura 5 muestra una grafica de contorno que representa la superficie de respuesta para LRV en los intervalos de confianza de 95 y mayores para el pH en funcion de la concentracion de proteinas a 30 mM de caprilato y 40 °C (Panel A). El Panel B muestra una representacion tridimensional de la superficie de respuesta. Se llevo LRV hasta el valor maximo (es decir, el 100%) con el menor intervalo de prediccion de 95% con las condiciones de pH 4,4 y concentracion de proteinas del 5%, a 30 mM de caprilato y 40 °C.
La figura 6 muestra graficas de contorno que representan la superficie de respuesta para LRV en los intervalos de confianza de 95 y mayores para la concentracion de proteinas en funcion de la concentracion de caprilato a pH 3,96 y 40 °C (Panel A) o pH en funcion de la concentracion de caprilato a 6,6% de proteinas y 36,9 °C (Panel B).
La figura 7 muestra un diagrama de flujo del proceso de purificacion de albumina modificado que incluye una etapa de inactivacion viral por caprilato.
DESCRIPCION DETALLADA
Un procedimiento de purificacion de albumina actual incluye una etapa de secado con acetona. La etapa de secado con acetona ha sido validada como una etapa de inactivacion viral. Sin embargo, la etapa con acetona es dificultosa, requiere de equipamiento de funcionamiento costoso y las grandes cantidades de acetona utilizadas presentan un riesgo de inflamabilidad y/o explosion, que requiere de muchas precauciones de seguridad. Es deseable sustituir las etapas de secado con acetona. La incubacion con caprilato descrita en la presente invencion se puede utilizar como
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una etapa de inactivacion viral y, a continuacion, la albumina se puede concentrar utilizando una etapa de ultrafiltracion/diafiltracion.
El acido caprilico (caprilato; acido octanoico) puede ser un agente de inactivacion viral eficaz. Ademas, actualmente el caprilato se utiliza en la formulacion de albumina y, por lo tanto, la inactivacion viral por caprilato se puede integrar facilmente en el proceso de obtencion de albumina sin introducir reactivos adicionales tales como disolventes o detergentes con cambios minimos en el proceso.
El acido caprilico o caprilato de sodio se anade a las formulaciones de albumina como estabilizador durante la etapa de envase a granel. Sin embargo, el pH de la solucion de albumina en el envasado a granel es muy alto (~7) para crear suficiente acido caprilico libre para la inactivacion viral. El caprilato se puede anadir durante la suspension de la pasta de la Fraccion V (pasta de albumina), que ya es una solucion de pH bajo. Debido a que el caprilato esencialmente es un estabilizador de la albumina, su efecto sobre la albumina es minimo. Una filtracion adecuada antes de UF/DF elimina la mayor parte del caprilato en forma de acido caprilico no disuelto. Como el procesamiento de la albumina continua en las etapas de UF/DF, el pH aumentara y el caprilato de sodio se eliminara por diafiltracion para permitir un envasado a granel normal de la albumina.
En general, el proceso de albumina modificado consiste en la utilizacion del Efluente de la Fraccion IV-1 (o filtrado) o la pasta de Cohn V como material de partida. La pasta de Cohn V se resuspende en agua fria para inyeccion o el Efluente de la Fraccion IV-1 se diluye hasta una concentracion de proteinas aproximadamente de 25 AU (A280). Se anade caprilato de sodio hasta una concentracion de 20 mM de caprilato y el pH se ajusta a menos de pH 5, en caso necesario. A continuacion, la solucion se incuba a 27 °C - 30 °C durante 90 min. Vease la figura 7.
Para evaluar la eficacia viricida, se llevaron a cabo experimentos de inactivacion viral con un grupo de virus con envoltura (es decir, virus de la diarrea viral bovina (BVDV), virus de la pseudorrabia (PRV) y virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)) en la suspension de la Fraccion V de Cohn y la suspension de albumina utilizando un modelo de desescalado del proceso de fabricacion propuesto. La pasta de la Fraccion V o pasta de albumina se suspendio en agua, se inoculo con aproximadamente un 5% de virus, y se ajusto el pH hasta el objetivo adecuado, en caso necesario. Se anadio caprilato de sodio para lograr la concentracion de caprilato de sodio deseada, se verifico el pH de la solucion, y se incubo la solucion a la temperatura adecuada. Las muestras se extrajeron en varios momentos durante la incubacion y se les determino el titulo utilizando ensayos basados en celulas para cuantificar los virus infecciosos. Se observo una inactivacion rapida y eficaz de BVDV, PSV, y HIV en las condiciones adecuadas de pH, concentracion de caprilato, concentracion de proteinas y temperatura.
Se evaluo la capacidad del proceso por separado para las suspensiones tanto de la pasta de la Fraccion V como para la pasta de albumina utilizando un desescalado (500 g de suspension de pasta) del proceso de fabricacion propuesto. Se anadio caprilato de sodio y se ajusto el pH, segun fue necesario, para lograr la concentracion de caprilato y el pH deseados. Tras la incubacion, el material se filtro, se proceso mediante UF/DF, se formulo, se envaso a granel, se filtro de forma esteril y se pasteurizo. Los datos de caracterizacion del producto intermedio y final derivados del proceso modificado de estudio a escala de laboratorio fueron comparables con los datos derivados de un experimento de control a escala de laboratorio y con los datos derivados del proceso de fabricacion actual a gran escala.
Los experimentos a escala de laboratorio del proceso modificado se llevaron a cabo con la pasta de la Fraccion V de Cohn o pasta de albumina. Se disolvieron inicialmente aproximadamente 500 g de pasta en agua fria para inyeccion. A continuacion, la pasta disuelta se calento hasta una temperatura de ~27 °C y se anadio caprilato de sodio hasta una concentracion de ~20 mM. Esta solucion a granel disuelta se dejo incubar durante 90 minutos para dejar que ocurra la inactivacion viral. La clarificacion de la solucion de albumina se llevo a cabo mediante filtracion a traves de un conjunto de filtros. A continuacion, la solucion de albumina clarificada se concentro hasta ~12% p/v por ultrafiltracion, se diafiltro la proteina a granel con solucion salina y agua fria para inyeccion. Se obtuvo una concentracion de ~28% de proteinas mediante una segunda etapa de ultrafiltracion. A continuacion, la solucion a granel de proteinas obtenida de UF/DF se formulo con la adicion de hidroxido de sodio, triptofano y caprilato de sodio. La solucion a granel formulada se filtro de forma esteril, se introdujo en viales, los viales se taponaron y se sellaron. A continuacion, estos viales se pasteurizaron a 60 °C durante 10-11 horas para llegar al recipiente final.
Se descubrio, sorprendentemente, que el caprilato puede actuar como inactivador viral y como estabilizador de manera simultanea durante el proceso a las concentraciones de proteinas y de caprilato utilizadas, y la duracion y temperatura de incubacion. Esto tambien fue sorprendente porque la albumina se une al caprilato y las concentraciones de caprilato fueron eficaces para la inactivacion viral a concentraciones moderadas de proteinas con tiempos de incubacion cortos a temperatura ambiente.
El proceso de purificacion de albumina actual, que incluye la etapa de secado con acetona, se describe en el ejemplo 1 y comienza con el Efluente IV-1 de Cohn o la Fraccion V. Vease Cohn y otros, J. Am. Chem. Soc. 68: 459475 (1946); Cohn y otros, J. Am. Chem. Soc. 69: 1753-1761 (1947); Patentes de EE.UU. Nos. 2.390.074 y 2.469.193.
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Ejemplo 1
Preparacion de Albumina Humana
La Fraccion V de Cohn se suspendio en agua frfa para inyeccion. De forma alternativa, se puede utilizar el Efluente IV-1 en vez de la Fraccion V. Se anadio etanol desnaturalizado frfo (SDA-3A) para obtener una solucion de alcohol aproximadamente del 10%, a la vez que se enfrio la solucion hasta una temperatura aproximadamente de 0 °C. La solucion se mezclo durante aproximadamente 1 hora aproximadamente a 0 °C, y, a continuacion, se clarifico mediante filtracion de profundidad.
A continuacion, la fraccion de albumina se precipito a partir del Efluente IV-1 o la Fraccion V mediante el ajuste del pH, la adicion de etanol desnaturalizado frfo (SDA-3A), e incubacion de la solucion a baja temperatura. Despues de la incubacion a baja temperatura, la fraccion de albumina se separo mediante centrifugacion.
Inactivacion viral por acetona
A continuacion, la fraccion de albumina se suspendio en acetona frfa y se mantuvo durante aproximadamente minutos aproximadamente a 0 °C. La protefna se separo de la suspension y se lavo con acetona frfa. El polvo de albumina humedo se seco haciendo pasar nitrogeno seco y/o aire a traves del polvo.
Concentracion y Filtracion
El polvo de albumina seco se disolvio en agua frfa para inyeccion hasta una concentracion de protefnas aproximadamente del 7%. La solucion de albumina se clarifico mediante filtracion a traves de un conjunto de filtros graduados en porosidad hasta un filtro absoluto final de 0,2 pm (se utilizo diatomita en caso necesario como ayuda de la filtracion). El pH de la solucion de albumina se ajusto aproximadamente a pH 7, se ultrafiltro para concentrar la solucion aproximadamente dos veces y, a continuacion, se diafiltro con NaCl al 3% seguido de agua para inyeccion. A continuacion, la solucion de albumina se concentro, en caso necesario, mediante ultrafiltracion hasta la concentracion de protefnas adecuada (aproximadamente del 25%).
Envasado a granel, Esterilizacion, Llenado y Pasteurizacion
Se preparo una solucion acuosa a granel de albumina mediante el ajuste de la solucion de albumina ultrafiltrada/diafiltrada con caprilato de sodio, excipientes, hidroxido de sodio, cloruro de sodio, y agua para inyeccion para obtener 20 mM de caprilato de sodio, 25% de protefnas, y pH 7. El pH se ajusto con carbonato de sodio 1,0 M y/o HCl 1,0 M, en caso necesario.
La solucion de albumina se esterilizo mediante filtracion a traves de un conjunto de filtros graduados en porosidad hasta un filtro absoluto final de 0,2 pm. La solucion de albumina esteril se lleno de forma aseptica en botellas esteriles y se pasteurizo durante aproximadamente 10 horas aproximadamente a 60 °C. Los recipientes finales se incubaron a 25 °C durante aproximadamente dos semanas y, a continuacion, se almacenaron a temperatura ambiente.
Ejemplo 2
Experimentos de Inactivacion Viral
El tratamiento con acetona de la pasta de albumina es una etapa de inactivacion de virus con envoltura muy eficaz pero es un cuello de botella en el proceso y esta asociada con numerosos problemas de limpieza y seguridad (riesgo de incendios). Por consiguiente, el tratamiento con caprilato es una alternativa posible a la suspension y secado con acetona. Se llevaron a cabo experimentos para evaluar la inactivacion de virus con envoltura mediante tratamiento con caprilato de la suspension de pasta de albumina. Para los estudios, la suspension de pasta de albumina con una concentracion de protefnas de 25 AU se inoculo con virus de la diarrea viral bovina (BVDV) o virus de la estomatitis vesicular (VSV) y se incubo durante 1 h a 27 °C, pH 5,1, con 0, 10, 15, o 20 mM de caprilato. Los datos muestran la inactivacion viral hasta el lfmite de deteccion despues del tratamiento con 15 mM de caprilato. Vease la tabla 1 y la figura 1.
5
10
15
20
25
30
35
Tabla 1: Experimentos de Inactivacion Viral
Titulo Viral Log
t (h)
SP-BVDV SUPE-BVDV SP-VSV
A B C D E F G H I J K L
0 10 15 20 0 10 15 20 0 10 15 20
mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM mM
0,0
6,3 6,3 6,3 5,1 6,3 6,1 6,1 5,2 7,0 6,6 6,4 5,6
0,5
5,9 4,7 18 18 5,5 18 18 5,6 3,4 18 18
1,0
6,0 4,2 0,7* 0,7* 5,9 4,0 0,7* 0,7* 6,3 2,9 0,7* 0,7*
LRV
0,3 2,1 >5,6 >5,6 0,4 2,1 >5,4 >5,4 0,7 4,1 >6,3 >6,3
* ensayos de volumen extendido; valores subrayados = virus no detectable
Ejemplo 3
Se llevaron a cabo experimentos para evaluar la capacidad viricida del caprilato a bajas temperaturas. Se diluyeron las suspensiones de pasta de Albumina y Fraccion V hasta 25 y 65 unidades de absorbancia (AU), y se anadio caprilato de sodio hasta una concentracion final de 20 mM. Las soluciones se ajustaron a pH 4,5 o 5,1 y se inocularon con BVDV de pH ajustado antes de la incubacion a 5, 12, o 20 °C. Las muestras para determinar titulacion, pH, y/o concentracion de proteinas (es decir, A280) se extrajeron despues de inocular (hora 0) y a 0,5, 2, y 6 horas.
Tanto para la suspension de pasta de Albumina como de Fraccion V, la inactivacion viral por caprilato fue superior a temperaturas mas altas y a concentraciones de proteinas mas bajas. Vease la figura 2. Para las suspensiones de Fraccion V a 25 AU y 65 AU, la inactivacion viral fue superior a pH 4,5 que a pH 5,1. La inactivacion viral fue tambien superior a pH 4,5 para las suspensiones de albumina a 25 AU. Para las suspensiones de albumina a 65 AU, sin embargo, la inactivacion viral fue superior a pH 5,1 que a pH 4,5. Debido a que el mecanismo de inactivacion viral por caprilato se atribuye a la forma no ionizada del caprilato, y las concentraciones de la forma no ionizada deben ser superiores a pH 4,5 que a pH 5,1, los resultados con albumina a 65 AU fueron inesperados.
La inactivacion viral es dependiente del pH, el tiempo de exposicion, la concentracion de proteinas y la composicion del producto. A diferencia del tratamiento a 27 °C, que inactivo el BVDV por debajo del limite de deteccion en 30 minutos (datos no mostrados), el tratamiento a 5 °C en condiciones optimas (25 AU, pH 4,5) requirio de 2 horas para la inactivacion completa del BVDV. Una etapa de incubacion con caprilato de albumina/Fraccion V a 5 °C no fue eficaz en la inactivacion de virus con envoltura.
Ejemplo 4
Estudio de Diseno de Experimentos de las Variables del Proceso de Inactivacion Viral
En base a los resultados iniciales de la inactivacion viral con caprilato en muestras de albumina o Fraccion V, se llevo a cabo un estudio de Diseno de Experimentos para evaluar las condiciones que podrian maximizar la actividad viricida. Las variables que se optimizaron fueron la Concentracion de Albumina (del 5% al 20%); la concentracion de caprilato (de 10 mM a 30 mM); el pH de la solucion (de 3,8 a 5,5); la temperatura de incubacion (de 20 °C a 40 °C); y el tiempo de incubacion (10 min y 120 min). Las variables de respuesta fueron el logaritmo del valor de reduccion viral (LRV), la concentracion de albumina, la agregacion (% de monomeros) y la concentracion de haptoglobulina. Se diseno un Diseno de Experimento lineal para ensayar tres niveles de cada variable (es decir, Bajo, Medio y Alto; vease la tabla 2).
Tabla 2: Variables del Diseno de Experimentos
Variable
Nivel de Variable Parametros Iniciales Parametros Finales
Concentracion de albumina (± 1 AU)
Bajo 26,5 AU (5%) 26,5 AU (5%)
Medio
66,25 AU (12,5%) 60,95 AU (11,5%)
Alto
106 AU (20%) 95,4 AU (18%)
Concentracion de Caprilato
Bajo 3 mM 10 mM
Medio
16,5 mM 20 mM
Alto
30 mM 30 mM
Temperatura (± 1 °C)
Bajo 0 0 O CNJ 15 °C
Medio
0 0 O CO 27,5 °C
Alto
0 0 0 O O O
pH (± 1)
Bajo 3,8 3,8
Medio
4,65 4,50
Alto
5,50 5,20
Se llevaron a cabo un total de 28 experimentos individuales. Vease la tabla 3.
Tabla 3: Ensayos del Diseno de Experimentos
Dia
Ensayo Conc. de Caprilato (mM) Temperatura (°C) Conc. de Proteinas (%) pH
1
1a 10 15 5 3,8
17
20 40 5 3,8
20
10 27,5 5 5,2
13
20 27,5 18 5,2
3a
30 15 18 3,8
2
4a 10 40 18 3,8
7
30 15 18 5,2
19
10 27,5 18 3,8
5a
10 15 5 5,2
6
30 40 5 5,2
3
14 30 27,5 11,5 5,2
15
20 40 11,5 5,2
18
30 15 11,5 3,8
2a
30 40 5 3,8
5b
10 15 5 5,2
4
11 10 40 5 4,5
10
30 15 5 4,5
3b
30 15 18 3,8
8
10 40 18 5,2
4b
10 40 18 3,8
5
9 30 40 18 4,5
12
10 15 18 4,5
16
20 15 5 5,2
1b
10 15 5 3,8
2b
30 40 5 3,8
4a
10 40 18 3,8
6
4b 10 40 18 3,8
19
10 27,5 18 3,8
4a
10 40 18 3,8
Se llevaron a cabo los siguientes experimentos: la pasta de Fraccion V se suspendio en agua para inyeccion y se 5 mantuvo a entre 2 y 8 °C durante toda la noche. A continuacion, la temperatura se aumento a entre 27 y 30 °C y se ajusto la concentracion (en base a la absorbancia a 280 nm) hasta uno de los tres valores experimentales, por ejemplo, 5, 11,5, o 18% (es decir, g de albumina/100 ml; 26,5, 60,95 o 95,4 AU respectivamente; ~0,75 M, 1,7 M, o 2,7 M, respectivamente). A continuacion, se ajusto el pH de la solucion (pH 3,8, 4,5, o 5,2). Las muestras se incubaron a continuacion a la temperatura experimental (por ejemplo, 15, 27,5, o 40 °C). A continuacion, se anadio 10 virus a una concentracion del 1%. Se anadio caprilato a continuacion a una de las tres concentraciones: 10, 20, o 30 mM. Las muestras se incubaron a continuacion a la temperatura experimental durante 120 min. Tambien se obtuvieron muestras de titulacion (antes de la adicion de caprilato y a 5, 10, 15, 30, 60, 90, y 120 min) para determinar la cinetica de la actividad viricida del caprilato. Finalmente, se determino el LRV para cada experimento. Los resultados experimentales se muestran en la tabla 4 y las figuras 3-6.
15
Tabla 4: Resultados del Diseno de Experimentos
Dia
Exp. Conc. de caprilato (mM) Temperatura (°C) Conc. de proteinas (%) pH LRV, 10 min LRV, 120 min
1a 10 15 5 3,8 <0,2 LRV >1,8 LRV
17 20 40 5 3,8 >1,8 LRV >1,8 LRV
1
20 10 27,5 5 5,2 >1,8 LRV <0,2 LRV
13 20 27,5 18 5,2 >1,8 LRV 0,2 < LRV< 1,8
3a 30 15 18 3,8 0,2 < LRV< 1,8 >1,8 LRV
4a 10 40 18 3,8 * >1,8 LRV
7 30 15 18 5,2 0,2 < LRV< 1,8 0,2 < LRV< 1,8
2
19 10 27,5 18 3,8 * *
5a 10 15 5 5,2 0,2 < LRV< 1,8 0,2 < LRV< 1,8
6 30 40 5 5,2 >1,8 LRV >1,8 LRV
5
10
15
20
25
30
Tabla 4: Resultados del Diseno de Experimentos
Dia
Exp. Conc. de caprilato (mM) Temperatura (°C) Conc. de proteinas (%) pH LRV, 10 min LRV, 120 min
3
14 30 27,5 11,5 5,2 0,2 < LRV< 1,8 >1,8 LRV
15
20 40 11,5 5,2 0,2 < LRV< 1,8 >1,8 LRV
18
30 15 11,5 3,8 >1,8 LRV >1,8 LRV
2a
30 40 5 3,8 >1,8 LRV >1,8 LRV
5b
10 15 5 5,2 0,2 < LRV< 1,8 <0,2 LRV
4
11 10 40 5 4,5 0,2 < LRV< 1,8 >1,8 LRV
10
30 15 5 4,5 >1,8 LRV >1,8 LRV
3b
30 15 18 3,8 0,2 < LRV< 1,8 >1,8 LRV
8
10 40 18 5,2 0,2 < LRV< 1,8 0,2 < LRV< 1,8
4b
10 40 18 3,8 * *
5
9 30 40 18 4,5 >1,8 LRV >1,8 LRV
12
10 15 18 4,5 0,2 < LRV< 1,8 0,2 < LRV< 1,8
16
20 15 5 5,2 0,2 < LRV< 1,8 0,2 < LRV< 1,8
1b
10 15 5 3,8 0,2 < LRV< 1,8 >1,8 LRV
2b
30 40 5 3,8 >1,8 LRV >1,8 LRV
4a
10 40 18 3,8 * *
6
4b 10 40 18 3,8 >1,8 LRV >1,8 LRV
19
10 27,5 18 3,8 >1,8 LRV >1,8 LRV
4a
10 40 18 3,8 >1,8 LRV >1,8 LRV
—* Estas reacciones se gelificaron y no se obtuvieron datos. Las celdas sombreadas se corresponden con:
actividad viricida eficaz >1,8LRV; algo de actividad viricida 0,2 < LRV< 1,8; actividad viricida limitada <0,2 LRV.
Hubo una matriz de concentraciones de caprilato, concentraciones de proteinas, temperaturas, y pH que fue eficaz en la actividad viricida. Basandose en las condiciones ensayadas en el estudio de DOE, fueron evidentes las siguientes generalidades:
• El aumento de la temperatura mejora la actividad viricida;
• El aumento del tiempo de incubacion mejora la actividad viricida;
• El aumento de la concentracion de caprilato mejora la actividad viricida;
• La disminucion de la concentracion de proteinas (albumina) mejora la actividad viricida; y
• La disminucion del pH mejora la actividad viricida.
Ademas, se maximizo el LRV predicho en la escala de 0 a 100, es decir, igual al 100% (el equivalente a un LRV de 2,16), con el intervalo de prediccion de confianza del 95% mas pequeno en el siguiente conjunto de variables juntas (veanse las figuras 6-7):
• Concentracion de caprilato: 30 mM;
• Concentracion de albumina: 5% (aprox. 26,5 AU; 750 mM);
• pH: 4,4;
• Temperatura: 40 °C ; y
• Tiempo de incubacion: 120 min.
Basandose en estos datos, se determinaron las siguientes condiciones como practicas para una etapa de inactivacion viral en el proceso de purificacion de albumina:
• Concentracion de proteinas: <25 AU (A280) (es decir, <5%; <750 mM)
• Concentracion de caprilato: >20 mM;
• pH: <5,0;
• Temperatura: 27-30 °C; y
• Tiempo de incubacion: >90 min.
Estas condiciones maximizan la actividad viricida a la vez que reducen los costes y tiempos de fabricacion en el proceso de purificacion de albumina.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento de preparacion de albumina a partir de una solucion que comprende albumina, que comprende:
    ajustar la concentracion de proteinas de la solucion a menos del 5% en peso;
    ajustar el pH de la solucion a pH 5 o menos;
    anadir acido caprilico (acido octanoico) o caprilato de sodio;
    aumentar la temperatura de la solucion a 27-30 °C; e
    incubar la solucion durante 30 min a 120 min.
  2. 2. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la incubacion se realiza, como minimo, durante 90 min.
  3. 3. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la concentracion de caprilato es de 10 mM a 40 mM.
  4. 4. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la concentracion de caprilato es de 15 mM a 30 mM.
  5. 5. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que la concentracion de caprilato es de 20 mM.
  6. 6. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que el pH es de 3,8 a 5.
  7. 7. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, en el que el pH es 5.
  8. 8. Procedimiento, segun la reivindicacion 1, que ademas comprende: filtrar la solucion;
    llevar a cabo ultrafiltracion y diafiltracion; formular y envasar a granel la solucion; y esterilizar, llenar y pasteurizar la albumina.
  9. 9. Procedimiento de inactivacion de virus en una solucion que comprende albumina, comprendiendo el procedimiento:
    ajustar la concentracion de proteinas de la solucion al 5% en peso de proteinas;
    ajustar el pH de la solucion a menos de 5;
    anadir acido caprilico (acido octanoico) o caprilato de sodio;
    aumentar la temperatura de la solucion a 27-30 °C; e
    incubar la solucion durante, como minimo, 90 min.
  10. 10. Procedimiento, segun la reivindicacion 9, en el que los virus son virus con envoltura lipidica.
  11. 11. Procedimiento, segun la reivindicacion 9, en el que la concentracion de caprilato es de 15 mM a 30 mM.
  12. 12. Procedimiento, segun la reivindicacion 9, en el que la concentracion de caprilato es de 20 mM.
  13. 13. Procedimiento, segun la reivindicacion 9, en el que la incubacion se realiza durante 90 min.
  14. 14. Procedimiento, segun la reivindicacion 9, en el que la temperatura es de 30 °C.
  15. 15. Procedimiento, segun la reivindicacion 10, en el que los virus son virus con envoltura lipidica que infectan a los humanos.
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