CN103570823A - 从含白蛋白的溶液制备白蛋白的方法和在含白蛋白的溶液中使用辛酸盐使病毒灭活的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中所描述的是从包含白蛋白的溶液制备白蛋白的方法和在包含白蛋白的溶液中使用辛酸盐使病毒灭活的方法。从包含白蛋白的溶液制备白蛋白的方法包括：调节该溶液的蛋白质浓度至低于5%；调节该溶液的pH至pH5以下；加入辛酸或辛酸钠；提高溶液温度高于20°C；和温育该溶液。

Description

从含白蛋白的溶液制备白蛋白的方法和在含白蛋白的溶液中使用辛酸盐使病毒灭活的方法
技术领域
本发明描述的是在从血浆纯化白蛋白的过程中使用辛酸盐使病毒灭活的方法。 
背景技术
人类血清白蛋白（以下称为白蛋白）是人类血浆中最丰富的蛋白质。体液白蛋白是具有67kDa的分子量的585个氨基酸的蛋白质。该蛋白质具有约20天的血清半衰期并且参与运输很多激素、代谢物、和药物以及维持渗透压和缓冲血液pH。在外伤、烧伤、和外科手术患者中治疗性地给予白蛋白来代替流失的体液并恢复血量。 
通过差别分馏法，Cohn首次描述了从人类血浆中纯化白蛋白。参见Cohn et al.,J.Am.Chem.Soc.68:459-475（1946）；Cohn et al.,J.Am.Chem.Soc.69:1753-1761（1947）；美国专利号2,390,074和2,469,193。由Gerlough改进了这些方法。参见美国专利号2,710,293和2,710,294。方法使用冷乙醇并操纵pH、离子强度、蛋白质浓度、和温度来沉淀血浆蛋白质如白蛋白。 
用于从人类血浆中纯化白蛋白用于医药产品的流程典型地包括病毒灭活步骤以降低传播血源性病毒的风险。这些病毒灭活步骤可以包括：热巴氏杀菌、有机溶剂、或有机溶剂与去垢剂的组合物（例如，磷酸三正丁基酯和聚山梨醇酯80）。另外，脂肪酸辛酸酯、或其钠盐（例如，辛酸钠）， 已经被有效地用作病毒灭活药剂。参见美国专利号4,939,176；国际专利申请公开号WO1998/024485与WO2000/056768；Lundblad and Seng,Vox Sang.60:75-81（1991）;Johnston,Jonstone,&Wu,Biologicals31:213-221（2003）。此外，在纯化治疗性的人类白蛋白中，辛酸盐也被用作稳定剂并且用作分配剂。参见美国专利号5,250,663和5,561,115。 
从Cohn级分（留分）IV-1流出液或级分V中纯化人类白蛋白并且包括丙酮干燥步骤来浓缩白蛋白和灭活病毒。丙酮法昂贵并且使用大量的丙酮，其引起火灾或爆炸危险。因此，需要可替代的病毒灭活和浓缩程序。本文描述了在低pH及升高的温度条件下使用辛酸酯灭活病毒随后通过超滤/渗滤从人类血浆中纯化白蛋白的方法。 
发明内容
本文中所描述的是在从血浆中纯化白蛋白的过程中使用辛酸盐灭活病毒的方法。 
本文中所描述的一个实施方式是从包含白蛋白的溶液中制备白蛋白的方法，包括：调节溶液的蛋白质浓度至低于约5%；调节溶液的pH至约pH5以下；加入辛酸（caprylic acid）（辛酸，octanoic acid）或辛酸钠；提高溶液温度高于约20°C；和温育该溶液。 
在本文中所描述的一些方面中，温育温度是27°C-30°C。 
在本文中所描述的一些方面中，温育持续约30min至约120min。 
在本文中所描述的一些方面中，温育持续至少约90min。 
在本文中所描述的一些方面中，辛酸盐浓度是从约10mM至约40mM。 
在本文中所描述的一些方面中，辛酸盐浓度是约15mM至约30mM。 
在本文中所描述的一些方面中，辛酸盐浓度是约20mM。 
在本文中所描述的一些方面中，pH值是约3.8至约5。 
在本文中所描述的一些方面中，pH值是约5。 
在本文中所描述的一些方面中，该方法进一步包括：过滤溶液；进行超滤及渗滤；配制和批化（批次化，bulking）溶液；和灭菌、灌装和巴氏杀菌白蛋白。 
本文中所描述的另一个实施方式是从包含白蛋白质的溶液中制备白蛋白的方法，包括：调节溶液的蛋白质浓度至低于约5%；调节溶液的pH至约pH5以下；加入辛酸（caprylic acid）（辛酸，octanoic acid）或辛酸钠至约20mM的浓度；提高溶液温度至约27°C–30°C；并且温育该溶液持续至少约30min至约120min。 
在本文中所描述的一些方面中，温育持续至少约90min。 
在本文中所描述的一些方面中，pH值为约5。 
在本文中所描述的一些方面中，方法进一步包括：过滤溶液；进行超滤及渗滤；配制和批化溶液；和灭菌、灌装和巴氏杀菌白蛋白。 
本文中所描述的另一个实施方式是在包含白蛋白的溶液中灭活病毒的方法，该方法包括：调节溶液的蛋白质浓度至约5%；调节溶液的pH至低于约5；加入辛酸（caprylic acid）（辛酸，octanoic acid）或辛酸钠；提高溶液温度高于约20°C；和温育该溶液。 
在本文中所描述的一些方面中，病毒是脂质包膜病毒。 
在本文中所描述的一些方面中，辛酸盐浓度是约15mM至约30mM。 
在本文中所描述的一些方面中，温度是约27°C-30°C。 
在本文中所描述的一些方面中，温育持续至少90min。 
在本文中所描述的一些方面中，辛酸盐浓度是20mM。 
在本文中所描述的一些方面中，温育持续90min。 
在本文中所描述的一些方面中，温度是30°C。 
在本文中所描述的一些方面中，病毒是感染人类的脂质包膜病毒。 
本文中所描述的另一个实施方式是在包含白蛋白的溶液中灭活病毒的方法，该方法包括：调节溶液的蛋白质浓度至约5%蛋白质；调节溶液的pH至低于约5；加入辛酸（caprylic acid）（辛酸，octanoic acid）或辛酸钠至约20mM的浓度；提高溶液温度至约27°C–30°C；和温育该溶液持续至少90min。 
在本文中所描述的一些方面中，该病毒是感染人类的脂质包膜病毒。 
在本文中所描述的一些方面中，该方法还包括：过滤溶液；进行超滤及渗滤；配制和批化溶液；和灭菌、灌装和巴氏杀菌白蛋白。 
附图说明
图1示出了在27°C、pH5.1、1小时期间内在25AU白蛋白浆液悬浮液中由辛酸盐诱导的病毒灭活的结果。在0、0.5小时、和1小时间隔下评估0、10mM、15mM、和20mM的辛酸盐浓度。该结果显示在27°C下1小时内15mM辛酸盐有效地将牛病毒性腹泻病毒及水泡性口膜炎病毒灭活至检测极限（Limit of detecion）。 
图2示出在25AU或65AU白蛋白浓度下，在亦或pH4.5亦或pH5.1、在5°C、12°C和20°C的低温下，在6小时期间内，由20mM辛酸盐诱导的病毒灭活的结果。该结果显示在白蛋白的较低浓度下，在20°C下2小时之后20mM辛酸盐作为病毒灭活剂有效。然而，在较低温度下病毒灭活作用不强并且取决于pH、温育时间、和白蛋白浓度。 
图3示出在恒定的温度（27.5°C）和pH值（4.5）下设计实验（DOE）的响应和对于蛋白质浓度预测的对数下降值（LRV）作为辛酸盐浓度的函数（图A）。图B示出在恒定的温度（27.5°C）和蛋白质浓度（11.5%）下的响应和对于pH预测的LRV作为辛酸盐浓度的函数。 
图4示出在恒定的温度（27.5°C）和辛酸盐浓度（20mM）下的DOE响应和对于pH预测的LRV作为蛋白质浓度的函数。 
图5示出表现了在30mM辛酸盐及40°C下、在对于pH的95和更大的置信区间下LRV作为蛋白质浓度的函数的响应面的等值线图（图A）。图B示出响应面的三维图像。在30mM辛酸盐与40°C下，使用最小95%预测区间随着pH4.4和5%的蛋白质浓度的条件将LRV最大化（即，100%）。 
图6示出表现了对于LRV的响应面的等值线图，其中，在pH3.96和40°C下在95和更大的置信区间下蛋白质浓度作为辛酸盐浓度的函数（图A）或在6.6%蛋白质和36.9°C下pH作为辛酸盐浓度的函数（图B）。 
图7示出包括辛酸盐病毒灭活步骤的改进的白蛋白纯化方法的流程图。 
具体实施方式
当前的白蛋白纯化方法包括丙酮干燥步骤。已经证实该丙酮干燥步骤作为病毒灭活步骤。然而，丙酮步骤是困难的，需要昂贵的操作设备，并且使用大量的丙酮存在可燃性和/或爆炸性问题，其需要多方面的安全预防 措施。需要替代丙酮干燥步骤。可以将本文中所描述的辛酸盐温育用作病毒灭活步骤并且随后可以使用超滤/渗滤步骤浓缩白蛋白。 
辛酸（caprylic acid）（辛酸盐；辛酸，octanoic acid）可以是有效的病毒灭活药剂。此外，在白蛋白制剂中普遍使用辛酸盐，从而可以容易地将辛酸盐病毒（小管（vial）？）灭活整合至白蛋白处理中而不引入另外的试剂如溶剂或去垢剂，并且对该方法具有最小的改变。 
在批化（批次配制，bulking）步骤期间将辛酸或辛酸钠加入白蛋白制剂作为稳定剂。然而，在批化中白蛋白溶液的pH值太高（～7）而不能产生用于病毒灭活的足够的游离的辛酸。可以在悬浮已经是低pH溶液的级分V浆液（白蛋白浆液）期间加入辛酸盐。因为辛酸盐本质上是白蛋白的稳定剂，其对白蛋白的影响是最小的。在UF/DF之前适当的过滤除去大量以未溶解的辛酸形式的辛酸盐。随着在UF/DF步骤中白蛋白处理持续进行，pH将提高并且通过渗滤将洗掉辛酸钠以使得能够正常批化白蛋白。 
总的说来，该改良的白蛋白方法由将级分IV-1流出液（或滤出液）或Cohn V浆液用作原料组成。在注射用冷水中重悬Cohn V浆液或将级分IV-1流穿液稀释至约25AU（A280）的蛋白质浓度。如果需要，加入辛酸钠至20mM辛酸盐的浓度并且将pH调节至低于pH5。然后在27°C-30°C下温育该溶液90min。参见图7。 
为了检测杀病毒的效力，在Cohn级分V悬浮液与白蛋白悬浮液中使用建议的制造方法的递减模型以包膜病毒板（即，牛病毒性腹泻病毒（BVDV），伪狂犬病病毒（PRV）和人类免疫缺陷病毒（HIV））进行病毒灭活实验。如果需要，在水中悬浮级分V浆液或白蛋白浆液，针尖穿入（spiked with）约5%的病毒，并且将pH调节至适当的目标。加入辛酸钠以达到目标的辛酸盐浓度，检验溶液的pH，并且在适当的温度下温育该溶液。温育期间在多个时间点处移取样品并且使用细胞类分析滴定样品以 定量传染性病毒。在适当的pH值、辛酸盐浓度、蛋白质浓度、和温度的条件下观察到快速并有效灭活BVDV、PSV、和HIV。 
使用递减的所提出的制造方法（500g浆液悬浮液）独立地评估了对于级分V和白蛋白浆液悬浮液的处理能力。根据需要，加入辛酸钠并调节pH，以达到目标的辛酸盐浓度和pH。温育之后，材料被过滤、通过UF/DF处理、配制、批化、无菌过滤、和巴氏杀菌。将从实验室规模（bench-scale）研究改进的方法获得的中间产物和最终产物的特征数据与从实验室规模对照组获得的特征数据以及与从当前的大规模（实比例）（full-scale）制造方法获得的特征数据相比较。 
使用Cohn级分V或白蛋白浆液进行改进的方法实验室规模的操作。在注射用冷水中首先溶解大约500g的浆液。然后将溶解的浆液加热至～27°C的温度并且加入辛酸钠至～20mM的浓度。温育溶解的本体溶液90分钟使得能够发生病毒的灭活。通过经由一系列过滤器的过滤实现白蛋白质溶液的澄清。然后通过超滤将澄清的白蛋白溶液浓缩至～12%w/v，使用盐溶液与注射用冷水渗滤该蛋白质本体。通过第二超滤步骤达到～28%蛋白质的浓度。然后通过加入氢氧化钠、色氨酸、和辛酸钠配制UF/DF蛋白质本体溶液。该配制的本体溶液是无菌过滤、灌装入小瓶、塞住、并密封。然后在60°C下将这些小瓶巴氏杀菌10–11小时以达到最终容器。 
令人惊奇地发现，在使用的蛋白质和辛酸盐浓度下，以及在温育的长度和温度下，在处理期间辛酸盐可以同时作为病毒灭活剂和稳定剂。同样令人惊奇地，因为白蛋白结合辛酸盐，并且在室温下伴随短的温育，在适度的蛋白质浓度下辛酸盐的浓度对于灭活病毒有效。 
在实施例1中描述了包括丙酮干燥步骤的当前的白蛋白质纯化方法，并且该方法以Cohn流出液IV-1或级分V起始。参见Cohn et al.,J.Am.Chem.Soc.68:459-475（1946）；Cohn et al.,J.Am.Chem.Soc.69:1753-1761（1947）；美国专利号2,390,074和2,469,193。 
实施例1 
制备人白蛋白质 
在注射用冷水中悬浮Cohn级分V。可替换地，可以使用流出液IV-1替代级分V。加入冷的变性乙醇（SDA-3A）以获得约10%的酒精溶液，同时将该溶液冷却至约0°C的温度。在约0°C下混合该溶液约1小时，然后通过深度过滤来澄清。 
然后通过调节pH、加入冷的变性乙醇（SDA-3A）、并在低温下温育该溶液，从流穿液IV-1或级分V中沉淀白蛋白部分。在低温温育之后，通过离心分离白蛋白部分。 
丙酮灭活病毒 
然后在冷丙酮中悬浮白蛋白部分并且在约0°C下保持大约数分钟。从浆料中分离蛋白质并且使用冷丙酮漂洗。通过将干燥的氮气和/或空气通过粉末来干燥湿润的白蛋白粉末。 
浓缩和过滤 
在注射用冷水中溶解干燥的白蛋白粉末至约7%的蛋白质浓度。通过经由一系列孔隙率逐渐变化直至最后0.2μm绝对值的过滤器（根据需要使用硅藻土以辅助过滤）的过滤来澄清白蛋白溶液。将白蛋白溶液的pH调节至约pH7，超滤以浓缩该溶液约两倍，然后使用3%NaCl渗滤随后使用注射用水渗滤。如果必需，然后通过超滤将该白蛋白溶液浓缩至适当的蛋白质浓度（约25%）。 
批化、灭菌、灌装、和巴氏杀菌 
通过使用辛酸钠、赋形剂、氢氧化钠、氯化钠、与注射用水调节超滤后的/渗滤后的白蛋白溶液以获得20mM辛酸钠、25%蛋白质、及pH7制备白蛋白的水性本体。如果必需，使用1.0M碳酸钠和/或1.0M HCl来调节该pH。 
通过经由一系列孔隙度逐渐变化直至最后0.2μm绝对值的过滤器的过滤将该白蛋白溶液灭菌。将该白蛋白溶液无菌地灌装入无菌的瓶中并且在约60°C下巴氏杀菌约10小时。将最终容器在25°C下温育约两星期并随后在室温下保存。 
实施例2 
病毒灭活实验 
白蛋白浆液的丙酮处理是非常有效的包膜病毒灭活步骤，但是该步骤是该方法中的瓶颈，并且该步骤还与很多的清洁问题及安全问题（火灾）相关。因此，辛酸盐处理可能代替丙酮悬浮与干燥。通过辛酸盐处理白蛋白浆液悬浮液，进行实验来评价包膜病毒的灭活。对于该研究，具有25AU的蛋白质浓度的白蛋白浆液悬浮液针尖穿刺加入牛病毒性腹泻病毒（BVDV）或水泡性口膜炎病毒（VSV）并且在27°C、pH5.1下、与0mM、10mM、15mM、或20mM辛酸盐温育1小时。数据显示，在使用15mM辛酸盐处理之后病毒被灭活到检测的极限。参见表1和图1。 
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实施例3 
在低温下进行实验来评价辛酸盐的杀病毒能力。将白蛋白和级分V浆液悬浮液稀释至25和65的吸光度单位（AU），并且加入辛酸钠至20mM的终浓度。将溶液调节至pH4.5或5.1并且在5°C、12°C、或20°C温育之前穿刺加入pH调节后的BVDV。在穿刺后（0小时）和0.5小时、2小时、和6小时之后移取用于滴定、pH、和/或蛋白质浓度（即，A280）的样品。 
对于白蛋白和级分V浆液悬浮液二者，在较高的温度和较低的蛋白质浓度下由辛酸盐的病毒灭活作用更大。参见图2。对于25AU和65AU的级分V悬浮液，在pH4.5下的病毒灭活高于pH5.1。对于25AU的白蛋白悬浮液，在pH4.5下也具有更高的病毒灭活。然而，对于在65AU下的白蛋白悬浮液，在pH5.1下的病毒灭活高于pH4.5。由于由辛酸盐的病毒灭活机制归因于非离子化形式的辛酸盐，并且在pH4.5下的非离子化形式的浓度应当高于pH5.1，因此使用65AU白蛋白的结果是未预料到的。 
病毒灭活取决于pH、暴露时间、蛋白质浓度、和产物组成。与在27°C下的处理不同，其在30分钟内将BVDV灭活至低于检测水平（数据未显示），最佳条件下（25AU，pH4.5）在5°C下的处理需要2小时来完全灭活BVDV。5°C下白蛋白/级分V辛酸盐温育步骤对于包膜病毒灭活无效。 
实施例4 
设计病毒灭活方法变量的实验研究 
基于在白蛋白或级分V样品中使用辛酸盐病毒灭活的最初结果，进行设计实验的研究以评价能够使杀病毒活性最大化的条件。最优化的变量是白蛋白浓度（5%至20%）；辛酸盐浓度（10mM至30mM）；溶液pH（3.8 至5.5）；温育温度（20°C至40°C）；和温育时间（10min至120min）。响应变量是病毒的对数减少值（LRV）、白蛋白浓度、积聚（%单体）和络合球蛋白浓度。设计了线性的设计实验来检测每一个变量的三个水平（即，低，中，和高；参见表2）。 
进行了总共28个单独的实验。参见表3。 
Figure BDA00003540635800112
Figure BDA00003540635800121
如下进行实验：在注射用水中悬浮级分V浆液并且在2°C至8°C下保持过夜。然后将温度提高至27°C至30°C并且将浓度（基于280nm处的吸光度）调节至三个实验值的一个，例如5%、11.5%、或18%（即，g白蛋白/100mL；分别是26.5AU、60.95AU、或95.4AU；分别是～0.75M、1.7M、或2.7M）。然后，调节溶液的pH（pH3.8、4.5、或5.2）。然后在实验温度下（例如，15°C、27.5°C、或40°C）温育样品。然后以1%的浓度加入病毒。然后以三个浓度之一加入辛酸盐：10mM、20mM、或30mM。然后在实验温度下温育该样品120min。同样获得滴定样品（在加入辛酸盐之前并且在5min、10min、15min、30min、60min、90min、和120min时）以测定辛酸盐杀病毒活性的动力学。最后，对于每一个实验测定LRV。在表4和图3–6中示出实验结果。 
Figure BDA00003540635800131
在杀病毒的活性方面一系列的辛酸盐浓度、蛋白质浓度、温度、和pH是有效的。基于在DOE研究中测试的条件，以下概述是显而易见的： 
·提高的温度增强杀病毒的活性； 
·延长的温育时间增强杀病毒的活性； 
·提高的辛酸盐浓度增强杀病毒的活性； 
·降低的蛋白质浓度（白蛋白）增强杀病毒的活性；和 
·降低的pH增强杀病毒的活性。 
此外，在以下的联合变量设置下，使用最小的95%置信预测区间，在0至100比例上预测的LRV是最大化的，即，等于100%（相当于2.16的LRV）（参见图6-7）： 
·辛酸盐浓度：30mM； 
·白蛋白浓度：5%（约26.5AU；750mM）； 
·pH：4.4； 
·温度：40°C；和 
·温育时间：120min。 
基于这些数据，将以下条件确定为在白蛋白纯化方法中的病毒灭活步骤的实践条件： 
·蛋白质浓度：≤25AU（A280）（即，<5%；<750mM） 
·辛酸盐浓度：≥20mM； 
·pH：≤5.0； 
·温度：27°C–30°C；和 
·温育时间：≥90min。 
在白蛋白纯化方法中这些条件使杀病毒的活性最大化同时降低制造成本并减少制造时间。 
本文中所描述的条件、方法、和过程的范围包括本文中所描述的实施方式、方面、实施例、步骤、和优选的所有组合。 

Claims (26)

1.一种从包含白蛋白的溶液中制备白蛋白的方法，包括：
调节所述溶液的蛋白质浓度至低于5%；
调节所述溶液的pH至pH5以下；
加入辛酸或辛酸钠；
提高所述溶液温度高于20°C；和
温育所述溶液。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述温育温度是27°C–30°C。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述温育持续30min至120min。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述温育持续至少90min。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辛酸盐浓度是10mM至40mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辛酸盐浓度是15mM至30mM。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述辛酸盐浓度是20mM。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述pH是3.8至5。
9.根据权利要求1所述的方法，其中，所述pH是5。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
过滤所述溶液；
进行超滤和渗滤；
配制和批化所述溶液；和
灭菌、灌装、和巴氏杀菌所述白蛋白。
11.一种从包含白蛋白的溶液中制备白蛋白的方法：
调节所述溶液的蛋白质浓度至低于5%；
调节所述溶液的pH至pH5以下；
加入辛酸或辛酸钠至20mM的浓度；
提高所述溶液温度至27°C–30°C；和
温育所述溶液持续至少30min至120min。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述温育持续至少90min。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述pH是5。
14.根据权利要求11所述的方法，进一步包括：
过滤所述溶液；
进行超滤和渗滤；
配制和批化所述溶液；和
灭菌、灌装、和巴氏杀菌所述白蛋白。
15.一种在包含白蛋白的溶液中灭活病毒的方法，所述方法包括：
调节溶液的所述蛋白质浓度至5%；
调节所述溶液的pH至低于5；
加入辛酸或辛酸钠；
提高所述溶液温度高于20°C；和
温育所述溶液。
16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述病毒是脂质-包膜病毒。
17.根据权利要求15所述的方法，其中，所述辛酸盐浓度是15mM至30mM。
18.根据权利要求15所述的方法，其中，所述温度是27°C–30°C。
19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述温育持续至少90min。
20.根据权利要求15所述的方法，其中，所述辛酸盐浓度是20mM。
21.根据权利要求15所述的方法，其中，所述温育持续90min。
22.根据权利要求15所述的方法，其中，所述温度是30°C。
23.根据权利要求16所述的方法，其中，所述病毒是感染人类的脂质-包膜病毒。
24.一种在包含白蛋白的溶液中灭活病毒的方法，所述方法包括：
调节溶液的所述蛋白质浓度至5%蛋白质；
调节所述溶液的pH至低于5；
加入辛酸或辛酸钠至约20mM的浓度；
提高所述溶液温度至27°C–30°C；和
温育所述溶液持续至少90min。
25.根据权利要求24所述的方法，其中，所述病毒是感染人类的脂质-包膜病毒。
26.根据权利要求24所述的方法，进一步包括：
过滤所述溶液；
进行超滤和渗滤；
配制和批化所述溶液；和
灭菌、灌装、和巴氏杀菌所述白蛋白。
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