ES2544761T3

ES2544761T3 - Antagonistas específicos del receptor FGF-R4

Info

Publication number: ES2544761T3
Application number: ES09784478.1T
Authority: ES
Inventors: Nicolas Baurin; Pierre-François BERNE; Francis Blanche; Françoise Bono; Béatrice Cameron; Tarik Dabdoubi; Corentin Herbert; Vincent Mikol; Elisabeth Remy
Original assignee: Sanofi SA
Current assignee: Sanofi SA
Priority date: 2008-07-08
Filing date: 2009-07-07
Publication date: 2015-09-03
Anticipated expiration: 2029-07-07
Also published as: WO2010004204A2; CO6440535A2; EA201170155A1; HRP20150836T1; HN2011000074A; UA107782C2; NZ602905A; US20110150903A1; AU2009267834B2; CR11868A; WO2010004204A3; EA201401107A1; UY31970A; NZ590860A; JP2011527322A; SG10201403751XA; MX2011000328A; HK1159133A1; AR072699A1; BRPI0915660A2

Abstract

Anticuerpo Antagonista específico del receptor Fibroblast Growt Factor-Receptor 4 (FGF-R4) para su uso en el tratamiento de las enfermedades asociadas a una angiogénesis patológica.

Description

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De manera aún más preferida, la presente invención tiene por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias codificadas por las secuencias nucleotídicas SEC ID NO: 82 y

87.

El anticuerpo compuesto por una cadena pesada de secuencia SEC ID NO 77 y una secuencia ligera SEC ID NO 72 se denominará clon 8 a continuación en la solicitud.

El anticuerpo compuesto por una cadena pesada de secuencia SEC ID NO 87 y una secuencia ligera SEC ID NO 82 se denominará clon 31 a continuación en la solicitud.

El anticuerpo compuesto por una cadena pesada de secuencia SEC ID NO 97 y una secuencia ligera SEC ID NO 92 se denominará clon 33 a continuación en la solicitud.

El anticuerpo compuesto por una cadena pesada de secuencia SEC ID NO 107 y una secuencia ligera SEC ID NO 102, se denominará clon 36 a continuación en la solicitud.

El campo de la presente invención no se limita a los anticuerpos que comprenden estas secuencias. En efecto, todos los anticuerpos que se unen de manera específica a FGF-R4, teniendo una acción antagonista sobre este receptor, entran en el campo de la presente invención.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4, conjugado con un agente citotóxico.

La presente invención tiene por objeto el usó de un antagonista específico del receptor FGF-R4, en el tratamiento de enfermedades asociadas a la angiogénesis.

La presente invención tiene por objeto el uso de un antagonista específico del receptor FGF-R4, en el tratamiento de un cáncer.

La presente invención tiene por objeto el uso de un antagonista específico del receptor FGF-R4 en el tratamiento de los hepatocarcinomas o de cualquier otro tipo de cáncer hepático.

La presente invención tiene por objeto el uso de un antagonista específico del receptor FGF-R4 en el tratamiento del cáncer de páncreas.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo específico del receptor FGF-R4 útil al mismo tiempo en el tratamiento de enfermedades asociadas a la angiogénesis y en el tratamiento de los hepatocarcinomas o de cualquier otro tipo de cáncer hepático.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo específico del receptor FGF-R4 útil al mismo tiempo en el tratamiento de enfermedades asociadas a la angiogénesis, en el tratamiento de los hepatocarcinomas o de cualquier otro tipo de cáncer hepático, en el tratamiento del cáncer de páncreas, órganos del tracto gastrointestinal o cualquier otro órgano que exprese FGF-R4. La presente invención tiene por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 para su uso en el tratamiento de las enfermedades asociadas a una angiogénesis patológica.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo según la reivindicación 1 para su uso para inhibir el crecimiento tumoral simultáneamente con la inhibición de la angiogénesis.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 y 2, para su uso en el tratamiento de los hepatocarcinomas o de cualquier otro tipo de cáncer hepático.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 a 3 para su uso en el tratamiento del cáncer de páncreas.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 4, que se une al dominio D2-D3 del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 5, que se une al dominio D2 del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 6, que tiene un KD frente al receptor FGF-R4 determinado mediante la técnica Surface Plasmon Resonance (Biacore) inferior a 10E-8M.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 7, que es activo al mismo tiempo contra FGF-R4 humano y FGF-R4 murino.

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La presente invención tiene por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las CDR de las secuencias SEC ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 y 14; o 73, 74, 75, 78, 79 y 80; u 83, 84, 85, 88, 89 y 90; o 93, 94, 95, 98, 99 y 100; o 103, 104, 105, 108, 109 y 110, en las que una de las CDR puede diferir de uno a dos aminoácidos con respecto a una al menos de las secuencias citadas anteriormente, siempre que el anticuerpo conserve su especificidad de unión para su utilización en el tratamiento de las enfermedades asociadas a una angiogénesis patológica.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 cuya parte variable de su cadena pesada comprende una secuencia nucleotídica que presenta al menos el 80% de identidad con la secuencia SEC ID NO: 5, 76, 86, 96 o 106, y cuya parte variable de su cadena ligera comprende una secuencia nucleotídica que presenta al menos el 80% de identidad con la secuencia SEC ID NO: 7, 71, 81, 91 o 101, siempre que el anticuerpo conserve su especificidad de unión para su utilización en el tratamiento de las enfermedades asociadas a una angiogénesis patológica.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 cuya secuencia comprende las secuencias polipeptídicas SEC ID NO: 2 y 4; o 6 y 8; o 72 y 77; u 82 y 87; o 92 y 97; o 102 y 107, o unas secuencias que corresponden a estas secuencias que tienen al menos el 80% de identidad con ellas, siempre que el anticuerpo conserve su especificidad de unión para su utilización en el tratamiento de las enfermedades asociadas a una angiogénesis patológica.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo específico del receptor FGF-R4 para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por que es un anticuerpo humanizado. La presente invención tiene por objeto un anticuerpo para su uso según la reivindicación 12, caracterizado por que comprende una cadena variable ligera que presenta al menos el 80% de identidad con una de las secuencias polipeptídicas SEC ID NO 30 o 32, y una cadena variable pesada que presenta al menos el 80% de identidad con una secuencia SEC ID NO 34, 36 o 38.

La presente invención tiene por objeto un anticuerpo para su uso según una de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado por que es un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico.

La presente invención tiene por objeto una composición farmacéutica que comprende un antagonista específico del receptor FGF-R4 y excipientes.

La presente invención tiene por objeto un método de tratamiento de un cáncer que comprende la administración al paciente de un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un método de tratamiento de una enfermedad asociada a un aumento patológico de la angiogénesis, que comprende la administración al paciente de un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento de selección de un anticuerpo monoclonal antagonista especifico del receptor FGF-R4, que comprende las etapas siguientes:

a.: inmunización en el ratón

b.: extracción de nódulos linfáticos en los ratones y

c.: cribado de los sobrenadantes de hibridomas

La presente invención tiene por objeto una línea celular que produce unos anticuerpos antagonistas específicos del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento de producción de un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4, que comprende cultivar una línea celular que produce unos anticuerpos antagonistas del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un medicamento que comprende un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene igualmente por objeto un polinucleótido que codifica para un polipéptido específico de FGFR4 seleccionado del grupo constituido por las SEC ID NOS: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 30, 32, 34, 36, 38, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110, y por las secuencias idénticas al menos en el 80%, 90%, 95% o el 99% a una de estas secuencias.

La presente invención tiene por objeto un polinucleótido que codifica para un polipéptido antagonista específico del receptor FGF-R4 cuyas secuencias presentan al menos el 80% de identidad con una de las secuencias siguientes:

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SEC ID NOS 2 y 4; o SEC ID NOS 6 y 8; o SEC ID NOS 9, 10, 11, 12, 13 y 14; o SEC ID NOS 30 o 32 y 34 o 36 o 38; o SEC ID NOS 72 y 77; o SEC ID NOS 73, 74, 75, 78, 79 y 80; o SEC ID NOS 82 y 87; o SEC ID NOS 83, 84, 85, 88, 89 y 90; o SEC ID NOS 92 y 97; o SEC ID NOS 93, 94, 95, 98, 99 y 100; o SEC ID NOS 102 y 107; o SEC ID NOS 103, 104, 105, 108, 109 y 110, siempre que el polipéptido que codifica conserve la especificidad de unión, para su uso en el tratamiento de las enfermedades asociadas a una angiogénesis patológica.

La presente invención tiene por objeto un polinucleótido caracterizado por que presenta una secuencia que presenta al menos el 80% de identidad con una de las secuencias SEC ID NOS 1 y 3; o SEC ID NOS 5 y 7; SEC ID NOS 29 o 31, y 33, 35 o 37; o SEC ID NOS 71 y 76; o SEC ID NOS 81 y 86; o SEC ID NOS 91 y 96; o SEC ID NOS 101 y 106, siempre que el polipéptido que codifica conserve la especificidad de unión antagonista al receptor FGF-R4, para su uso en el tratamiento de las enfermedades asociadas a una angiogénesis patológica.

La presente invención tiene por objeto un vector recombinante que comprenda un polinucleótido tal como se ha descrito anteriormente o que codifique un polipéptido tal como se ha descrito anteriormente.

Con el fin de permitir la expresión de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras del anticuerpo antagonista del receptor FGF-R4, objeto de la invención, los polinucleótidos que codifican para dichas cadenas se insertan en los vectores de expresión. Estos vectores de expresión pueden ser unos plásmidos, unos YAC, unos cósmidos, unos retrovirus, unos episomas derivados de EBV, y todos los vectores que el experto en la materia puede juzgar apropiados para la expresión de tales cadenas.

La presente invención tiene por objeto una célula hospedante que comprenda un vector recombinante tal como se ha descrito anteriormente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención tiene por objeto el uso de anticuerpos antagonistas dirigidos específicamente contra FGF-R4 (sin reacción cruzada con FGF-R1, R2 o R3) para la inhibición de la angiogénesis y del crecimiento tumoral.

De manera inesperada, los inventores han demostrado que el FGF-R4 desempeña un papel activo y específico en el control de la angiogénesis.

Esta función del FGF-R4 no se había demostrado o propuesto nunca antes. Por consiguiente, este receptor se puede utilizar como diana para tratar las patologías que presenten una disfunción angiogénica. Los ligandos del FGF-R4 capaces de modular su actividad son por lo tanto unos agentes terapéuticos potenciales para numerosas patologías relacionadas a la angiogénesis.

La presente invención se puede utilizar por lo tanto en el tratamiento de todas las patologías que implican una desregulación de la angiogénesis y que necesitan una inhibición de ésta. Las patologías consideradas pueden ser el cáncer, con el uso de los antagonistas según la invención como inhibidores de la angiogénesis tumoral, o las patologías para las cuales se describe una desregulación de la angiogénesis como: la degeneración macular relacionada con la edad o DMLA, las enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide, la osteoartritis, las colitis, los úlceras o cualquier enfermedad inflamatoria de los intestinos, la ateroesclerosis o incluso en el tratamiento de la obesidad.

En un modo aún más ventajoso, el anticuerpo se une a un epítopo comprendido en el dominio que comprende los aminoácidos 144 a 365 del receptor de FGF-R4.

En un modo aún más ventajoso, el anticuerpo se une a un epítopo comprendido en el dominio D2 del receptor de FGF-R4, correspondiendo este epítopo a los aminoácidos 145 a 242 descritos en la secuencia SEC ID NO 70.

Un anticuerpo, también denominado inmunoglobulina, está compuesto por dos cadenas pesadas idénticas ("VH") y dos cadenas ligeras idénticas ("VL") que se unen por un puente disulfuro. Cada cadena contiene una región constante y una región variable. Cada región variable comprende tres segmentos denominados "regiones que determinan la complementariedad" ("CDRs") o "regiones hipervariables", que son principalmente responsables de la unión al epítopo de un antígeno.

El término "VH" hace referencia a las regiones variables de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, que incluye las cadenas pesadas de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' o F(ab)'.

El término "VL" hace referencia a las regiones variables de una cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo, que incluye las cadenas ligeras de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' o F(ab)'.

Por "fragmento de anticuerpo" se entiende cualquier parte de éste: Fab (unión Fragmento antígeno), Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), Fc (Fragmento cristalizable). Preferentemente, estos fragmentos funcionales serán unos fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab') 2, Fab', scFv-Fc o diabodies, que poseen en general la misma especificidad

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La presente invención se refiere en particular a anticuerpos humanizados cuyas partes variables son modificadas según la siguiente tecnología:

Las cadenas ligeras y pesadas más similares a las cadenas correspondientes del anticuerpo murino anti-FGF-R4 40-12 son identificadas por comparación con el Banco de Datos de Proteínas (H. M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng,

G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne. Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242). La alineación de secuencias utiliza el algoritmo BLAST (J Mol Biol. 1990 Oct. 215:403-410). Se trata de estructuras tridimensionales que responden a los códigos PDB 1NDM y 1ETZ, que se han utilizado respectivamente para construir los modelos por homología de cadenas ligeras y pesadas de dominios variables. Estos modelos tridimensionales se afinan a continuación minimizando su energía potencial con el procedimiento estándar implementado en el programa MOE (Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, Quebec, Canadá). Se realiza después una simulación de dinámica molecular (DM) a partir de estos modelos tridimensionales minimizados del anticuerpo con el programa Amber (D. A. Case, T. E. Cheatham, III, T. Darden, H. Gohlke, R. Luo,

K. M. Merz, Jr., A. Onufriev, C. Simmerling, B. Wang y R. Woods. J. Computat. Chem. 2005, 26:1668-1688). Esta simulación tiene lugar con las tensiones armónicas aplicadas a los átomos del esqueleto proteico a una temperatura de 500 K, durante un tiempo de 1,1 nanosegundos, en un modelo de disolvente implícito, tal como se implementa en el método generalizado de Born (Gallicchio & Levy, J Comput Chem 2004, 25:479-499). Se extraen así diez conformaciones diversas de esta primera simulación a razón de una conformación tridimensional cada cien picosegundos durante el último nanosegundo de la simulación. Estas diez diversas conformaciones se someten cada una a continuación a una simulación de dinámica molecular, sin tensiones sobre el esqueleto proteico, a una temperatura de 27°C, durante 2,3 nanosegundos, en un modelo de disolvente implícito tal como se implementa en el método generalizado de Born. Las uniones que implican un átomo de hidrógeno son restricciones con el algoritmo SHAKE (Barth. et al., J Comp Chem, 1995, 16:1192-1209), el paso es de 1 femto segundo y la simulación tiene lugar según la ecuación de Langevin a volumen constante y una temperatura constante de 27ºC. Para cada una de las diez simulaciones de dinámica molecular, las últimas dos mil conformaciones extraídas a la frecuencia de un par de picosegundos, se utilizan a continuación para cuantificar, para cada aminoácido del anticuerpo a humanizar, la desviación de las posiciones de los átomos con respecto a una conformación media, denominada medoide, del aminoácido. El conjunto del análisis descrito a continuación se realiza con el lenguaje script Scientific Vector Language (SVL) del programa MOE. La conformación medoide del aminoácido es la conformación resultante de la dinámica molecular que es la más próxima a la conformación media calculada a partir de la posición de los átomos de todas las conformaciones del aminoácido. La distancia utilizada para detectar la conformación medoide es la desviación cuadrática media de las distancias escalares entre los átomos de dos conformaciones del aminoácido. De manera similar, la desviación de las posiciones de los átomos de una conformación de un aminoácido con respecto a la conformación medoide se cuantifica calculando la desviación cuadrática media de las distancias escalares entre los átomos del aminoácido de una conformación de la simulación y los mismos átomos de la conformación medoide. A continuación, es comparando la desviación cuadrática media de las posiciones de los átomos de un aminoácido dado (i) promediado sobre el conjunto de diez simulaciones de dinámica molecular (Fi), a la desviación cuadrática media de las posiciones de todos los aminoácidos del anticuerpo promediado sobre el conjunto de diez simulaciones de dinámica molecular (Fm) como se decide si el aminoácido es bastante flexible para ser considerado que puede interactuar potencialmente con los receptores de células T y provocar la activación del sistema inmunitario. Un aminoácido i se considera flexible si presenta un resultado de flexibilidad Zi por encima de 0,15 tal como se define a continuación: Zi= (Fi -Fm)/Fm. Se identifican así 45 aminoácidos como flexibles en el dominio variable del anticuerpo, con exclusión de la región que determina la complementariedad al antígeno (RDC) y de su entorno inmediato. Se define el entorno inmediato de la RDC como cualquier aminoácido cuyo carbono alfa se sitúa a una distancia de 5 Angstrom (Å) o menos de un carbono alfa de la RDC.

Los movimientos de los 60 aminoácidos más flexibles del anticuerpo, durante los 20 nanosegundos (10 x 2 ns) de simulación, se comparan a continuación con los movimientos de los aminoácidos correspondientes de 49 modelos por homología de secuencias germinales humanas de anticuerpos, para cada uno de los cuales las diez simulaciones de dinámica molecular (10 x 2 ns) se han realizado según el mismo modo de realización. Los 60 aminoácidos más flexibles excluyen la región que determina la complementariedad al antígeno (RDC) y su entorno inmediato. Los 49 modelos humanos de secuencias germinales del anticuerpo se han construido combinando sistemáticamente las 7 cadenas ligeras humanas más frecuentes (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda1, vlambda2, vlambda3) y las 7 cadenas pesadas humanas más frecuentes (vh1a, vh1b, vh2, vh3, vh4, vh5, vh6) (Nucleic Acids Research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597).

La similitud del anticuerpo a humanizar con los 49 modelos de secuencias humanas germinales se cuantifica preparando un muestreo de las posiciones de algunos átomos de los 60 aminoácidos flexibles de un anticuerpo, durante las diez dinámicas moleculares, mediante una misma representación cúbica tridimensional de resolución 1Å. Se habla de similitud cuadridimensional. La representación tridimensional utilizada comprende 445740 puntos y se inicia a partir de la estructura tridimensional del anticuerpo humano que responde al código PDB 8FAB. La estructura 8FAB se utiliza también para posicionar todas las conformaciones de un anticuerpo que se tiene que preparar para muestreo en la representación tridimensional. Se superpone para hacer esto la conformación medoide de la dinámica molecular del anticuerpo en la estructura 8FAB. Esta superposición consiste en la alineación de los momentos de inercia de dos conformaciones, seguido por la optimización de las distancias escalares entre los átomos de carbono alfa de las dos conformaciones. Todas las demás conformaciones de la dinámica molecular del

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anticuerpo se superponen sobre la conformación medoide según el mismo método. Se realizan dos tipos de muestreo dando como resultado dos similitudes (similitud electrostática y similitud lipófila), para un par de anticuerpos a comparar, que se suman para obtener la similitud total. El primer muestreo, electrostático, considera todos los átomos de la cadena lateral del aminoácido. Se calcula el valor en un punto x de la representación aplicando a los átomos de la cadena lateral del aminoácido una función gaussiana tridimensional f(x) que se pondera con la carga electrostática del átomo tal como se describe en el campo de fuerza Amber99 (Cieplak, J., et al.; J. Comp. Chem. 2001, 22:1048-1057). La función f(x) se aplica según los 3 ejes de coordenadas cartesianas y responde a la fórmula:

imagen7con x y u respectivamente las coordenadas cartesianas de un punto x de la representación y de un átomo del muestreo, s= r/1,6 (r = radio de covalencia del átomo). El muestreo se repite para todas las conformaciones del aminoácido y los resultados obtenidos son medias en cualquier punto x de la representación tridimensional. El segundo muestreo, lipófilo, considera únicamente los átomos lipófilos de la cadena lateral del aminoácido. El valor en un punto x de la representación se calcula con ayuda de la misma función gaussiana f(x) sin ponderación. Los dos conjuntos de conformaciones de las dinámicas moleculares de dos anticuerpos que se comparan se muestrean así por la misma representación tridimensional. Se mide la similitud electrostática (sim-elec), entre 2 anticuerpos a y b, con ayuda de la siguiente fórmula:

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La similitud lipófila se calcula con la misma fórmula sobre los datos procedentes del muestreo lipófilo descrito anteriormente.

El modelo de secuencias germinales humanas vlambda2-vh2 muestra así la similitud cuadridimensional más alta (similitud total = 58%) de estos 60 aminoácidos flexibles con respecto a los aminoácidos flexibles del anticuerpo murino 40-12. El modelo de secuencia germinal humana vlambda2-vh2 se ha utilizado por lo tanto para humanizar el anticuerpo a humanizar centrándose en los 45 aminoácidos flexibles. Para determinar las mutaciones a realizar, la estructura tridimensional del modelo del anticuerpo murino 40-12 se superpone a la del modelo resultante de las secuencias germinales que muestran la similitud más alta optimizando las posiciones de los carbonos alfa de los aminoácidos. Los aminoácidos identificados como flexibles mutan por los aminoácidos correspondientes en la secuencia del modelo que muestra la similitud más alta.

Los motivos de las secuencias no deseables considerados son los siguientes: Aspartato-Prolina (unión peptídica lábil en medio ácido), Asparagina-X-Serina/Treonina (sitio de glicosilación, X = cualqueir aminoácido salvo la Prolina), Aspartato-Glícina/Serina/Treonina (formación potencial de succinimida/iso-aspartato en las zonas flexibles), Asparagina-Glicina/Histidina/Serina/Alanina/Cisteína (sitios expuestos de desamidación), Metionina (oxidación en las zonas expuestas). Las secuencias humanizadas así obtenidas se comparan finalmente mediante el algoritmo BLAST de comparación de secuencia, con las secuencias de la base de datos IEDB (http://www.immuneepitope.org/ The imune epitope database and analysis resource: from vision to blueprint. PLoS Biol. 2005 Mar.; 3 (3):e91) para asegurarse que las secuencias no contienen epítopos conocidos para ser reconocidos por las células linfocitos B y

T. Si la secuencia contiene residuos que presentan unas secuencias indeseables, también se modifican entonces. Si la secuencia compuesta contiene un epítopo conocido catalogado en el IEDB, entonces se utiliza como modelo otra estructura de referencia germinal que muestre una gran similitud.

De manera más ventajosa, el anticuerpo según la invención comprende unas secuencias que presentan al menos el 80%, 90%, 95% o el 99% de identidad con la secuencia SEC ID NO 30 o la secuencia SEC ID NO 32 utilizadas en combinación con las secuencias que presentan al menos al menos el 80%, 90%, 95% o el 99% de identidad con la secuencia SEC ID NO 34, la secuencia SEC ID NO 36 o la secuencia SEC ID NO 38.

En un modo de realización, el anticuerpo según la invención comprende unas cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID NO 30 y unas cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID NO 34.

En otro modo de realización, el anticuerpo comprende cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID NO 32 y cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID NO 38.

En otro modo de realización, el anticuerpo comprende cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID NO 30 y variables pesadas de secuencia SEC ID NO 36.

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En otro modo de realización, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGFR4 comprende unas cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID NO 32 y unas cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID NO 38.

En otro modo de realización, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGFR4 comprende unas cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID NO 30 y unas cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID NO 36.

En otro modo de realización, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGFR4 comprende unas cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID NO 32 y unas cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID NO 34.

En otro modo de realización, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGFR4 comprende unas cadenas variables ligeras de secuencias SEC ID NO 32 y unas cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID NO 36.

En otro modo de realización, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGFR4 comprende unas cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID NO 30 y unas cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID NO 38.

La presente invención tiene igualmente por objeto unos anticuerpos humanos antagonistas específicos de FGF-R4. Tales anticuerpos se pueden obtener por visualización de fagos según los métodos conocidos por el experto en la materia (McCafferty J. et al., 1990; Hoogenboom HR et al., 2005). Otras tecnologías están disponibles para la preparación de anticuerpos humanos tales como la tecnología XenoMouse descrita en la patente U.S. 5,939,598.

En un modo de realización particular, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 es un anticuerpo humano cuyas partes variables de la cadena pesada comprenden una secuencia que presenta al menos el 80%, 90%, 95% o el 99% de identidad con las secuencias SEC ID NO: 76, 86, 96 o 106.

En otro modo de realización, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 es un anticuerpo humano cuyas partes variables de la cadena ligera comprenden una secuencia que presenta al menos el 80%, 90%, 95% o el 99% de identidad con las secuencias SEC ID NO: 71, 81, 91 o 101.

La presente invención tiene también por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena pesada que comprende una parte variable codificada por una secuencia nucleotídica que presenta una identidad de al menos el 80%, 90%, 95% o el 99% con las secuencias SEC ID NO 77, 87, 97 o

107.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena ligera que comprende una parte variable codificada por una secuencia nucleotídica que presenta una identidad de al menos el 80%, 90%, 95% o el 99% con las secuencias SEC ID NO 72, 82, 92 o

102.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista especifico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias codificadas por las secuencias nucleotídicas SEC ID NO: 71 y 76 o las secuencias nucleotídicas SEC ID NO: 81 y 86 o las secuencias nucleotídicas SEC ID NO: 91 y 96 o las secuencias nucleotídicas SEC ID NO: 101 y 106.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias polipeptidicas SEC ID NO: 72 y 77 o las secuencias polipeptidicas SEC ID NO: 82 y 87 o las secuencias polipeptidicas SEC ID NO: 92 y 97 o las secuencias polipeptídicas SEC ID NO: 102 y 107.

De manera particularmente preferida, un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias polipeptidicas SEC ID NO: 82 y 87.

Las secuencias en aminoácidos así modificadas se pueden modificar también por modificaciones posttraduccionales durante la producción en la célula mamífera. En particular, el uso de líneas estables deficientes en la biosíntesis de fucosa puede permitir producir anticuerpos monoclonales de los cuales el N-glicano del Fc (posición N297) está desprovisto parcial o totalmente de fucosa y permite aumentar el efecto efector ADCC (Kanda et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94:680-688 y Ripka et al., 1986 Arch Biochem Bioph 249: 533-545).

En otro modo de realización de la invención, el antagonista específico de FGF-R4 es un anticuerpo conjugado.

Los anticuerpos pueden estar conjugados con un agente citotóxico. Mediante la expresión "agente citotóxicos" se designa aquí una sustancia que reduce o bloquea la función o el crecimiento de las células o causa la destrucción de las células.

En un modo de realización, el anticuerpo o un fragmento de la unión de éste, puede estar conjugado con un medicamento, tal como un maitansinoide, para formar un "profármaco" con una citotoxicidad hacía las células que expresan el antígeno.

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El agente citotóxico de la presente invención puede ser cualquier compuesto que resulte de la muerte de una célula

o induzca la muerte de una célula o disminuya de diversas maneras la viabilidad de las células. Los agentes citotóxicos preferidos incluyen, por ejemplo, unos

Figura 2B: Mapa del plásmido pXL4613 que permite la expresión de hFGFR4-Streptag. (SEC ID NO 69).

Figura 3: Mapa del plásmido pXL4615 que permite la expresión de hFGFR4(D2,D3)-Histag. (SEC ID NO 42)

Figura 4: Mapa del plásmido pXL4621 que permite la expresión de mFGFR4-Histag. (SEC ID NO 44)

Figura 5: Mapa del plásmido pXL4328 que permite la expresión de hFGFR1-Fc (de la secuencia SEC ID NO 46)

Figura 6: Mapa del plásmido pXL4327 que permite la expresión de hPGFR2-Fc (de la secuencia SEC ID NO 48)

Figura 7: Unas placas ELISA se recubren por los 4 receptores humanos de los FGF. La capacidad de los anticuerpos anti-FGFR4 40-12 y 64-12 para reconocer estos diferentes FGF-R se mide por ensayo ELISA. El clon 40-12 (histograma negro) es específico de FGF-R4. El clon 64-12 (histograma gris) reconoce además el FGF-R3 muy débilmente.

Figuras 8A y 8B: El anticuerpo antagonista activo 40-12 y su control inactivo 64-12 no tienen efecto propio sobre la angiogénesis basal. Por el contrario, a la dosis de 30 g/ml (aproximadamente 200 nM), el anticuerpo monoclonal anti-FGFR4 40-12 es capaz de inhibir la angiogénesis de las células HUVEC inducida por el FGF2 aunque el anticuerpo de control 64-12 no es capaz (Fig 8A).

El FGF2 marcado con ayuda de un AlexaFluor® 488 nm, es capaz de unirse al FGF-R4 expresado por las células 300-19 (histograma blanco). Esta interacción se puede disociar por el FGF2 no marcado (histogramas negros) o por el anticuerpo anti-FGFR4 40-12 (histogramas gris oscuro) aunque el anticuerpo control 64-12 no es capaz (histogramas gris claro) (Fig 8B).

Figura 8C y 8D: Efecto de los anticuerpos anti-FGFR4 resultantes de los clones 8, 31, 33 y 36 a 10 g/ml sobre la angiogénesis in vitro inducida por 3 ng/ml de FGF-2. Los clones 8 (Fig 8C) y 31, 33 y 36 (Fig 8D) inhiben la angiogénesis de las células HUVEC inducida por el FGF-2.

Figuras 9A y 9B: Las células de los hepatocarcinomas humanos Hep3b son estimuladas por el FGF19 a 30 ng/ml. Esta estimulación induce una señalización celular específica de FGF-R4 que conduce a la síntesis de las proteínas cFos y JunB y a la fosforilación de Erk1/2 observada por el método de transferencia Western (Fig 9A). Cada banda se cuantifica después. Esta cuantificación se representa en forma de histograma (Fig 9B). El anticuerpo 40-12 a 100 g/ml inhibe totalmente la inducción de la señalización celular específica de FGF-R4 mientras que el anticuerpo de control no tiene ningún efecto. En efecto, el anticuerpo 40-12 bloquea completamente la síntesis de JunB y de cFos así como la fosforilación de Erk1/2 inducida por el FGF19 después de una simulación de 3h.

Figura 9C: El efecto inhibidor del anticuerpo anti-FGFR4 40-12 sobre la fosforilación de Erk1/2 inducida en las células Hep3b por el FGF-19 (30 ng/ml) se confirma con ayuda del ELISA anti-fosfoERk1/2. El anticuerpo 40-12 es capaz también de inhibir la fosforilación de Erk1/2 en las células Hep3b estimuladas por el FGF-2 (1 ng/ml) o por suero (SVF) al 10%.

Figura 9D: Porcentaje de inhibición de la fosforilación de Erk1/2 inducida por el FGF-19 (30 ng/ml) obtenido por ELISA en células Hep3b con la ayuda de los anticuerpos resultantes de los clones 8, 31, 33 y 36.

Figuras 10A, y 10B: La proliferación de células Hep3b puede ser estimulada por la adición de suero (Fig 10A) o de FGF19 (Fig 10B). La inducción por el suero está parcialmente inhibida por el anticuerpo 40-12 a 100 g/ml mientras que el anticuerpo de control no tiene efecto (Fig 10A). La proliferación inducida por el FGF19 está totalmente bloqueada por 10 g/ml de anticuerpo anti-FGFR4 40-12 mientras que, a esta misma dosis, el anticuerpo de control no es capaz (Fig 10B).

Figuras 11A a 11D: El anticuerpo anti-FGFR4 40-12 es capaz de reducir el desarrollo de tumores pancreáticos en un modelo murino RipTag inhibiendo la angiogénesis tumoral: El modelo Rip1-Tag2 es un modelo murino en el que unos ratones transgénicos expresan el antígeno T del SV40 en las células  de los islotes pancreáticos que producen la insulina (Hanahan D. Nature, 1985, 9-15:115-22.). Este antígeno T se expresa durante el desarrollo embrionario del páncreas hasta de 4 a 5 semanas de vida, sin efecto aparente. Una parte de los islotes pancreáticos que expresan el antígeno T progresa entonces durante las 5 semanas siguientes hacia la formación de islotes angiogénicos asociados a una activación de la vasculatura después hacia el desarrollo de pequeños tumores de tipo adenoma. Algunas semanas más tarde se desarrollan algunos adenomas para formar carcinomas invasivos (Fig. 11 A).

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La correlación in vivo con las datos in vitro se ha obtenido con la ayuda del modelo de inducción de la angiogénesis in vivo en implantes de celulosa en el ratón. Este modelo es una adaptación del modelo descrito por Andrade et al. (Microvascular Research, 1997, 54, 253-61).

Los animales, ratones blancos BALB/c J consanguíneos, se anestesian con una mezcla de Xilazina (Rompun®, 10 mg/kg)/ Ketamina (Imalgéne 1000, 100 mg/kg) por vía intraperitoneal. Se afeita el lomo del animal y se desinfecta con Hexomedine®. Se crea una bolsa de aire subcutánea en el lomo del ratón por inyección de 5 ml de aire estéril. Se realiza una incisión de aproximadamente 2 cm, en lo alto del lomo del animal para introducir un implante de celulosa estéril (disco de 1 cm de diámetro, espesor de 2 mm, Cellspon® ref 0501) impregnado con 50 l de solución estéril que contiene la proteína o el producto a ensayar. Después, se sutura la incisión y se limpia con Hexomedine®. Los días siguientes a la colocación del implante, los ratones recibieron en el implante la proteína o el producto mediante una inyección a través de la piel (50 l/implante/día) bajo anestesia gaseosa (Isoflurano al 5% (Aerrane®, Baxter).

Siete días después de la colocación de la esponja, se sacrifican los ratones mediante una dosis letal de Pentobarbital sódico (CEVA salud animal), administrada por vía intraperitoneal. Después, se recorta la piel, aproximadamente 1 cm alrededor de la esponja evitando la cicatriz para sacar la piel y la esponja. Se recorta la esponja a continuación en varios trozos y se coloca en un tubo Ribolyser® que contiene 1 ml de tampón de lisis (Cell Death Detection ELISA, Roche). Se agitan los tubos 4 veces consecutivas, durante 20 s, fuerza 4, en un triturador celular (FastPrep® FP 120). Después, se centrifugan los tubos durante 10 min. a 2000 g a 20°C y se congelan los sobrenadantes a -20°C, esperando el análisis de Hemoglobina.

El día del análisis, se centrifugan los tubos de nuevo después de la descongelación y se mide la concentración de hemoglobina con el reactivo de Drabkin (Sigma, volumen a volumen) por lectura en un espectrofotómetro, a 405 nm, contra una gama estándar de hemoglobina bovina (Sigma). La concentración de hemoglobina en cada muestra se expresa en mg/ml después de la regresión polinomial realizada a partir de la gama. Los resultados se expresan en valor medio (± sem) para cada grupo. Las diferencias entre los grupos se ensayan con una ANOVA seguido por un ensayo de Dunnett sobre la raíz cuadrada de los valores.

En este modelo, el FGF19 a 50 ng por sitio y 5 re-inyecciones es capaz de inducir significativamente la colonización de la esponja por vasos maduros nuevamente formados con la misma eficacia que el FGF2 a 5 ng por sitio. La presencia de vasos sanguíneos funcionales en la esponja se pone en evidencia por la presencia de hemoglobina (Fig. 1B). Estos resultados muestran que la activación específica de FGF-R4 permite el reclutamiento de vasos sanguíneos funcionales, lo que indica que FGF-R4 controla igualmente la angiogénesis in vivo.

Ejemplo 2: Descripción de las proteínas FGFR utilizadas como inmunógeno y antígeno.

Unos receptores de los factores de crecimiento FGFR, y en particular sus dominios extracelulares de FGF-R1, FGF-R2, FGF-R3, FGF-R4 se fusionan a un tag (Histag) o en el dominio Fc de inmunoglobulina.

El ADNc que codifica para el dominio extracelular de FGF-R4 humano, corresponde a la proteína descrita en SwissProt FGF-R4_HUMAN, posición 1-365, con la mutación L136P. Se ha clonado en el vector de expresión eucariota pXL4614 representado en la figura 2 para expresar una proteína que contiene un Histag en la posición Cterminal en el dominio extracelular.

Las proteínas denominadas hFGFR4-Histag, de secuencia SEC ID NO 40 se han producido por transfección transitoria en la línea HEK293 EBNA (Invitrogen) con la ayuda del plásmido pXL4614 y los plásmidos accesorios pXL4544 y pXL4551 que permiten la expresión de dos enzimas de glicosilación de los N-glicanos, es decir, la -2,3sialiltransferasa y la -1,4-galactosiltransferasa, como se ha descrito en la solicitud WO 2008/065543.

La proteína hFGFR4-Histag expresada en el sobrenadante de cultivo de células HEK293 EBNA se ha purificado por cromatografía sobre columna de sefarosa Ni-quelante (Amersham Biosciences; ref. 17-0575-01) y elución en tampón de imidazol, después se ha formulado en tampón PBS (Invitrogen; ref. 14190-094). El análisis de la composición en monosacáridos y la cuantificación de ácidos siálicos de los N-glicanos, como se describe por Saddic et al. 2002. (Methods Mol. Biol. 194:23-36 y Anumula et al. 1998. Glycobiology 8:685-694) han permitido demostrar que la proteína era muy ampliamente sialilada (91%). Como consecuencia, la proteína tenía todas las características para tener unas propiedades farmacocinéticas suficientes.

De manera comparable, la proteína hFGFR4-Strept (SEC ID NO 69) se ha purificado por cromatografía sobre columna Strep-Tactin Superflow (IBA; ref. 2-1206) y elución en tampón de destiobiotina, después formulada en tampón PBS.

La proteína hFGFR4(D2,D3)-Hístag corresponde a la secuencia SEC ID NO 42. Se ha clonado el ADNc en el plásmido de expresión eucariota pXL4615 representado en la figura 3 y se ha producido y purificado la proteína en condiciones comparables a las de la proteína hFGFR4-Histag.

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El ADNc que codifica la proteína mFGFR4-Histag (SEC ID NO 43) se ha clonado en el plásmido de expresión eucariota pXL4621 representado en la figura 4 y se ha producido y purificado la proteína en condiciones comparables a las de la proteína hFGFR4-Histag.

La proteína hFGFR1-Fc, (SEC ID NO 46) contiene el dominio extracelular de FGF-R1 lIlc humano fusionado en Cterminal al dominio Fc del lgGI humano. El ADNc se ha clonado en el plásmido de expresión eucariota pXL4728 representado en la figura 5 y se ha producido la proteína en condiciones comparables a las de la proteína hFGFR4-Hístag, después, se ha purificado por cromatografía sobre columna de afinidad de Sepharosa proteína G (Amersham Biosciences) y elución en tampón 100 mM de glicina/HCI, pH 2,7, después formulada en tampón PBS.

La proteína hFGFR2-Fc, de secuencia SEC ID NO 48, contiene el dominio extracelular de FGF-R2 lIlc humano, fusionado en C-terminal al dominio Fc del lgG1 humano. Se ha clonado el ADNc en el plásmido de expresión eucariota pXL4327 representado en la figura 6 y la proteína se ha producido y después purificado, en condiciones comparables a las de la proteína hFGFR1-Fc.

La proteína hFGFR3-Fc es una proteína que fusiona el dominio extracelular de FGF-R3 lIlc humano al dominio Fc, lgG1 humano se ha obtenido de R&D System (ref: 760-FR).

La proteína hFGFR4-Fc es una proteína que fusiona el dominio extracelular de FGF-R4 humano al dominio Fc, lgG1 humano se ha obtenido de R&D Systems (ref: 685-FR).

Se han fusionado diferentes sub-dominios de la parte extracelular de la proteína hFGFR4 al dominio Fc de lgG1 humano. El sub-dominio D1 está contenido en el constructo SABVA4794 (SEC ID NO 112 y Fig 14A y 14B). El subdominio D2 está contenido en el constructo SABVA4796 (SEC ID NO 114 y Fig 15A y 15B). El sub-dominio D3 está contenido en el constructo SABVA4799 (SEC ID NO 116 y Fig 16A y 16B). Estos tres sub-dominios se extienden respectivamente de las posiciones 1 a 179 para SABVA4794, 1 a 32 más 145 a 242 para el SABVA4796 y 1 a 32 más 228 a 360 para el SABVA4799 (posiciones descritas en SwissProt FGF-R4_HUMAN). Estas proteínas se han producido a partir de los plásmidos pXL4794 (secuencia codificadora SEC ID NO 111), pXL4796 (secuencia codificadora SEC ID NO 113) y pXL4799 (secuencia codificadora SEC ID NO 115) en condiciones comparables a las de la proteína FGFR1-FC.

Ejemplo 3: Generación y cribado de anticuerpos monoclonaies anti-FGF-R4

A -Anticuerpos obtenidos por inmunización

Los anticuerpos monoclonaies se han obtenido por inmunización con el inmunógeno hFGFR4-Histag en cinco ratones BALB/cJ (Charles River), de 6 a 8 semanas de edad, inmunizados cada uno con un total de 24 g de hFGFR4-Histag mediante el método RIMMS descrito por Kilpatrick et al. (1997. Hybridoma 16: 381389) y el protocolo de fusión descrito en ClonaCell™-HY Hybridoma Cloning kit (StemCell Technologies; ref 03800).

Dos días después de la última inyección, se sacrificaron los ratones y se fusionaron los nódulos linfáticos con las células de mieloma P3X63-A.G8.653 (ATCC, CRL-1580) en una relación 5:1 en presencia de Polietilenglicol (ClonaCelITM-HY ref. 03806). Se repartió asépticamente la suspensión celular en cajas de Petri incubadas a 37°C, en presencia de CO2 al 5%. Se aislaron las colonias aparecidas después de 12 días de incubación y se cultivaron en un medio E (ClonaCelITM-HY; ref. 03805) en cajas de 96 pocillos.

El cribado primario de anticuerpos monoclonales obtenidos por inmunización con hFGFR4-Histag se realizó por ensayo ELISA utilizando como antígeno de captura hFGFR4-Streptag. Se fijó el antígeno de captura en cajas lmmulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron después los sobrenadantes de cultivo de hibrídomas y después se detectaron gracias al anticuerpo de conejo anti-ratón IgG conjugado con peroxidasa (Sigma; ref. A9044-dilución al 1:50000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) y las mediciones con la lectora de placas a 450 nm. Entre los 444 hibridomas ensayados, 129 eran positivos por ensayo ELISA con el antígeno hFGFR4-Streptag, cuyos 120 hibridomas eran también positivos con la proteína dímera hFGFR4-Fc.

Se realizó un cribado secundario para seleccionar únicamente los anticuerpos específicos al FGF-R4 por ensayo ELISA, utilizando como antígeno de captura la proteína hFGFR4-Streptag, después con las proteínas hFGFR1-Fc, hFGFR2-Fc y hFGFR3-Fc descritas en el ejemplo 2. Se fijó el antígeno de captura en cajas lmmulon-4 enzymelinked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron después los sobrenadantes de cultivo de hibridomas y después se detectaron gracias al anticuerpo de conejo anti-ratón IgG conjugado con peroxidasa (Sigma; ref. A9044dilución al 1:50000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) y las mediciones con la lectora de placas a 450 nm.

Entre los 129 hibridomas ensayados, positivos, por ensayo ELISA con el antígeno, 84 hibridomas eran positivos con hFGFR4-Streptag y no tenían afinidad ni por hFGFR1-Fc, ni por hFGFR2-Fc ni por hFGFR3-Fc. En función de su

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crecimiento y de su morfología, se conservaron 39 hibridomas. Se determinó su isotipo con la ayuda del kit SEROTEC (ref. MMT1); 95% eran IgG1.

Se realizó un cribado terciario sobre un ensayo de proliferación de células modificadas Baf/3, inducidas por FGF2 5 para caracterizar la inhibición por los anticuerpos anti-FGFR4.

Se clonaron los hibridomas murinos que expresan los anticuerpos anti-FGFR4 antagonistas por dilución límite. A partir de las células de hibridomas cultivadas en fase exponencial, se determinó la secuencia codificadora (ADNc) después de la extracción del ARNm con ayuda del kit Oligotex (Qiagen; ref 72022); obtención y amplificación del 10 ADNc por el método RACE-RT con el kit Gene Racer, la transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen; ref L1500) y los cebadores (cebadores) descritos en la tabla 2 siguiente; amplificación de los fragmentos de ADNc con la ayuda de la polimerasa Phusion (Finnzymes; ref. F-530S), los cebadores (cebadores) y las condiciones de temperatura descritas en la tabla 2. Se clonaron los fragmentos amplificados que contienen las partes codificadoras para VH (parte variable de la cadena pesada HC) o VL (parte variable de la cadena ligera LC), en el vector pGEM-T Easy de

15 Promega; ref A137A), se secuenciaron los insertos de los plásmidos obtenidos, de manera que se analice la secuencia codificadora de cada dominio variable en el sentido 5'-3' y 3'-5' en al menos 6 plásmidos que corresponden a los anticuerpos anti-FGFR4 40-12 y anti-FGFR4 64-12. Se realizaron los análisis de secuencia, contigs y alineaciones con la ayuda del programa disponible sobre Vector NTI (Invitrogen).

20 Se conservaron los plásmidos que contienen las secuencias consensuadas que codifican las partes variables de los anticuerpos anti-FGFR4. El plásmido pXL4691 contiene la secuencia que codifica para VH de secuencia SEC ID NO 5 del anticuerpo anti-FGFR4 40-12 y el plásmido pXL4693 contiene la secuencia que codifica para la VH de secuencia SEC ID NO 19 del anticuerpo anti-FGFR4 64-12 como se presenta en la tabla 2 siguiente.

25 El plásmido pXL4690 contiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO 7 que codifica para la VL de secuencia SEC ID NO 8 del anticuerpo anti-FGFR4 40-12 y el plásmido pXL4692 contiene la secuencia nucleotídica SEC ID NO 21 que codifica para la VL de secuencia SEC ID NO 22 del anticuerpo anti-FGFR4 64-12 tal como se presenta en la tabla 2 siguiente.

30 Tabla 2 -Condiciones de realización y análisis de reacciones de la transcriptasa inversa y PCR-Identificación de los plásmidos pXL4690 a pXL4693.

Anti-FGFR4: 40-12 64-12

Reacción RT Temperatura Cebadores: 55°C SEC ID NO 64 (HC) SEC ID NO 65 (LC) 55°C SEC ID NO 64 (HC) SEC ID NO 66 y ID NO 67 (LC)

Cebador 5'-GeneRacer (SEC ID NO 63): 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'

Cebador 3'interno a la articulación murina (SEC ID NO 64): 5'-TATGCAAGGCTTACAACCACA-3'

Cebador 3'-interno al Ck murino (SEC ID NO 65): 5'-CTCATTCCTGTT GAAGCTCTT GAC-3'

Cebadores 3-internos a C murino (SEC ID NO 66 y SEC ID NO 67): 5'-ACACTCAGCGGG ACAAACTCTT-3' 5'-ACACTCTGCAGGAG ACAGACTCTTTTC-3'

PCR de HC: Temperatura Cebadores: 55° C SEC ID NO 63 -SEC ID NO 64 55°C SEC ID NO 63 -SEC ID NO 64

Secuencia de productos PCR clonados (VH): 9 clones tienen la misma secuencia VH y una secuencia CH1 idéntica a la del mCH 1 6 clones tienen la misma secuencia VH y una secuencia CH1 idéntica a la de mCH1

Plásmido que contiene VH: pXL4691 pXL4693

PCR de LC: Temperatura Cebadores: 55° C SEC ID NO 63 -SEC ID NO 65 55°C SEC ID NO 63 -SEC ID NO 66 y 67

Secuencia de los productos PCR clonados (VL): 11 clones tienen la misma secuencia VL y una secuencia Ck idéntica a mCk 6 clones tienen la misma secuencia VL y una secuencia C idéntica a mC

Plásmido que contiene VL: pXL4690 pXL4692

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Las secuencias de aminoácidos de las partes variables ligeras y pesadas, respectivamente, de los anticuerpos anti-FGFR4 64-12 y anti-FGFR4 40-12 son diferentes. Los números de las secuencias utilizadas, obtenidas y deducidas, se indican en la tabla 7.

Los anticuerpos 40-12 y 64-12 se han producido en frascos T500. El sobrenadante de cultivo se recogió después de 7 días. Los anticuerpos anti-FGFR4 se purificaron por afinidad sobre proteína G, después se dializaron contra PBS, se filtraron estériles y se conservaron a 4°C.

Los anticuerpos antagonistas purificados tienen un KD de 6,5 x 10-9 M (anti-FGFR4 40-12) y 5,75 10-8 M (anti-FGFR4 64-12).

B -Anticuerpo seleccionado con ayuda del método de visualización de fagos

El cribado primario de anticuerpos monoclonales obtenidos por visualización de fagos con hFGFR4-Histag se realizó por ensayo ELISA utilizando como antígeno de captura hFGFR4-Histag. Se fijó el antígeno de captura en cajas lmmulon-2 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron a continuación los sobrenadantes de cultivo de E. coli infectados por los fagos, después se detectaron gracias al anticuerpo de ratón antiM13 conjugado con la peroxidasa (GE Healthcare; ref. 27-9421-01, dilución al 1:5000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H2O2 (Interchim; ref UP664780) y las mediciones de densidad óptica (D.O.) se efectuaron a 450 nm.

Se realizó un cribado secundario para seleccionar únicamente los anticuerpos específicos al FGF-R4 por ensayo ELISA utilizando como antígeno de captura la proteína hFGFR4-Histag, después con las proteínas hFGFR1-Fc, hFGFR2-Fc y hFGFR3-Fc descritas en el ejemplo 2. Se fijó el antígeno de captura en cajas lmmulon-2 enzymelinked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron a continuación los sobrenadantes de cultivo de E. coli infectados por los fagos, después se detectaron gracias al anticuerpo de ratón antiM13 conjugado con peroxidasa (GE Healthcare; ref. 27-9421-01, dilución al 1:5000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H2O2 (Interchim; ref UP664780) y las mediciones de densidad óptica (D.O.) se efectuaron a 450 nm.

Se secuenciaron los clones específicos al FGF-R4 seleccionados y se reclonaron en un vector de expresión para transfección transitoria de células HEK293.

Para ello, en una primera etapa, las regiones que codifican Fab, es decir la cadena ligera del anticuerpo, un sitio de unión de ribosoma bacteriano y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, se extraen del fagémido por restricción y se insertan en un plásmido de expresión de IgG para células de mamíferos, más abajo de una secuencia señal de anticuerpo eucariota y más arriba de la región constante de una cadena pesada de lgG1 humano. En una segunda etapa, la región que contiene el sitio de unión del ribosoma bacteriano y el péptido señal bacteriano de la cadena pesada se intercambia contra una secuencia IRES y una secuencia señal eucariota. Los IgG se expresan por transfección transitoria de células HEK293. Este proceso se describe con detalle en T. Jostock et al., Journal of Immunological Methods 289 (2004) 65-80.

Un ejemplo de secuencia de región constante de IgG1 humano que se puede utilizar en la presente invención es la secuencia SEC ID NO 117.

Se realizó un cribado terciario en un ensayo de proliferación de células modificadas Baf/3, inducido por FGF2 y descrito en el ejemplo 4 a fin de caracterizar la inhibición por los anticuerpos anti-FGFR4 utilizando los sobrenadantes de cultivos de células HEK293 transfectadas transitoriamente por los vectores de expresión de los anticuerpos. Este cribado ha permitido identificar los anticuerpos de los clones 8, 31, 33 y 36. Las secuencias correspondientes se describen en la tabla 7.

Ejemplo 4: Establecimiento de la línea clonal murina BaF/3 FGF-R4-hMpl y protocolo de proliferación celular

Se clonó la parte extracelular y transmembranaria del FGF-R4 en fusión traduccional con el dominio intracelular del hMpI en un vector pEF6/V5-His A mutado a fin de obtener la presencia en 5' del tag HA delante del receptor quimérico FGF-R4-hMpl.

Constructo del pEF6A mutado

Se mejoró el vector pEF6/V5-His A (Invitrogen, referencia V961-20) a fin de integrar el MCS (multi Clonage Sites) asociado al tag HA colocado bajo el péptido señal del IgGk del pDisplay (Invitrogen, referencia V660-20). Para eso, se amplificó el MCS asociado al tag HA y su péptido señal por PCR entre los cebadores sentido de la secuencia SEC ID NO: 51 y la inversa de la secuencia SEC ID NO: 52 permitiendo insertar los sitios de restricción Kpnl en 5' y Xbal en 3'. Se digirió el fragmento PCR por las enzimas Kpnl y Xbal, después se clonó en el vector pEF6/V5-His A abierto por las mismas enzimas. Finalmente, el primer sitio BamHI del MCS se reemplazó por el sitio BsrGI digiriendo el vector nuevamente formado por las enzimas Kpnl y Spel e insertando entre estos sitios los cebadores de las secuencias SEC ID NO: 53 y SEC ID NO: 54 híbridas entre sí y que contienen el sitio enzimático BsrGI. El vector obtenido se denominó: pEF6mut-HA.

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tipo HUVEC, inducida por el FGF-2. Estos 4 anticuerpos bloquean la estimulación de la angiogénesis in vitro obtenida con el FGF-2, y esti a la dosis de 10 g/ml (Fig. 8C y 8D).

Ejemplo 7: Efecto antagonista del anticuerpo 40-12 y de los anticuerpos resultantes de los clones 8, 31, 33, 36 sobre las células de hepatocarcinomas humanos (in vitro)

A fin de determinar el efecto anti-tumoral del anticuerpo monoclonal anti-FGFR4 antagonista 40-12, se realizaron unos experimentos sobre células de hepatocarcinoma humano Hep3b en las que la proliferación y las vías de señalización y conducción dependen del par ligando-receptor: FGF19/FGF-R4.

En primer lugar, se realizó el estudio de las vías de señalización dependientes de FGF-R4 y que conducen a la proliferación de células Hep3b mediante el método de transferencia Western. Esta señalización celular pasa por la neo-síntesis de las proteínas cFos y JunB, así como por la fosforilación de Erk1/2 (Lin et al., J Biol Chem., 2007, 14:27277-84). Para eso, se inocularon 5.105 células en una caja de 35 mm de diámetro, en 2 ml de medio completo (DMEM, SVF al 10%, glutamina 2 mM). Veinticuatro horas después, se pusieron en carencia las células durante 24h, en 1,8 ml de medio desprovisto de suero. Después, se estimularon las células durante 3h por 200 l de FGF19 concentrado 10 veces en ausencia o en presencia de anticuerpo anti-FGFR4 de control o 40-12. Se retiró después el medio, se lavaron las células una vez con PBS frío y se lisaron en una caja durante 30 min, a 4°C, por 75 l de tampón RIPA complementado con inhibidor de proteasa. Después, se centrifugó el extracto proteico total durante 10 min, a 4°C, a 13.000 rpm y se analizó el sobrenadante mediante la técnica de transferencia Western. A continuación se incubaron las membranas durante 2h, a temperatura ambiente, en TBS, tween al 0,05%, 5% de leche y después se añadieron el anticuerpo primario anti-cFos (Cell Signaling Technology, ref 2250), anti-JunB (Cell Signaling Technology, ref 3746) y anti-fosfoErk1/2 (Cell Signaling Technology, ref 4377), al 1/1000 y se incubaron una noche a 4°C con agitación lenta. Se aclaró tres veces la membrana con TBS, tween al 0,05% y se incubó el anticuerpo secundario unido a HRP durante 4h, a 4°C, diluido al 1/2000 en TBS, tween al 0,05%, 5% de leche. Se cuantificaron entonces los resultados de la transferencia Western con ayuda de un Chemigenius (Syngene). Se ponderó la intensidad de las bandas obtenidas con los diferentes anticuerpos por la intensidad de las bandas obtenidas con el anticuerpo anti-actina directamente unido con la HRP y utilizado al 1/3000 (Santa Cruz Biotechnology, ref Sc-8432-HRP).

El FGF19 a 30 ng/ml induce la síntesis de las proteínas JunB y cFos, así como la fosforilación de Erk1/2 en las células Hep3b. Esta neo-síntesis de proteína y la fosforilación de Erk son inhibidas completamente por el anticuerpo anti-FGFR4 40-12 a 100 g/ml, aunque el anticuerpo de control no tiene ningún efecto inhibidor. Se cuantificaron estos efectos observados en las membranas de transferencia Western (Fig. 9A) y se representaron las intensidades de las bandas de cada membrana en forma de gráfica (Fig. 9B).

En segundo lugar, se han llevado a cabo experimentos de proliferación celular propiamente dichos. Se inocularon 5000 células en placas de 96 pocillos, en 100 l de medio DMEM, SVF al 10%, glutamina 2 mM. 24 horas después, las células son desprovistas de suero durante 24 horas en un medio de cultivo. Después, se estimularon las células Hep3b durante 72h, por 100 l de medio sin suero complementado con 10 ng/ml de FGF19 (producción interna a Sanofi-Aventis R&D) o por el 10% de suero en ausencia o en presencia de anticuerpo control o de anticuerpo monoclonal anti-FGFR4 antagonista 40-12. Después de 3 días, se cuantificó la proliferación celular con la ayuda del kit CelITiter Glo (Promega, Francia).

De estos experimentos, se desprende que el suero así como el FGF19 son capaces de estimular la proliferación de Hep3b. El anticuerpo anti-FGFR4 antagonista 40-12 inhibe parcialmente a 100 g/ml esta proliferación induce al suero mientras que el anticuerpo control no presenta ninguna actividad inhibidora (Fig. 10A). Además, el anticuerpo 40-12 a 10 g/ml bloquea completamente la proliferación inducida por el FGF19 (Fig. 10B). El anticuerpo control no tiene ningún efecto.

Esto demuestra que se puede utilizar el anti-FGFR4 antagonista objeto de la invención como agente terapéutico anti-tumoral en el ámbito de tumores dependientes del FGF19 o del FGF-R4 y que este anticuerpo sería particularmente eficaz en el tratamiento de los hepatocarcinomas.

A fin de simplificar el estudio del efecto de los anticuerpos anti-FGFR4 sobre las células Hep3b, se desarrolló un ensayo ELISA para la detección de la fosforilación de Erk1/2 tras la estimulación de estas células por el FGF-19 (en correlación con los experimentos descritos en el ejemplo 8), del FGF-2 o de suero fetal bovino.

Para eso, se inocularon 50.000 células Hep3b en placas de 96 pocillos, negras, de fondo transparente (COSTAR, ref 3603) en 100 I de medio DMEM, SVF al 10%, glutamina 2 mM. Después de 24h, se sometieron las células a carencia durante 24h en medio DMEM, glutamina 2 mM sin SVF. Se aspiró el medio a continuación y se reemplazó por 100 l de medio de carencia pre-equilibrado a 37°C, que contiene el FGF o el SVF, así como los anticuerpos evaluados a las diferentes dosis. Las células se incuban durante 3h a 37°C, CO2 al 5%. Se aspira entonces el medio de estimulación, se enjuagan los pocillos con PBS a 4°C y se fijan las células por adición de 200 l de PFA

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Tabla 5: Medición de la unión del anticuerpo 40-12 a los diferentes subdominios de FGF-R4

Dominio estudiado: D1 SABVA4794 D2 SABVA4796 D3 SABVA4799 D1-D3 FGFR-Fc

Señal (D.O., 450 nm): 0,185 3,000 0,105 3.000

El anticuerpo anti-FGFR4 reconoce por lo tanto el dominio D2 de la parte extracelular de la proteína FGFR4. 5 Por otra parte, la proteína FGFR4-Fc desnaturalizada con SDS no es reconocida por el anticuerpo 40-12 en el análisis por transferencia Western, lo que indica que el epítopos determinado por el 40-12 sobre el dominio D2 de FGFR4 es de tipo conformacional.

10 B-Determinación del epítopo reconocido por los anticuerpos anti-FGFR4 8, 31, 33, 36.

Se realizó un cribado para determinar el dominio específico del FGFR4 reconocido por los anticuerpos 8, 31, 33, 36 por ensayo ELISA, utilizando como antígeno de captura los constructos que contienen o bien los dominios D2 y D3 (SEC ID No 42) o bien la proteína hFGFR4-Histag (SABVA4614, SEC ID NO 40). Se fijó el antígeno de captura en 15 cajas lmmulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron después los sobrenadantes de los cultivos de HEK293 transfectados transitoriamente por plásmidos que permiten la secreción de los anticuerpos 8, 31, 33, 36, y después se detectaron gracias al anticuerpo de conejo anti-humano IgG conjugado con peroxidasa (DakoCytomation, ref. P0214-dilución al 1:5000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H2O2 (Interchim; ref U P664780) y las mediciones de densidad óptica (D.O.) se efectuaron a 450 nm. La tabla 6 siguiente resume los

20 resultados obtenidos:

Tabla 6: Unión de los anticuerpos resultantes de los clones 8, 31, 33 y 36 al FGF-R4 entero o al sub-dominio D2-D3 (señal DO a 450 nm)

hFGFR4-Histag: hFGFR4(D2,D3)-Histag

Clon 8: 3,898 3,860

Clon 31: 3,859 3,741

Clon 33: 3,752 3,621

Clon 36: 3,751 3,616

Los anticuerpos 8, 31, 33 y 36 reconocen por lo tanto el D2-D3 de la parte extracelular de la proteína FGFR4. Tabla 7: secuencias utilizadas, obtenidas y deducidas

Secuencias nucleotídicas: Secuencias proteicas

Anticuerpo 40-1 2

VH + CH: SEC ID NO 1 SEC ID NO 2

VL + CL: SEC ID NO 3 SEC ID NO 4

VH: SEC ID NO 5 SEC ID NO 6

VL: SEC ID NO 7 SEC ID NO 8

CDR VH: SEC ID NO 9; 0; 11

CDR VL: SEC ID NO 12; 13; 14

Anticuerpo 64-12

VH + CH: SEC ID NO 15 SEC ID NO 16

VL + CL: SEC ID NO 17 SEC ID NO 18

VH: SEC ID NO 19 SEC ID NO 20

VL: SEC ID NO 21 SEC ID NO 22

CDR VH: SEC ID NO 23; 24; 25

CDR VL: SEC ID NO 26; 27; 28

Secuencias humanizadas

Cadena ligera 1: SEC ID NO 29 SEC ID NO 30

Cadena ligera 2: SEC ID NO 31 SEC ID NO 32

Cadena pesada 1: SEC ID NO 33 SEC ID NO 34

Cadena pesada 2: SEC ID NO 35 SEC ID NO 36

Cadena pesada 3: SEC ID NO 37 SEC ID NO 38

Constructos

hFGFR4-Histag: SEC ID NO 39 SEC ID NO 40

hFGFR4-Streptag: SEC ID NO 68 SEC ID NO 69

hFGFR4(D2D3)-Histag: SEC ID NO 41 SEC ID NO 42

mFGFR4-Histag.: SEC ID NO 43 SEC ID NO 44

hFGFRI -Fc: SEC ID NO 45 SEC ID NO 46

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hFGFR2-Fc: SEC ID NO 47 SEC ID NO 48

rFGFR4: SEC ID NO 49 SEC ID NO 50

Secuencias de cebadores para el establecimiento de la línea clonal (ejemplo 4): SEC ID NO 51; 52; 53; 54; 55; 56; 58 SEC ID NO 61; 62

Dominio transmembranario FGFR4: SEC ID NO 59; 60

Oligonucleótidos cebadores tabla 1: SEC ID NO 63; 64; 65; 66; 67

Epítopo en dominio D2: SEC ID NO 70

Anticuerpo clon 8

Cadena ligera entera Cadena ligera CDR: SEC ID NO 71 SEC ID NO 72 SEC ID NO 73; 74; 75

Cadena pesada entera Cadena pesada CDR: SEC ID NO 76 SEC ID NO 77 SEC ID NO 78; 79; 80

Anticuerpo del clon 31

Cadena ligera entera Cadena ligera CDR: SEC ID NO 81 SEC ID NO 82 SEC ID NO 83; 84; 85

Cadena pesada entera Cadena pesada CDR: SEC ID NO 86 SEC ID NO 87 SEC ID NO 88; 89; 80

Anticuerpo del clon 33

Cadena ligera entera Cadena ligera CDR: SEC ID NO 91 SEC ID NO 92 SEC ID NO 93; 94; 85

Cadena pesada entera Cadena pesada CDR: SEC ID NO 96 SEC ID NO 97 SEC ID NO 98; 99; 100

Anticuerpo del clon 36

Cadena ligera entera Cadena ligera CDR: SEC ID NO 101 SEC ID NO 102 SEC ID NO 103; 104; 105

Cadena pesada entera Cadena pesada CDR: SEC ID NO 106 SEC ID NO 107 SEC ID NO 108; 109; 110

Sub-dominios de la parte extracelular de hFGFR4 fusionados al dominio Fc del lgG1

fGFGR4_D1::Fc: SEC ID NO 111 SEC ID NO 112

fGFGR4_D2::Fc: SEC ID NO 113 SEC ID NO 114

fGFGR4_D3::Fc: SEC ID NO 115 SEC ID NO 116

Secuencia de región constante de lgG1 humano: SEC ID NO 117

Claims

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