BRPI0915660A2

BRPI0915660A2 - antagonistas específicos do receptor fgf-r4

Info

Publication number: BRPI0915660A2
Application number: BRPI0915660A
Authority: BR
Inventors: Cameron Béatrice; Herbert Corentin; Remy Elisabeth; Blanche Francis; Bono Françoise; Baurin Nicolas; Berne Pierre-François; Dabdoubi Tarik; Mikol Vincent
Original assignee: Sanofi Aventis
Priority date: 2008-07-08
Filing date: 2009-07-07
Publication date: 2019-08-27
Also published as: HK1159133A1; US20110150903A1; WO2010004204A3; EP2315781A2; FR2933702A1; PE20110313A1; IL210516A0; CN103784954A; MX2011000328A; ECSP11010748A; ES2544761T3; KR20110028536A; MA32547B1; UA107782C2; CA2730300A1; NZ590860A; AU2009267834B2; DK2315781T3; JP2011527322A; EP2315781B1

Abstract

"antagonistas específicos do receptor fgf-r4". a presente invenção refere-se a moléculas antagonistas especí- ficas do receptor fgf-r4, permitindo inibir a atividade do receptor. esses antagonistas são, em particular, anticorpos dirigidos especificamente contra o receptor fgf-r4, permitindo inibir a atividade desse receptor. a presente invenção refere-se também à utilização terapêutica desses anticorpos, em particular no domínio da angiogênese, e no tratamento de certos tipos de câncer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTAGONISTAS ESPECÍFICOS DO RECEPTOR FGF-R4.

A presente invenção refere-se aos antagonistas específicos do receptor 4 aos FGF (FGF-R4), permitindo inibir a atividade desse receptor. Esses antagonistas são, em particular, anticorpos dirigidos especificamente contra o receptor 4 aos FGF (FGF-R4).

A presente invenção refere-se também à utilização terapêutica desses antagonistas, em particular no domínio da angiogênese e no tratamento de certos tipos de câncer.

Os FGF (Fibroblast Growth Factor) contam entre as primeiras moléculas descritas como sendo capazes de estimular a proliferação, a migração e a diferenciação das células vasculares in vitro e in vivo. Uma literatura abundante descreve a indução da angiogênese e a formação de capilares sanguíneos in vitro e in vivo pelos FGF. Os FGF são também implicados na angiogênese tumoral, promovendo a formação de vasos sanguíneos recrutados pelo tumor.

A família dos FGF humanos é composta de pelo menos 23 membros que possuem um domínio central conservado de 120 aminoácidos. Eles exercem sua atividade biológica interagindo com seus receptores de alta afinidade de tipo tirosina-quinase (FGF-R) e heparanas sulfato proteoglicanos, compostos presentes na maior parte das superfícies celulares e matrizes extra-celulares (local de ligação de baixa afinidade) para formar um complexo ternário. Determinados FGF apresentam uma elevada afinidade para vários FGF-R, enquanto que outros ativam especificamente um receptor ou uma isoforma de um receptor.

Um ligante específico de FGF-R4 foi identificado por Xie et al (Cytokine, 1999, 11:729-35). Esse ligante, denominado FGF 19 é um ligante de elevada afinidade ao FGF-R4 exclusivamente e cuja ligação ao receptor é dependente da heparina ou das heparanas sulfatos. O FGF 19 foi identificado no animal adulto, unicamente no nível dos hepatócitos e do intestino delgado onde ele regula a síntese de ácido biliar pelo fígado. Seria um fator de crescimento, intervindo quando do desenvolvimento embrionário e seria im2/59 plicado no desenvolvimento do cérebro fetal no peixe zebra e no homem.

Outros ligantes de FGF-R4 são descritos como o FGF1 ou FGF2. Esses ligantes ativam muito o FGF-R4, mas não são específicos de FGF-R4: eles se ligam também a outros FGF-R (Ornitz et al.; J. Biol. Chem., 1996, 271:15292-7).

A ativação do receptor FGF-R4 leva a vários tipos de sinalizações celulares. Dentre estas, a forma a mais clássica correspondente à colocação de uma via de sinalização por cascata de fosforilação de uma estimulação de FGF-R4 por FGF. Essa indução leva à alta fosforilação do domínio tirosina quinase de FGF-R4 e serve para iniciar uma via de sinalização intracelular dependente das fosforilações de outras proteínas de sinalização, tais como AKT, p44/42, JNK etc... Essa sinalização por fosforilação varia segundo o tipo celular e segundo os correceptores ou as moléculas de adesão presentes na superfície dessas células. (Cavallaro et al., Nat. Cell Biol. 3/7, 650-657 (2001); Stadler et al., Cell. Signal. 18/6, 783-794, (2006); Lin et al., J. Biol Chem., 2007, 14:27277-84, (2007)). Um outro modo de sinalização importante para os FGF-R, dos quais esse FGF-R4 é a internalização do receptor, após ativação em associação com seu ligante. Esse mecanismo não é dependente da atividade tirosina quinase do receptor, mais de uma curta sequência em C-terminal de FGF-R4 (Klingenberg et al., J. Cell Sei., 113/Ptl0:1827-1838 (2000)).

Quatro formas distintas de FGF-R4 são descritas na literatura. Uma forma de tamanho pleno com duas variantes polimórficas na posição 388, a saber o FGF-R4 Gly388 que é a forma normal do receptor e a forma arg 388 que é descrita no âmbito de vários tumores (Bange et al., Cancer Res. 62/3, 840-847 (2002); Spinola et al., J. din Oncol 23, 73077311 (2005) uma forma solúvel foi também descoberta expressa em células tumorais mamárias (Takaishi et al. Biochem Biophys res Commun., 2000, 267:65862). Uma quarta forma truncada na parte extracelular foi descrita em certos adenomas hipofisários (Ezzat et al., J Clin invest., 2002, 109:69-78).

O FGF-R4 é principalmente expresso nos tecidos derivados da endoderme, tais como o trato gastrointestinal, o pâncreas, o fígado, os mús3/59 culos e as glândulas suprarrenais.

O FGF-R4 é conhecido na literatura como tendo vários papéis celulares, dos quais os três principais são descritos no que se segue:

Em primeiro lugar, esse receptor é implicado no controle de diferentes processos de diferenciação celular in vitro e in vivo como a diferenciação e a regeneração dos músculos esqueléticos, a diferenciação do tecido mesenquimatoso, a osteogênese ou ainda na formação dos alvéolos no decorrer do desenvolvimento hepático pós-natal.

Em segundo lugar, o FGF-R4 é descrito no controle da homeostasia do ácido biliar e do colesterol e interviria no controle da adiposidade. Além disso, a balança entre a produção do ácido biliar e aquela do colesterol é controlada por FGF-R4 in vitro e in vivo.

Em terceiro lugar, o FGF-R4 é implicado em certos fenômenos tumorais como desenvolvimento dos carcinomas hepatocelulares ou dos cânceres do cólon, na proliferação de células de fibroadenomas mamários, de células epiteliais de cânceres mamários, como a motilidade das células de carcinomas mamários ou colorretais. A implicação tumoral do FGF-R4 é majoritariamente associada ao aparecimento do polimorfismo (Gly388Arg) correlacionada à aceleração da progressão tumoral de tumores mamários e colorretais (Bange et al., Cancer Res. 62/3, 840-847. 2002), prostáticos (Wang et al. Clin Cancer Res. 10/18, 6169-6178, 2004) ou hepáticos (Nicholes et al. Am. J. Pathol. 160/6, 2295-307, 2002). Esse polimorfismo é também associado a um mau prognóstico no âmbito de sarcomas (Morimoto et al., Cancer 98/10, 2245-2250, 2003), de adenocarcinomas pulmonares (Spinola et al., J. Clin Oncol 23, 7307-7311, 2005) ou de sarcomas escamosos (da Costa Andrade et al., Exp Mol Pathol 82, 53-7, 2007). A superexpressão de FGF-R4 é também descrita em certas linhagens de cânceres pancreáticos (Shah et al., Oncogene 21/54, 8251-61, 2002) e correlaciona com a malignidade de astrocitomas (Yamada et al., Neurol. Res. 24/3, 244-8, 2002). Além disso, a utilização de um anticorpo monoclonal anti-FGF 19 em modelos in vivo de xenoenxertos de tumores de cólon e em modelos de carcinomas hepatocelulares, mostra que a inativação do FGF 19 e, portanto, o blo

4/59 queio da ativação de FGF-R4 pode ser benéfico no tratamento de câncer do cólon ou do fígado.

É admitido na literatura que as camadas FGF/FGF-R1 e FGF/FGF-R2 participam da formação dos novos vasos sanguíneos em um contexto normal ou patológico. Todavia, a implicação potencial de FGF-R4 no controle desse fenômeno celular jamais foi estudada. Foi com efeito até hoje suposto que a ativação da angiogênese é mediada por FGF-R1 e/ou FGF-R2 (Presta et al, Cytokine Growth Factor Rev., 2005, 16:159-78).

Exemplos de antagonistas de FGF-R4 são descritos na literatura, notadamente: pequenas moléculas, porém elas não atingem o FGF-R4 de maneira específica, acarretando assim efeitos indesejáveis. Assim pequenas moléculas químicas inibidoras do domínio tirosina quinase que inibem vários FGF-R, assim como outros receptores tirosina quinase foram descritos por (Thompson et al J Med Chem., 2000, 43:4200-11). Pequenas moléculas químicas inibidoras dos FGF-R por associação à sua parte extracelular foram também descritas no pedido W02007/080325.

Anticorpos foram também estudados, como os anticorpos antiFGF-R1 e/ou anti-FGF-R4 descritos nos pedidos internacionais W02005/066211 e W02008/052796 ou por Chen et al„ (Hybridona 24/3, 152-159, 2005). O pedido W02005/037235 descreve anticorpos antagonistas dos FGF-R para o tratamento da obesidade e do diabetes. Por outro lado, anticorpos anti-FGF-R4 agonistas são descritos no pedido WO03/063893.

A presente invenção tem por objeto um antagonista do receptor FGF-R4, caracterizado pelo fato de se ligar especificamente a este. De maneira vantajosa, esse antagonista é um anticorpo específico do receptor FGF-R4.

Em um modo de realização, o antagonista objeto da invenção,se liga ao domínio D2-D3 do receptor FGF-R4. Em um modo de realização vantajoso, o antagonista objeto da invenção se liga ao domínio D2 do receptor FGF-R4. Em um modo ainda mais vantajoso, o antagonista se liga à sequência SEQ ID N°: 70.

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De maneira vantajosa, o antagonista específico do receptor FGF-R4 tem um K_D face o receptor FGF-R4 determinado pela técnica Biacore inferior a 10E-8 M, inferior a 5 x 10E-9M, inferior a 2 x 10E-9M ou inferior a 1 x 10E-9M.

Em um modo de realização vantajoso o antagonista específico do receptor FGF-R4 é ativo ao mesmo tempo contra FGF-R4 humano e FGF-R4 murino.

Em um outro modo de realização vantajoso, o antagonista específico do receptor FGF-R4 é ativo ao mesmo tempo contra FGF-R4 humano, FGF-R4 murino e FGF-R4 de rato.

Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende pelo menos um CDR que apresenta uma sequência idêntica à SEQ ID N°: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 73, 74, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 88, 89, 90, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 108, 109 ou 110 ou pelo menos um CDR, cuja sequência difere de um a dois aminoácidos em relação às sequências SEQ ID N°: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 73, 74, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 88, 89, 90, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 108, 109 ou 110 contanto que o corpo mantenha sua especificidade de ligação.

Em um modo de realização particularmente vantajoso, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende os CDR de sequência SEQ ID N°: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 73, 74, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 88, 89, 90, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 108, 109 ou 110 os CDR, cujas sequências diferem de um a dois aminoácidos em relação - respectivamente - às sequências acima citadas, contanto que isto não modifique a especificidade de ligação do anticorpo ao receptor FGF-R4.

Em um modo de realização vantajoso, os anticorpos da invenção compreendem pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, essa cadeia pesada compreendendo três sequências CDR que têm sequências em aminoácidos selecionados no grupo que consiste em SEQ ID N°: 9, 10 e 11 ou 73, 74 e 75, 83, 84 e 85, ou 93, 94, 95 ou 103, 104 e 105 essa cadeia leve compreendendo três sequências CDR que têm sequências

6/59 em aminoácidos selecionados no grupo que consiste em SEQ ID N°: 12, 13 e 14 ou 78, 79 e 80, ou 88, 89 e 90 ou 98, 99 e 100 ou 108, 109 e 110.

Em um modo de realização vantajoso as partes variáveis da cadeia pesada do anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendem uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 6, 77, 87, 97 ou 107.

Em um modo de realização vantajoso as partes variáveis da cadeia leve do anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendem uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 8, 72, 82, 92 ou 102.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo uma cadeia pesada, que compreende uma parte variável codificada por uma sequência nucleotídica que apresenta uma identidade de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% com a sequência SEQ ID N°: 5, 76, 86, 96 ou 106.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo uma cadeia leve que compreende uma parte variável codificada por uma sequência nucleotídica apresentando uma identidade de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% com a sequência SEQ ID N°: 7, 71, 81, 91 ou 101.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo uma cadeia pesada que compreende uma parte variável codificada por uma sequência polipeptídica SEQ ID N°: 6, 77, 87, 97 ou 107.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo uma cadeia leve que compreende uma parte variável de sequência polipeptídica SEQ ID N°: 8, 72, 82, 92 ou 102.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 5 e 7 ou 71 e 76 ou 81 e 86, ou 91 e 96 ou 101 e 106.

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A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 6 e 8 ou 72 e 77 ou 82 e 87, ou 92 e 97 ou 102 e 107.

Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende sequências idênticas pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% às SEQ ID N°: 2 e/ou SEQ ID N°: 4; ou SEQ ID N°: 72 e/ou SEQ ID N°: 77; ou SEQ ID N°: 82 e/ou SEQ ID N°: 87 ou SEQ ID N°: 92 e/ou SEQ ID N°: 97 ou SEQ ID N°: 102 e/ou SEQ ID N°: 107.

Em um modo de realização particularmente vantajoso, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende uma cadeia pesada codificada por uma sequência nucleotídica idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 1.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista do receptor FGF-R4, compreendendo uma cadeia pesada de sequência polipeptídica idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 2.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista do receptor FGF-R4, compreendendo uma cadeia leve codificada por uma sequência nucleotídica idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 3.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4, compreendendo uma cadeia pesada de sequência polipeptídica idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 4.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4, compreendendo as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 1 e 3.

Em um modo ainda mais vantajoso, o anticorpo antagonista específico de FGF-R4 compreende uma cadeia pesada que compreende a sequência SEQ ID N°: 2 e uma cadeia leve que compreende a sequência SEQ ID N°: 4.

O anticorpo composto de uma cadeia pesada de sequência SEQ

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ID N°: 2 e de uma sequência leve SEQ ID N°: 4 será denominado 40-12 na sequência do pedido.

Em um modo de realização da invenção os anticorpos específicos de FGF-R4 são ativos ao mesmo tempo contra FGF-R4 humano, FGFR4 murin e FGF-R4 de rato.

Em um modo de realização vantajoso, o antagonista específico do receptor FGF-R4 induz uma inibição das vias celulares AKT/p38.

Em um modo de realização vantajoso, o antagonista específico do receptor FGF-R4 induz uma inibição das vias celulares Erk ¹A

Em um modo de realização vantajoso, o antagonista específico do receptor FGF-R4 induz uma inibição das vias de sinalização celular controladas por FGF-R4.

Em um outro modo de realização vantajoso, o antagonista específico do receptor FGF-R4 induz uma inibição da proliferação celular tumoral.

Ainda em um outro modo de realização vantajoso o antagonista específico do receptor FGF-R4 induz uma inibição da angiogênese.

Em um outro modo de realização particularmente vantajoso, o antagonista específico do receptor FGF-R4 apresenta uma afinidade para FGFR4 10 vezes superior à sua afinidade para os outros receptores de FGF.

Em um modo de realização particularmente vantajoso, o anticorpo, segundo a invenção é um anticorpo humanizado antagonista específico do receptor FGF-R4.

Em um modo de realização, o anticorpo humanizado antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende uma cadeia leve da qual a parte variável é codificada por uma sequência nucleotídica idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 29 ou à sequência SEQ ID N°: 31.

Em um outro modo de realização, o anticorpo humanizado antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende uma cadeia leve, cuja parte variável é idêntica pelo menos a 80%, 905, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 30 ou à sequência SEQ ID N°: 32.

Em um outro modo de realização, o anticorpo humanizado anta

9/59 gonista específico do receptor FGF-R4 compreende uma cadeia leve, cuja parte variável é codificada por uma sequência idêntica à sequência nucleotídica SEQ ID N°: 29 ou à sequência SEQ ID N°: 31.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humanizado antagonista específico do receptor FGF-R4, compreendendo uma cadeia pesada, cuja parte variável é codificada por uma sequência idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 33, à sequência SEQ ID N°: 35 ou à sequência SEQ ID N°: 37.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humanizado antagonista específico do receptor FGF-R4, compreendendo uma cadeia pesada, cuja parte variável é idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 34, à sequência SEQ ID N°: 36 ou à sequência SEQ ID N°: 38.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humanizado antagonista específico do receptor FGF-R4, compreendendo uma cadeia pesada codificada por uma sequência nucleotídica SEQ ID N°: 33 e/ou SEQ ID N°: 35 e ou SEQ ID N°: 37.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humanizado antagonista específico do receptor FGF-R4, cujas sequências humanizadas de sequência SEQ ID N°: 30 ou 32 são utilizadas em combinação com as sequências humanizadas de sequência SEQ ID N°: 34, 36 ou 38.

Em um outro modo de realização, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende os CDR de sequência SEQ ID N°: 73, 74, 75, 78, 79 e 80 ou CDR, cujas sequências diferem de um a dois aminoácidos em relação respectivamente às sequências mencionadas, contanto que isto não modifique a especificidade de ligação do anticorpo ao receptor FGF-R4.

Em um outro modo de realização, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende os CDR de sequência SEQ ID N°: 83, 84, 85, 88, 89 e 90 ou CDR, cujas sequências diferem de um a dois aminoácidos em relação - respectivamente - às sequências mencionadas, contanto que isto não modifique a especificidade de ligação do anticorpo ao receptor FGF-R4.

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Em um outro modo de realização, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende os CDR de sequência SEQ ID N°: 93, 94, 95, 98, 99 e 100 ou CDR, cujas sequências diferem de um a dois aminoácidos em relação - respectivamente - às sequências mencionadas, contanto que isto não modifique a especificidade de ligação do anticorpo ao receptor FGF-R4.

Em um outro modo de realização, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende os CDR de sequência SEQ ID N°: 103, 104, 105, 108, 109 e 110 ou CDR, cujas sequências diferem de um a dois aminoácidos em relação - respectivamente - às sequências mencionadas, contanto que isto não modifique a especificidade de ligação do anticorpo ao receptor FGF-R4.

Em um modo de aplicação preferido da invenção, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende os CDR de sequência SEQ ID N°: 83, 84, 85, 88, 89 e 90.

Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 é um anticorpo humano, cujas partes variáveis da cadeia pesada compreendem uma sequência nucleotídica que apresenta pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 76, 86, 96 ou 106.

Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 é um anticorpo humano, cujas partes variáveis da cadeia leve compreendem uma sequência nucleotídica que apresenta pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ IDN°: 71, 81, 91 ou 101.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo uma cadeia pesada que compreende um parte variável codificada por uma sequência proteica que apresenta uma identidade de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% com a sequência SEQ ID N°: 77, 87, 97 ou 107.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo uma cadeia leve que

11/59 compreende uma parte variável codificada por uma sequência proteica que apresenta uma identidade de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% com a sequência SEQ ID N°: 72, 82, 92 ou 102.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 compreendendo sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 71 e 76 ou as sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 81 e 86 ou as sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 81 e 86 ou as sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 91 e 96 ou as sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 191 e 106.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4, compreendendo as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 72 e 77 ou as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 82 e 87 ou as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 92 e 97 ou as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 102 e 107.

Em um modo de realização vantajoso, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende sequências idênticas pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% às SEQ ID N°: 72 e/ou SEQ ID N°: 77.

Em um outro modo de realização vantajoso, o anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende sequências idênticas pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% às SEQ ID N°: 82 e/ou SEQ ID N°: 87.

Em um outro modo de realização vantajoso, o anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende sequências idênticas pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% às SEQ ID N°: 92 e/ou SEQ ID N°: 97.

Em um outro modo de realização vantajoso, o anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 compreende sequências idênticas pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% às SEQ ID N°: 102 e/ou SEQ ID N°: 107.

Em um modo de realização preferido, a presente invenção tem por objeto um anticorpo antagonista humano específico do receptor FGF-R4 compreendendo uma cadeia leve codificada por uma sequência nucleotídica idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à sequência SEQ ID N°: 82 e

12/59 compreendendo uma cadeia leve de sequência polipeptídica idêntica pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99% à SEQ ID N°: 87.

De maneira ainda mais preferida, a presente invenção tem por objeto um anticorpo humano agonista específico do receptor FGF-R4, compreendendo as sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 82 e 87.

O anticorpo composto de uma cadeia pesada de sequência SEQ ID N°: 77 e de uma sequência leve SEQ ID N°: 72 será denominado clone 8 na sequência do pedido.

O anticorpo composto de uma cadeia pesada de sequência SEQ ID N°: 87 e de uma sequência leve SEQ ID N°: 72 será denominado clone 31 na sequência do pedido.

O anticorpo composto de uma cadeia pesada de sequência SEQ ID N°: 97 e de uma sequência leve SEQ ID N°: 92 será denominado clone 33 na sequência do pedido.

O anticorpo composto de uma cadeia pesada de sequência SEQ ID N°: 107 e de uma sequência leve SEQ ID N°: 102 será denominado clone 36 na sequência do pedido.

O campo da presente invenção não se limita aos anticorpos, que compreendem essas sequências. Com efeito, todos os anticorpos que se ligam de maneira específica a FGF-R4 tendo uma seção antagonista sobre esse receptor, entram no campo da presente invenção.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 conjugado a um agente citotóxico.

A presente invenção tem por objeto a utilização de um antagonista específico do receptor FGF-R4 no tratamento das doenças associadas à angiogênese.

A presente invenção tem por objeto a utilização de um antagonista específico do receptor FGF-R4 no tratamento de um câncer.

A presente invenção tem por objeto a utilização de um antagonista específico do receptor FGF-R4 no tratamento dos hepatocarcinomas ou de qualquer outro tipo de câncer hepático.

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A presente invenção tem por objeto a utilização de um antagonista específico do receptor FGF-R4 no tratamento do câncer do pâncreas.

A presente invenção tem por objeto um anticorpo específico do receptor FGF-R4 útil, ao mesmo tempo, no tratamento das doenças associadas à angiogênese e no tratamento dos hepatocarcinomas ou de qualquer outro tipo de câncer hepático.

A presente invenção tem por objeto um anticorpo específico do receptor FGF-R4 útil, ao mesmo tempo, no tratamento das doenças associadas à angiogênese e no tratamento dos hepatocarcinomas ou de qualquer outro tipo de câncer hepático, no tratamento do câncer do pâncreas, dos órgãos do trato gastrointestinal ou qualquer outro órgão expressando FGFR4.

A presente invenção tem por objeto uma composição farmacêutica, compreendendo um antagonista específico do receptor FGF-R4 e dos excipientes.

A presente invenção tem por objeto um método de tratamento de um câncer que compreende a administração no paciente de um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4.

A presente invenção tem por objeto um método de tratamento de uma doença associada a um aumento patológico da angiogênese que compreende a administração no paciente de um anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4.

A presente invenção tem por objeto um processo de seleção de um anticorpo monoclonal antagonista específico do receptor FGF-R4, compreendendo as seguintes etapas:

a. imunização no rato;

b. retirada de nódulos linfáticos nos ratos, e

c. crivação do que flutua de hibridomas

A presente invenção tem por objeto uma linhagem celular que produz anticorpos antagonistas específicos do receptor FGF-R4, compreendendo a colocação em cultura de uma linhagem celular que produz anticorpos antagonistas do receptor FGF-R4.

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A presente invenção tem por objeto um medicamento que compreende um antagonista específico do receptor FGF-R4.

A presente invenção tem também por objeto um polinucleotídeo codificando para um polipeptídeo selecionado no grupo das SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 30, 32, 34, 36, 38, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110 e sequências idênticas pelo menos a 80%, 90%, 95% ou 99 % a uma dessas sequências.

A presente invenção tem por objeto um vetor recombinante, compreendendo um polinucleotídeo, tal como descrito acima ou codificante para um polipeptídeo, tal como descrito acima.

A fim de permitir a expressão de cadeias pesadas e/ou cadeias leves do anticorpo antagonista do receptor FGF-R4, objeto da invenção, os polinucleotídeos codificando para essas cadeias são inseridos em vetores de expressão. Esses vetores de expressão podem ser plasmídeos, YACs, cosmídeos, retrovirus, epissomas derivados de EBV, e todos os vetores que o técnico pode julgar apropriados à expressão dessas cadeias.

A presente invenção tem por objeto uma célula hospedeira compreendendo um vetor recombinante tal como descrito acima.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção tem por objeto a utilização de anticorpos dirigidos especificamente contra FGF-R4 (sem reação cruzada com FGF-R1, R2 ou R3) para a inibição da angiogênese e do crescimento tumoral.

De forma esperada, os inventores mostraram que o FGF-R4 exerce um papel ativo e específico no controle da angiogênese.

Essa função do FGF-R4 jamais fora mostrada ou proposta antes. Por conseguinte, esse receptor pode ser utilizado como alvo para tratar as patologias que apresentam um disfuncionamento angiogênico. Os ligantes do FGF-R4 capazes de modular sua atividade são, portanto, agentes terapêuticos potenciais para numerosas patologias ligadas à angiogênese.

A presente invenção pode, portanto, ser utilizada no tratamento de todas as patologias que implicam uma desregulagem da angiogênese e

15/59 necessitando de uma inibição desta. As patologias visadas podem ser o câncer, com a utilização dos antagonistas, de acordo com a invenção, como inibidores da angiogênese tumoral, ou as patologias para as quais uma desregulagem da angiogênese é descrita como: a degenerescência macular ligada à idade ou DMLA, as doenças inflamatórias como a artrite reumatoide, a osteoartrite, as colites, as úlceras ou qualquer doença inflamatória dos intestinos, a aterosclerose ou ainda no tratamento da obesidade. A utilização desses anticorpos é também ilustrada na inibição do crescimento tumoral. Os antagonistas, segundo a presente invenção, podem, portanto, ser utilizados para o tratamento de certos cânceres, implicando em uma desregulagem do FGF-R4, e mais particularmente os cânceres do fígado, do cólon, de mama, do pulmão, da próstata, do pâncreas, da pele ou do esôfago.

Uma das vantagens maiores dos antagonistas, segundo a presente invenção, é de alvejar especificamente um receptor aos FGF, no caso FGF-R4. Essa especificidade permite limitar os efeitos indesejáveis que podem ter moléculas químicas pequenas inibidoras do domínio tirosina quinase. Além disso, o FGF-R4 não sendo expresso de maneira ubiquitária, mas sendo notadamente expresso sobre as células endoteliais como sobre as células hepatocitárias, biliares, mamárias, prostáticas, ovarianas, pancreáticas, renais, dispõe-se de um modo de tratamento das doenças ligadas a uma desregulagem da atividade FGF-R4, limitando os efeitos secundários.

Por antagonista, entende-se qualquer ligante, capaz de diminuir ou de inibir a atividade do FGF-R4. Esse composto antagonista é também denominado inibidor de FGF-R4.

Esse antagonista pode ser qualquer ligante de FGF-R4, tal como uma molécula química, uma proteína recombinante, um oligossacarídeo, um polissacarídeo, oligonucleotídeo ou um anticorpo capaz de se ligar, de maneira específica ao receptor FGF-R4, com exclusão de qualquer outro FGFR.

Um objeto da invenção é, portanto, um antagonista específico de FGF-R4. De acordo com a invenção, um antagonista que se liga especificamente ao FGF-R4 é entendido como um ligante que se liga aos outros receptores aos FGF, a saber FGF-R1, FGF-R2 ou FGF-R3. Em particular, um

16/59 anticorpo específico de FGF-R4 é um anticorpo que não apresenta reação cruzada com FGF-R1, FGF-R2 ou FGF-R3.

Uma ligação específica é entendida como uma diferença de um fator pelo menos 10 entre a intensidade da ligação a um receptor em relação a um outro, no caso entre a ligação com FGF-R4 e as ligações possíveis com FGF-R1, FGF-R2 ou FGF-R3.

Em um modo de realização da invenção, o ligante FGF-R4 é um oligossacarídeo ou um polissacarídeo.

Um oligossacarídeo é entendido como qualquer polímero de sacarídeo contendo de três a dez unidades de açúcares simples. Existem oligossacarídeos naturais, como, por exemplo, os frutos-oligossacarídeos (FOS) e oligossacarídeos de síntese, como por exemplo, os antitrombóticos miméticos da heparina.

Por polissacarídeo, entende-se qualquer polímero constituído de mais de dez monossacarídeos ligados entre si por ligações glicosídicas. Existem polissacarídeos naturais, como, por exemplo, os mucopolissacarídeos, os fucoides, os carragenanos, os exopolissacarídeos bacterianos e polissacarídeos de síntese. Assim, fucoidanos de baixos pesos moleculares ou exopolisacarídeos muito sulfatados mostraram atividades pró-angiogêne (Chabut et al., Mol Pharmacol., 2003, 64:696-702; Matou et al., Biochem Pharmacol., 2005, 69:75-9). Ao contrário, oligossacarídeos ligeiramente sulfatados derivados da heparina ou fosfomano pentose sulfato podem apresentar características antiangiogênes (Parish et al., 1999, 15:3433-41; Casu et al., J Med Chem., 2004, 12:838-48).

Em um modo de realização da invenção, o ligante de FGF-R4 é um anticorpo.

Por anticorpo, entende-se qualquer tipo de anticorpo ou moléculas derivadas, tais como os anticorpos policlonais e monoclonais. Dentre as moléculas derivadas dos anticorpos monoclonais, estão compreendidos os anticorpos humanizados, os anticorpos humanos, os anticorpos multiespecíficos, os anticorpos quiméricos, os fragmentos de anticorpos, os nanocorpos...

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Em um modo de realização da invenção, o antagonista específico de FGF-R4 é um anticorpo policlonal.

Um anticorpo policlonal é um anticorpo que foi produzido dentre uma mistura de anticorpos proveniente de vários clones de linfócitos B e reconhecendo uma série de epitopos diferentes.

Em um modo de realização vantajoso, o antagonista específico de FGF-R4 é um anticorpo monoclonal.

Um anticorpo monoclonal é um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea oriunda de um único tipo de linfócitos B amplificada de maneira clonal. Os anticorpos que formam essa população são idênticos exceto para possíveis mutações naturais que podem estar presentes em quantidade muito pequena. Esses anticorpos são dirigidos contra um único epitopo e são, portanto, altamente específicos.

Por epitopo entende-se o local do antígeno ao qual se liga o anticorpo. Se o antígeno for um polímero, tal como uma proteína ou um polissacarídeos, o epitopo poderá ser formado por resíduos contíguos ou nãocontíguos.

Em um modo de realização vantajoso da invenção, um anticorpo antagonista anti-FGF-R4 se liga a um epitopo pertencente ao domínio D2-D3 do receptor ao FGF-R4.

Em um modo de mais vantajoso ainda, o anticorpo se liga, a um epitopo compreendido no domínio que compreende os aminoácidos 144 a 365 do receptor ao FGF-R4.

Em um modo ainda mais vantajoso, o anticorpo se liga a um epitopo compreendido no domínio D2 do receptor ao FGF-R4, esse epitopo correspondendo aos aminoácidos 145 a 242 descritos na sequência SEQ ID N°: 70.

Um anticorpo, também denominado imunoglobulina, é composto de duas cadeias pesadas idênticas (VH) e de duas cadeias leves idênticas (VL) que são ligadas por uma ponte dissulfeto. Cada cadeia contém uma região constante e uma região variável. Cada região variável compreende três segmentos denominados regiões que determinam a complementarie

18/59 dade (CDRs) ou regiões hipervariáveis, que são principalmente responsáveis da ligação ao epitopo de um antígeno.

O termo VH faz referência às regiões variáveis de uma cadeia pesada de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo as cadeias pesadas de um fragmento Fv, scFv, dsFv, FAB, Fab' ou F(ab)'.

O termo VL faz referência às regiões variáveis de uma cadeia leve de imunoglobulina de um anticorpo, incluindo as cadeias leves de um fragmento Fv, scFv, dsFv, FAB, Fab' ou F(ab)'.

Por fragmento de anticorpo entende-se qualquer parte deste: (Fragment antigen binding), FV, scFv (single chain Fv), Fc (Fragment cristalisable). De preferência, esses fragmentos funcionais serão fragmentos de tipo Fv, scFv, FAB, F(ab')2, Fab', scFv-Fc ou diacorpos, que possuem geralmente a mesma especificidade de fixação que o anticorpo monoclonal, quimérico ou humanizado, dos quais são oriundos. Segundo a presente invenção, fragmentos de anticorpos da invenção podem ser obtidos a partir dos anticorpos monoclonais, quiméricos ou humanizados, por métodos tais como a digestão por enzimas, como a pepsina ou a papaína e/ou por divagem das pontes dissulfetos por redução química.

Por regiões CDR ou CDRs, entendem-se as regiões hipervariáveis das cadeias pesadas e leves das imunoglobulinas como definidas por Kabat et al., (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5t Ed., U.S. Department of Health and Human Services, NiH, 1991, and later aditions). Existem 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve. Ο termo CDR ou CDRs é utilizado aqui para designar, conforme os casos, uma dessas regiões ou várias, até mesmo o conjunto dessas regiões que contêm a maioria dos resíduos de aminoácidos responsáveis pela ligação a fim do anticorpo para o antígeno ou o epitopo que ele reconhece. As regiões as mais conservadas dos domínios variáveis são chamadas regiões ou sequências FR para framework ou regiões vigas.

Em um outro modo de realização da invenção, o antagonista específico de FGF-R4 é um anticorpo quimérico.

Por anticorpo quimérico, entende-se um anticorpo no qual a

19/59 região constante, ou uma parte desta, é alterada substituída ou trocada, tal como a região variável é ligada a uma região constante de uma espécie diferente, ou pertence a uma outra classe ou subclasse de anticorpos.

Entende-se também por anticorpo quimérico um anticorpo no qual a região variável, uma parte desta, é alterada, substituída ou trocada, tal como a região constante é ligada a uma região variável de uma espécie diferente, ou pertence a uma outra classe ou subclasse de anticorpos.

Os métodos de produção de anticorpos quiméricos são conhecidos do técnico. Ver por exemplo, Morrison, 1985, Science, 229: 1202; Oi et al., 1986, Bio Techniques, 4:214; Gillies et al., 1989, J. Immunol. Methods, 125: 191-202; patentes U.S. N°^s 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397.

Essas versões quiméricas do anticorpo podem consistir na fusão das partes variáveis VL e VH nas partes constantes de Ckappa et CH (lgG1) de origem humana, a fim de gerar um anticorpo monoclonal quimera.

A parte CH (lgG1) pode também ser modificada por mutações pontuais, a fim de aumentar a afinidade do fragmento Fc para o receptor FcyRllla e assim aumentar as funções efetivas do anticorpo (Lazar et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 103:4005-4010; Stavenhagen et al. 2007, Cancer Res. 67: 8882-8890).

A presente invenção inclui as versões humanizadas dos anticorpos.

Por anticorpo humanizado, entende-se um anticorpo que contém principalmente sequências de imunoglobulina humanas. Esse termo faz geralmente referência a uma imunoglobulina não humana que foi codificada por incorporação de sequências humanas ou de resíduos descobertos em sequências humanas.

Em geral, os anticorpos humanizados compreendem um ou tipicamente dos domínios variáveis nos quais o total ou parte das regiões CDR correspondem a partes oriundas da sequência parente não humana e nos quais toda ou parte das regiões FR são aquelas oriundas de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode então compreender pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc),

20/59 em particular aquela da imunoglobulina humana de referência escolhida.

Busca-se assim obter um anticorpo que seja imunogene a minima em um ser humano. Assim é possível que um ou dois aminoácidos de um ou vários CDRs sejam modificados por um aminoácido menos imunogene para o hospedeiro humano, isto sem reduzir substancialmente a especificidade de ligação do anticorpo ao FGF-R4. Da mesma forma, os resíduos das regiões vigas podem não ser humanos e é possível que não sejam modificados, pois não contribuem para o potencial imunogênico do anticorpo.

Existem vários métodos de humanização conhecidos do técnico para modificar um anticorpo parente não humano em um anticorpo menos imunogene para o ser humano. Uma identidade global das sequências com um anticorpo humano não é forçosamente necessária. Com efeito, a identidade global de sequência não é necessariamente um indicador preditivo de uma imunogenicidade reduzida e a modificação de um número limitado de resíduos pode levar a anticorpos humanizados que apresentam um potencial imunogênico muito atenuado no homem (Molecular Immunology (2007) 44, 1986-1998).

Diversos métodos são, por exemplo, a inclusão de CDRs (grafiting) (EPO 0 239 400; WO 91/09967; e patentes U.S. Nos. 5.530. 101 e 5.585.089), a ressurfaçagem (EPO 0 592 106; EPO 0 519 596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; et Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) ou ainda a mistura das cadeias (patente U.S. No. 5.565.332).

A presente invenção se refere, em particular, aos anticorpos humanizados, dos quais as partes variáveis são modificadas, de acordo com a seguinte tecnologia:

As cadeias leves e pesadas, as mais similares às cadeias correspondentes do anticorpo murino anti-FGF-R4 40-12 são identificadas por comparação com a Protein Data Bank (H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng.

G. Gilliand, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne. Nucleic Acid Research, 2000, 28:235-242).

O alinhamento de sequências utiliza o algoritmo BLAST (J. Mol

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Biol. 1990 Oct 215:403-410) trata-se das estruturas tridimensionais correspondendo aos códigos PDB 1NDM & 1ETZ que foram respectivamente utilizadas para construir modelos por homologia das cadeias leves e pesadas dos domínios variáveis. Esses modelos tridimensionais são em seguida afinados, minimizando sua energia potencial com o procedimento padrão implementado no programa MOE (Molecular Operating Environment, Chemical Computing Group, Quebec, Canadá). Um estímulo de domínio molecular (DM) é em seguida realizado a partir desses modelos tridimensionais minimizados no anticorpo com o programa Amber (D.A. case, T.E. Cheatham, III, T. Darden, H. Gohlke, R. Luo, K.M. Merz. Jr., A. Onufriev, C. Simmerting B. Wang and R. Woods. J. Computat. Chem. 2005, 26: 1668-1688).

Essa simulação ocorre com esforços harmônicos aplicados aos átomos da estrutura proteica a uma temperatura de 226,85°C (500°K) por uma duração de 1,1 nanossegundo em um modelo de solvente implícito, tal como implementado no método generalizado de Born (Gallicchio & Levy, J Comput Chem 2004, 25:479-499). Dez conformações diversas são assim extraídas dessa primeira simulação à razão de uma conformação tridimensional a cada 100 pico-segundos durante o último nanossegundo da simulação. Essas dez conformações diversas são em seguida cada uma submetidas a uma simulação de dinâmica molecular, sem esforços sobre a estrutura proteica a uma temperatura de 27°C durante 2,3 nanossegundos em um modelo de solvente implícito, tal como implementado no método generalizado de Born. As ligações que implicam um átomo de hidrogênio são relacionadas com o algoritmo SHAKE (Barth. Et al., J Comp Chem, 1995, 16:11921209), o passo é de 1 femto segundo e a simulação ocorre conforme a equação de Langevin de volume constante e uma temperatura constante de 27°C. Para cada uma das dez simulações de dinâmica molecular, as últimas 10.000 conformações, extraídas à frequência de uma por pico-segundo são em seguida utilizadas para quantificar, para cada aminoácido do anticorpo a humanizar, o desvio das posições dos átomos em relação a uma conformação média, dita medóide, do aminoácido. O conjunto da análise descrita a seguir é realizado com a linguagem de script Scientific Vector language (S

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VL) do programa MOE. A conformação medóide do aminoácido é a conformação oriunda da dinâmica molecular que é a mais próxima da conformação média calculada a partir da posição dos átomos de todas as conformações do aminoácido. A distância utilizada para detectar a conformação medoide é o desvio quadrático médio das distâncias escalares entre os átomos de duas conformações do aminoácido. De maneira similar, o desvio das posições dos átomos de uma conformação de um aminoácido em relação à conformação medoide é quantificada, calculando-se o desvio quadrático médio das distâncias escalares entre os átomos dos aminoácidos de uma conformação da simulação e os mesmos átomos da conformação medoide. Na sequência, é comparando o desvio quadrático médio das posições dos átomos de um aminoácido determinado (I) mediano sobre o conjunto das dez simulações de dinâmica molecular (Fi), no desvio quadrático médio das posições de todos os aminoácidos do anticorpo mediano sobre o conjunto das dez simulações de dinâmica molecular (Fm) que se decide se o aminoácido é bastante flexível para ser considerado como podendo potencialmente interagir com os receptores de células T e provocar a ativação do sistema imunitário. Um aminoácido i é considerado flexível, caso apresente um escore de flexibilidade Zi acima de 0,15, tal como definido a seguir: Zi = (Fi - Fm)/Fm. 45 aminoácidos são assim identificados como flexível no domínio variável do anticorpo, com exclusão da região que determina a complementariedade ao antígeno (RDC) e de seu ambiente imediato. Define-se o ambiente imediato da RDC como qualquer aminoácido cujo carbono alfa se situa a uma distância de 5 angstroms (Á) ou menos de um carbono alfa da RDC.

Os movimentos dos 60 aminoácidos os mais flexíveis do anticorpo, durante os 20 nanossegundos (10x2 ns) de simulação, são em seguida comparados aos movimentos correspondentes de 49 modelos por homologia de sequências germinais humanas de anticorpos, para cada um dos quais as dez simulações de dinâmica molecular (10x2 ns) foram realizadas conforme o mesmo método operacional. Os 60 aminoácidos os mais flexíveis excluem a região que determina a complementariedade ao antígeno (RDC) e seu ambiente imediato. Os 49 modelos humanos de sequências

23/59 germinais de anticorpos foram construídos, combinando sistematicamente as sete cadeias leves humanas as mais frequentes (vk1, vk2, vk3, vk4, vlambda 1, vlambda 2, vlambda 3) e as sete cadeias pesadas humanas as mais frequentes (vh 1a, vh h1b, vh 2, vh 3, vh 4, vh 5, vh 6) (Nucleic Acids research, 2005, Vol. 33, Database issue D593-D597).

A similaridade do anticorpo a humanizar aos 49 modelos de sequências humanas germinais é quantificada, amostrando as posições de certos átomos dos 60 aminoácidos flexíveis de um anticorpo, no decorrer das dez dinâmicas moleculares, por meio de uma mesma grade cúbica tridimensional. A grade tridimensional de resolução 1Á. Fala-se de similaridade quadridimensional. A grade tridimensional utilizada comporta 445740 pontos e ela é inicializada a partir da estrutura tridimensional do anticorpo humano correspondente ao código PDB 8FAB. A estrutura 8FAB é também utilizada para posicionar todas as conformações de um anticorpo a transformar em amostra na grade tridimensional. Superpõe-se para isso a conformação medoide da dinâmica molecular do anticorpo sobre a estrutura 8FAB. Essa superposição consiste no alinhamento dos momentos de inércia das duas conformações, seguido da otimização das distâncias escalares entre os átomos de carbono alfa das duas conformações. Todas as outras conformações da dinâmica molecular do anticorpo são superpostas sobre a conformação medoide, segundo o mesmo método. Dos tipos de amostragem são realizados resultando em duas similaridades (similaridade eletrostática e similaridade lipófila), para um binário de anticorpo a comparar, que se adiciona para obter a similaridade total. A primeira amostragem eletrostática, considera todos os átomos da cadeia lateral do aminoácido. O valor em um ponto X da grade é calculado, aplicando-se aos átomos da cadeia lateral do aminoácido uma função gaussiana tridimensional f(x) que se pondera com a carga eletrostática do átomo, tal como descrita no campo de força Amber99 (Cieplak, J. et al., J. Comp. Chem. 2001, 22:1048-1057). A função f(x) é aplicada segundo os três eixos de coordenadas cartesianas e responde à fórmula: f(x) = (s-VãF x cxp( ,

2s² com x e u respectívamente coordenadas cartesianas de um ponto x da grade e de um átomo amostrado, s = r/1,6 (r = raio de

24/59 covalência do átomo). A amostragem é repetida por todas as conformações do aminoácido e os resultados obtidos são médias em qualquer ponto x da grade tridimensional. A segunda amostra, lipófila, considera unicamente os átomos lipófilos da cadeia lateral do aminoácido. O valor em um ponto x da grade é calculado com o auxílio da mesma função gaussiana f(x) sem ponderação. Os dois conjuntos de conformações das dinâmicas moleculares dos dois anticorpos que são comparados são assim amostrados pela mesma grade tridimensional. Mede-se a similaridade eletrostática (sim-elec), entre 2 corpos a e b, com o auxílio da seguinte fórmula:

⁴⁴⁵⁷⁴⁰ /l . I Λ y k+xf|-|< -χ,⁶|) sim - elec = ^!=i --------------.

É k+x-) <-=i X similaridade lipófila é calculada com a mesma fórmula sobre os dados oriundos da amostragem lipófila descrita acima.

O modelo de sequências germinais humanas vlambda2-vh2 mostra assim a mais forte similaridade quadridimensional (similaridade total = 58%) desses 60 aminoácidos flexíveis em relação aos aminoácidos flexíveis do anticorpo murino 40 - 12. O modelo de sequência germinal humana vlambda2-vh2 foi, portanto, utilizado para humanizar o anticorpo a humanizar, focalizando sobre os 45 aminoácidos flexíveis. Para determinar as mutações a operar, a estrutura tridimensional do modelo do anticorpo murino 40 - 12. O modelo de sequência germinal humana vlambda2-vh2 foi, portanto, utilizado para humanizar o anticorpo a humanizar, focalizando sobre os 45 aminoácidos flexíveis. Para determinar as mutações a operar, a estrutura tridimensional do modelo do anticorpo murino 40 - 12 é superposta àquela do modelo oriundo das sequências germinais, mostrando a mais forte similaridade, otimizando as posições dos carbonos alfa dos aminoácidos. Os aminoácidos identificados como flexíveis são mutados pelos aminoácidos correspondentes na sequência do modelo que mostra a mais elevada similaridade.

Os motivos de sequências indesejáveis considerados são os seguintes: Aspartato-Prolina (ligação peptídica lábil em meio ácido), Asparagi

25/59 na-X-Serina/Treonina (portal de glicosilação, X = qualquer aminoácido, salvo Prolina), Aspartato-Glicina/Serina/Treonina (formação potencial de Succinimida/lso-Aspartato nas zonas flexíveis), AsparaginaGlicina/Histidina/Serina/Alanina/Cisteína (portais expostos de desamidação), Metionina (Oxidação nas zonas expostas). As sequências humanizadas assim obtidas são finalmente comparadas, por meio do algoritmo BLAST de comparação de sequência, às sequências da base de dados IEDB (http/www.immuneepitope.org/ The immune epitope database and analysis resource: from vision to blueprint. PloS Biol. 2005 Mar; 3 (3): e 91) para se assegurar que as sequências não contêm epitopos conhecidos para serem reconhecidos pelas células linfócitas B e T. Se a sequência contiver resíduos que apresentam sequências indesejáveis elas serão então também modificadas. Se a sequência compósita contiver um epitopo conhecido listado em IEDB, uma outra estrutura de referência germinal que mostra uma forte similaridade será então utilizada como modelo.

De maneira mais vantajosa, o anticorpo, de acordo com a invenção, compreende sequências que apresentam pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 30 ou a sequência SEQ ID N°: 32 são utilizadas, em combinação com as sequências que apresentam pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 34, sequência SEQ ID N°: 36 ou a sequência SEQ ID N°: 38.

Em um modo de realização o anticorpo, de acordo com a invenção, compreende cadeias variáveis leves de sequência SEQ ID N°: 30 e cadeias variáveis pesadas de sequência SEQ ID N°: 34.

Em um outro modo de realização o anticorpo compreende cadeias variáveis leves de sequência SEQ ID N°: 32 e cadeias variáveis pesadas de sequência SEQ ID N°: 38.

Em um outro modo de realização o anticorpo compreende cadeias variáveis leves de sequência SEQ ID N°: 30 e cadeias variáveis pesadas de sequência SEQ ID N°: 36.

Em um outro modo de realização o anticorpo compreende cadeias variáveis leves de sequência SEQ ID N°: 32 e cadeias variáveis pesa26/59 das de sequência SEQ ID N°: 34.

Em um outro modo de realização o anticorpo compreende cadeias variáveis leves de sequência SEQ ID N°: 32 e cadeias variáveis pesadas de sequência SEQ ID N°: 36.

Em um outro modo de realização o anticorpo compreende cadeias variáveis leves de sequência SEQ ID N°: 30 e cadeias variáveis pesadas de sequência SEQ ID N°: 38.

A presente invenção tem também por objeto anticorpos humanos antagonistas específicos do FGF-R4. Esses anticorpos podem ser obtidos por exibição porfagos, segundo métodos conhecidos do técnico (McCafferty J. et al., 1990; Hoogenboom, HR et al., 2005). Outras tecnologias estão disponíveis para o preparo de anticorpos humanos, tais como a tecnologia XenoMouse sendo descrita na patente U.S. 5.939.598.

Em um modo de realização particular, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 é um anticorpo humano cujas partes variáveis da cadeia pesada compreendem uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 76, 86, 96 ou 106.

Em um modo de realização particular, o anticorpo antagonista específico do receptor FGF-R4 é um anticorpo humano cujas partes variáveis da cadeia leve compreendem uma sequência que apresenta pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 71, 81, 91 ou 101.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 que compreende uma cadeia pesada que compreende uma parte variável codificada por uma sequência nucleotídica que apresenta uma identidade de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 77, 87, 97 ou 107.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 que compreende uma cadeia leve que compreende uma parte variável codificada por uma sequência

27/59 nucleotídica que apresenta uma identidade de pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 72, 82, 92 ou 102.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 que compreende sequências codificadas pelas sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 71 e 76 ou as sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 81 e 86 ou as sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 91 e 96 ou as sequências nucleotídicas SEQ ID N°: 101 e 106.

A presente invenção tem também por objeto um anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 que compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 72 e 77 ou as sequências peptídicas SEQ ID N°: 82 e 87 ou as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 92 e 97 ou as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 102 e 107.

De maneira particularmente preferida, um anticorpo humano antagonista específico do receptor FGF-R4 que compreende as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 82 e 87. As sequências em aminoácidos assim modificadas podem também ser modificadas por modificações póstraducionais no decorrer da produção na célula mamífera. Em particular o emprego de linhagens estáveis deficientes na biossíntese da fucose pode permitir produzir anticorpos monoclonais, dos quais o N-glicano do Fc (posição N297) é desprovido parcial ou totalmente de fucose e permite aumentar o efeito efetuador ADCC (Kanda et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 680688 e Ripka et al., 1986 Arch Biochem Bioph 249: 533-545).

Em um outro modo de realização da invenção, o antagonista específico de FGF-R4 é um anticorpo conjugado.

Os anticorpos podem ser conjugados a um agente citotóxico. O termo agente citotóxico designa no caso uma substância que reduz ou bloqueia a função ou o crescimento das células ou causa a destruição das células.

Em um modo de realização, o anticorpo ou um fragmento de ligação deste pode ser conjugado a um medicamento, tal como um maitansinoide, para formar um pró-medicamento que tem uma citotoxicidade em relação às células que expressam o antígeno.

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O agente citotóxico da presente invenção pode ser qualquer composto que resulta na morte de uma célula, ou induz a morte de uma célula, ou diminui de diversas formas a viabilidade das células. Os agentes citotóxicos preferidos incluem, por exemplo, maitansinoides e análogos de maitansinoides, dos taxoides, CC-1065 e análogos de CC-1065, dolastatina e análogo de dolastatina, definidos acima. Esses agentes citotóxicos são conjugados a anticorpos, fragmentos de anticorpos, equivalentes funcionais, anticorpos melhorados e seus análogos conforme descritos no presente pedido.

Os anticorpos conjugados podem ser preparados por métodos in vitro. A fim de ligar um medicamento ou um pró-medicamento ao anticorpo se utiliza um grupo de ligação. Grupos de ligação apropriados são bemconhecidos do técnico e incluem notadamente os grupos dissulfetos, os grupos tioéter, os grupos ácidos lábeis, os grupos fotolábeis, os grupos peptidases lábeis e os grupos estearase lábeis. Grupos de ligação preferidos são os grupos dissulfetos e os grupos tioéter. Por exemplo, um conjugado pode ser construído, utilizando uma reação de troca dissulfeto ou formando uma ponte tioéter entre o anticorpo e o medicamento ou pró-medicamento.

Compostos, tais como: o metotraxetato, o daunorrubicina, a vincristina, a vinblastina, o melfalan, a mitomicina C, o clorambucil, o calichamicin, o tubulsin e os análogos do tulbusin, a duocarmicina e os análogos da duocarmicina, o dolastatin e os análogos de dolastatin são também apropriados para o preparo de conjugados da presente invenção. As moléculas podem também ser ligadas às moléculas de anticorpos por uma molécula intermediária, tal como a soro albumina. A doxorrubicina e os compostos de doxorrubicina, como descritos, por exemplo, no pedido de patente US 09/740991, podem também ser agentes citotóxicos úteis.

Os anticorpos objetos da presente invenção podem ser associados a uma molécula ou um composto citotóxico. Eles podem também ser associados a um composto antiangiogênico agindo sobre outras vias da angiogênese.

Por células que expressam o FGF-R4, entende-se qualquer cé

29/59 lula eucariote, notadamente de mamíferos e em particular humana, que expressa um receptor FGF-R4 sob sua forma nativa, sob uma forma mutada. O FGF-R4 pode também estar sob sua forma completa ou sob uma forma truncada que compreende, por exemplo, o domínio extracelular de FGF-R4 e em particular os domínios D2-D3. O FGF-R4 pode também ser recombinado sob uma forma quimérica.

Os compostos da invenção podem ser formulados em composições farmacêuticas, visando uma administração por via tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraocular, etc. Preferencialmente, as composições farmacêuticas contêm veículos farmaceuticamente aceitáveis para uma formulação injetável. Pode tratar-se em particular de soluções salinas (fosfato monossódico, dissódico, cloreto de sódio, potássio, cálcio ou magnésio, etc ou misturas desses sais), ésteres, isotônicas, ou de composições secas, notadamente liofilizadas que, por adição conforme o caso, de água esterilizada ou de soro fisiológico, permitem a constituição de solutos injetáveis.

As patologias visadas não podem ser todas as doenças ligadas à angiogênese, tumoral ou não tumoral.

As patologias visadas podem ser o câncer (com a utilização da invenção como inibidor da angiogênese tumoral), notadamente o câncer do fígado, do cólon, de mama ou do pulmão, próstata, pâncreas ou da pele, ou ainda patologias para as quais uma desregulagem da angiogênese é descrita como: a degenerescência macular ligada à idade ou DMLA, as doenças inflamatórias como a artrite reumatoide, a osteoartrite, as colites, as úlceras ou qualquer doença inflamatória dos intestinos, a aterosclerose ou ainda no tratamento da obesidade.

Os anticorpos anti-FGF-R4 podem também ser utilizados para tratar o câncer, notadamente os hepatocarcinomas e outros cânceres hepáticos, e o câncer do pâncreas como inibidor que tem uma ação diretamente sobre o crescimento tumoral.

A presente invenção é ilustrada, sem para tanto ser limitada, pelos exemplos a seguir.

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Descrição das Figuras

Figuras 1A e 1B: In vitro (figura 1A) das células endoteliais humanas do tipo HUVEC são capazes de formar um resíduo de pseudotúbulos denominado angiogênese. Essa rede é estimulada pelo acréscimo de 1 ng/ml de FGF2. Essa indução pode ser também obtida pelo acréscimo de 10 ng/ml de FGF19, ligante específico de FGF-R4, enquanto que 10 ng/ml de FGF-R4 (ligante não ativador de FGF-R4) não são capazes de estimular a angiogênese. Da mesma forma, in vivo (figura 1B) em um modelo murino de indução da angiogênese no nível de implante de esponja sobre o dorso do rato, o FGF2 é capaz de induzir o recrutamento de novos vasos funcionais para a esponja que se caracteriza por um aumento do conteúdo em hemoglobina dessas esponjas em comparação com o controle. O FGF19 é capaz também de induzir essa angiogênese no nível da esponja.

Figura 2A: Mapa do plasmídeo pXL4614 que permite a expressão de hFGFR4-Histag. (SEQ ID N° 40).

Figura 2B: Mapa do plasmídeo pXL4613, permitindo a expressão de hFGFR4-Streptag. (SEQ ID N° 69).

Figura 3: Mapa do plasmídeo pXL4615, permitindo a expressão de hFGFR4-(D2, D3) - Histag. (SEQ ID N° 42).

Figura 4: Mapa do plasmídeo pXL4621, permitindo a expressão de hFGFR4 - Histag. (SEQ ID N° 44).

Figura 5: Mapa do plasmídeo pXL4628, permitindo a expressão de hFGFR4- Fc (SEQ ID N° 46).

Figura 6: Mapa do plasmídeo pXL.4627, permitindo a expressão de hFGFR4- Fc (SEQ ID N° 48).

Figura 7: Placas ELISA são recobertas pelos 4 receptores humanos ao FGF. A capacidade dos anticorpos anti-FGF-R4 40-12 e 64-12 de reconhecer esses diferentes FGF-Rs é medida por dosagem ELISA. O clone 40-12 (histograma escuro) é específico de FGF-R4. O clone 64-12 (histograma cinza) reconhece, além disso muito ligeiramente FGF-R3.

Figuras 8A e 8B: O anticorpo antagonista ativo 40-12 e seu controle inativo 64-12 não tem efeito próprio sobre a angiogênese basal. Ao con

31/59 trário, na dose de 30 pg/ml (200 nM aproximadamente), o anticorpo monoclonal anti-FGF-R4 40-12 é capaz de inibir a angiogênese de células HUVEC induzida pelo FGF2, enquanto que o anticorpo controle 64-12 não é capaz disso (figura 8A).

FGF2 marcado com o auxílio de um AlexaFluor® 488 nm é capaz de se ligar ao FGF-R4 expresso por células 300-19 (histograma branco). Essa interação pode ser dissociada por FGF2 não marcado (histogramas escuros) ou pelo anticorpo anti-FGF-R4 40-12 (histogramas cinza escuro), enquanto que o anticorpo prova 64-12 não é capaz disso (histograma cinza claro) (figura 8B).

Figura 8C e 8D: Efeito dos anticorpos anti-FGF-R4 oriundos dos clones 8, 31, 33 e 36 a 10 pm/ml sobre a angiogênese in vitro induzida por 3 ng/ml de FGF-2. Os clones 8 (figura 8C) e 31, 33 e 36 (figura 8D) inibem a angiogênese de células HUVEC induzida pelo FGF-2.

Figuras 9A e 9B: Células de hepatocarcinomas humanos Hep3b são estimuladas por FGF19 a 30 ng/ml. Essa estimulação induz uma sinalização celular específica de FGF-R4, chegando à síntese das proteínas cFos e JunB e à fosforilação de Erk1/2 observado por Western-blot (figura 9A). Cada faixa é então quantificada. Essa quantificação está representada sob a forma de histograma (figura 9B). O anticorpo 40-12 a 100 pg/ml inibe totalmente a indução da sinalização celular específica de FGF-R4, enquanto que o anticorpo controle não tem nenhum efeito. Com efeito, o anticorpo 40-12 bloqueia completamente a síntese de JunB e de cFos, assim como a fosforilação de Erk % induzida pelo FGF19, após uma simulação de três horas.

Figura 9C: O efeito inibidor do anticorpo anti-FGF-R4 40-12 sobre a fosforilação de Erk % induzida nas células Hep3b pelo FGF-19 (30 ng/ml) é conformado com o auxílio de ELISA anti-fosfoERK1/2. Um anticorpo 40-12 é também capaz de inibir a fosforilação de Erk1/2 nas células Hep3b estimuladas por FGF-2 (1 ng/ml) ou por soro (SVF) a 10%.

Figura 9D: Percentagem de inibição da fosforilação de Erk1/2 induzida pelo FGF-19 (30 ng/ml) obtida por ELISA sobre células Hep3b com o auxílio dos anticorpos oriundos dos clones 8,31, 33 e 36.

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Figuras 10A e 10B: A proliferação de células Hep3b pode ser estimulada pelo acréscimo de soro (figura 10A) ou de FGF19 (figura 10B). A indução pelo soro é parcialmente embebida pelo anticorpo 40-12 a 100 μg/ml, enquanto que anticorpo controle não tem efeito (figura 10A). A proliferação induzida pelo FGF19 é totalmente bloqueada por 10 pg/ml de anticorpos anti-FGF-R4 40-12 enquanto que nessa mesma dose, o anticorpo controle não é capaz disso (figura 10B).

Figuras 11A a 11D: O anticorpo anti-FGF-R4 40-12 é capaz de resolver desenvolvimento de tumores pancreáticos em um modelo murino RipTag, inibindo a angiogênese tumoral: O modelo Rip1-Tag2 é um modelo murino no qual ratos transgênicos expressam o antígeno T do SV40 nas células β das ilhotas do pâncreas que produz a insulina (Hanahan D. Nature, 1985, 9-15:11522). Esse antígeno T é expresso no decorrer do desenvolvimento embrionário do pâncreas até 4 a 5 semanas de vida, sem efeito aparente. Uma parte das ilhotas pancreáticas que expressam o antígeno T progride então durante as cinco semanas seguintes para a formação de ilhotas angiogênicas associadas a uma ativação da vasculatura, depois para o desenvolvimento de pequenos tumores de tipo adenoma. Algumas semanas mais tarde alguns adenomas se desenvolvem para formar carcinomas invasivos (figura 11 A). Esses ratos Rip1 Tag2 são tratados por via subcutânea uma vez por semana entre as semanas 10 e 13 na dose de 25 mg/kg com o auxílio do anticorpo 40-12 ou do anticorpo controle. Após 13 semanas, os ratos são sacrificados, o volume tumoral, assim como o número de tumores por pâncreas e a densidade vascular são determinados. O tratamento pelo anticorpo anti-FGF-R4 40-12 permite reduzir significativamente o volume tumoral de 55%, enquanto que o anticorpo prova não apresenta nenhum efeito (figura 11B). O anticorpo 40-12 permite também reduzir em 34% o número de tumores por pâncreas em comparação com prova (figura 11C). Essa redução do volume tumoral é acompanhada por uma redução da densidade vascular, quer isto seja no nível do número de vasos pequenos, médios ou grandes (figura 11 D).

Figura 12: A capacidade dos anticorpos 40-12 e 64-12 de reconhecer o domínio extracelular completo do FGF-R4 humano ou murino

33/59 assim que o domínio extracelular do FGF-R4 amputado de seu domínio D1 é medido por ELISA. O clone 40-12 é capaz de se ligar com as três construções de FGF-R4, enquanto que o clone 64-12 reconhece mal a forma murina do FGF-R4.

Figuras 13A a 13C: O efeito antagonista do anticorpo anti-FGFR4 clone 40-12 sobre a ligação FGF2/FGF-R4 é medido por experiências de competição de ligação com FGF2 marcado com o auxílio de um AlexaFluor® 488 nm. O clone 40-12 é capaz de bloquear a ligação do FGF2 humano (figura 13A), murino (figura 13B) e de rato (figura 13C) sobre células 300-19 murinas transfectadas com o auxílio de cDNA codificando para as formas humanas, murinas ou de rato do receptor FGF-R4 e isto com a mesma eficácia (3500, 4110 e 3940 ng/ml seja 23, 27 e 26 nM para os complexos humanos, murinos ou de rato respectivamente).

Figura 14A: Mapa do plasmídeo pXL4794 permitindo a expressão de hFGFR4_D1: Fc.

Figura 14B: Sequência em aminoácidos da proteína hFGFR4_D1: Fc secretada na linhagem HEK293 transfectada com o plasmídeo pXL4794.

Figura 15A: Mapa do plasmídeo pXL4796 permitindo a expressão de hFGFR4_D2: Fc.

Figura 15B: Sequência em aminoácidos da proteína hFGFR4_D2: Fc secretada na linhagem HEK293 transfectada com o plasmídeo pXL4796.

Figura 16A: Mapa do plasmídeo pXL4799 permitindo a expressão de hFGFR4_D3: Fc.

Figura 16B: Sequência em aminoácidos da proteína hFGFR4 D3: Fc secretada na linhagem HEK293 transfectada com o plasmídeo pXL4799.

Exemplos:

Exemplo 1: Colocação em evidência do papel de FGF-R4 no controle da anqiogênese.

A fim de demonstrar o papel de FGF-R4 no controle da angiogê

34/59 nese, experiências de angiogênese in vitro foram feitas com células endoteliais humanas de tipo HUVEC estimuladas com vários FGF. O FGF2, ligante ativador da maior parte dos receptores aos FGF. O FGF19, ligante ativador específico de FGF-R4 e o FGF4 ligante não ativador de FGF-R4.

Para isso, géis foram preparados, distribuindo em cada poço de

Chambereslaide (Biocoat Cellware collage, Tipo 1, 8-Well culturesides : Becton dickinson 354630), 160 μΙ de matrigel diluído a 1/6 (Growth factor reduced matrigel: Bacton dickinson 356230) no colágeno (rat Tail collagene, tipo I : Becton dickinson 354236). Os géis são mantidos durante uma hora a 10 37°C para permitir sua polimerização. Em seguida as células endoteliais venosas humanas (HUVEC ref: C-12200 - Promocell) foram inseminadas a 15.10³ células/poços em 400 μΙ de meio EBM (Clonetics C3121) + 2% FBS + HEGF 10 pg/ml. Esse protocolo pode ser adaptado a placas de 96 poços: 60 μΙ por poço de placas de 96 poços (Biocoat collagenl cellwere, Becton Dic15 kinson 354407). A matriz é preparada, misturando-se 1/3 de matrigel, 1 mg/ml final de colágeno. NaOH (0,026 x o volume de colágeno em μΙ), PBS 1x, o volume é em seguida ajustado pela água. As células endoteliais são estimuladas com 1 ng/ml de FGF2 (R&D, 133-FB-025) ou 10 ng/ml de FGF4 (R&D, 235-F4-025) ou de FGF19 (R&D, 969-FG-025) durante 24 horas a 20 37°C em presença de 5% de CO2. Após 24 horas, o comprimento da rede de microtúbulos formados é medido com o auxílio de um sistema de análise de imagens assistido por computador (Imagenia Biocom, Courtaboeuf, França) e o comprimento total dos pseudotúbulos em cada poço é determinado. A média do comprimento total da rede de microcapilar é calculada em pm 25 para cada condição correspondente à média sobre 6 réplicas.

O estímulo por FGF2 ou FGF19 permite a indução da formação de novos túbulos, enquanto o FGF-R4 não tem efeito (figura 1A). Esses resultados mostram que a ativação específica de FGF-R4 permite induzir a formação de novos vasos e, portanto, concluir que FGF-R4 controla a angio30 gênese in vitro.

A correlação in vivo com os dados in vitro foi obtida com o auxílio do modelo de indução da angiogênese in vivo em implantes de celulose

35/59 no rato. Esse modelo é uma adaptação do modelo descrito por Andrade et al. (Microvascular Research, 1997, 54, 253-61).

Os animais, ratos brancos BALB/c J cossanguíneos, são anestesiados com uma mistura de Xilasina (Rampun®, 10 mg/kg)/ quetamina (Imalgen 1000, 100 mg/kg) por via intraperitoneal. O dorso do animal é raspado e desinfectado com a hexomedina®. Uma bolsa de ar é criada subcutaneamente sobre o dorso do rato por injeção de 5 ml de ar estéreo. Uma incisão de aproximadamente 2 cm, sobre o topo do dorso do animal, é feita a fim de introduzir um implante de celulose estéril (disco de 1 cm de diâmetro, 2 mm de espessura, Cellspon® referência 05101) impregnado com 50 pl de solução estéril contendo a proteína ou o produto a testar. A incisão é em seguida suturada e limpa com a hexomedina®. Nos dias seguintes à colocação do implante, os ratos receberam no implante a proteína ou o produto por uma injeção através da pele (50 μΙ/implante/dia) sob anestesia gasosa (Isoflurano a 5% (Aerrane®, Baxter). Sete dias após a colocação da esponja, os ratos são sacrificados por uma dose letal de pentobarbital sódico (CEVA saúde animal), administrada por via intraperitoneal. A pele é em seguida recortada, aproximadamente 1 cm em torno da esponja, evitando a cicatriz, a fim de liberar a pele e a esponja. A esponja é em seguida recortada em diversos pedaços e colocada em um tubo RiboLyser® contendo 1 ml de tampão de lise (Cell Death Detection ELISA, Roche). Os tubos são agitados 4 vezes consecutivas durante 20 segundos, força 4, no moedor celular (FastPrep® FP 120). Os tubos são em seguida centrifugados durante 10 minutos a 2000 g a 20°C e o que flutua é congelado a - 20°C, esperando a dosagem de hemoglobina.

No dia da dosagem, os tubos são de novo centrifugados após descongelamento e a concentração de hemoglobina é medida com o reagente de Drabkin (Sigma, volume a volume) por leitura no espectrofotômetro a 405 nm contra uma faixa de aferição de hemoglobina bovina (Sigma). A concentração de hemoglobina em cada amostra é expressa em mg/ml a partir da regressão polinomial realizada a partir da faixa. Os resultados são expressos em valor médio (+ sem) para cada grupo. As diferenças entre os grupos são

36/59 testadas com uma ANOVA seguida de um teste de Dunnett sobre a raiz quadrada dos valores.

Nesse modelo, o FGF19 a 50 ng por local e 5 reinjeções é capaz de induzir significativamente a colonização da esponja por vasos maduros novamente formados com a mesma eficácia que o FGF2 a 5 ng por local. A presença de vasos sanguíneos funcionais na esponja é colocada em evidência pela presença de hemoglobina (figura 1B). Esses resultados mostram que a ativação específica de FGF-R4 permite o recrutamento de vasos sanguíneos funcionais, indicando que FGF-R4 controla também a angiogênese in vivo.

Exemplo 2: Descrição das proteínas FGFR utilizadas com imunóqeno e antígeno.

Receptores aos fatores de crescimento FGF-R e em particular seus domínios extracelulares dos FGF-R1, FGF-R2, FGF-R4, FGF-R4 são fundidos em um tag (Histag) ou no domínio Fc de imunoglobulina.

O cDNA codificando para o domínio extracelular de FGF-R4 humano corresponde à proteína descrita em SwissProt FGF-R4 HUMAN posição 1-365 com a mutação L136P. Foi clonado no vetor de expressão eucariote pXL4614 representado na figura 2, a fim de expressar uma proteína contendo um Histag em posição C terminal no domínio extracelular.

As proteínas nomeadas hFGFR4-Histag, de sequência SEQ ID N°: 40 foram produzidas por transfecção transitória na linhagem HEK293 EBNA (Invitrogen) com o auxílio do plasmídeo pXL4614 e dos plasmídeos acessórios pXL4544 e pXL4551, permitindo a expressão de duas enzimas de glicosilação dos N-glicanos, isto é a alfa-2,3-sialil transferase e a β-1,4galactosil transferase, conforme foi descrito no pedido WQ2008/065543.

A proteína hFGFR4-Histag expressa no que flutua de cultura das células HEK293 EBNA foi purificada por cromatografia sobre coluna sefarose Ni-chelating (Amersham Biosciences; referência 17-0575-01) e purificação em tampão imidazol, depois formulada em tampão PBS (Invitrogen; referência 14190-094). A análise da composição em monossacarídeos e a quantificação dos ácidos siálicos dos N-glicanos, conforme descrito por Saddic et

37/59 al. 2002. (Methods Mol. Biol. 194:23-36 e Anumula et al 1998. Glicobiologia 8:685-694) permitiram demonstrar que a proteína era muito amplamente sialilada (91%). Por conseguinte, a proteína tinha todas as características para ter propriedades farmacocinéticas suficientes.

De forma comparável, a proteína hFGFR4-Streptag (SEQ ID N° 69) foi purificada por cromatografia sobre coluna Strep-Tacting Superflow (IBA: referência 2-1206) e purificação em tampão destiobiotina, depois formulada em tampão PBS.

A proteína hFGFR4(D2, D3)-Histag corresponde à sequência SEQ ID N°: 42. O cDNA foi clonado no plasmídeo de expressão eucariote pXL4615 representado na figura 3 a proteína foi produzida e purificada em condições comparáveis à proteína hFGFR4-Histag.

O cDNA codificando para a proteína mFGFR4-Histag (SEQ ID N° 43) foi clonado no plasmídeo de expressão eucariote pXL4621 representado na figura 4 e a proteína foi produzida e purificada em condições comparáveis com a proteína hFGFR4-Histag.

A proteína hFGFR1-Fc, (SEQ ID N° 46) contém o domínio extracelular FGF-R1 lllc humano fundido em C- terminal no domínio Fc do igG1 humano. O cDNA foi clonado no plasmídeo de expressão eucariote pXL4728 representado na figura 5 e a proteína foi produzida em condições comparáveis à proteína hFGFR4-Histag, depois purificada por cromatografia sobre coluna de afinidade sefarose proteína G (Amersham Biosciences) e purificação em tampão 100 mM glicina/HCI pH 2,7, depois formulada em tampão PBS.

A proteína hFGFR2-Fc, de sequência SEQ ID N°: 48, contém o domínio extracelular de FGF-R2 lllc humano fundido em C-terminal no domínio Fc do lgG1 humano. O cDNA foi clonado no plasmídeo de expressão eucariote pXL4327 representado na figura 6 e a proteína foi produzida, depois purificada em condições comparáveis à proteína hFGFR1-Fc.

A proteína hFGFR3-Fc é uma proteína que se funde no domínio extracelular de hFGFR3 lllc humano no domínio Fc do lgG1 humano foi obtida de R&D System (referência: 760-FR).

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A proteína hFGFR4-Fc é uma proteína que se funde no domínio extracelular de FGF-R4 humano no domínio Fc do lgG1 humano foi obtida de R&D Systems (referência: 685-FR).

Diferentes subdomínios da parte extracelular de proteína hFGFR4 foram fundidos no domínio Fc do lgG1 humano. O subdomínio D1 está contido na construção SABVA4794 (SEQ ID N° 112 e figuras 14A e 14B). O subdomínio D2 é contido na construção SABVA4796 (SEQ ID N° 114 e figuras 15A e 15B). O subdomínio D3 fica contido na construção SABVA4799 (SEQ ID N° 116 e figuras 16A e 16B). Esses três subdomínios se estendem respectivamente das posições 1 a 179 para SABVA4794, 1 a 32 mais 145 a 242 para o SABVA4796 e 1 a 32 mais 228 a 360 para o SABVA4799 (posições descritas em SwissProt FGF-R4_Humano). Essas proteínas foram produzidas através dos plasmídeos pXL4794 (sequência codificante SEQ ID N°: 111), pXL4796 (sequência codificante SEQ ID N°: 113) e pXL4799 (sequência codificante SEQ ID N°: 115) em condições comparáveis à proteína FGFR1-Fc.

Exemplo 3: Produção e crivação dos anticorpos monoclonais anti-FGF-R4 A- Anticorpos obtidos por imunização.

Os anticorpos monoclonais foram obtidos por imunização com o imonogene hFGFR4-Histag em cinco ratos BALB/cJ (Charles River), com seis a oito semanas de vida imunizados cada um com um total de 24 pg de hFGFR4-Histag pelo método RIMMS descritos por Kilpatrick et al. (1997. Hibridoma 16 ; 381389) e o protocolo de fusão descrito em clonacell™ - HY Hybridoma Cloning Kit (StemCell Tecnologies; referência 03800).

Dois dias após a última injeção, os ratos foram sacrificados e os nódulos linfáticos foram fundidos com as células de mieloma P3X63AG8.653 (ATCC, CRL-1580) em uma relação 5:1 em presença de Polietileno Glicol (ClonaCelITM-HY referência 03806). A suspensão celular foi repartida assepticamente em caixas de Petri incubadas a 37°C em presença de 5% de CO2. As colônias surgidas após 12 dias de incubação foram isoladas e colocadas em cultura em meio E (ClonaCelITM-HY; referência 03805) em caixas de 96 poços.

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A crivação primária de anticorpos monoclonais obtidos por imunização com hFGFR4-Histag foi realizada por dosagem ELISA, utilizando como antígeno de captura hFGFR4-Streptag. O antígeno de captura foi fixado sobre caixas immulon-4 enzyme-linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). O que flutua de cultura de hibridomas foram acrescentados, depois detectados, graças a anticorpos de coelho antirratos IgG conjugado à peroxidase (Sigma; referência A9044-diluição a 1:50000). A revelação foi feita com o substrato TMB-H202 (Interchim; referência UP664780) e as medidas com a leitora de placas a 450 nm. Dentre os 444 hibridomas testados, 129 eram positivos por dosagem ELISA com o antígeno hFGFR4-Streptag, dos quais 120 hibridomas eram também positivos com a proteína dímero hFGFR4-Fc.

Uma crivagem secundária foi feita para selecionar unicamente os anticorpos específicos ao FGF-R4 por dosagem ELISA, utilizando como antígeno de captura a proteína hFGFR4-Streptag, depois com as proteínas hFGFR1-Fc, hFGFR2-Fc e hFGFR3-Fc descritas no exemplo 2. O antígeno de captura foi fixado sobre caixas immulon-4 enzyme-linked (VWR Inc. Scientific Swedesboro, NJ). O que flutua de cultura hibridomas foi em seguida acrescentado, depois detectado, graças ao anticorpo de coelho antirrato IgG conjugado à peroxidase (Sigma; referência A9044-diluição a 1:50000). A revelação foi feita com o substrato TMB-H202 (Interchim; referência UP664780) e as medidas com a leitora de placas a 450 nm.

Dentre os 129 hibridomas testados positivos por dosagem ELISA com o antígeno, 84 hibridomas eram positivos com hFGFR4-Streptag e não tinham afinidade nem para hFGFR1-Fc, nem para hFGFR2-Fc e nem para hFGFR3-Fc. Em função de seu crescimento e sua morfologia, 39 hibridomas foram conservados. Seu isotipo foi determinado com o auxílio do kit SEROTEC (referência MMT1); 95% eram os lgG1.

Uma crivagem terciária foi realizada sobre um teste de proliferação de células modificadas Baf/3, induzida por FGF2, a fim de caracterizar a inibição pelos anticorpos FGF-R4. Os hibridomas murinos expressando os anticorpos anti-FGF-R4 antagonistas foram clonados por diluição-limite. A partir das células de hibridomas cultivadas em fase exponencial, a sequência

40/59 codificante (cDNA) foi determinada, após extração do mRNA com o auxílio do kit Oligotex (Qiagen; referência 72022); obtenção e amplificação do cDNA pelo método RACE-RT com o kit Gene Racer, a reversa transcriptase Superscript III (Invitrogen; referência L1500) e as atrações (primeiras) descritos na tabela 2 abaixo; amplificação dos fragmentos cDNA com o auxílio da polimerase Phusion (Finnzymes; referência F-530S), as atrações (primeiras) e as condições de temperatura descritas na tabela 2. Os fragmentos amplificados contendo as partes codificantes para VH (parte variável da cadeia pesada HC) ou VL (parte variável da cadeia leve LC) foram clonadas no vetor pGEM-T Easy de Promega; referência A137A), os enxertos dos plasmídeos obtidos foram sequenciados, de modo que a sequência codificante de cada domínio variável foi analisada nos sentidos 5'-3' e 3-5' sobre pelo menos 6 plasmídeos correspondentes aos anticorpos anti-FGF-R4 40-12 e anti-FGFR4 64-12. As análises de sequência, contíguos e alinhamentos foram realizados com o auxílio do programa disponível sobre Vector NTI (Invitrogen).

Os plasmídeos contendo as sequências consenso codificando para as partes variáveis dos anticorpos anti-FGF-R4 foram conservados. O plasmídeo pXL4691 contém a sequência codificando para a VH de sequência SEQ ID N°: 5 de anticorpos anti-FGF-R4 40-12 e o plasmídeo pXL4693 contém a sequência codificando para a VH de sequência SEQ ID N°: 19 do anticorpo anti-FGF-R4 64-12, conforme apresentado na tabela 2 abaixo.

O plasmídeo pXL4690 contém a sequência nucleotídica SEQ ID N°: 7 codificando para a VL de sequência SEQ ID N°: 8 do anticorpo antiFGF-R4 40-12, e o plasmídeo pXL4692 contém a sequência nucleotídica SEQ ID N°: 21 codificando para a VL de sequência SEQ ID N°: 22 do anticorpo anti-FGF-R4 64-12 conforme apresentado na tabela 2 abaixo.

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Tabela 2 - Condições operacionais e análise das reações de transcriptase reversa e PCR-identificação dos plasmídeos pXL4690 a pXL4693.

Anti-FGFR4	40-12	64-12
Reação RT Temperatura Iniciadores	55°C SEQ ID N° 64 (HC) SEQ ID N° 65 (LC)	55°C SEQ ID N° 64 (HC) SEQ ID N° 66 & SEQ ID N°: 67 (LC)
Iniciador 5'-GeneRacer (SEQIDN⁰ 63)	5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'
Iniciador 3'-interno ao hinge murino (SEQ ID N°64)	5'-TATGCAAGGCTTACAACCACA-3'
Iniciador 3'-interno ao Ck murino (SEQ ID N° 65)	5'-CTCATTCCTGTT- GAAGCTCTT GAC-3'
Iniciador 3'-interno ao CÀ murino (SEQ ID N° 66 e SEQ ID N°: 67)		5'-ACACTCAGCACGGGACAAACTCTTCTC-3' 5'-ACACTCTGCAGGAGACAGACTC I I I IC-3
PCR de HC: Temperatura Iniciadores	55 °C SEQ ID N° 63 - SEQ ID N°: 64	55 °C SEQIDN⁰ 63-SEQIDN⁰: 64
Sequência dos produtos PCR clonados (VH)	9 clones têm a mesma sequência VH e uma sequência CH1 idêntica àquela do mCH1-	6 clones têm a mesma sequência VH e uma sequência CH1 idêntica àquela do mCH1
Plasmídeo contendo VH	PXL4691	PXL4693
PCR de LC: Temperatura Iniciadores	55°C SEQ ID N° 63 - SEQ ID N°: 64	55°C SEQIDN⁰ 63 - SEQ ID N°: 64
Sequência dos produtos PCR clonados (VL)	11 clones têm a mesma sequência VL e uma sequência Ck idêntica àquela do mCk	6 clones têm a mesma sequência VL e uma sequência CÀ idêntica àquela do mCÀ
Plasmídeo contendo VL	PXL4690	PXL4692

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As sequências em aminoácidos das partes variáveis leves e pesadas respectivamente dos anticorpos anti-FGF-R4 64-12 e anti-FGF-R4 4012 são diferentes. Os números das sequências utilizadas obtidas e deduzidas estão indicados na tabela 7.

Os anticorpos 40-12 e 64-12 foram produzidos em placas T500. O que flutua de cultura foi coletado após sete dias. Os anticorpos anti-FGFR4 foram purificados por afinidade sobre a proteína G, depois dialisados contra PBS filtrados estéreis e conservados a 4 °C.

Os anticorpos antagonistas purificados têm um Kd de 6,5 x 10'⁹M (anti-FGF-R4 40-12) e 5,75 10’⁸ M (anti-FGF-R4 64-12).

B- Anticorpo selecionado com o auxílio do método exibição por fagos.

A crivagem primária de anticorpos monoclonais obtidos por exibição por fagos com hFGFR4-Histag foi realizada por dosagem ELISA, utilizando como antígeno de captura hFGFR4-Histag. O antígeno de captura foi fixado sobre caixas lmmulon-2 enzima - linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). O que flutua de cultura de E. coli infectado por fagos foram em seguida acrescentados, depois detectados, graças ao anticorpo de rato antiMIS conjugado à peroxidase (GE Healthcare; referência 27-9421-01, diluição a 1: 5000). A revelação foi realizada com o substrato TMB-H2O2 (Interchim; referência UP664780) e as medidas de densidade óptica (O.D) efetuadas a 450 nm.

Uma crivagem secundária foi realizada para selecionar unicamente os anticorpos específicos ao FGF-R4 por dosagem ELISA, utilizando como antígeno de captura a proteína hFGFR4-Histag, depois com as proteínas hFGFR1-Fc, hFGFR2-Fc e hFGFR3-Fc descritas no exemplo 2. O antígeno de captura foi fixado sobre caixas lmmulon-2 enzima - linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). O que flutua de cultura de E. coli infectado pelos fagos foi em seguida acrescentado, depois detectado, graças ao anticorpo de rato antiM13 conjugado à peroxidase (GE Healthcare; referência 27-9421-01, diluição a 1: 5000).. A revelação foi realizada com o substrato TMB-H2O2 (Interchim : referência UP 664780) e as medidas de densidade

43/59 óptica (O.D) efetuadas a 450 nm.

Os clones específicos ao FGF-R4 selecionados foram sequenciados e reclonados em um vetor de expressão por transfecção transitória de células HEK293.

Para isso, em uma primeira etapa, as regiões codificando o FAB, isto é a cadeia leve do anticorpo, um local de ligação de ribossoma bacteriano, e a região variável da cadeia pesada do anticorpo, são extraídas do fagemídeo por restrição e inseridas em um plasmídeo de expressão de IgG para células de mamíferos, a jusante de uma sequência sinal de anticorpo eucariote e a montante da região constante de uma cadeia pesada de lgG1 humano. Em uma segunda etapa, a região contendo o local de ligação do ribossoma bacteriano e o peptídeo sinal bacteriano da cadeia pesada é trocada contra uma sequência IRES e uma sequência sinal eucariote. As IgG são expressas por transfecção transitória de células HEK293. Esse processo é descrito em detalhes em T. Jostock et al. Journal of immunological Methods 289 (2004) 65-80.

Um exemplo de sequência de região constante de lgG1 humana que pode ser utilizada na presente invenção na sequência SEQ ID N°: 117.

Uma crivagem terciária foi realizada sobre um teste de proliferação de células modificadas Baf/3, induzida por FGF2 e descrita no exemplo 4, a fim de caracterizar a inibição pelos anticorpos FGF-R4, utilizando o que flutua de culturas de células HEK293 transfectadas transitoriamente pelos vetores de expressão dos anticorpos. Essa crivagem permitiu identificar os anticorpos dos clones 8, 31, 33 e 36. As sequências correspondentes são descritas na tabela 7.

Exemplo 4: Estabelecimento da linhagem clonal murina BaF/3 FGF-R4-hMpl e protocolo de proliferação celular.

A parte extracelular e transmembranária do FGF-R4 foi clonada em fusão traducional com o domínio intracelular do hMpl em um vetor pEF6/V5-His A mutado a fim de obter a presença em 5' do tag HA diante do receptor quimera FGF-R4 - hMpl.

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Construção do pEF6A mutado.

O vetor pEF6/V5-His A (Invitrogen, referência V961-20) foi melhorado a fim de integrar o MCS (locais de multiclonagem) associado ao tag HA colocado sob o peptídeo sinal do igGk do pDisplay (Invitrogen, referência V660-20). Para se fazer isso, o MSC associado ao tag HA e a seu peptídeo sinal foram amplificados por PCR entre as atrações sentido de sequência SEQ ID N°: : 51 e reverso de sequência SEQ ID N°: 52, permitindo inserir os locais de restrição Kpnl em 5' e Xbal em 3'. O fragmento PCR foi digerido pelas enzimas Kpnl e Xbal foi clonado no vetor pEF6/V5-His A abertos pelas mesmas enzimas. Enfim, o primeiro local BamHI do MCS foi substituído pelo local BsrGI, digerindo vetor novamente formado pelas enzimas Kpnl e Spel e inserindo entre esses locais as atrações de sequências SEQ ID N°: 53 e SEQ ID N°: 54 hibridadas entre elas e contendo o local enzimático BsrGI. O vetor obtido foi nomeado : pEF6mut-HA.

Construção do vetor pEF6mut-HA-FGF-R4-hMpl.

O domínio intracelular do Mpl foi amplificado em um vetor pEF6/V5-His TOPO (Invitrogen, referência K961-20) entre as atrações sentidos de sequência SEQ ID N°: 55 permitindo a inserção do local de digestão Saci e reverso de sequência SEQ ID N°: 56 denominada comumente revBGH. Os fragmentos PCR gerados foram em seguida digeridos pelas enzimas Saci e Notl.

O domínio extracelular e transmembranário do FGF-R4 foi amplificado com o auxílio do par de atrações (sentido: sequência SEQ ID N°: 57; reverso: sequência SEQ ID N°: 58). Essas atrações permitem a inserção dos locais enzimáticos BamHI em 5' e Saci em 3'. O fragmento PCR obtido foi então digerido pelas enzimas BamHI e Saci.

As amplificações de DNA, codificando para o hMpl e para o FGF-R4 foram em seguida clonadas simultaneamente no vetor pEF6mut-HA aberto BamHI - Notl. A construção que daí resulta foi nomeada pEF6mutHA-FGF-R4- alllc-hMpl2. Essa construção foi em seguida melhorada por mutagênese dirigida, a fim de trocar o domínio transmembranário do FGFR4 (sequência proteica SEQ ID N°: 59) para a sequência SEQ ID N°: 60.

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Para se fazer isto, o kit QuickChange® Site-Directed mutagenesis kit (Clontech, referência 200518) foi utilizado com as atrações sentido de sequência SEQ ID N°: 81 e reverso de sequência SEQ ID N°: 62. A nova construção quimera obtida foi denominada pEF6mut-HA-FGF-R4- alIlc-hMpl2.

Criação de uma linhagem estável por transfecção da linhagem murina BaF/3 com a construção FGF-R4- alHc-hMpl2.

A construção pEF6mut-HA-FGF-R4- alllc-hMpl2 foi introduzida de forma estável por eletroporação no genoma das células murinas BaF/3 a linhagem obtida foi selecionada em presença de FGF2 a 20 ng/ml (R&D, referência 234-FSE-025) e de heparina a 100 ng/ml (Sigma, referência H3149). A linhagem transfectada e selecionada é então de tipo clonal.

Protocolo de proliferação celular com a linhagem celular BaF/3 FGFR4-hMpl:

As células BaF/3 FGFR4-hMpl foram cultivadas e mantidas em meio RPMI 1640 (invitrogen; referência 32404-014) completo (10% SVF (Hyclone; referência SH30070.03), glutamina a 2mM, MEM Non Essencial Amino Acid 1x (Gibco, referência 11140-035), MEM Sodium Piruvato 1x (Gibco, referência 11360-039)), suplementado em FGF2 a 20 ng/ml (R&D System, referência 234-FSE) e heparina a 3 ng/ml (Sigma, referência H3149). Na véspera, as células são inseminadas a 0.4 10⁶ células/ml em meio RPMI 1640 completo suplementado em FGF2 a 20 ng/ml e em heparina a 3 ng/ml. Na manhã seguinte, 50 pl de suspensão celular BaF/3 FGFR4-hMpl em meio RPMI 1640 completo suplementado em FGF2 a 20 ng/ml e em heparina a 3 ng/ml a 0.2 10⁶ células/ml foram dispensados em placa 96 poços (Porvair, referência 214006) seguido de 50 μΙ do que flutua de hibridoma contendo o anticorpo a testar. As placas foram em seguida colocadas a 37°C, 5% CO₂ durante 24 a 30 horas. Para a leitura da proliferação celular, a quantidade de ATP foi quantificada pelo acréscimo de 100 μΙ de Cell Titer Gio Luminesent Cell Viability Assay (Promega, referência G7571) e a luminescência foi lida com o auxílio de um luminômetro.

Os clones apresentando nesse teste um sinal 50% menor que aquele do meio RPMI 1640 completo contendo os aditivos FGF2 a 20 ng/ml

46/59 e heparina 3 ng/ml foram retidos.

Quando os anticorpos anti-FGF-R4 específicos de FGF-R4 foram incubados com as células BaF/3 FGFR4-hMpl e com os aditivos seguintes FGF2 a 20 ng/ml e heparina 3 ng/ml, um efeito antagonista sobre a proliferação celular foi observado. Dentre os 39 hibridomas testados, 14 são capazes de inibir a proliferação celular, induzida pelo FGF, células das células BaF/3 FGFR4-hMpl em presença de FGF2.

Foi mostrado por ELISA (figura 12) que os anticorpos anti-FGFR4 antagonistas 40-12 e 64-12 eram afins para as proteínas murinas mFGFR4 e humanas hFGFR4 (D2, D3).

Enfim, uma última crivagem foi realizada por surface plasmon resonance (BIAcore 2000) para determinar as constantes de afinidade dos anticorpos anti-FGF-R4. A interação entre a proteína FGF-R4 e o anticorpo anti-FGF-R4 presente no que flutua de cultura do hibridoma foi analisada após ter fixado o anticorpo anti-FGF-R4 em um anticorpo anti-Fc ele próprio fixado sobre o chips CM. As medidas de cinéticas foram realizadas segundo o protocolo de Canziani et al 2004. Anal. Biochem. 325 : 301 - 307.

Dois anticorpos dentre aqueles que têm constantes de afinidade de 10'⁸ a 10'⁹ M e velocidades de dissociação de W³ a 10’⁵ S’¹ foram selecionados. As características desses anticorpos foram descritas na tabela 1 abaixo.

O método de referência aplicado para a determinação do Kd é o

Surface Plasmon Resonance (BIAcore).

Tabela 1A: Constante de afinidades e de associação/dissociação dos anticorpos anti-FGF-R4 antagonistas purificados 40-12 e 64-12.

Anti-FGFR4	koníMts·¹)	koníMÍs-¹)	Kd ím)
40-12	1.94E+05	1,26E-03	6.50E-09
64-12	1.05E+04	6.02E-04	5.75E-08

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Tabela 1B: Parâmetros cinéticos de ligação dos anticorpos anti-FGF-R4

8,31, 33 e 36 medidos por Surface Plasmon Resonance (BIAcore 3000):

	Sobre h-FGFR4-Histag	sobre m-FGFR4-Histag
	Kon (M¹s’)	Koff(s¹)	KD (M)	Kon (M ¹s¹)	Koff(s¹)
Clone 8	8.93E+05	2,92E-04	3,27E- 10	1.20E+06	1.36E-04	1.15E- 10
Clone 31	6,48 E+05	9,80E-04	1,52E-9	9.14E+05	1,80E-03	1,97E- 09
Clone 33	8,05E+05	6.17E-04	7,71 E- 10	1,01E=06	7,04E-04	6,92E- 10
Clone 36	2,44E+05	6,31 E-04	2,62 E-9	3.30E+05	7,52E-04	2,28E- 09

Exemplo 5: Especificidade dos anticorpos anti-FGFR4

A- Especificidade do anticorpo anti-FGFR4 40-12 para FGFR4

A especificidade de cada anticorpo é estabelecida por ELISA segundo o protocolo descrito no exemplo 4. Dessa forma, observa-se a capacidade de cada anticorpo de se ligar a cada FGF-R. Essa experiência mostra claramente que o anticorpo 40-12 reconhece apenas FGF-R4 e é, portanto, específico de FGF-R4. O anticorpo 64-12 é capaz de se ligar principalmente a FGF-R4, mas também ligeiramente a FGF-R3 (figura 7). B- Especificidade dos anticorpos anti-FGFR4 8, 31, 33 e 36 para o FGF-R4

A especificidade de cada anticorpo é estabelecida por ELISA, segundo o protocolo abaixo: suspensões de fagos que apresentam em sua superfície os anticorpos no formato FAB são geradas por infecção de bactérias E. Coli. Os antígenos de captura foram fixados sobre caixas lmmulon-2 enzima - linked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). As suspensões de fagos foram em seguida, acrescentadas, depois detectadas, graças ao anticorpo de rato antifago M13 conjugado à peroxidase (GE Healthcare; referência 27-9421-01, diluição a 1: 5000). A revelação foi realizada com o substrato TMB-H2O2 (Interchim; referência UP66480) e as medidas de densidade óptica (O.D) efetuadas a 450 nm. A tabela 2 resume os resultados obtidos:

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Dessa forma se observa a capacidade de cada anticorpo de se ligar a cada FGF-R. Essa experiência mostra claramente que o anticorpo 8, 31, 33, 36 reconhece apenas FGF-R4 e são, portanto, específicos de FGFR4.

Tabela 2: Especificidade dos anticorpos anti-FGFR4 oriundos dos clones 8,

31, 33 e 36 estabelecida por EL	SA (sinal = O.D 450 nm).
	h-FGFR4(D2,D3)-hlstag	h-FGFR1-Fc	h-FGFR2-Fc	h-FGFR3-Fc
Clone 8	2,55	0,05	0,00	0,00
Clone 31	2,52	0,00	0,00	0,01
Clone 33	2,73	0,00	0,00	-0,01
Clone 36	1,87	-0,01	-0,01	-0,02

Exemplo 6: Efeito antagonista do anticorpo 40-12 e dos anticorpos oriundos dos clones 8, 31, 33 e 36 sobre a angiogênese (in vitro).

A fim de determinar a atividade biológica do anticorpo monoclonal 40-12 anti-FGF-R4 no decorrer da angiogênese de células endoteliais humanas, experiências de angiogênese in vitro foram realizadas com o auxílio de células HUVEC estimuladas por FGF2 em presença do anticorpo 4012 ou de anticorpos provas em doses crescentes de 1 a 30 pg/ml (figura 8A e figura 8B).

Nesse caso o anticorpo monoclonal anti-FGF-R4 antagonista ativo 40-12 é capaz de inibir a angiogênese de células HUVEC induzida pelo FGF2, e isto na dose de 30 pg/ml ou 200 nM enquanto que o anticorpo prova 64-12 não tem nenhum efeito. Além disso, o anticorpo 40-12 não tem nenhum efeito próprio sobre a angiogênese basal.

Esses resultados indicam que um anticorpo antagonista específico de FGF-R4 é capaz de inibir a angiogênese.

Como para o anticorpo 40-12, os anticorpos anti-FGF-R4 dos clones 8, 31, 33 e 36 oriundos da exibição por fagos foram avaliados quanto à

49/59 sua capacidade de inibir a angiogênese de células endoteliais humanas de tipo HUVEC induzida pelo FGF-2. Esses anticorpos bloqueiam a estimulação da angiogênese in vitro obtida com FGF-2 e isto à dose de 10 pg/ml (figura 8C e 8D).

Exemplo 7: Efeito antagonista do anticorpo 40-12 e dos anticorpos oriundos dos clones 8, 31, 33 e 36 sobre células de hepatocarcinomas humanos (in vitro).

A fim de determinar o efeito antitumoral do anticorpo monoclonal anti-FGF-R4 antagonista 40-12, experiências foram feitas sobre células de hepatocarcinoma humano Hep3b, cuja proliferação e cujas vias de sinalização aí chegando são dependentes do par ligante-receptor: FGF19/FGF-R4 FGF-R4.

Em primeiro lugar, o estudo das vias de sinalização, dependentes de FGF-R4 e chegando à proliferação das células Hep3b foi feito por Western-Blot. Essa sinalização celular passa pela neo-síntese das proteínas CFos e JunB, assim como pela fosforilação de Erki (Lina t al., J Biol Chem. 2007, 14:27277-84). Para fazer isto, 5.10⁵ células foram inseminadas em caixa de 35 mm de diâmetro em 2 ml de meio completo (DMEM, 10% SVF, 2 mM glutamina). 24 horas após as células são colocadas em carência 24 horas em 1,8 ml de meio desprovido de soro. As células são em seguida estimuladas durante 3 horas por 200 pl de FGF19 concentrado dez vezes na ausência ou em presença de anticorpos anti-FGF-R4 controle ou 40-12. O meio é em seguida retirado, as células lavadas uma vez por PBS frio e lisadas sobre caixa durante 30 minutos a 4 °C por 75 μΙ de tampão RIPA suplementado em inibidor de protease. O extrato proteico total é em seguida centrifugado durante 10 minutos a 4 °C a 13000 rpm e o que flutua analisado pela técnica de Western Blot. As membranas são em seguida incubadas durante duas horas à temperatura ambiente em TBS, tween 0,05%, 5% de leite, depois o anticorpo primário anti-cFos (Cell Signaling Technology, referência 2250), anti-JunB (Cell Signaling Technology, referência 3746) e antifospsoErki1/2 (Cell Signaling Technology, referência 4377) são acrescentados a 1/1000 e incubados durante uma noite a 4 °C sob agitação lenta. A

50/59 membrana é enxaguada três vezes por TBS, tween 0,05%, e o anticorpo secundário acoplado à HRP é incubado durante 4 horas a 4 °C diluído a 1/2000 em TBS, tween 0,05%, 5% de leite. Os resultados de Western Blot são então quantificados com um auxílio de um Chemigenius (Syngene). A intensidade das faixas obtidas com diferentes anticorpos é ponderada pela intensidade das faixas obtidas com o anticorpo antiactina diretamente acoplado à HRP e utilizado a 1/3000 (Santa Cruz Biotecnologia, referência SC8432-HRP).

O FGF19 a 30 ng/ml induz a síntese das proteínas JunB e cFos, assim como a fosforilação de Erki ¹Z> nas células Hep3b. Essa neo-síntese de proteína e a fosforilação de Erki são inibidas completamente pelo anticorpo anti-FGF-R4 40-12 a 100 pg/ml enquanto que o anticorpo controle não tem nenhum efeito inibidor. Esses efeitos observados sobre as membranas de Western Blot (figura 9A) são quantificados e as intensidades das faixas de cada membrana estão representadas sob a forma de gráfico (figura 9B).

Em segundo lugar, experiências de proliferação celular propriamente ditas foram feitas. 5000 células foram inseminadas em placa de 96 poços em 100 pl de meio DMEM, 10% SVF, 2 mM glutamina. 24 horas após as células foram desprivadas em um meio de cultura sem soro durante 24 horas. As células Hep3b foram em seguida estimuladas durante 72 horas por 100 μΙ de meio sem soro suplementado por 10 ng/ml de FGF19 (produção interna a Sanofi-Avent R&D) ou por 10% de soro na ausência ou em presença de anticorpos provas ou de anticorpo monoclonal anti-FGF-R4 antagonista 40-12. Após 3 dias, a proliferação celular foi quantificada com o auxílio do kit CelITiter Glo (Promega, França).

Dessas experiências, sobressai que o soro, assim como o FGF 19 são capazes de estimular a proliferação dos Hep3b. O anticorpo antiFGF-R4 antagonista 40-12 inibe parcialmente a 100 pg/ml, essa proliferação induz ao soro, enquanto que o anticorpo prova não apresenta atividade inibidora (figura 10A).AIém disso, o anticorpo 401-2 a 10 pg/ml bloqueia completamente a proliferação induzida pelo FGF19 (figura 10B). O anticorpo prova não tem efeito.

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Isto demonstra que o anti-FGF-R4 antagonista objeto da invenção pode ser utilizado como agente terapêutico antitumoral no âmbito de tumores dependentes do FGF19 ou do FGF-R4 e que esse anticorpo seria particularmente eficaz no tratamento dos hepatocarcinomas.

A fim de simplificar o estudo do efeito dos anticorpos anti-FGFR4 sobre as células Hep3b, um teste ELISA foi desenvolvido para a detecção da fosforilação de Erk1 /2 em consequência da estimulação dessas células por FGF-19 (em correlação com as experiências descritas no exemplo 8) do FGF-2 ou do soro de bezerro fetal. Para fazer isto, 50000 células Hep3b são inseminadas em placa de 96 poços escuros de fundo transparente (COSTAR, referência 3603) em 100 μΙ de meio DMEM, 10% SVF, 2 mM glutamina. Após 24 horas,as células são colocadas em carência durante 24 horas em meio DMEM, 2mM glutamina sem SVF. O meio é em seguida aspirado e substituído por 100 μΙ de meio de carência pré-equilibrado a 37°C contendo o FGF ou o SVF, assim como os anticorpos avaliados nas diferentes doses. As células são incubadas durante 3 horas a 37°C, 5% CO2. O meio de estimulação é então aspirado, os poços são enxaguados por PBS a 4°C e as células são fixadas por acréscimo de 200 μΙ de PFA (paraformaldeído) 4% em PBS durante 15 minutos à temperatura ambiente. O PFA é retirado e as células lavadas três vezes por 200 μΙ de PBS. A marcação por anticorpos para a detecção de fosfo-Erk Vz diretamente sobre as células Hep3b começa pela saturação dos locais não específicos com 100 μΙ de tampão de saturação (21,25 ml de PBS, 1,25 ml de soro não imune de cabra a 10% (Zymed, referência 50-062Z), 75 μΙ de triton X100) durante duas horas. O tampão de saturação é substituído por 50 μΙ de anticorpo primário antifosfo Erk Vz (Cell Signaling Technology, referência 4377) diluído a 1/1000 em tampão PBS, 1% BSA, 0,3% triton X100. O anticorpo primário é incubado com as células durante uma noite a 4°C. Em seguida, é enxaguado por 3 lavagens de 200 μΙ de PBS e revelado com 0 auxílio de um anticorpo secundário anticoelho acoplado à Alexa Flúor 488 (Molecular Probes, referência A 11008) diluído a 1/5000 em tampão PBS, 1% BSA, 0,3% triton X100 durante 4 horas. O anticorpo secundário é em seguida enxaguado por 3 lavagens de 200 μΙ de PBS

52/59 e 100 μΙ de PBS ;e então acrescentado a cada poço. A fluorescência é lida por cima com o auxílio de uma leitora de placa de tipo EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin Elmer), utilizando o filtro FITC.

Essa técnica permite confirmar que o FGF-19 a 30 ng/ml induz a fosforilação de Erk1 /2 nas células Hep3b e que o 40-12 é capaz de bloquear essa estimulação desde a dose de 3 pg/ml (figura 9C), O FGF-2, assim como o soro são também capazes de induzir o sistema. Nesses 2 últimos, o anticorpo 40-12 inibe o efeito do FGF-2 e do soro em doses mais elevadas (30-100 pg/ml; figura 90).

A detecção de fosfo-Erk1/2 por ELISA também permitiu mostrar que anticorpos anti-FGF-R4 ativos no modelo da angiogênese in vitro são também capazes de bloquear entre 70 e 95% da fosforilação de Erk ¹Λ induzida pelo FGF-19 à dose de 3 pg/ml (figura 9D).

De maneira vantajosa, os anticorpos da presente invenção têm um efeito antagonista ao mesmo tempo sobre a angiogênese patológica associada ao desenvolvimento do tumor e sobre o crescimento tumoral hepático propriamente dito, em particular sobre um modelo de hepatocarcinoma. Exemplo 8: efeito antagonista do anticorpo 40-12 no modelo murino de câncer pancreático

Para esse modelo farmacológico, ratos fêmeas Rip-1 - Tag2 (Charles River Laboratory, França) de fundo genético C57BI/6J são utilizadas. Os animais têm a partir da semana 9, após nascer a água de bebida suplementada por 5% de sacarose. Os ratos são tratados da semana 10 à semana 12.5 em um protocolo de tratamento em intervenção, uma vez por semana por uma injeção por via subcutânea dos anticorpos anti-FGF-R4 4012 ou controle à dose de 25 mg/kg (figura 14A). Esse protocolo é aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal (Animal Care and Use Committee) de Sanofi-Aventis Pesquisa. As instalações zootécnicas, a atenção dedicada aos animais assim como os protocolos de tratamento estão em acordo com os princípios impostos pela convenção europeia sobre a proteção dos animais vertebrados e eutanasiados após o período de tratamento ou quando a carga tumoral e/ou os efeitos secundários obriga sua retirada do estudo.

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Para a medida da carga tumoral, os animais são eutanasiados no fim da experiência e os tumores são microdissecados a partir de pâncreas recentemente excisados. O volume tumoral em mm³ é medido como auxílio de base com corrediça, aplicando a fórmula [ volume = 0,52 x (largura)² x (comprimento)], a fim de se aproximar do volume de um esferoide. A carga tumoral por rato é calculada pelo acúmulo do volume de tumores de cada rato.

Para a análise histoquímica da densidade vascular, os animais são anestesiados, os pâncreas coletados, fixados durante uma noite em Accustain® (Sigma), depois passados na parafina. Cortes de 5 pm de espessura são preparados para cada amostra. As células endoteliais são detectadas pela incubação dos cortes com a tripsina (Zymed, referência 00-3003)a 37°C durante 10 min, depois com um anticorpo anti-CD31 de rato feito no rato e diluído a 1/50 (BD Pharmingen). Para revelar as regiões marcadas pelo anticorpo, os cortes são incubados com um anticorpo antirrato acoplado à biotina durante 30 minutos, depois com a estreptavidina acoplado à HRP durante também 30 min (Vectastain® ABC kit Vector) e enfim com DAB durante 5 minutos (Vector, referência SK4100). Os cortes são então marcados com a hematoxilina diluída a 1/10 (Dako, S-3309). As fotos são realizadas com o auxílio de uma câmera montada sobre um microscópio (Nikon, E-800) a um aumento total de 2000 vezes. As imagens são analisadas por um programa (Visiolab, Biocom). Os vasos sanguíneos no tumor são computados e classificados em função de sua superfície: os vasos pequenos entre 5 e 20 pm², os meios entre 21 e 100 pm² e os grossos a partir de 101 pm². Dois portaobjetos por pâncreas são analisados, a fim de determinar a densidade vascular correspondente ao número total de elementos marcados por campo.

Nesse modelo, o tratamento subcutâneo com o auxílio de anticorpos anti-FGF-R4 40-12 a 25 mg/kg uma vez por semana entre a décima e décima segunda semanas, permite reduzir a carga tumoral de 55% e de forma significativa (figura 11B) e com tendência a reduzir em 34 % o número de tumores por pâncreas (figura 11C), enquanto que o tratamento controle não tem nenhum efeito. Essa inibição do desenvolvimento tumoral, graças

54/59 ao anticorpo anti-FGF-R4 40-12 é acompanhada por um redução significativa de 31 % da densidade vascular total (figura 11 D) correspondente a uma redução observada do número de vasos sanguíneos no conjunto dos grupos de tamanho de vasos marcados com o auxílio de um anticorpo anti-CD31 (figura 11 D).

Esses resultados in vivo mostram claramente que um anticorpoFGF-R4 antagonista é capaz de inibir o recrutamento e a formação dos vasos sanguíneos no tumor. Essa inibição da vascularização tumoral se acompanha de uma redução do número de tumores por pâncreas e do volume tumoral total.

De maneira vantajosa, os anticorpos da presente invenção têm um efeito antagonista ao mesmo tempo sobre a angiogênese patológica e sobre o crescimento tumoral hepático (sobre um modelo de hepatocarcinoma) e pancreático.

Exemplo 9: reatividade cruzada do anticorpo em relação ao FGF-R4 humano, murino e de rato.

Em uma primeira etapa, experiências de competição de ligação foram realizadas. Para fazer isto, o FGF2 foi marcado no nível das 2 cisteínas livres com o auxílio de um AlexaFlúor® 488 nm C-5 maleimida (Molecular Probes, A10254), segundo as recomendações do fornecedor. Esse FGF2-AF488 a 10 ng/ml é capaz de se ligar sobre os FGF-R4 humanos expressos na superfície de células 300-19 transfectadas (figura 8). Essa ligação é específica, já que o acréscimo em excesso de FGF2 não marcado permite deslocar a interação FGF2/ FGF-R4 (figura 8A). A mesma experiência foi realizada, acrescentando doses crescentes do anticorpo 40-12 ou do anticorpo provas 64-12. Só o anticorpo antagonista 40-12 está apto a deslocar a ligação FGF2-AF488/FGF-R4 e isto, com uma IC₅₀ de 3500 ng/ml seja 23 nM mostrando que o efeito antagonista desse anticorpo seria devido à sua capacidade de deslocar a ligação FGF/FGF-R4.

Em uma segunda etapa e com a finalidade de determinar a aptidão do clone 40-12 a bloquear a ligação FGF/FGF-R4 em outras espécies que o Homem, uma experiência de dissociação foi realizada, utilizando-se os

55/59 pares FGF2/FGF-R4 de rato, de rato e humano em referência. Para fazer isto, FGF2 murino (R&D, referência 3139-FB-025) ou de rato (R&D, referência 3339-FB025) foi marcado da mesma forma que o FGF2 humano por um AlexaFlúor 488. As experiências de dissociação foram realizadas, utilizando as linhagens 300-19 transfectadas com os receptores FGF-R4 de camundongo ou de rato. Os resultados mostram que o anticorpo anti-FGFR4 antagonista 40-12 é capaz de dissociar a ligação FGF2/FGF-R4 em um sistema camundongo ou rato com a mesma eficácia que no sistema humano. Com efeito, as IC50 são de 3500, 4110 e 3940 ng/ml seja 23, 27 e 26 nM para os complexos FGF2/FGF-R4 humano, murino ou de rato respectivamente (figuras 13A, 13B e 13C, respectivamente). Essa capacidade de se ligar ao FGFR4 de roedores foi verificada por ELISA. Os anticorpos 40-12 se ligam também ao FGF-R4 humano e murino (figura 12).

Esses resultados indicam que o anticorpo anti-FGF-R4 40-12 poderá ser utilizado em modelos farmacológicos sobre roedores (pelo menos camundongo e rato) e que os resultados obtidos deveríam ser preditivos da eficácia no Homem,

Da mesma forma, estudos feitos sobre os anticorpos oriundos dos clones 8, 31, 33 e 36 mostram que esses anticorpos reconhecem, ao mesmo tempo o FGF-R4 humano e o FGF-R4 murino (Tabela 4 abaixo)

Tabela 4: parâmetros cinéticos de ligação dos anticorpos anti-FGF-R4 8, 31, e 36 medidos sobre Surface Plasmon Resonance (BIAacore 3000):

	sobre h-FGFR4-Histag	sobre m-FGFR4-Histag
	Kon (IVT’s¹)	Koff (s¹)	KD(M)	Kon (M‘¹s‘¹)	Koff (s'¹)	KD(M)
Clone 8	8,93E+05	2.92E-04	3.27E-10	1.20E+06	1.36E-04	1.15E-10
Clone 31	6.48E+05	9.80E-04	1,52E-09	9.14E+05	1.80E-03	1.97E-09
Clone 33	8.05E+05	6.17E-04	7.71E-10	1,01 E+06	7,04E-04	6,92E-10
Clone 36	2.44E+05	6,31 E-04	2.62E-O9	3.30E+05	7.52E-04	2.28E-09

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Exemplo 10: determinação do epitopo reconhecido pelo anticorpo anti-FGFR4

A- Determinação do epitopo reconhecido pelo anticorpo anti-FGF-R4 40-12.

Uma crivação foi realizada para determinar o domínio específico do FGF-R4 reconhecido pelo anticorpo 40-12 por dosagem ELISA. Graças à utilização de uma forma deletada do domínio D1 de FGF-R4 em ELISA, foi estabelecido que o anticorpo 40-12 interagindo no nível dos domínios D2-D3 de FGF-R4 (figura 12).

Uma segunda crivação foi realizada por dosagem ELISA, utilizando como antígeno de captura os construídos contendo seja o domínio D1 (SABVA4794) ou o domínio D2 (SABVA4796) ou o domínio D3 (SABVA4799) de proteína h FGF-R4 conforme descritos no exemplo 2. O antígeno de captura foi fixado sobre caixas immulon -4-enzyme- lonked (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). O hibridoma 40-12 foi em seguida acrescentado, depois detectado graças ao anticorpo de coelho antirrato IgG conjugado à peroxidase (Signa; referência A9044 - diluição a 1:50000). A revelação foi realizada com o substrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) e as medidas de densidade óptica (O.D.) realizadas a 450 nm. A tabela 5 resume os resultados obtidos:

Tabela 5: medida da ligação do anticorpo 40-12 nos diferentes subdomínios de FGF-R4.

Domínio estudado	D1 SABVA4794	D2 SABVA4796	D3 SABVA4799	D1-D3 FGFR4-FC
Sinal (O.D., 450 nm)	0,185	3,000	0,105	3,000

O anticorpo anti-FGF-R4 reconhece, portanto, o domínio D2 da parte extracelular da proteína FGF-R4.

Por outro lado, a proteína FGF-R4 -Fc desnaturada com SDS não é reconhecida pelo anticorpo 40-12 em análise Western Blot, o que implica que o epitopo alvejado pelo 40-12 sobre o domínio D2 de FGF-R4 é de tipo conformacional.

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B- Determinação do epitopo reconhecido pelos anticorpos anti-FGF-R4 8, 31, 33, 36

Uma crivação foi realizada para determinar o domínio específico do FGF-R4 reconhecido pelos anticorpo s 8, 31, 33, 36 por dosagem ELISA, 5 utilizando como antígeno de captura os construídos contendo seja os domínios D2 e D3 (SEQ ID N° 42), seja a proteína hFGF-R4 -Histag (SABVA4614, SEQ ID N°: 40). O antígeno de captura foi fixado sobre caixas Immulon-4-enzyme linked (VWR Scientific One, Swedesboro, NJ). O que flutua de culturas de HEK293 transfectadas transitoriamente por plasmídeos permito tindo a secreção dos anticorpo(s) 8, 31, 33, 36 foram em seguida acrescentados, depois detectados graças ao anticorpo de coelho anti-humano IgG conjugado à peroxidase (DakoCytomation, referência P0214-diluição a 1:5000). A revelação foi realizada com o substrato TMB-H202 (Interchim; referência UP664780) e as medidas de densidade óptica (O.D.) feitas a 450 15 nm. A tabela 6 abaixo resume os resultados obtidos.

Tabela 6: ligação dos anticorpos oriundos dos clones 8, 31, 33 e 36 ao FGFR4 total ou ao subdomínio D2-D3 (sinal OD a 450 nm)

	hFGFR4-Histag	hFGFR4(D2,D3)-Histag
Clone 8	3,898	3,860
Clone 31	3,859	3,741
Clone 33	3,752	3,621
Clone 36	3,751	3,616

Os anticorpos 8, 31, 33 e 36 reconhecem, portanto, o domínio D2-D3 da parte extracelular da proteína FGF-R4.

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Tabela 7: sequências utilizadas, obtidas e deduzidas.

	Sequências nucleotídicas	Sequências protéicas
Anticorpos 40-12
VH + CH	SEQ ID N° 1	SEQ IDN°2
VL + CL	SEQ ID N° 3	SEQ ID N° 4
VH	SEQ ID N° 5	SEQ ID N° 6
VL	SEQ ID N° 7	SEQ ID N° 8
CDR VH		SEQ IDN°9; 10; 11
CDR VL		SEQ ID N° 12; 13; 14
Anticorpos 64-12
VH + CH	SEQ ID N° 15	SEQ ID N° 16
VL + CL	SEQ ID N° 17	SEQ ID N° 18
VH	SEQ ID N° 19	SEQ ID N° 20
VL	SEQ ID N°21	SEQ ID N° 22
CDRVH		SEQ ID N° 23; 24; 25
CDR VL		SEQ ID N° 26; 27; 28
Sequências humanizadas
Cadeia leve 1	SEQ ID N° 29	SEQ ID N° 30
Cadeia leve 2	SEQ ID N° 31	SEQ ID N° 32
Cadeia pesada 1	SEQ ID N° 33	SEQ ID N° 34
Cadeia pesada 2	SEQ ID N° 35	SEQ ID N° 36
Cadeia pesada 3	SEQ ID N° 37	SEQ ID N° 38
Construções
hFGFR4-Histag	SEQ ID N° 30	SEQ ID N° 40
hFGFR4-Streptag	SEQ ID N° 68	SEQ ID N° 69
hFGFR4(D2D3)-Histaq	SEQ ID N°41	SEQ ID N° 42
mFGFR4-Histag	SEQ ID N°43	SEQ ID N° 44
hFGFR1-Fc	SEQ ID N° 45	SEQ ID N°46
hFGFR2-Fc	SEQ ID N° 47	SEQ ID N° 48
rFGFR4	SEQ ID N° 49	SEQ ID N° 50
Sequências atrações para estabelecimento linhagem clonal (exemplo 4)	SEQ ID N° 51; 52; 53; 54; 55; 56; 58 SEQ ID N°61; 62
Domínio transmembranário FGF-R4		SEQ ID N° 59; 60
Oligonucleotideos atrações tabela 1	SEQ ID N° 63; 64; 65; 66; 67

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Epitopo em domínio D2		SEQ ID N° 70
Anticorpo clone 8
Cadeia leve total Cadeia leve CDR	SEQ ID N° 71	SEQ ID N°72 SEQ ID N° 73; 74; 75
Cadeia pesada total Cadeia pesada CDR	SEQ ID N° 76	SEQ ID N° 77 SEQ ID N° 78; 79; 80
Anticorpo clone 31
Cadeia leve total Cadeia leve CDR	SEQ ID N° 81	SEQ ID N°82 SEQ ID N° 83; 84; 85
Cadeia pesada total Cadeia pesada CDR	SEQ ID N° 86	SEQ ID N°87 SEQ ID N° 88; 89; 90
Anticorpo clone 33
Cadeia leve total Cadeia leve CDR	SEQ ID N° 91	SEQ ID N° 92 SEQ ID N° 93; 94; 95
Cadeia pesada total Cadeia pesada CDR	SEQ ID N° 96	SEQ ID N° 97 SEQ ID N° 98; 99; 100
Anticorpo clone 36
Cadeia leve total Cadeia leve CDR	SEQ ID N° 101	SEQ IDN°102 SEQ IDN°103; 104; 105
Cadeia pesada total Cadeia pesada CDR	SEQ ID N° 106	SEQ ID N° 107 SEQ IDN°108; 109; 110
Subdomínios da parte extracelular de hFGF-R4 fundidos com o domínio Fc de lgG1
fGFGR4 D1::Fc	SEQ ID N° 111	SEQ IDN°112
fGFGR4 D2::Fc	SEQ ID N°113	SEQ IDN°114
fGFGR4 D3::Fc	SEQ ID N° 115	SEQ IDN°116
Sequência de região constante de lgG1 humano		SEQ IDN°117

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Antagonista do receptor FGF-R4, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo que se liga especificamente a FGF-R4.
2. Antagonista, de acordo com uma das reivindicações 1, caracterizado pelo fato de se ligar ao domínio D2-D3 do receptor FGF-R4.
3. Anticorpo, de acordo com uma das reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de se ligar ao domínio D2 do receptor FGF-R4.
4. Antagonista, de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ter um K_D alternadamente do receptor FGF-R4 determinado pela técnica Surface Plasmon Resonance (Biacore) inferior a 10E-8 M.
5. Antagonista, de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser ativo ao mesmo tempo contra FGF-R4 humano e FGF-R4 murino.
6. Antagonista, de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo e compreender pelo menos um CDR que apresenta uma sequência idêntica a uma das sequências SEQ ID N°: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 73, 74, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 88, 89, 90, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 108, 109 ou 110.
7. Antagonista, de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo e compreender os CDR de sequência SEQ ID N°: 9, 10, 11, 12, 13 e 14; ou 73, 74, 75, 78, 79 e 80; ou 83, 84, 85, 88, 89 e 90; ou 93, 94, 95, 98, 99 e 100; ou 103, 104, 105, 108, 109 e 110, na qual um dos CDR pode diferir de um a dois aminoácidos em relação a pelo menos uma das sequências citadas acima, contanto que o anticorpo mantenha sua especificidade de ligação.
8. Antagonista, de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo, cuja parte variável de sua cadeia pesada compreende uma sequência nucleotídica que apresenta pelo menos 80% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 5, 76, 86, 96 ou 106.
9. Antagonista, de acordo com uma das reivindicações prece2/4 dentes, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo, cuja parte variável de sua cadeia leve compreende uma sequência nucleotídica que apresenta 80% de identidade com a sequência SEQ ID N°: 7, 71, 81, 91 ou 101.
10. Antagonista, de acordo com uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo e pelo fato de sua sequência compreender as sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 2 e 4; ou 6 e 8; ou 72 e 77; ou 82 e 87; ou 92 e 97; ou 102 e 107.
11. Antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de induzir uma inibição das vias de sinalização celular controladas por FGF-R4.
12. Antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de induzir uma inibição da angiogênese.
13. Antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de induzir uma inibição da proliferação celular tumoral.
14. Antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de sua afinidade para FGF-R4 ser 10 vezes superior à sua afinidade para os outros receptores a FGF.
15. Antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo humanizado.
16. Antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo humano.
17. Antagonista, de acordo com a reivindicaçãolõ, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia variável leve que apresenta pelo menos 80% de identidade com uma das sequências polipeptídicas SEQ ID N°: 30 ou 32.
18. Antagonista, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de compreender uma cadeia variável pesada, que apresenta pelo menos 80% de identidade com uma sequência SEQ ID N°: 34, 36 ou 38.
19. Antagonista, de acordo com qualquer uma das reivindica3/4 ções precedentes, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo e pelo fato de ser conjugado a um agente citotóxico.
20. Utilização de um antagonista, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes no tratamento das doenças associadas a uma angiogênese patológica.
21. Utilização de um antagonista, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, no tratamento dos hepatocarcinomas ou de qualquer outro tipo de câncer hepático.
22. Utilização de um antagonista, como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes no tratamento do câncer do pâncreas.
23. Composição farmacêutica, compreendendo um antagonista, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19 e excipientes.
24. Método de tratamento de uma doença, ligada a uma angiogênese patológica, caracterizado pelo fato de compreender a administração no paciente de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
25. Método de tratamento de um câncer, caracterizado pelo fato de compreender a administração no paciente de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
26. Linhagem celular, produzindo anticorpos, como definidos nas reivindicações 1 a 19.
27. Processo de produção de um anticorpo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de compreender a colocação em cultura de uma linhagem celular, como definida na reivindicação 26.
28. Medicamento compreendendo um antagonista, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 19.
29. Polinucleotídeo codificando para um polipeptídeo, que apresenta pelo menos 80% de identidade com uma das sequências SEQ ID N°: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 30, 32, 34, 36, 38, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 107, 108, 109 ou 110.

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30. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de apresentar uma sequência que apresenta pelo menos 80% de identidade com uma das sequências SEQ ID N°: 1, 3, 5, 7, 29,
31, 33, 35 ou 37, 71, 76, 81, 86, 91, 96, 101 ou 106.

5 31. Vetor recombinante, compreendendo um ácido nucleico, como definido em qualquer uma das reivindicações 29 e 30.
32. Célula hospedeira, compreendendo um vetor, como definido na reivindicação 31.