CN103784954A - Fgf-r4受体特异性拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及FGF-R4受体特异性拮抗剂。本发明涉及FGF-R4受体特异性拮抗剂分子，其能够抑制所述受体的活性。所述拮抗剂特别是FGF-R4特异性抗体，其能够抑制所述受体的活性。本发明还涉及所述抗体的治疗用途，特别是在血管发生领域中及在某些类型的癌症的治疗中。

Description

FGF-R4受体特异性拮抗剂
本申请是申请日为2009年07月07日、中国申请号为200980134842.3、发明名称为“FGF-R4受体特异性拮抗剂”的发明申请的分案申请。
本发明的主题是对FGF受体4(FGF-R4)特异性的拮抗剂，使得它有可能抑制这种受体的活性。这些拮抗剂特别是对FGF受体4(FGF-R4)特异性的抗体。
本发明的主题还有这些拮抗剂的治疗用途，特别是在血管发生领域中及在某些类型的癌症的治疗中。
FGF（成纤维细胞生长因子）是最早记载为能够在体外和在体内刺激血管细胞增殖，迁移和分化的分子之一。有大量的文献描述FGF在体外和在体内对血管发生和毛细血管形成的诱导。通过促进由肿瘤募集的血管形成，FGF还涉及肿瘤血管发生。
人FGF家族包括至少23个成员，它们都具有保守的120个氨基酸的中央域。它们如下发挥它们的生物学活性，即与它们的酪氨酸激酶型高亲和力受体(FGF-R)和硫酸类肝素蛋白聚糖（即在大多数细胞表面和细胞外基质上存在的成分）（低亲和力结合位点）相互作用，从而形成三元复合物。有些FGF具有对数种FGF-R的高亲和力，而其它特异性活化一种受体或一种受体同等型。
FGF-R4特异性配体已经由Xie等人（Cytokine，1999，11：729-35）鉴定。这种称作FGF19的配体是专门对FGF-R4具有高亲和力的配体，而且它对受体的结合是肝素依赖性的或硫酸类肝素依赖性的。FGF19已经在成年动物中鉴定到，只在肝细胞和小肠中，它在那里调节肝对胆汁酸的合成。它表现为胚胎发育期间涉及的生长因子，而且表现为涉及斑马鱼和人类中的胎脑发育。
其它FGF-R4配体也有记载，诸如FGF1或FGF2。这些配体强烈活化FGF-R4，但是不是FGF-R4特异性的：它们也结合其它FGF-R（Ornitz等，J.Biol.Chem.，1996，271：15292-7）。
FGF-R4受体的活化导致数种类型的细胞信号传导。其中，最常规的形式对应于FGF刺激FGF-R4后由磷酸化级联介导的信号传导途径的建立。此诱导导致FGF-R4的酪氨酸激酶域的自磷酸化，并用来启动依赖其它信号传导蛋白（诸如AKT，p44/42，JNK等）磷酸化的细胞内信号传导途径。此磷酸化介导的信号传导随细胞类型和这些细胞的表面处存在的共同受体或粘附分子而变化（Cavallaro等，Nat.Cell Biol.3/7，650-657，2001；Stadler等，Cell.Signal.18/6，783-794，2006；Lin等，J Biol Chem.，14：27277-84，2007）。对于FGF-R（包括FGF-R4）重要的另一种信号传导方法是受体在活化后与它的配体一起内化。此机制不依赖于受体的酪氨酸激酶活性，但是依赖于FGF-R4的短C端序列（Klingenberg等，J.Cell Sci.，113/Pt10：1827-1838，2000）。
文献中记载了四种不同形式的FGF-R4。全长形式在位置388处有2种多态变体，即FGF-R4Gly388，它是受体的正常形式，和Arg388形式，它记载于数种肿瘤的背景中（Bange等，Cancer Res.62/3，840-847，2002；Spinola等，J Clin Oncol23，7307-7311，2005；Stadler等，Cell.Signal.18/6，783-794，2006）。还发现了在乳腺肿瘤细胞中表达的可溶形式（Takaishi等，BiochemBiophys Res Commun.，267：658-62，2000）。已经在某些垂体腺瘤中记载了在细胞外部分中截短的第四种形式（Ezzat等，J Clin Invest.，109：69-78，2002）。
FGF-R4主要在自内胚层衍生的组织（诸如胃肠道，胰，肝，肌肉和肾上腺）中表达。
在文献中已知FGF-R4具有数种细胞作用，下面描述主要的三项：
第一，这种受体涉及在体外和在体内控制多种细胞分化过程，诸如骨骼肌分化和再生、间充质组织分化、或骨发生，或另外涉及出生后肝发育期间的肝泡(alveoli)形成。
第二，FGF-R4记载于控制胆汁酸和胆固醇稳态，而且认为涉及控制脂肪过多。另外，在体外和在体内胆汁酸生成和胆固醇生成之间的平衡受FGF-R4控制。
第三，FGF-R4涉及某些肿瘤现象，诸如肝细胞癌瘤或结肠癌发生，或乳腺纤维腺瘤细胞或乳腺癌上皮细胞增殖，诸如乳腺或结肠直肠癌瘤细胞运动。FGF-R4在肿瘤中的作用主要与多态性（Gly388Arg）的出现有关，所述多态性与乳腺和结肠直肠肿瘤（Bange等，Cancer Res.62/3，840-847，2002）、前列腺肿瘤（Wang等，Clin.Cancer Res.10/18，6169-6178，2004）或肝肿瘤（Nicholes等，Am.J.Pathol.160/6，2295-307，2002）中肿瘤进展的加速有关。此多态性还与肉瘤（Morimoto等，Cancer98/10，2245-2250，2003）、肺腺癌（Spinola等，J Clin Oncol23，7307-7311，2005）或鳞状肉瘤（da CostaAndrade等，Exp Mol Pathol82，53-7，2007）病例中的预后差有关。FGF-R4的过表达还记载于某些胰腺癌系（Shah等，Oncogene21/54，8251-61，2002），而且与星形细胞瘤恶性有关（Yamada等，Neurol.Res.24/3，244-8，2002）。另外，在结肠肿瘤异种移植物体内模型中或在肝细胞癌瘤模型中使用抗FGF19单克隆抗体显示出FGF19的失活，而且因此阻断FGF-R4活化在结肠或肝癌治疗中可能是有益的。
文献中公认FGF/FGF-R1和FGF/FGF-R2对参与正常或病理背景中的新血管形成。然而，从未研究FGF-R4在控制这种细胞现象中的潜在作用。事实上，直到现在才提出血管发生的活化是由FGF-R1和/或FGF-R2介导的（Presta等，Cytokine Growth Factor Rev.，16：159-78，2005）。
文献中记载了FGF-R4拮抗剂的例子，特别是：小分子，但是它们不是特异性靶向FGF-R4的，如此导致不良作用。如此，Thompson等人（Thompson等，J Med Chem.，43：4200-11，2000）记载了抑制数种FGF-R和还有其它受体酪氨酸激酶的酪氨酸激酶域抑制性化学小分子。申请WO2007/080325中也记载了通过与FGF-R细胞外部分结合来抑制FGF-R的化学小分子。
还研究了抗体，诸如国际申请WO2005/066211和WO2008052796或Chen等人（Hybridoma24/3，152-159，2005）中记载的抗FGFR1和/或抗FGFR4抗体。申请WO2005/037235记载了作为FGF-R拮抗剂的抗体，其用于治疗肥胖症和糖尿病。另外，申请WO03/063893中记载了作为激动剂的抗FGF-R4抗体。
本发明的主题是FGF-R4受体拮抗剂，其特征在于它特异性结合所述FGF-R4受体。
有利地，所述拮抗剂是对FGF-R4受体特异性的抗体。
在一个实施方案中，作为本发明主题的拮抗剂结合FGF-R4受体的D2-D3域。在一个有利的实施方案中，作为本发明主题的拮抗剂结合FGF-R4受体的D2域。在一个甚至更有利的实施方案中，所述拮抗剂结合序列SEQ ID No.70。
有利地，FGF-R4受体特异性拮抗剂具有通过Biacore技术测定的小于10-8M的、小于5x10-9M的、小于2x10-9M的或小于1x10-9M的关于FGF-R4受体的KD。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂对人FGF-R4和鼠FGF-R4都有活性。
在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂同时对人FGF-R4，小鼠FGF-R4和大鼠FGF-R4有活性。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含至少一个CDR，该CDR具有与SEQ ID No.9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90，93，94，95，98，99，100，103，104，105，108，109或110相同的序列，或包含至少一个CDR，该CDR的序列与序列SEQ ID No.9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90，93，94，95，98，99，100，103，104，105，108，109或110相比相差一个或两个氨基酸，前提是该抗体保留其结合特异性。
在一个特别有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列为SEQ ID No.9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90，93，94，95，98，99，100，103，104，105，108，109或110的CDR或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的CDR，前提是这不改变抗体的FGF-R4受体结合特异性。
在一个有利的实施方案中，本发明的抗体包含至少一条重链和至少一条轻链，所述重链包含氨基酸序列选自下组的三个CDR序列：SEQ ID No.9、10和11；或73、74和75；或83、84和85；或93、94和95；或103、104和105；所述轻链包含氨基酸序列选择下组的三个CDR序列：SEQ ID No.12、13和14；或78、79和80；或88、89和90；或98、99和100；或108、109和110。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体的重链可变区包含与序列SEQ ID No.6，77，87，97或107具有至少80%，90%，95%或99%同一性的序列。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体的轻链可变区包含与序列SEQ ID No.8，72，82，92或102具有至少80%，90%，95%或99%同一性的序列。
本发明的主题还有包含如下重链的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，所述重链包含由与序列SEQ ID No.5，76，86，96或106具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷酸序列编码的可变区。
本发明的主题还有包含如下轻链的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，所述轻链包含由与序列SEQ ID No.7，71，81，91或101具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷酸序列编码的可变区。
本发明的主题还有包含如下重链的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，所述重链包含多肽序列SEQ ID No.6，77，87，97或107的可变区。
本发明的主题还有包含如下轻链的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，所述轻链包含多肽序列SEQ ID No.8，72，82，92或102的可变区。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含由核苷酸序列SEQ ID No.5和7，或71和76，或81和86，或91和96，或101和106编码的序列。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含多肽序列SEQ ID No.6和8，或72和77，或82和87，或92和97，或102和107。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含与SEQID No.2和/或SEQ ID No.4；或SEQ ID No.72和/或SEQ ID No.77；或SEQ IDNo.82和/或SEQ ID No.87；或SEQ ID No.92和/或SEQ ID No.97；或SEQ IDNo.102和/或SEQ ID No.107至少80%，90%，95%或99%相同的序列。
在一个特别有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含由与序列SEQ ID No.1至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列编码的重链。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体拮抗剂抗体，其包含与序列SEQID No.2至少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的重链。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含由与序列SEQ ID No.3至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列编码的轻链。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含与序列SEQ ID No.4至少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的轻链。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体，其包含由核苷酸序列SEQ ID No.1和3编码的序列。
在一个甚至更有利的实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂抗体包含如下的重链和轻链，所述重链包含序列SEQ ID No.2且所述轻链包含序列SEQ IDNo.4。
由序列SEQ ID No.2作为重链和序列SEQ ID No.4作为轻链构成的抗体在本申请的剩余部分中会称作40-12。
在本发明的一个实施方案中，FGF-R4特异性抗体同时对人FGF-R4，小鼠FGF-R4和大鼠FGF-R4有活性。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对AKT/p38细胞途径的抑制。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对Erk1/2细胞途径的抑制。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对受FGF-R4控制的细胞信号传导途径的抑制。
在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对肿瘤细胞增殖的抑制。
在又一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂诱导对血管发生的抑制。
在另一个特别有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂对FGF-R4的亲和力比它对其它FGF受体的亲和力大10倍。
在一个特别有利的实施方案中，依照本发明的抗体是FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体。
在一个实施方案中，FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体包含可变区由与序列SEQ ID No.29或序列SEQ ID No.31至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列编码的轻链。
在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体包含可变区与序列SEQ ID No.30或序列SEQ ID No.32至少80%，90%，95%或99%相同的轻链。
在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体包含可变区由与核苷酸序列SEQ ID No.29或序列SEQ ID No.31相同的序列编码的轻链。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体，其包含可变区由与序列SEQ ID No.33，序列SEQ ID No.35或序列SEQ ID No.37至少80%，90%，95%或99%相同的序列编码的重链。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体，其包含可变区与序列SEQ ID No.34，序列SEQ ID No.36或序列SEQ ID No.38至少80%，90%，95%或99%相同的重链。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体，其包含由核苷酸序列SEQ ID No.33和/或SEQ ID No.35和/或SEQ ID No.37编码的重链。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人源化拮抗剂抗体，其中序列SEQ ID No.30或32的人源化序列与序列SEQ ID No.34，36或38的人源化序列组合使用。
在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ IDNo.73，74，75，78，79和80的CDR或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的CDR，前提是这不改变抗体的FGF-R4受体结合特异性。
在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ IDNo.83，84，85，88，89和90的CDR或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的CDR，前提是这不改变抗体的FGF-R4受体结合特异性。
在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ IDNo.93，94，95，98，99和100的CDR或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的CDR，前提是这不改变抗体的FGF-R4受体结合特异性。
在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ IDNo.103，104，105，108，109和110的CDR或序列与上述序列相比相差一个或两个氨基酸的CDR，前提是这不改变抗体的FGF-R4受体结合特异性。
在本发明的一个优选的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含序列SEQ ID No.83，84，85，88，89和90的CDR。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体是人抗体，其重链可变区包含与序列SEQ ID No.76，86，96或106具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷酸序列。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体是人抗体，其轻链可变区包含与序列SEQ ID No.71，81，91或101具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷酸序列。
本发明的主题还有包含如下重链的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，所述重链包含由与序列SEQ ID No.77，87，97或107具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷酸序列编码的可变区。
本发明的主题还有包含如下轻链的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，所述轻链包含由与序列SEQ ID No.72，82，92或102具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷酸序列编码的可变区。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，其包含由核苷酸序列SEQ ID No.71和76或核苷酸序列SEQ ID No.81和86或核苷酸序列SEQ ID No.91和96或核苷酸序列SEQ ID No.101和106编码的序列。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，其包含多肽序列SEQ ID No.72和77或多肽序列SEQ ID No.82和87或多肽序列SEQ IDNo.92和97或多肽序列SEQ ID No102和107。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体包含与SEQID No.72和/或SEQ ID No.77至少80%，90%，95%或99%相同的序列。
在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体包含与SEQ ID No.82和/或SEQ ID No.87至少80%，90%，95%或99%相同的序列。
在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体包含与SEQ ID No.92和/或SEQ ID No.97至少80%，90%，95%或99%相同的序列。
在另一个有利的实施方案中，FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体包含与SEQ ID No.102和/或SEQ ID No.107至少80%，90%，95%或99%相同的序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的主题是如下的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，其包含由与序列SEQ ID No.82至少80%，90%，95%或99%相同的核苷酸序列编码的轻链和包含与序列SEQ ID No.87至少80%，90%，95%或99%相同的多肽序列的重链。
甚至更优选地，本发明的主题是如下的FGF-R4受体特异性人拮抗剂抗体，其包含有核苷酸序列SEQ ID No.82和87编码的序列。
由序列SEQ ID No.77作为重链和序列SEQ ID No.72作为轻链构成的抗体在本申请的剩余部分中会称作克隆8。
由序列SEQ ID No.87作为重链和序列SEQ ID No.82作为轻链构成的抗体在本申请的剩余部分中会称作克隆31。
由序列SEQ ID No.97作为重链和序列SEQ ID No.92作为轻链构成的抗体在本申请的剩余部分中会称作克隆33。
由序列SEQ ID No.107作为重链和序列SEQ ID No.102作为轻链构成的抗体在本申请的剩余部分中会称作克隆36。
本发明的范围不限于包含这些序列的抗体。事实上，所有特异性结合FGF-R4的对这种受体具有拮抗作用的抗体都是本发明的范围的一部分。
本发明的主题还有偶联至细胞毒剂的FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体。
本发明的一个主题是FGF-R4受体特异性拮抗剂在治疗与血管发生有关的疾病中的用途。
本发明的一个主题是FGF-R4受体特异性拮抗剂在治疗癌症中的用途。
本发明的一个主题是FGF-R4受体特异性拮抗剂在治疗肝癌瘤(hepatocarcinomas)或任何其它类型肝癌中的用途。
本发明的一个主题是FGF-R4受体特异性拮抗剂在治疗胰腺癌中的用途。
本发明的一个主题是如下的FGF-R4受体特异性抗体，其供治疗与血管发生有关的疾病和治疗肝癌瘤或任何其它类型肝癌二者使用。
本发明的一个主题是如下的FGF-R4受体特异性抗体，其供同时治疗与血管发生有关的疾病，治疗肝癌瘤或任何其它类型肝癌，及治疗胰腺癌，或表达FGF-R4的胃肠道器官或任何其它器官的癌症使用。
本发明的一个主题是包含FGF-R4受体特异性拮抗剂和赋形剂的药物组合物。
本发明的一个主题是治疗癌症的方法，包括给患者施用FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体。
本发明的一个主题是治疗与血管发生病理性升高有关的疾病的方法，包括给患者施用FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体。
本发明的一个主题是选择FGF-R4受体特异性拮抗剂单克隆抗体的方法，其包括下面的步骤：
a.给小鼠免疫接种，
b.自小鼠取出淋巴结，并
c.筛选杂交瘤上清液。
本发明的一个主题是生成FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体的细胞系。
本发明的一个主题是生产FGF-R4受体特异性拮抗剂抗体的方法，其包括培养生成FGF-R4受体拮抗剂抗体的细胞系。
本发明的一个主题是包含FGF-R4受体特异性拮抗剂的药物。
本发明的主题还有编码选自下组的多肽的多核苷酸：SEQ ID No.2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，30，32，34，36，38，72，73，74，75，77，78，79，80，82，83，84，85，87，88，89，90，92，93，94，95，97，98，99，100，102，103，104，105，107，108，109和110，以及与这些序列之一至少80%，90%，95%或99%相同的序列。
本发明的一个主题是包含如上所述多核苷酸或编码如上所述多肽的重组载体。
为了能够表达作为本发明的一个主题的FGF-R4受体拮抗剂抗体的重链和/或轻链，将编码所述链的多核苷酸插入表达载体。这些表达载体可以是质粒，YAC，粘粒，逆转录病毒，EBV衍生附加体，和本领域技术人员认为适合于表达所述链的任何载体。
本发明的一个主题是包含如上所述重组载体的宿主细胞。
发明详述
本发明的一个主题是对FGF-R4特异性（与FGF-R1、R2或R3不起交叉反应）的抗体用于抑制血管发生和肿瘤生长的用途。
出乎意料地，本发明显示了FGF-R4在控制血管发生中发挥积极的且特异性的作用。
先前从未显示或提出FGF-R4的这种功能。因此，这种受体可用作治疗展现血管发生失调的病理的靶物。因此，能够调控所述受体的活性的FGF-R4配体是众多血管发生相关病理的潜在治疗剂。
因此，本发明可用于治疗所有涉及血管发生失调及需要抑制血管发生的病理。所涵盖的病理可以是癌症（其中依照本发明的拮抗剂用作肿瘤血管发生抑制剂）或记载有血管发生失调的病理，诸如老年性黄斑变性或ARMD，炎性疾病诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、结肠炎、溃疡或肠的任何炎性疾病，动脉粥样硬化或肥胖症的治疗。
在抑制肿瘤生长中也例示了这些抗体的用途。因此，依照本发明的拮抗剂可用于治疗某些涉及FGF-R4失调的癌症，更特别地是肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、皮肤癌或食管癌。
依照本发明的拮抗剂的主要优点之一在于特异性针对FGF受体中的FGF-R4。这种特异性使之有可能限制抑制酪氨酸激酶域的化学小分子可能具有的不良作用。另外，由于FGF-R4不是遍在表达的，而是具体地在内皮细胞上表达，例如肝细胞、胆囊细胞、乳腺细胞、前列腺细胞、卵巢细胞、胰腺细胞或肾细胞，因此这提供了在限制副作用的情况中治疗涉及FGF-R4活性失调的疾病的方法。
术语“拮抗剂”指任何能够降低或完全抑制FGF-R4活性的配体。因此，这种拮抗性化合物也称作FGF-R4抑制剂。
这种拮抗剂可以是任何FGF-R4配体，诸如嵌合分子、重组蛋白、寡糖、多糖、寡核苷酸或抗体，其能够特异性结合FGF-R4受体，但排斥任何其它FGFR。
因此，本发明的一个主题是FGF-R4特异性拮抗剂。依照本发明，特异性结合FGF-R4的拮抗剂指不结合其它FGF受体（即FGF-R1、FGF-R2或FGF-R3）的配体。特别地，FGF-R4特异性抗体指不展现与FGF-R1、FGF-R2或FGF-R3的任何交叉反应的抗体。
“特异性结合”指对一种受体的结合强度与另一种受体相比（在本案中指对FGF-R4的结合与对FGF-R1、FGF-R2或FGF-R3的可能的结合之间）相差至少10倍。
在本发明的一个实施方案中，FGF-R4配体是寡糖或多糖。
“寡糖”指任何含有3个至10个单糖单元的糖聚合物。存在天然寡糖（诸如例如果糖寡糖(FOS)）和合成寡糖（诸如例如肝素模拟物抗血栓药）。
术语“多糖”指任何由通过糖苷键彼此连接的超过10个单糖构成的聚合物。存在天然多糖（诸如例如粘多糖、岩藻多糖(fucoids)、角叉菜胶或细菌表多糖），正如合成多糖。如此，低分子量岩藻多糖(fucoidans)或高硫酸化表多糖(exopolysaccharide)显示出促血管发生活性（Chabut等，Mol Pharmacol.，2003，64：696-702；Matou等，Biochem Pharmacol.，2005，69：751-9）。相反，肝素衍生的低硫酸化寡糖或硫酸磷酸甘露戊糖可具有抗血管发生特征（Parish等，1999，15：3433-41；Casu等，J Med Chem.，2004，12：838-48）。
在本发明的一个实施方案中，FGF-R4配体是抗体。
术语“抗体”指任何类型的抗体或衍生分子，诸如多克隆和单克隆抗体。.自单克隆抗体衍生的分子包括人源化抗体、人抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、抗体片段、纳米抗体等。
在本发明的一个实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂是多克隆抗体。
“多克隆抗体”指如下的抗体，其是自源自数个B淋巴细胞克隆且识别一系列不同表位的抗体混合物生成的。
在一个有利的实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂是单克隆抗体。
“单克隆抗体”指如下的抗体，其是自衍生自单一类型B淋巴细胞的、克隆扩增的基本上同质的抗体群获得的。除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变外，构成这种群体的抗体是相同的。这些抗体针对单一表位，因此是高度特异性的。
术语“表位”指抗原上抗体所结合的位点。如果抗原是聚合物（诸如蛋白质或多糖），那么表位可以由连续的或不连续的残基构成。
在本发明的一个有利的实施方案中，抗FGF-R4拮抗剂抗体结合属于FGF-R4受体D2-D3域的表位。
在一个甚至更有利的实施方案中，所述抗体结合FGF-R4受体的包含氨基酸144至365的域中包括的表位。
在一个甚至更有利的实施方案中，所述抗体结合FGF-R4受体D2域中包括的表位，此表位对应于序列SEQ ID No.70中描述的氨基酸145至242。
抗体（也称作免疫球蛋白）由通过二硫桥连接的两条相同的重链(“VH”)和两条相同的轻链(“VL”)构成。每条链含有恒定区和可变区。每个可变区包含三个称作“互补决定区”(“CDR”)或“高变区”的区段，它们主要负责对抗原的表位的结合。
术语“VH”指抗体的免疫球蛋白重链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab)’片段的重链。
术语“VL”指抗体的免疫球蛋白轻链的可变区，包括Fv、scFv、dsFv、Fab、Fab’或F(ab)’片段的轻链。
术语“抗体片段”指所述抗体的任何部分：Fab（抗原结合片段），Fv，scFv（单链Fv），Fc（可结晶片段）。优选地，这些功能性片段会是Fv、scFv、Fab、F(ab')2、Fab'、scFv-Fc或双抗体类型的片段，它们一般具有与衍生它们的嵌合或人源化单克隆抗体相同的结合特异性。依照本发明，本发明的抗体片段可通过下述得自嵌合或人源化单克隆抗体，诸如用酶消化，例如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，和/或通过化学还原来切割二硫桥。
术语“CDR区或CDR”意图指如Kabat等（Kabat等，Sequences of proteinsof immunological interest，第5版，U.S.Department of Health and HumanServices，NIH，1991，及后来的版本）定义的免疫球蛋白重链和轻链高变区。有3个重链CDR和3个轻链CDR。术语CDR在本文中在适当时用于指这些区中的一个或多个或者甚至所有这些区，它们含有负责抗体对它所识别的抗原或表位的亲和力结合的大多数氨基酸残基。可变域中最保守的区称作FR（“框架”）区或序列。
在本发明的另一个实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂是嵌合抗体。
术语“嵌合抗体”指如下的抗体，其中恒定区或其部分发生改变、替换或交换，使得可变区连接至不同物种的或属于另一抗体类或亚类的恒定区。
术语“嵌合抗体”也指如下的抗体，其中可变区或其片段发生改变、替换或交换，使得恒定区连接至不同物种的或属于另一抗体类或亚类的可变区。
用于生成嵌合抗体的方法是本领域技术人员已知的。参见例如Morrison，1985，Science，229：1202；Oi等，1986，Bio Techniques，4：214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods，125：191-202；美国专利No.5,807,715；4,816,567；和4,816,397。
这些嵌合型式的抗体可包含VL和VH可变区与人起源的Cκ和CH(IgG1)恒定域的融合物，从而生成嵌合单克隆抗体。
CH(IgG1)域也可以通过点突变来修饰，从而提高Fc片段对FcγRIIIa受体的亲和力及由此提高抗体的效应器功能（Lazar等，2006，Proc.Natl.Acad.Sci.USA103：4005-4010；Stavenhagen等，2007，Cancer Res.67：8882-8890）。
本发明包括人源化型式的抗体。
术语“人源化抗体”指如下的抗体，其主要含有人免疫球蛋白序列。此术语一般指通过掺入人序列或在人序列中找到的残基而经过修饰的非人免疫球蛋白。
一般地，人源化抗体包含一个或通常两个如下的可变域，其中所有或部分CDR区对应于自非人亲本序列衍生的部分，且其中所有或部分FR区是自人免疫球蛋白序列衍生的。然后，人源化抗体至少可以包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，特别是所选择的人免疫球蛋白模板的一部分。
因此，目的是使抗体在人体中的免疫原性最小化。因此，有可能的是，一个或多个CDR中的一个或两个氨基酸可以用对人宿主的免疫原性较低的氨基酸修饰，且不实质性降低抗体对FGF-R4的特异性结合功能。类似地，框架区的残基可以不是人的，而且它们有可能是未修饰的，因为它们不促成抗体的免疫原性潜力。
本领域技术人员知道数种人源化方法可用于修饰非人亲本抗体，从而得到对人的免疫原性较低的抗体。不必要求与人抗体的整体序列相同。这是因为整体序列相同不必然是免疫原性降低的预测指标，而且对有限数目的残基的修饰可导致人源化抗体在人体中具有大大降低的免疫原性潜力（MolecularImmunology，2007，44，1986-1998）。
所述各种方法有例如CDR嫁接（EPO0239400；WO91/09967；及美国专利No.5,530,101和5,585,089）、表面重建（EPO0592106；EPO0519596；Padlan，1991，Molec Imm28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Prot Eng7(6)：805-814；及Roguska等，1994，PNAS91：969-973）或链改组（美国专利No.5,565,332）等。
本发明特别地涉及如下的人源化抗体，它的可变部分是依照下面的技术修饰的：
通过与蛋白质数据库比较来鉴定与抗FGF-R4小鼠抗体40-12的相应链最相似的轻链和重链（H.M.Berman，J.Westbrook，Z.Feng，G.Gilliland，T.N.Bhat，H.Weissig，I.N.Shindyalov，P.E.Bourne，Nucleic Acids Research，2000，28：235-242）。序列比对使用BLAST算法（J Mol Biol.1990Oct215：403-410）。这些三维结构分别对应于PDB代码1NDM和1ETZ，它们用于构建可变域轻链和重链的同源性模型。随后使用MOE（Molecular Operating Environment，Chemical Computing Group，Quebec，Canada）软件中的标准规程将这些三维模型能量最小化。随后用Amber软件（D.A.Case，T.E.Cheatham，III，T.Darden，H.Gohlke，R.Luo，K.M.Merz，Jr.，A.Onufriev，C.Simmerling，B.Wang和R.Woods，J.Computat.Chem.2005，26：1668-1688）对抗体的这些（能量）最小化三维模型实施分子动力学(MD)模拟。这种模拟是在广义Born隐含溶剂中以温度500K、时程1.1纳秒用应用于蛋白质骨架原子的调和约束(harmonic constraint)进行的（Gallicchio和Levy，J Comput Chem2004，25：479-499）。如此，自这个第一次模拟提取10种不同构象，即模拟的最后一纳秒期间每100皮秒一个三维构象。然后在广义Born隐含溶剂中以温度27℃不约束蛋白质骨架地对这10种不同构象中每一个进行分子动力学模拟2.3纳秒。使用SHAKE算法（Barth等，J Comp Chem，1995，16：1192-1209）来约束涉及氢原子的键，时间步为1飞(10-15)秒，而且基于Langevin方程以恒定体积和恒定温度27℃运行模拟。对于10次分子动力学模拟中每一次，然后将以每皮秒一次的频率提取的最后2000种构象用于对要人源化的抗体的每个氨基酸定量原子位置相对于氨基酸的平均或medoid构象的偏差。使用MOE软件的科学矢量语言(SVL)来编码下文描述的所有分析。氨基酸的medoid构象指自与平均构象最接近的分子动力学衍生的构象，而平均构象是自氨基酸的所有构象的原子位置计算得到的。用于检测medoid构象的距离是氨基酸的两种构象的原子之间的标量距离的均方根(RMSD)。类似地，氨基酸的一种构象的原子位置相对于medoid构象的偏差通过计算模拟的一种构象的氨基酸的原子与medoid构象的相同原子之间的标量距离的RMSD来定量。随后，通过将给定氨基酸(i)的原子位置在所有10次分子动力学模拟上平均的RMSD(Fi)与抗体的所有氨基酸的位置在所有10次分子动力学模拟上平均的RMSD(Fm)比较，决定氨基酸的柔性是否足够被认为能够潜在与T细胞受体相互作用及触发免疫系统活化。如果氨基酸i的柔性得分Zi（其定义为Zi=(Fi–Fm)/Fm）超过0.15，那么它被认为是柔性的。如此，除了抗原互补决定区(CDR)及其紧邻区，抗体可变域中的45个氨基酸被鉴定为柔性的。CDR的紧邻区定义为α碳距离CDR的α碳5埃
Figure BDA0000474722580000151
或更短的任何氨基酸。
然后将抗体的60个最柔性的氨基酸在20纳秒(10x2ns)模拟期间的动作与人抗体种系的49种同源性模型中每一种使用相同方案运行10次分子动力学模拟(10x2ns)得到的相应氨基酸的动作比较。60个最柔性的氨基酸排除抗原互补决定区(CDR)及其紧邻区。49种人抗体种系模型是通过系统组合7种最频繁的人轻链（vk1，vk2，vk3，vk4，vλ1，vλ2，vλ3）和7种最频繁的人重链（vh1a，vh1b，vh2，vh3，vh4，vh5，vh6）而构建的（Nucleic Acids Research，2005，Vol.33，Database issue D593-D597）。
如下来定量要人源化的抗体与49种人种系模型的相似性，即借助分辨率为
Figure BDA0000474722580000152
的一种独特三维立体网格在10次分子动力学模拟的过程里对抗体的60个柔性氨基酸的特定原子的位置采样。这叫作四维相似性。所使用的三维网格由445-740个点构成，而且使用与PDB代码8FAB对应的人抗体的三维结构来初始化。8FAB结构还用于在三维网格中定位要采样的抗体的所有构象。为此目的，将抗体的分子动力学的medoid构象叠加到8FAB结构上。此叠加包括比对两种构象的惯性的力矩，接着优化两种构象的α碳原子之间的标量距离。使用相同的方法将抗体的分子动力学的所有剩余构象叠加到medoid构象上。
实施两种类型的采样，这为一对所比较的抗体产生两种相似性（静电相似性和亲脂相似性）。然后将这两种相似性相加以获得总相似性。第一种采样（即静电采样）考虑氨基酸侧链的所有原子。通过对氨基酸侧链的原子应用用原子部分电荷加权的三维Gaussian函数f(x)获得网格的一个点（x）中的值，如Amber99力场（Cieplak，J.等，J.Comp.Chem.2001，22：1048-1057）中记载的。将f(x)函数应用于3个Cartesian坐标轴，并对应于下面的公式：
Figure BDA0000474722580000161
其中x和u分别为网格点x和采样原子的Cartesian坐标，而s=r/1.6（r=原子的共价半径）。对氨基酸的所有构象重复采样，并在三维网格的所有点x处对获得的结果取平均。第二种采样（即亲脂采样）只考虑氨基酸侧链的亲脂性原子。用不加权的相同的Gaussian函数f(x)计算网格的一个点（x）处的值。作为结果，通过相同的三维网格对来自所比较的两种抗体的分子动力学模拟的两个构象系综采样。用下面的公式测量抗体a与抗体b之间的静电相似性(sim-elec)： sim - elec = Σ i = 1 445740 ( | x i a + x i b | - | x i a - x i b | ) Σ i = 1 445740 ( | x i a + x i b | ) . 用相同的公式应用于通过先前所述亲脂采样生成的数据来计算亲脂相似性。
如此，就小鼠抗体40-12的柔性氨基酸而言，人种系模型vλ2-vh2展示这60个柔性氨基酸的最高四维相似性（总相似性=58%）。如此，人种系模型vλ2-vh2用于人源化将要人源化的抗体，同时聚焦于45个柔性氨基酸。为了确定要进行的突变，将小鼠抗体40-12的模型的三维结构叠加到自显示最高相似性的种系衍生的模型上，优化氨基酸的α碳的位置。将鉴定为柔性的氨基酸用显示最高相似性的模型的序列中的相应氨基酸突变。
不想要的所考虑的序列基序如下：天冬氨酸-脯氨酸（在酸性培养基中不稳定的肽键），天冬酰胺-X-丝氨酸/苏氨酸（糖基化位点，X=除脯氨酸外的任意氨基酸），天冬氨酸-甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸（柔性区带中潜在形成琥珀酰亚胺/异天冬氨酸），天冬酰胺-甘氨酸/组氨酸/丝氨酸/丙氨酸/半胱氨酸（暴露的脱酰胺位点），甲硫氨酸（暴露区带中氧化）。借助BLAST序列比较算法，最终将如此获得的人源化序列与IEDB数据库（http://www.immuneepitope.org/；免疫表位数据库和分析来源：from vision toblueprint.PLoS Biol.2005Mar；3(3)：e91）的序列比较，从而确保序列不含有任何已知受到B和T淋巴细胞识别的表位。如果序列含有具有不需要的序列的残基，那么然后还修饰它们。如果复合序列含有IEDB中列出的已知表位，那么使用显示高相似性的另一种种系结构模板作为模型。
更有利地，同与序列SEQ ID No.34、序列SEQ ID No.36或序列SEQ IDNo.38具有至少80%，90%，95%或99%同一性的序列组合地使用依照本发明的包含与序列SEQ ID No.30或序列SEQ ID No.32具有至少80%，90%，95%或99%同一性的序列的抗体。
在一个实施方案中，依照本发明的抗体包含序列SEQ ID No.30的可变轻链和序列SEQ ID No.34的可变重链。
在另一个实施方案中，抗体包含序列SEQ ID No.32的可变轻链和序列SEQ ID No.38的可变重链。
在另一个实施方案中，抗体包含序列SEQ ID No.30的可变轻链和序列SEQ ID No.36的可变重链。
在另一个实施方案中，抗体包含序列SEQ ID No.32的可变轻链和序列SEQ ID No.34的可变重链。
在另一个实施方案中，抗体包含序列SEQ ID No.32的可变轻链和序列SEQ ID No.36的可变重链。
在另一个实施方案中，抗体包含序列SEQ ID No.30的可变轻链和序列SEQ ID No.38的可变重链。
本发明的主题还有FGF-R4特异性人拮抗性抗体。此类抗体可以依照本领域技术人员知道的方法（McCafferty J等，1990；Hoogenboom HR等，2005）通过噬菌体展示来获得。其它技术也可用于制备人抗体，诸如美国专利5,939,598中记载的XenoMouse技术。
在一个具体的实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗性抗体是如下的人抗体，它的重链可变区包含与序列SEQ ID No.76，86，96或106具有至少80%，90%，95%或99%同一性的序列。
在另一个实施方案中，FGF-R4受体特异性拮抗性抗体是如下的人抗体，它的轻链可变包含与序列SEQ ID No.71，81，91或101具有至少80%，90%，95%或99%同一性的序列。
本发明的主题还有包含如下重链的FGF-R4受体特异性人拮抗性抗体，所述重链包含由与序列SEQ ID No.77，87，97或107具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷酸序列编码的可变区。
本发明的主题还有包含如下轻链的FGF-R4受体特异性人拮抗性抗体，所述轻链包含由与序列SEQ ID No.72，82，92或102具有至少80%，90%，95%或99%同一性的核苷酸序列编码的可变区。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人拮抗性抗体，其包含由核苷酸序列SEQ ID No.71和76或核苷酸序列SEQ ID No.81和86或核苷酸序列SEQ ID No.91和96或核苷酸序列SEQ ID No.101和106编码的序列。
本发明的主题还有如下的FGF-R4受体特异性人拮抗性抗体，其包含多肽序列SEQ ID No.72和77或多肽序列SEQ ID No.82和87或多肽序列SEQ IDNo.92和97或多肽序列SEQ ID No.102和107。
特别优选地，FGF-R4受体特异性人拮抗性抗体包含多肽序列SEQ ID No.82和87。
经如此修饰的氨基酸序列还可通过在哺乳动物细胞中生成期间的翻译后修饰来修饰。特别地，岩藻糖生物合成缺陷的稳定系的使用能使之有可能生成如下的单克隆抗体，其中Fc（位置N297）的N-聚糖部分或完全缺乏岩藻糖，且使之有可能提高ADCC效应器作用（Kanda等，2006，Biotechnol.Bioeng.94：680-688及Ripka等，1986，Arch Biochem Bioph249：533-545）。
在本发明的另一个实施方案中，FGF-R4特异性拮抗剂是偶联的抗体。
抗体可以偶联至细胞毒剂。术语“细胞毒剂”在本文中指降低或阻断细胞的功能或生长，或引起细胞破坏的物质。
在一个实施方案中，可以将抗体或其结合片段偶联至药物，诸如美登木素生物碱，从而形成对表达抗原的细胞具有细胞毒性的“前体药物”。
本发明的细胞毒剂可以是任何以各种方式导致细胞死亡或诱导细胞死亡或降低细胞存活力的化合物。优选的细胞毒剂包括例如上文定义的美登木素生物碱和美登木素生物碱类似物、类紫杉醇、CC-1065和CC-1065类似物、多拉司他汀和多拉司他汀类似物。如本申请中描述的，将这些细胞毒剂偶联至抗体、抗体片段、功能性等同物、改良抗体及其类似物。
可以通过体外方法来制备偶联抗体。使用接头基团将药物或前体药物连接至抗体。合适的接头基团是本领域技术人员公知的，而且特别包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团是二硫化物基团和硫醚基团。例如，可以通过使用二硫化物交换反应或通过在抗体和药物或前体药物之间形成硫醚桥来构建偶联物。
诸如甲氨蝶呤、柔红霉素、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、加利车霉素、tubulysin和tubulysin类似物、duocarmycin和duocarmycin类似物、多拉司他汀和多拉司他汀类似物等化合物也适合于制备本发明的偶联物。也可以经居间分子诸如血清清蛋白将上述分子连接至抗体。多柔比星和多柔比星化合物（例如专利申请US09/740991中记载的）也可能是有用的细胞毒剂。
作为本发明主题的抗体可以与细胞毒性分子或化合物组合。它们还可以与作用于其它血管发生途径的抗血管发生性化合物组合。
表述“表达FGF-R4的细胞”指任何表达天然形式或突变形式的FGF-R4受体的真核细胞，尤其是哺乳动物细胞，特别是人细胞。FGF-R4还可以是完整形式或截短形式，其包含例如FGR-R4的胞外域，特别是D2-D3域。FGF-R4还可以是嵌合形式重组的。
本发明的化合物可以配制成药物组合物，用于表面、口服、胃肠外、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、眼内等施用。优选地，药物组合物含有供可注射配制剂用的药学可接受的载体。它们可以特别地是无菌的、等渗的盐水溶液（磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或此类盐的混合物），或干的（特别是冻干的）组合物，它们在适当时通过添加经灭菌的水或生理盐水能形成可注射溶液。
所针对的病理可以是所有涉及血管发生的疾病，无论所述血管发生是肿瘤的或非肿瘤的。
所针对的病理可以是癌症（本发明用作肿瘤血管发生的抑制剂），特别是肝癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌或皮肤癌，或其它记载了血管发生失调的病理，诸如：老年性黄斑变性或ARMD，炎性疾病诸如类风湿性关节炎、骨关节炎、结肠炎、溃疡或肠的任何炎性疾病，动脉粥样硬化或肥胖症的治疗。
抗FGF-R4抗体还可作为对肿瘤生长直接具有作用的抑制剂用于治疗癌症，特别是肝癌瘤和其它肝癌，及胰腺癌。
下面的实施例例示而非限制本发明。
附图说明
图1A和1B：在体外（图1A），HUVEC类型的人内皮细胞能够形成假管网络，称作血管发生。此网络通过添加1ng/ml FGF2而受到刺激。这种诱导也可通过添加10ng/ml FGF19（对FGF-R4特异性的配体）来获得，而10ng/mlFGF4（不活化FGF-R4的配体）不能够刺激血管发生。同样地，在体内（图1B），在小鼠背上海绵植入物中诱导血管发生的鼠模型中，FGF2能够诱导功能性新血管募集至海绵，其特征在于与对照相比这些海绵的血红蛋白含量升高。FGF19也能够在海绵中诱导这种血管发生。
图2A：能够表达hFGFR4-Histag（SEQ ID No.40）的质粒pXL4614的图。
图2B：能够表达hFGFR4-Streptag（SEQ ID No.69）的质粒pXL4613的图。
图3：能够表达hFGFR4(D2,D3)-Histag（SEQ ID No.42）的质粒pXL4615的图。
图4：能够表达mFGFR4-Histag（SEQ ID No.44）的质粒pXL4621的图。
图5：能够表达hFGFR1-Fc（SEQ ID No.46的序列）的质粒pXL4328的图。
图6：能够表达hFGFR2-Fc（SEQ ID No.48的序列）的质粒pXL4327的图。
图7：将ELISA板用4种人FGF受体包被。通过ELISA测定法测量抗FGFR4抗体40-12和64-12识别这些各种各样的FGF-R的能力。克隆40-12（黑色柱形图）是对FGF-R4特异性的。另外，克隆64-12（灰色柱形图）对FGF-R3的识别非常弱。
图8A和8B：活性拮抗性抗体40-12及其无活性对照64-12本身对基础血管发生没有影响。另一方面，在剂量30μg/ml（大约200nM），抗FGFR4单克隆抗体40-12能够抑制FGF2诱导的HUVEC细胞血管发生，而对照抗体64-12不能够这样做（图8A）。
用
Figure BDA0000474722580000201
488nm标记的FGF2能够结合由300-19细胞表达的FGF-R4（白色柱形图）。这种相互作用能被未标记的FGF2（黑色柱形图）或被抗FGFR4抗体40-12（深灰色柱形图）解离，而对照抗体64-12不能够这样做（浅灰色柱形图（图8B）。
图8C和8D：自克隆8、31、33和36衍生的抗FGFR4抗体在10μg/ml对由3ng/ml FGF-2诱导的体外血管发生的影响。克隆8（图8C）和31、33和36（图8D）抑制FGF-2诱导的HUVEC细胞血管发生。
图9A和9B：将Hep3b人肝癌瘤细胞用FGF19以30ng/ml刺激。这种刺激诱导FGF-R4特异性细胞信号传导，导致cFos和JunB蛋白合成及Erk1/2磷酸化，如通过Western印迹观察的（图9A）。然后对每条带定量。此定量以柱形图的形式呈现（图9B）。抗体40-12在100μg/ml完全抑制对FGF-R4特异性细胞信号传导的诱导，而对照抗体没有效果。具体而言，抗体40-12完全阻断刺激3小时后由FGF19诱导的JunB和cFos的合成以及Erk1/2磷酸化。
图9C：抗FGFR4抗体40-12对Hep3b细胞中由FGF-19(30ng/ml)诱导的Erk1/2磷酸化的抑制效果借助抗磷酸ERk1/2ELISA得到证实。抗体40-12还能够抑制Hep3b细胞中用FGF-2(1ng/ml)或用血清(FCS)在10%时刺激的Erk1/2磷酸化。
图9D：通过使用自克隆8、31、33和36衍生的抗体对Hep3b细胞进行的ELISA获得的，对由FGF-19(30ng/ml)诱导的Erk1/2磷酸化的百分比抑制。
图10A和10B：Hep3b细胞的增殖能通过添加血清（图10A）或FGF19（图10B）来刺激。用血清实现的诱导受到抗体40-12在100μg/ml时的部分抑制，而对照抗体没有效果（图10A）。由FGF19诱导的增殖被10μg/ml抗FGFR4抗体40-12完全阻断，而相同剂量的对照抗体不能够这样做（图10B）。
图11A至11D：抗FGFR4抗体40-12能够通过抑制肿瘤血管发生来降低RipTag鼠模型中胰腺肿瘤的形成：Rip1-Tag2模型是一种鼠模型，其中转基因小鼠在胰岛的胰岛素生成β细胞中表达SV40T抗原（Hanahan D.，Nature，1985，9-15：115-22）。此T抗原在胰胚胎发育长达4-5周寿命期间表达，没有明显影响。在接下来的5周期间，一些表达T抗原的胰岛然后朝向与血管系统活化有关的血管生成性岛形成及然后朝向腺瘤类型的小肿瘤发生方向进展。几周后，发生了一些腺瘤，从而形成浸润性癌瘤（图11A）。
在第10周和第13周之间每周一次以25mg/kg的剂量用抗体40-12或用对照抗体皮下处理这些Rip1-Tag2小鼠。13周后，处死小鼠。测定肿瘤体积，还有每个胰的肿瘤数目和血管密度。抗FGFR4抗体40-12处理使之有可能将肿瘤体积显著降低55%，而对照抗体没有显示效果（图11B）。抗体40-12还使之有可能与对照相比将每个胰的肿瘤数目降低34%（图11C）。这种肿瘤体积缩小伴有血管密度降低，无论是小、中等或大血管的数目（图11D）。
图12：通过ELISA测量抗体40-12和64-12识别人或小鼠FGF-R4的完整胞外域，及还有删除了其D1域的FGF-R4胞外域的能力。克隆40-12能够同等地结合3种FGF-R4构建物，而克隆64-12对FGF-R4的小鼠形式的识别不太好。
图13A至13C：通过用经488nm标记的FGF2进行的竞争结合实验测量抗FGFR4抗体克隆40-12对FGF2/FGF-R4结合的拮抗效果。克隆40-12能够以相同的效力（人、小鼠或大鼠复合物分别为3500、4110和3940ng/ml，即23、27和26nM）阻断经编码FGF-R4受体的人、小鼠或大鼠形式的cDNA转染的小鼠300-19细胞上的人（图13A）、小鼠（图13B）和大鼠（图13C）FGF2的结合。
图14A：能够表达hFGFR4_D1:Fc的质粒pXL4794的图。
图14B：经质粒pXL4794转染的HEK293系中分泌的hFGFR4_D1:Fc蛋白的氨基酸序列。
图15A：能够表达hFGFR4_D2:Fc的质粒pXL4796的图。
图15B：经质粒pXL4796转染的HEK293系中分泌的hFGFR4_D2:Fc蛋白的氨基酸序列。
图16A：能够表达hFGFR4_D3:Fc的质粒pXL4799的图。
图16B：经质粒pXL4799转染的HEK293系中分泌的hFGFR4_D3:Fc蛋白质的氨基酸序列。
实施例
实施例1：FGF-R4在控制血管发生中的作用的证明
为了证明FGF-R4在控制血管发生中的作用，用经数种FGF刺激的HUVEC类型的人内皮细胞进行了体外血管发生实验：FGF2，一种活化大多数FGF受体的配体；FGF19，一种特异性活化FGF-R4的配体；和FGF4，一种不活化FGF-R4的配体。
为了做这个实验，准备凝胶，即将160μl在胶原（大鼠尾胶原，I型：Bectondickinson354236）中稀释至1/6的Matrigel（生长因子降低的Matrigel：Bectondickinson356230）分配入腔式载玻片（Biocoatwellware collagen，I型，8孔培养载玻片：Becton dickinson354630）的每个孔。将凝胶于37℃维持1小时，使得它们能够聚合。接着，在400EBM培养基（Clonetics C3121）+2%FBS+10μg/ml hEGF中以15x103细胞/孔接种人静脉内皮细胞（HUVEC，ref.C-12200，Promocell）。可以将这个方案适应96孔板：60μl/孔96孔板（BiocoatcollagenI cellware，Becton Dickinson354407）。制备基质，即混合1/3的Matrigel、1mg/ml终浓度的胶原、NaOH（0.026x胶原体积，以μl计）、1xPBS，然后用水调整体积。将内皮细胞在5%CO2存在下用1ng/ml FGF2（R&D，133-FB-025）或10ng/ml FGF4（R&D，235-F4-025）或FGF19（R&D，969-FG-025）于37℃刺激24小时。24小时后，使用计算机辅助图像分析系统（Imagenia Biocom，Courtaboeuf，France）测量形成的微管网络的长度，并测定每个孔中的假管的总长度。为每种条件以μm为单位计算与6份复制品的均值对应的微细管网络总长度均值。
用FGF2或FGF19刺激能够诱导新的小管形成，而FGF4没有效果（图1A）。这些结果显示了FGF-R4的特异性活化使之有可能诱导新血管形成，并由此得出FGF-R4在体外控制血管发生的结论。
使用小鼠中纤维素植入物中体内血管发生诱导模型获得了体外数据的体内关联。这种模型是Andrade等，Microvascular Research，1997，54，253-61记载的模型的改版。
用腹膜内给予的甲苯噻嗪（
Figure BDA0000474722580000231
10mg/kg）/氯胺酮（Imalgene1000，100mg/kg）混合物麻醉动物即近交白色BALB/c J小鼠。将动物的背部除毛，并用消毒。通过注射5ml无菌空气在小鼠的背上皮下创建一气袋。在动物的上背部做一大约2cm的切口，以导入无菌纤维素植入物（直径1cm、厚2mm的片，
Figure BDA0000474722580000233
ref.0501），其注有50μl含有要测试的蛋白质或产物的无菌溶液。然后缝合切口，并用
Figure BDA0000474722580000234
清洁。植入植入物后的数天期间，通过在气体麻醉（5%异氟烷（Baxter））下穿过皮肤注射（50μl/植入物/天），小鼠接受植入物中的蛋白质或产物。
植入海绵后7天，通过腹膜内施用致死剂量的戊巴比妥钠（CEVA santéanimale）来处死小鼠。然后切出海绵周围大约1cm的皮肤，避免结疤，以使皮肤和海绵游离。然后将海绵切成数块，并放置在装有1ml裂解缓冲液（细胞死亡检测ELISA，Roche）的
Figure BDA0000474722580000236
管中。将管在细胞匀浆器（
Figure BDA0000474722580000237
FP120）中连续摇动4次，20秒，力度4。然后将管于20℃以2000g离心10分钟，并在等待血红蛋白测定法的同时将上清液冻存于20℃。
在测定那天，将管再次在融化后离心，并用Drabkin试剂（Sigma，volumefor volume）通过在分光光度计上于405nm读数，针对牛血红蛋白（Sigma）的标准范围测量血红蛋白浓度。每份样品中的血红蛋白浓度依照以标准范围为基础进行的多项式回归以mg/ml为单位表述。结果表述成每个组的均值（±sem）。用ANOVA，接着用Dunnett氏检验（对数值的平方根）来检验各组之间的差异。
在这种模型中，FGF19在50ng/位点和5次再注射能够显著诱导由新形成的成熟血管进行的海绵建群(colonization)，效力与FGF2在5ng/位点相同。海绵中功能性血管的百分比以血红蛋白的存在来显现（图1B）。这些结果显示了FGF-R4的特异性活化能够募集功能性血管，指示FGF-R4在体内也控制血管发生。
实施例2：用作免疫原和抗原的FGFR蛋白质的描述
将FGFR生长因子受体，特别是FGF-R1、FGF-R2、FGF-R3、FGF-R4的胞外域融合至标签（His标签）或免疫球蛋白Fc域。
编码人FGF-R4胞外域的cDNA对应于具有L136P突变的SwissProtFGF-R4_人位置1-365中记载的蛋白质。将它克隆入图2A所示真核表达载体pXL4614，以表达在胞外域C端位置含有His标签的蛋白质。
通过使用质粒pXL4614和辅助质粒pXL4544和pXL4551（它们能够表达两种N-聚糖糖基化酶，即α-2,3-唾液酸转移酶和β-1,4-半乳糖转移酶，如申请WO2008/065543中记载的）在HEK293EBNA系（Invitrogen）中瞬时转染，生成称作hFGFR4-Histag的序列SEQ ID No.40之蛋白质。
纯化在HEK293EBNA细胞培养物上清液中表达的hFGFR4-Histag蛋白质，即在Ni螯合Sepharose柱（Amersham Biosciences；ref.17-0575-01）上层析，在咪唑缓冲液中进行洗脱，然后在PBS缓冲液（Invitrogen；ref.14190-094）中配制。单糖组成分析和N-聚糖唾液酸定量（如Saddic等，2002，Methods Mol.Biol.194：23-36及Anumula等，1998，Glycobiology8：685-694记载的）使之有可能证明蛋白质的唾液酸化程度很高（91%）。结果，蛋白质具有足够药动学特性所需的所有特征。
在一种相当的方式，纯化hFGFR4-Streptag蛋白质（SEQ ID No.69），即在Strep-Tactin Superflow柱（IBA；ref.2-1206）上层析，在脱硫生物素缓冲液中进行洗脱，然后在PBS缓冲液中配制。
hFGFR4(D2,D3)-Histag蛋白质对应于序列SEQ ID No.42。将cDNA克隆入图3所示真核表达质粒pXL4615，并在与hFGFR4-Histag蛋白质相当的条件下生成和纯化蛋白质。
将编码mFGFR4-Histag蛋白质的cDNA（SEQ ID No.43）克隆入图4所示真核表达质粒pXL4621，并在与hFGFR4-Histag蛋白质相当的条件下生成和纯化蛋白质。
hFGFR1-Fc蛋白质（SEQ ID No.46）含有在C端位置融合至人IgG1Fc域的人FGF-R1IIIc胞外域。将cDNA克隆入图5所示真核表达质粒pXL4728，并在与hFGFR4-Histag蛋白质相当的条件下生成蛋白质并纯化，即在蛋白GSepharose亲和柱（Amersham Biosciences）上层析，在100mM甘氨酸/HCl缓冲液pH2.7中进行洗脱，然后在PBS缓冲液中配制。
序列SEQ ID No.48之hFGFR2-Fc蛋白质含有在C端位置融合至人IgG1Fc域的人FGF-R2IIIc胞外域。将cDNA克隆入图6所示真核表达质粒pXL4327，并在与hFGFR1-Fc蛋白质相当的条件下制备然后纯化蛋白质。
hFGFR3-Fc蛋白质是融合人FGF-R3IIIc胞外域与人IgG1Fc域的蛋白质，而且是自R&D Systems（ref.760-FR）获得的。
hFGFR4-Fc蛋白质是融合人FGF-R4胞外域与人IgG1Fc域的蛋白质，而且是自R&D Systems（ref.685-FR）获得的。
将hFGFR4蛋白质的细胞外部分的各亚域融合至人IgG1Fc域。D1亚域包含在构建物SABVA4794中（SEQ ID No.112及图14A和14B）。D2亚域包含在构建物SABVA4796中（SEQ ID No.114及图15A和15B）。D3亚域包含在构建物SABVA4799中（SEQ ID No.116及图16A和16B）。这三种亚域分别延伸SABVA4794的位置1至179，SABVA4796的1至32加145至242，及SABVA4799的1至32加228至360（SwissProt FGF-R4_HUMAN中记载的位置）。这些是使用质粒pXL4794（编码序列SEQ ID No.111）、pXL4796（编码序列SEQ ID No.113）和pXL4799（编码序列SEQ ID No.115）在与FGFR1-Fc蛋白质相当的条件下生成的。
实施例3：抗FGF-R4单克隆抗体的生成和筛选
A-通过免疫接种获得的抗体
如下获得了单克隆抗体，即在五只6-8周龄BALB/cJ小鼠（Charles River）中免疫接种hFGFR4-Histag免疫原，每只通过Kilpatrick等人（1997，Hybridoma16：381-389）记载的RIMMS法和ClonaCellTM-HY杂交瘤克隆试剂盒（StemCellTechnologies；ref03800）中记载的融合方案免疫接种总共24μghFGFR4-Histag。
最后一次注射后两天，处死小鼠，并将淋巴结与P3X63-AG8.653骨髓瘤细胞（ATCC，CRL-1580）以5:1的比在聚乙二醇（ClonaCellTM-HY，ref.03806）存在下融合。将细胞悬浮液无菌分配入Petri皿，于37℃在5%CO2存在下温育。分离温育12天后出现的集落并在96孔板中在培养基E（ClonaCellTM-HY；ref.03805）中温育。
使用hFGFR4-Streptag作为捕捉抗原通过ELISA测定法对通过免疫接种hFGFR4-Histag获得的单克隆抗体进行初级筛选。将捕捉抗原结合至Immulon-4酶联板（VWR Scientific Inc.，Swedesboro，NJ）。随后添加杂交瘤培养物上清液，然后使用过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG家兔抗体（Sigma；ref.A9044；稀释至1:50,000）进行检测。用TMB-H2O2底物（Interchim；ref.UP664780）进行显色，并用读板仪于450nm进行测量。在所测试的444个杂交瘤中，129个通过用hFGFR4-Streptag抗原进行的ELISA测定法呈阳性，而且这些杂交瘤中的120个对hFGFR4-Fc二聚体蛋白质也呈阳性。
如实施例2中所述使用hFGFR4-Streptag蛋白质及然后用hFGFR1-Fc、hFGFR2-Fc和hFGFR3-Fc蛋白质作为捕捉抗原通过ELISA测定法进行次级筛选以只选择FGF-R4特异性抗体。将捕捉抗原结合至Immulon-4酶联板（VWRScientific Inc.，Swedesboro，NJ）。随后添加杂交瘤培养物上清液，然后使用过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG家兔抗体（Sigma；ref.A9044，稀释至1:50,000）进行检测。用TMB-H2O2底物（Interchim；ref.UP664780）进行显色，并用读板仪于450nm进行测量。
在用抗原通过ELISA测定法测试呈阳性的129个杂交瘤中，84个杂交瘤对hFGFR4-Streptag呈阳性，而且对hFGFR1-Fc、hFGFR2-Fc或hFGFR3-Fc任一没有亲和力。保存39个杂交瘤，作为它们的生长和它们的形态的功能。使用SEROTEC试剂盒（ref.MMT1）测定它们的同种型；95%是IgG1。
进行三级筛选，其用FGF2诱导的Baf/3经修饰细胞增殖测试，以表征抗FGFR4抗体的抑制作用。
通过有限稀释来克隆表达抗FGFR4拮抗性抗体的鼠杂交瘤。使用在指数期中培养的杂交瘤细胞，测定编码序列（cDNA），即使用Oligotex试剂盒（Qiagen；ref.72022）提取mRNA；用Gene Racer试剂盒、SuperScript III逆转录酶（Invitrogen；ref.L1500）和下文表2中描述的引物通过RACE-RT法生成和扩增cDNA；使用Phusion聚合酶（Finnzymes；ref.F-530S）、表2中描述的引物和温度条件扩增cDNA片段。将含有VH（重链HC的可变区）或VL（轻链LC的可变区）编码区的扩增片段克隆入pGEM-T Easy载体（Promega；ref.A137A），并对获得的质粒的插入物测序，使得在与抗FGFR4抗体40-12和抗FGFR4抗体64-12对应的至少6份质粒上以5’-3’和3’-5’方向分析每种可变域的编码序列。使用在Vector NTI（Invitrogen）上可得的软件进行序列分析、毗连群(contig)和比对。
保存含有编码抗FGFR4抗体可变区的共有序列的质粒。质粒pXL4691含有编码抗FGFR4抗体40-12的序列SEQ ID No.5之VH的序列，而质粒pXL4693含有编码抗FGFR4抗体64-12的序列SEQ ID No.19之VH的序列，如下文表2中显示的。
质粒pXL4690含有核苷酸序列SEQ ID No.7，其编码抗FGFR4抗体40-12的序列SEQ ID No.8之VL，而质粒pXL4692含有核苷酸序列SEQ ID No.21，其编码抗FGFR4抗体64-12的序列SEQ ID No.22之VL，如下文表2中显示的。
表2：逆转录酶和PCR反应的操作条件和分析-质粒pXL4690至pXL4693的鉴定。
Figure BDA0000474722580000271
Figure BDA0000474722580000281
抗FGFR4抗体64-12和抗FGFR4抗体40-12的轻链和重链可变区的氨基酸序列是不同的。表7中显示了使用的、获得的和推导的序列的数目。
在T500烧瓶中生成抗体40-12和64-12。7天后收获培养物上清液。将抗FGFR4抗体在蛋白G上亲和纯化，然后针对PBS透析，无菌过滤，并保存于4℃。
纯化的拮抗性抗体具有6.5x10-9M（抗FGFR4 40-12）和5.75x10-8M（抗FGFR4 64-12）的KD。
B-使用噬菌体展示法选择的抗体
使用hFGFR4-Histag作为捕捉抗原通过ELISA测定法用hFGFR4-Histag对通过噬菌体展示获得的单克隆抗体进行初级筛选。将捕捉抗原结合至Immulon-2酶联板（VWR Scientific Inc.，Swedesboro，NJ）。随后添加来自经噬菌体感染的大肠杆菌的培养物上清液，然后使用过氧化物酶偶联的抗M13小鼠抗体（GE Healthcare；ref.27-9421-01，稀释至1:5000）进行检测。用TMB-H2O2底物（Interchim；ref.UP664780）进行显色，并于450nm进行光密度(O.D.)测量。
如实施例2中所述使用hFGFR4-Histag蛋白质及然后用hFGFR1-Fc、hFGFR2-Fc和hFGFR3-Fc蛋白质作为捕捉抗原通过ELISA测定法进行次级筛选以只选择FGF-R4特异性抗体。将捕捉抗原结合至Immulon-2酶联板（VWRScientific Inc.，Swedesboro，NJ）。随后添加来自经噬菌体感染的大肠杆菌的培养物上清液，然后使用过氧化物酶偶联的抗M13小鼠抗体（GE Healthcare；ref.27-9421-01，稀释至1:5000）进行检测。用TMB-H2O2底物（Interchim；ref.UP664780）进行显色，并于450nm进行光密度(O.D.)测量。
对选定的FGF-R4特异性克隆测序，并再克隆入表达载体，供瞬时转染HEK293细胞用。
为了这个，第一步，通过限制性自噬菌粒提取编码Fab即抗体的轻链、细菌核糖体结合位点、和抗体重链可变区的区域，并插入用于哺乳动物细胞的IgG表达质粒，在真核抗体信号序列的下游及在人IgG1重链恒定区的上游。第二步，含有细菌核糖体结合位点和细菌信号肽重链的区域交换IRES序列和真核信号序列。通过瞬时转染HEK293细胞来表达IgG。这个过程详细记载于T.Jostock等，Journal of Immunological Methods289(2004)65-80。
可用于本发明的人IgG1恒定区序列的一个例子是序列SEQ ID No.117。
进行三级筛选，其使用来自经抗体表达载体瞬时转染的HEK293细胞的培养物上清液，用实施例4中描述的FGF2诱导的经修饰Baf/3细胞增殖测试，以表征抗FGFR4抗体的抑制作用。这项筛选使之有可能鉴定克隆8、31、33和36的抗体。表7描述了相应的序列。
实施例4：BaF/3FGF-R4-hMpl小鼠克隆系的建立和细胞增殖方案
将FGF-R4的胞外和跨膜域作为与hMpl胞内域的翻译融合物克隆入突变型pEF6/V5-His A载体，以获得在嵌合FGF-R4-hMpl受体前面的5'位置HA标签的存在。
突变型pEF6A的构建
改进pEF6/V5-His A载体（Invitrogen，ref.V961-20）以整合与HA标签连接的MCS（多克隆位点），所述HA标签放置在pDisplay（Invitrogen，ref.V660-20）的IgGk信号肽下面。为了做这个，在有义引物序列SEQ ID No.51和反向引物序列SEQ ID No.52之间通过PCR扩增与HA标签及其信号肽连接的MCS，使之有可能插入5'位置的KpnI限制性位点和3'位置的XbaI限制性位点。将PCR片段用KpnI和XbaI酶消化，然后克隆入用相同的酶打开的pEF6/V5-His A载体。最后，将MCS的第一个BamHI位点用BsrGI位点替换，即将新形成的载体用KpnI和SpeI酶消化，并在这些位点之间插入彼此杂交且含有BsrGI酶位点的引物序列SEQ ID No.53和SEQ ID No.54。所得的载体称作：pEF6mut-HA。
pEF6mut-HA-FGF-R4-hMpl载体的构建
在有义引物序列SEQ ID No.55（其容许插入SacI消化位点）和反向引物序列SEQ ID No.56（通常称作revBGH）之间在载体pEF6/V5-His TOPO（Invitrogen，ref.K9610-20）中扩增Mpl胞内域。然后，将生成的PCR片段用SacI和NotI酶消化。
使用引物对（有义：序列SEQ ID No.57；反向：序列SEQ ID No.58）扩增FGF-R4胞外和跨膜域。这些引物使之有可能插入5'位置的BamHI酶位点和3'位置的SacI酶位点。然后，将PCR片段用BamHI和SacI酶消化。
然后同时将编码hMpl和编码FGF-R4的DNA的扩增物克隆入用BamHI-NotI打开的pEF6mut-HA载体。所得构建物称作“pEF6mut-HAFGF-R4αIIIc-hMpl2”。然后，通过定点诱变来改进此构建物，从而将FGF-R4跨膜域（蛋白质序列SEQ ID No.59）变成序列SEQ ID No.60。为了做这个，使用
Figure BDA0000474722580000301
定点诱变试剂盒（Clontech，ref.200518）及有义引物序列SEQ ID No.61和反向引物序列SEQ ID No.62。获得的新的嵌合构建物称作pEF6mut-HA FGF-R4αIIIcmut-hMpl2。
通过用FGF-R4αIIIcmut-hMpl2构建物转染BaF/3小鼠系来创建稳定系
通过电穿孔将“pEF6mut-HA FGF-R4αIIIcmut-hMpl2”构建物稳定地导入BaF/3小鼠细胞的基因组。在20ng/ml FGF2（R&D，ref.234-FSE-025）和100ng/ml肝素（Sigma，ref.H3149）存在下选择获得的系。这样，转染和选择的系是克隆型的。
BaF/3FGFR4-hMpl细胞系的细胞增殖方案
将BaF/3FGFR4-hMpl细胞在补充有20ng/ml FGF2（R&D Systems，ref.234-FSE）和3ng/ml肝素（Sigma，ref.H3149）的完全RPMI1640培养基（Invitrogen；ref.32404-014）（10%FCS（Hyclone；ref.SH30070.03），2mM谷氨酰胺，1x MEM非必需氨基酸（Gibco，ref.11140-035），1x MEM丙酮酸钠（Gibco，ref.11360-039））中培养和维持。第一天，在补充有20ng/ml FGF2和3ng/ml肝素的完全RPMI1640培养基中以0.4x106细胞/ml接种细胞。次日，将50μl在补充有20ng/ml FGF2和3ng/ml肝素的完全RPMI1640培养基中0.2x106细胞/ml的BaF/3FGFR4-hMpl细胞悬浮液分配入96孔板（Porvair，ref.214006），接着是50μl含有要测试的抗体的杂交瘤上清液。然后，将板于37℃、5%CO2放置24-30小时。为了读取细胞增殖，通过添加100μl细胞滴度Glo发光细胞存活力测定法（Promega，ref.G7571）来定量ATP的量，并使用发光计读取发光。
选择在此测试中展现比含有添加剂20ng/ml FGF2和3ng/ml肝素的完全RPMI1640培养基弱50%的信号的克隆。
当将对FGF-R4特异性的抗FGFR4抗体与Baf/3-FGFR4-hMpl细胞和与下面的添加剂20ng/ml FGF2和3ng/ml肝素一起温育时，观察对细胞增殖的拮抗效果。在测试的39个杂交瘤中，14个能够在FGF2存在下抑制Baf/3-FGFR4-hMpl细胞的由FGF诱导的细胞增殖。
通过ELISA（图12）显示了抗FGFR4拮抗性抗体40-12和64-12具有对小鼠蛋白质mFGFR4和人蛋白质hFGFR4(D2,D3)的亲和力。
最后，通过表面等离振子共振（BIAcore2000）进行最后一次筛选以测定抗FGFR4抗体的亲和常数。在抗FGFR4抗体结合至抗Fc抗体，其自身结合至CM芯片后，分析FGF-R4蛋白质和杂交瘤培养物上清液中存在的抗FGFR4抗体之间的相互作用。依照Canziani等，2004，Anal.Biochem.325：301-307的方案测量动力学。
选择那些中亲和常数为10-8至10-9M和解离速率为10-3至10-5s-1的两种抗体。下文表1描述了这些抗体的特征。
用于测定KD的参照方法是表面等离振子共振（BIAcore）。
表1A：纯化的抗FGFR4拮抗性抗体40-12和64-12的亲和力和结合/解离常数
抗FGFR4 kon(M-1.s-1) koff(s-1) KD(M)
40-12 1.94x105 1.26x10-3 6.50x10-9
64-12 1.05x104 6.02x10-4 5.75x10-8
表1B：抗FGFR4抗体8、31、33和36的结合的动力学参数，通过表面等离振子共振（BIAcore3000）测量：
实施例5：抗FGFR4抗体的特异性
A-抗FGFR4抗体40-12对FGF-R4的特异性
依照实施例4中描述的方案通过ELISA确立每种抗体的特异性。这样，观察每种抗体结合每种FGF-R的能力。这个实验清楚地显示抗体40-12只识别FGF-R4，因此是对FGF-R4特异性的。抗体64-12主要能够结合FGF-R4，但是也微弱结合FGF-R3（图7）。
B-抗FGFR4抗体8、31、33和36对FGF-R4的特异性
依照下面的方案通过ELISA确立每种抗体的特异性：通过感染大肠杆菌细菌来生成在它们的表面展示Fab格式的抗体的噬菌体的悬浮液。将捕捉抗原结合至Immulon-2酶联板（VWR Scientific Inc.，Swedesboro，NJ）。随后添加噬菌体悬浮液，然后使用过氧化物酶偶联的抗M13噬菌体小鼠抗体（GEHealthcare，ref.27-9421-01，稀释至1:5000）进行检测。用TMB-H2O2底物（Interchim；ref UP664780）进行显色，并于450nm进行光密度(OD)测量。
表2汇总了获得的结果：
这样，观察每种抗体结合每种FGF-R的能力。这个实验清楚地显示抗体8、31、33、36只识别FGF-R4，因此是对FGF-R4特异性的。
表2：自克隆8、31、33和36衍生的抗FGF-R4抗体通过ELISA确立的特异性（信号=OD，450nm）
h-FGFR4(D2,D3)-histag h-FGFR1-Fc h-FGFR2-Fc h-FGFR3-Fc
克隆8 2.55 0.05 0.00 0.00
克隆31 2.52 0.00 0.00 0.01
克隆33 2.73 0.00 0.00 -0.01
克隆36 1.87 -0.01 -0.01 -0.02
实施例6：抗体40-12和自克隆8、31、33、36衍生的抗体对血管发生的拮抗效果（体外）
为了确定抗FGFR4单克隆抗体40-12对人内皮细胞血管发生过程的生物学活性，在渐增剂量1-30μg/ml的抗体40-12或对照抗体存在下使用经FGF2刺激的HUVEC细胞进行体外血管发生实验（图8A和8B）。
在此语境中，活性抗FGFR4拮抗性单克隆抗体40-12在剂量30μg/ml或200nM能够抑制FGF2诱导的HUVEC细胞血管发生，而对照抗体64-12没有效果。此外，抗体40-12本身对基底血管发生(basal angiogenesis)没有效果。
这些结果指示FGF-R4特异性拮抗性抗体能够抑制血管发生。
正如对抗体40-12，对自噬菌体展示衍生的克隆8、31、33和36的抗FGFR4抗体评估它们抑制FGF-2诱导的HUVEC型人内皮细胞血管发生的能力。这4种抗体在体外阻断用FGF-2获得的对血管发生的刺激，所述抗体的剂量为10μg/ml（图8C和8D）。
实施例7：抗体40-12和自克隆8、31、33和36衍生的抗体对人肝癌瘤细胞的拮抗效果（体外）
为了确定抗FGFR4拮抗性单克隆抗体40-12的抗肿瘤效果，用Hep3b人肝癌瘤细胞进行实验，其中增殖和导致增殖的信号传导途径依赖于配体-受体对：FGF19/FGF-R4。
首先，通过Western印迹进行Hep3b细胞中导致增殖的FGF-R4依赖性信号传导途径的研究。这种细胞信号传导涉及cFos和JunB蛋白的新合成，还有Erk1/2的磷酸化（Lin等，J Biol Chem.，2007，14：27277-84）。为了做这个实验，将5x105个细胞在2ml完全培养基（DMEM，10%FCS，2mM谷氨酰胺）中接种入直径35mm的皿。24小时后，使细胞在1.8ml无血清培养基中经历缺陷条件24小时。然后在对照抗FGFR4抗体或抗FGFR4抗体40-12缺失或存在下将细胞用200μl10倍浓缩的FGF19刺激3小时。然后除去培养基，并将细胞用冷PBS清洗一次，并在皿上用75μl补充有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液于4℃裂解30分钟。然后将总蛋白质提取物于4℃以13,000rpm离心10分钟，并通过Western印迹技术分析上清液。然后将膜在TBS、0.05%Tween、5%奶中于环境温度温育2小时，然后以1/1000添加抗cFos（Cell SignalingTechnology，ref2250）、抗JunB（Cell Signaling Technology，ref3746）和抗磷酸Erk1/2（Cell Signaling Technology，ref4377）一抗，并在缓慢摇动中于4℃温育过夜。将膜用TBS、0.05%Tween漂洗三次，并将在TBS、0.05%Tween、5%奶中稀释至1/2000的偶联至HRP的二抗于4℃温育4小时。然后使用Chemigenius仪器（Syngene）对Western印迹结果定量。将用各种抗体获得的条带亮度以用1/3000使用的直接偶联至HRP的抗肌动蛋白抗体（Santa CruzBiotechnology，ref.Sc-8432-HRP）获得的条带亮度加权。
在Hep3b细胞中，FGF19在30ng/ml诱导JunB和cFos蛋白质的合成和还有Erk1/2的磷酸化。这种蛋白质新合成和Erk磷酸化被抗FGFR4抗体40-12在100μg/ml完全抑制，而对照抗体没有抑制效果。对在Western印迹膜（图9A）上观察到的这些效果定量，而且每张膜的条带的亮度以图的形式呈现（图9B）。
其次，进行细胞增殖实验本身。将5000个细胞在100μl含有10%FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中接种入96孔板。24小时后，将细胞在无血清培养基中剥夺血清24小时。然后在对照抗体或抗FGFR4拮抗性单克隆抗体40-12缺失或存在下将Hep3b细胞用100μl补充有10ng/ml FGF19（Sanofi-Aventis R&D内部生成的）的无血清培养基或用10%血清刺激72小时。3天后，使用细胞滴度Glo试剂盒（Promega，France）对细胞增殖定量。
从这些实验看出，血清和FGF19能够刺激Hep3b增殖。抗FGFR4拮抗性抗体40-12在100μg/ml部分抑制这种血清诱导的增殖，而对照抗体没有显示任何抑制活性（图10A）。另外，抗体40-12在10μg/ml完全阻断由FGF19诱导的增殖（图10B）。对照抗体没有效果。
这证明了作为本发明主题的抗FGFR4拮抗性抗体可用作FGF19依赖性或FGF-R4依赖性肿瘤的背景中的抗肿瘤治疗剂，而且这种抗体在肝癌瘤的治疗中会特别有效。
为了简化抗FGFR4抗体对Hep3b细胞的效果的研究，为检测用FGF-19（与实施例8中描述的实验有关）、FGF-2或胎牛血清刺激这些细胞后Erk1/2的磷酸化开发了一种ELISA测定法。
为了做这个实验，将50,000个Hep3b细胞在100μl含有10%FCS和2mM谷氨酰胺的DMEM培养基中接种入96孔黑色透明底板（COSTAR，ref.3603）。24小时后，使细胞在含有2mM谷氨酰胺、不含FCS的DMEM培养基中经历缺陷条件24小时。然后除去培养基，并用100μl经于37℃预平衡的含有FGF或FCS和还有各种剂量的所评估抗体的缺陷培养基替换。将细胞于37℃、5%CO2温育3小时。然后取出刺激培养基，并于4℃将孔用PBS漂洗，并通过添加200μl含4%PFA（低聚甲醛）的PBS于环境温度15分钟来固定细胞。除去PFA，并将细胞用200μl PBS清洗三次。开始直接在Hep3b细胞上检测磷酸Erk1/2的抗体标记，即用100μl饱和缓冲液（21.25ml PBS，1.25ml10%非免疫山羊血清（Zymed，ref.50-062Z），75μl Triton X100）2小时饱和非特异性位点。将饱和缓冲液用50μl在含有1%BSA和0.3%Triton X100的PBS缓冲液中稀释至1/100的抗磷酸Erk1/2一抗（Cell Signaling Technology，ref.4377）替换。将一抗与细胞一起于4℃温育过夜。然后通过用200μl PBS清洗三次来漂洗除去它，并使用在含有1%BSA和0.3%Triton X100的PBS缓冲液中稀释至1/5000的偶联有AlexaFluor488的抗家兔二抗（Molecular Probes，ref.A11008）4小时来显现。然后通过用200μl PBS清洗三次来漂洗除去二抗，然后将100μlPBS添加至每个孔。使用FITC滤光片在EnVision2103多标记物读出器（PerkinElmer）上读取荧光。
这种技术使之有可能确认FGF-19在30ng/ml在Hep3b细胞中诱导Erk1/2磷酸化及40-12能够自3μg/ml的剂量起阻断这种刺激（图9C）。FGF-2和血清也能够诱导该系统。在后两种情况中，所述抗体40-12在更高的剂量抑制FGF-2和血清的效果（30-100μg/ml；图9C）。
通过ELISA对磷酸Erk1/2的检测也使之有可能显示在体外血管发生模型中有活性的抗FGFR4抗体也能够将由FGF-19在3μg/ml诱导的Erk1/2磷酸化阻断70%和95%（图9D）。
有利地，本发明的抗体具有对与肿瘤形成有关的病理性血管发生及对肝肿瘤生长本身，特别是对肝癌瘤模型都有拮抗效果。
实施例8：抗体40-12在胰腺癌的小鼠模型中的拮抗效果
对于这种药理学模型，使用具有C57Bl/6J遗传背景的雌性Rip1-Tag2小鼠（Charles River Laboratory，France）。自出生后9周龄开始，动物获得补充有5%蔗糖的饮用水。自第10周至第12.5周在干涉处理方案中处理小鼠，每周一次皮下注射抗FGFR4抗体40-12或对照抗体，剂量为25mg/kg（图14A）。这个方案得到了Sanofi-Aventis Recherche的动物护理和使用委员会的批准。我们的畜牧学设备、给予动物的关心和还有处理方案依照欧洲脊椎动物保护公约列出的原则，在处理后或在有肿瘤负荷和/或副作用时使得它们自研究强制退出时处死。
为了测量肿瘤负荷，在实验结束时通过安乐死处死动物，并自新鲜切出的胰显微解剖肿瘤。使用卡尺测量以mm3为单位的肿瘤体积，应用公式[体积=0.52x(宽)2x(长)]以近似计算椭球体的体积。通过累积每只小鼠的肿瘤体积来计算每只小鼠的肿瘤负荷。
对于血管密度的组织化学分析，麻醉动物，并收集胰，在
Figure BDA0000474722580000361
（Sigma）中固定过夜，然后在石蜡中包埋。对每个样品制备5μm厚的切片。检测内皮细胞，即将切片与胰蛋白酶（Zymed，ref.003003）一起于37℃温育10分钟，然后与在大鼠中生成的、稀释至1/50的抗小鼠CD31抗体（BDPharmingen）一起温育。为了显现用抗体标记的区域，将切片与生物素偶联的抗大鼠抗体一起温育30分钟，然后与HRP偶联的链霉亲合素（
Figure BDA0000474722580000362
ABC试剂盒，Vector）一起也温育30分钟，最后与DAB（Vector，ref.SK4100）一起温育5分钟。然后将切片用稀释至1/10的苏木精（Dako，S-3309）染色。用安装在显微镜（Nikon，E-800）上的照相机拍照，总放大倍数为200倍。使用软件（Visiolab，Biocom）分析图像。对肿瘤中的血管计数，并依照它们的表面积归类：小血管介于5和20μm2之间，中等血管介于21和100μm2之间，而大血管自101μm2开始。每个胰分析两种载玻片以测定血管密度，其对应于每个视野经标记元素的总数。
在这种模型中，第10周和第12周之间每周一次以25mg/kg使用抗FGFR4抗体40-12的皮下处理使之有可能将肿瘤负荷显著降低55%（图11B），而且具有将每个胰的肿瘤数目降低34%的趋势（图11C），而对照处理没有效果。这种凭借抗FGFR4抗体40-12对肿瘤形成的抑制伴有总的血管密度显著降低31%（图11D），符合在所有血管大小组中观察到的血管数目（用抗CD31抗体标记）减少（图11D）。
这些体内结果清楚地显示了抗FGFR4拮抗性抗体能够抑制肿瘤中的血管募集和形成。这种对肿瘤血管化的抑制伴有每个胰的肿瘤数目和总的肿瘤体积的降低。
有利地，本发明的抗体对病理性血管发生及对肝肿瘤生长（在肝癌瘤的模型上）和胰肿瘤生长都具有拮抗效果。
实施例9：抗体与人、小鼠和大鼠FGF-R4的交叉反应性
首先，进行竞争结合实验。为了做这个实验，将FGF2在2个游离半胱氨酸上用488nm C-5马来酰亚胺（Molecular Probes，A10254）依照供应商的推荐标记。这种FGF2-AF488在10ng/ml能够结合在经转染300-19细胞的表面表达的人FGF-R4（图8B）。这个结合是特异性的，因为添加过量的未标记FGF2使之有可能替换FGF2/FGF-R4相互作用（图8A）。用渐增剂量的所添加的抗体40-12或对照抗体64-12进行相同的实验。只有拮抗性抗体40-12能够替换FGF2-AF488/FGF-R4结合，IC50为3500ng/ml，即23nM，显示了这种抗体的拮抗效果是由于替换FGF/FGF-R4结合的能力。
其次，及为了测定克隆40-12在人以外的物种中阻断FGF/FGF-R4结合的能力，使用上述小鼠、大鼠和人FGF2/FGF-R4对进行解离实验。为了做这个实验，将小鼠FGF2（R&D，ref.3139-FB-025）或大鼠FGF2（R&D，ref.3339-FB-025）以与人FGF2相同的方式用AlexaFluor488标记。使用经小鼠或大鼠FGF-R4受体转染的300-19系进行解离实验。结果显示了抗FGFR4拮抗性抗体40-12能够以与人系统中相同的效力在小鼠或大鼠系统中解离FGF2/FGF-R4结合。事实上，人、小鼠或大鼠FGF2/FGF-R4复合物的IC50值分别为3500、4110和3940ng/ml，即23、27和26nM（分别见图13A、13B和13C）。这种结合啮齿类FGF-R4的能力得到了ELISA的证实。抗体40-12结合人FGF-R4和小鼠FGF-R4二者（图12）。
这些结果指示抗FGFR4抗体40-12可用于啮齿类（至少是小鼠和大鼠）的药理学模型，而且获得的结果应当预测在人中的效力。
类似地，用自克隆8、31、33和36衍生的抗体进行的研究显示这些抗体识别人FGF-R4和小鼠FGF-R4二者（下文表4）。
表4：抗FGFR4抗体8、31、33和36的结合的动力学参数，通过表面等离振子共振（BIAcore3000）测量：
Figure BDA0000474722580000371
Figure BDA0000474722580000381
实施例10：受抗FGF-R4抗体识别的表位的测定
A-受抗FGFR4抗体40-12识别的表位的测定
通过ELISA测定法进行一项筛选以测定受抗体40-12识别的FGFR4特定域。经由在ELISA中使用删除了D1域的FGF-R4形式，确立了抗体40-12与FGF-R4的D2-D3域相互作用（图12）。
通过ELISA测定法进行第二项筛选，其中使用实施例2中所述含有hFGFR4蛋白质D1域（SABVA4794）或D2域（SABVA4796）或D3域（SABVA4799）任一的构建物作为捕捉抗原。将捕捉抗原结合至Immulon-4酶联板（VWR Scientific Inc.，Swedesboro，NJ）。随后添加杂交瘤40-12，然后使用过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG家兔抗体（Sigma；ref.A9044；稀释至1:50,000）进行检测。用TMB-H2O2底物（Interchim；ref.UP664780）进行显色，并于450nm进行光密度(OD)测量。表5总结了获得的结果。
表5：抗体40-12对FGF-R4各亚域的结合的测量
Figure BDA0000474722580000382
抗FGFR4抗体因此识别FGFR4蛋白质的细胞外部分的D2域。
另外，在Western印迹分析中，用FCS变性的FGFR4-Fc蛋白质不受抗体40-12识别，由此指示FGFR4的D2域上40-12所针对的表位是构象类型的。
B-受抗FGFR4抗体8、31、33、36识别的表位的测定
通过ELISA测定法进行一项筛选以测定受抗体8、31、33和36识别的FGFR4特定域，其中使用含有D2和D3域（SEQ ID No.42）或hFGFR4-Histag蛋白质（SABVA4614，SEQ ID No.40）任一的构建物作为捕捉抗原。将捕捉抗原结合至Immulon-4酶联板（VWR Scientific Inc.，Swedesboro，NJ）。随后添加来自经质粒瞬时转染的HEK293细胞的培养物上清液，所述质粒能够分泌抗体8、31、33和36，然后使用过氧化物酶偶联的抗人IgG家兔抗体（DakoCytomation，ref.P0214，稀释至1:5000）进行检测。用TMB-H2O2底物（Interchim；ref.UP664780）进行显色，并于450nm进行光密度(OD)测量。
下面的表6总结了获得的结果。
表6：自克隆8，31，33和36衍生的抗体对完整FGF-R4或对D2-D3亚域的结合（450nm处的OD信号）
hFGFR4-Histag hFGFR4(D2,D3)-Histag
克隆8 3.898 3.860
克隆31 3.859 3.741
克隆33 3.752 3.621
克隆36 3.751 3.616
抗体8、31、33和36因此识别FGFR4蛋白质的细胞外部分的D2-D3域。
表7：使用的、获得的和推导的序列
Figure BDA0000474722580000391
Figure BDA0000474722580000402
Figure BDA0000474722580000411
本发明涉及下述各项。
1.FGF-R4受体拮抗剂，其特征在于它是特异性结合FGF-R4的抗体。
2.依照项1的拮抗剂，其特征在于它结合FGF-R4受体的D2-D3域。
3.依照项1和2任一项的抗体，其特征在于它结合FGF-R4受体的D2域。
4.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它具有通过表面等离振子共振(Biacore)技术测定的小于10-8M的关于FGF-R4受体的KD。
5.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它对人FGF-R4和对鼠FGF-R4都有活性。
6.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且包含至少一个CDR，该CDR具有与序列SEQ ID No.9，10，11，12，13，14，73，74，75，78，79，80，83，84，85，88，89，90，93，94，95，98，99，100，103，104，105，108，109或110之一相同的序列。
7.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且包含序列为序列SEQ ID No.9，10，11，12，13和14；或73，74，75，78，79和80；或83，84，85，88，89和90；或93，94，95，98，99和100；或103，104，105，108，109和110的CDR，其中所述CDR之一可以与至少一种上述序列相比相差一个或两个氨基酸，前提是所述抗体保留其结合特异性。
8.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且它的重链可变区包含与序列SEQ ID No.5，76，86，96或106具有至少80%同一性的核苷酸序列。
9.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且它的轻链可变区包含与序列SEQ ID No.7，71，81，91或101具有至少80%同一性的核苷酸序列。
10.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且它的序列包含多肽序列SEQ ID No.2和4；或6和8；或72和77；或82和87；或92和97；或102和107。
11.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它诱导对受FGF-R4控制的细胞信号传导途径的抑制。
12.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它诱导对血管发生的抑制。
13.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它诱导对肿瘤细胞增殖的抑制。
14.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它对FGF-R4的亲和力比它对其它FGF受体的亲和力大10倍。
15.依照项1-7任一项的拮抗剂，其特征在于它是人源化抗体。
16.依照项1-7任一项的拮抗剂，其特征在于它是人抗体。
17.依照项15的拮抗剂，其特征在于它包含与多肽序列SEQ ID No.30或32之一具有至少80%同一性的可变轻链。
18.依照项15的拮抗剂，其特征在于它包含与序列SEQ ID No.34，36或38之一具有至少80%同一性的可变重链。
19.依照前述项任一项的拮抗剂，其特征在于它是抗体且它是偶联至细胞毒剂的。
20.依照前述项任一项的拮抗剂在治疗与病理性血管发生有关的疾病中的用途。
21.依照前述项任一项的拮抗剂在治疗肝癌瘤或任何其它类型肝癌中的用途。
22.依照前述项任一项的拮抗剂在治疗胰腺癌中的用途。
23.包含依照项1-19任一项的拮抗剂和赋形剂的药物组合物。
24.治疗与病理性血管发生有关的疾病的方法，其特征在于它包括给患者施用依照项1-19任一项的抗体。
25.治疗癌症的方法，其特征在于它包括给患者施用依照项1-19任一项的抗体。
26.生成依照项1-19任一项的抗体的细胞系。
27.生产依照项1-19任一项的抗体的方法，其特征在于它包括培养依照项的26的细胞系。
28.包含依照项1-19任一项的拮抗剂的药物。
29.编码与序列SEQ ID No.2，4，6，8，9，10，11，12，13，14，30，32，34，36，38，72，73，74，75，77，78，79，80，82，83，84，85，87，88，89，90，92，93，94，95，97，98，99，100，103，104，105，107，108，109或110之一具有至少80%同一性的多肽的多核苷酸。
30.多核苷酸，其特征在于它的序列与序列SEQ ID No.1，3，5，7，29，31，33，35，或37，71，76，81，86，91，96，101或106之一具有至少80%同一性。
31.包含依照项29和30任一项的核酸的重组载体。
32.包含依照项31的载体的宿主细胞。
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Claims (13)

1.包含序列SEQ ID No.9，10，11，12，13和14的CDR的FGF-R4拮抗性抗体在制备用于治疗病理性血管发生的药物中的用途，其中每一个CDR可以与上文所述相应序列相比相差一个氨基酸，前提是该抗体保留其对FGF-R4的结合特异性。
2.依照权利要求1的用途，其中所述药物用于治疗与病理性血管发生有关的疾病。
3.依照权利要求1或2的用途，其中所述药物用于在抑制血管发生同时抑制肿瘤生长。
4.依照权利要求1-3任一项的用途，其中所述药物用于治疗肝癌瘤或任何其它类型的肝脏癌症。
5.依照权利要求1-4任一项的用途，其中所述药物用于治疗胰腺癌症。
6.依照前述权利要求任一项的用途，其中所述抗体的重链可变区由与SEQID No.5至少95%相同的核苷酸序列编码且所述抗体的轻链可变区由与SEQ ID No.7至少95%相同的核苷酸序列编码。
7.依照前述权利要求任一项的用途，其中所述抗体的重链可变区由与SEQID No.6至少95%相同的序列组成且所述抗体的轻链可变区由与SEQ IDNo.8至少95%相同的序列组成。
8.依照前述权利要求任一项的用途，其中所述抗体的重链由与SEQ ID No.1至少95%相同的核苷酸序列编码且所述抗体的轻链由与SEQ ID No.3至少95%相同的核苷酸序列编码。
9.依照前述权利要求任一项的用途，其中所述抗体的重链序列由与SEQ IDNo.2至少95%相同的序列组成且所述抗体的轻链序列由与SEQ ID No.4至少95%相同的序列组成。
10.依照前述权利要求任一项的用途，其中所述抗体是人源化抗体。
11.依照权利要求10的用途，其中所述抗体包含
-序列与SEQ ID No.30至少95%相同的可变轻链和序列与SEQ ID No.34至少95%相同的可变重链；或
-序列与SEQ ID No.30至少95%相同的可变轻链和序列与SEQ ID No.36至少95%相同的可变重链；或
-序列与SEQ ID No.30至少95%相同的可变轻链和序列与SEQ ID No.38至少95%相同的可变重链；或
-序列与SEQ ID No.32至少95%相同的可变轻链和序列与SEQ ID No.34至少95%相同的可变重链；或
-序列与SEQ ID No.32至少95%相同的可变轻链和序列与SEQ ID No.36至少95%相同的可变重链；或
-序列与SEQ ID No.32至少95%相同的可变轻链和序列与SEQ ID No.38至少95%相同的可变重链。
12.依照前述权利要求任一项的用途，其中所述抗体是偶联至细胞毒剂的。
13.依照权利要求1的用途，其中所述抗体的重链序列由SEQ ID No.6组成且轻链序列由SEQ ID No.8组成；或其中重链序列由SEQ ID No.77组成且轻链序列由SEQ ID No.72组成；或其中重链序列由SEQ ID No.87组成且轻链序列由SEQ ID No.82组成；或其中重链序列由SEQ ID No.97组成且轻链序列由SEQ ID No.92组成；或其中重链序列由SEQ ID No.107组成且轻链序列由SEQ ID No.102组成。
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