CN118108840A - 抗fgfr4单克隆抗体、靶向fgfr4的嵌合抗原受体t细胞及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗FGFR4单克隆抗体、靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞及其应用，该抗FGFR4单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明还公开抗FGFR4单链抗体，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。本发明进一步公开包括抗FGFR4单链抗体的嵌合抗原受体，并制备靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞，FGFR4‑CAR‑T回输至患者体内，可以高效且特异性的杀伤癌细胞，可用于治疗肝癌等多种癌症。

Description

抗FGFR4单克隆抗体、靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞及其 应用
技术领域
本发明属于CAR-T细胞制备技术领域，抗FGFR4单克隆抗体、靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞及其应用。
背景技术
据国际癌症研究机构(IARC)报道，肝癌死亡率(10.2％)在男性总病例中仅次于肺癌，居于恶性肿瘤第二位，中国更是肝癌的高发大国。目前，小分子治疗药物可用来治疗不能手术的远处转移的原发肝癌，如多激酶抑制剂索拉菲尼，但是预后仍然很差，5年生存率仅为3-11％。最近多个肝癌靶向治疗的三期临床试验亦宣告失败，这很大程度上归因于在癌症晚期的病灶内药物不能充分发挥其抗肿瘤效应，及周围发炎肝脏的高肿瘤复发率。因此，研究肿瘤细胞免疫治疗利于寻找肝癌有效治疗的新策略。
嵌合抗原受体修饰的T细胞(CAR-T)可以特异性地识别并杀伤表达特异性抗原的癌细胞，并能在体内增殖活化从而获得特异性的抗肿瘤长效机制，被认为是唯一有希望完全治愈癌症的技术。CAR-T技术在治疗以急性B淋巴性白血病为代表的血液瘤中取得了巨大的成功，对肝癌等多种实体瘤的疗效远非满意。目前CAR-T技术对实体瘤的限制性因素主要有三点：1)由于肿瘤的异质性，缺乏理想的特异性靶点；2)肿瘤微环境免疫抑制；3)CAR-T细胞无法有效穿过肿瘤物理屏障，细胞归巢实体瘤的能力差。研究肿瘤发生发展的作用机制是实现肿瘤精准治疗和良好预后的关键所在。成纤维细胞生长因子受体FGFR属于受体酪氨酸激酶家族(RTKs)，由5个成员组成，包括FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4和FGFR5(也称为FGFRL1)。成纤维细胞生长因子(FGFs)通过作用于其受体FGFRs，启动FGFRs下游MAPK、STAT3等信号级联，在许多生理过程中发挥重要作用，如胚胎形成、创伤修复、血管生成等。目前研究表明，FGFR4异常信号转导在一些癌症的发生发展中发挥着重要的作用，因此FGFR4是此类肿瘤潜在的治疗靶标。FGF19/FGFR4通路的过度激活能够诱发肝脏肿瘤细胞的形成，通过敲除FGFR4可以有效阻断FGF19/FGFR4介导的致瘤效应。据统计大约33％的肝癌患者中高表达FGFR4,与预后和总存活率呈明显负相关性。结合体外和小鼠体内实验结果，靶向FGFR4的CAR-T细胞免疫治疗针对FGF19/FGFR4诱导的这一类群的肝癌患者也许会有比较好的预后效果。
现有FGFR4单克隆抗体的主要缺点之一是选择性差，脱靶现象会导致肝毒性等不良反应。到目前为止，FDA没有批准任何FGFR4特异性的抑制剂上市。因此基于基因工程合成高效特异性靶向FGFR4的单克隆抗体任重道远。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供抗FGFR4单克隆抗体、靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞及其应用。
本发明的具体技术方案如下：
本发明第一方面提供一种抗FGFR4单克隆抗体，所述抗FGFR4单克隆抗体包含轻链和重链，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明第二方面提供一种抗FGFR4单链抗体，所述抗FGFR4单链抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，所述抗FGFR4单链抗体进一步包含轻链可变区和重链可变区之间的接头。
本发明第三方面提供编码所述抗FGFR4单克隆抗体，或所述抗FGFR4单链抗体的核苷酸序列；
优选地，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，编码所述抗FGFR4单克隆抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，编码所述抗FGFR4单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
本发明第四方面提供所述抗FGFR4单克隆抗体，或所述抗FGFR4单链抗体在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括血液瘤和实体瘤；
优选地，所述肿瘤为肝癌。
本发明第五方面提供一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括所述抗FGFR4单链抗体；
优选地，所述嵌合抗原受体自N末端到C末端包括权利要求2或3所述抗FGFR4单链抗体、胞外铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和激活结构域。
进一步地，所述胞外铰链区为选自CD8铰链区；
所述跨膜结构域为CD8跨膜区；
所述共刺激结构域为41BB；
所述激活结构域为CD3zeta。
本发明第六方面提供一种编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
本发明第七方面提供一种由所述嵌合抗原受体的核苷酸转录的mRNA。
本发明第八方面提供一种包含编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的表达载体；
优选地，所述表达载体选自慢病毒载体、逆转病毒载体或腺病毒载体。
本发明第九方面提供一种靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞，其为细胞表面被所述嵌合抗原受体修饰的T细胞。
本发明第十方面提供一种靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述制备方法为：将所述嵌合抗原受体的核苷酸转录的mRNA，或所述包含编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的表达载体转染至T细胞中。
本发明第十一方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的包含编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的表达载体，或所述的靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞。
本发明第十二方面提供所述的靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞，或所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括血液瘤和实体瘤；
优选地，所述肿瘤为肝癌。
本发明的有益效果为：
本发明提供一种抗FGFR4单克隆抗体和抗FGFR4单链抗体，有其独特的抗体可变区序列，具有高的生物活性和高效特异的靶向性。进一步提供靶向以肝癌为代表的多种实体瘤特异性靶点FGFR4的嵌合抗原受体CAR-FGFR4，CAR-FGFR4包含特异性识别FGFR4的膜外单链抗体可变区基因(ScFv)段，、胞外铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和激活结构域。利用基因工程技术在人体杀伤性T细胞上表达CAR-FGFR4制备FGFR4-CAR-T，并FGFR4-CAR-T回输至患者体内，可以高效且特异性的杀伤癌细胞，可用于治疗肝癌等多种癌症。
附图说明
图1.6G12F5抗体亲和力检测图。
图2.FGFR4单克隆抗体6G12F5抗体能够特异性识别Jurkat细胞表面的FGFR4。黑色：同型对照；蓝色:6G12F5；红色:商业化抗体(Biolegend,324305)。
图3.CAR-FGFR4 BBzeta慢病毒载体的构造示意图。其以HIV的NL4-3克隆为骨架，EF1alpha为启动子，包括了anti-FGFR4 ScFv段，CD8铰链段，CD8跨膜区以及细胞内的41BB和CD3zeta信号通路段。
图4.FGFR4-CAR慢病毒有效转导Jurkat细胞检测结果。UTD，用未转染的细胞上清感染Jurkat作为阴性对照。
图5.FGFR4-CAR-T的生产过程流程图。
图6.FGFR4-CAR-T靶向杀伤T细胞。FGFR4-CAR-T细胞与靶细胞Huh7共孵育16个小时(E:T＝0.3:1，0.6:1,1.2:1,2.5:1，5:1,10:1，20:1)，RTCA检测CTL介导的细胞毒性效应。图中展示了共培养体系中靶细胞Huh7的活性状态。
图7.CAR-T可在体内靶向杀伤肿瘤细胞。A)CAR-T可在体内靶向杀伤血液瘤细胞。CAR-T细胞注入荷瘤小鼠后第0,6,10,15天，通过小动物成像仪IVIS LuminaXR对小鼠进行成像，监测肿瘤生长情况，进而确证CAR-T的抗肿瘤活性。可见随着时间推移，靶细胞(携带荧光素酶Luciferase)被CAR-T细胞清除干净。图中展示的是CAR-T细胞注入后第10天肿瘤细胞清除状况。B)FGFR4-CAR-T可在体内靶向杀伤肝癌细胞系。皮下注射Huh7细胞系12天后，尾静脉注入低剂量(1x10^6/mouse)或中剂量(5x10^6/mouse)FGFR4-CAR-T细胞，回输后第7天中剂量CAR-T组小鼠的肿瘤明显减小，后续药效还在监测中。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
1.FGFR4单克隆抗体的生产
采用杂交瘤法(由Kohler等，Nature,256:495(1975)首先提出)。用FGFR4-Fc蛋白抗原(深圳市中科艾深医药有限公司提供，氨基酸序列及制备方法参考专利201610067931.2)免疫雌性BALB/c小鼠(6周龄)，首次免疫使用弗氏完全佐剂进行乳化抗原，第二次免疫开始，使用弗氏不完全佐剂乳化抗原，皮下5～6点注射，每只小鼠注射的抗原量为～100μg。在第3次免疫后10天，对小鼠剪尾采集少量血液进行血清效价ELISA检测，选择抗体滴度高(>1:100000)的小鼠进行加强第4次免疫，通过腹腔注射抗原蛋白，每只小鼠注射100μg。第4次免疫后3～5天，处死小鼠取其脾细胞与SP2/0细胞融合，通过HAT培养基培养获得稳定的杂交瘤细胞。通过ELISA法筛选得到能分泌FGFR4抗体的杂交瘤细胞，通过有限稀释的方法进行亚克隆，ELISA法筛选得到能分泌FGFR4抗体的单克隆杂交瘤细胞株，通过逐级扩大培养，液氮冻存保种。
腹水抗体制备：雌性BALB/c小鼠(8周龄)腹腔注射弗氏不完全佐剂，每只小鼠注射0.5ml，3～5天后腹腔注射处于对数生长期的杂交瘤细胞，每只小鼠注射1～5×105个细胞(0.5ml)，注射杂交瘤细胞～11天后处死小鼠，获得腹水。3000rpm，4℃离心10min，去除沉淀，用10倍体积1×PB溶液稀释腹水，混匀后过0.45μm滤膜。通过Protein G(Protein GSepharose 4Fast Flow,GE Healthcare)亲和纯化腹水，得到纯化的FGFR4抗体蛋白，用BCA法测抗体浓度。将纯化抗体跑SDS-PAGE(上样量5.4μg)，考马斯亮蓝染色。
2.FGFR4单克隆抗体杂交瘤细胞的抗体基因测序
收获处于对数生长期的单克隆抗体杂交瘤细胞，TRIZOL裂解进行RNA提取，反转录后获得cDNA，扩增并获得重链和轻链可变区，将非功能性VK基因去除，克隆至pMD18-T载体，测序，使用IMGT/V-QUEST数据库进行测序结果比对，进一步分析。
碱基序列6G12F5 SEQ ID NO.1：
GGATCCATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCC
GCTCGGCCCGAGGTGATGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGT
CCCTGAAACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACTTTCAGGAACTATGCCATGTCTTGGG
TTCGCCAGTCTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAGAAATTAGTAATGGTGGTAGA
TATATCTACTATCCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAG
AACACCCTGTACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTG
TGTAAGGGGGGGGGAAAAGACCTCGGGCTACGTCTGGTTTGCTTACTGGGGCGAAGGA
ACTTTAGTCACAGTCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGAT
CTGACATCCAGATGACTCAGACTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGAAGAAACTGTC
ACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAA
CAGGGAAGATCTCCTCAACTCCTGCTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCC
ATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGC
AGCCTGAAGATTTTGGGATTTATTACTGTCAACATTTTTCTGGAACTCCGTACACGTTCG
GAGAGGGGACAAAATTGGAAATAACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGC
TCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTG
GTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGATATCTACATTTGGGCCCCTC
TGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGTAAGCGCG
GTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACT
CAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAA
CTGCGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACC
AGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCG
GAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGG
CCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGA
AAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCG
CCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTAAGAATTC重链可变区核苷酸序列SEQ ID NO.2：
GAGGTGATGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAAC
TCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACTTTCAGGAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGT
CTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAGAAATTAGTAATGGTGGTAGATATATCTACT
ATCCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTG
TACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGTAAGGGG
GGGGGAAAAGACCTCGGGCTACGTCTGGTTTGCTTACTGGGGCGAAGGAACTTTAGTC
ACAGTCGGT
重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.3：
EVMLVESGGGLVKPGGSLKLSCAVSGFTFRNYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISNGGRYIYYP
DTVTGRFTISRDNAKNTLYLEMSSLRSEDTAMYYCVRGGEKTSGYVWFAYWGEGTLVTVG
SEQ
轻链可变区核苷酸序列SEQ ID NO.4：
GACATCCAGATGACTCAGACTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGAAGAAACTGTCAC
CATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACA
GGGAAGATCTCCTCAACTCCTGCTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCAT
CAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCA
GCCTGAAGATTTTGGGATTTATTACTGTCAACATTTTTCTGGAACTCCGTACACGTTCGG
AGAGGGGACAAAATTGGAAATAACC
轻链可变区氨基酸序列SEQ ID NO.5：
DIQMTQTPASLSASVEETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGRSPQLLLYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTQFSLKINSLQPEDFGIYYCQHFSGTPYTFGEGTKLEIT
抗FGFR4单链抗体(ScFv)的核苷酸序列SEQ ID NO.6：
GGATCCATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCCGAGGTGATGCTTGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACTTTCAGGAACTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGTCTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAGAAATTAGTAATGGTGGTAGATATATCTACTATCCAGACACTGTGACGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGGAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCATGTATTACTGTGTAAGGGGGGGGGAAAAGACCTCGGGCTACGTCTGGTTTGCTTACTGGGGCGAAGGAACTTTAGTCACAGTCGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGTCGGGTGGCGGCGGATCTGACATCCAGATGACTCAGACTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGAAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAGATCTCCTCAACTCCTGCTCTATAATGCAAAAACCTTAGCAGAAGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGATTTATTACTGTCAACATTTTTCTGGAACTCCGTACACGTTCGGAGAGGGGACAAAATTGGAAATAACC
3.FGFR4单克隆抗体的亲和力测定
使用10μg/ml FGFR4-Fc((深圳市中科艾深医药有限公司提供))蛋白与传感器进行固化结合，使用SD buffer(PBS+0.02％Tween 20+0.1％BSA)配制不同浓度的6G12F5抗体(566.7nM、283.3nM、141.7nM、70.8nM、35.4nM、17.7nM、8.84nM)作为流动相，使用分子间相互作用仪(OCTET K2，PALL life science)进行亲和力检测，程序设定为：Baseline240s，Loading 360s，Baseline2180s，Association 480s，Dissociation 480s，使用AHC(Anti-hIgG Fc Capture)传感器。结果如下表和如图1所示，6G12F5抗体与FGFR4的亲和力<1.0E-12(M)。
4.流式检测FGFR4单克隆抗体的特异性
构建瞬时表达FGFR4的Jurkat细胞，孵育FGFR4单克隆抗体6G12F5，商业化的anti-FGFR4抗体作为阳性对照，6G12F5能与Jurkat膜细胞表面的FGFR4蛋白结合，应用于流式细胞检测(图2)。
实施例2
1.靶向FGFR4的嵌合抗原受体的设计
本发明提供的靶向FGFR4的嵌合抗原受体自N末端到C末端包括实施例1中抗FGFR4单链抗体、胞外铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和激活结构域。
在本发明一个具体的实施例中，胞外铰链区为选自CD8铰链区、跨膜结构域为CD8跨膜区、共刺激结构域为41BB、激活结构域为CD3zeta。
CD8铰链区核苷酸序列SEQ ID NO.7：
ACCACTACCCCTGCCCCTAGACCACCTACCCCTGCCCCAACAATTGCATCTCAGCCCCTGAGCTTGAGACCTGAAGCATGCAGACCTGCTGCTGGGGGGGCTGTGCACACAAGAGGCCTGGACTTTGCCTGTGAC
CD8跨膜区核苷酸序列SEQ ID NO.8：
ATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCTGGCACCTGTGGGGTGCTGCTGCTGAGCCTGGTGATCACCCTGTACTGC
4-1BB核苷酸序列SEQ ID NO.9：
AAGAGAGGGAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCTGTGCAGACCACCCAAGAGGAGGATGGCTGCAGCTGCAGATTCCCTGAGGAGGAGGAGGGGGGCTGTGAGCTG
CD3zeta核苷酸序列SEQ ID NO.10：
AGAGTGAAGTTCAGCAGATCTGCTGATGCCCCTGCCTACAAGCAAGGGCAGAATCAGCTCTACAATGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTATGATGTGCTGGACAAGAGAAGAGGCAGAGACCCTGAGATGGGGGGCAAGCCTAGAAGAAAGAACCCCCAAGAGGGCCTGTATAATGAGTTGCAAAAGGACAAGATGGCTGAGGCCTACTCTGAGATTGGCATGAAGGGGGAGAGAAGAAGAGGCAAGGGCCATGATGGCCTGTACCAAGGCCTGAGCACAGCCACCAAGGACACCTATGATGCCCTGCACATGCAAGCCCTGCCCCCTAGA
2.CAR-FGFR4的设计与慢病毒载体的构建
本实施例进一步提供靶向FGFR4的嵌合抗原受体(CAR-FGFR4)慢病毒表达质粒的设计，CAR-FGFR4慢病毒表达质粒以EF1alpha为启动子，包含了与FGFR4结合的ScFv段，CD8铰链段，CD8跨膜区以及位于T细胞内的41BB和CD3zeta信号通路段(图3)。CAR-FGFR4慢病毒质粒的载体来自于HIV的NL4-3克隆。HIV内部结构已经被最大程度的破坏，以去除其致病性，因此载体只保留了HIV的一部分保守区域。
本实施例进一步通过慢病毒包装构建CAR-FGFR4慢病毒载体，病毒包装采用水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)衣壳。为确保安全性，采用第三代慢病毒四质粒包装体系，共转四质粒到HEK293T细胞中生产病毒载体。考虑到后期临床应用安全性需求，所有质粒已转换为卡那霉素抗性。VSV-G衣壳会协助病毒载体向细胞膜的粘附，并保持慢病毒的感染性。具体操作为：在HEK293T细胞共转CAR-FGFR4表达质粒(pWPXLd-CAR-FGFR4)，包装质粒(pMDLg/pRRE&pRSV-Rev)和VSV-G包膜质粒(pMD2.G)，48小时后收取病毒液上清。取0.2ml病毒上清感染Jurkat细胞，两天后收获细胞用protein L染色，利用流式细胞技术检测FGFR4-CAR在膜表面的表达水平。用未转染的细胞上清感染Jurkat作为阴性对照(UTD)。收取病毒液上清感染Jurkat细胞，通过流式检测FGFR4阳性的细胞高达58.6％(图4)。说明制备的CAR-FGFR4慢病毒载体具有可观的转导效率。
3.FGFR4-CAR-T细胞的制备方法
靶向FGFR4的CAR-T细胞(FGFR4-CAR-T细胞)的制备，可以使用表达嵌合抗原受体的慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体等进行转染T细胞。表达嵌合抗原受体的慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体制备时，可以采用脂质体、磷酸钙等转染方法。下面以上述构建的CAR-FGFR4慢病毒载体制备FGFR4-CAR-T细胞进行说明，FGFR4-CAR-T细胞制备流程见图5，具体包括步骤：
a)采集患者/志愿者新鲜的外周血液30-100ml；
b)从患者外周血液中分离出杀伤性淋巴细胞，具体方案是通过离心沉降、细胞粒径筛选等物理方法，以及磁珠靶向细胞表面抗原特异性筛选的方法，筛选出患者外周血液中具有高活性和扩增性的T细胞群；
c)对分离后的杀伤性淋巴细胞进行特异性体外扩增。具体培养方法是利用抗CD3/抗CD28抗体包被的磁珠活化T细胞。细胞制备采用GMP级全封闭的细胞培养体系，以及临床级的细胞培养液。细胞制备周期约为2周。获得CD3+T淋巴细胞。
d)使用CAR-FGFR4慢病毒载体对培养中的淋巴细胞进行基因改造，即取上述CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的所述制备的CAR-FGFR4慢病毒进行培养。培养的第3天，收集合适数量的感染慢病毒的T细胞，制作FGFR4-CAR-T。
FGFR4-CAR-T体外扩增完成后，对其进行效能实验(例如，肿瘤杀伤性，扩增性，细胞因子分泌能力等)以及安全性实验(例如，内毒素，过敏原，细菌/真菌/支原体等)。培养完成的FGFR4-CAR-T采用回输专用的细胞冻存液冻存，以供患者回输之用。
4.FGFR4-CAR-T细胞能够靶向杀伤靶细胞
分别取未转导的CAR-T细胞(蓝色曲线)与FGFR4-CAR-T细胞(红色曲线)加入前一天铺板的靶细胞Huh7共培养，用Real Time Cell Analysis实时检测CAR-T细胞的体外杀伤效应。如图6显示，CAR-T细胞的体外杀伤效应呈现剂量依赖性，加入高剂量CAR-T后20-30小时内高达40％的Huh7细胞被FGFR4-CAR-T细胞识别并杀伤(E:T＝2.5:1)。
同时，申请人建立了完善的CAR-T细胞针对血液瘤和实体瘤的体内药效和安全性评价的实验操作技术平台。如图7所示，FGFR4-CAR-T可在体内靶向杀伤肿瘤细胞。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (14)

1.一种抗FGFR4单克隆抗体，其特征在于，所述抗FGFR4单克隆抗体包含轻链和重链，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。
2.一种抗FGFR4单链抗体，其特征在于，所述抗FGFR4单链抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.根据权利要求2所述的抗FGFR4单链抗体，其特征在于，所述抗FGFR4单链抗体进一步包含轻链可变区和重链可变区之间的接头。
4.编码权利要求1所述抗FGFR4单克隆抗体，或权利要求2或3所述抗FGFR4单链抗体的核苷酸序列；
优选地，所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
优选地，编码所述抗FGFR4单克隆抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
优选地，编码所述抗FGFR4单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
5.权利要求1所述抗FGFR4单克隆抗体，或权利要求2或3所述抗FGFR4单链抗体在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括血液瘤和实体瘤；
优选地，所述肿瘤为肝癌。
6.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括权利要求2或3所述抗FGFR4单链抗体；
优选地，所述嵌合抗原受体自N末端到C末端包括权利要求2或3所述抗FGFR4单链抗体、胞外铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和激活结构域。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞外铰链区为选自CD8铰链区；
所述跨膜结构域为CD8跨膜区；
所述共刺激结构域为41BB；
所述激活结构域为CD3zeta。
8.一种编码权利要求6或7所述嵌合抗原受体的核苷酸序列。
9.一种由权利要求8所述嵌合抗原受体的核苷酸转录的mRNA。
10.一种包含权利要求8所述核苷酸序列的表达载体；
优选地，所述表达载体选自慢病毒载体、逆转病毒载体或腺病毒载体。
11.一种靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，其为细胞表面被权利要求6或7所述嵌合抗原受体修饰的T细胞。
12.一种靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：将权利要求9所述的mRNA，或权利要求10所述的表达载体转染至T细胞中。
13.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求10所述的表达载体，或权利要求11所述的靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞。
14.权利要求11所述的靶向FGFR4的嵌合抗原受体T细胞，或权利要求13所述的药物组合物在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述肿瘤包括血液瘤和实体瘤；
优选地，所述肿瘤为肝癌。
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