MX2011000328A - Antagonistas especificos del receptor fgf-r4. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a moléculas del antagonista específico del receptor FGF-R4 que permiten la inhibición de la actividad del receptor. Los antagonistas son, particularmente, anticuerpos específicos de FGF-R4 que permiten la inhibición de la actividad del receptor. La presente invención también se refiere al uso terapéutico de los anticuerpos, particularmente en el campo de la angiogénesis y en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer.

Description

ANTAGONISTAS ESPECIFICOS DEL RECEPTOR FGF-R4 Campo de la Invención La presente invención tiene por objeto antagonistas específicos del receptor 4 de FGF (FGF-R4) que permiten inhibir la actividad de este receptor. Estos antagonistas son en particular anticuerpos dirigidos específicamente contra el receptor 4 de FGF (FGF-R4).

Antecedentes de la Invención La presente invención tiene igualmente por objetó el uso terapéutica de estos antagonistas, en particular en el dominio de la angiogénesis y. en el tratamiento de algunos tipos de cáncer.

Los FGF (Factor de Crecimiento de Fibroblastos) se consideran entre las primeras moléculas que se describe que son capaces de estimular la proliferación, migración y diferenciación de células vasculares in vitro e in vivo. Una bibliografía abundante describe la inducción de la angiogénesis y la formación de capilares sanguíneos in vitro e in vivo por los FGF. Los FGF están igualmente implicados en la angiogénesis tumoral que fomenta la formación de vasos sanguíneos reclutados por el tumor.

La familia de los FGF humanos consta de al menos 23 miembros que poseen todo un dominio central conservaco de 120 aminoácidos. Ejercen su actividad biológica interactuando con sus receptores de alta afinidad de tipo tirosina-cinasa (fpGF-R) y heparanos sulfato proteoglucanos, componentes presentes en la mayor parte de las superficies celulares y matrices extracelulares (sitio de unión de débil afinidad) para formar un complejo ternario. Algunos FGF presentan una alta afinidad por diversos FGF-R aunque otros activan específicamente un receptor o una isoforma de un receptor.

Se ha identificado un ligando específico de FGF-R4 por Xie y colaboradores (Cytokine, 1999, 11:729-35.) Este ligando, denominado FGF19, es un ligando de alta afinidad por FGF-R4 exclusivamente y cuya unión al receptor depende de la heparina o de los heparanos-sulfatos. El FGF19 ha sido identificado en el animal adulto, únicamente al nivel de hepatocitos y del ntestino delgado donde regula la síntesis de ácido biliar por el hígado. Será un factor de crecimiento que intervenga durante el desarrollo embrionario y estará implicado en el desarrollo del cerebro fetal en el pez cebra y en el humano.

Otros ligandos de FGF-R4 se describen como el FGF1 o FGF2. Estos ligandos activan considerablemente el FGF-R4 pero no son específicos de FGF-R4: se unen también a otros FGF-R (Ornitz y colaboradores. J. Biol. Chem., 1996, 271:15292 7).

La activación del receptor FGF-R4 conduce a diversos tipos de señalizaciones celulares. Entre éstas, la forma más clásica que corresponde a la disposición de una vía de señalización por cascada de fosforilación a raíz de una estimulación de FGF-R4 por el FGF. Esta inducción conduce a la autofosforilación del dominio tirosina cinasa de FGF-R4 y sirve para iniciar una vía de señalización intracelular dependiente de las fosforilaciones de otras proteínas de señalización tales como AKT, p44/42, JNK etc. Esta señalización por fosforilación varía de acuerdo al tipo celular y de acuerdo a los receptores conjuntos o las moléculas de adhesión presentes en la superficie de estas células. (Caiallaro y colaboradores., Nat. Cell Biol. 3/7, 650-657 (2001); Stadler y colaboradores., Cell. Signal. 18/6, 783-794. (2006); Lin. y colaboradores, J Biol Chem., 2007, 14:27277-84. (2007)). Otra forma de señalización importante para los FGF-R, uno de ellos FGF-R4, es la internalización del receptor después de la activación en asociación con su ligando. Este mecanismo no depende de la actividad tirosina cinasa del receptor sino de una corta secuencia en el C-terminal de FGF-R4 (Klingenberg y colaboradores., J.' Cell Sci., 113/Pt10: 1827-1838 (2000)).

Se describen cuatro formas distintas de FGF-R4 en la bibliografía. Una forma de tamaño pleno con 2 ganantes polimórficas en la posición 388 a saber el FGF-R4 Gly388 que es la forma normal del receptor y la forma Arg388 que se describe en el ámbito de diversos tumores (Bange y colaboradores. , Cáncer Res. 62/3, 840-847 (2002); Spinola y colaboradores., J Clin Oncol 23, 7307-7311 (2005); Stadler y colaboradores., Cell. Signal. 18/6, 783-794. (2006)). Se ha descubierto igualmente una forma soluble expresada en células tumorales mamarias (Takaishi y colaboradores. , Biochem Biophys Res Commun., 2000, 267:658- 62). Se ha descrito una cuarta forma, truncada en la parte extracelular, en algunos adenomas hipofisarios (Ezzat y colaboradores., J Clin Invest., 2002, 109:69-78).

El FGF-R4 se expresa principalmente en los tejidos derivados del endodermo tales como el tubo digestivo, páncreas, hígado, músculos y glándulas suprarrenales.

Se sabe en la bibliografía que el FGF-R4 tiene jdiversos papeles celulares, de los cuales los tres principales se diescriben a continuación: Primero, este receptor está implicado en el control de diferentes procesos de diferenciación celular in vitro e in vivo como la diferenciación y la regeneración de los músculos esqueléticos, la diferenciación del tejido mesenquimatoso, osteogénesis o incluso en la formación de los alveolos durante el desarrollo hepático posnatal.

Segundo, el FGF-R4 se describe en el controjl de la homeostasis del ácido biliar y del colesterol e intervendrá en el control de la adiposidad. Además, el equilibrio entre la producción del ácido biliar y la del colesterol está controlado por el| FGF-R4 in vitro e in vivo.

Tercero, el FGF-R4 está implicado en algunos fenómenos tumorales como el desarrollo de carcinomas hepatocelulares o tumores malignos. de colon, en la proliferación de células de fibroadenomas mamarios, células epiteliales de tumores malignos mamarios, como la motilidad de células de carcinomas mamarios o colorrectales. La implicación tumoral del FGF-R4 está mayoritariamente asociada a la aparición de polimorfismo (Gly388Arg) correlacionado con la aceleración de la progresión tumoral de tumores mamarios y colorrectales (Bange y colaboradores., Cáncer Res. 62/3, 840-847. 2002), prostéticos (Wang y colaboradores., Clin. Cáncer Res. 10/18, 6169-6178, 2004) o hepáticos (Nicholes y colaboradores., Am. PAthol. 160/6, 2295-307, 2002). Este polimorfismo está asoci también mal pronóstico en el ámbito de los sarcomas (Morimoto y colaboradores., Cáncer 98/10, 2245-2250, 2003), adenocarcinomas pulmonares (Spinola y colaboradores. J Clin Oncol 23, 7307-7311, 2005) o sarcomas escamosos (d a Costa Andrade y colaboradores., Exp Mol Pathol 82, 53-7 J 2007).

También se ha descrito la sobreexpresión de FGF-R4 en algunas líneas de tumores malignos pancreáticos (Shah y colaboradores., Oncogene 21/54, 8251-61, 2002) y se correlaciona | con la malignidad de los astrocitomas (Yamada y colaboradores. [ Neurol. Res. 24/3, 244-8, 2002). Además, el uso de un anticuerpo monoclonal anti-FGF19 en modelos in vivo de xenoinjertos de tumores de colon o en modelos de carcinomas hepatocelulares, muestra que la inactivación del FGF19 y luego el bloqueo de la activación de FGF-R4 puede ser beneficioso en el tratamiento de cáncer de colon o de hígado.

Se admite en la bibliografía que las parejas FGF/FGF-R1 y FGF/FGF-R2 participan en la formación de nuevos vasos sanguíneos en un contexto normal o patológico. Sin embargo, nunca se ha estudiado la potencial implicación de FGF-R4 en el control de este fenómeno celular. Hasta ahora, en efecto, se ha supuesto que la activación de la angiogénesis está mediada por FGF-R1 y/o FGF-R2 (Presta y colaboradores, Cytokine] Growth Factor Rev., 2005, 16:159-78).

Se describen ejemplos de antagonistas de FGF-R4 en la bibliografía, especialmente: pequeñas moléculas, pero no determinan el FGF-R4 de manera específica, acarreando así efectos indeseables. Así se han descrito pequeñas moléculas químicas inhibidoras del dominio tirosina cinasa que inhiben diversos FGF-R, así como otros receptores tirosina cinasa por Thompson y colaboradores (Thompson y colaboradores J Med Chem., 2000, 43:4.200-11.). Se han descrito también pequeñas moléculas químicas inhibidoras de FGF-R por asociación a su parte extracelular en la solicitud de patente internacional WO 2007/080325.

Se han estudiado también anticuerpos como los anticuerpos anti-FGFR1 y/o anti-FGFR4 descritos en las solicitudes de patente internacional WO 2005/066211 y WO 2008052796 o por Chen y colaboradores (Hybridoma 24/3, 152-159, 2005). La i solicitud de patente internacional WO 2005/037235 describe anticuerpos antagonistas de FGF-R para el tratamiento de la obesidad y la diabetes. Por otra parte, se describen anticuerpos anti-FGF-R4 agonistas en la solicitud de patente internacional WO invención se une al dominio D2 del receptor FGF-R4. En una forma incluso más ventajoso, el antagonista se une a la secuencia SEC ID N° 70 De manera v.entajosa el antagonista específico del ¡receptor FGF-R4 tiene un KD en comparación con el receptor | FGF-R4 determinado por la técnica Biacore inferior a 10E-8 M, inferior a 5 x 10E-9M, inferior a 2 x 10E-9M o inferior a 1 x 10E-9M.

En una forma de modalidad ventajoso el antagonista específico del receptor FGF-R4 es activo a la vez contral FGF-R4 humano y FGF-R4 murino.

En otra forma de modalidad ventajoso el antagonista específico del receptor FGF-R4 es activo a la vez contra FGF-R4 humano, FGF-R4 murino y FGF-R4 de rata. |" En una forma de modalidad ventajoso, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende al menos una CDR que presenta una secuencia idéntica a SEC ID N°: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 73, 74, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 88, 89, 190, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 108, 109 ó 110 o al menos una CDR cuya secuencia difiera en uno a dos aminoácidos con respecto a las secuencias SEC ID N° 9, 10, 11, 12, 13, 14, 73, 74, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 88, 89, 90, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 108, 109 ó 110, siempre que los anticuerpos mantengan su especificidad de unión.

En una forma de modalidad particularmente ventajoso, los anticuerpos antagonistas específicos del receptor FGF-R4 comprenden CDR de secuencia SEC ID N°: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 73, 74, 75, 78, 79, 80, 83, 84, 85, 88, 89, 90, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 108, 109 ó 110 o CDR cuyas secuencias difieren en uno a dos aminoácidos con respecto - respecti amente - a las secuencias ya citadas, siempre que eso no modifique la especificidad de unión de los anticuerpos al receptor FGF-R4.

En una forma de modalidad ventajoso, los anticuerpos de la invención comprenden al menos una cadena pesada y al menos una cadena ligera, comprendiendo tal cadena pesada tres secuencias, teniendo CDR las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID N°: 9, 10 y 11 ó 73, 74 y 75, 83, 84 y 85 ó 93, 94 y 95 ó 103, 104 y 105, comprendiendo tal cadena ligera tres secuencias, teniendo CDR las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en SEC ID N°: 12, 13 y 14 ó 78, 79 y 80 ó 88, 8,9 y 90 ó 98, 99 y 100 ó 108, 109 y 110.

En una forma de modalidad ventajosa las partes variables de la cadena pesada de los anticuerpos antagonistas específicos del receptor FGF-R4 comprenden una secuencia que presenta al menos el 80%, 90%, 95% ó 99% de identidad con la secuencia SEC ID N°: 6, 77, 87, 97 ó 107.

En una forma de modalidad ventajosa las partes variables de la cadena ligera del anticuerpo antagonista espec fico del receptor FGF-R4 comprenden una secuencia que presenta al menos el 80%, 90%, 95% ó 99% de identidad con la secuencia SEC ID N°: 8, 72, 82, 92 ó 102.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena pesada que comprende una parte variable codificada por una secuencia nucleotídica que presenta una identidad de al menos 80%, 90%, 95% ó 99% con la secuencia SEC ID N°: 5, 76, 86, 96 ó 106.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena ligera que comprende una parte variable codificada por una secuencia nucleotídica que presenta una identidad de al menos 80%, 90%, 95% ó 99% con la secuencia SEC ID N°: 7, 71, 81, 91 0 10 .

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena pesada que comprende una partel variable de secuencia polipeptídica SEC ID N°: 6, 77, 87, 97 ó 107.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena ligera que comprende una parte variable de secuencia polipeptídica SEC ID N°: 8, 72, 82, 92 ó 102] La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende secuencias codificadas por las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 5 y 7 ó 71 y 76 ó 81 y 86 ó 91 y 96 ó 101 y 106.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 6 y 8 ó 72 y 77 ó 82 y 87 ó 92 y 97 ó 102 y 107. | En una forma de modalidad ventajoso el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende secuencias idénticas o al menos el 80%, 90%, 95% ó 99% de la SEC ID N°: 2 y/o SEC ID N°: 4 o SEC ID N°: 72 y/o SEC ID N°: 77 o SEC ID N°: 82 y/o SEC ID N°: 87 o SEC ID N°: 92 y/o SEC ID N°: 97 o SEC ID N°: 102 y/o SEC ID N°: 107.

En una forma de modalidad particularmente ventajoso, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 conprende una cadena pesada codificada por una secuencia nuc eotídica idéntica al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 1.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista del receptor FGF-R4 que comprende una cadena pesada de secuencia polipeptídica idéntica al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 2.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena ligera codificada por una secuencia nucleotídica idéntica al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 3.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF R4 que comprende una cadena ligera de secuencia polipeptídica idéntica al menos ai 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 4.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias codificadas por las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 1 y 3.

En una forma incluso más ventajosa, el anticuerpo antagonista específico de FGF-R4 comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEC ID N° 2 y una cadena ligera que comprende la secuencia SEC ID N° 4.

El anticuerpo compuesto por una cadena pesada de secuencia SEC ID N° 2 y una secuencia ligera SEC ID|N° 4 se denominará 40-12 en la solicitud.

En una forma de modalidad de la invención, los anticuerpos específicos de FGF-R4 son activos a la vez contra | FG F-R4 humano, FGF-R4 n urino y FGF-R4 de rata.

En una forma de modalidad ventajoso, el antagonista específico del receptor FGF-R4 induce una inhibición de|las vías celulares AKT/p38.

En una forma de modalidad ventajoso, el antagonista específico del receptor FGF-R4 induce una inhibición de¡las vías celulares Erk112.

En una forma de modalidad ventajoso, el antagonista específico del receptor FGF-R4 induce una inhibición de| las vías de señalización celular controladas por FGF-.R4.

En otra forma de modalidad ventajosa, el antagonista específico del receptor FGF-R4 induce una inhibición de la proliferación celular tumoral.

En otra forma más de modalidad ventajoso, el antagonista específico del receptor FGF-R4 induce una inhibicióli de la angiogénesis.

En otra forma de modalidad particularmente ventajoso, el antagonista específico del receptor FGF-R4 presenta una afinidad por FGF-R4 10 veces superior a su afinidad por los otros receptores por FGF.

En una forma de modalidad particularmente ventajosa, el anticuerpo de acuerdo a la invención es un anticuerpo humanizado antagonista específico del receptor FGF-R4.

En una forma de modalidad el anticuerpo humanizado antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende una cadena ligera cuya parte variable está codificada por una secuencia nucleotídica idéntica al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 29 ó la secuencia SEC ID N° 31.

En otra forma de modalidad el anticuerpo humanizado antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende una cadena ligera cuya parte variable es idéntica al menos |al 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 30 o la secuencia SEC ID N° 32.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo humanizado antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende una cadena ligera cuya parte variable está codificada por una secuencia idéntica a la secuencia nucleotídica SEC ID N? 29 o la secuencia SEC ID N°: 31 La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humanizado antagonista específico del receptor FGF-R4, que comprende una cadena pesada cuya parte variable está codificada por una secuencia idéntica al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 33, a la secuencia SEC ID N° 35 o la secuencia SEC ID N° 37.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humanizado antagonista específico del receplor FGF-R4 que comprende una cadena pesada cuya parte variable es idéntica al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID i I N° 34, a la secuencia SEC ID N° 36 o la secuencia SEC IÜ N° 38.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humanizado antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena pesada codificada por una secuencia nucleotidica SEC ID N° 33 y/o SEC ID N°: 35 y/o SEC ID N°: 37.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humanizado antagonista específico del receptar FGF-R4 cuyas secuencias humanizadas de secuencia SEC ID N°: 30 ó 32 se utilizan en combinación con las secuencias humanizadas de secuencia SEC ID N°: 34, 36 ó 38.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende las CDR de secuencia SEC ID N°: 73, 74, 75, 78, 79 y 80 ó las CDR cuyas secuencias difieren en uno a dos aminoácidos con respecto - respectivamente - a las secuencias citadas antes, siempre que eso no modifique la especificidad de unión del anticuerpo al receptor FGF-R4.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende las CDR de secuencia SEC ID N°: 83, 84, 85, 88, 89 y 90 ó las CDR cuyas secuencias difieren en uno a dos aminoácidos con respecto - respectivamente - a las secuencias citadas antes, siempre que eso no modifique la especificidad de unión del anticuerpo al receptor FGF-R4.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende las CDR de secuencia SEC ID N°: 93, 94, 95, 98, 99 y 100 o las CDR cuyas secuencias difieren en uno a dos aminoácidos con respecto - respecti amente - a las secuencias citadas antes, siempre que eso no modifique la especificidad de unión del anticuerpo al receptor FGF-R4.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende las CDR de secuencia SEC ID N°: 103, 104, 105, 108, 109 y 110 o las CDR cuyas secuencias difieren en uno a dos aminoácidos con respecto -respectivamente - a las secuencias citadas antes, siempre que eso no modifique la especificidad de unión del anticuerpo al receptor FGF-R4.

En una forma de aplicación preferida de la invención, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende las CDR de secuencia SEC ID N°: 83, 84, 85, 88, 89 y 90.

En una forma de modalidad ventajosa, el ariticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 es un anticuerpo humano cuyas partes variables de la cadena pesada comprenden una secuencia nucleotídica que presenta al menos el 80|%, 90%, 95% ó 99% de identidad con la secuencia SEC ID N°: 76, ¡86 , 96 ó 106.

En una forma de modalidad ventajosa, el ariticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 es un anticuerpo humano cuyas partes variables de la cadena ligera comprenden una secuencia nucleotídica que presenta al menos el 80|%, 90%, 95% ó 99% de identidad con la secuencia SEC ID N°: 71, |81, 91 ó 101.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4, que comprende una cadena pesada que comprende una parte variable codificada por una secuencia proteica que presenta una identidad de al menos 80%, 90%, 95% ó 99% con la secuencia SEC ID N°: 77, 87, 97 ó 107.

La presente invención tiene igualmente por ob!jeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena ligera que comprende una parte variable codificada por una secuencia proteica que presenta una identidad de al menos 80%, 90%, 95% ó 99% con la secuencia SEC ID N°: 72, 82, 92 ó 102.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4, que comprende las secuencias codificadas por las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 71 y 76 ó las secuencias nuc eotídica SEC ID N°: 81 y 86 ó las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 91 y 96 ó las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 101 y 106.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4, que comprende las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 7j2 y 77 ó las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 82 y 87 ó las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 92 y 97 ó las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 102 y 107.

En una forma de modalidad ventajoso, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende secuencias idénticas al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la SEC ID N°: 72 y/o SEC ID N°: 77.

En otra forma de modalidad ventajoso, el anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende secuencias idénticas al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la SEC ID N°: 82 y/o SEC ID N°: 87.

En otra forma de modalidad ventajoso, el anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende secuencias idénticas al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la SEC ID N°: 92 y/o SEC ID N°: 97.

En otra forma de modalidad ventajoso, el anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 comprende secuencias idénticas al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la SEC ID N°: 102 y/o SEC ID N°: 107.

En una forma de modalidad preferido, la presente invención tiene por objeto un anticuerpo antagonista humano específico del receptor FGF-R4, que comprende una cadena ligera codificada por una secuencia nucleotídica idéntica al menos al 80¡%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 82 y que comprJnde una cadena ligera de secuencia polipeptídica idéntica al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a la secuencia SEC ID N° 87.

De manera incluso más preferida, la presente invención tiene por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias codificadas por las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 82 y 87.

El anticuerpo formado por una cadena pesada de secuencia SEC ID N° 77 y una secuencia ligera SEC ID N° 72, se denominará clon 8 en la solicitud.

El anticuerpo formado por una cadena pesada de sécuencia SEC ID N° 87 y una secuencia ligera SEC ID N° | 82, se denominará clon 31 en la solicitud.

El anticuerpo formado por una cadena pesada de secuencia SEC ID N° 97 y una secuencia ligera SEC ID N° 92, se denominará clon 33 en la solicitud.

El anticuerpo formado por una cadena pesada de secuencia SEC ID N° 107 y una secuencia ligera SEC ID N° | 02, se denominará clon 36 en la solicitud.

El campo de la presente invención no se limita a los anticuerpos que comprenden estas secuencias. En efecto, todos los anticuerpos que se unen de manera específica a FGF-R4, teniendo una acción antagonista sobre este receptor, entran en el i campo de la presente invención.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4, conjugado a un agente citotóxicos.

La presente invención tiene por objeto el usó de un antagonista específico del receptor FGF-R4, en el tratarniento de enfermedades asociadas a la angiogénesis.

La presente invención tiene por objeto el usó de un La presente invención tiene por objeto un método de tratamiento de una enfermedad asociada a un aumento patológico de la angiogénesis, que comprende la administración al paciente de un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento de i selección de un anticuerpo monoclonal antagonista específico del receptor FGF-R4, que comprende las etapas siguientes: a. inmunización en el ratón b. extracción de nodulos linfáticos en el ratón y c. cribado de sobrenadantes de hibridomas La presente invención tiene por objeto una línea celular que produce anticuerpos antagonistas específicos del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un procedimiento de producción de un anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4, que comprende poner en cultivo una línea celular que produzca anticuerpos antagonistas del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene por objeto un medicaménto que comprende un antagonista específico del receptor FGF-R4.

La presente invención tiene igualmente por objeto un polinucleótido que codifique un polipéptido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nos: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 30, 32, 34, 36, 38, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 80, 82 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 102, 103, 104, 105, 107, 108, 109, 110 y secuencias idénticas al menos al 80%, 90%, 95% ó 99% a una de estas secuencias.

La presente invención tiene por objeto un| vector recombinante que comprenda un polinucleótido tal cjomo se i describió anteriormente o que codifique un polipéptido t<a I como se describió anteriormente.

Con el fin de permitir la expresión de cadenas pesadas y/o cadenas ligeras del anticuerpo antagonista del receptor FGF-R4, objeto de la invención, los polinucleótidos que codifican tales cadenas se insertan en los vectores de expresión. Estos ectores de expresión pueden ser plásmidos, los YAC, cósmidos, retrovirus, episomas derivados de EBV (virus de Epstein-Barr, por sus siglas en inglés) y todos los vectores que el experto en la técnica puede juzgar apropiados para la expresión de tales cadenas.

La presente invención tiene por objeto una célula anfitriona que comprenda un vector recombinante tal como se describió anteriormente.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención tiene por objeto el uso de un anticuerpo dirigido específicamente contra FGF-R4 (sin reacción cruzada con FGF-R1, R2 ó R3) para la inhibición| de la angiogénesis y del crecimiento tumoral.

De manera inesperada, los autores han demostrado que el FGF-R4 desempeña un papel activo y específico en el control de la angiogénesis.

Esta función del FGF-R4 no había sido demostrada Inunca o propuesta antes. Por consiguiente, este receptor puede ser utilizado como blanco para tratar las patologías que presenten una disfunción angiogénica. Los ligandos del FGF-R4 capaces de modular su actividad son agentes terapéuticos potenciales para las numerosas patologías unidas a la angiogénesis. ' La presente invención puede ser utilizada en el tratamiento de todas las patologías que impliquen una desregulación de la angiogénesis y que necesiten una inhibición de ésta. Las patologías concernientes pueden ser el cáncer, con el uso de antagonistas de acuerdo a la invención como inhibidores de la angiogénesis tumoral o las patologías para las cuales se describe una desregulación de la angiogénesis como: la degeneración macular relacionada con la edad o DMLA (por sus siglas en inglés), enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide, osteoartritis, coliti i¡s, úlceras o cualquier enfermedad infla j matoria de los intestinos, ateroesclerosis o incluso en el tratamiento de la obesidad .

El uso de estos anticuerpos también se ilustra en la inhibición del crecimiento tumoral. Los antagonistas de acuerdo a la presente invención pueden ser utilizados para el tratamiento de ciertos tumores malignos que impliquen la desregulación del FGF-R4 y más en particular los tumores malignos de hígado, colon, mama, pulmón, próstata, páncreas, piel o esófago.

Una de las mayores ventajas de los antagonistas delacuerdo actividad FGF-R4 que limite los efectos secundarios.

Por «antagonista», se entiende todo ligando capaz de disminuir o inhibir totalmente la actividad del FGF-R4. Este compuesto antagonista se denomina también inhibidor de FGF- R4.

Este antagonista puede ser cualquier ligando de FGF-R4 tal como una molécula química, una proteína recombinante, un oligosacárido, un polisacárido, un oligonucleótido o un anticuerpo capaz de unirse de manera específica al receptor FGF-R4, con exclusión de cualquier otro FGFR.

Un objeto de la invención es pues un antagonista específico FGF-R4. De acuerdo a la invención, se entiende que un antagonista que se une específicamente al FGF-R4 es un ligando que no se une a los otros receptores de los FGF a saber FGF-R1, FGF-R2 ó FGF-R3. En particular, un anticuerpo específico de FGF-R4 es un anticuerpo que no presenta reacción cruzada con FGF-R1, FGF-R2 o FGF-R3.

Se entiende una unión específica una diferencia de un factor i al menos 10 entre la intensidad de la unión a un receptor con respecto a otro, aquí entre la unión al FGF-R4 y las luniones posibles a FGF-R1, FGF-R2 o FGF-R3.

En una forma de modalidad de la invención, el ligando de FGF-R4 es un oligosacárido o un polisacárido.

Se entiende que un oligosacárido es todo polímero de sacárido que contenga de tres a diez unidades de azúcar simples. Existen oligosacáridos naturales, como por ejemplo los fructo-oligosacáridos (FOS) y los oligosacáridos de síntesis como por ejemplo los anti-trombóticos miméticos de la heparina.

Por «polisacárido», se entiende todo polímero constituido además por diez monosacáridos unidos entre sí por enlaces glicosídicos. Existen polisacáridos naturales, como por ejemplo los mucopolisacáridos, fucoides, carragenanos, exopolisacáridos bacterianos y los polisacáridos de síntesis. Así, los fucoidanos de pesos moleculares bajos o los exopolisacáridos muy sulfatados han demostrado actividades pro-angíogénicas (Chabut y colaboradores., Mol Pharmacol., 2003, 64:696-702; Matou y colaboradores., Biochem Pharmacol., 2005, 69:751-9.). A la inversa, los oligosacáridos ligeramente sulfatados derivados de la heparina o el sulfato de fosfomanopentosa pueden presentar características antiangiogénicas (Parish y colaboradores., 1999, 15:3433-41; Casu y colaboradores., J Med Chem., 2004,112:838- 48) En una forma de modalidad de la invención, el ligjando de FGF-R4 es un anticuerpo.

Por «anticuerpo», se entiende todo tipo de anticuerpos o moléculas derivadas tales como los anticuerpos policlonales y monoclonales. Ení,re las moléculas derivadas de los anticuerpos monoclonales, se incluyen los anticuerpos humanizados, anticuerpos humanos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos quiméricos, fragmentos de anticuerpos, nanocuerpos.

En una forma de modalidad de la invención, el antagonista específico de FGF-R4 es un anticuerpo policlonal.

Un «anticuerpo policlonal» es un anticuerpo qué se ha producido entre una mezcla de anticuerpos que proceden de varios clones de linfocitos B y que reconoce una serie de epítopos diferentes.

En una forma de modalidad ventajosa, el antagonista específico de FGF-R4 es un anticuerpo monoclonal.

Un «anticuerpo monoclonal» es un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancjialmente homogénea resultante de un solo tipo de linfocitos B am plificada manera clonal. Los anticuerpos que forman esta población son idénticos excepto las posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en una cantidad muy reducida. Estos anticuerpos se dirigen contra, un solo epítopos y son pues a tamente específicos.

Por «epítopos» se entiende el sitio del antígeno al que se une el anticuerpo. Si el antígeno es un polímero, tal cocino una proteína o un polisacárido, el epítopos puede estar form|ado por restos contiguos o no contiguos.

En una forma de modalidad ventajosa de la invención, el anticuerpo antagonista anti-FGF-R4 se une a un epítopos perteneciente al dominio D2-D3 del receptor del FGF-R4.

En una forma incluso más ventajoso, el anticuerpo se une a un epítopos comprendido en el dominio que comprende los aminoácidos 144 a 365 del receptor del FGF-R4.

En una forma incluso más ventajoso, el anticuerpo se une a un epítopos comprendido en el dominio D2 del receptor del FGF-R4, correspondiendo este epítopos a los aminoácidos 14;5 a 242 descritos en la secuencia SEC ID N° 70. v Un anticuerpo, también denominado inmunoglobulina, está compuesto por dos cadenas pesadas idénticas («VH») y dos i cadenas ligeras idénticas («VL») que se unen por un' puente disulfuro. Cada cadena contiene una región constante y una región variable. Cada región variable comprende tres segmentos denominados «regiones que determinan la complementariedad» («las CDR, por sus siglas en inglés») o «regiones hipervariables», que son principalmente responsables de la unión al epítopos de un antígeno.

La terminología «VH» hace referencia a las regiones variables de una cadena pesada de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo las cadenas pesadas de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' o F(ab)'.

La terminología «VL» hace referencia a las regiones variables de una cadena ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo, incluyendo las cadenas ligeras de un fragmento Fv, scFv, dsFv, Fab, Fab' o F(ab)'.

Por «fragmento de anticuerpo» se entiende toda parte de éste: Fab (unión Fragmento antígeno), Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), Fe (Fragmento cristalizable). Preferentemente, estos fragmentos funcionales serán fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab') 2, Fab", scFv-Fc o diacuerpos que poseen en general la misma especificidad de fijación que el anticuerpo monoclonal, quimérico o humanizado que resulta. De acuerdo a la presente invención, los fragmentos de anticuerpos de la invención se pueden obtener a partir de anticuerpos monoclonales, quiméricos o humanizados, por métodos tales como la digestión por enzimas, como la pepsina o la papaína y/o por escisión de ¡puentes disulfuro por reducción química.

Por «regiones CDR o las CDRs», se entiende designar las regiones hipervariables de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulinas, como se define por Kabat y colaboradores. (Kabat y colaboradores, Sequences of proteins of immurological interest, 5a Ed., U^S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991 y ediciones posteriores). Existen 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. La terminología CDR o las CDRs se utiliza en el presente documento para designar siguiendo el caso, una de estas regiones o varias, incluso el conjuntó, de estas regiones que contienen la mayoría de los restos de aminoácidos responsables de la unión afín del anticuerpo por el antígeno o el epítopos que reconóce. Las regiones más conservadas de los dominios variables se denominan regiones o secuencias FR para «estructura» o regiones «armazones».

En otra forma de modalidad de la invención, el antagonista específico de FGF-R4 es un anticuerpo quimérico.

Por «anticuerpo quimérico» se entiende un anticuerpo en donde la región constante o una porción de ésta, se modifican, se reemplaza o se cambia, tal que la región variable está unida a una región constante de una especie diferente o pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos.

Se entiende igualmente por «anticuerpo quimérico» un anticuerpo en donde la región variable o una porción de ésta, se modifican, se reemplaza o se cambia, tal que la región constante está unida a una región variable de una especie diferente o pertenece a otra clase o subclase de anticuerpos.

Los métodos de producción de anticuerpos quiméricos son conocidos por el experto en la técnica. Ver por ejemplo, Morrison, 1985, Science, 229:1202; Oi y colaboradores., 1986, Bio Techniques, 4:214; Gillies y colaboradores., 1989, J. Immunol. Methods, 125:191-202; patentes de EE.UU. Nos. 5, ,807, 715; 4,816,567 y 4,816,397.

Estas versiones quiméricas de anticuerpos pueden consistir en la fusión de partes variables VL y VH a las partes constantes de Ckappa y CH (lgG1) de origen humano para generar un anticuerpo monoclonal quimérico.

La parte CH ( I g G 1 ) también se puede modificar por mutaciones puntuales para aumentar la afinidad del fragmento Fe por el receptor FcyRIIIa y por la misma aumentar las funciones eficaces de los anticuerpos (Lazar y colaboradores., 2006, Proc Nati. Acad. Sci. EE.UU. 103: 4005-4010; Staven jagen y colaboradores., 2007, Cáncer Res. 67: 8882-8890).

La presente invención incluye las versiones humanizadas de los anticuerpos.

Por «anticuerpo humanizado» se entiende un anticuerpo que contiene principalmente secuencias humanas de la inmunoglobulina. Esta terminología hace referencia en general a una inmunoglobulina no humana que ha sido modificada por incorporación de secuencias humanas o de restos encontrados en las secuencias humanas.

En general, los anticuerpos humanizados comprenden uno o típicamente dos dominios variables en los que todo o parte de las regiones CDR corresponden a partes resultantes de la secuencia v' de la misma familia, no humana y en los que todo o parte de las regiones FR son las resultantes de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender entonces al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), en particular I la de inmunoglobulina humana de la referencia seleccionada.

Se busca también obtener un anticuerpo que sea inmunógeno como mínimo en un ser humano. Así, es posible que uno o dos aminoácidos de una o varias CDR se modifiquen por un aminoácido menos inmunógeno para el anfitrión humano, esto sin reducir sustancialmente la especificidad de unión del anticuerpo al FGF-R4. Del mismo modo, los restos de las regiones armazones pueden no ser humanos y es posible que no estén modificados ya que no contribuyen al potencial inmunogenico del anticuerpo.

Existen varios métodos de humanización conocidos por el experto en la técnica para modificar un anticuerpo padre, no humano, en un anticuerpo menos inmunógeno para el humano. No es forzosamente necesaria una identidad global de las sejcuencias con un anticuerpo humano. En efecto, la identidad global de secuencia no es necesariamente un indicador predictivo de una inmunogenicidad reducida y la modificación de un número limitado de restos puede conducir a los anticuerpos humanizados que i I presenten un potencial inmunogénico muy atenuado en e hombre (Molecular Immunology (2007) 44, 1.986-1.998).

Diversos métodos son por ejemplo la inclusión de las CDR (injerto) (patente europea EPO 0 239 400; patente internacional WO 91/09967 y patente Estadounidense N° 5,530,101 y 5,585,089), la preparación de nuevo (patente europea EPiO 0 592 106, patente europea EPO 0 519 596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka y colaboradores., 1994, Prot Eng 7(6):805-814 y Roguska y colaboradores., 1994, PNAS| 91:969-973) o incluso la mezcla de cadenas (patente Estadounidense Nc 5,565,332).

La presente invención se refiere en particulaj a los anticuerpos humanizados cuyas partes variables son modificadas de acuerdo a la siguiente tecnología: Las cadenas ligeras y pesadas más similares a las cadenas correspondientes del anticuerpo murino anti-FGF-R4 40-12 son identificadas por comparación con el Banco de Datos de Proteínas (H. M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne. Nucleic Acids Research, 2000, 28:235-242). La alineación de secuencias utiliza el algoritmo BLAST (J Mol Biol. 1990 Oct 215:403-410). Se trata de estructuras tridimensionales que responden a los códigos PDB 1NDM y 1ETZ, que se han utilizado respectivamente para construir los modelos por homología de cadenas ligeras y pesadas de dominios variables. Estos modelos tridimensionales se afinan a continuación minimizando su energía potencial con el procedimiento estándar implementado en el programa MOE (Entorno de Operación Molecular, por sus siglas en inglés, Chemical Computing Group, Quebec, Canadá). Se realiza después una simulación de dinámica molecular (DM) a partir de estos modelos tridimensionales minimizados del anticuerpo 1 con el programa Amber (D. A. Case, T. E. Cheatham, III, T. Darden, H. Gohlke, R. Luo, K. M. Merz, Jr., A. Onufriev, C. Simmerling, B. Wang y R. Woods. J. Computat. Chem. 2005, 26:1668-1688). Esta simulación tiene lugar con las tensiones armónicas aplicadas a los átomos del esqueleto proteico a una temperatura de 500 K, durante un tiempo de 1,1 nanosegundos, en un modelo de solvente implícito tal que se ¡mplementa en el método generalizado de Born (Gallicchio & Levy, J Comput Chem 2004, 25:479-499). Se extraen así diez conformaciones diversas de esta primera simulación a razón de una conformación tridimensional cada cien picosegundos durante el último nanosegundo de la simulación. Estas diez diversas conformaciones se someten cada una a continuación a una simulación de dinámica molecjlar, sin tensiones sobre el esqueleto proteico, a una temperatura de 27°C, durante 2,3 nanosegundos, en un modelo de solvente implícito tal que se ¡mplementa en el método generalizado de Born. Las uniones que implican un átomo de hidrógeno son tensiones con el algoritmo SHAKE (Barth. y colaboradores. , J Comp Chem, 1995, 16:1192-1209), el paso es de 1 femto segundo y la simulación tiene lugar de acuerdo a la ecuación de L.angevin a volumen constante y una temperatura constante de 27°C. Para cada una de las diez simulaciones de dinámica molecular, las últimas dos mil conformaciones extraídas a la frecuencia de un par de picosegundos, se utilizan a continuación para cuantificar para cada aminoácido del anticuerpo que se tiene que humanizar, la desviación de las posiciones de los átomos con respecto a una conformación media, denominada medoide, del aminoá'cido. El conjunto del análisis descrito anteriormente se realiza con el lenguaje script Scientific Vector Language (SVL) del programa MOE. La conformación medoide del aminoácido es la conformación resultante de la dinámica molecular que es la más próxima de la conformación media calculada a partir de la posición de los átomos de todas las conformaciones del aminoácido. La distancia utilizada para detectar la conformación medoide es la desviación cuadrática media de las d Iistancias escalares entre los átomos de dos conformaciones del aminoácido. De manera similar, la desviación de las posiciones de los átomos de una conformación de un aminoácido con respecto a la conformación medoide se cuantifica calculando la desviación cuadrática media de las distancias escalares entre los átomos del aminoácido de una conformación de la simulación y los mismos átomos de la conformación medoide. A continuación, es comparando la desviación cuadrática media de las posiciones de los átomos de un aminoácido dado (i) promediado jsobre el conjunto de diez "simulaciones de dinámica molecular (|Fi), a la desviación cuadrática media de las posiciones de todos los aminoácidos del anticuerpo promediado sobre el conjunto de diez simulaciones de dinámica molecular (Fm) como se decide si el aminoácido es bastante flexible para ser considerado qiie puede D597).

La similitud del anticuerpo que se tiene que humanizar con los 49 modelos de secuencias humanas germinales se cuantifica preparando un muestreo de las posiciones de algunos átomos de los 60 aminoácidos flexibles de un anticuerpo, durante las diez dinámicas moleculares, mediante una misma representación cúbica tridimensional de resolución 1Á. Se habla de similitud cuadridimensional. La representación tridimensional utilizada conlleva 445740 puntos y se inicia a partir de la estructura tridimensional del anticuerpo humano que responde al código PDB 8FAB La estructura 8FAB se utiliza asi para posicionar todas las conformaciones de un anticuerpo que se tiene que preparar para muestreo en la representación tridimensional. Se superpone para esto hacer la conformación medoide de la dinámica molecular del anticuerpo en la estructura 8FAB. Esta superposición consiste en la alineación de los momentos de inercia de dos conformaciones, seguido por la optimización de las distancias escalares entre los átomos de carbono alfa de las dos conformaciones. Todas las demás conformaciones de la dinámica molecular del anticuerpo se superponen sobre, la conformación medoide de acuerdo al mismo método. Se realizan dos tipos de muestreo dando como resultado dos similitudes (similitud electrostática y similitud lipófila), para un par de anticuerpos que se tengan que comparar, que se suman para obtener la similitud total. El primer muestreo, electrostático, considera todos los átomos de la cadena lateral del aminoácido.

Se calcula el valor en un punto x de la representación aplicando a los átomos de la cadena lateral del aminoácido una función gausiana tridimensional f(x) que se pondera con la carga electrostática del átomo tal como se describe en el campo de fuerza Amber99 (Cieplak, J., y colaboradores.; J. Comp. Chem. 2001, 22:1048-1057). La función f(x) se aplica de acuerdó a los 3 ejes de coordenadas cartesianas y responde a la fórmula: ( ) , con x y u respectivamente, coordenadas cartesianas de un punto x de la representación y un átomo del muestreo, s= r/1.6 (r = radio de covalencia del átomo). El muestreo se repite para todas las conformaciones del aminoácido y los resultados obtenidos son medias en todo punto x de la representación tridimensional. El segundo muestreo, lipófilo, considera únicamente los átomos lipófilos de la cadena lateral del aminoácido. El valor en un punto x de la representación se calcula con ayuda de la misma función gausiana f(x) sin ponderación. Los dos grupos de conformaciones de las dinámicas moleculares de dos anticuerpos que se comparan se muestrean así por la misma representación tridimensional. Se mide la similitud electrostática (sim-elec), entre 2 anticuerpos a ¡y b, con ayuda de la siguiente fórmula: 1. ? | +x?|-| f - sim - elec = La similitud lipófila se calcula con la misma fórmula sobre los resultados dados del muestreo lipófilo descrito anteriormente.

El modelo de secuencias germinales humanas vlambda2-vh2 muestra así la similitud cuadridimensional más importante (similitud total = 58%) de estos 60 aminoácidos flexibles con respecto a los aminoácidos flexibles del anticuerpo murino 40-12. El modelo de secuencia germinal humana vlambda2-vh2 ha sido utilizado pues para humanizar el anticuerpo que se tenía que humanizar centrándose en los 45 aminoácidos flexibles. Para determinar las mutaciones que se tienen que rea izar, la estructura tridimensional del modelo del anticuerpo murino 40-12 se superpone a la del modelo resultante de las sejcuencias germinales que muestran la similitud más considerable optimizando las posiciones de los carbonos alfa de los aminoácidos. Los aminoácidos identificados como flexibles mutan por los aminoácidos correspondientes en la secuencia de|l modelo que muestra la similitud más considerable.

Los motivos de las secuencias no deseables considerados son los siguientes: Aspartato-Prolina (unión peptídica | lábil en I medio ácido), Asparagina-X-Serina/Treonina (sitio de glicosilación, X = todo aminoácido salvo la Prolina), Aspartato-Glicina/Serina/Treonina (formación potencial de succinimida/iso-aspartato en las zonas flexibles), Asparagina- Glicina/Histidina/Serina/Alanina/Cisteína (sitios expuestos de desamidación), Metionina (oxidación en las zonas expuestas). Las secuencias humanizadas así obtenidas se comparan finalmente mediante el algoritmo BLAST de comparación de secuencia, con las secuencias de la base de IEDB dadas (http://www.immuneepitope.org/ La base de datos inmune epítopos y análisis de los recursos: de la visión a blueprint. PLoS Biol. 2005 Mar; 3 (3):e91) para asegurar que las secuencias no contienen epítopos conocidos para ser reconocidos por las células linfocitos B y T. Si la secuencia contiene restos que presentan secuencias indeseables, también se modifican entonces. Si la secuencia del compuesto contiene un epítopos conocido catalogado en el IEDB, entonces se utiliza como modelo otra estructura de referencia germinal que muestre una gran similitud .

De manera más ventajosa, el anticuerpo de acuerdo a la invención comprende las secuencias que presentan al menos 80%, 90%, 95% ó 99% de identidad utilizándose la secuencia SEC ID N° 30 o la secuencia SEC ID N° 32, en combinación con las secuencias que presentan al menos al menos 80%, 90%, 95% ó 99% de identidad con la secuencia SEC ID N° 34, la secuencia SEC ID N° 36 o la secuencia SEC ID N° 38. j En una forma de modalidad, el anticuerpo de acuerdo a la invención comprende las cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID N° 30 y las cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID N° 34.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo comprende cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID N° 32 ylcadenas variables pesadas de secuencia SEC ID N° 38.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo comprende cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID N° 30 y cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID N° 36.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo comprende cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID N° 32 y cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID N° 34.

En otra forma de modalidad el anticuerpo co'mprende cadenas variables ligeras de secuencias SEC ID N° 32 y cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID N° 36.

En otra forma de modalidad el anticuerpo co'mprende cadenas variables ligeras de secuencia SEC ID N° 30 y cadenas variables pesadas de secuencia SEC ID N° 38.

La presente invención tiene igualmente por| objeto anticuerpos humanos antagonistas específicos del FGF-R4. Tales anticuerpos se pueden obtener por visualización de fagos de j acuerdo a los métodos conocidos por el experto en la técnica (McCafferty J. y colaboradores, 1990; Hoogenboom HR y colaboradores, 2005). Están disponibles otras tecnologías para la preparación de anticuerpos humanos tales como la tecnología XenoMouse descrita en la patente Estadounidense 5,939,598.

En una forma de modalidad particular, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 es un anticuerpo humano cuyas partes variables de la cadena pesada comprenden una secuencia que presenta al menos 80%, 90%, 95% ó 99% de identidad con la secuencia SEC ID N°: 76, 86, 96 ó 106.

En otra forma de modalidad, el anticuerpo antagonista específico del receptor FGF-R4 es un anticuerpo humano cuyas partes variables de la cadena ligera comprenden una secuencia que presenta al menos 80%, 90%, 95% ó 99% de identidad con la secuencia SEC ID N°: 71, 81, 91 ó 101.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena pesada que comprende una parte variable codificada por una secuencia nucleotídica que presenta una identidad de al menos 80%, 90%, 95% ó 99% con la secuencia SEC ID N° 77, 87, 97 ó 107.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende una cadena ligera que comprende una parte variable codificada por una secuencia nucleotídica que ¡presenta una identidad de al menos 80%, 90%, 95% ó 99% con la secuencia SEC ID N° 72, 82, 92 ó 102 La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias codificadas por las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 71 y 76 ó las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 81 y 86 ó las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 91 y 96 ó las secuencias nucleotídica SEC ID N°: 101 y 106.

La presente invención tiene igualmente por objeto un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 que comprende las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 72 y 77 ó las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 82 y 87 ó las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 92 y 97 ó las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 102 y 107.

De manera particularmente preferida, un anticuerpo humano antagonista específico del receptor FGF-R4 comprendiendo las secuencias polipeptídica SEC ID N°: 82 y 87.

Las secuencias en aminoácidos así modificadas sé pueden modificar también por modificaciones post-traduccionales durante la producción en la célula de mamífero. En particular, el uso de líneas estables deficientes en la biosíntesis de fucosa puede permitir producir anticuerpos monoclonales de los cuales el N-glucano del Fe (posición N297) está desprovisto parcial o totalmente de fucosa y permite aumentar el efecto realizador ADCC (Kanda y colaboradores. , 2.006, Biotechnol. Bioeng. 94:680-688 y Ripka y colaboradores., 1986 Arch Biochem Bioph 249: 533-545).

En otra forma de modalidad de la invención, el antagonista específico de FGF-R4 es un anticuerpo conjugado.

Los anticuerpos pueden estar conjugados con un agente citotóxicos. La terminología «agente citotóxicos» designa en el presente documento una sustancia que reduce o bloquea la función o el crecimiento de las células o causa la destrucción de las células.

En una forma de modalidad, el anticuerpo o un fragmento de unión de éste pueden estar conjugados con un medicarJento, tal como un maitansinoide, para formar un «pro-medicamento» con una citotoxicidad para con las células que expresan el antígeno.

El agente citotóxicos de la presente invención puede ser cualquier compuesto que resulte de la muerte de una célula o induzca la muerte de una célula o disminuya de diversas maneras la viabilidad de las células. Los agentes citotóxicos preferidos incluyen, por ejemplo, los maitansinoides y análogos de maitansinoides, taxoides, CC-1065 y análogos de CC-1065, dolastatina y análogo de dolastatina, definidos anteriormente. Estos agentes citotóxicos están conjugados con anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, equivalentes funcionales, anticuerpos mejorados y sus análogos, como se describe en la presente solicitud.

Los anticuerpos conjugados se pueden preparar por métodos in vitro. Con el fin de unir un medicamento o un pro-medicamento al anticuerpo se utiliza un grupo de enlace. Los grupos de enlace apropiados son bien conocidos por el experto en la técnica e incluyen especialmente grupos disulfuro, tioéter, ácido lábiles, grupos fotolábiles, peptidasa lábiles y estearasa lábiles. Los grupos de enlace preferidos son los grupos disulfuro y los grupos tioéter. Por ejemplo, se puede construir un conjugado utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o formando un puente tioéter entre el anticuerpo y el medicamento o pro-medicamento.

Los compuestos tales como: metotraxetato, daunorubicina, vincristina, vinblastina, melfalano, mitomicina C, clorambucilo, calichamicina, tubulisina y análogos de la tubulisina, duocarmicina y análogos de duocarmicina, dolastatina y los análogos de la dolastatina son igualmente apropiados para la preparación de conjugados de la presente invención. Las moléculas pueden unirse también a las moléculas de anticuerpo por una molécula intermedia tal como la sueroalbúmina . La doxorubicina y los compuestos de doxorubicina, como se describe por ejemplo en la solicitud de patente Estadounidense 09/740991, también pueden ser agente citotóxicos útiles. anticuerpos objeto de la presente invención pueden estar asociados a una molécula o un compuesto citotóxicos.

También pueden estar asociados a un compues anti-angiogénico que sea eficaz en otras vías de la angiogénesis Por «células que expresan el FGF-R4», se lentiende cualquier célula eucariota, especialmente de mamíferos y en particular humana, que exprese un receptor FGF-R4 en su forma nativa, bajo una forma mutada. El FGF-R4 puede estar igualmente en su forma entera o en una forma truncada que comprenda por ejemplo el dominio extracelular de FGR-R4 y en particular los dominios D2-D3. El FGF-R4 puede estar igualmente recqmbinado en una forma quimérica.

Los compuestos de la invención se pueden formular en las composiciones farmacéuticas con vistas a una administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, infraocular etc. Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas contienen vehículos farmacéuticamente aceptables para una formulación inyectable. Se puede tratar en particular de soluciones salinas (fosfato monosódico, disódico, cloruro de sodio, potasio, calcio o magnesio, etc., o mezclas de tales sales), estériles, isotónicas o de composiciones secas, especialmente liofílizadas, que además de acuerdo al caso de agua esterilizada o de suero fisiológico, permitan la constitución de solutos inyectables.

Las patologías concernientes pueden ser todas las enfermedades unidas a la angiogénesis, tumoral o no tumoral.

Las patologías concernientes pueden ser el cánce" (con el uso de la invención como inhibidor de la angiogénesis :umoral), especialmente cáncer de hígado, colon, mama o de pulmón, próstata, páncreas o de la piel o incluso patologías para las que se describe una desregulación de la angiogénesis como: la degeneración macular relacionada con la edad o DMLA, enfermedades inflamatorias como artritis reumatoide, osteoartritis, colitis, úlceras o cualquier enfermedad inflamatoria de los intestinos, ateroesclerosis o incluso en el tratamiento de la obesidad Los anticuerpos anti-FGF-R4 se pueden utilizar igualmente para tratar el cáncer, especialmente los hepatocarcinomas y otros tumores malignos hepáticos y el cáncer de páncreas como inhibidor que tiene una acción directamente sobre el crecimiento tumoral.

La presente invención se ilustra, sin estar limitada sin embargo, por los ejemplos que siguen.

Descripción de las figuras Figuras 1A y 1B: In vitro (Fig 1A) las células endoteliales humanas de tipo HUVEC son capaces de formar una red de pseudotúbulos denominada angiogénesis. Esta red está estimulada por la adición de 1 ng/ml de FGF2. Esta inducción se puede obtener igualmente por la adición de 10 ng/ml de FGF19, ligando específico de FGF-R4 aunque 10 ng/ml de FGF4 (ligando no activador de FGF-R4) no pueden estimular la angiogénesis. De la misma manera, in vivo, (Fig 1 B) en un modelo murino de inducción de la angiogénesis al nivel de implante de esponja en el lomo del ratón, e!, FGF2 es capaz de inducir el reclutamiento de neovasos funcionales hacia la esponja que se caracteriza por un aumento del contenido de hemoglobina de estas esponjas en comparación con el control. El FGF19 es capaz igualmente de inducir esta angiogénesis al nivel de la esponja.

Figura 2A: Representación del plásmido pXL4614 que permite la expresión de hFGFR4-Histag. (SEC ID N° 40) Figura 2B: Representación del plásmido pXL4613 que permite la expresión de hFGFR4-Streptag. (SEC ID N° 69).

Figura 3: Representación del plásmido pXL4615 qué permite la expresión de hFGFR4(D2,D3)-Histag. (SEC ID N° 42) Figura 4: Representación del plásmido pXL4621 qué permite la expresión de mFGFR4-Histag. (SEC ID N° 44) Figura 5: Representación del plásmido pXL4328 que permite la expresión de hFGFR1-Fc (de secuencia SEC ID N° 46) Figura 6: Representación del plásmido pXL4327 que permite la expresión de h F G F R 2 - F c (de secuencia SEC ID N° 48) Figura 7: Las placas ELISA se recubren por los 4 receptores humanos de los FGF. La capacidad de los anticuerpos anti-FGFR4 40-12 y 64-12 para reconocer estos diferentes FGF-R se mide por análisis ELISA. El clon 40-12 (histograma negro) es específico de FGF-R4. El clon 64-12 (histograma gris) reconoce acemás el FGF-R3 muy débilmente.

Figuras 8A y 8B: El anticuerpo antagonista activo 40-12 y su control inactivo 64-12 no tienen efecto propio sobre la angiogénesis basal. Por el contrario, a la dosis de 30 pg/ml (aproximadamente 200 nM), el anticuerpo monoclonal anti-FGFR4 40-12 puede inhibir la angiogénesis de células HUVEC inducida por el FGF2 aunque el anticuerpo de control 64-12 no séa capaz (Fig 8A).

El FGF2 marcado con ayuda de un AlexaFluor®, 488 nm, es capaz de unirse al FGF-R4 expresado por las células 300-19 (histograma blanco). Esta interacción se puede disociar por el FGF2 no marcado (histogramas negros) o por el anticuerpo anti-FGFR4 40-12 (histogramas gris oscuro) aunque el anticuerpo de muestra 64-12 no es capaz (histogramas gr¡is claro) (Fig 8B).

Figura 8C y 8D: Efecto de los anticuerpos an i-FGFR4 resultantes de los clones 8, 31, 33 y 36 a 10 pg/ml sobre la angiogénesis in vitro inducida por 3 ng/ml de FGF-2. Los Iclones 8 (Fig 8C) y 31, 33 y 36 (Fig 8D) inhiben la angiogénesijs de las células HUVEC inducida por el FGF-2.

Figuras 9A y 9B: Las células de los hepatoca rcinomas humanos Hep3b son estimuladas por el FGF19 a 30 ng/ml. Esta estimulación induce una señalización celular específica de FGF- R4 que conduce a la síntesis de las proteínas cFos y JunB y a la fosforilación de Erk1/2 observada por el método Western j(Fig 9A). Cada banda se cuantifica después. Esta cuantificación se representa en forma de histograma (Fig 9B). El anticuerpo 40-12 a 100 pg/ml inhibe totalmente la inducción de la señalización celular específica de FGF-R4 aunque el anticuerpo de control no tiene ningún efecto. En efecto, el anticuerpo 40-12 bloquea completamente la síntesis de JunB y de cFos así como la fosforilación de Erk1/2 inducida por el FGF19 después de una simulación de 3 h.

Figura 9C: El efecto inhibidor del anticuerpo anti-FGFR4 40-12 sobre la fosforilación de Erk1/2 inducida en las células Hep3b por el FGF-19 (30 ng/ml) se confirma con ayuda del ELISA anti-fosfoERk1/2. El anticuerpo 40-12 es capaz también de inhibir la fosforilación de Erk1/2 en las células Hep3b estimuladas por el FGF-2 (1 ng/ml) o por suero (SVF) al 10%.

Figura 9D: Porcentaje de inhibición de la fosforilación de Erk1/2 inducida por el FGF-19 (30 ng/ml) obtenido por ELISA en células Hep3b con ayuda de los anticuerpos resultantes de los clones 8, 31 , 33 y 36.

Figuras 10A,y 10B: La proliferación de células Hep3b puede ser estimulada por la adición de suero (Fig 10A) o de FGF19 (Fig 10B). La inducción por el suero está parcialmente inhibida por el anticuerpo 40-12 a 100 pg/ml aunque no tenga efecto el anticuerpo de control (Fig 10A). La proliferación inducica por el FGF19 está totalmente bloqueada por 10 pg/ml de anticuerpo anti-FGFR4 40-12 aunque a esta misma dosis, el anticuerpo de control no tiene capacidad (Fig 10B).

Figuras 11A a 11D: El anticuerpo anti-FGFR4 40-12 es capaz de reducir el desarrollo de tumores pancreáticojs en un modelo murino RipTag inhibiendo la angiogénesis tumoral: El modelo Rip1-Tag2 es un modelo murino en que los ratones transgénicos expresan el antígeno T del SV40 en las células ß de los islotes pancreáticos que producen la insulina (Hartaban D. Nature, 1985, 9-15:115-22.). Este antígeno T se expresa durante el desarrollo embrionario del páncreas hasta 4 a 5 semanas de vida, sin efecto aparente. Una parte de los islotes pancreáticos que expresan el antígeno T progresa entonces durante las 5 semanas siguientes hacia la formación de islotes angiogénicos asociados a una activación de la vasculatura después hacia el desarrollo de pequeños tumores de tipo adenoma. Algunas semanas más tarde se desarrollaron algunos adenomas para formar carcinomas invasivos (Fig .11 A).

Estos ratones Rip1-Tag2 son tratados por vía subcutánea una vez por semana entre las semanas 10 y 13 a la dosis de 25 mg/kg con ayuda del anticuerpo 40-12 o del anticuerpo de control. Después de 13 semanas, se sacrifican los ratones. Se determina el volumen tumoral así como el número de tumores por páncreas y la densidad vascular. El tratamiento por el anticue po anti-FGFR4 40-12 permite reducir significativamente el volumen tumoral del 55% aunque el anticuerpo de muestra no presente ningún efecto (Fig. 11B). El anticuerpo 40-12 permite igualmente reducir al 34% el número de tumores por páncreas en comparación con la muestra (Fig. 11C). Esta reducción del volumen tumoral está acompañada por una reducción de la densidad vascular, sea al nivel del número de vasos pequeños, medios o grandes (Fig. 11D).

Figura 12: La capacidad de los anticuerpos 40-12 y 64-12 para reconocer el dominio extracelular completo del FGF-R4 humano o murino así como el dominio extracelular del FGF-R4 amputado de su dominio D1, se mide por ELISA. El clon 40-12 es capaz de unirse bien también con las 3 construcciones de FGF-R4 aunque el clon 64-12 reconoce menos bien la forma murina del FGF-R4.

Figura 13A a 13C: El efecto antagonista del anticuerpo anti- FGFR4 clon 40-12 en la unión FGF2/FGF-R4 se mide por experiencias de competición de unión con el FGF2 marcado con ayuda de un AlexaFluor®, 488 nm. El clon 40-12 es capaz de bloquear la unión del FGF2 humano (Fig. 13A), murino (Fig. 13B) y de rata (Fig. 13C) en las células 300-19 murinas transfectadas con ayuda del ADNc que codifica las formas humanas, murinas o de rata del receptor FGF-R4, y esto, con la misma eficacia (3500, 4110 y 3940 ng/ml o 23, 27 y 26 nM para los complejos Jumanos, murinos o de rata, respectivamente). | Figura 14A: Representación del plásmido pXL4794 que permite la expresión de hFGFR4_D1. Fe Figura 14B: Secuencia de aminoácidos de la |proteína hFGFR4_D1: Fe segregada en la línea HEK293 transfectada con el plásmido pXL4794 Figura 15A: Representación del plásmido pXL4|796 que permite la expresión de hFGFR4_D2: Fe Figura 15B: Secuencia de aminoácidos de la proteína hFGFR4_D2: Fe segregada en la línea HEK293 transfec-tada con el plásmido pXL4796 Figura 16A. Representación del plásmido pXL4|799 que permite la expresión de hFGFR4_D3: Fe.

Figura 16B: Secuencia de aminoácidos de la proteína hFGFR4_D3: Fe segregada en la línea HEK293 transfectada con el plásmido pXL4799 EJEMPLOS: Ejemplo 1: Puesta en evidencia del papel de FGF-R4 en el control de la angiogénesis Para demostrar el papel de FGF-R4 en el control de la angiogénesis, se han realizado experiencias de angiogénesis in vitro con células endoteliales humanas de tipo HUVEC estimuladas con diversos FGF. El FGF2, ligando activador de la mayor parte de los receptores de FGF. El FGF19, ligando activador específico de FGF-R4 y el FGF4 ligando no activador de FGF-R4.

Para hacerlo, se han preparado geles que se distribuyen en cada pozo del chambersiide (Cellware Biocoat, colágeno, tipo I, hojas de cultivo de 8-pozos: Becton dickinson 354630), 60 µ? de matrigel diluido a 1/6 (Matrigel de factor de crecimiento reducido: Becton dickinson 356230) en colágeno (colágeno de cola de rata, tipo I: Becton dickinson 354236). Se mantienen los geles durante 1 hora, a 37°C, para permitir su polimerización. A cont'nuación , se sembraron células endoteliales venosas humanas (HUVEC ref: C-12200 - Promocell) a 15.103 células/pozo, en 400 µ? de medio EBM (Clonetics C3121) + FBS al 2%+ hEGF 10 pg/ml. Este protocolo se puede adaptar a placas de 96 pozos: 60 µ? por pozo de placas de 96 pozos (colágeno/ cellware Biocoat, Becton Dickinson 354407). La matriz se prepara mezclando 1/3 de matrigel, 1 mg/ml final de colágeno, NaOH (0.026x el vo umen de colágeno en µ?), PBS 1x, el volumen se ajustó a continuación con agua. Las células endoteliales se estimularon con 1 ig/ml de FGF2 (R&D , 133-FB-025) o 10 ng/ml de FGF4 (R&D , 235 -F4-025) FGF19 (R&D, 969-FG-025) durante presencia de 5% de CQ2. Después de 24 horas, se midió la longitud de la red de microtúbulos formados con ayud|a de un sistema de análisis de imágenes asistido por ordenador (Imagenia Biocom, Courtaboeuf, Francia) y se determinó la longitud total de los pseudotúbulos en cada pozo. La media de la longitud total del depósito del microcapilar se calculó en gm para cada condición correspondiente a la media sobre 6 replicados.

La estimulación por el FGF2 o el FGF19 permitió la inducción de la formación de nuevos túbulos aunque el FGF4 no tuviera efecto (Fig. 1A). Estos resultados demuestran que la activación específica de FGF-R4 permite inducir la formación de neo-vasos y concluir pues que FGF-R4 controla la angiogénesis in vi tro.

La correlación in vivo con las dadas in vitro se ha obtenido con ayuda del modelo de inducción de la angiogénesis in vivo en implantes de celulosa en el ratón. Este modelo es una adaptación del modelo descrito por Andrade y colaboradores. (Micrqvascular Research, 1997, 54, 253-61).

Los animales, ratones blancos BALB/c J consanguíneos, se anestesian con una mezcla de Xilazina (Rompun®, 10¡ mg/kg)/ Ketamina (Imalgéne 1000, 100 mg/kg) por vía intraperitóneal. Se afeita el lomo del animal y se desinfecta con Hexomedlne®. Se crea una bolsa de aire subcutánea en el lomo del ratón por inyección de 5 mi de aire estéril. Se realiza una incisión de aproximadamente 2 cm, en lo alto del lomo del animal para introducir un implante de celulosa estéril (disco de 1 cm de diámetro, espesor de 2 mm, Cellspon® ref 0501) impregnado con 50 µ? de solución estéril que contiene la proteína o el producto que se tiene que ensayar. Después se sutura la incisión y se limpia con Hexomedine®. Los días siguientes a la colocación del implante, los ratones recibieron en el implante la jproteína o el producto por una inyección a través de la piel (50 µ?/implante/día) bajo anestesia gaseosa (Isoflurano] al 5% (Aerrane®, Baxter).

Siete días después de la colocación de la esponja, se sacrifican los ratqnes mediante una dosis letal de Pentobarbital sódico (CEVA salud animal), administrada por vía intraperitoneal. Se recorta la piel a continuación, aproximadamente 1 cm alrededor de la esponja evitando la cicatriz para sacar la piel y la esponja. Se recorta la esponja a continuación en varios trozos y se pone en un tubo Ribolyser® que contiene 1 mi de amortiguador de lisis (Detección de Muerte Celular ELISA, Roche), s'e agitan los tubos 4 veces consecutivas, durante 20 s, fuerza 4, en un molino celular (FastPrep® FP 120). Se centrifugan los tubos a continuación 10 min a 2.000 g a 20°C y se congelan los sobrenadantes a -20°C, esperando la dosificación de Hemoglobina.

El día de la dosificación, se centrifugan los tubos de nuevo después de descongelación y se mide la concentración de hemoglobina con el reactivo de Drabkin (Sigma, volumen a volumen) por lectura en un espectrofotómetro, a 405 nm, contra una gama de patrones de hemoglobina bovina (Sigma). La concentración de hemoglobina en cada muestra se expresa en mg/ml después de la regresión polinomial realizada a pajrtir de la gama. Los resultados se expresan en valor medio (±sém) para cada grupo. Las diferencias entre los grupos se ensayan con una ANOVA seguido por un ensayo de Dunnett sobre la raíz cuadrada de los valores.

En este modelo, el FGF19 a 50 ng por sitio y 5 reinyecciones es capaz de inducir significativamente la colonización de la esponja por vasos maduros nuevamente formados con la misma eficacia que el FGF2 a 5 ng por sitio. La presencia de vasos sanguíneos funcionales en la esponja se pone en evidencia por la presencia de hemoglobina (Fig. 1B). Estos resultados demuestran que la activación específica de FGF-R4 permite el reclutamiento de vasos sanguíneos funcionales, que indica que FGF-R4 controla igualmente la angiogénesis in vivo.

Ejemplo 2: Descripción de las proteínas FGFR utilizadas como inmunógeno y antígeno.

Los receptores de los factores de crecimiento FGFR y en particular los dominios extracelulares de FGF-R1, FGF-†2, FGF-R3, FGF-R4 se fusionan a un tag (Histag) o al dominio Fe de inmunoglobulina. era sialilada muy ampliamente (91%). Como consecuencia, la proteína tenía todas las características para tener las suficientes propiedades farm icocinéticas.

De manera comparable, la proteína hFGFR4-Strept|ag (SEC ID N° 69) se ha purificado por cromatografía sobre columna Strep-Tactin Superflow (IBA; ref. 2-1206) y elución en amortiguador de destiobiotina, después formulada en amortiguador PBS.

La proteína hFGFR4(D2,D3)-Histag corresponde a la secuencia SEC ID N° 42. Se ha clonado el ADNc en el plásmido de expresión eucariota pXL4615 representado en la figura 3 y se ha producido y se ha purificado la proteína en condiciones comparables a las de la proteína hFGFR4-Histag.

El ADNc que codifica la proteína mFGFR4-Histag (SEC ID N° 43) se ha clonado en el plásmido de expresión eucariota pXL4621 representado en la figura 4 y se ha producido y se ha purificado la proteína en condiciones comparables a las de la | proteína hFGFR4-Histag.

La proteína hFGFRI -Fe, (SEC ID N° 46) contiene el dominio i extrace ular de FGF-R1 Ule humano fusionado en C-terminal al dominio Fe del l'lgGI humano. El ADNc se ha clonado en el plásmido de expresión eucariota pXL4728 representado en la figura 5 y se ha producido la proteína en condiciones comparables a las de la proteína hFGFR4-Histag, después purificada por cromatografía sobre columna de afinidad de Sepharosa proteína G (Amersham Biosciences) y elución en amortiguador 100 mM de glicina/HCI, pH 2,7, después formulada en amortiguador PBS.

La proteína hFGFR2-Fc, de secuencia SEC ID N° 48, contiene el dominio extracelular de FGF-R2 lile humano, fusionado en C-terminal al dominio Fe del lgG1 humano. Se ha clonado el ADNc en el plásmido de expresión eucariota ¡pXL4327 representada en la figura 6 y se ha producido la ¡proteína, después se ha purificado, en condiciones comparables alias de la proteína hFGFR1-Fc.

La proteína hFGFR3-Fc es una proteína que fusiona e dominio extracelular de FGF-R3 lile humano al dominio Fe del i* | lgG1 humano, se ha obtenido de R&D System (ref: 760-FR).

La proteína hFGFR4-Fc es una proteína que fusiona el dominio extracelular de FGF-R4 humano al dominio Fe del lgG1 humano, se ha obtenido de R&D Systems (ref: 685-FR).

Se han fusionado diferentes sub-dominios de la parte extracelular de la proteína hFGFR4 al dominio Fe del lgG1 humano. El sub-dominio D1 está contenido en la construcción i I SABVA4794 (SEC ID N° 112 y Fig 14A y 14B). El sub-dojminio D2 está contenido en la construcción SABVA4796 (SEC ID |N° 114 t Fig 15A y 15B). El sub-dominio D3 está contenido en la construcción SABVA4799 (SEC ID N° 116 y Fig 16A y 16B). Estos tres sub-dominios se extienden respectivamente de las posiciones 1 a 179 para SABVA4794, 1 a 32 más 145 a 242 para el SABVA4796 y 1 a 32 más 228 a 360 para el SABVA4799 (posiciones descritas en SwissProt FGF-R4_HUMAN). Estas proteínas se han producido a partir de los plásmidos |pXL4794 (secuencia codificadora SEC ID N° 111), pXL4796 (sjecuencia codificadora SEC ID N° 113) y pXL4799 (secuencia codificadora SEC ID N° 115) en condiciones comparables a las de la|proteína FGFR1-FC.

Ejemplo 3: Generación y cribado de anticuerpos mono|clonales anti-FGF-R4 A - Anticuerpo obtenido por inmunización Los anticuerpos monoclonales se han obtenido por inmunización con el inmunógeno hFGFR4-Histag en cinco ratones BALB/cJ (Charles River), de 6 a 8 semanas de edad, inmunizados cada uno con un total de 24 9 de hFGFR4-Histag por el método RIMMS descrito por Kilpatrick y colaboradores. (1.997. Hybridoma 16: 381389) y el protocolo de fusión descrito en ClonaCell™-Estuche de Clonación de Hibridomas HY (StemCell Technologies; ref 03800).

Dos días después de la última inyección, se sacrificaron los ratones y se fusionaron los nodulos linfáticos con las células de mieloma P3X63-A.G8.653 (ATCC, CRL-1580) en una relación 5:1 en presencia de Polietilenglicol (ClonaCelIT -H Y ref. 03806). Se repartió asépticamente la suspensión celular en cajas de Petri incubadas a 37°C, en presencia de C02 al 5%. Se ais aron las colonias aparecidas después de 12 días de incubación y se pusieron en cultivo en medio E (ClonaCelITM-HY; ref. 0¡3805) en cajas de 96 pozos.

El cribado primario de anticuerpos monoclonales obtenidos por inmunización con hFGFR4-Histag se realizó por análisis ELISA utilizando como antígeno de captura hFGFR4 -Streptag. Se fijó el antígeno de captura en cajas lmmulon-4 unido a enzima (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron después los sobrenadantes de cultivo de hibridomas, después detectados gracias al anticuerpo de conejo anti-ratón IgG conjugado con peroxidasa (Sigma; ref. A9044-dilución al 1:50.000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) y las mediciones con la lectora de placas a 450 nm. Entre los 444 hibridomas ensayados, 129 fueron positivos por análisis ELISA con el antígeno hFGFR4-Streptag cuyos 120 hibridomas fueron también positivos con la proteína dímera hFGFR4-Fc.

Se realizó un cribado secundario para se eccionar únicamente los anticuerpos específicos al FGF-R4 por análisis ELISA, utilizando como antígeno de captura la proteína hFGFR4-Streptag, después con las proteínas hFGFR1-Fc, hFGFR2-Fc y hFGFR3-Fc descritas en el ejemplo 2. Se fijó el ant geno de captura en cajas lmmulon-4 unido a enzima (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron después los sobrenadantes de cultivo de hibridomas, después se detectaron gracias al anticuerpo de conejo anti-ratón IgG conjugado con peroxidasa (Sigma; ref. A9044-dilución al 1:50000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) y las codificadoras para VH (parte variable de la cadena pesada HC) o VL (parte variable de la cadena ligera LC), en el vector pGEM-T Easy de Promega; ref A137A), se secuenciaron los insertos de los plásmidos obtenidos, de manera que se analizara la secuencia codificadora de cada dominio variable en el sentido 5'-3' y 3'-5' en al menos 6 plásmidos correspondiendo a los anticuerpos anti-FGFR4 40-12 y anti-FGFR4 64-12. Se realizaron los análisis de secuencia, contigs y alineaciones con ayuda del programa disponible sobre Vector NTI (Invitrogen).

Se conservaron los plásmidos que contenían las se'cuencias consensuadas que codificaban las partes variables de los anticuerpos anti-FGFR4. El plásmido pXL4691 contiene la secuencia que codifica la VH de secuencia SEC ID M° 5 del anticuerpo anti-FGFR4 40-12 y el plásmido pXL4693 contiene la secuencia que codifica la VH de secuencia SEC ID N° 19 del anticuerpo anti-FGFR4 64-12 como se presenta en la tabla 2 a continuación.

El plásmido pXL4690 contiene la secuencia nucleotídica SEC ID N° 7 que codifica la VL de secuencia SEC ID N° 8 del anticuerpo anti-FGFR4 40-12 y el plásmido pXL4692 contiene la secuencia nucleotídica SEC ID N° 21 que codifica la VL de secuencia SEC ID N° 22 del anticuerpo anti-FGFR4 64-12, como se presenta en la tabla 2 a continuación.

Tabla 2 - Condiciones de operación y análisis de rejacciones de la transcriptasa inversa y PCR- Identificación de los plásmidos pXL4690 a pXL4693.

Anti-FGFR4 40-12 64-12 Temperatura 55°C 55°C de la Reacción SEC ID N° 64 (HC) SEC ID N° 64 ( HC) TR SEC ID N° 65 (LC) SEC ID N° 66 y SEC Cebadores ID N° 67 LC) Cebador 5'- 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-, GeneRacer (SEC ID N° 63) Cebador 3'- 5 '-TATGCAAGGCTTACAACCACA-3' interno a la articulación murina (SEC ID N° 64) Cebador 3'- 5'-CTCATTCCTGTT interno al Ck GAAGCTCTT GAC-3' murino (SEC ID N° 65) Cebadores 3'- 5'- internos a CA ACACTCAGC s iCGGG murino ACAAACTCTT CTC-3' (SEC ID N° 66 5'- y ACACTCTGC/o GGAG SEC ID N° 67) ACAGACTCTT TTC-3' Anti-FGFR4 40-12 64-12 PCR de HC: 55°C 55°C Temperatura SEC ID N° 63 - SEC SEC ID N° 63 - SEC Cebadores ID N° 64 ID N° 64 Secuencia de 9 clones tienen la 6 clones tie nen la productos PCR misma secuencia VH misma secuen cia VH clonados (VH) y una secuencia CH1 y una secuenc ia CH1 idéntica a la del idéntica a la del mCH1- mCH1 Plásmido que pXL4691 pXL4693 contiene VH PCR de LC: 55°C 55°C Temperatura SEC ID N° 63 - SEC SEC ID N° 63 - SEC Cebadores ID N° 65 ID N° 66 y 67 Secuencia de 11 clones tienen la 6 clones tienen la los productos misma secuencia VL y misma secuencia VL PCR clonados una secuencia CK y una secuencia CA (VL) idéntica a ITICK idéntica a mcJ Plásmido que pXL4690 pXL4692 contiene VL Las secuencias de aminoácidos de las partes variables ligeras y pesadas, respectivamente, de los anticuerpos anti-FGFR4 64-12 y anti-FGFR4 40-12 son diferentes. Los números de las secuencias utilizadas, obtenidas y deducidas, se indican en la tabla 7.

Los anticuerpos 40-12 y 64-12 se han producido en frascos T500. El sobrenadante de cultivo se recogió después de 7 días. Los anticuerpos anti-FGFR4 se purificaron por afinidad sobre proteina G, después se dializó contra PBS, se filtró ¡estéril y conservó a 4°C.

Los anticuerpos antagonistas purificados tienen un KD de 6.5 x 10'9 M (anti-FGFR4 40-12) y 5.75 10"8 M (anti-FGFR4 64-12).

B - Anticuerpo seleccionado con ayuda del método de visualización de fagos El cribado primario de anticuerpos monoclonales obtenidos por visualización de fagos con hFGFR4-Histag se realizó por análisis ELISA utilizando como antígeno de captura hFGFR4 -Histag. Se fijó el antígeno de captura en cajas lmmulon-2 unido a enzima (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron a continuación los sobrenadantes de cultivo de E. col¡ infectadas por los fagos, después se detectaron gracias al anticuerpo de ratón antiM13 conjugado con la peroxidasa (GE Healthcare; ref. 27-9421-01, dilución al 1:5000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) y las mediciones de densidad óptica (D.O.) se efectuaron a 450 nm.

Se realizó un cribado secundario para seleccionar únicamente los anticuerpos específicos al FGF-R4 por¡ análisis ELISA utilizando como antígeno de captura la proteína |hFGFR4- Histag, después con las proteínas hFGFR1-Fc, hFGFR2-Fc y hFGFR3-Fc descritas en el ejemplo 2. Se fijó el antígeno de captura en cajas lmmulon-2 unido a enzima (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron a continuación los sobrenadantes de cultivo de E. coli infectadas por los fagos, después se detectaron gracias al anticuerpo de ratón antiM13 conjugado con peroxidasa (GE Healthcare; ref. 27-9421-01, dilución al 1:5000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) y las mediciones de densidad óptica (D.O.) se efectuaron a 450 nm.

Se secuenciaron los clones específicos al FGF-R4 seleccionados y se reclonaron en un vector de expresión para transfección transitoria de células HEK293.

Para ello, en una primera etapa, las regiones codificadoras del Fab, es decir la cadena ligera del anticuerpo, un sitio de unión de ribosoma bacteriano y la región variable de la cadena pesada del anticuerpo, se extraen del fagémido por restricción y se insertan en un plásmido de expresión de IgG para células de mamíferos, más abajo de una secuencia señal de anticuerpo eucariota y más arriba de la región constante de una cadena pesada de lgG1 humano. En una segunda etapa, la región que contiene el sitio de unión del ribosoma bacteriano y el péptido señal bacteriana de la cadena pesada se cambia contra una secuencia IRES y una secuencia señal eucariota. Los IgG se expresan por transfección transitoria de células HEK293. hacerlo, se amplificó el MCS asociado al tag HA y a su péptido señal por PCR entre los cebadores sentido de secuencia SEC ID N°: 51 e inversa de secuencia SEC ID N°: 52 permitiendo insertar los sitios de restricción Kpnl en 5' y Xbal en 3'. Se digirió el fragmento PCR por las enzimas Kpnl y Xbal, después se clonó en el vector pEF6/V5-His A abierto por las mismas enzimas. Por último, el primer sitio BamHI del MCS se reemplazó por el sitio BsrGI digiriéndose el vector nuevamente formado por las enzimas Kpnl y Spel e insertándose entre estos sitios los cebadores de las secuencias SEC ID N°: 53 y SEC ID N°: 54 híbridas ejntre sí y conteniendo el sitio enzimático BsrGI. El vector obtenido se denominó: pEF6mut-HA.

Construcción del vector pEF6mut-HA-FGF-R4-hMpl El dominio intracelular del Mpl se amplificó en un vector pEF6/V5-His TOPO (Invitrogen, referencia K9610-20) entre los cebadores sentido de secuencia SEC ID N°: 55 permitiendo la inserción del sitio de digestión Sacl e inversa de secuencia SEC ID N°: 56 denominada comúnmente revBGH. Se digirieron después los fragmentos PCR generados, por las enzimas Sacl y Notl. ¡ I El dominio extracelular y transmembrana del FGF-R4 se amplificó con ayuda del par de cebadores (sentido: secuencia SEC ID N°: 57; inverso: secuencia SEC ID N°: 58). Estos cebadores permiten la inserción de sitios enzimáticos BamHI en 5' y Sacl en 3'. Se digirió entonces el fragmento PCR obtenido por las enzimas BamHI y Sacl.

Se clonaron entonces las amplificaciones de ADN que codificaban el hMpI y el FGF-R4, simultáneamente, en el vector pEF6mut-HA abierto BamHI - Notl. La construcción que se deduce se denominó «pEF6mut-HA FGF-R4al I lc-hMpl2». Se mejoró después esta construcción por mutagénesis dirigida para cambiar el dominio transmembrana del FGF-R4 (secuencia proteica SEC ID N°: 59) para la secuencia SEC ID N°: 60. Para hacerlo, se utilizó el estuche "QuickChange® estuche de mutagénesis sitio-dirigida" (Clontech, referencia 200518) con los cebadores sentido de secuencia SEC ID N°: 61 e inverso de secuencia SEC ID N°: 62. La nueva construcción quimérica obtenida se denominó pEF6mut-HA FGF-R4alllcmut-hMpl2.

Creación de una línea estable para transfección de lia línea murina BaF/3 con la construcción FGF- R4alllcmut-hMpl2: Se introdujo , la construcción «pEF6mut-HA FGF-R4alllcmut-hMpl2» de manera estable por electroporacion en el genoma de células murinas BaF/3. Se seleccionó la línea obtenida en presencia de FGF2, 20 ng/ml (R&D, referencia 234-FSE-025) y heparina, 100 ng/ml (Sigma, referencia H3149). La línea transfectada y seleccionada es entonces de tipo clonal.

Protocolo de proliferación celular con la línea celular BaF/3 FGFR4-hMpl: Se cultivaron y se mantuvieron las células BaF/3 FGFR4-h pI en un medio RPMI 1640 (Invitrogen; ref. 32404-014) completo (SVF al 10% (Hyclone; ref. SH30070.03), Glutamina 2 mM, Aminoácido No Esencial MEM 1x (Gibco, ref 11140-035), Piruvato de Sodio MEM 1x (Gibco, ref 11360-039)), enriquecido en FGF2 20 ng/ml (R&D System, ref 234-FSE) y heparina 3 ng/ml (Sigma, ref H3149). La víspera, se sembraron las células a 0.4 106 células/ml en medio RPMI 1640 completo enriquecido en FGF2, 20 ng/ml y : en heparina a 3 ng/ml. Al día siguiente, se dispensaron 50 µ? de suspensión celular BaF/3 FGFR4-hMpl en medio RPMI 1640 completo enriquecido en FGF2 a 20 ng/ml y en heparina a 3 ng/ml a 0.2 106 células/ml en placa de 96 pozos (Porvair, ref 214006) seguido por 50 µ? de sobrenadante de hibridoma que contenía el anticuerpo que se tenía que ensayar. A continuación se pusieron las placas a 37°C, C02 al 5%, durante 24 a 30 h. Para la lectura de la proliferación celular, se cuantificó la cantidad de ATP por adición de 100 µ? de Cell Titer Glo Luminesent Cell Viability Assay (Promega, ref G7571) y s|e leyó la luminiscencia con ayuda de un luminómetro.

Se retuvieron los clones que presentaron en esté ensayo una señal del 50% más débil que la del medio RPMI 1640 completo conteniendo los aditivos FGF2, 20 ng/ml y heparina, 3 ng/ml.

Cuando se incubaron los anticuerpos ant¡-FGFR4, específicos de FGF-R4, con las células Baf/3-FGFR4-hMpl y con los siguientes aditivos FGF2, 20 ng/ml y heparina, 3 ng/ml, se observo un efecto antagonista sobre la proliferación celular. Entre los 39 hibridomas ensayados, 14 pueden inhibir la pro iteración celular, inducida por el FGF, de las células Baf/3-FGFR4-hMpl en presencia de FGF2.

Se demostró por ELISA (Fig 12) que los anticuerpos anti-FGFR4 antagonistas 40-12 y 64-12 eran afines a las proteínas murinas mFG FR4 y humanas hFG.FR4 (D2, D3).

Por último se realizó un último cribado, por Resonancia de Plasmón de Superficie (BIAcore 2000) para determinar las constantes de afinidad de los anticuerpos anti-FGFR4. Se analizó la interacción entre la proteína FGF-R4 y el anticuerpo anti-FGFR4 presente en el sobrenadante de cultivo del hibridoma, después de haber fijado el anticuerpo anti-FGFR4 a un anticuerpo anti-Fc fijado él mismo sobre el chip CM. Las mediciones de cinéticas se realizaron de acuerdo al protocolo de Canziani y colaboradores 2.004. Anal. Biochem. 325: 301-307.

Se seleccionaron dos anticuerpos entre éstos con constantes de afinidad de 10~8 a 10"9 M y velocidades de disociación de 103 a 10~5 s"1. Las características de estos anticuerpos se describen en la tabla 1 a continuación.

El método de referencia utilizado para la determinación de KD es la Resonancia de Plasmón de Superficie (BIAcore).

Tabla 1 A: Constantes de afinidad y de asociación/disociación ddee los anticuerpos anti-FGFR4 antagonistas purificados 40-12 y 64-12.

Ant¡-FGFR4 kon ( -1.s-1) koft (s-1) KD ( 40-12 1.94E + 05 1.26E-03 6.50E-09 64-12 1.05E + 04 6.02E-04 5.75E-08 Tabla 1B: Parámetros cinéticos de unión de los antjicuerpos anti-FGFR4 8, 31, 33 y 36 medidos por Resonancia de |Plasmón de Superficie (BIAcore 3000): Ejemplo 5: Especificidad de los anticuerpos anti-FGFR4 A- Especificidad de los anticuerpos anti-FGFR4 40-1 2 por el FGF-R4 La especificidad de cada anticuerpo se establece por ELISA de acuerdo al protocolo descrito en el ejemplo 4. De esta manera se observa la capacidad de cada anticuerpo para unirse a cada FGF-R. 'Esta experiencia demuestra claramente que el anticuerpo 40-12 no reconoce más que FGF-IR4 y es específico de FGF-R4. El anticuerpo 64-12 es capaz de unirse principalmente a FGF-R4 pero igualmente débilmente a FGF-R3 (Fig.7).

B - Especificidad de los anticuerpos anti-FGFR4 8, 31. 33 y 36 para el FGF-R4 La especificidad de cada anticuerpo se establece por ELISA de acuerdo al protocolo siguiente: las suspensiones de féigos que i presentan en su superficie los anticuerpos del formato Fab se generan por infección de bacterias E. coli. Los antígenos de captura se han fijado en cajas lmmulon-2 unidos a enzima (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). A continuación se añadieron las suspensiones de fagos, se detectaron después gracias al anticuerpo de ratón anti-fago M13 conjugado con peroxidasa (GE Healthcare, ref. 27-9421-01, dilución al 1.5.000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) y las mediciones de densidad óptica (D.O.) se efectuaron a 450 nm. La tabla 2 resume los resultados obtenidos: De esta manera se observa la capacidad de cada anticuerpo para unirse a cada FGF-R. Esta experiencia demuestra claramente que los anticuerpos 8, 31, 33, 36 no reconocen más que FGF-R4 y son pues específicos de FGF-R4.

Tabla 2: Especificidad de los anticuerpos antí-FGF-R4 resultantes de los clones 8, 31, 33 y 36 establecida por ELISA (Señal = D.O., 450 nm) h-FGFR4(D2,D3)- h-FGFR1 - h-FGFR2- h-F GFR3- histag Fe Fc Fc Clon 8 2,55 0,05 0,00 0,00 Clon 31 2,52 0,00 0,00 0,01 Clon 33 2,73 0,00 0,00 -0,01 Clon 36 1 ,87 -0,01 -0,01 - 0,02 Ejemplo 6: Efecto antagonista del anticuerpo 40-12 y de los anticuerpos resultantes de los clones 8, 31, 33, 36 en la angiogénesis (¡n vitro) Para determinar la actividad biológica del anticuerpo monoclonal 40-12 anti-FGFR4 durante la angiogénesis de células endoteliales humanas, las experiencias de angiogénesis in vitro se realizaron con ayuda de células HUVEC estimulada|s por el FGF2 en presencia del anticuerpo 40-12 o del anticuerpo) muestra en dosis crecientes de 1 a 30 pg/ml. (Fig 8A y 8B) En este ámbito, el anticuerpo monoclonal anti-FGFR4 antagonista activo 40-12 es capaz de inhibir la angiogénesis de i i células HUVEC, inducida por el FGF2 y esto a la dosis de 30 pg/ml o 200 nM, aunque el anticuerpo muestra 64-12 no tiene ningún efecto. Además, el anticuerpo 40-12 no tiene ningún efecto propio sobre la angiogénesis basal. | Estos resultados indican que un anticuerpo antagonista específico de FGF-R4 es capaz de inhibir la angiogénesis!.

Como para el anticuerpo 40-12, se evaluaron los anticuerpos anti-FGFR4 de los clones 8, 31, 33 y 36 resultantes de la visualización de fagos, en cuanto a su capacidad para inhibir la angiogénesis de células endoteliales humanas de tipo HUVEC, inducida por el FGF-2. Estos 4 anticuerpos bloquean la estimulación de la angiogénesis in vitro obtenida con el ¡FGF-2 y esto a la dosis de 10 pg/ml (Fig. 8C y 8D).

Ejemplo 7: Efecto antagonista del anticuerpo 40-12 y de los anticuerpos resultantes de los clones 8, 31, 33, 36 sobre las células de hepatocarcinomas humanos (in vitro) Para determinar el efecto anti-tumoral del anticuerpo monoclonal anti-FGFR4 antagonista 40-12, se realizaron experiencias sobre células de hepatocarcinoma humano Fep3b en las que la proliferación y las vías de señalización y conducción dependen del par ligando-receptor: FGF19/FGF-R4.

En primer lugar, se propuso el estudio de las vías de señalización dependientes de FGF-R4 y que conducen a la proliferación de células Hep3b por el método Western. Esta señalización celular pasa por la neo-síntesis de las proteínas cFos y JunB, así como por la fosforilación de Erk1/2 (Lin y colaboradores., J Biol Chem., 2007, 14:27277-84.). Para hacer esto, se sembraron 5.105 células en una caja de 35 mm de diámetro, en 2 mi de medio completo (DMEM, SVF al 10%, glutamina 2 mM). 24 h después, se pusieron en carencia las células, 24 h, en 1.8 mi de medio desprovisto de suero. A continuación se estimularon las células durante 3 h por 200 µ? de FGF19 concentrado 10 veces en ausencia o en presencia de anticuerpo anti-FGFR4 de control o 40-12. A continuación se retiró el medio, se lavaron las células una vez con PBS frío y se lisaron en una caja durante 30 min, a 4°C, por 75 µ? de amortiguador RIPA enriquecido en inhibidor de proteasa. Se centrifugó el extracto proteico total a continuación, 10 min, a 4°C, a 13.000 rpm y se analizó el sobrenadante por la técnica de ensayo de Western. A continuación se incubaron las membranas, 2 h, a temperatura ambiente, en TBS, tween al 0.05%, 5% de leche, después se añadió el anticuerpo primario anti-cFos (Cell Signaling Technology, ref 2250), anti-JunB (Cell Signaling Technology, ref 3746) y anti-fosfoErk1/2 (Cell Signaling Technology, ref 4377), al 1/1000° y se incubaron una noc e a 4°C con agitación lenta. Se enjuagó tres veces la membrana con TBS, tween al 0.05% y se incubó el anticuerpo secundario unido a HRP, 4 h, a 4°C, diluido al 1/2000° en TBS, tween al 0.05%, 5% de leche. Se cuantificaron después los resultados del ensayo de Western con ayuda de un Chemigenius (Syngene). Se ponderó la intensidad de las bandas obtenidas con los diferentes anticuerpos por la intensidad de las bandas obtenidas con el anticuerpo anti-actina directamente unido con la HRP y utilizado al 1/3000c (Santa Cruz Biotechnology, ref Sc-8432-? P) .

El FGF19 a 30 ng/ml induce la síntesis de las proteínas JunB y cFos, así como la fosforilación de Erk1/2 en las células Hep3b. Esta neo-síntesis de proteína y la fosforilación de Erk se inhiben completamente por el anticuerpo anti-FGFR4 40- 2 a 100 pg/ml, aunque el anticuerpo de control no tiene ningún efecto inhibidor. Se cuantificaron estos efectos observados en las membranas de ensayo de Western (Fig. 9A) y se representaron las intensidades de las bandas de cada membrana en forma de gráfica (Fig. 9B).

En segundo lugar, se han llevado a cabo experiencias de proliferación celular propiamente tales. Se sembraron 5000 células en placas de 96 pozos, en 100 µ? de medio DME , SVF al 10%, glutamina 2 mM. 24 h después, se sometieron las células a carencia en un medio de cultivo sin suero, durante 24 h. A continuación se estimularon las células Hep3b, 72 h, por 100 µ? de medio sin suero enriquecido por 10 ng/ml FGF19 (producción interna a Sanofi-Aventis R&D) o por 10% suero en ausencia o en presencia de anticuerpo muestra o de anticuerpo monoclonal anti-FGFR4 antagonista 40-12. Después de 3| días, se cuantificó la proliferación celular con ayuda del estuche | CelITiter Glo (Promega, Francia).

De estas experiencias, se desprende que el suero así como el FGF19 son capaces de estimular la proliferación de Hep3b. El anticuerpo anti-FGFR4 antagonista 40-12 inhibe parcialmente a 100 g/ml esta proliferación inducida al suero aunque el anticuerpo de muestra no presente actividad inhibidora (Fig. 10A). Además, el anticuerpo 40-12 a 10 g/ml bloquea completamente la proliferación inducida por el FGF19 (Fig. 10B). El anticuerpo de por los anticuerpos para la detección de fosfo-Erk112, directamente, sobre las células Hep3b comienza con la saturación de los sitios no específicos con 100 µ? de amortiguador de saturación (21.25 mi de PBS, 1.25 mi de suero no inmune de cabra al 10% (Zymed, ref 50-062Z), 75 µ? de tritón X 100), durante 2 h. Se reemplazó el amortiguador de saturación por 50 µ? de anticuerpo primario anti-fosfo Erk1/2 (Cell Signaling Technology, ref 4377) diluido al 1/100° en amortiguador de PBS, BSA al 1%, tritón X 100 al 0.3%. Se incubó el anticuerpo primario con las células, una noche, a 4°C. Se enjuagó a continuación por 3 lavados de 200 µ? de PBS y se reveló con ayuda de un anticuerpo secundario anti-conejo unido a AlexaFluor 488 (Molecular Probes, ref A11008) diluido al 1/5000° en amortiguador de PBS, BSA al 1%, tritón X 100 al 0.3%, durante 4 h. A continuación se enjuagó el anticuerpo secundario con 3 lavados de 200 µ? de PBS y se añadieron después 100 µ? de PBS a cada pozo Se leyó la fluorescencia por encima con ayuda de una lectora de placas de tipo EnVision 2103 Multilabel Reader (Perkin Elmer) utilizando el filtro FITC.

Esta técnica permite confirmar que el FGF-19 a 30 ng/ml induce la fosforilación de Erk1/2 en las células Hep3b y que el 40-12 es capaz de bloquear esta estimulación desde la dosis de 3 µ?/??? ( F i g . 9C). El FGF-2 así como el suero son igualmente capaces de inducir el sistema. En estos 2 últimos, el anticuerpo 40-12 inhibe el efecto del FGF-2 y del suero a dosis máslelevadas (30-100 Mg/ml; Fig. 9C).

La detección de fosfo-Erk1/2 por ELISA permitió también demostrar que los anticuerpos anti-FGFR4 activos en e| modelo de la angiogénesis in vitro son igualmente capaces de bloquear entre 70 y 95% de la fosforilación de Erk1/2 inducida por el FGF-19 con la dosis de 3 pg/ml (Fig. 9D).

De manera ventajosa, los anticuerpos de la presente invención tienen un efecto antagonista a la vez sobre la angiogénesis patológica asociada al desarrollo del tumor y sobre el crecimiento tumoral hepático propiamente tal, en particular en un modelo de hepatocarcinoma.

Ejemplo 8: Efecto antagonista del anticuerpo 40-12 en el modelo murino de cáncer pancreático Para este modelo farmacológico, se utilizaron | ratones hembra Rip1-Tag2 (Charles River Laboratory, Francia) de fondo genético C57BI/6J. Los animales tuvieron a partir de la semana 9 después del nacimiento, agua de bebida enriquecida con 5% de sacarosa. Los ratones se trataron de la semana 10 a la semana 12.5 en un protocolo de tratamiento en intervención, una vez por semana, por una inyección por vía sub-cutánea de los anticuerpos anti-FGFR4 40-12 o de control con la dosis de 25 mg/kg (Fig. 14A). Este protocolo fue aprobado por el «Comité de experimentación Animal (Comité del Cuidado y UsoJ de los Animales)» de Sanofi-Aventis Recherche. Nuestras instalaciones zootécnicas, la atención prestada a los animales así como los protocolos de tratamiento están de acuerdo con los principios impuestos por el convenio europeo sobre la protección de los animales Vertebrados y sometidos a eutanasia después del periodo de tratamiento o cuando la carga tumoral y/o los efectos secundarios obligaran su retirada del estudio.

Para la medición de la carga tumoral, se someten los animales a eutanasia al final de la experiencia y los tumores se microdisecaron a partir del páncreas recién extirpado. Se midió el volumen tumoral en mm3 con ayuda de un pie de rey, aplicando la fórmula [volumen = 0.52 x (anchura)2 x (longitud)] para aproximarnos al volumen de un esferoide. La carga tumoral para i" el ratón se calculó por la acumulación del volumen de losj tumores de cada ratón.

Para el análisis histoquímico de la densidad vascular, se anestesiaron los animales, se recogieron los páncreas, se fijaron una noche en accustain® (Sigma), después se fijó en parafina. Se prepararon cortes de 5 pm de espesor para cada muestra. Se detectaron las células endoteliales por incubación de los cortes con tripsina (Zymed, ref 00-3003), a 37°C, durante 10 min , después con un anticuerpo anti-CD31 de ratón hecho en rata y diluido al 1/50° (BD Pharmingen). Para revelar las regiones marcadas por el anticuerpo, se incubaron los cortes! con un anticuerpo anti-rata unido a biotina durante 30 min, después con estreptavidina unida a HRP durante igualmente 30 min (estuche ABC Vectastain®, Vector) y por último con DAB durante (Vector, ref SK4100). Se marcaron después los cortes con hematoxilina diluida al 1/10° (Dako, S-3309). Se realizaron las tomas de vista con la ayuda de una cámara montada en un microscopio (Nikon, E-800) a un aumento total de 200 veces. Se analizaron las imágenes por un programa (Visiolab, Biocom). Se contaron los vasos sanguíneos en el tumor y se clasificaron en función de su superficie: los vasos pequeños entre 5 y 20 pm2, los medios entre 21 y 100 pm2 y los grandes a partir de 101 pm2. Se analizaron dos portaobjetos por páncreas para determinar la densidad vascular que correspondía al número total de e ementos marcados por campo.

En este modelo, el tratamiento subcutáneo con la ayuda del anticuerpo ant¡-FGFR4 40-12 a 25 mg/kg, una vez por semana, entre la décima y la duodécima semana, permite reducir la carga tumoral de 55% y de manera significativa (Fig 11B) y la tendencia a reducir 34% el número de tumores por páncreas (F g. 11C), aunque el tratamiento de control no tiene ningún efecto. Esta inhibición del desarrollo tumoral gracias al anticuerpo anti-FGFR4 40-12 va acompañada de una reducción significativa de 31% de la densidad vascula'r total (Fig. 11D) correspondiendo a una reducción observada del número de vasos sanguíneos en el conjunto de grupos de tamaño de vasos marcados con ayuda de un anticuerpo anti-CD31 (Fig. 11D).

Estos resultados in vivo demuestran claramentel que un anticuerpo anti-FGFR4 antagonista es capaz de inhibir el reclutamiento y la formación de vasos sanguíneos en el tumor. Esta inhibición de la vascularización tumoral va acompañada de una reducción del número de tumores por páncreas y del|volumen tumoral total.

De manera ventajosa, los anticuerpos de la |presente invención tienen un efecto antagonista a la vez sobre la angiogénesis patológica y sobre el crecimiento tumoral | hepático (en un modelo de hepatocarcinoma) y pancreático.

Ejemplo 9: Reactividad cruzada del anticuerpo con los FGF-R4 humano, murino y de rata ',?' En un primer momento, se realizaron experiencias de competición de unión. Para hacer esto, se marcó el FGF2 al nivel de 2 cisteínas libres con la ayuda de un AlexaFluor®, 488 nm, C-5 maleimida (Molecular Probes, A10254) de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. Este FGF2-AF488 a 10 ng/ml, es capaz de unirse a los FGF-R4 humanos expresados en la superficie de las células 300-19 transfectadas (Fig. 8). Esta unión es específica puesto que la adición en exceso de FGF2 no marcado permite desplazar la interacción FGF2/FGF-R4 (Fig. 8A). Se realizó la misma experiencia volviendo a añadir dosis crecientes del anticuerpo 40-12 o del anticuerpo de muestra 64-12. Sólo el anticuerpo antagonista 40-12 es apto para desplazar la unión FGF2-AF488/FGF-R4 y esto, con un IC50 de 3500 ng/ml o sea 23 nM, que demuestra que el efecto antagonista de este anticuerpo será debido a su capacidad para desplazar! la unión FGF/FGF-R4.

En un segundo momento y con el fin de determinar la aptitud del clon 40-12 para bloquear la unión FGF/FGF-R4 en otras especies distintas del humano, se realizó una experiencia de disociación utilizando las parejas FGF2/FGF-R4 de ratón, de rata y humano en la referencia. Para hacer esto, se marcó FGF2 murino (R&D, ref 3139-FB-025) o de rata (R&D, ref 3339-FB-025) de la misma manera que el FGF2 humano por un AlexaF uor 488. Se realizaron experiencias de disociación utilizando las líneas 300-19 transfectadas con los receptores FGF-R4 de ratón o de rata. Los resultados demuestran que el anticuerpo ant.i-FGFR4 antagonista 40-12 es capaz de disociar la unión FGF2/FGF-R4 en un sistema ratón o rata con la misma eficacia que en el sistema humano. En efecto, los IC50 son de 3500, 4110 y 3940 ng'/ml o sea 23, 27 y 26 nM, para los complejos FGF2/FGF-R4 humano, murino rata, respectivamente (Fig. 13A, 13B 13C, respectivamente). Esta capacidad para unirse al FGF-R4 de roedores se verificó por ELISA. El anticuerpo 40-12 selune bien también al FGF-R4 humano y murino (Fig. 2).

Estos resultados indican que el anticuerpo anti-FGFR4 40-12 se podrá utilizar en modelos farmacológicos en roedores (al menos ratón y rata) y que los resultados obtenidos deberán ser predictivos de la eficacia en el humano.

Igualmente, los estudios dirigidos sobre el anticuerpo resultante de los clones 8, 31, 33 y 36 demuestran que estos anticuerpos reconocen a la ez el FGF-R4 humano y el| FGF-R4 murino (Tabla 4 a continuación) Tabla 4: Parámetros cinéticos de unión de los anticuerpos a nti-FGFR4 8, 31, 33 y 36 medidos por Resonancia de Plasmón de Superficie (BIAcore 3000): Ejemplo 10: Determinación del epítopos reconocido] por los anticuerpos anti-FGF-R4 A- Determinación del epítopos reconocido por el anticuerpo anti-FGFR4 40-12 Se realizó un cribado para determinar el dominio ejspecífico del FGFR4 reconocido por el anticuerpo 40-12 por análisis ELISA. Gracias al uso de una forma negativa del dominio D1 dé FGF-R4 en ELISA, se estableció que el anticuerpo 40-12 interactuó al nivel de los dominios D2-D3 de FGF-R4 (Fig. 12).

Se realizó un segundo cribado por análisis ELISA, utilizando como antígeno de captura las construcciones que contienen o el dominio D1 (SABVA4794) o el dominio D2 (SABVA4796) o el dominio D3 (SABVA4799) de proteína hFGFR4, como se describe en el ejemplo 2. Se fijó el antígeno de captura en cajas Immulon-4 unido a enzima (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). A continuación se añadió el hibridoma 40-12, se detectó gracias al anticuerpo de conejo anti-ratón IgG conjugado con peroxidasa (Sigma; ref. A9044-dilución al 1:50.000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim; ref UP664780) y se realizaron las mediciones de densidad óptica (D. O.), a|450 nm. La tabla 5 resume los resultados obtenidos: Tabla 5: Medición de la unión del anticuerpo 40-1¡2 a los diferentes subdominios de FGF-R4 Dominio D1 D2 D3 D1-D3 estudiado SABVA4794 SABVA4796 SABVA4799 FGFR4 -Fe Señal (D.O. 0 185 3.000 0.105 3.000 450 nm) El anticuerpo anti-FGFR4 reconoció pues el domingo D2 de la parte extracelujar de la proteína FGFR4.

Por otra parte, la proteína FGFR4-Fc desnaturalizada con SDS no fue reconocida por el anticuerpo 40-12 en el análisis por i el Método Western, lo que indica que el epítopos determinado por el 40-12 sobre el dominio D2 de FGFR4 es de tipo conformacional .

B- Determinación del epítopos reconocido por los anticuerpos anti-FGFR4 8. 31. 33. 36.

Se realizó un cribado para determinar el dominio especifico del FGFR4 reconocido por los anticuerpos 8, 31, 33, 36 por análisis ELISA, utilizando como antígeno de captura las construcciones que contienen o los dominios D2 y D3 (SEC ID No 42) o la proteína hFGFR4-Histag (SABVA4614, SEC ID Nj 40). Se fijó el antígeno de captura en cajas lmmulon-4 unido a enzima (VWR Scientific Inc. Swedesboro, NJ). Se añadieron a continuación los sobrenadantes de los cultivos de HEK293 transfectados transitoriamente por plásmidos que permiten la secreción de los anticuerpos 8, 31, 33, 36, después se detectaron gracias al anticuerpo de conejo anti-humano IgG conjugado con peroxidasa (DakoCytomation, ref. P0214-dilucíón al 1:5.000). El revelado se realizó con el sustrato TMB-H202 (Interchim, ref UP664780) y las mediciones de densidad óptica (D.O.) se efectuaron a 450 nm. La tabla 6 a continuación resume los resultados obtenidos: Tabla 6: Unión de los anticuerpos resultantes de los clonjes 8, 31, 33 y 36 al FGF-R4 entero o al subdominio D2-D3 (señal DO a 450 nm) hFGFR4(D2,D3)- hFGFR4-Histag Histag Clon 8 3,898 3,860 Clon 31 3,859 3,741 Clon 33 3,752 3,621 Clon 36 3,751 3,616 Los anticuerpos 8, 31, 33 y 36 reconocen pues dominio D2-D3 de la parte extracelular de la proteína FGFR4.

Tabla 7: secuencias utilizadas, obtenidas y deducidas Secuencias Secuenci iS nucleotídica proteica ? Anticuerpo 40-12 VH + CH SEC ID N° 1 SEC ID N° 2 VL + CL SEC ID N° 3 SEC ID N° 4 VH SEC ID N° 5 SEC ID N° 6 VL SEC ID N° 7 SEC ID N° 8 CDR VH SEC ID N° 9; 1 0; 11 CDR VL SEC ID N° 12; 13; 14 Anticuerpo 64-12 VH + CH SEC ID N° 15 SEC ID N° 16 VL + CL SEC ID N° 17 SEC ID N° 18 VH SEC ID N° 19 SEC ID N° 20 VL SEC ID N° 21 SEC ID N° 22 CDR VH SEC ID N° 23; 24; 25 CDR VL SEC ID N° 26; 27; 28 Secuencias humanizadas Cadena ligera 1 SEC ID N° 29 SEC ID N° 30 Cadena ligera 2 SEC ID N° 31 SEC ID N° 32 Cadena pesada 1 SEC ID N° 33 SEC ID N° 34 Cadena pesada 2 SEC ID N° 35 SEC ID N° 36 Cadena pesada 3 SEC ID N° 37 SEC ID N° 38 Anticuerpo clon 8 Cadena ligera entera SEC ID N° 71 SEC ID N° 7: Cadena ligera CDR SEC ID N° 73; 74; 75 Cadena pesada entera SEC ID N° 76 SEC ID N° 7" r Cadena pesada CDR SEC ID N° 78; 79; 80 Anticuerpo del clon 31 Cadena ligera entera SEC ID N° 81 SEC ID N° 8; Cadena ligera CDR SEC ID N° 33; 84; 85 Cadena pesada entera SEC ID N° 86 SEC ID N° 8' 7 Cadena pesada CDR SEC ID N° 38; 89; 90 Anticuerpo del clon 33 Cadena ligera entera SEC ID N° 91 SEC ID N°92 Cadena ligera CDR SEC ID N° 93; 94; 95 Cadena pesada entera SEC ID N° 96 SEC ID N° 9" 7 Cadena pesada CDR SEC ID N° 98; 99; 100 Anticuerpo del clon 36 Cadena ligera entera SEC ID N° 101 SEC ID N° 1C >2 Cadena ligera CDR SEC ID Nc 103; 104; 105 Cadena pesada entera SEC ID N° 106 SEC ID N° 1( )7 Cadena pesada CDR SEC ID Nc ' 108; 109; 110 Sub-dominios de la parte extracelular de hFGFF 4 fusionados al dominio Fe del lgG1 fGFGR4_D1 ::Fc SEC ID N° 111 SEC ID N° 112 fGFGR4_D2::Fc SEC ID N° 113 SEC ID N° 114 fGFGR4_D3::Fc SEC ID N° 115 SEC ID N° 116 Secuencia de región SEC ID N° 1 ' 17 constante de lgG1 humano

Claims (28)

REIVINDICACIONES

1. Antagonista del receptor FGF-R4 para su uso para inhibir la angiogénesis

2. Antagonista de conformidad con la reivindic'ación 1 para su uso en el tratamiento de las enfermedades asojciadas a una angiogénesis patológica.

3. Antagonista de conformidad con la reivindicación 1 para su uso para inhibir el crecimiento tumoral simultáneamente a la inhibición de la angiogénesis.

4. Antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el tratamiento de hepatocarcinomas o de cualquier otro tipo de cáncer hepático.

5. Antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el tratamiento del cáncer de páncreas.

6. Antagonista de FGF-R4 para su uso para inhibir la proliferación celular tumoral en el tratamiento de hepatocarcinomas o de cualquier otro tipo de cáncer hepático, y en el tratamiento de cánceres pancreáticos.

7. Antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por qué es un anticuerpo que se une específicamente a FGF-R4.

8. Antagonista de conformidad con la reivindicación 7, que se une al dominio D2-D3 del receptor FGF-R4.

9. Antagonista de conformidad con la reivindicación 7, se une al dominio D2 del receptor FGF-R4.

10. Antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, que tiene un o con respecto al receptor FGF-R4 determinado por la técnica Resonancia de Plasmón de Superficie (Biacore) inferior 10E-8 M.

11. Antagonista de conformidad con cualquiera' de las reivindicaciones 7 a 10, que es activo a la vez contra FGF-R4 humano y FGF-R4 murino.

12. Antagonista del receptor FGF-R4 que | es un anticuerpo que comprende las CDR de secuencia SEC ID No: 9, 10, 11, 12, 13 y 14; ó 73, 74, 75, 78, 79 y 80; ó 83, 84, 85, 88, 89 y 90; ó 93, 94, 95, 98, 99 y 100; ó 103, 104, 105, 108, 109 y 110, en donde una de las CDR puede diferir en uno a dos aminoácidos con relación a una al menos de las secuenciaJ citadas anteriormente, siempre que el anticuerpo mantenga su especificidad de unión.

13. Antagonista del receptor FGF-R4 que es un anticuerpo cuya parte variable de su cadena pesada comprende una secuencia nucleotídica que presenta al menos el 80% de identidad con la secuencia SEC ID No: 5, 76, 86, 96 ó 106 y cuya parte variable de su cadena ligera comprende una secuencia nucleotídica que presenta al menos el 80% de identidad con la secuencia SEC ID No: 7, 71, 81, 91 ó 101, siempre que el anticuerpo mantenga su especificidad de unión.

14. Antagonista del receptor FGF-R4 que | es un anticuerpo cuya secuencia comprende las secuencias polipeptídica SEQ ID N°: 2 y 4; ó 6 y 8; ó 72 y 77; ó 82 y 87; ó 92 y 97; ó 192 y 107 ó secuencias que corresponden a estas secuencias que tienen al menos 80% de identidad con ellas, siempre que el anticuerpo mantenga su especificidad de unión.

15. Antagonista del receptor FGF-R4 que es un anticuerpo cuya afinidad por FGF-R4 es 10 veces superior a su afinidad por los otros receptores de FGF.

16. Antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado por que es un anticuerpo humanizado.

17. Antagonista de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado por que comprende una cadena variable ligera que presenta al menos 80% de identidad una de las secuencias polipeptídica SED ID N° 30 ó 32 y una cadena variable pesada que presenta al menos 80% de identidad con una de las secuencia SEQ ID N° 34, 36 ó 38.

18. Antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, caracterizado por que es un anticuerpo conjugado a un agente citotóxicos.

19. Composición farmacéutica que comprende un antagonista de conformidad con cualquiera | de las reivindicaciones 1 a 18 y excipientes.

20. Método de tratamiento de una enfermedad unida a una angiogénesis patológica caracterizado por que comprende la administración al paciente |de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18.

21. Método de tratamiento de un cáncer caracterizado por que comprende la administración al paciente de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 18.

22. Línea celular que produce los anticuerpos de conformidad con la reivindicación 7 a 17.

23. Procedimiento de producción de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 17, caracterizado por que comprende poner en cultivo una línea celular de conformidad con la reivindicación 22.

24. Medicamento que comprende un antagonista de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.

25. Polinucleótido que codifica un polipéptido que presenta al menos el 80% de identidad con una de las secuencias SEC ID Nos: 2, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 30, 32, 34, 36, 38, 72, 73, 74, 75, 77, 78, 79, 80, 82, 83, 84, 85, 87, 88, 89, 90, 92, 93, 94, 95, 97, 98, 99, 100, 103, 104, 105, 107, 108, 109 ó 110, siempre que el polipéptido mantenga su especificidad de unión.

26. Polinucleótido caracterizado por que presenta una secuencia que presenta al menos el 80% de identidad con una de las secuencias SEC ID Nos: 1, 3, 5, 7, 29, 31, 33, 35 ó 37, 71, 76, 81, 86, 91, 96, 101 ó 106, siempre que el polipéptido mantenga su especificidad de unión.

27. Vector recombinante que comprende un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 y 26.

28. Célula anfitriona que comprende un vector de conformidad con la reivindicación 27.