ES2420907T3 - Genoma del Bifidobacterium CNCM I-2618 - Google Patents
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Abstract
Bifidobacterium longum cepa CNCM I-2618.
Description
Genoma del Bifidobacterium CNCM I-2618
5 La presente invención se refiere a un nuevo microorganismo del género Bifidobacterium longum, en concreto a su secuencia genómica. Se da a conocer un soporte de datos que comprende las secuencias de nucleótidos de NCC2705. Además, la presente invención se refiere a la cepa de Bifidobacterium longum NCC2705 y también a composiciones alimentarias y farmacéuticas que contienen dicho Bifidobacterium para la prevención y/o tratamiento de la diarrea provocada por rotavirus y bacterias patógenas.
10 Desde hace décadas se conocen los organismos que producen ácido láctico como componente metabólico principal. Estas bacterias se hallan normalmente en la leche o en fábricas procesadoras de leche, respectivamente, en plantas vivas o en estado de descomposición y también en el intestino del hombre y de los animales. Estos microorganismos agrupados bajo el término “bacterias lácticas”, representan un grupo bastante poco homogéneo y comprenden los
15 géneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediocaccus etc.
El hombre ha utilizado las bacterias lácticas como agentes fermentadores para la conservación de alimentos aprovechando su pH bajo y la acción de productos generados durante la actividad fermentadora de las mismas para inhibir el crecimiento de bacterias contaminantes. Además, las bacterias lácticas también se han utilizado para la
20 preparación de una serie de alimentos diferentes tales como quesos, yogures y otros productos lácteos fermentados a partir de la leche.
De forma bastante reciente, las bacterias lácticas han generado mucho interés al observarse que algunas cepas muestran propiedades valiosas para el hombre y los animales tras su ingestión. En concreto, se ha observado que
25 cepas específicas de los géneros Lactobacillus o Bifidobacterium pasan a lo largo del tracto gastro-intestinal en forma viva y viable sin ser destruidas en la parte superior del mismo, especialmente por el impacto del pH bajo que predomina en el estómago, siendo capaces de colonizar la mucosa intestinal, suponiéndose que su permanencia temporal o mantenida en el intestino genera numerosos efectos positivos sobre la salud de los seres vivos. Estas cepas se denominan de forma genérica probióticos.
30 La patente EP 0 768 375 da a conocer una cepa específica del género Bifidobacterium, que es capaz de implantarse en la flora intestinal y que puede adherirse a las células intestinales. Se ha notificado que este Bifidobacterium colabora en la modulación de la inmunidad, siendo capaz de excluir de forma competitiva la adhesión a las células intestinales de bacterias patógenas, contribuyendo de este modo al mantenimiento de la salud del individuo.
35 A la vista de las valiosas propiedades que pueden producir cepas concretas de bacterias lácticas, existe en la técnica el interés por cepas adicionales de bacterias lácticas que sean beneficiosas para el bienestar del hombre y/o los animales. Además, interesa poseer información más detallada en relación a la biología de estas cepas, en concreto en lo que se refiere a la interacción con los huéspedes, los fenómenos del paso a través de diferentes
40 condiciones ambientales en el intestino, así como a la capacidad de adherirse a la mucosa intestinal y eventualmente a su papel en el incremento del sistema inmunitario y de defensa contra patógenos, permitiendo dicha información una mejor comprensión de estos mecanismos.
Por consiguiente, un problema que aborda la presente invención es dar a conocer datos substanciales sobre cepas 45 bacterianas que muestran propiedades beneficiosas para el hombre y/o los animales.
A la vista de dicho problema, un tema de la presente invención versa sobre la secuencia de nucleótidos mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798 de la bacteria láctica Bifidobacterium longum NCC2705. Sin embargo, la invención no queda limitada a la secuencia mostrada en el identificador de secuencia nº1
50 de la patente WO 02/074798, si no que engloba genomas y nucleótidos que codifican polipéptidos de variantes de la cepa, polimorfismos, variantes alélicas y mutantes de la misma.
En las figuras,
55 La figura 1 muestra un gráfico que indica la capacidad de Bifidobacterium longum NCC2705 de adherirse a las células intestinales humanas en cultivo; como comparación se utilizó la cepa Bifidobacterium BL28 Cal;
La figura 2 muestra la sensibilidad patogénica de bacterias patógenas frente a Bifidobacterium longum NCC2705;
60 La figura 3 muestra la actividad de las líneas celulares NCC2705 y BI 28 contra la infección de células Caco-2 por
S. typhimurium SL1344;
La figura 4 muestra la tasa de supervivencia de ratones infectados con Salmonella typhimurium SL 1344 y tratados con Bifidobacterium NCC2705; 65
La figura 5 muestra un esquema que ilustra el cribado de cultivos celulares para evaluar las propiedades protectoras frente a rotavirus de la cepa bacteriana NCC 2705.
La presente invención se basa en la secuenciación de genoma completo del genoma de Bifidobacterium longum 5 cepa NCC2705, depositado en el Instituto Pasteur, según el Tratado de Budapest de 29 de Enero de 2001, recibiendo el nºde depósito CNCM I- I-2618.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos seleccionadas del grupo formado por (a) la secuencia de nucleótidos mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798, y
10 una secuencia de nucleótidos que muestra una identidad de al menos el 90% con la secuencia mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798.
Los términos genoma o secuencia genómica deben entenderse que significan la secuencia del cromosoma de Bifidobacterium longum. El término plásmido debe entenderse que denomina cualquier trozo de ADN 15 extracromosómico contenido en el Bifidobacterium de la presente invención. Secuencia de nucleótido, polinucleotido
o ácido nucleico deben entenderse que denominan el ADN de doble cadena, ADN de cadena única o los productos de la transcripción de dichos ADNs de diversas longitudes, incluyendo oligonucleótidos de aproximadamente entre 10 y 100 nucleótidos de longitud.
20 Una secuencia de nucleótidos homóloga según la presente invención se entiende que significa una secuencia de nucleótidos que posee un porcentaje de identidad con las bases de la secuencia de nucleótidos del identificador de secuencia nº1 o nº2 de al menos el 90%, más preferentemente del 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Dichos homólogos pueden comprender, por ejemplo, las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de los fragmentos representativos de una bacteria perteneciente a la especie Bifidobacterium, preferentemente la
25 especie Bifidobacterium longum, así como las secuencias correspondientes a la secuencia genómica o a las secuencias de los fragmentos representativos de una bacteria perteneciente a las variantes de la especie Bifidobacterium. En la presente invención, los términos especie y género son mutuamente intercambiables.
Estas secuencias homólogas pueden, por lo tanto, corresponder a variaciones asociadas a mutaciones dentro de la
30 misma especie o entre especies y pueden corresponder, en concreto, a truncamientos, substituciones, deleciones y/o adiciones de al menos un nucleótido. Dichas secuencias homólogas también pueden corresponder a variaciones asociadas a la degeneración del código genético o a sesgos en el código genético específicos de la familia, de la especie o de la variante y que es posible que estén presentes en Bifidobacterium.
35 Las homologías entre secuencias de proteínas y/o ácidos nucleicos pueden evaluarse utilizando cualquiera de los diferentes programas y algoritmos de comparación conocidos en la técnica. Dichos programas y algoritmos incluyen, pero sin carácter limitativo en modo alguno, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, y CLUSTALW (ver, por ejemplo, Pearson y Lipman, 1988 Proc. Natl Acad. Sci. USA 85 (8): 2444-2448; Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol. 215 (3): 403-410; Thompson y otros, 1994, Nucleic Acids Res. 22 (2): 4673-4680; Higgins y otros, 1996, Methods Enzymol.
40 266: 383-402; Altschul y otros, 1990, J. Mol. Biol 215 (3):403-410; Altschul y otros, 1993, Nature Genetics 3: 266272).
Las homologías entre secuencias de proteínas y ácidos nucleicos se evalúan utilizando la herramienta “Basic Local Aligment Search Tool” (Herramienta básica de búsqueda de alineamientos locales) (“BLAST”) bien conocida en la
45 técnica (ver más arriba). En concreto, se han utilizado cuatro programas BLAST específicos para realizar las siguientes tareas:
(1) BLASTP: Compara una secuencia de aminoácidos problema frente a una base de datos de secuencias de proteínas.
50 (2) BLASTN: Compara una secuencia de nucleótidos problema frente a una base de datos de secuencias de nucleótidos.
(3) BLASTX: Compara una secuencia de nucleótidos problema traducida en todos los marcos de lectura frente a una base de datos de proteínas.
(4) TBLASTN: Compara una secuencia de proteína problema frente a una base de datos de secuencias de 55 nucleótidos traducida dinámicamente en todos los marcos de lectura.
Entre estos fragmentos representativos, son preferentes aquellos capaces de hibridarse bajo condiciones restrictivas con una secuencia de nucleótidos según la presente invención. Hibridación bajo condiciones restrictivas significa que se escogen unas condiciones de temperatura y potencia iónica tales que permiten que se mantenga la
60 hibridación entre dos fragmentos complementarios de ADN. Estas condiciones altamente restrictivas pueden conseguirse, por ejemplo, realizando la hibridación a una temperatura preferente de 65 ºC en presencia de tampón SSC, por ejemplo SSC 1x correspondiente a NaCl 0,15 M y citrato sódico 0,05 M. Las etapas de lavado pueden ser, por ejemplo, las siguientes: SSC 2x, SDS 0,1% a temperatura ambiente seguido de tres lavados con SSC 1x, SDS 0,1%; SSC 0,5x, SDS 0,1%; SSC 0,1x, SDS 0,1% a 68ºC durante 15 minutos.
65 La secuencia de nucleótidos mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798 se ha obtenido mediante la secuenciación del genoma de Bifidobacterium longum NCC2705 y del plásmido contenido en el mismo mediante el método de secuenciación dirigida tras secuenciación automatizada fluorescente de los insertos de clones y el ensamblaje de dichas secuencias de fragmentos de nucleótidos (insertos) mediante programas
5 informáticos. Con este fin, se generaron fragmentos del genoma, se ligaron dentro de vectores adecuados para la amplificación y propagación y se secuenciaron los fragmentos correspondientes. Las superposiciones y la disposición final de los fragmentos, así como la secuencia de nucleótidos de los mismos, se evaluó con la ayuda de los programas informáticos adecuados.
10 La presente invención puede utilizarse para la producción de polipéptidos utilizando los conocimientos de los marcos de lectura abiertos (ORFs) derivados de la secuencia mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798.
Las moléculas de ácido nucleico derivadas a partir de la secuencia genómica identificada como la secuencia
15 mostrada en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO 02/074798 pueden obtenerse, por ejemplo, mediante la amplificación específica de la secuencia correspondiente utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. Gracias a la información de secuencias dada a conocer en la presente invención, los expertos en la técnica pueden diseñar y sintetizar cualquier cebador adecuado y amplificar un fragmento de interés utilizando la reacción en cadena de la polimerasa. Obviamente también pueden utilizarse otras técnicas de amplificación de
20 ácidos nucleicos diana, tales como, por ejemplo la técnica TAS (Transcription-based Amplification System (“Sistema de amplificación basado en la transcripción”)), la técnica 3SR (Self-Sustained Sequence Replication (“Replicación sostenida de secuencias”)), la técnica NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification (“Amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos”)), la técnica SDA (Strand Displacement Amplification (“Amplificación por desplazamiento de hebra”)), o la técnica TMA (Transcription Mediated Amplification (“Amplificación mediada por
25 transcripción”)), etc.
Los (poli)nucleótidos también pueden utilizarse como sondas y pudiendo aplicarse técnicas para la amplificación o modificación de ácidos nucleicos utilizados como sondas, tales como, por ejemplo la técnica LCR (Ligase Chain Reaction (“Reacción en cadena de la ligasa”)), la técnica RCR (Repair Chain Reaction (“Reacción de reparación de
30 cadenas”)), la técnica CPR (Cycling Probe Reaction (“Reacción de sondas cíclicas”)) o la técnica de amplificación de la Q-beta-replicasa.
Para obtener fragmentos del ácido nucleico representado por la secuencia mostrada en el identificador de secuencia nº1 de WO 02/074798, puede someterse el ADN genómico de Bifidobacterium longum a una digestión con enzimas
35 de restricción seleccionadas, separando los fragmentos mediante, por ejemplo, electroforesis u otra técnica de separación adecuada. Dichas técnicas son bien conocidas en la técnica y se dan a conocer, entre otros, en Sambrook y otros. A Laboratory Manual (“Manual de laboratorio”), Cold Spring Harbor 1992. Dichos fragmentos pueden obtenerse con facilidad aislando el ADN genómico de Bifidobacterium longum NCC2705 (CNCM I-2618) y realizando las etapas necesarias.
40 De forma alternativa, también pueden obtenerse los ácidos nucleicos mediante síntesis química cuando no son de un tamaño demasiado grande, según métodos bien conocidos por los expertos en la técnica.
Debe entenderse que el término secuencias de nucleótidos modificadas significa cualquier secuencia de nucleótidos
45 obtenida mediante mutagénesis según técnicas bien conocidas por los expertos en la técnica y que muestran modificaciones en relación a las secuencias normales, por ejemplo, mutaciones en las secuencias reguladoras y/o promotoras de la expresión de un polipéptido, en concreto las que provocan una modificación en el nivel de expresión de dicho polipéptido o a una modulación del ciclo de replicación. También se entenderá que el término secuencia de nucleótidos modificada significa cualquier secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido
50 modificado tal y como se define más adelante.
Durante el estudio del genoma de Bifidobacterium longum pudo realizarse la anotación siguiente como se identifica por las secuencias que poseen un marco de lectura abierto identificado por los números 1 a 1.147, mostradas en la tabla 1 siguiente.
Los ORF correspondientes a las secuencias de nucleótidos nº 1 a 1147 se definen en la anterior tabla 1 y están representadas por su posición en la secuencia genómica del identificador de secuencia nº 1. Por ejemplo, la secuencia ORF3 es definida por la secuencia de nucleótido entre los nucleótidos de las posiciones 4622 y 6472 en la secuencia indicada en el identificador de secuencia nº 1 de WO 02/074798, incluyendo los extremos.
5 Los marcos de lectura abiertos han sido identificados a través de análisis de homología y también como análisis de lugares de inicio potenciales de ORF. Se comprenderá que cada ORF identificada comprende una secuencia de nucleótidos que se extiende a la secuencia de nucleótidos contigua desde el codón inmediato 3’ al codón de interrupción del ORF precedente y a través del codón 5’ al siguiente codón de interrupción de la secuencia dada a
10 conocer en el identificador de secuencia nº 1 de WO 02/074798 en marco a la secuencia de nucleótido de ORF.
La tabla 1 muestra también los resultados de búsquedas de homología en las que se ha efectuado comparación de las secuencias de los polipéptidos codificados con cada una de los ORF con respecto a secuencias presentes en bases de datos publicadas. Se comprenderá que en una realización, los polipéptidos en la lista de la tabla 1, que
15 muestran identidad superior aproximadamente al 99% con respecto a un polipéptido presente en una base de datos dada a conocer públicamente no se consideran parte de la presente invención. De modo similar a esta realización, las secuencias de nucleótidos que codifican dichos polipéptidos no se consideran parte de la invención.
En lo que respecta a la homología con las secuencias de nucleótidos ORF, las secuencias homólogas que muestran
20 un porcentaje de identidad con las bases de una de las secuencias de nucleótidos ORF del, como mínimo, 80%, preferentemente 90% y 95% son preferentes. Estas secuencias homólogas son identificadas a través de, por ejemplo, los algoritmos descritos anteriormente y en los ejemplos que seguirán. Dichas secuencias homólogas corresponden a las secuencias homólogas definidas anteriormente y pueden comprender, por ejemplo, las secuencias correspondientes a las secuencias ORF de una bacteria que pertenece a la familia Bifidobacterium.
25 Estas secuencias homólogas pueden corresponder igualmente a variaciones relacionadas con mutaciones dentro de las mismas especies o entre especies y pueden corresponder en particular a truncaciones, sustituciones, delaciones y/o adiciones de, como mínimo, un nucleótido. Dichas secuencias homólogas pueden también corresponder a variaciones relacionadas con la degeneración del código genético o a una tendencia en el código genético que es
30 específica de la familia, con respecto a la especie y a la variante y que es probable que se encuentren presentes en Bifidobacterium.
Son secuencias especialmente interesantes secuencias de nucleótidos que codifican los siguientes polipéptidos o fragmentos de los mismos:
(a) Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 5 (ORF13) de WO 02/074798
40 (b) Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 525 (ORF1827) de WO 02/074798 (c) Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 424 (ORF1473) de WO 02/074798
- (d)
- Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 548 (ORF1905) de WO 02/074798
- (e)
- Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 74 (ORF219) de WO 02/074798
- (f)
- Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 576 (ORF1972) de WO 02/074798
(g) Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 403 (ORF1403) de WO 02/074798
- (h)
- Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 804 (ORF2676) de WO 02/074798
- (i)
- Secuencia dada a conocer en el identificador de secuencia nº 313 (ORF1077) de WO 02/074798
Se entenderá que la información de secuencias contenida en la presente solicitud puede ser utilizada para seleccionar un polinucleótido de interés, es decir, un ácido nucleico que contenga un marco de lectura abierto que 15 codifique un polipéptido potencial conocido o desconocido, y transformar microorganismos con el polinucleótido seleccionado. Como vehículos de la transformación pueden utilizarse los bien conocidos plásmidos, vectores fago (transfección) o vectores F. El ácido nucleico introducido dentro del microorganismo seleccionado puede expresarse y su función biológica o bien puede ser utilizada como tal, si es conocida, o bien elucidarse, en caso de que se exprese un polipéptido desconocido hasta ese momento. El microorganismo seleccionado puede ser el mismo
Bifidobacterium u otros microorganismos bien conocidos, tales como bacterias, por ejemplo E. coli, Lactobacillus, Streptococcus o levaduras, células de insecto o incluso células de animales y plantas.
Se entenderá que el polipéptido puede expresarse como tal o como un polipéptido de fusión. Los expertos están 5 bien familiarizados con las técnicas para realizar dicha ligadura y expresión del péptido de fusión correspondiente en una célula adecuada.
A la vista de la presente invención también pueden idearse nuevos vectores recombinantes para la clonación y/o expresión de una secuencia de nucleótidos según la presente invención. Los vectores comprenden los elementos necesarios para permitir la expresión y/o secreción de las secuencias de nucleótidos en una célula huésped determinada, tales como un promotor, señales de iniciación y terminación de la traducción, así como regiones adecuadas para regular de la transcripción. Por ejemplo, puede controlarse la expresión de una proteína o péptido mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Son ejemplos de promotores el promotor de CMV, la región promotora temprana de SV40, el promotor contenido en la representación larga terminal 3’ del
15 virus del sarcoma de Rous, el promotor de la herpes timidina quinasa, las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína o para sistemas de expresión procariotas, el promotor de la ß-lactamasa, el promotor tac o el promotor T7.
El vector debe ser capaz de mantenerse de forma estable en la célula huésped y puede poseer opcionalmente señales particulares que especifiquen la secreción de la proteína traducida. Estos diferentes elementos se seleccionan según la célula huésped utilizada. A éste efecto, las secuencias de nucleótidos según la presente invención pueden insertarse dentro de vectores de replicación autónoma dentro del huésped escogido, o dentro de vectores que se integran en el huésped escogido, tales como, por ejemplo, cromosomas artificiales de levadura, plásmidos o vectores virales. Se apreciará que el vector puede ser el plásmido según la secuencia dada a conocer
25 en el identificador de secuencia nº2 de la patente WO 02/074798, en una forma recombinante de la misma, suplementada con oris (orígenes de replicación) que permitan un número elevado de copias.
Para construir vectores de expresión que contengan un gen quimérico formado por las señales de control de la transcripción y traducción adecuadas y las secuencias de codificación de la proteína, pueden utilizarse cualquiera de los métodos estándar conocidos por los expertos en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN dentro de un vector. Estos método pueden incluir técnicas de síntesis y de ADN recombinante in vitro y recombinantes in vivo (recombinación genética).
El vector puede utilizarse para la transcripción y/o traducción de un ácido nucleico comprendido dentro o por la
35 secuencia dada a conocer por los identificadores de secuencia nº1 o nº2 de la patente produciendo, respectivamente, ARN o ARN antisentido. Dicho vector puede permanecer en forma episómica o integrarse en el cromosoma, siempre y cuando pueda ser transcrito produciendo el producto de transcripción deseado.
Los ácidos nucleicos antisentido de la presente invención comprenden una secuencia complementaria al menos a una parte de un producto de transcripción ARN de una secuencia de polinucleótido del identificador de secuencia nº1, con una secuencia que posee la complementariedad suficiente para poder hibridarse con el ARN, formando un dúplex estable. En el caso de las secuencias de ácidos nucleicos antisentido de doble cadena, debe por lo tanto evaluarse una cadena del ADN doble, o puede ensayarse la formación de una triple cadena.
45 La presente invención también abarca las células huésped transformadas con ácidos nucleicos según la presente invención tal como se ha descrito previamente. Estas células pueden obtenerse introduciendo dentro de una célula adecuada de una secuencia de nucleótidos tal como se ha definido anteriormente, procediendo a continuación al cultivo de dicha célula bajo condiciones que permitan la replicación y/o expresión de la secuencia de nucleótidos transfectada/transformada.
La célula huésped puede seleccionarse entre células del sistema eucariota o procariota, tales como, por ejemplo, células bacterianas, células de levadura, células animales así como células de plantas. En el contexto de la presente invención debe entenderse que una célula comprende sistemas biológicos superiores. Tales como animales, plantas completas o parte de las mismas. Además, puede seleccionarse una cepa de células huésped que module la
55 expresión de las secuencias insertadas, o que modifique y procese el producto génico de la forma específica deseada.
Las células transformadas/transfectadas pueden servir de forma ventajosa como modelo y pueden utilizarse en métodos para el estudio, identificación y/o selección de compuestos capaces de ser responsables de cualquiera de los efectos beneficiosos provocados por la presente cepa de Bifidobacterium.
La presente invención también comprende las secuencias de nucleótidos inmovilizadas de forma covalente o no covalente sobre un soporte sólido. En el primer caso dicho soporte puede servir para capturar, mediante hibridación específica, un ácido nucleico diana obtenido a partir de una muestra biológica que se quiere analizar. En caso 65 necesario, el soporte sólido es separado de la muestra y a continuación se detecta el complejo de hibridación
formado entre la sonda de captura y el ácido nucleico diana utilizando una segunda sonda, denominada sonda de detección, marcada con un elemento fácilmente detectable.
Dicho soporte puede adoptar la forma de las denominadas matrices de ADN o chips de ADN, una multitud de
5 sondas moleculares organizadas de forma precisa sobre un soporte sólido, que permitirá la secuenciación de genes, estudios de las mutaciones contenidas en los mismos y la expresión de genes, y que son actualmente de interés dado su pequeño tamaño y su elevada capacidad en términos de número de análisis.
La función de dichas matrices/chips se basa en sondas moleculares, principalmente oligonucleótidos unidos a una matriz/chip de ADN que en general tiene un tamaño de unos pocos centímetros cuadrados o más según se desee. Para realizar el análisis la matriz/chip de ADN se recubre con sondas dispuestas en una ubicación predeterminada de la matriz/chip. A continuación se pone en contacto con la matriz/chip de ADN una muestra que contiene fragmentos del ácido nucleico diana a analizar, por ejemplo ADN o ARN o ADNc marcado previamente, dando lugar a la formación, mediante hibridación, de un dúplex. Tras una etapa de lavado, el análisis de la superficie del chip
15 permite localizar las hibridaciones específicas a través de las señales emitidas por los marcadores unidos a la diana. Este análisis genera una huella de hibridación que, a través de un procesamiento informático adecuado, permite obtener información tal como la expresión de genes, la presencia en la muestra de fragmentos específicos, la determinación de secuencias y la presencia de mutaciones.
La hibridación entre las sondas de la presente invención, depositadas o sintetizadas in situ en los chips de ADN, y la muestra a analizar, puede determinarse, por ejemplo, mediante fluorescencia, radioactividad o detección electrónica.
La secuencia de nucleótidos según la presente invención pueden utilizarse en matrices/chips de ADN para llevar a cabo análisis de la expresión de los genes de Bifidobacterium. Este análisis se basa en matrices/chips de ADN en
25 las cuales están presentes sondas, escogidas por su especificidad para caracterizar un gen determinado. Las secuencias diana a analizar se marcan antes de hibridarse en el chip. Tras lavado se detectan y cuantifican los compuestos marcados, llevándose a cabo las hibridaciones como mínimo por duplicado. El análisis comparativo de las intensidades de señal obtenidas para a la misma sonda en diferentes muestras y/o para diferentes sondas en la misma muestra, determina la transcripción diferencia del ARN derivado de la muestra.
Las matrices/chips también pueden contener sondas de nucleótidos específicas para otros microorganismos, que permitirá un análisis seriado que permite la identificación rápida de la presencia de un microorganismo en una muestra.
35 El principio del chip de ADN, tal como se ha detallado anteriormente, también puede utilizarse para producir chips de proteínas en los que el soporte es recubierto con un polipéptido o un anticuerpo según la presente invención, o matrices de los mismos, en lugar del ADN. Estos chips de proteínas hacen posible analizar las interacciones biomoleculares (BIA) inducidas por la captura por afinidad de analitos diana sobre un soporte recubierto, por ejemplo, con proteínas, mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR). Los polipéptidos o anticuerpos según la presente invención, capaces de unirse específicamente a anticuerpos o polipéptidos derivados de una muestra a analizar, pueden de este modo ser utilizados en chips de proteínas para la detección y/o la identificación de proteínas en muestras.
La presente invención también se refiere a un medio informáticamente legible que tiene registrada una secuencia de
45 nucleótidos según la presente invención. Este medio también puede comprender información adicional extraída de la presente invención, tal como, por ejemplo, analogías con secuencias ya conocidas y/o información relativa a las secuencias de nucleótidos y/o polipéptidos de otros microorganismos para facilitar el análisis comparativo y la explotación de los resultados obtenidos. Los medios preferentes son, por ejemplo, medios magnéticos, ópticos, eléctricos e híbridos tales como, por ejemplo, disquetes, CD-ROMs, o casetes de grabación.
La presente invención también se refiere a kits o equipos para la detección y/o identificación de bacterias pertenecientes a la especie Bifidobacterium longum o microorganismos asociados, que comprenden, un polipéptido, en caso necesario los reactivos para formar el medio adecuado para la reacción inmunológica o específica, los reactivos que permiten la detección de los complejos antígeno-anticuerpo producidos por la reacción inmunológica
55 entre el o los polipéptidos de la presente invención y los anticuerpos que puedan estar presentes en la muestra biológica, siendo posible que estos reactivos lleven un marcador o bien que sean capaces de ser reconocidos a su vez por un reactivo marcado, y de forma más particular, en el caso de que el polipéptido según la presente invención no esté marcado, una muestra biológica de referencia (control negativo) sin anticuerpos reconocidos por el polipéptido según la presente invención, y una muestra biológica de referencia (control positivo) que contiene una cantidad predeterminada de anticuerpos reconocidos por el polipéptido según la presente invención.
El microorganismo novedoso denominado NCC2705, descrito en la presente invención a través de sus secuencias genómicas, se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en el Instituto Pasteur el 29 de Enero de 2001, y ha recibido el nº de depósito CNCM I-2618. Este microorganismo pertenece al género Bifidobacterium, especie 65 Bifidobacterium longum y es un microorganismo probiótico, es decir, puede pasar el tracto gastrointestinal en forma esencialmente viva y viable y posee la capacidad de prevenir la colonización del intestino por bacterias patógenas
que provocan diarrea y además puede prevenir o disminuir la aparición de infección de las células intestinales por rotavirus.
El microorganismo es un microorganismo Gram positivo, catalasa negativo y productor de CO2 negativo, produce
5 ácido láctico L(+) y previene esencialmente la colonización de las células intestinales por bacterias que provocan diarrea, tales como E. coli patógeno, por ejemplo E. coli enteropatógeno (EPEC), o salmonella, por ejemplo Salmonella typhimurium y previene la infección de las células intestinales por rotavirus.
El microorganismo novedoso puede ser utilizado para la preparación de diversos materiales portadores, tales como, por ejemplo, leche, yogurt, cuajada, leches fermentadas, productos fermentados a base de leche, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, fórmulas infantiles, y puede incluirse en el soporte en una cantidad entre aproximadamente 105 cfu/g a aproximadamente 1011 cfu/g. A efectos de la presente invención, la abreviatura cfu denomina una “unidad formadora de colonias” que se define como el número de células bacterianas según el recuento microbiológico en placas de agar.
15 La presente invención da a conocer también una composición alimentaria o farmacéutica que contiene, como mínimo, Bifidobacterium NCC2705 y/o un sobrenadante en el que se han desarrollado los microorganismos.
Para preparar la composición alimentaria según la presente invención se incorpora al menos una de las Bifidobacterias de la presente invención en un soporte adecuado en una cantidad entre aproximadamente 105 cfu/g y aproximadamente 1012 cfu/g, preferiblemente entre aproximadamente 106 cfu/g y aproximadamente 1010 cfu/g, más preferentemente entre aproximadamente 107 cfu/g y aproximadamente 109 cfu/g.
En el caso de preparaciones farmacéuticas, el producto puede prepararse en forma de comprimidos, suspensiones
25 bacterianas líquidas, suplementos orales en seco, suplementos orales húmedos, alimentación enteral por sonda en seco o alimentación enteral por sonda líquida con la cantidad de Bifidobacterium/Bifidobacterias a incorporar en el orden de aproximadamente 1012 cfu/g, preferiblemente entre aproximadamente 107 cfu/g y aproximadamente 1011 cfu/g, más preferentemente entre aproximadamente 107 cfu/g y aproximadamente 1010 cfu/g.
La actividad del microrganismo novedoso en el intestino del individuo es obviamente dosis dependiente. Es decir, cuanto más microrganismo novedoso o componente activo del mismo se incorpora mediante la ingestión de los alimentos o composiciones farmacéuticas anteriores mayor es la actividad protectora y/o curadora. Dado que el microorganismo novedoso no es perjudicial para el ser humano y animales y ha sido eventualmente aislado en las heces de bebés, puede incorporarse una cantidad elevada de los mismos de manera que esencialmente una parte
35 elevada del intestino del individuo quede colonizada por los microorganismos novedosos.
Además, según otra realización preferente puede utilizarse el sobrenadante de un cultivo de Bifidobacterium de la presente invención para preparar el portador. El sobrenadante puede utilizarse tal cual o puede secarse bajo condiciones que no destruyan los compuestos metabólicos secretados por los microorganismos en el medio líquido, tales como, por ejemplo, la liofilización, y pueden incluirse en el portador. Para minimizar el número de compuestos desconocidos en el sobrenadante, las Bifidobacterias se cultivarán preferentemente en medios definidos, cuya composición es conocida y no afecta de forma negativa el huésped que los incorpora. Además, los expertos en la técnica, en base a su conocimiento general, opcionalmente disminuirán la cantidad de productos no deseados del sobrenadante, por ejemplo mediante cromatografía.
45 Los inventores de la presente invención han investigado las heces de bebés y han aislado en las mismas una serie de cepas bacterianas diferentes. A continuación, se examinó la capacidad de estas cepas para prevenir la colonización y/o invasión de células epiteliales con bacterias que se sabe que producen diarrea, tales como, E. coli, Sigella, Klebsiella, Yersinia, Pseudomonas aeruginosa, Listeria, Streptococcus, Staphilococcus, Clostridium difficile,
H. pylori y también Candida albicans.
Se avaluaron las propiedades inhibidoras de la diarrea de diversos géneros bacterianos como Bifidobacterium, Lactococcus y Streptococcus. Los ensayos sobre la capacidad inhibidora se realizaron con microorganismo patógenos como E. coli, Klebsiella, Yersinia, Pseudomonas aeruginosa, H. pylori, y Salmonella typhimurium como
55 representantes de microorganismos patógenos causantes de diarrea en los individuos afectos.
Las bacterias se cultivaron en medios adecuados tales como MRS, Hugo-Jago o medio M17 a temperaturas entre aproximadamente 30ºC y 40ºC correspondientes a su temperatura óptima de crecimiento. Tras alcanzar un crecimiento estacionario, se recogieron las bacterias mediante centrifugación y se volvieron a suspender en una solución fisiológica de NaCl. Entre la realización de los diferentes ensayos las células bacterianas se almacenaron congeladas (-20ºC).
Para evaluar las propiedades anti-bacterianas se seleccionaron las estrategias siguientes.
65 Según un protocolo se examinó la capacidad de los Bifidobacterium de la presente invención en cultivo para disminuir la viabilidad de los diferentes microorganismos patógenos. Para ello, se puso en contacto un cultivo de bacterias patógenas con un sobrenadante concentrado de un cultivo de Bifidobacterium y se evaluó el potencial de crecimiento de las bacterias patógenas.
Según un segundo protocolo, se determinó la capacidad de adhesión de las Bifidobacterias de la presente invención 5 a células T84, un modelo de cultivo celular de intestino, cultivando las Bifidobacterias con células T84 y evaluando el porcentaje de adhesión.
Según otro protocolo, se determinó el potencial de las Bifidobacterias de la presente invención para prevenir la infección de células intestinales por Salmonella, utilizando la línea celular Caco-2 como modelo de intestino. Para ello, se añadió el sobrenadante de un cultivo celular de Bifidobacterias de la presente invención conjuntamente con el microorganismo patógeno a las células intestinales evaluándose, respectivamente, el porcentaje de adhesión o invasión.
De este modo, pudo demostrarse que las Bifidobacterias en cultivo y el sobrenadante eran extremadamente
15 efectivos para prevenir tanto la adhesión como la invasión en células intestinales, indicando que uno o más de los compuestos metabólicos segregados por los microorganismos es o son muy probablemente responsables de la actividad anti-diarrea.
Según otro protocolo adicional se evaluó además si NCC2705 era capaz de prevenir la invasión epitelial por rotavirus. Se llevaron a cabo dos protocolos diferentes. Según un protocolo se examinó la interacción directa de las diversas cepas bacterianas con la cepa de rotavirus, mientras que en el segundo protocolo se cribaron las bacterias para determinar aquellas cepas capaces de interaccionar con los receptores celulares de rotavirus.
El primer protocolo supone poner en contacto cada una de las suspensiones bacterianas correspondientes con
25 cepas diferentes de rotavirus e incubarlas en medios adecuados. A continuación, la mezcla virus-bacterias se aplica a una monocapa de células de células de adenoma de colon indeferenciadas HT-29 (línea celular epitelial intestinal) y se continúa la incubación. A continuación se analiza la replicación viral.
El segundo protocolo supone la incubación en primer lugar de las suspensiones bacterianas correspondientes con una monocapa de células de células de adenoma de colon indeferenciadas HT-29 y a continuación añadir los virus. Tras una incubación continuada se evalúa la replicación viral.
La replicación de rotavirus se evalúa mediante tinción inmunohistoquímica de las proteínas de rotavirus en las células infectadas. Se atribuyó a una bacteria determinada un efecto inhibidor sobre los rotavirus cuando se redujo
35 en un 90% el número de células infectadas en un cultivo celular inoculado con rotavirus más la bacteria en comparación con las células inoculadas solamente con rotavirus.
A continuación se describirá la presente invención mediante ejemplos sin que éstos limiten el alcance de la presente invención.
Medios y soluciones:
MRS (Difco)
Hugo-Jago (triptona 30g / 1 (Difco), extracto de lavadura 10 g / 1 (Difco), lactosa 5 g / 1
(Difco), KH2PO4 6 g / 1, extracto de buey 2 g / 1 (Difco), agar 2 g / 1 (Difco))
45 M17 (Difco) Agar Eugon Tomate (Jugo de tomate enlatado 400 ml, Agar Eugon BBL 45.5 g, Maltosa Difco 10 g, Hemin Sigma 5mg, Agar Difco 5 g, agua destilada 600 ml) DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium “Medio Eagle modificado de Dulbecco) CFA (según Ghosh y otros, Journal of Clinical Microbiology, 1993 31 2163-6) Agar Müller Hinton (Oxoid) LB (Luria Bertami, Maniatis, A Laboratory Handbook (“Manual de laboratorio”), Cold Spring Harbor, 1992) Acetato C14 (53,4 Ci/mMol, Amersham International PLC) PBS (NaCl 8g/l, KCl 0.2 g/l, Na2HPO4 1.15 g/l, KH2PO4 0.2 g/l)) Solución Tripsina-EDTA (Seromed)
55 FCS Suero bovino fetal (Gibco)
La cepa E. coli DAEC C 1845 se obtuvo de la Universidad de Washington, Seattle y la cepa E. coli JPN15 se obtuvo del Centro para el desarrollo de vacunas de la Universidad de Maryland, EE.UU). La cepa Salmonella typhimurium SL1344 se obtuvo del Departamento de microbiología de la Universidad de Stanford, CA, EE.UU. Esta cepa es patógena en ratones y resistente a la estreptomicina. Se adhiere a células de colon Caco-2 (Finlay y Falkow, 1990). La Klebsiella se obtuvo de aislados clínicos en stock del laboratorio de microbiología de la Facultad de farmacia Paris XI, Châtenay-Malabry, Francia. La Yersinia se obtuvo de la Unidad 411 del INSERM, Hôpital Necker, Paris, Francia. La Pseudomonas aeruginosa se obtuvo de aislados clínicos en stock del laboratorio de microbiología de la Facultad de farmacia Paris XI, Châtenay-Malabry, Francia.
65 El H. pylori se obtuvo del Instituto de microbiología, Universidad de Lausana, Lausana, Suiza.
El rotavirus humano Wa (serotipo G1) y el rotavirus de mono SA-11 (serotipo G13) se obtuvieron de P.A. Offit, Children’s Hospital of Philadelphia, EE.UU. El virus reagrupado DS-lxRRV se obtuvo de A. Kapikian, NIH Bethesda, EE.UU. El rotavirus humano Hochi serotipo 4 se obtuvo de P. Bachmann, Universidad de Munich, Alemania.
5
Ejemplo 1
Aislamiento de Bifidobacterias
Se recogieron heces frescas de pañales de 16 bebés sanos de 15 a 27 días de edad. Se colocó 1 g de heces frescas bajo condiciones anaerobias para su transporte al laboratorio y se realizaron los análisis microbiológicos dentro de las 2 primeras horas después de la toma de muestras mediante diluciones seriadas en solución Ringer y sembraron en medios selectivos. Para aislar las bifidobacterias, se utilizó Agar Eugon Tomate (Jugo de tomate enlatado 400 ml, Agar Eugon BBL 45.5 g, Maltosa Difco 10 g, Hemin Sigma 5 mg, Agar Difco 5 g, agua destilada
15 600 ml) incubado en condiciones anaeróbicas a 37ºC durante 48 horas. Se recogieron colonias al azar y fueron purificadas. Se llevó a cabo caracterización fisiológica y genética en los aislados,
Ejemplo 2
Cultivo de líneas celulares
Células Caco-2
Para los ensayos de inhibición se utilizó como modelo de enterocitos maduros de intestino delgado la línea celular
25 Caco-2. Esta línea presenta características de células intestinales tales como, por ejemplo, la polarización, la expresión de enzimas intestinales, la producción de ciertos polipéptidos estructurales etc. Las células se cultivaron en diferentes soportes, a saber, placas de plástico (25 cm2, Corning) para su crecimiento y propagación, placas de vidrio de 6 pocillos desagradados y esterilizados (22 x 22 mm, Corning) para los ensayos de adhesión e inhibición. Tras el segundo día de cultivo, se cambión el medio de cultivo (DMEM) de forma diaria. Antes de ser utilizado, el medio se suplementó con 100 U/ml de penicilina/estreptomicina, 1 µg/ml de amfoterina, 20% de FCS inactivado a 56ºC durante 30 min y un 1% de una solución que contenía aminoácidos no esenciales (10 mM) (Eurobio, Paris, Francia). El cultivo se realizó a 37ºC en una atmósfera que contenía un 90% de aire y un 10% de CO2. Las células se dividieron cada seis días. Las células se desprendieron de las paredes del pocillo mediante tratamiento con PBS con un 0,015% de tripsina y 3 mM de EDTA a pH 7,2. Para neutralizar el efecto de la tripsina se añadió a la
35 suspensión celular obtenida un volumen igual de medio de cultivo que contenía FCS, se centrifugó la mezcla (10 min a 1.000 rpm) y el pellet se disolvió de nuevo en medio de cultivo. Se contaron las células vivas (no teñidas por azul de tripano). Se transfirieron aproximadamente 3,5 x 105 células vivas a un nuevo frasco de cultivo y aproximadamente 1,4 x 105 células por pocillo y se cultivaron hasta obtener una monocapa confluyente.
Células T84
Para los ensayos de adhesión se utilizó la línea celular T84 como modelo de células de colon intestinal. Esta línea celular presenta características de células intestinales tales como, por ejemplo, la polarización, la expresión de enzimas intestinales, la producción de ciertos polipéptidos estructurales etc. Las células T84 se obtuvieron de la
45 Universidad de California, San Diego, CA. Las células se cultivaron en DMEM (50%) y Ham’s F12 (50%) suplementados con glutamina 2mM, HEPES 50 mM, un 1% de aminoácidos no esenciales y un 10% de suero fetal bovino inactivado (30 min 56ºC) (Boehringer, Mannheim, Alemania) a 37ºC en una atmósfera de 10% de CO2/90% de aire. Las células se sembraron a una concentración de 106 células por cm2. Las células se utilizaron para los ensayos de adherencia a una post-confluencia tardía, es decir, tras 10 días.
Todas las cepas excepto las Bifidobacterias se almacenaron a -80ºC en su medio de cultivo con un 15% de glicerol. Dado que el número de transferencias en medio fresco tiene influencia sobre los factores de adhesión, la cepa de Salmonella solamente se transfirió dos veces en un período de 24 horas, realizándose la primera transferencia con la cepa congelada. Todos los cultivos se realizaron en condiciones aeróbicas.
55 Bifidobacterias
La cepa bacteriana (Bifidobacterium longum CNCM I-2618 (NCC2705) se almacenó a -20ºC en medio MRS con un 15% de glicerol. La cepa se cultivó en condiciones anaeróbicas en MRS y se transfirió dos veces a medio fresco en intervalos de 24 horas antes de ser utilizada en los ensayos de inhibición. Para el ensayo se utilizó una concentración de 2 x 109 cfu/ml. Se recogió el sobrenadante mediante centrifugación durante 1 hora a 20.000 rpm y a continuación se comprobó la presencia de bacterias en el sobrenadante obtenido. Las cepas de Bifidobacterium se cultivaron en condiciones anaeróbicas en MRS durante 18 horas a 37ºC. A continuación se centrifugaron los cultivos (20 minutos a 4ºC), se recogió el sobrenadante, se liofilizó y se volvió a la solución y a continuación se concentró
65 diez veces (10x). Finalmente se ajustó el pH del sobrenadante a 4,5.
E. coli C 1845:
La primera transferencia tras descongelar se realizó en Agar CFA - Müller Hinton, que es adecuado para que se efectúe la expresión de factores de adhesión por parte de las bacterias. Antes de cada experimento, se incubaron 5 las células bacterianas a 37 ºC realizándose la transferencia a medio fresco dos veces cada una de ellas tras 24 horas.
Klebsiella:
Las bacterias se cultivaron por la noche durante 18 horas a 37ºC en caldo Luria.
10 Yersinia: Las bacterias se cultivaron por la noche durante 18 horas a 37ºC en caldo Luria.
Pseudomonas aeruginosa: 15 Las bacterias se cultivaron por la noche durante 18 horas a 37ºC en caldo Luria.
H. pylori: Las bacterias se cultivaron en placas de Agar infusión cerebro-corazón (BHI) con un 0,25% de extracto de levadura (Difco Laboratories, Detroit, MI), un 10% de suero de caballo y un 0,4% de complemento selectivo de Campylobacter
20 (suplemento Skirro, SR 69; Oxoid Ltd, Basingstoke, Inglaterra).
Ejemplo 4
Las monocapas de Caco-2 y T84, preparadas en cubres de vidrio colocado en placas de cultivo tisular Corning de
25 seis pocillos (Corning Glass Works, Corning, NY), se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se añadieron Bifidobacterias (1 ml 4x108 bacterias/ml en sobrenadante de cultivo utilizado, sobrenadante tratado o caldo MRS fresco) a 1 ml del medio de cultivo de la línea celular. Se añadió esta suspensión (2 ml) a cada pocillo de la placa de cultivo celular y se incubó la placa a 37 ºC en 10% de CO2/90% de aire. Tras 1 hora de incubación, se lavaron las monocapas cinco veces con PBS estéril, se fijaron con metanol, se tiñeron con tinción de
30 Gram, y se examinaron microscópicamente. Todos los ensayos de adherencia se realizaron por duplicado en tres pases sucesivos de células intestinales. Para cada monocapa sobre un cubre de vidrio, se evaluó el número de bacterias adherentes en 20 áreas microscópicas aleatorias. La adhesión fue evaluada por dos técnicos diferentes para eliminar sesgos.
35 Los resultados se muestran en la figura 1, en la cual es obvio que NCC2705 es capaz de adherirse a células intestinales en comparación con las líneas celulares conocidas GG (WO 97/00078), La1 (EP 0 577 903) u otra cepa Bifido (BL28/Ca1).
Ejemplo 5
40 Como candidatos de bacterias patógenas se utilizaron E. coli, Klebsiella, Yersinia, Pseudomonas aeruginosa y H. Pylori.
Sobre la base de un cultivo NCC2705 mantenido en medio MRS durante 18 horas, se produjo un cultivo de 45 crecimiento exponencial (3 horas a 37 ºC). Se retiraron 2 ml de esta solución y se centrifugaron durante 5 min a
5.500 g, +4ºC. Tras recoger el sobrenadante se lavó el pellet celular en PBS estéril. Tras centrifugación, se recogió el pellet y se añadieron 2 ml de PBS estéril. Se recontaron las bacterias y se adaptó la suspensión para obtener entre 1 y 5 x 106 bacterias/ml.
50 La valoración del efecto antimicrobiano ejercido por las Bifidobacterias de la presente invención se realizó de acuerdo con el método de Lehrer descrito en Lehrer y otros, J. Imunol. Methods 137 (1991), 167-173. Los resultados de la misma se muestran en las figuras 2 y 3.
De los resultados anteriores puede observarse que el Bifidobacterium de la presente invención puede inhibir de 55 forma efectiva el crecimiento de varias bacterias patógenas.
Ejemplo 6
Ensayo de inhibición para salmonella
60 Las Salmonellas son bacterias que invaden las células epiteliales y se multiplican en su interior. Para determinar la actividad inhibidora de las Bifidobacterias de la presente invención frente a Salmonella typhimurium se utilizaron la cepa SL1344 y el procedimiento siguiente.
Se cultivaron las células patógenas en medio LB. Tras la segunda transferencia a medio fresco se marcaron las cepas de bacterias con radioisótopos utilizando acetato-C14 a una concentración de 10 µCi/ml en medio LB. La incubación de las cepas en este medio se realizó durante 18 horas a 37 ºC.
5 A continuación se sometió la suspensión bacteriana a centrifugación (1.041 rpm, 15 min) para eliminar del sobrenadante el acetato-C14 restante. Se suspendió y lavó el pellet en PBS y se suspendieron las células a una concentración de aproximadamente 108 células / ml en manosa estéril al 1%. Es conocido que la manosa inhibe la adhesión no específica. A continuación se ajustó la solución bacteriana a una concentración de 2 x 108 células/ml.
Se preincubaron el patógeno (1 ml; 2 x 108 células) y una alícuota de sobrenadante (1 ml) de cultivo de Bifidobacterium durante 2 horas a 37ºC. A continuación se centrifugó la suspensión, se eliminó el sobrenadante resultante y se volvió a suspender el pellet en 0,5 ml de PBS. A continuación se puso en contacto esta solución de patógeno (0,5 ml) con células de intestino humano en cultivo. Se lavó el cultivo con PBS estéril dos veces y se añadieron 0,5 ml de medio de adhesión (DMEM). A continuación, las células se incubaron durante 1 hora a 37ºC
15 bajo una atmósfera de CO2 al 10%.
Tras la incubación se recontaron el número de bacterias en el medio de incubación y sobre/en las células intestinales. Para determinar la cantidad de células adheridas o que han invadido las células intestinales se seleccionaron las siguientes estrategias.
Para determinar el número de bacterias adherentes se decantó el medio y se lavaron las células una vez con medio de cultivo y una vez con PBS estéril. A continuación, se añadió 1 ml de H2O estéril por compartimento, para lisar las células y formar una solución celular que se incubó durante 1-2 horas a 37ºC, tras lo cual se realizaron diluciones seriadas. Para recontar el número de bacterias adheridas e invasivas, se centrifugó la solución celular para eliminar
25 los restos celulares y se midió la radioactividad.
Según otro protocolo se pusieron 10 alícuotas en medio TSA. A continuación se incubaron durante 18-24 horas a 37ºC.
Para determinar la cantidad de bacterias invasoras se lavaron las células Caco-2 con PBS para eliminar todas las células no adherentes. A continuación, se añadió un medio que contenía gentamicina (20 µg/ml) y se continuó la incubación durante 1 hora a 37ºC. La gentamicina es un antibiótico que no penetra las células intestinales de manera que se destruyeron los microorganismos extracelulares, mientras que las bacterias que ya habían invadido las células intestinales sobrevivieron. A continuación se incubaron las células durante una hora más a 37ºC y a
35 continuación se lavaron dos veces con PBS. Se lisaron las células mediante la adición e incubación en agua destilada durante 1-2 horas a 37º C. Tras eliminar los restos celulares se determinó la radioactividad. Según otro protocolo se realizaron diluciones seriadas, que se pusieron en medio TSA. Incubación: 18-24 horas a 37ºC.
Puede observarse que las células cultivadas y el sobrenadante del cultivo eran son extremadamente efectivas para prevenir la adhesión e invasión de las células intestinales por Salmonella.
Ejemplo 7
Infección de ratones por la cepa S. typhimurium C5
45 Se infectaron por vía oral, ratones hembra, axénicos de 7-8 semanas (C3H/He/oujco convencional, Iffa Credo, Francia), desarrollados bajo condiciones estériles con una concentración fija de S. Typhimurium (0,2 ml, 108 cfu/ratón). Algunos ratones se convirtieron en monoxénicos mediante la implantación de diversas cepas de Bifidobacterias. En algunos ratones se recontaron las Bifidobacterias de segmentos del intestino tras extraer y triturar los órganos en PBS. En otros ratones, se evaluó la protección frente a la infección manteniéndolos continuamente en un medio estéril y comparando los días de supervivencia frente al grupo control.
Los resultados se muestran en la figura 4. Como puede observarse en la misma en el grupo control casi todos los ratones murieron tras un período de aproximadamente 10 días. Por el contrario, todos los ratones con NCC2705
55 estaban vivos tras 10 días muriendo solamente un 20% debido a los efectos perjudiciales ejercidos por la Salmonella tras un período de 30 días.
Ejemplo 8
1º protocolo
Se mezclaron 30 ml de las suspensiones bacterianas correspondientes (conteniendo una media de 3x106 bacterias) con 70 !l de medio M199 suplementado con un 10% de caldo de fosfato triptosa (Flow) y un 5% de solución tripsina-EDTA (Seromed) y se añadieron 100 !l de virus en medio M199 suplementado. Se incubó la mezcla de virus65 bacterias así obtenida durante 1 hora a 4ºC y durante 1 hora a 37ºC. Por separado, se lavaron tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS; pH 7,2) células de adenoma de colon humano indiferenciado HT-29,
cultivadas en forma de monocapa confluyente en placas de microtitulación de 96 pocillos (en medio M199 suplementado con un 10% de caldo de fosfato triptosa (Flow) y un 5% de solución tripsina-EDTA (Seromed) diluido
1:4 con PBS). Se transfirió la mezcla de virus-bacterias procesada tal como se ha indicado anteriormente a las
células y se incubaron las placas de microtitulación durante 18 horas en una incubadora de CO2 (Heraeus). Se 5 determinó la replicación viral tal como se describe más adelante.
2º protocolo
Se mezclaron 30 ml de suspensión bacteriana (ver más arriba) con 70 ml de medio M199 suplementado con un 10%
10 de caldo de fosfato triptosa (Flow) y un 5% de solución tripsina-EDTA (Seromed) y se aplicaron directamente sobre células HT-29 cultivadas y pre-tratadas tal como se ha descrito en el primer protocolo en placas de microtitulación. Tras una hora de incubación a 37ºC se añadieron a las células en las placas de microtitulación 100 ml de virus en medio M199 suplementado. Se continuó la incubación durante 18 horas en una incubadora de CO2 (Heraeus). Se determinó la replicación viral tal como se describe más adelante.
15 La replicación de rotavirus se evaluó mediante tinción inmunohistoquímica de las proteínas de en las células infectadas tal como se describe más adelante.
Un día después de la infección, se eliminó el medio de cultivo de las placas de microtitulación y se fijaron los pocillos
20 con etanol absoluto durante 10 min. Se eliminó el etanol y se lavaron las placas tres veces en tampón PBS. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 µl de un suero anti-rotavirus (principalmente dirigido contra la proteína VP6), producido en conejos (obtenido de ISREC, Universidad de Lausana) y diluido 1:2000 en PBS, y se incubó durante 1 hora a 37ºC con un cubre para prevenir el secado de los pocillos. Tras ello, se eliminó el anti-suero, y se lavaron las placas tres veces con PBS. A continuación se añadieron a cada pocillo 50 µl de antisuero
25 inmunoglobulina G (IgG) anti-conejo producido en cabras y acoplado a peroxidasa (GAR-IgG-PO; Nordic) a una dilución 1:500 en PBS y se incubaron las placas durante 1 hora a 37 ºC. Se eliminó el suero y se lavaron de nuevo las placas tres veces con PBS. A continuación se añadieron a cada pocillo 100 µl de la siguiente mezcla substrato: 10 ml de Tris-clorhídrico (pH 7,8) 0,05 M, 1 ml de H2O2 (Suprapur 30%, diluida 1:600 en H2O; Merck) y 200 µl de 3-amino-9-etilcarbazol (0,1 g/10 ml de etanol almacenado en alícuotas de 200 µl a -80ºC; A-5754; Sigma). Se
30 incubaron las placas durante al menos 30 min a temperatura ambiente. Se eliminó el substrato y se cargaron los pocillos con 200 µl de H2O para parar la reacción. Se recontaron los focos de células infectadas con un microscopio invertido (Diavert; Leitz).
Únicamente unas pocas cepas bacterianas interaccionaron con los rotavirus. Tan solo 4 de las 260 células
35 bacterianas seleccionadas primariamente inhibieron la replicación de los rotavirus en al menos un protocolo. Bifidobacterium adolescentis CNCM I-2618 (NCC2705) mostró una actividad extremadamente elevada contra el rotavirus serotipo 1, rotavirus SA-11 serotipo 3 y rotavirus Hochi serotipo 4.
NCC2705 es una bacteria Gram positiva y catalasa negativa, no produce CO2 durante la fermentación y solamente
40 produce ácido láctico L (+) según los métodos descritos en el “Genera of lactic acid bacteria” (“Géneros de bacterias lácticas”), Ed. B.J.B. Wood and W.H. Holzapfel, Blackie A&P.
Estos resultados muestran las propiedades extremadamente superiores del Bifidobacterium de la presente invención.
Claims (13)
- REIVINDICACIONES1. Bifidobacterium longum cepa CNCM I-2618.5 2. Polinucleótido que posee la secuencia de nucleótidos identificada por a) La secuencia de nucleótidos de Bifidobacterium longum cepa CNCM I-2618, tal como se da a conocer en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO02/074798; b) Una secuencia de nucleótidos que muestra una identidad de al menos el 90% con la de Bifidobacterium longum cepa CNCM I-2618, tal como se da a conocer en el identificador de secuencia nº1 de la patente WO02/074798.
- 3. Utilización de un polinucleótido, según la reivindicación 2, para elucidar las interacciones entre huésped y bacteria en una muestra.
-
- 4.
- Utilización, según la reivindicación 3, en la que la interacción se basa en las propiedades anti-patógenas y/o anti15 virales de las cepas bacterianas.
- 5. Kit que comprende un polinucleótido, según la reivindicación 2.
-
- 6.
- Medio informático legible que tiene registrada la secuencia de ácidos nucleicos según la reivindicación 2. 20
- 7. Medió informático legible, según la reivindicación 6, en el que dicho medio se selecciona del grupo formado por: a) Un disquete; b) Un disco duro; c) Una memoria de acceso aleatorio (RAM)25 d) Una memoria de sólo lectura (ROM); y e) Un CD-ROM
- 8. Sistema informático para identificar fragmentos del genoma de Bifidobacterium longum que comprende los elementos siguientes:30 a) Un medio de almacenamiento de datos que comprende una secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 2; b) Medios de búsqueda para comparar una secuencia diana con la secuencia de nucleótidos del medio de almacenamiento de datos de la etapa (a) para identificar una secuencia o secuencias homólogas; y c) Medios de recuperación para obtener dicha secuencia o secuencias homólogas de la etapa (b).
- 9. Utilización del Bifidobacterium, según la reivindicación 1, o de un microorganismo que contiene una secuencia de polinucléotidos según la reivindicación 2, o un sobrenadante de los mismos para preparar un portador.
- 10. Utilización, según la reivindicación 9, en la que el Bifidobacterium está contenido en un portador en una cantidad 40 entre aproximadamente 105 cfu/g y aproximadamente 1012 cfu/g de material portador.
- 11. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, en la que el portador es para la prevención y/o tratamiento de enfermedades o molestias intestinales, preferentemente la IBD (enfermedad inflamatoria intestinal), la enfermedad de Crohn o la diarrea.45 12. Utilización, según la reivindicación 11, en la que las enfermedades o molestias intestinales es provocada por bacterias patógenas y/o rotavirus.
- 13. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que el portador es una composición alimentaria seleccionada entre leche, yogurt, cuajada, queso, leches fermentadas, productos fermentados a base de50 leche, helados, productos a base de cereales fermentados, polvos a base de leche, fórmulas infantiles, alimentos para mascotas o una composición farmacéutica seleccionada entre comprimidos, suspensiones bacterianas líquidas, suplementos orales en seco, suplementos orales húmedos, alimentación enteral por sonda en seco, o alimentación enteral por sonda húmeda.55 14. Utilización, del Bifidobacterium según la reivindicación 1, para la preparación de una composición para disminuiro prevenir la aparición de infecciones de las células intestinales por rotavirus.
- 15. Utilización, del Bifidobacterium según la reivindicación 1, para la preparación de una composición para prevenirla colonización del intestino por bacterias patógenas que provocan diarrea seleccionadas entre E. coli, E. coli 60 enteropatógena, salmonella, Salmonella typhimurium.
- 16. Utilización, del Bifidobacterium según la reivindicación 1, para la preparación de una composición para inhibir el crecimiento de rotavirus seleccionados entre rotavirus serotipo 1, rotavirus SA-11 serotipo 3 y rotavirus Hochi serotipo 4.
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