TWI487530B - 可產生高免疫激活反應之比菲德氏龍根菌分離株 - Google Patents

Description

可產生高免疫激活反應之比菲德氏龍根菌分離株

本發明為一株可產生高細胞免疫激活反應之分離株BR022，其寄存於臺灣新竹的食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 910500。針對菌種特性與利用16S rDNA部份序列進行比對及Biolog鑑定系統鑑定為比菲德氏龍根菌(Bifidobacterium longum subsp.longum)，可刺激細胞產生高的免疫激活反應。

隨著感染性疾病的控制與工業化程度的提高，過敏性疾病發生率逐年上升，已經成為世界的趨勢。近二十年來，過敏疾病發生率平均升高5~10倍，成為不容忽視的健康問題。世界過敏組織(WAO)在2005公布了30個國家12億總人口中，有22%(約2億5千萬人)患有IgE介導(IgE mediated)的過敏性疾病，包括過敏性鼻炎、哮喘、結膜炎、食物過敏、濕疹、藥物過敏及嚴重過敏反應等。過敏性疾病罹病率的迅速增高，已達流行病的程度。這些疾病的罹病率增加，與長期持續的環境因素和生活方式改變有關。工業化、都市化越高的國家，過敏性疾病的罹病率就越高，像是澳洲、英國、美國、西歐等國家，都是過敏性疾病最嚴重的地區。過敏疾病是一種免疫疾病，是人體內的免疫功能失調，出現不平衡的狀況。

人體的免疫系統中可以區分成第一型T細胞反應(Th1)與第二型T細胞反應(Th2)，由於人體內有抗原(過敏原)進入，身體就 會產生免疫保護作用，當人體再次接觸抗原時，就會誘發身體免疫系統產生反應，T細胞會釋放γ干擾素(IFN-γ)、細胞間白素2(IL-2)，使免疫反應趨向第一型T細胞反應，B細胞因此分泌更多的免疫球蛋白G(IgG)。過敏疾病的致病機轉是多因子，免疫球蛋白E抗體，嗜伊紅白血球(Eosinophil)，過敏原特異性T淋巴球和細胞間白素4、5、9、13都佔有很重要的免疫致病機轉，但要如何啟動這些致病機轉，進一步引發過敏症狀的發生，則與遺傳因素和環境因素脫不了關係。然而，有過敏體質的人，當過敏原進入體內，則會誘發身體免疫系統朝第二型T細胞免疫反應，T細胞會釋放細胞間白素4、5、9、13，讓免疫B細胞製造免疫球蛋白E(IgE)增加，黏附在肥大細胞(Mast cells)上，再遇過敏原時，過敏原會黏附在免疫球蛋白E上，共同作用後，肥大細胞會釋放發炎介質如組織胺(Histamine)、白三稀素(Leukotriene)、前列腺素(Prostaglandin)、和血小板活化因子等，這些發炎介質會進一步影響呼吸道產生發炎反應，導致過敏症狀發生。

根據學者針對內在腸道的原生菌叢研究指出，益生菌與壞菌的多寡與過敏性疾病發生率息息相關。研究學者於瑞典和愛沙尼亞2歲幼童的糞便中，發現乳酸菌數和壞菌的菌數有截然的不同表現，依據瑞典都市化、西方化的生活型態和飲食習慣的改變，使得兒童腸道中厭氧菌(clostridia)菌數愈增加，患過敏疾病的比例也愈增加；相反的，愛沙尼亞幼兒糞便中益生菌(包括乳酸 菌、比菲德氏菌以及腸球菌等)菌數較多，過敏性疾病的罹病比例偏低。另一個實驗結果發現，如果嬰兒出生後第一年腸道中大腸菌菌數愈高，日後罹患異位性皮膚炎的機率也會提高；如果綠膿桿菌(Clostridium difficile)多，日後罹患氣喘等過敏性疾病的機率也偏高。

進一步的研究又發現，幼兒生活型態中，愈不常接觸細菌、使用較多抗生素和超清潔的飲食，反而使過敏的可能性增加。根據這些調查顯示，人類所接觸的細菌種類、數量，和時機，正足以影響免疫系統發育的走向。隨著疫苗的提早普遍接種和公共衛生學的進步，外在感染的形態正逐年改變，並非我們所能控制，因此許多研究學者希望能借著調整腸胃道中乳酸菌菌數而進一步控制過敏的發生。

「乳酸菌」是指能夠代謝糖類、產生50%以上乳酸之細菌，具有這些功能的細菌包括了：乳酸桿菌(Lactobacillus)、鍵球菌(Streptococcus)、念球菌(Leuconostoc)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等，但乳酸菌為習慣用語，並不是分類學上正式用語。

科學家最早發現某些乳酸菌菌種與人類單核球或細胞株培養可以增加第一型T細胞細胞素包括珈瑪干擾素(IFN-γ)，細胞間白素-12(IL-12)，和細胞間白素-18(IL-18)的分泌，主要的機轉在增加細胞內STAT1和STAT3轉譯分子的磷酸化，增加干擾素的釋放。進一步的研究也指出乳酸菌和腸道內皮細胞上的TOLL接受 器，尤其是TOLL-2接受器的結合，能活化細胞內的轉譯蛋白NF-κ B移至核內而釋放大量細胞素，屬於先天免疫(Innate Immunity)的一環。因此某些乳酸菌菌種借由其細胞壁成份(Peptidoglycan)，經由先天免疫系統，確實能活化T細胞的發育。在動物實驗方面，早期科學家即發現，若實驗動物腸中處於無菌狀態，就不可能誘發免疫耐受性，因此證明腸胃中菌叢的改變，可以影響免疫反應。日本科學家進一步發現乳酸菌Lactobacillus casei shirota可以抑制抗原特異性IgE抗體的產生，並可以預防過敏反應和食物過敏，主要機轉是此乳酸菌細胞壁可以誘發T細胞產生大量的間白素-12。在使用卵蛋白基因轉殖鼠的動物實驗中，也證明服用乳酸菌確實能抑制與過敏相關的IgG和IgE抗體，且能產生大量的干擾素和IgA抗體，可治療食物過敏。因此從動物實驗的結果，幾乎能確定乳酸菌確實能降低第二型T細胞所造成的過敏免疫發炎反應。

最早使用乳酸菌的目的都放在病毒性或細菌性腸炎的治療，尤其是旅行者腹瀉和輪狀病毒所引起的腹瀉症狀的改善，最常用的菌種是Lactobacillus rhamnosus GG(LGG,ATCC 53103)，大部份的雙盲臨床試驗結果皆證實有部份療效。臨床醫師又進一步將乳酸菌用於治療食物過敏，尤其是對牛奶過敏所引起的症狀能有神奇的改善效果，進一步的發現更證明服用一百億菌落數的LGG乳酸菌可在血清中增加足夠的細胞間白素-10，能明顯抑制過敏症狀，尤其是異位性皮膚炎的症狀。在預防方面，芬蘭的學者證明 在懷孕媽媽若一等親中有過敏病者，在產前服用乳酸菌LGG一百億連續14天，小孩則在出生後服用6個月，則2年的追蹤顯示小孩過敏病的發生率與對照組比至少降低50%以上，統計上有顯著的意義。從以上研究報告顯示口服乳酸菌能對過敏免疫疾病產生調節治療作用。

學者也將嗜酸乳桿菌L.acidophilus引用在氣喘的治療，雙盲試驗證明不論是家塵螨或是花粉所引起的過敏症狀，都能有效降低，但不能明顯降低IgE和氣道過度收縮反應。其它學者則證明若連續服用優格(Yogurt)，每天至少200公克1年，則不只能改善過敏症狀，也能降低IgE抗體。

乳酸菌為人體使用超過300年，其作用是多方位的，除了上述免疫作用，包括促進干擾素，細胞間白素-12，和細胞間白素-18的產生，產生IgA抗體，在口服耐受性的研究中，乳酸菌也能促進免疫抑制細胞素細胞間白素-10和細胞轉形成長因子(TGF-β)的產生，因此乳酸菌也被使用於調節自體免疫反應。乳酸菌的其它作用包括能產生乳酸菌和抑菌素(bacteriocin)，可以抑制其他病原菌，改善腸道中的生態，幫助腸道優勢好菌的建立，另外乳酸菌也能黏附M細胞，促進腸細胞分泌生長素，增加腸細胞的再生生長，而其產生的丁酸(Butyric acid)更可中和食物的致癌物質。

日本科學家發現乳酸菌中比菲德氏菌能夠減輕西洋杉花粉症的症狀，在花粉季的早期連續使用比菲德氏龍根菌能夠減輕鼻 塞、流鼻水、打噴嚏、眼睛癢、流淚等症狀，同時在使用四周後血清中INF-γ、IL-10濃度下降的情形會減緩，而代表第二型T細胞反應的細胞趨化素TARC濃度也較安慰劑組低，使用八周後嗜伊紅性球的比率也下降。TARC是在發炎的後期由抗原呈現細胞(APC)、脾臟細胞、上皮細胞等細胞所分泌的趨化素(chemokines)，它會吸引嗜伊紅性球等過敏免疫細胞聚集。龍根菌能夠調節TARC的分泌，減少第二型T細胞的免疫反應。比菲德氏龍根菌改善花粉症的機轉除了減少第二型T細胞免疫反應外，科學家發現在花粉症期間，病人腸道的菌叢會產生變化，Faecalibacterium prausnitzii、Bacteroides fragilis會明顯增加，補充比菲德氏龍根菌則能幫助維持正常的菌叢。

另一項動物實驗發現龍根菌能夠誘導調節型T細胞增加，出生小鼠餵食龍根菌後血中循環的調節型T細胞數目會增加，在腸道淋巴組織中Toll like receptor訊息傳導、抗原呈現、細胞激素等基因的表現都會增加。同時，口服龍根菌能夠阻斷抗原誘導的IgE合成。也有研究指出口服龍根菌能夠阻止組織胺的訊息傳遞，它能讓血球中histamine H1 receptor(H1R)以及histidine decarboxylase(HDC)的基因表現下降，減少組織胺的合成，並緩解組織胺所引起的病理反應，進而緩解過敏性疾病的症狀。此外，還有研究也指出口服比菲德氏菌能夠提升免疫力，如增加NK細胞的活性、脾臟淋巴細胞的增生以及血中溶血素(hemolysin)的濃度等。

乳酸菌是非致病性的革蘭氏陽性桿菌，是腸道的益生菌，在腸道黏膜表面的正常菌叢中大多數是乳酸菌與比菲德氏菌，其臨床作用有：調節腸道的通透性、改變腸道微生物的狀態與增加腸道IgA的反應性。早期的研究發現乳酸菌可刺激老鼠的脾臟細胞株分泌干擾素-γ，同時在人類的研究上亦發現血液中的淋巴球細胞亦可被乳酸菌刺激而分泌干擾素-γ，而干擾素-γ可調節免疫反應產生與否。

過敏免疫反應之一產生干擾素γ是免疫細胞活化後所產生的，可以增加抗原呈獻細胞的功能，使巨噬細胞能有效的辨識並吞噬侵入的病原體，所以干擾素-γ也被稱為巨噬細胞的活化因子之一。因此乳酸菌能刺激產生干擾素-γ也代表其可調節免疫反應。

有鑑於此，關鍵的影響過敏免疫反應之一為干擾素γ，免疫細胞活化到某程度後所產生的干擾素-γ，可以增加抗原呈獻細胞的功能，使巨噬細胞能有效的辨識並吞噬侵入的病原體或過敏原，干擾素-γ產生越高細胞免疫激活反應越強。

本發明為提供一種產生高細胞免疫激活反應之分離株BR022，篩選自新生兒糞便檢體之菌種並寄存於臺灣新竹的食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 910500。

本發明將分離出來之菌株利用革蘭氏染色鏡檢觀察為革蘭氏陽性桿菌，其化學與物理特性為不具觸酶、氧化酶及運動性，不 會產生內生孢子，於厭氧環境下會生長，好氧環境下不會生長。

另外本發明利用16S rDNA部份序列進行比對及Biolog鑑定系統與標準菌株B.lonum subsp.longum BCRC 11847、B.lonum subsp.infantis BCRC 15416、B.lonum subsp.suis BCRC 14671進行比對，加以鑑定確認該分離株BR022為Bifidobacterium longum subsp.longum。利用引子RP4進行BR022與市售乳酸菌(B.longum BB536)基因組DNA之RAPD比對，結果顯示BR022 RPAD Pattern為600bp、450bp，B.longum BB536 RPAD Pattern為600bp、450bp、~340bp、300~200bp間有3條Band，此一結果證實BR022與B.longum BB536為兩株不同的Bifidobacterium longum菌屬。

另一方面，本發明利用其他乳酸菌種L.paracasei及L.acidophilus作為對照組進行免疫激活反應差異分析。將三株菌種L.paracasei、L.acidophilus、BR022與PBMC進行免疫激活反應後，利用ELISPOT assay進行干擾素-γ分析。ELISPOT assay利用呈色反應，於細胞分泌細胞激素的對應位置上顯現可辨的斑點，以ELISPOT辨識系統對斑點進行計數，1個斑點代表1個細胞，計算出分泌該細胞激素的細胞數量。且ELISPOT assay利用細胞平台進行檢測，具高靈敏度、高親和力、高特異性，能於2.0~3.0×10⁵細胞/毫升中即可檢出1顆可分泌細胞激素的細胞，且於刺激細胞時，不會影響細胞分泌細胞激素的反應。其檢測原理乃是利用96孔盤底部PVDF材質薄膜，用來吸附特殊挑選、且無毒性(不含sodium azide、內毒素endotoxin)的單株抗體。 當血液檢體經過分離後的取得之PBMC(人類週邊血球細胞)細胞被加至96孔盤上，利用抗原刺激後將微孔盤放置於是當溫度下培養16~24小時後，記憶型T細胞在受抗原刺激數小時後會開始分泌細胞激素，此時局部(在緊靠分泌細胞的周圍)分泌出的細胞激素會被PVDF薄膜上特異抗體捕獲。微孔盤中的細胞被移除並清洗後，被捕獲的細胞激素可進一步使用生物素(Biotin)標記的二次抗體來標誌，其後再以結合酵素的StreptAvidin與之作用，並加入酵素受質使其呈色，有反應作用的細胞會留下染色斑點，將檢體分析結果視為免疫激活反應強度，並將三株菌種之免疫激活反應進行排序。

本發明在於綜合鑑定結果顯示此分離株(BR022)為一比菲德氏龍根菌亞種龍根菌(Bifidobacterium longum subsp.Longum)，並可產生較強之免疫激活反應。

有關本發明的特徵與實作，茲以最佳實施例詳細說明如下：

1. BR022乳酸菌分離鑑定

本發明BR022乃由光晟生物科技公司篩選自新生兒糞便檢體之菌種，寄存編號BCRC 910500。利用革蘭氏染色鏡檢觀察為革蘭氏陽性桿菌，結果如圖1所示，不具觸酶、氧化酶及運動性，不會產生內生孢子，於厭氧環境下會生長，好氧環境下不會生長；根據2002 P.S.M.Yeung et.al.等人研究指出，利用特殊引子對：Primer PAF[5′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3′]與Primer 536R[5′GTA TTA CCG CGG CTG CTG 3′]，進行乳酸菌16S rDNA gene PCR放大，即可進行乳酸菌屬的鑑定。利用16S rDNA部份序列進行比對，加以鑑定確認該分離株BR022為比菲德氏龍根菌亞種龍根菌(Bifidobacterium longum subsp.Longum)，如表1所示，可得知BR022 16S rDNA gene片段與Bifidobacterium longum高達99%的相似度，證實BR022為Bifidobacterium longum菌屬。另利用Biolog鑑定系統，依據微生物95種不同炭原利用之生化代謝特性，比對分析來鑑別微生物，其結果顯示BR022與標準菌株Bifidobacterium longum subsp.longum BCRC11847於95種炭原代謝特性中有93項具有相同反應，證實BR022為Bifidobacterium longum菌屬。結果如表2、3所示。

2. BR022與市售乳酸菌(B.longum BB536)之差異比對分析： 2.1.基因組DNA之RAPD比對：

運用隨機引子對擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。 這種方法即為RAPD(Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性DNA)。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上，它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列堿基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引子，對所研究基因組DNA(本實驗乃指乳酸菌基因組DNA)進行PCR擴增，檢測擴增產物DNA片段的多態性，這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引子DNA序列各不相同，但對於任一特異的引子，它同基因組DNA序列有其特異的結合位點。這些特異的結合位元點在基因組某些區域內的分佈如符合PCR擴增反應的條件，即引子在模板的兩條鏈上有互補位置，且引子3’端相距在一定的長度範圍之內，就可擴增出DNA片段。因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或堿基突變就可能導致這些特定結合位元點分佈發生相應的變化，而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引子數很大，雖然對每一個引子而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的，但是利用一系列引子則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。

本發明利用引子RP4進行BR022與市售乳酸菌(B.longum BB536)基因組DNA之RAPD比對，其DNA電泳圖結果顯示如圖2所示，BR022 RPAD Pattern為600bp、450bp，B.longum BB536 RPAD Pattern為600bp、450bp、~340bp、300~200bp間有3條Band， 此一結果證實BR022與B.longum BB536為兩株不同的Bifidobacterium longum菌屬。

2.2. DNA序列比對分析：

根據2002 P.S.M.Yeung et.al.等人研究指出，利用特殊引子對：Primer PAF[5′AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG 3′]與Primer 536R[5′GTA TTA CCG CGG CTG CTG 3′]，進行乳酸菌16S rDNA gene PCR放大.即可進行乳酸菌屬的鑑定。BR022與市售乳酸菌(B.longum BB536)16S rDNA基因片段定序後利用Vector NTI 7.0軟體進行比對，結果如表4所示，兩序列差異為：a)B.longum BB536於序列起始處多出3個核甘酸(TAA)；b)BR022第496個位置是核甘酸(G)，B.longum BB536相對應是核甘酸(C)；c)BR022第510個位置是核甘酸(T)，B.longum BB536相對應是核甘酸(A)；d)BR022於序列終點處缺少1個核甘酸(A)。

3. BR022乳酸菌製備

將該菌種活化放大後，利用冷凍乾燥方式進行凍乾。凍乾菌粉末檢測菌數須大於1.0×10¹¹CFU/克。進行細胞實驗時，取1克菌粉溶於10毫升無菌水中，充分均勻混合後，以系列稀釋方式，將菌粉混合液稀釋至1.0×10⁶~1.0×10⁸CFU/毫升，置於攝氏95度水浴槽中加熱處理5分鐘後，置於攝氏4度備用。

3.人類週邊血球細胞(PBMC)製備 3.1.病人血液樣本收集

血液檢體來自台灣某診所，共計73名過敏病人。

3.2.人類周邊血球細胞分離

抽取病人血液約10毫升，將病人血液沿管壁緩慢加入含有Ficoll-Hypaque(BD Pharmacia,Cat.No.17-1400-02)的離心管中，以冷凍離心機進行梯度離心(每分鐘3000轉，10分鐘)來進行全血的血球分離，分界面處為周邊血球細胞(PBMC)，沉澱物為紅血球。將取出的PBMC置於新的15毫升離心管，並加入10毫升1×PBS至離心管中，以離心機進行離心(每分鐘1500轉，5分鐘)，除去上清液，留下血球細胞pellet。取10毫升RPMI-1640培養基(含1% Penicillin-Streptomycin及10% Calf serum)至離心管中，來回吸沖20次並避免氣泡產生，使血球細胞均勻分佈。取血球細胞懸浮液與台盼藍(trypan blue)染劑等體積混合，以血球計數盤進行細胞計數。並以RPMI-1640培養基調整血球細胞懸浮液濃度為1.0×10⁶~1.0×10⁸細胞/毫升。

四、利用ELISPOT assay(免疫酵素聯結斑點法)進行乳酸菌刺激PBMC產生干擾素γ(IFN-γ)之分析

ELISPOT assay其反應步驟如下：

1.於無菌操作台中，將已precoated mAb1-D1K plate自攝氏4度回溫至室溫後，以無菌1×PBS洗滌4次(200微升/well)；

2.加入200微升/well之培養基RPMI-1640(含10% FBS)於室溫下進行blacking 30分鐘；

3.去除培養基，以100微升1×PBS洗滌一次，於吸水紙上輕拍；

4.加入PBMC(細胞濃度調整為1.0×10⁶~1.0×10⁸細胞/毫升)及BR022菌液(1.0×10⁶~1.0×10⁸CFU/毫升)，最後體積約計150微升/well，此時正對照組為mAb CD3-2同時加入，試驗濃度為100ng/毫升；

5.將plate置於攝氏37度5%二氧化碳(CO₂)培養箱中反應12~48小時。

6.去除細胞懸浮液，加入200微升/well 1×PBS洗滌五次；

7.稀釋偵測抗體7-b6-1-biotin至濃度1微克/毫升於1×PBS-0.5%FBS(1×PBS含0.5%胎牛血清)，加入100微升/well稀釋之抗體，於室溫下反應2小時；

8.去除上清液，加入200微升/well 1×PBS洗滌五次；稀釋Streptavidin-ALP(1：1000)於1×PBS-0.5%FBS(1×PBS含0.5%胎牛血清)，加入100微升/well於室溫下反應1小時；

9.去除上清液，加入200微升/well 1×PBS洗滌五次；將呈色劑BCIT/NBT以0.45微米(μm)濾膜進行過濾並加入100微升/well，至於室溫下直到斑點呈現為止；

10.完全顯色後，將上清液加入相應的盤中，以蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜乾燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜乾燥後，利用顯微鏡或判讀系統即可讀取斑點數。將plate置於室溫下避光保存。

4.依據三株乳酸菌免疫激活反應強度進行差異分析

將三株菌種(L.paracasei,L.acidophilus & BR022)與PBMC進行免疫激活反應後，利用ELISPOT assay進行干擾素-γ分析，將檢體分析結果視為免疫激活反應強度，並將三株菌種之免疫激活反應進行排序，依據73位病人檢體進行分析，共有15位以L.paracasei之免疫激活反應最強，28位以L.acidophilus之免疫激活反應最強，30位以BR022之免疫激活反應最強。

再依據反應最強之菌株斑點數，將斑點數結果分類，並視為對該菌株之免疫激活反應強度，分為：1~300為對該菌株免疫激活反應「弱」；斑點數300~500為對該菌株免疫激活反應「中」；斑點數>500為對該菌株免疫激活反應「強」。並以L.paracasei免疫激活反應作為正對照組進行Dunnet’s Test檢定，以進行免疫激活反應差異性分析。

由ELISPOT assay分析免疫激活反應中觀察，結果如表5與圖3所示。於15位病人檢體中，對L.paracasei(LP)之免疫激 活反應較強，但以免疫激活反應觀察多屬於反應強度「弱」(53.3%)；28位以L.acidophilus(LA)之免疫激活反應，依據免疫激活反應多屬於反應強度「中」(50.0%)；30位以BR022之免疫激活反應，其免疫激活反應多屬於反應強度「強」(60.0%)，顯示雖然不同檢體對於不同菌株與細胞進行免疫激活反應時具有差異，但仍以BR022之激活反應較高，且與L.paracasei菌株之反應比較，具統計上顯著差異(P=0.003)，圖中黑色區塊代表斑點數大於500，白色區塊代表斑點數於300到500之間，顯示該分離株BR022可刺激細胞產生較強的免疫激活反應。

雖然已說明且描述了本發明之實施例，但是熟悉此項技術者可作各種修改及改良。並不意欲將本發明限制於如所說明之特殊形式，且所有不背離本發明之精神及範圍的修改都屬於如隨附之申請專利範圍中所界定之範圍內。

綜觀上述，本發明以其整體之組合與特徵而言，既未曾見諸於同類產品中，申請前亦未公開，誠已符合專利法之法定要件，依法提出發明專利之申請。

圖1 BR022革蘭氏染色鏡檢觀察結果；圖2 BR022與B.longum BB536基因組DNA之RAPD比對電泳圖，A為B.longum BB536基因組DNA之RAPD，B為DNA marker，C為BR022基因組DNA之RAPD；以及圖3 ELISPOT assay分析免疫激活反應差異性分析。

<110> 光晟生物科技股份有限公司

<120> 可產生高免疫激活反應之比菲德氏龍根菌分離株

<130> PK13522

<140> 100108250

<141> 2011-03-11

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 507

<212> DNA

<213> Bifidobacterium longum

<400> 1

Claims (19)

1. 一種經分離之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其係寄存於臺灣新竹的食品工業發展研究所，寄存編號BCRC910500，該比菲德氏龍根菌分離株BR022係具有如SEQ ID NO：1所示之16S rDNA序列。
2. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株為可產生高細胞免疫激活反應之分離株。
3. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株係經鑑定為比菲德氏龍根菌亞種龍根菌。
4. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株係篩選自嬰兒糞便檢體。
5. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株係經革蘭氏染色鏡檢觀察結果為革蘭氏陽性桿菌。
6. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株係不具觸酶。
7. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株係不具氧化酶。
8. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株係不具運動性。
9. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株係於厭氧環境下生長，好氧環境下不會生 長。
10. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株系不產生內生孢子。
11. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株其具有龍根菌的所有被鑑知之特性。
12. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該分離株可產生較其他乳酸菌種高的細胞免疫激活反應，該其他乳酸菌種係為副乾酪乳桿菌及嗜酸乳桿菌所組成之群組。
13. 如申請專利範圍第12項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該細胞免疫激活反應係為利用ELISPOT assay進行干擾素-γ分析。
14. 如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其係具有刺激人類週邊血液單核球細胞產生干擾素-γ的能力。
15. 如申請專利範圍第14項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其刺激人類週邊血液單核球細胞可產生較其他乳酸菌種高的干擾素-γ。
16. 如申請專利範圍第15項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022，其中該其他乳酸菌種係為副乾酪乳桿菌及嗜酸乳桿菌所組成之群組。
17. 一種可刺激免疫激活之組合物，包括： 一有效量之如申請專利範圍第1項所述之微生物比菲德氏龍根菌分離株BR022。
18. 如申請專利範圍第17項所述之組合物，其中該微生物株之形式為菌粉。
19. 如申請專利範圍第18項所述之組合物，其中該菌粉為冷凍乾燥而得。