ES2881959T3 - L salivarius SGL03: actividades probióticas y producción de proteínas antimicrobianas - Google Patents

Abstract

Uso de la cepa L salivarius SGL03 DSM 25381 como un agente antimicrobiano.

Description

d es c r ip c ió n

L salivarius SGL03: actividades probióticas y producción de proteínas antimicrobianas

Campo de la invención

La presente invención se refiere al uso de una cepa de L salivarius SGL03 como agente antimicrobiano.

La invención se refiere además a una composición que comprende L salivarius SGL03 y una o más proteínas antimicrobianas, y al uso de dicha composición para la preparación de un producto nutracéutico o dermo-cosmético.

Estado de la técnica

Los probióticos son microorganismos vivos que pueden aportar propiedades beneficiosas al organismo, si se incluyen en cantidades adecuadas en la dieta. Para que un organismo sea considerado “probiótico” deben existir estudios científicos que aseguren por un lado su uso seguro en humanos y, por otro, la presencia de propiedades como la resistencia a la agresión de los jugos gástricos, pancreáticos y biliares, y la capacidad de adherirse firmemente a la mucosa intestinal colonizándola.

Las bacterias del ácido láctico (LAB), representadas en su mayor parte por lactobacilos y bifidobacterias, son los tipos más comunes de microorganismos probióticos. Dichos microorganismos pueden realizar su efecto a nivel del organismo huésped, directa o indirectamente, modulando el ecosistema endógeno o la respuesta inmune. Algunos probióticos, en cambio, pueden actuar fortaleciendo directamente la barrera intestinal, previniendo la permeabilidad y la consiguiente pérdida de macromoléculas, que se observan en infecciones intestinales e intolerancias alimentarias, o ejerciendo una acción trófica sobre la mucosa del colon, o bien protegiendo el moco que recubre la pared intestinal. Otras especies intervienen indirectamente en la barrera intestinal, estimulando el sistema inmunológico intestinal, o tejido linfoide asociado al intestino (GALT), que constituye una barrera de defensa inmunológica para el cuerpo. Específicamente, los probióticos son adyuvantes de la flora bacteriana endógena, asegurando el desarrollo de células productoras de IgA y linfocitos del epitelio intestinal, además de modular la producción de IgE e interleucinas. La investigación básica también mostró que los probióticos pueden actuar inhibiendo la síntesis de algunos mediadores inflamatorios.

Está ampliamente documentada la fuerte acción antagónica que ejercen algunas cepas contra los microorganismos patógenos, haciéndolas potencialmente eficaces en la prevención y el tratamiento de determinadas patologías.

El efecto antimicrobiano está relacionado principalmente con la disminución del pH debido a la producción de ácido láctico, mientras que otros mecanismos inhibidores comprenden la producción de peróxido de hidrógeno, la competencia de nutrientes y la producción de metabolitos inhibidores, factores que, solos o combinados, dan como resultado un bloqueo del crecimiento de patógenos.

En las últimas décadas, un importante objeto de estudio ha sido la acción antimicrobiana mediada por la producción de “bacteriocinas”, péptidos biológicamente activos, sintetizados a nivel ribosómico, capaces de desarrollar enlaces a sitios de anclaje específicos ubicados en las membranas celulares.

La familia de las bacteriocinas comprende una amplia gama de proteínas que difieren en términos de tamaño, estructura química, células diana, modo de acción y mecanismos inmunitarios inducidos. Se cree que son producidos por el 99% de las especies bacterianas presentes en la naturaleza.

Las bacteriocinas producidas por bacterias Gram-negativas son en general proteínas de alto peso molecular que exhiben un dominio característico, específico para la adhesión, translocación o actividad destructora de la bacteriocina. Las bacteriocinas producidas por bacterias Gram-positivas son en general péptidos catiónicos pequeños y termoestables, inicialmente sintetizados como prepéptidos y que, tras fenómenos de escisión, se transforman en moléculas biológicamente activas.

Sus espectros inhibidores pueden estar limitados a ciertas cepas pertenecientes a la misma especie del organismo productor (espectro estrecho), o pueden tener un amplio espectro de acción contra varias especies de bacterias (amplio espectro) (Gillor et al., 2005). En cuanto al mecanismo de acción de estas proteínas, algunas de ellas actúan formando poros en la membrana citoplasmática, otras interfieren en la síntesis proteica o tienen actividad de nucleasa. Estas sustancias con fuerte actividad antimicrobiana han ganado un interés creciente por su uso potencial tanto en el campo clínico, como terapéutico, como en el campo tecnológico/alimentario como conservantes naturales en alimentos.

Las bacteriocinas son, de hecho, resistentes a fuertes tensiones térmicas y son activas en un amplio intervalo de pH. A continuación, una peculiaridad importante está representada por las dificultades de las bacterias para desarrollar resistencia a ellas; un fenómeno ligado a su rápido mecanismo de acción. Además, al ser en general sensibles a las proteasas, se degradan fácilmente; esto significa que no duran mucho en el medio ambiente y, por tanto, el desarrollo de resistencias por parte de las bacterias es menos favorable. Finalmente, las bacteriocinas son altamente específicas contra patógenos clínicos, incluidas las cepas resistentes a múltiples fármacos (MDR, Cotter PD etal., 2013).

Las bacteriocinas pueden usarse como suplementos o agregarse a los probióticos para el tratamiento de la disbiosis y la restauración de la homeostasis en varios distritos del cuerpo.

Los efectos probióticos de una especie microbiana son característicos de la especie, pero también pueden variar dentro de la misma especie.

“Lac Vis Nature” (http://it.wikifarmaco.org/Lac_Vis_Nature) describe una composición que comprende Lactobacillus Acidophilus SD5212, Lactococcus Lactis ATCC 11454, Lactobacillus Salivarius SGL 03, Bacillus coagulans 5260, Lactobacillus CaseiSD5213, Bifidumbacterium Bifidum 29521, Lactobacillus Bulgaricus SD5589 y otros componentes.

“Bio Flora Capsules” (http://www.biodelta.it/en/bio-flora-capsules/) describe un complemento alimenticio que comprende vitaminas, minerales y fermentos lácticos tyndallizados y FOS. En los ingredientes del suplemento, se enumeran muchos lactobacilos diferentes, como Lactobacillus plantarum SGL 07, Lactobacillus casei SGL 15, Lactobacillus rhamnosus SGL 06, Lactobacillus acidophilus SGL 11, Lactobacillus lactis SGLc01, Lactobacillus salivarius SGL 03, Lactobacillus Delbrueckii spp bulgaricus DSM 20081.

US 2005/084482 describe el uso de una cepa de L salivarius para la profilaxis o el tratamiento de la actividad inflamatoria gastrointestinal. Esta actividad inflamatoria puede deberse a una enfermedad inflamatoria intestinal, síndrome del intestino irritable o cáncer.

Svetoch E.A. et al. (“ Isolation of Lactobacillus salivarius 1077 (NRRL B-50053) and characterization of its Bacteriocin, including the antimicrobial activity spectrum” (Appl Environ Microbiol 2011 Abr;77(8):2749-54) se refiere a una actividad in vitro anti- Campylobacterde una cepa de L salivarius aislada y afirma que el L salivarius aislado se utilizó para la producción y el enriquecimiento de bacteriocina. El polipéptido se purificó a partir del aislado de L salivarius y se caracterizó como bacteriocina L-1077.

O’Shea EF et al. (“Bactofencin A, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity” mBio 2013 Oct 29;4(6):e00498-13) se refiere a la bactofencina A, producida por Lactobacillus salivarius DPC6502 aislado de intestino de cerdo, que es activo contra especies patógenas que incluyen Staphylococcus aureus y Listeria monacytogenes.

Muchos experimentos in vitro han demostrado que cepas estrechamente relacionadas pueden tener propiedades de adhesión, agregación, exclusión competitiva y actividad inhibidora significativamente diferentes frente a patógenos. La caracterización fenotípica y genotípica es, por tanto, un requisito clave para obtener un producto a base de probióticos que pueda utilizarse adecuadamente con fines sanitarios.

Por tanto, el objeto de la presente invención es proporcionar una cepa bacteriana específica para la producción de proteínas antimicrobianas con actividad inhibidora contra microorganismos nocivos.

Resumen de la invención

El objetivo del presente trabajo es la identificación y caracterización de algunas proteínas antimicrobianas producidas por la cepa L salivarius SGL 03 DSM 25381 y sus usos terapéuticos.

Por tanto, la invención se refiere al uso de la cepa L salivarius SGL03 DSM 25381 para la producción de proteínas antimicrobianas.

En una realización adicional, la invención se refiere a una composición probiótica que comprende L salivarius SGL03 DSM 25381, que tiene o está suplementada con una o más proteínas antimicrobianas seleccionadas del grupo que consiste en del grupo que consiste en proteína ribosómica L2750S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L3050S y, opcionalmente, peróxido de magnesio.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de una composición que comprende una cepa de L salivarius SGL03 DSM 25381 y una o más proteínas antimicrobianas seleccionadas del grupo que consiste en proteína ribosómica L27 50S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L30 50S para la preparación de un producto nutracéutico.

Aún en otro aspecto, la invención se refiere al uso de una composición que comprende una cepa de L salivarius SGL03 DSM 25381, y una o más proteínas antimicrobianas seleccionadas del grupo que consiste en proteína ribosómica L27 50S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L30 50S para la preparación de un producto dermo-cosmético.

Descripción de las figuras

La invención se describirá ahora en detalle y con referencia a las figuras adjuntas donde:

La Figura 1 muestra la fotografía de un gel de agarosa, donde se muestra una amplificación específica de la especie con un cebador: B1 y B2 (blancos, muestras libres de ADN para verificar la ausencia de contaminación en la mezcla de PCR), C+ y C- (control positivo y control negativo respecto al ADN amplificado), S (muestra amplificada correspondiente a la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) por aparición de la banda de 411 pb como confirmación de la especie), M (marcador de peso molecular);

La Figura 2 representa el gráfico de los resultados de la evaluación de la resistencia a concentraciones salinas elevadas;

La Figura 3 representa el gráfico de los resultados de la evaluación de la resistencia a ambientes ácidos;

La Figura 4 representa la curva de crecimiento de S. pyogenes en presencia de varias concentraciones (1x107CFU/ml, 1x108CFU/ml, 1x109CFU/ml) de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381), para determinar la concentración mínima inhibitoria (MIC);

La Figura 5 representa la curva de crecimiento de S. uberis en presencia de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) a la concentración de 1x107CFU/ml (MIC);

La Figura 6a muestra la curva de crecimiento de S. mutans en presencia de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) a la concentración de 1x107CFU/ml (MIC);

La Figura 6b muestra la curva de crecimiento de S. mutans, obtenida analizando concentraciones más altas de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) para evaluar si la inhibición del crecimiento era dependiente de la dosis. Las concentraciones probadas fueron: 2x107CFU/ml, 3x107CFU/ml, 10x107CFU/ml;

La Figura 7 representa la curva de crecimiento de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) durante la fermentación por lotes;

La Figura 8 representa la imagen del gel Tricina SDS-PAGE del secretoma de L. salivarius SGL03 (DSM 25381); La Figura 9 representa la imagen del gel Tricina SDS-PAGE de rpmA, rpmD, rpsT y LSL_0885 expresado en E. coli BL21 (DE) y purificado;

La Figura 10 muestra la imagen de una placa que muestra la inhibición del crecimiento de S. pyogenes debido a la presencia de 15 pl de 1 pg/pl rpmA (A), 15 pl de 1 pg/pl rpmD (B), presencia simultánea (actividad sinérgica) de 15 pl de 1 pg/pl rpmA y rpmD (C);

La Figura 11 representa los efectos inhibidores sobre el crecimiento de S. pyogenes ATCC 19615, debido a la presencia de rpmA (11a, 11b) y rpmD (11c, 11 d), ambos a la concentración de 133 AU/ml. En concreto, se muestran las medidas de la densidad óptica a 600 nm y los conteos de células viables (CFU/ml): curva de control (A), crecimiento en presencia de rpmA o rpmD (•).

Descripción detallada de la invención

Por tanto, la invención se refiere al uso de la cepa de L salivarius SGL03 (DSM 25381) como agente antimicrobiano. En la presente invención, cuando se usa la definición:

- "bacteriocinas" pretende incluir una amplia gama de proteínas que difieren en términos de tamaño y estructura química. Estos péptidos biológicamente activos se sintetizan a nivel ribosómico de varias especies microbianas y tienen una acción antimicrobiana. Sorprendentemente, dichas bacteriocinas tienen una acción inhibidora frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas.

Específicamente, se encontró que dichas bacteriocinas tienen una acción inhibidora frente a bacterias de las especies Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium, y Streptococcus uberis.

En una realización preferida, dichas bacteriocinas se seleccionan del grupo que consiste en proteína de unión a peptidoglicano, proteína ribosómica L1 50S, proteína ribosómica S5 30S, proteína ribosómica S8 30S, proteína ribosómica L11 50S, Proteína ribosómica L14 50S, proteína ribosómica L27 50S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L3050S.

En una realización aún más preferida, dichas bacteriocinas se seleccionan del grupo que consiste en proteína ribosómica L2750S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L3050S. En otro aspecto, la invención se refiere a una composición probiótica que comprende la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381), que tiene o está suplementada con una o más bacteriocinas seleccionadas del grupo que consiste en proteína ribosómica L2750S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L3050S. En una realización preferida, la composición probiótica comprende:

La cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381), y una o más bacteriocinas seleccionadas del grupo que consiste en proteína ribosómica L2750S, proteína UH de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L3050S, donde dichas una o más proteínas antimicrobianas están en una cantidad en un intervalo de 10 a 200 pg, 50 a 150 pg o preferiblemente de 50 a 100 pg de proteína purificada.

En una realización preferida, la composición probiótica comprende:

La cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381); una o más bacteriocinas seleccionadas del grupo que consiste en proteína ribosómica L27 50S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S20 30S y proteína ribosómica L30 50S; y peróxido de magnesio.

La invención puede realizarse en forma de un producto alimenticio que comprende la composición según la invención y otros ingredientes adecuados para uso alimentario. Dichos productos alimenticios pueden incluir la composición probiótica y una base alimenticia. La composición o componente probiótico puede estar en forma líquida o sólida, seca o liofilizada, dependiendo de las necesidades, tiempo y temperaturas de almacenamiento, conservación y transporte. Ventajosamente, la invención se refiere a un producto alimenticio en forma de complemento dietético.

En comparación con otros alimentos, los FSMP tienen la capacidad de cubrir total o parcialmente las necesidades nutricionales particulares impuestas por una enfermedad, trastorno o condición patológica, así como las consecuencias de la desnutrición.

Los complementos dietéticos o alimenticios se definen como productos específicos destinados a favorecer la ingesta de determinados principios nutricionales que no están presentes en los alimentos de una dieta incorrecta.

Los suplementos se recomiendan en los casos en que el organismo carece de determinados principios alimentarios: no tienen propiedades curativas, pero complementan una dieta normal completándola.

Los efectos probióticos están estrechamente relacionados con la especie microbiana y también puede haber diferencias dentro de la misma especie.

Muchos experimentos in vitro han demostrado que cepas estrechamente relacionadas pueden tener propiedades de adhesión, agregación, exclusión competitiva y actividad inhibidora significativamente diferentes frente a patógenos. La caracterización fenotípica y molecular es, por tanto, un requisito clave para obtener un producto a base de probióticos que pueda utilizarse adecuadamente con fines sanitarios.

La caracterización molecular y fenotípica demostró que la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) posee las características esenciales y propiedades beneficiosas de una cepa probiótica adecuada que promueve su uso en formulaciones terapéuticas.

La invención puede prepararse en la forma de un producto nutracéutico que comprende la composición según la invención y otros ingredientes adecuados para tal uso.

Cuando se usa como nutracéutico, la composición o componente probiótico puede estar en forma líquida o sólida, seca o liofilizada.

En otro aspecto, a continuación, la invención se refiere al uso de una composición que comprende L salivarius SGL03 (DSM 25381 y una o más proteínas antimicrobianas seleccionadas del grupo que consiste en proteína ribosómica L27 50S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L30 50S para la preparación de un producto nutracéutico.

En un aspecto adicional, dicho nutracéutico está en forma de cápsulas, comprimidos, bolsitas o gomas de mascar. Aún en otro aspecto, la invención se refiere al uso de una composición que comprende una cepa de L salivarius SGL03 (DSM 25381), y una o más proteínas antimicrobianas seleccionadas del grupo que consiste en proteína ribosómica L27 50S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S20 30S y proteína ribosómica L30 50S para la preparación de un producto dermo-cosmético.

En otro aspecto preferido, dicho dermo-cosmético está en forma de parche, emplasto, crema, polvo o talco, aceite o aceite seco.

Los siguientes son Ejemplos de realizaciones de la presente invención que se proporcionan con fines ilustrativos. e je m p lo s

e je m p lo i : a is l a m ie n t o de c epa

La cepa se aisló de las heces de bebés sanos.

Inicialmente, se preparó una suspensión de heces frescas homogeneizadas en medio complejo al 50% de caldo de Man Rogosa y Sharpe (MRS) (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido), agregado con L-cisteína al 0,05% como agente reductor. Después de incubar las muestras a 37°C durante 30 minutos, se realizó el aislamiento en medio selectivo de agar LAMVAB (LV) para lactobacilos resistentes a vancomicina. Para obtener 1 litro de medio LAMVAB se preparó la solución A disolviendo los siguientes componentes en 500 ml de agua destilada:

Caldo MRS 52,2 g/l

L-Cisteina 0,25 g/l

Bromocresol verde (0,25% en etanol) 3 ml/l

La solución A se llevó a pH 5 usando HCl 4 N y se esterilizó en autoclave a 110°C durante 30 minutos. Posteriormente, se preparó la solución B resuspendiendo 18 g de agar en 500 ml de agua destilada, esterilizada a 110°C durante 30 minutos. Después de enfriarse a 55°C, se fusionaron las soluciones A y B. Al medio agarizado se le añadió 20 mg de vancomicina antes de verterlo en una placa.

r e s u lta d o s

La cepa se aisló de heces de lactantes sanos en LAMVAB (LV) en anaerobiosis, a 37°C durante 48 horas. Las colonias de L salivarius SGL03 (DSM 25381) resultaron ser de tamaño mediano y de color verde en LV, mientras que eran de color blanco crema en MRS. Desde un punto de vista morfológico, bajo un microscopio, tales microorganismos aparecen en forma de varillas regulares de longitud media.

^{e je m p lo} 2: CARACTERIZACIÓN MOLECULAR

La cepa aislada se identificó inicialmente mediante crecimiento en medio selectivo LAMVAB, como se describió anteriormente, y observación directa de la morfología de las colonias cultivadas en placa y morfología celular después de la observación al microscopio óptico.

Cierta atribución del género y la especie se realizó mediante técnicas de análisis de ADN ribosómico 16S y caracterización bioquímica.

Análisis de la Secuencia 16S

El genoma del microorganismo se extrajo utilizando un kit comercial (Macherey Nagel) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para la reacción de amplificación del gen 16S, el ADN se utilizó en una concentración de 50-100 ng. Las reacciones de amplificación se llevaron a cabo utilizando un termociclador profesional Biometra T (Biometra, Gottingen, Alemania). Las condiciones de amplificación utilizadas fueron las que dieron los mejores rendimientos del producto de amplificación. Todas las reacciones se llevaron a cabo utilizando un volumen final de 25 |ul.

Los componentes utilizados en todas las reacciones de amplificación son:

• DyNAzyme (Finnzymes, Espoo, Finlandia) como ADN polimerasa termoestable (1 U por reacción) y su tampón de reacción 10, tampón DyNAzyme optimizado (100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl² , 0,1% Triton X-100, pH 8,8 a 25°C);

• Mezcla de nucleótidos trifosfato (8 mM, Euroclone, Siziano, Italia).

• conjunto de cebadores (100 |uM, Eurofins MWG Operon, Ebersberg, Alemania);

• ADN genómico

• agua estéril.

A continuación se muestran los cebadores utilizados, el termociclo y el amplicón esperado.

Cebador: 16S-27 Para 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' SEQ ID NO.1 16-1552 Rev 5'-AAGGAGGTGWTCARCCGCA-3' SEQ ID NO.2

Termociclo: 95°C 5'

72°C 5’

15° C «

Amplicón: 1552 bp

Se secuenció el fragmento de aproximadamente 1550 pb (MWG Biotech, Ebersberg, Alemania) y se alineó con la base de datos Blast (NCBI, nucleótido blast) para obtener la identificación correcta de la especie.

PCR de especies específicas

El mismo ADN se utilizó como plantilla para un conjunto de cebadores específicos de especie para la cepa _Z_. salivarius SGL03 (DSM 25381). Si el ADN amplificado pertenece a la especie en cuestión, estos cebadores producen un fragmento de aproximadamente 411 pb.

Los cebadores, el termociclo y el amplicón se describen a continuación.

Cebador: L Sal1 5'-AAT CGC TAA ACT CAT AAC CT-3' SEQ ID NO.3

L Sal25'-CAC TCT CTT TGG CTA ATC TT - 3' SEQ ID NO.4

Termociclo: 95°C 5'

72°C 5’

15° C «

Amplicón: 411 bp

La visualización de los productos de amplificación se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa (1-2%). Este análisis se llevó a cabo cargando en el gel un volumen de 10-15 pl de la mezcla de reacción en paralelo con el marcador de peso molecular (MassRuler™ Low Range DNA Ladder, Fermentas).

Perfil de Cepa en MALDI-TOF MS

Para obtener un perfil de identificación Maldi-Tof, la muestra se preparó de la siguiente manera: se recogió un cultivo bacteriano de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) durante la noche para tener una cantidad suficiente de células para ser detectadas (5 mil millones). El sedimento celular se lavó con solución fisiológica para eliminar los residuos del medio fermentado y se resuspendió en 300 pl de agua destilada y 900 pl de etanol puro. La suspensión se homogeneizó bien. A continuación, la muestra se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 minutos y se dejó secar al aire después de eliminar el sobrenadante. La muestra se almacenó a -20°C mientras se esperaba el análisis.

En el momento del análisis, la muestra se resuspendió con 50 pl de ácido fórmico al 70%. Después de la resuspensión, se añadieron 50 pl adicionales de acetonitrilo y se agitó todo vigorosamente. A continuación, la muestra se centrifugó a 13.000 rpm durante 2 min. Se colocó 1 pl del sobrenadante en el centro de una mancha en una placa MALDI desechable y se secó al aire. La adición de 1 pl de una matriz de materiales orgánicos (ácido a-ciano-4-hidroxicinámico) determinó el inicio del análisis Maldi Tof.

Maldi Tof MS se realizó con un sistema MicroFlex LT utilizando las condiciones establecidas en el manual del usuario. Los iones generados por el láser de nitrógeno a la longitud de onda de 337 nm se capturaron linealmente en un intervalo de masa de 2 a 20 KDa. El instrumento se conectó al software Biotyper 2.0 (Bruker Daltonics) que es capaz de capturar los datos entrantes, procesarlos en espectros de masas y compararlos con los espectros de referencia almacenados en una base de datos interna (3.740 espectros de 319 géneros y 1.946 especies diferentes). Para cada placa MALDI que contiene 24 muestras, se incluyó una prueba estándar para calibrar y validar el análisis.

El grado de correspondencia con el espectro típico de cada microorganismo en la base de datos determina la atribución de un valor de puntuación que expresa el grado de certeza de la identificación propuesta para la especie en consideración. Las puntuaciones superiores a 2.000 se consideran fiables en la identificación a nivel de especie, mientras que los valores que oscilan entre 1.700 y 1.900 son atribuibles a una determinada identificación específica de género.

La cepa se analizó por triplicado utilizando 3 cultivos bacterianos diferentes.

Tinción de Gram

La tinción de Gram es un tipo de tinción diferencial que permite clasificar las bacterias en Gram-positivas y Gramnegativas.

Esta prueba de identificación, que se realizó con el Gram Color Kit (Liofilchem), se divide en 4 etapas, espaciados por lavados con agua destilada, cada uno de los cuales implica el tratamiento con un reactivo particular que se deja actuar durante aproximadamente 1 minuto sobre el superficie de un portaobjetos sobre el que se ha depositado una colonia microbiana de un suelo sólido, diluida con una gota de agua esterilizada. A continuación, la suspensión así obtenida se fijó térmicamente con un mechero Bunsen.

Los reactivos utilizados, por orden de aplicación, son:

• cristal violeta,

• solución de Lugol,

• solución decolorante (alcohol etílico),

• safranina.

Al final, las bacterias grampositivas aparecen de color púrpura, mientras que las bacterias gramnegativas son rojas o rosadas.

Ensayo de Catalasa

Este ensayo se utiliza para verificar la presencia de la enzima catalasa en un cultivo bacteriano capaz de desintoxicar el peróxido de hidrógeno. (Brock et al. 1995).

Se disolvió un bucle de células de un cultivo sólido en una gota de peróxido de hidrógeno al 3%. La aparición inmediata de efervescencia es indicativa de la presencia de catalasa.

La efervescencia se debe al oxígeno que se desarrolla en la reacción:

2 H²O² —— 2 H²O O²

Ensayo de Oxidasa

El ensayo de oxidasa es una prueba enzimática que se utiliza para detectar la presencia de la enzima citocromo oxidasa en bacterias. Es positivo para bacterias aeróbicas y anaerobias facultativas. Discos de prueba de oxidasa (Liofilchem), p. ej. se utilizaron discos de papel de 3 mm de diámetro impregnados con clorhidrato de tetrametil-pfenilendiamina (reactivo de Kovacs). El disco se humedeció con 2 gotas de agua destilada y se frotó con un asa de una colonia pura.

El desarrollo de un color azul en 30 segundos demuestra la oxidación del sustrato contenido en el disco. En este caso, el microorganismo es oxidasa positivo, por el contrario, si no se produce desarrollo de color, el microorganismo será oxidasa negativo.

Perfil de Fermentación de Azúcar (API)

Para la caracterización bioquímica de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381), se utilizó el sistema de galería API 50 CH con medio de inóculo API 50 CHL (BioMerieux, Milán, Italia). La galería consiste en 50 microtubos que contienen sustratos deshidratados para la detección de la actividad enzimática y la fermentación de azúcares. La suspensión bacteriana, con una turbidez de 2 McFarland, se distribuyó en los microtubos y se obtuvo la anaerobiosis cubriéndola con aceite de parafina estéril. El metabolismo del sustrato por la bacteria durante el período de incubación a 37°C se destaca por un cambio de color del medio, después de la acidificación del medio. La lectura de la reacción se realizó sobre la base de una tabla de lectura donde se registraron los resultados y la identificación se realizó mediante un software informático (www.apiweb.biomerieux.com).

r e s u lta d o s

Caracterización Molecular

Las cepas de lactobacilos seleccionadas por aislamiento con medio LV se clasificaron taxonómicamente mediante el estudio del gen 16S completo. Se amplificó una región de 1500 pb de longitud usando cebadores genéricos para eubacterias, se secuenció y a continuación se alineó usando BLAST con bases de datos públicas. Los resultados permitieron una cierta clasificación. Los resultados de Maldi Tof que se muestran a continuación proporcionaron un apoyo adicional para la identificación de la cepa.

La cepa L salivarius SGL03fue depositada el 21/11/2011 en la European International Collection DSMZ, que posee el estatus IDA (International Depositary Authority), con un “depósito de patente” con el siguiente número de registro: L salivaríus SGL03 DSM. 25381.

Además, el microorganismo se amplificó con cebadores específicos de especie, verificando la positividad por la aparición del amplicón que tiene el tamaño esperado de 411 pb. Este dato adicional nos permite destinar de forma inequívoca la especie, y disponer de un instrumento de control y seguimiento del cultivo en examen durante las fases de fermentación y liofilización. La Figura 1 muestra el resultado de la amplificación de la cepa L salivaríus SGL 03 (DSM 25381) usando cebadores específicos de especie. Caracterización Bioquímica

La cepa L salivaríus SGL03 (DSM 25381) también se analizó en términos de perfil bioquímico mediante tinción de Gram, prueba de catalasa, prueba de oxidasa y sistema API 50CH.

Los resultados obtenidos confirmaron que la cepa es Gram positiva, catalasa y oxidasa negativa, y fermenta los azúcares como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1: Caracterización bioquímica de L. salivaríus SGL03 mediante el sistema API 50CH.

e je m p lo 3: CARACTERIZACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS PROBIÓTICAS DE L. SALIVARIUS SGL03 Tolerancia al medio gastrointestinal

Para evaluar la tolerancia a los jugos gastrointestinales, se determinó la vitalidad en el tiempo mediante el conteo en placa de la cepa aislada, después de haber estado en contacto con:

• pepsina sintética;

• pancreatina sisntética;

• diversas concentraciones de sales biliares;

• diversas concentraciones de NaCl;

• medio de crecimiento con pH ácido.

- Prueba de resistencia a la pepsina

Se obtuvo una solución de pepsina que consiste en 3 g/l de pepsina, derivada de mucosa gástrica de cerdo (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), solubilizando pepsina en polvo en solución salina estéril de NaCl al 0,5% (p/v), y el pH se ajustó a 3. Partiendo de cultivos crecidos durante la noche en 10 ml de medio de caldo MRS suplementado con 0,05% de L-cisteína a 37°C durante aproximadamente 18 horas, en presencia de O2, se recogieron aproximadamente 109 células/ml mediante centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos. Posteriormente, las células sedimentadas se lavaron con una solución salina estéril de NaCl al 0,09% (p/v) y se sometieron al mismo ciclo de centrifugación. El lavado se repitió una segunda vez en las mismas condiciones.

Para simular el paso por el tracto gástrico, las células se resuspendieron en 10 ml de solución de pepsina a pH 3. La suspensión así preparada se incubó en anaerobiosis, a 37°C, durante 2 horas, midiendo el número de CFU/ml a los 0, 90 y 120 minutos por conteo en placa.

Para controlar el crecimiento incluso en ausencia de pepsina, la cepa se inoculó en dos soluciones salinas estériles al 0,5% (p/v), a pH 3, una que contenía pepsina y otra sin ella (muestra de control). Las muestras se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente.

La resistencia de la cepa tratada se expresó como porcentaje de supervivencia sobre el control.

- Prueba de resistencia a la pancreatina

Se obtuvo una solución de pancreatina, que consistía en 1 g/l de pancreatina de páncreas de cerdo (Sigma-Aldrich), solubilizando el polvo en solución salina estéril de NaCl al 0,5% (p/v), y el pH se ajustó a 8. Partiendo de cultivos crecidos durante la noche a 37°C durante aproximadamente 18 h, en presencia de O2, en 10 ml de medio de caldo MRS suplementado con 0,05% de L-cisteína, se recogieron aproximadamente 109 células/ml mediante centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos. Usando el mismo ciclo de centrifugación, las células se lavaron con una solución salina estéril de NaCl al 0,09% (p/v).

Posteriormente las células se lavaron con un tampón de neutralización estéril (PBS - 8 g/l NaCl, 0,2 g/l KCI, 1,44 g/l Na2HPO4, 0,24 g/l KH² PO⁴) a pH 7 y, para simular el paso por el intestino, se resuspendieron en 10 ml de solución de pancreatina a pH 8. La suspensión se incubó en anaerobiosis, a 37°C, durante 4 horas, estimando el número de CFU/ml a los 0, 60 y 240 minutos por conteo en placa. Para monitorear el crecimiento en ausencia de pancreatina, la cepa en evaluación se inoculó en dos soluciones salinas estériles al 0,5% (p/v), a pH 8, una que contenía pancreatina y otra sin ella (muestra de control). Las muestras se incubaron en las mismas condiciones descritas anteriormente.

La resistencia de las cepas tratadas se expresó como porcentaje de supervivencia sobre el control.

- Prueba de resistencia a sales biliares, pH y NaCl

El análisis se llevó a cabo en cultivos bacterianos desarrollados durante la noche. Aproximadamente 109 células/ml se recogieron por centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos. A continuación, las células se lavaron con 2 ml de solución fisiológica estéril (NaCl 9 g/l) y, tras centrifugación a 4.000 rpm durante 10 minutos, se resuspendieron en caldo MRS que contenía:

• 0%, 0,5%, 1%, 2%, 3% sales biliares (p/v, Sigma-Aldrich);

• 0%, 2%, 6%, 10% NaCl (p/v, Oxoid);

• pH 6,3, 3,5, 2, 1,5, ajustado con HCl 4 N.

Las soluciones se incubaron en anaerobiosis, a 37°C durante 24h, para cada inóculo se registró la densidad óptica a 600 nm a 0h, 2h y 24h, mientras que la estimación del número de CFU/ml se realizó a 0h y 24h, por conteo en placa.

Adhesión a monocapa de células intestinales

Para evaluar la actividad de adhesión de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) a la línea entérica humana HT29, se añadieron 1 x 108 células bacterianas a una monocapa epitelial de células HT29 (1,23 x 106 células) y se incubaron durante 1,5 h. Al final de la incubación, la monocapa celular se lavó 4 veces con PBS y las células bacterianas adherentes se cuantificaron mediante PCR en tiempo real utilizando el cebador específico de género (Candela M, Seibold G, Vitali B, Lachenmaier S, Eikmanns BJ, Brigidi P. Real-time PCR quantification of bacterial adhesión to Caco-2 cells: competition between bifidobacteria and enteropathogens. Res. Microbiol. (2005) 156:887-895).

Los enteropatógenos adherentes Salmonella Typhimurium y E.coli ETEC H10407 se utilizaron como controles positivos, mientras que la cepa de E. coli B44 no adherente se utilizó como control negativo.

Actividad inhibitoria contra el crecimiento de estreptococos patógenos que residen en la cavidad oral

Se evaluó la actividad inhibidora de la cepa de L. salivarius SGL03 (DSM 25381)- contra ciertos estreptococos que residen en la cavidad bucal, algunos asociados con procedimientos patológicos de la cavidad bucal. Específicamente, el objeto del estudio fue S. pyogenes, el agente etiológico más común de faringitis y amigdalitis, y S. mutans, la principal especie responsable de la caries dental.

Además, se evaluó la actividad antagonista frente a otro estreptococo comensal de la mucosa oral, S. uberis, no conocido como patógeno oral pero asociado ocasionalmente a infecciones del tracto urinario genitourinario., Para determinar la concentración mínima de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) capaz de inhibir el crecimiento de cada patógeno, se realizó un estudio preliminar sobre S. pyogenes, analizando tres concentraciones diferentes de L salivarius (1x107 CFU/ml, 1x108 CFU/ml, 1x109 CFU/ml).

Para la prueba de inhibición, el punto de partida fue un tubo que contenía 10 ml de medio M17 (Liofilchem), inoculado con S. pyogenes. El cultivo se incubó en aerobiosis a 37°C durante la noche, en condiciones estáticas.

Después de 24 horas, se inocularon 4 matraces que contenían 100 ml de medio M17 con 1 ml de cultivo de S. pyogenes S. pyogenes crecido durante la noche. Se utilizó 1 matraz como control de crecimiento de S. pyogenes, los otros 3 matraces se adicionaron con diferentes concentraciones de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) (1x107CFU/ml, 1x108 CFU/ml, 1x109 CFU/ml). Todos los matraces se incubaron en aerobiosis a 37°C, en condiciones estáticas. El crecimiento microbiano se evaluó en diferentes momentos midiendo la densidad óptica de los cultivos y calculando el conteo en placa de CFU/ml en medio M17 agarizado. Para diferenciar las colonias patógenas de las de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381), también se realizaron conteos en placas de medio agar MRS específico de lactobacilos. Las placas utilizadas durante los conteos se incubaron en aerobiosis a 37°C durante 24-48 horas. A continuación, se ensayó la concentración mínima de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) capaz de inhibir el crecimiento de S. pyogenes en S. mutans y S. uberis, con el fin de verificar si la dosis determinada era igualmente eficaz.

La prueba de inhibición en S. mutans y S. uberis se realizó siguiendo la misma parcela experimental de la prueba preliminar realizada en S. pyogenes.

Perfil de resistencia a antibióticos

La sensibilidad a los agentes antimicrobianos de la cepa L. salivarius SGL03 (DSM 25381) se evaluó utilizando la tira de prueba MIC (Liofilchem), un procedimiento cuantitativo para la determinación de la concentración mínima inhibitoria (MIC) de un solo agente antimicrobiano contra microorganismos. El kit consta de tiras de papel impregnadas con un gradiente predeterminado de concentraciones de antibiótico, que consiste en 15 diluciones en el intervalo de diluciones utilizado en los procedimientos convencionales para la determinación de la MIC.

Los cultivos en fase estacionaria se diluyeron en tampón MRD (Liofilchem) para tener una turbidez igual al estándar McFarland 3. Se espatularon 100 pl de esta solución sobre la superficie de medio agar MRS suplementado con L-cisteína al 0,05% en placa, con el fin de producir un crecimiento homogéneo. Después de permitir que la superficie del agar se secase por completo, la tira se colocó en el centro de la placa con los valores de MIC hacia arriba. Las placas así preparadas se incubaron, con la tapa hacia arriba, en aerobiosis, a 37°C durante 48 horas.

Cuando la tira del kit se aplica a la superficie inoculada del medio agarizado en placa, el gradiente predefinido es liberado por la tira al medio, por lo tanto, después de la incubación, se puede observar un área elíptica, simétrica y centrada a lo largo del área de inhibición de la tira. El valor de MIC, expresado en pg/ml, se leyó en el punto de intersección entre el borde de la elipse de inhibición y la tira de papel.

r e s u lta d o s

Tolerancia al medio gastro-intestinal

El microorganismo fue probado para asegurar su tránsito gastrointestinal y supervivencia, y asegurar que alcance con plena vitalidad el tramo intestinal donde debe ejercer su actividad fisiológica.

A continuación, esta cepa se probó en las siguientes condiciones del medio:

1. resistencia a la pepsina en medio ácido

2. resistencia a la pancreatina en medio básico

3. resistencia a altas concentraciones de sales biliares

4. resistencia a medio ácido

5. resistencia a altas concentraciones salinas

La cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) mostró una buena tolerancia al medio gastrointestinal. Específicamente, los resultados mostraron una buena tasa de supervivencia después de 1 h, e incluso después de 4 h de incubación en presencia de pancreatina a pH 8. Se obtuvieron resultados similares después de 1 hora y 30 minutos, y después de 2 horas y 30 minutos de incubación en presencia de pepsina a pH 3. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 2 a continuación.

.

El microorganismo se ve levemente afectado por la presencia de sales biliares en concentraciones superiores al 2% (unas 10 veces superiores a las fisiológicas), aún mostrando buena supervivencia incluso en presencia del 3%. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Esto lo hace adecuado para su uso como probiótico.

Tabla 3: L. salivarius SGL03 resistencia a sales biliares

Resistencia en Medio Salino

Como se muestra en la Figura 2, la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) se ve afectada por la presencia de NaCl en el medio de cultivo. Su supervivencia está asegurada hasta un 2% de NaCl; a concentraciones más altas se detiene el crecimiento del microorganismo.

Resistencia en Medio Ácido

Como se muestra en la Figura 3, la cepa L salivaríus SGL03 (DSM 25381) muestra una baja tolerancia al pH ácido; a pH por debajo de 3, su supervivencia se ve comprometida.

Adhesión a la Monocapa de Células Intestinales

La actividad de adhesión de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) a la línea entérica humana HT29 se evaluó contando el número de microorganismos adherentes a las células HT29 mediante PCR en tiempo real. Los resultados obtenidos fueron de 9,57 bacterias por 100 células HT29, por lo que la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) no puede considerarse una cepa adhesiva (valor de referencia de adhesión, 6,77E 5 Salmonella/100 células HT29 y 157 E. coli B44/100 HT29).

Actividad inhibitoria sobre el crecimiento de patógenos que residen en la cavidad oral

Los resultados del estudio preliminar realizado en S. pyogenes muestran que la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) es capaz de inhibir el crecimiento de S. pyogenes a todas las concentraciones probadas (1x107CF U/ml, 1x108 CFU/ml, 1x109 CFU/ml), con una inhibición máxima en las primeras 6-7 horas de co-cultivo, después de lo cual el microorganismo, mientras está inhibido, comienza a crecer lentamente, como se muestra en la Figura 4. La concentración mínima inhibitoria de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381), determinada en la prueba realizada en S. pyogenes, es 1x107CFU/ml, por lo que se ensayó la misma concentración en los otros estreptococos orales en estudio, uberis y S. mutans. La prueba de inhibición se realizó siguiendo el mismo ploteado experimental utilizado para S. pyogenes, y también se evaluó el crecimiento microbiano después de 24 horas de incubación.

Los resultados mostraron que, de manera similar a S. pyogenes, S. uberis se inhibe cuando están presentes 1x107CFU/ml de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) en el medio de crecimiento. Además, la inhibición del crecimiento se mantiene durante todo el período de 24 horas, como se deduce del gráfico de la Figura 5.

S. mutans, por otro lado, no se ve afectado por la presencia de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) en el medio de cultivo a una concentración de 1x107CFU/ml; de hecho, como puede verse en el gráfico de la Figura 6a, la curva de crecimiento de S. mutans muestra aproximadamente el mismo patrón tanto en la muestra como en el control. Por lo tanto, se realizó una prueba adicional a concentraciones más altas de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) (Figura 6b), con el fin de evaluar si la inhibición del crecimiento de S. mutans era dependiente de la dosis. Las concentraciones probaras fueron 2x107CFU/ml, 3x107CFU/ml, 10x107CFU/ml.

Los resultados de la prueba se muestran después de los de la prueba realizada con 1x107CFU/ml SGL03. La concentración mínima de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) necesaria para inhibir el crecimiento del patógeno resultó ser de 3x107CFU/ml,mientras que a concentraciones de 2x107CFU/ml, el patógeno parece estar poco afectado por la presencia de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381), especialmente durante las primeras 8-9 horas de incubación.

Perfil de resistencia a antibióticos

La Tabla 4, que se informa a continuación, muestra el perfil de resistencia a los antibióticos probados contra la cepa L salivarius SGL03, utilizando la tira de prueba MIC.

Tabla 4: Perfil de resistencia a antibióticos de L. salivarius SGL03

e je m p lo 4: d e s c r ip c ió n del p r o c e d im ie n to de fe r m e n ta c ió n y lio f il iza c ió n

Fermentación

La fermentación se realizó en un biorreactor de laboratorio para estudios de lotes pequeños, equipado con dos recipientes de 1,5 litros.

Inicialmente, se realizó un cribado con varios medios de cultivo, con el fin de identificar el medio más adecuado para el crecimiento de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) en términos de biomasa. El medio de cultivo identificado tiene la siguiente composición:

Peptona de carne 18 g/l

Extracto de levadura 4 g/l

Dextrosa 60 g/l

Dihidrógeno fosfato de potasio 2 g/l

Citrato de amonio tribásico 2 g/l

Sulfato de magnesio heptahidratado 0,2 g/l

Sulfato de manganeso monohidrato 0,05 g/l

Cisteina-HCl 0,5 g/l

Tween 80 10 g/l

Una vez llenos de 1,5 litros del medio de cultivo seleccionado, los recipientes se esterilizaron en autoclave a 105°C durante 90 minutos y se conectaron al panel de control. Los parámetros establecidos para la fermentación por lotes fueron los siguientes:

- temperatura 37°C;

- pH 6,0, controlado con NaOH 5N;

- oxígeno;

- agitación a 100 rpm.

El inóculo con 3% de precultivo en fase exponencial se obtuvo realizando un escalado corto: de 10 ml de MRS a 50 ml, finalizando con el recipiente de 1,5 litros.

Liofilización

El procedimiento de fermentación se detuvo después de aproximadamente 7 horas desde el inóculo, específicamente cuando la densidad óptica del cultivo bacteriano, medida a 600 nm, alcanzó 10. A continuación, el caldo de cultivo se centrifugó a 9.000 rpm durante 20 minutos a 10°C, se descargó el sobrenadante y el sedimento se resuspendió en una proporción de 1:1 con un crioprotector de la siguiente composición:

Trealosa 150 g/l

Polivinilpirrolidona K90 25 g/l

Almidón de patata 25g/l

El sedimento mezclado con el crioprotector se colocó a continuación dentro de un recipiente metálico que tenía una superficie de soporte perfectamente adherida a la superficie del estante del liofilizador.

El liofilizador utilizado fue un Lyobeta 3PS (Telstar, España). La Tabla 5 a continuación resume la receta de liofilización utilizada, con los parámetros de control relevantes utilizados durante el procedimiento de liofilización.

Tabla 5: Parámetros de liofilización de L. salivaríus SGL03

*La temperatura va de -5°C a -55°C en 1h, y a continuación es mantenida a -55°C durante 3h y 30 minutos. Después de la liofilización, también se evaluó el porcentaje de vitalidad de L saHvarius SGL03 (DSM 25381), revitalizando el liofilizado obtenido en medio MRS durante aproximadamente 30 minutos a 37°C, y realizando un conteo en placa.

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Fermentación y Liofilización

Se monitorizó el crecimiento de L saHvarius SGL03 (DSM 25381), en términos de densidad óptica a 600 nm y CFU/ml, durante las primeras 6-7 horas desde el inóculo del fermentador, hasta alcanzar una densidad óptica de 10. La curva de crecimiento obtenida durante la fermentación se muestra en la Figura 7.

En la recogida del caldo de cultivo, el rendimiento en términos de CFU fue de aproximadamente 2,5x109CFU/litro de medio. La biomasa microbiana obtenida tras la liofilización fue de aproximadamente 10 g por litro de medio. Después de la revitalización de la cepa, el resultado del conteo fue de 200x109CFU/g, por lo que el porcentaje de vitalidad después de la liofilización fue del 54%.

e je m p lo 5: PRODUCCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE SECRETOMA de L. SALIVARIUS SGL03

Análisis de Secretoma de L.salivarius SGL03

La cepa de L saHvarius SGL03 (DSM 25381) se recogió de cultivos desarrollados en medio MRS mediante centrifugación (5.000 rpm, 10 minutos, 4°C) después de 12 horas de fermentación a 37°C. A continuación, se filtró el sobrenadante a través de filtros de 0,22 pm (Millipore). Esta muestra, referida al sobrenadante bruto libre de células, se concentró por ultrafiltración utilizando conjuntos de filtrado de límite de peso molecular nominal (corte) de 3 kDa (Ultraeel YM-3, Millipore), y la fracción con un corte inferior a 10 kDa se recogió y se concentró utilizando tubos Vivaspin 6 (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Alemania).

La concentración de proteína se determinó utilizando el procedimiento Bradford (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) en función de las instrucciones del fabricante.

La muestra de proteína secretada (corte <10 kDa) se cargó a continuación en gel SDS-PAGE, junto con los patrones de masa molecular (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). El gel se preparó con un gel de relleno de acrilamida/bis-acrilamida al 5% y un gel de separación al 5% para tricina-SDS-PAGE. La separación se realizó a 25 mA durante 3 horas en un aparato de gel de placa vertical, Mini PROTEAN 3 (Bio-Rad). El gel se tiñó con Coomassie Brilliant Blue G-250.

Actividad Antimicrobiana del Secretoma de L salivarius SGL03 (DSM 25381)

La actividad antimicrobiana del secretoma total se analizó mediante el procedimiento de difusión en agar. Para detectar la actividad antimicrobiana del secretoma de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381), el sobrenadante del cultivo se centrifugó a 5.000 rpm durante 10 minutos a 20°C, se llevó a pH 7 con NaOH 2N y se trató con 1000 U/ml de catalasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) para excluir los efectos debidos a los ácidos orgánicos y al peróxido de hidrógeno. A continuación, se esterilizó el sobrenadante a través de un filtro de 0,22 gm (Millipore) y se realizaron diluciones del sobrenadante en medio M17 estéril. Posteriormente, se vertieron alícuotas de 25 gl de las muestras de sobrenadante diluidas en orificios de 4 mm realizados en la superficie de placas de agar M17 (agar al 1,2%), previamente espatuladas con 1x108CFU/ml de la cepa marcadora en fase de crecimiento exponencial. También se probó una solución de NaCL al 0,9% como prueba de control. Las placas se incubaron a 37°C durante 24 horas.

La actividad antimicrobiana se destacó por la presencia de un halo de inhibición del crecimiento, cuyo diámetro en milímetros (mm) fue medido para el secretoma. Para las proteínas heterólogas, en cambio, la actividad antimicrobiana se expresó en forma de unidades arbitrarias (AU/ml), definidas como el recíproco de la dilución más alta capaz de producir un halo de inhibición.

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Análisis del Secretoma de L salivarius SGL03 (DSM 25381)

En el presente estudio, se analizó el perfil proteico extracelular de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) mediante electroforesis unidimensional en gel de tricina. La concentración de proteína en el sobrenadante, estimada mediante el procedimiento de Bradford, en el secretoma de L salivarius SGL03 (DSM 25381) fue de 8 mg/l. Con el fin de centrarse en compuestos de tipo bacteriocina, el secretoma total se concentró 15 veces y la fracción de proteína con un punto de corte inferior a 10 kDa se cargó en gel SDS-PAGE (Figura 8). A continuación, las bandas separadas se extrajeron del gel y se trataron con tripsina antes del análisis por espectrometría de masas.

Actividad Antimicrobiana del Secretomna de L salivarius SGL03

El secretoma obtenido de la cepa L salivarius SGL03 (DSM 25381) se ensayó para determinar su actividad antibacteriana frente a diversas bacterias Gram positivas y Gram negativas (Tabla 6). Las actividades antibacterianas se determinaron midiendo el diámetro del halo de inhibición. La cepa L salivarius SGL03 (DSM25381) mostró actividad inhibitoria frente a Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium, Streptococcus uberis. El grado de inhibición contra S. pyogenes fue alto, con un diámetro de halo de inhibición de 15 mm; y moderado contra E. faecium y S. uberis, con un diámetro de halo de inhibición de 6 mm.

Tabla 6: Actividad antibacteriana de Secretoma de L. salivarius SGL03

Zona de inhibición: actividad de inhibición, - sin actividad de inhibición.

e je m p lo 6: id e n t if ic a c ió n de p r o t e ín a s s e c r e t a d a s co n a c t iv id a d a n t im ic r o b ia n a m e d ia n te e s p e c t r o m e t r ía de m a s a s (MS)

Las bandas se cortaron cuidadosamente del gel de Coomassie y se sometieron a digestión en gel con tripsina en función de Shevchenko et al., con modificaciones menores. Brevemente, se dejó que los fragmentos de gel se hidrataran en un tampón de digestión que contenía NH4HCO3 50 mM y 12,5 ng/pl de tripsina de cerdo (Promega, Madison, WI, EE. UU.), y se dejó que la digestión prosiguiera a 37°C durante la noche. Antes de la espectroscopía de masas, las mezclas de péptidos se redisolvieron en 5 pl de acetonitrilo al 2% y ácido fórmico al 0,1%.

Los péptidos obtenidos de 5 pl de cada muestra se separaron a continuación en línea mediante un sistema de chip nano-HPLC de fase inversa (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.) acoplado a un espectrómetro de masas de trampa de iones 3D (modelo Esquire 6000, Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). La elución secuencial del péptido se realizó dentro del chip usando un caudal de 300 nl/minuto y un gradiente lineal de una Solución A (acetonitrilo al 2%; ácido fórmico al 0,1%), 50% v/v, a una Solución B (98% v/v acetonitrilo; 0,1% v/v ácido fórmico) en 20 minutos en una columna de enriquecimiento Zorbax 300SB-C18 (40 nl, 5pm) y en una columna analítica Zorbax 300SB-C18 (43 mm x 75pm, 5pm). El sistema completo estaba totalmente controlado por los software ChemStation (Agilent Technologies) y EsquireControl (Bruker Daltonics).

El intervalo de escaneo utilizado para adquirir los espectros fue de 300-1800 m/z (relación masa/carga). Para los experimentos en tándem de MS, el sistema se hizo funcionar con un cambio automático entre los modos MS y MS/MS.

Los tres péptidos más abundantes para cada valor m/z se seleccionaron para aislarlos y fragmentarlos más. El escaneo MS/MS se realizó en modo de resolución normal, a una velocidad de escaneo de 13.000 m/z por segundo. Se realizó un promedio de cinco escaneos para obtener un espectro MS/MS. Para la identificación de péptidos, se realizaron algunas búsquedas utilizando el software de búsqueda Mascot en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBInr) que contiene secuencias de proteínas no redundantes (base de datos NCBInr 20.130.918, secuencias 32611672, 11345269536 residuos).

Se utilizaron los siguientes parámetros para la búsqueda: digestión específica con tripsina, hasta una escisión perdida; modificaciones fijas y variables: carbamidometilación de cisteína y oxidación de metionina; tolerancia de masa para péptido y fragmento ± 0,9 Da y ± 0,9 Da, respectivamente; cargas peptídicas: 1, 2 y 3. Las proteínas se identificaron con un resultado significativo (P < 0,05) basado en el puntaje individual para el ión peptídico. Estos puntajes fueron calculados automáticamente por el programa Mascot, donde P es la probabilidad de que la coincidencia observada sea un evento aleatorio.

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Se encontraron un total de 10 proteínas diferentes en los medios analizados. Las proteínas secretadas identificadas se resumen en la Tabla 7 a continuación.

Tabla 7: Proteínas secretadas por L.salivarius SGL03 e identificadas por MS.

e je m p lo 7: EXPRESIÓN HETERÓLOGA DE PROTEÍNAS SECRETOMAS DE L. SALIVARIUS SGL03 Y EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA

Diseño de Cebadores y Condiciones de Amplificación por PCR

Debido al hecho de que muchas proteínas ribosómicas se caracterizan por características extra ribosómicas, en particular para las funciones antimicrobianas, hemos decidido concentrarnos inicialmente en rpmA (proteína ribosómica L2750S), rpmD (proteína ribosómica L3050S), rpsT (proteína ribosómica S2030S) y proteínas lSl_0885 (proteína HU de unión al ADN).

Los cebadores se diseñaron para amplificar la secuencia codificante completa de rpmA (Banco Genético, número de acceso: Q1WTI2), rpmD (Banco Genético, número de acceso: Y_536304), rpsT (Banco Genético, número de acceso: Q1WU88), y LSL_0885 (Banco Genético, número de acceso: Q1WTQ5) genes.

La secuencia de polipéptidos maduros (rpmA 282 pb, rpmD 183 pb, rpsT 255 pb, LS_0885 276 pb) se amplificó mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:

Para rpmA CTCAGCACATATGTTAATGAATTTACAATTCTTCGCT SEQ ID NO. 5 Rev rpmA CCCTCGACATATGGATAAATTAAAAGTTACTTTAATTCG SEQ ID NO. 6

Para rpmD GCTGGATCCTT ATT ATTCAGCAACAGGGT AAACA SEQ ID NO. 7 Rev rpmD GATGGATCCCT ACT ATTT AGCCAATT CAACGTCC SEQ ID NO. 8 Para rpsT CCACCTCATATGCCAATTATCAAATCTGCTATTAAA SEQ ID NO. 9 Rev rpsT S20 TCTGGATCCTTATTATTTAGCTAAACGAGCAGC SEQ ID NO. 10 Para LSL _0885 TTGGACGCATATGGCAAACAAAGCAGCATTGATTG SEQ ID NO. 11

Rev LSL_0885 GGCGGATCCTTATTATTTAACAGCGTCTTTCAAAGA SEQ ID NO. 12

Los sitios de reconocimiento para las endonucleasas de restricción Ndel y BamHI, necesarios para la subclonación, se incluyeron en los extremos 5’ y 3' del gen maduro, respectivamente. La amplificación del gen se realizó utilizando un volumen total que contenía 20 ng de modelo de ADN, 0,5 |jM de cada cebador, 2 mM Mg2+, 200 mM de cada desoxinucleótido trifosfato, tampón de PCR 1X y 2,5 unidades de Taq polimerasa.

Se utilizó el siguiente programa para la amplificación:

Inicio en caliente a 94°C durante 5 minutos, 34 ciclos de desnaturalización durante 40 segundos, recocido de cebadores a 60°C durante 30 segundos, extensión a 72°C durante 30 segundos, seguida de una extensión final a 72°C durante 5 minutos.

Los productos de PCR se analizaron en gel de agarosa al 0,8% en tampón TBE 1X y se purificaron del gel utilizando el kit de extracción de gel GenElute™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri), siguiendo las instrucciones del fabricante. Aislamiento de clones de ADN a partir de productos de PCR y secuenciación

Los productos de PCR se ligaron al vector pGEM Teasy, para generar plásmidos recombinantes usando ADN ligasa T4. Células competentes de E. coli JM109 se transformaron usando el vector plasmídico pGEM Teasy. Las bacterias transformadas se seleccionaron mediante selección de colonias azul-blancas en medio que contenía ampicilina (100 Mg/ml), X-Gal (80 gg/ml) e IPTG (0,5 mM).

Los modelos de ADN plasmídico se purificaron usando el sistema de purificación Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega).

La secuenciación de genes RpmA, rpmD, rpsT y LSL_0885 se realizó utilizando el procedimiento Sanger (BMR-genomics, Padova, Italia).

Expresión Heteróloga de Proteínas Recombinantes

Células de E. coli BL21 (DE3) se utilizaron como hospedadores de transformación para la expresión de proteínas recombinantes. Estas células, que contienen el gen T7 de ARN polimerasa bajo el control del gen promotor lacl, se transformaron utilizando el plásmido pET-15b.

Se incubó una sola colonia de células E. coli BL2 (DE3) a 37°C, con agitación de 200 rpm, en 2 ml de medio Luria-Bertani (LB), que contenía ampicilina (100 gg/ml).

Se tomaron 500 gl de caldo de cultivo y se inocularon en 1 litro de medio LB.

Las células se cultivaron a 37°C, bajo vigorosa agitación a 200 rpm, hasta alcanzar una densidad óptica de 0,8 a 600 nm.

Se añadió isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,5 mM para inducir la expresión de péptidos maduros en E. coli.

A continuación, se extendió la incubación durante 4 horas a 37°C, mientras se mantenía en agitación a 200 rpm. Se tomaron alícuotas de la suspensión bacteriana a las 4, 6, 12 horas.

Las proteínas expresadas se purificaron mediante columnas de Ni-sefarosa, siguiendo las instrucciones del fabricante (GE Healthcare), y a continuación se concentraron con tampón PBS a 4°C.

El grado de pureza de cada proteína recombinante purificada se evaluó mediante SDS-PAGE al 15% y se confirmó mediante nano-HPCL acoplado a espectrometría de masas.

Evaluación de la Actividad Antimicrobiana

Para probar la actividad bacteriostática y bactericida de rpmA, rpmD, rpsT y LSL_0885 frente a la cepa S. pyogenes ATCC19615, esta última se cultivó en 100 ml de medio M17 hasta alcanzar la fase exponencial (108 CFU/ml). Se produjeron cuatro matraces de 100 ml con S. pyogenes, uno para cada proteína a ensayar.

Posteriormente, las proteínas se filtraron a través de filtros de 0,45 gm (Millipore) y se añadieron individualmente a los cultivos crecidos de S. pyogenes, a la concentración de 133 AU/ml.

Se usó como control un cultivo de S. pyogenes, crecido en medio M17 sin ninguna adición de las proteínas purificadas. Después de la adición de proteínas, los cultivos se incubaron a

37°C durante otras 6 horas. Los cambios en la turbidez del cultivo se controlaron a lo largo del tiempo registrando la densidad óptica a 600 nm y realizando conteos de CFU/ml en placas de agar M17.

r e s u lta d o s

Evaluación de la Actividad Antimicrobiana

Se realizó expresión heteróloga para obtener proteínas purificadas. Un clon positivo de E. coli BL21 (DE3) permitió acumular la proteína recombinante (es decir, rpmA, rpmD rpsT y LSL_0885) en una forma soluble en citoplasma, y se produjo a un nivel constante con IPTG.

Las proteínas purificadas de expresión heteróloga se detectaron como una banda de aproximadamente 10, 7, 9 y 10 kDa por SDS-PAGE (Figura 9), que se identificaron como rpmA, rpmD, rpsT y LSL_0885, y que tenían una Mr de 9941,6557, 9126 y 9802Da mediante análisis MS/MS, respectivamente.

La cantidad total de proteínas purificadas fue de 1,5 mg/l, 0,3 mg/l, 6 mg/l y 11 mg/l para rpmA, rpmD, rpsT y LSL_0885, respectivamente.

Las proteínas purificadas rpmA, rpmD, rpsT y LSL_0885 se ensayaron para determinar su actividad antimicrobiana frente a las cepas indicadas en la Tabla 6.

Los resultados mostraron que las proteínas rpmA y rpmD exhiben una actividad antimicrobiana específica contra las cepas de S. pyogenes, E. faecium y S. uberis.

Se probaron varias concentraciones de las proteínas purificadas: 0,25 gg/gl, 0,5 gg/gl, 1,0 gg/gl, 1,5 gg/gl y 2,0 gg/gl (Tabla 8).

Tabla 8: Resultados de la actividad antimicrobiana de proteinas producidas por L. salivaríus SGL03 contra S. pyrogenes ATCC19615. Halo de inhibición: actividad inhibidora, - sin actividad inhibidora.

La unidad arbitraria calculada para las proteínas rpmA y rpmD fue 133 AU/ml, utilizando Streptococcus pyogenes como cepa marcadora.

Se probaron juntas RpmA y rpmD para verificar la presencia de cualquier actividad sinérgica. Para ello, se ensayaron en combinación 15 pL de cada proteína, a una concentración de 1 pg/pl, y se obtuvo un aumento de 0,5 mm del diámetro del halo de inhibición mediante el procedimiento de difusión en agar (Figura 10).

La adición de proteínas rpmA y rpmD purificadas, a una concentración de 133 AU/mL, al cultivo de S. pyogenes ATCC 19615, en la fase de crecimiento logarítmico, resultó en una rápida disminución de las células viables de S. pyogenes de 108 CFU/ml a 106 CFU/ml y de 108 CFU/ml a 105 CFU/ml, durante un período de 9 horas, en cultivos tratados con rpmA y rpmD, respectivamente.

En la muestra de control (sin adición de proteínas purificadas), las células viables de S. pyogenes ATCC 19615 alcanzaron 1010 CFU/ml después de 9 horas de crecimiento.

La densidad óptica del microorganismo marcador permaneció constante después de la adición de proteínas rpmA y rpmD purificadas (Figura 11a, 11b, 11c y 11d). Estos resultados mostraron que ambas proteínas exhiben actividad bactericida contra S. pyogenes.

A partir de la descripción detallada y los ejemplos anteriores, son evidentes las ventajas obtenidas con la cepa probiótica de la presente invención. Específicamente, tal cepa probiótica demostró ser sorprendente y ventajosamente adecuada para la producción de proteínas que tienen actividad inhibidora contra ciertas bacterias Gram-positivas.

Claims (12)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Uso de la cepa L salivarius SGL03 DSM 25381 como un agente antimicrobiano.

2. El uso según la reivindicación 1, donde dicha cepa tiene una acción inhibidora contra bacterias Gram positivas.

3. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde dicha cepa tiene una acción inhibidora contra Streptococcus pyogenes, Enterococcus faecium, Streptococcus uberis.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha cepa comprende proteínas elegidas del grupo que consiste en proteína de unión a peptidoglicano, proteína ribosómica L1 50S, proteína ribosómica S5 30S, proteína ribosómica S8 30S, proteína ribosómica L11 50S, Proteína ribosómica L14 50S, proteína ribosómica L2750S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L3050S.

5. El uso según la reivindicación 4, donde dichas proteínas se eligen del grupo que consiste en proteína ribosómica L2750S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L3050S.

6. Una composición probiótica que comprende la cepa L salivarius SGL03 DSM 25381 suplementada con una o más proteínas antimicrobianas elegidas del grupo que consiste en proteína ribosómica L27 50S, proteína HU de unión al ADN, proteína ribosómica S2030S y proteína ribosómica L3050S.

7. La composición según la reivindicación 6, donde dichas una o más proteínas antimicrobianas están en una cantidad en el intervalo de 50 a 100 gg de proteína purificada.

8. La composición según cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7, que comprende peróxido de magnesio.

9. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 8, para la preparación de un producto nutracéutico.

10. El uso según la reivindicación 9, donde dicho producto nutracéutico está en forma de cápsula, comprimido, polvo o goma de mascar.

11. Uso de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 6, 7 u 8, para la preparación de un producto dermo-cosmético.

12. El uso según la reivindicación 11, donde dicho producto dermo-cosmético está en forma de parche, emplasto, crema, polvo o talco, aceite o aceite seco.