ES2376026T3 - Agentes citotóxicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapéutico. - Google Patents

Abstract

Compuesto seleccionado del siguiente grupo: asi como los correspondientes esteres N-hidroxisuccinimidilicos. o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polimórficas de estos compuestos o sus isómeros ópticos, racematos, diastereoisómeros o enantiómeros.

Description

Agentes citot6xicos que comprenden nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapeutico

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invenci6n se refiere a nuevos derivados de tomaimicina y su uso terapeutico como agentes citot6xicos. El uso terapeutico es el resultado de distribuir los derivados de tomaimicina en una poblaci6n celular especifica de una manera dirigida por uni6n mediante enlaces quimicos del derivado de tomaimicina con un agente de uni6n a la celula. La invenci6n tambien se refiere a moleculas conjugadas que comprenden uno o mas de dichos derivados de tomaimicina unidos mediante enlaces quimicos a un agente de uni6n a la celula opcionalmente modificado.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Se han descrito muchos intentos de dirigir especificamente conjugados anticuerpo monoclonal-farmaco a celulas tumorales (Sela et al., en Immuno-conjugates 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose et al., en Targeted Drugs 1-22

(E.

Goldberg; ed. 1.983); Diener et al, en Antibody mediated delivery systems, 1-23 (J. Rodwell, ed. 1.988); Pietersz et al, en Antibody mediated delivery systems, 25-53 (J. Rodwell, ed. 1.988); Bumol et al, en Antibody mediated delivery systems, 55-79 (J. Rodwell, ed. 1.988); G.A. Pietersz & K. Krauer, 2, J. Drug Targeting, 183-215 (1.994); R.

V.

J. Chari, 31 Adv. Drug Delivery Revs., 89-104 (1998); w.A. Blattler & R.V.J. Chari, en Anticancer Agents, Frontiers in Cancer Chemotherapy, 317-338, ACS Symposium Series 796; Ojima et al eds, American Chemical Society 2.001; J.M.Lambert, 5 Current Opinion in Pharmacology, 543-549 (2.005); P.R. Hamann, 15 Expert Opinion on Therapeutics Patents, 1.087-1.103 (2.005)). Todas las referencias y patentes citadas en la presente memoria se incorporan como referencia.

Se han conjugado farmacos citot6xicos, tales como: metotrexato, daunorubicina, doxorubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C y clorambucilo, con varios anticuerpos monoclonales murinos. En algunos casos, las moleculas del farmaco se unieron a las moleculas de anticuerpo a traves de una molecula portadora intermedia, tal como albumina serica (Garnett et al., 46 el Cancer Res. 2.407-2.412 (1.986); Ohkawa et al 23, Cancer Immunol. Immunother. 81-86 (1.986); Endo et al, 47 Cancer Res. 1.076-1.080 (1.980); dextrano (Hurwitz et al, 2 Appl. Biochem. 25-35 (1.980); Manabi et al., 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1.985); Dillman et al, 46 Cancer Res., 4.886-4.891 (1.986); Shoval et al, 85, Proc. Natl. Acad. Sci., 8.276-8.280 (1.988)) o acido poliglutamico (Tsukada et al, 73, J. Natl. Canc. Inst., 721-729 (1.984); Kato et al, 27 J. Med. Chem., 1.602-1.607 (1.984); Tsukada et al, 52, Br.

J. Cancer, 111-116 (1.985)).

Se ha empleado una amplia serie de tecnologias de ligantes para la preparaci6n de tales inmunoconjugados y se han investigado tanto ligantes escindibles como no escindibles. En la mayoria de los casos, el alto potencial citot6xico de los farmacos s6lo podia observarse, sin embargo, si se podian liberar las moleculas de farmaco de los conjugados en forma no modificada en el sitio diana usando un ligante escindible.

Los ensayos in vitro de citotoxicidad han revelado, sin embargo, que los conjugados anticuerpo-farmaco podian destruir no s6lo celulas positivas de antigeno sino tambien otras celulas en los alrededores, con independencia de la expresi6n del antigeno en su superficie. Este fen6meno se denomina el efecto espectador. Este efecto se observ6 en conjugados del anticuerpo anti-CanAg; huC242, con maitansinoides y con un analogo CC1065 (Erickson et al, 66 Cancer Res., 4.426-4.433 (2.006); Kovtun et al, 66 Cancer Res., 3.214-3.221 (2.006)). Hasta ahora s6lo los conjugados unidos mediante un enlace escindible tal como un enlace disulfuro reducible, demostraron citotoxicidad del espectador, mientras los conjugados unidos mediante un enlace tioeter no reducible no presentaban efecto espectador.

Las moleculas efectoras citot6xicas muy potentes unidas a agentes diana tales como anticuerpos podian generar potentes derivados de farmacos despues del proceso intracelular del conjugado. Esto podia ser un problema si los metabolitos celulares generados manifestaran efectos secundarios no deseados o no facilmente manejables. Para controlar la toxicidad de conjugados anticuerpo-farmaco, podia ser muy beneficioso usar ligantes no escindibles.

Otra desventaja principal de la mayoria de los conjugados anticuerpo-farmaco es su incapacidad para suministrar una concentraci6n suficiente de farmaco al sitio diana debido al numero limitado de antigenos diana y la citotoxicidad relativamente moderada de los farmacos canceroestaticos como: metotrexato, daunorubicina y vincristina. Para conseguir una citotoxicidad significativa, se hace necesaria la uni6n de un gran numero de moleculas de farmaco, bien directamente al anticuerpo o mediante una molecula portadora polimerica. Sin embargo, tales anticuerpos modificados de forma importante presentan a menudo una uni6n debilitada con el antigeno diana y una eliminaci6n in vivo rapida del torrente circulatorio. Asi, una alternativa es usar moleculas de farmacos mucho mas potentes tales como las descritas a continuaci6n.

Tambien se han usado en conjugaci6n ligantes no escindibles. Tienen interes en aplicaciones radioinmunoterapeuticas en particular. Esto se ha utilizado tambien en la uni6n de toxinas a anticuerpos monoclonales, en cuanto a Pseudomonas exotoxina con MAb 9.2.27 usando 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1carboxilato de maleimidasuccinimidilo (SMCC, por sus siglas en ingles) heterobifuncional (patente europea EP 306943). La toxina conjugada MAb resulta tener mayor especificidad in vitro frente a lineas celulares positivas que el

correspondiente conjugado de enlace disulfuro y asi menos t6xica en modelos de ratones. La toxicidad no especifica disminuye significativamente cuando se usa un ligante no escindible. Este ligante no escindible se ha usado en el caso de trastuzumab (Herceptina) cuya diana HER2 (ErbB) HERR2 es una diana clave y se estan investigando metodos para maximizar el efecto de usar MAbs para inhibir a este receptor. Una propuesta se dirige a aumentar la eficacia de trastuzumab (Herceptina) acoplandolo a un agente quimioterapeutico, permitiendo asi la administraci6n de tratamiento citot6xico a un nivel celular (Ranson and Sliwkowski, 63 (Supl. 1) Oncology, 17-24 (2.002)).

Existen otras versiones del reactivo SMCC, por ejemplo tambien se ha usado 4-(N-maleimidometil)ciclohexan-1carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) soluble en agua, en reacci6n de conjugaci6n. Otros ligantes no escindibles incluyen en particular S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA), SATA-SMCC, 2-iminotiazol (2IT) y 2IT-SMCC (Foulon et al, 10, Bioconjugate Chem., 867-876 (1.999)). Tambien se han usado reactivos de acoplamiento que comprenden un resto basado en haloacetilo e incluyen 4-(yodoacetil)-aminobenzoato de N-succinimidilo (SIAB) yodoacetato de N-succinimidilo (SIA), bromoacetato de N-succinimidilo (SBA) y 3-(bromoacetamido)propionato de N-succinimidilo (SBAP). Estos reactivos de entrecruzamiento forman ligantes no escindibles procedentes de restos basados en haloacetilo.

A pesar de las dificultades descritas anteriormente debido a las moleculas de farmaco, se han descrito agentes citot6xicos utiles que comprenden restos de uni6n a la celula y el grupo de farmacos citot6xicos conocidos como maitansinoides (patente de EE.UU. 5.208.020, patente de EE.UU. 5.416.064 y R. V. J. Chari, 31 Advanced Drug Delivery Reviews 89-104 (1.998)). De manera similar, tambien se han descrito agentes citot6xicos utiles que comprenden restos de uni6n a la celula y analogos y derivados del potente antibi6tico antitumoral CC-1065 (patentes de EE.UU. 5,475,092, 5,585,499 y 6,756,397).

Los derivados de tomaimicina son pirrolo[1.4]benzodiazepinas (las PBD), una clase conocida de compuestos que ejercen sus propiedades biol6gicas por medio de la uni6n covalente al N2 de guanina en el surco menor del ADN. Las PBD incluyen una serie de aglutinantes de surco menor tales como antramicina, neotramicina y DC-81. Sin embargo, la actividad antitumoral de la tomaimicina esta limitada sin embargo debido a su toxicidad no especifica para las celulas normales. De esta manera, existe la necesidad de aumentar la actividad terapeutica y disminuir los efectos t6xicos no especificos de los compuestos de tomaimicina. Los presentes autores han demostrado que esta necesidad puede satisfacerse por la liberaci6n dirigida de compuestos de tomaimicina por medio de su uni6n con agentes de uni6n a la celula. Adicionalmente, existe la necesidad de desarrollar derivados de tomaimicina que sean solubles y estables en disoluciones acuosas. Ademas, la tomaimicina no es suficientemente potente como para usarse en conjugados de agentes de uni6n a la celula.

Recientemente se han descrito algunos nuevos derivados de PBD y su actividad antitumoral en modelos preclinicos (patente internacional wO 00/12508 Y patente internacional wO 2005/085260). Sin embargo, los ensayos clinicos iniciales realizados en seres humanos indican que los compuestos de esta clase son muy t6xicos, basandose en la muy baja dosis que puede administrarse a los seres humanos (I. Puzanov, Proc. AACR-NCI-EORTC International Conference, Filadelfia, EE.UU. 2.005, Resumen #B117). Asi, se desea proporcionar derivados alternativos que muestren menos efectos secundarios sin comprometer la actividad citot6xica.

TECNICA ANTERIOR

Las solicitudes de patente internacional wO 2007/085930 y wO 2008/010101 describen derivados de tomaimicina que se pueden unir a un agente de uni6n a la celula mediante un ligante pero el ligante no es un ligante como se define para los compuestos de la invenci6n.

El articulo "Tetrahedron Letters, Vol. 29, N"40, pags. 5.105-5.108" describe derivados de tomaimicina ref. (13)-(15) sin ligante.

La solicitud de patente internacional wO 2005/085250 describe dimeros de las PBD de f6rmula general PBD-A-Y-X(Het)na-L-(Het)nb-L-(Het)nc-T-(Het')nd-L-(Het')ne-L-(Het')nf-X'-Y'-A'-PBD' en la que Het y Het' son grupos aminoheteroarileno de f6rmula -J-G-J' o J'-G-J-donde G es un heteroarileno opcionalmente sustituido, na-nf son numeros enteros entre 0 y 5, L puede ser �-alanina, glicina, acido 4-aminobutanoico o un enlace sencillo. X y X' son ambos o -NH-o -C(=O)-e Y e Y' son grupos divalentes tal que HY es un grupo alquilo, heterociclo o arilo o un enlace sencillo. A y A' se seleccionan de O, S, NH o un enlace sencillo. T es un ligante divalente de la forma -NH-Q-NH-o -C(=O)-Q-C(=O)-donde Q es un grupo divalente tal que QH es un grupo alquilo, heterociclo o arilo (opcionalmente sustituido). Los compuestos de acuerdo con la f6rmula general comprenden todos -NH-o -C(=O)-comoXyX' y -NH-Q-NH-o -C(=O)-Q-C(=O)-que no es el caso para los compuestos de la invenci6n.

La solicitud de patente internacional wO 2005/023814 describe dimeros de PBDs protegidos en el atomo de nitr6geno N10 por R10-COO-que comprende un puente -X-R''-X-en el que R'' es un grupo alquileno opcionalmente interrumpido por uno o mas heteroatomos NH o o S y/o anillos aromaticos y X es O, S o NH. No se menciona un ligante en el puente -X-R''-X-. Por otra parte, los compuestos de la invenci6n no estan protegidos en N10.

El articulo "European Journal of Medicinal Chemistry Vol. 40, N" 7, pags. 641-654" describe dimeros de PBDs ref. (38)-(40) que no comprenden ningun ligante en cuanto a los compuestos de la invenci6n.

El articulo "Expert opinion ; Monoclonal antibody-drug conjugates", publicaciones Ashley, Vol. 15, N" 9, 2.005, pags. 1.087-1.103, ISSN:1.354-3.774 no describe los compuestos de la invenci6n y el articulo "Cancer Res. 2.006, 66(8); pags. 4.426-4.433" describe maitansinoide unido a agentes de uni6n a la celula.

COMPENDIO DE LA INVENCION

La invenci6n se refiere a nuevos derivados de tomaimicina segun las reivindicaciones 1 a 2, que comprenden un ligante. Tambien se refiere a las moleculas de conjugado que comprenden uno o mas de dichos derivados de tomaimicina unidos mediante enlaces covalentes a un agente de uni6n a la celula por un grupo de enlace que esta presente en el ligante del derivado de tomaimicina.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Definiciones

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Ms : mesilato ;

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"ligantes no escindibles" significa cualquier grupo adecuado para unir mediante enlaces covalentes a dicho derivado de tomaimicina a un agente de uni6n a la celula, en los que dicho grupo no contiene grupos disulfuro, grupos acidos labiles, grupos fotolabiles, grupos labiles de peptidasa y grupos labiles de esterasa. Preferiblemente, dichos "ligantes no escindibles" comprenden un grupo carboxi o amido terminal o precursores de los mismos. El ligante no se escinde durante el proceso intracelular despues de la internalizaci6n de la molecula de conjugado dentro de la celula y proteolisis potencial del agente de uni6n a la celula;

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la expresi6n "ligable a un agente de uni6n a la celula" se refiere a los derivados de tomaimicina que comprenden al menos un grupo ligante, que a su vez comprende un grupo ligante o un precursor del mismo, adecuado para unir dichos derivados a un agente de uni6n a la celula; son grupos ligantes preferidos: carboxi, enlaces amido o precursores de los mismos;

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la expresi6n "ligado a un agente de uni6n a la celula" se refiere a la molecula conjugada que comprende al menos un derivado de tomaimicina unido a un agente de uni6n a la celula mediante un grupo ligante adecuado o un precursor del mismo; grupos ligantes preferidos son enlaces no escindibles o precursores de los mismos;

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"precursor" de un grupo dado se refiere a cualquier grupo que pueda conducir a ese grupo por cualquier reacci6n de desprotecci6n, modificaci6n quimica o acoplamiento;

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"paciente" se refiere bien a un animal, tal como un animal valioso para fines de cria, compania o conservaci6n o preferiblemente un ser humano o un nino, que padece o que puede padecer una o mas enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria.

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"cantidad terapeuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un compuesto de la presente invenci6n que es eficaz para prevenir, reducir, eliminar, tratar o controlar los sintomas de las enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria. La terminologia "controlar" pretende referirse a todos los procesos en los que puede existir un retraso, interrupci6n, detenci6n o parada de la progresi6n de las enfermedades y afecciones descritas en la presente memoria, pero no indica necesariamente una eliminaci6n total de todos los sintomas de la enfermedad o afecci6n y pretende incluir tratamiento profilactico;

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"farmaceuticamente aceptable" se refiere a los compuestos, materiales, excipientes, composiciones o formas farmaceuticas que, dentro del alcance del juicio medico, son adecuados para ponerse en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin provocar toxicidad, irritaci6n, respuesta alergica excesivas u otras complicaciones problematicas que correspondan a una relaci6n beneficio/riesgo razonable;

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"sales farmaceuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos descritos, en los que el compuesto precursor se modifica preparando sales de acidos o bases del mismo. Las sales farmaceuticamente aceptables incluyen las sales no t6xicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto precursor formadas, por ejemplo, a partir de acidos inorganicos u organicos, no t6xicos. Por ejemplo, dichas sales no t6xicas convencionales incluyen las procedentes de acidos inorganicos tales como: clorhidrico, bromhidrico, sulfurico, sulfamico, fosf6rico, nitrico y similares y las sales preparadas a partir de acidos organicos tales como: acetico, propi6nico, succinico, tartarico, citrico, metanosulf6nico, bencenosulf6nico, glucor6nico, glutamico, benzoico, salicilico, toluenosulf6nico, oxalico, fumarico, maleico, lactico y similares. Otras sales de adici6n incluyen sales de amonio tales como trometamina, meglumina, epolamina, etc., sales de metales tales como sodio, potasio, calcio, cinc o magnesio. Las sales aceptables farmaceuticamente de la presente invenci6n pueden sintetizarse a partir del compuesto precursor que contiene un resto basico o acido por metodos quimicos convencionales. En general, tales sales pueden prepararse haciendo reaccionar las formas acidas o basicas libres de estos compuestos con una cantidad estequiometrica de la base o el acido apropiado, en agua o en un disolvente organico o en una mezcla de los dos. En general, se prefieren medios no acuosos como eter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo.

Las listas de sales adecuadas se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences, 17a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1.985, p. 1418, cuya descripci6n se incorpora en la presente memoria por referencia.

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"tratar" o "tratamiento " significa invertir, atenuar, inhibir el progreso de o prevenir el trastorno o afecci6n al que se aplica dicha terminologia o uno o mas sintomas de dicho trastorno o afecci6n.

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"cantidad terapeuticamente eficaz" significa una cantidad de un compuesto/medicamento de acuerdo con la presente invenci6n eficaz para prevenir o tratar el estado patol6gico al que se hace referencia en la presente memoria;

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"farmaceuticamente" o "farmaceuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacci6n adversa, alergica u otra reacci6n desfavorable cuando se administran a un animal o a un ser humano, segun sea apropiado;

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"excipiente farmaceuticamente aceptable" incluye cualquier soporte, diluyente, adyuvante o vehiculo, tales como agentes conservantes o antioxidantes, cargas, agentes disgregantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de suspensi6n, disolventes, medios de dispersi6n, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isot6nicos y para retrasar la absorci6n y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmaceuticas activas es bien conocido en la tecnica. Excepto en la medida en que algun medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se considera su uso en las composiciones terapeuticas. En las composiciones tambien pueden incorporarse ingredientes activos suplementarios como combinaciones terapeuticas adecuadas.

Derivados de tomaimicina

La invenci6n se basa en la sintesis de nuevos derivados de tomaimicina que retienen alta citotoxicidad y que pueden enlazarse eficazmente a agentes de uni6n a la celula con ligantes no escindibles, demostrando dichos conjugados alta potencia en la destrucci6n de celulas tumorales. Previamente se ha demostrado que la uni6n de farmacos muy citot6xicos a anticuerpos usando una uni6n escindible, tal como un enlace disulfuro, asegura la liberaci6n de farmacos totalmente activos dentro de la celula y que tales conjugados son citot6xicos con especificidad de antigeno (documentos US 6.340.701; US 6.372.738; US 6.436.931). Sin embargo, la tecnica revela que es extremadamente dificil modificar los farmacos existentes sin disminuir su potencial citot6xico. La invenci6n descrita resuelve este problema modificando los derivados de tomaimicina descritos con restos quimicos. Como resultado, los nuevos derivados de tomaimicina descritos conservan y en algunos casos podian incluso aumentar la potencia citot6xica de los derivados de tomaimicina. Los complejos agente de uni6n a la celula-derivado de tomaimicina permiten la medici6n completa de la acci6n citot6xica de los derivados de tomaimicina que se van a aplicar de forma dirigida contra celulas no deseadas s6lo, evitando por lo tanto los efectos secundarios debidos al dano en las celulas sanas no diana. Asi, la invenci6n proporciona agentes utiles para la eliminaci6n de celulas enfermas o anormales que deben destruirse o lisarse, tales como las celulas tumorales (particularmente, las celulas de tumor s6lido).

Tomaimicina

El agente citot6xico de acuerdo con la presente invenci6n comprende uno o mas derivados de tomaimicina, opcionalmente ligables o ligados a un agente de uni6n a la celula mediante un grupo ligante no escindible. El grupo ligante es parte de un resto quimico que se une por enlaces covalentes a un derivado de tomaimicina por metodos convencionales.

La invenci6n se refiere a los derivados de tomaimicina de las reivindicaciones 1-2.

El ligante comprende una cadena terminada por un grupo ligante que no contiene ningun grupo escindible tal como un grupo disulfuro, un grupo acido labil, un grupo fotolabil, un grupo labil de peptidasa y un grupo labil de esterasa. El grupo ligante terminal no contiene el grupo -S-V en el que V es H, un grupo protector de tiol tal como COR, R20 o SR20, R20 siendo H, metilo, alquilo, un grupo cicloalquilo opcionalmente sustituido, arilo, heteroarilo o heterociclo. El ligante no es ninguno descrito ni en la patente internacional wO 2007/085930 ni en la patente internacional wO 2008/010101. El grupo ligante terminal de los derivados de tomaimicina de la invenci6n es preferiblemente un grupo carboxi o amida, en el extremo terminal de la cadena lateral. La cadena lateral puede ser lineal o ramificada, aromatica o heterociclica. Los especialistas en la materia pueden identificar facilmente cadenas laterales adecuadas. Los ligantes preferidos constan de cadenas lineales que contienen funciones solubilizantes tales como: amino, hidroxi, eter, grupos sulf6nico y carboxilico.

Las sales farmaceuticamente aceptables, hidratos o sales hidratadas o las estructuras cristalinas polim6rficas de los compuestos junto con los is6meros 6pticos, racematos, diastereomeros o enanti6meros, tambien forman parte de la invenci6n. Cuando el compuesto esta en forma de un i6n (por ej. sulfonato); puede estar presente el contrai6n (por ej. Na+ o K+).

El ligante puede encontrarse mas particularmente en los ejemplos adjuntos en la presente memoria. El grupo particular

tiende a aumentar la reactividad de la funci6n ester.

Los compuestos de la invenci6n se seleccionan del grupo que consiste en :

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acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-butirico ;

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acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-acetico;

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acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico;

•

acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4] benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenil)-hex-5-inoico;

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acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico;

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acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico;

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acido N-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico;

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acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-metiliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenil)-propanoico;

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acido (2-{2-[2-(2-{3-[3,5-Bis-(7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-acetico;

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acido (3-{2-[2-(2-{3-[3,5-Bis-(7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoico;

asi como los correspondientes esteres o esteres N-hidroxisuccinimidilicos

o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polim6rficas de estos compuestos o sus is6meros 6pticos, racematos, diastere6meros o enanti6meros.

Los is6meros geometricos y estereois6meros de los compuestos de f6rmula general (I) o (I') tambien son parte de la invenci6n.

Se sabe que el doble enlace N10, C11 de los derivados de tomaimicina puede convertirse facilmente de manera reversible en los aductos de imina correspondientes en presencia de agua, un alcohol, un tiol, una amina primaria o secundaria, urea y otros nucle6filos. Este proceso es reversible y puede regenerar facilmente los derivados de tomaimicina correspondientes en presencia de un agente deshidratante, en un disolvente organico no pr6tico, al vacio o a temperaturas elevadas (Z. Tozuka, 36, J. Antibiotics, 276 (1.983).

Acerca de la preparacion de los compuestos

Los compuestos pueden sintetizarse por aplicaci6n o adaptaci6n de los metodos descritos a continuaci6n o variaciones en los mismos que puedan apreciarse por los especialistas en la materia. Las modificaciones y sustituciones apropiadas seran obvias y se conoceran bien o podran obtenerse facilmente a partir de la bibliografia cientifica por los expertos en la tecnica. En particular, dichos metodos pueden encontrarse en R.C. Larock, Comprehensive Organic Transformations, wiley-VCH Publishers, 1.999.

Se apreciara que los compuestos de la presente invenci6n pueden contener uno o mas atomos de carbono asimetricamente sustituidos y pueden aislarse en formas 6pticamente activas o racemicas. Por lo tanto, se desean todas las formas quirales, diastereomericas, racemicas y todas las formas isomericas geometricas de una estructura, a menos que se indique especificamente la estereoquimica o la forma isomerica especifica. Se sabe bien en la tecnica c6mo preparar y aislar dichas formas 6pticamente activas. Por ejemplo, pueden separarse mezclas de estereois6meros por tecnicas estandar que incluyen, pero no se limitan a, resoluci6n de formas racemicas, cromatografia normal, de fase reversa y quiral, formaci6n de sales preferencial, recristalizaci6n y similares o por sintesis quiral bien a partir de materiales de partida quirales o por sintesis deliberada de centros quirales diana.

En las reacciones descritas a continuaci6n en la presente memoria, puede ser necesario proteger grupos funcionales reactivos, por ejemplo grupos hidroxi, amino, imino, tio o carboxi, cuando se desean en el producto final, para evitar su participaci6n no deseada en las reacciones. Pueden usarse grupos protectores convencionales de acuerdo con la practica estandar, para ejemplos, veanse T. w. Greene y P. G. M. wuts in Protective Groups in Organic Chemistry, 3a ed., John wiley and Sons, 1999; J. F. w. McOmie en Protective Groups in Organic Synthesis, Plenum Press, 1973.

Algunas reacciones pueden realizarse en presencia de una base. No existe ninguna restricci6n particular sobre la naturaleza de la base que se tiene que usar en esta reacci6n y puede usarse aqui igualmente cualquier base usada convencionalmente en reacciones de este tipo, con la condici6n de que no afecte de forma adversa a otras partes de la molecula. Los ejemplos de bases adecuadas incluyen: hidr6xido de sodio, carbonato de potasio, trietilamina, hidruros de metales alcalinos, tales como hidruro de sodio e hidruro de potasio; compuestos de alquil-litio, tales como metil-litio y butil-litio; y alc6xidos de metales alcalinos, tales como met6xido de sodio y et6xido de sodio.

Habitualmente, las reacciones se realizan en un disolvente adecuado. Pueden usarse varios disolventes, con la condici6n de que no afecten de forma adversa a la reacci6n o a los reactivos implicados. Los ejemplos de disolventes adecuados incluyen: hidrocarburos, que pueden ser hidrocarburos aromaticos, alifaticos o cicloalifaticos, tales como hexano, ciclohexano, benceno, tolueno y xileno; amidas, tales como dimetilformamida; alcoholes tales como etanol y metanol y eteres, tales como eter dietilico y tetrahidrofurano.

Las reacciones pueden realizarse en un amplio intervalo de temperaturas. En general, se puede realizar la reacci6n a una temperatura de -20°C a 150°C (mas preferiblemente de aproximadamente la temperatura ambiente a 100°C). El tiempo requerido para la reacci6n tambien puede variar ampliamente, dependiendo de muchos factores, en particular de la temperatura de la reacci6n y de la naturaleza de los reactivos. Sin embargo, si la reacci6n se realiza en las condiciones preferidas indicadas anteriormente, normalmente sera suficiente un periodo de 3 horas a 20 horas.

El compuesto preparado de esta manera puede recuperarse de la mezcla de reacci6n por medios convencionales. Por ejemplo, los compuestos pueden recuperarse mediante retirada por destilaci6n del disolvente de la mezcla de reacci6n o, si es necesario despues de la retirada por destilaci6n del disolvente de la mezcla de reacci6n, vertiendo el residuo en agua seguido de la extracci6n con un disolvente organico inmiscible en agua y retirando por destilaci6n el disolvente del extracto. Ademas, si se desea, el producto puede purificarse adicionalmente mediante diversas tecnicas bien conocidas, tales como recristalizaci6n, reprecipitaci6n o las diversas tecnicas de cromatografia, principalmente cromatografia en columna o cromatografia preparativa de capa fina.

La tomaimicina y el mon6mero PBD son generalmente conocidos, como se describe por ejemplo en las patentes internacionales wO 00/12508, wO 00/12507, wO 2005/040170, wO 2005/085260 o comercialmente disponibles y/o estan disponibles por sintesis total (M. Mori et al, 42 Tetrahedron, 3793-3806, 1986) o producidos por especies Streptomyces, en particular siguiendo el procedimiento de la patente francesa FR 1.516.743 o se puede preparar por aplicaci6n o adaptaci6n de los procedimientos ilustrativos dados en los ejemplos.

A continuaci6n se proporciona un esquema ejemplar para una ruta:

Acerca de la molecula conjugada

La presente invenci6n tambien se refiere a una molecula conjugada que comprende al menos un derivado de tomaimicina unido mediante enlaces quimicos a un agente de uni6n a la celula por el grupo de uni6n del ligante. El enlace quimico es preferiblemente un enlace covalente. Dicho conjugado comprende un derivado o mas de tomaimicina de acuerdo con la invenci6n unido por enlaces covalentes al agente de uni6n a la celula por el grupo de uni6n del ligante del derivado de tomaimicina. Como ejemplo representativo, dicho conjugado comprende un derivado de tomaimicina de la invenci6n unido mediante enlaces covalentes al agente de uni6n a la celula por el grupo terminal -CO-Z'R'' del ligante. Dicho grupo ligante se une mediante enlaces covalentes al agente de uni6n a la celula con el ligante del derivado de tomaimicina.

La molecula de conjugado se describe en las reivindicaciones 3-7.

Preferiblemente, el ligante esta unido al agente de uni6n a la celula por una funci6n reactiva por, por ejemplo, funciones tiol y amino del agente de uni6n a la celula que va de enlaces disulfuro reducidos y restos lisina respectivamente. Mas particularmente, dicho derivado esta unido por el grupo -CO-a la funci6n amino del resto lisina de dicho agente de uni6n a la celula, de manera que se forme un enlace amido.

Los agentes de uni6n a la celula pueden ser de cualquier tipo e incluyen peptidos y no peptidos. En general, pueden ser anticuerpos (especialmente anticuerpos monoclonales) o un fragmento de un anticuerpo que contenga al menos un sitio de uni6n, linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, moleculas de transporte de nutrientes (tales como transferrina) o cualquier otra molecula o sustancia que se une a celulas. Los ejemplos mas especificos de agentes que se unen a celulas que se pueden usar incluyen: anticuerpos monoclonales; anticuerpos quimericos; anticuerpos humanizados; anticuerpos totalmente humanos; anticuerpos monocatenarios; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv {Parham, 131 J. Immunol. 2.895-2.902 (1.983); Spring et al, 113 J. Immunol. 470-478 (1974); Nisonoff et al, 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960)}; interferones; peptidos; linfocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; hormonas tales como insulina, TRH (hormonas liberadoras de tirotropina), MSH (hormona estimuladora de melanocitos), hormonas esteroideas, tales como andr6genos y estr6genos; factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGFa, factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF y GM-CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155 -158 (1.984)}; vitaminas, tales como folato y transferrina {O'Keefe et al, 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1.985)}.

La expresi6n "agente de uni6n a la celula" tambien incluye agentes de uni6n a la celula modificados, en la que dicho agente de uni6n a la celula es modificado por un agente modificador para mejorar la reactividad de dicho agente de uni6n a la celula por el grupo de uni6n del ligante del derivado de tomaimicina.

La tecnologia de los anticuerpos monoclonales permite la producci6n de agentes que se unen a celulas extremadamente selectivos en forma de anticuerpos monoclonales especificos. Son particularmente bien conocidas en la tecnica las tecnicas para crear anticuerpos monoclonales producidos por inmunizaci6n de ratones, ratas, hamsteres o cualquier otro mamifero con el antigeno de interes tal como la celula diana intacta, antigenos aislados a partir de la celula diana, virus enteros, virus enteros atenuados y proteinas virales tales como proteinas de la cubierta viral.

La selecci6n del agente que se une a celulas apropiado se elige dependiendo de la poblaci6n celular particular que se vaya a fijar como diana, pero en general se prefieren los anticuerpos monoclonales si esta disponible uno apropiado. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une especificamente al antigeno CD33 {J. D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y puede usarse si las celulas diana expresan CD33 como en la enfermedad de la leucemia miel6gena aguda (AML). De manera similar, el anticuerpo monoclonal anti

B4 es una IgG1 murina que se une al antigeno CD19 en celulas B {Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} y puede usarse si las celulas diana son celulas B o celulas enfermas que expresan este antigeno tal como en linfoma no-Hodgkin o leucemia linfoblastica cr6nica. Como se ha indicado anteriormente, los anticuerpos MY9 y anti-B4 pueden ser murinos, quimericos, humanizados o totalmente humanos.

Ademas, GM-CSF que se une a las celulas mieloides puede usarse como agente que se une a celulas para unirse a celulas enfermas de la leucemia miel6gena aguda. IL-2, que se une a celulas T activadas, puede usarse para la prevenci6n del rechazo de injertos trasplantados, para la terapia y prevenci6n de la enfermedad de injerto contra el anfitri6n y para el tratamiento de la leucemia aguda de celulas T. MSH, que se une a los melanocitos, puede usarse para el tratamiento de melanoma.

Ejemplos de anticuerpos monoclonales adecuados que se pueden usar para preparar la molecula conjugada pueden ser hu2H11 (registrada como PTA-7662 por ATCC), uno de huMy9-6 descrito en la patente internacional wO 2004/043344, huDS6 descrito en la patente internacional wO 2005/009369 o uno descrito en las patentes internacionales wO 2008/047242, wO 2005/061541 o wO 02/16101.

Los derivados de tomaimicina pueden estar unidos a un anticuerpo u otro agente de uni6n a la celula por una funci6n de tipo amida. Preferiblemente, los derivados se sintetizan para que contengan una funci6n carboxilica y despues uno o mas derivados que contienen acido carboxilico estan unidos cada uno mediante enlaces covalentes al agente de uni6n a la celula por un enlace amido.

Son conjugados representativos de la invenci6n anticuerpo-derivado de tomaimicina, fragmento de anticuerpoderivado de tomaimicina, factor de crecimiento epidermico (EGF, por sus siglas en ingles)-derivado de tomaimicina, hormona estimuladora de melanocitos (MSH, por sus siglas en ingles)-derivado de tomaimicina, hormona estimuladora del tiroides (TSH, por sus siglas en ingles)-derivado de tomaimicina, estr6geno-derivado de tomaimicina, analogo de estr6geno-derivado de tomaimicina, andr6geno-derivado de tomaimicina, analogo de andr6geno-derivado de tomaimicina y folato-derivado de tomaimicina. Los conjugados se pueden purificar por HPLC

o por filtraci6n en gel.

Preferiblemente, los conjugados anticuerpo monoclonal -o agente de uni6n a la celula -derivado de tomaimicina, son los que estan unidos mediante un enlace amido, como se ha indicado anteriormente, que son capaces de liberar los derivados de tomaimicina. Se pueden preparar conjugados usando derivados de N-hidroxisuccinimida de la funci6n carboxilica en el terminal del ligante de dimeros de tomaimicina. Por este metodo se preparan facilmente conjugados que contienen 1 a 10 farmacos derivados de tomaimicina unidos por un enlace amido.

Mas especificamente, una disoluci6n de anticuerpo a una concentraci6n de 8 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene fosfato de potasio 0,05 M, cloruro de sodio 0,05 M y acido etilendiaminotetra-acetico 2 mM (AEDT), a pH 8 es tratado con un exceso molar de 5 veces de una disoluci6n del derivado de N-hidroxisuccinimida de un dimero de tomaimicina en dimetilacetamida (DMA), tal que la concentraci6n final de DMA en el tamp6n sea 20%. La mezcla de reacci6n se agita a la temperatura ambiente (ta), durante 70 min. El conjugado anticuerpo -derivado de tomaimicina se purifica y se libera del farmaco sin reaccionar y otro material de bajo peso molecular por filtraci6n en gel a traves de una columna de Sephadex G-25 o Sephacryl S300 o Superdex 200. Tambien se puede dializar la muestra durante la noche en un tamp6n de pH 6,5 para purificar ademas el producto. El numero de restos de derivado de tomaimicina unidos por molecula de anticuerpo se puede determinar midiendo la relaci6n de la absorbancia a 320 nm y a 280 nm. Por este metodo se pueden unir mediante un enlace amido un promedio de 1-10 moleculas de derivado de tomaimicina/molecula de anticuerpo.

El efecto de la conjugaci6n sobre la afinidad de uni6n por las celulas que expresan el antigeno se puede determinar utilizando los metodos descritos previamente por Liu et al., 93 Proc. Natl. Acad. Sci 8618-8623 (1.996). La citotoxicidad de los derivados de tomaimicina y sus conjugados de anticuerpo para lineas celulares se puede medir por retro-extrapolaci6n de las curvas de proliferaci6n celular, como se describe en Goldmacher et al., 135 J. Immunol. 3648-3651 (1.985). La citotoxicidad de estos compuestos contra lineas de celulas adherentes se puede determinar por ensayos clonogenicos, como se describe en Goldmacher et al., 102 J. Cell Biol. 1.312-1.319 (1.986).

Son conjugados representativos de la invenci6n los derivados de tomaimicina con anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, factor de crecimiento epidermico (EGF, por sus siglas en ingles), hormona estimuladora de melanocitos (MSH), hormona estimuladora del tiroides (TSH), estr6genos, analogos de estr6genos, andr6genos y analogos de andr6genos.

A continuaci6n se describen ejemplos representativos de la preparaci6n de diversos conjugados de derivados y agentes de uni6n a la celula.

Ligantes de amida: Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal MY9 es un anticuerpo IgG1 murino que se une especificamente al antigeno CD33 {J. D. Griffin et al 8 Leukemia Res., 521 (1984)} y puede usarse si las celulas diana expresan CD33 como en la enfermedad de la leucemia miel6gena aguda (AML). De manera similar, el anticuerpo monoclonal anti-B4 es una IgG1 murina que se une al antigeno CD19 en celulas B {Nadler et al, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} y puede usarse si las celulas diana son celulas B o celulas enfermas que expresan este antigeno tal como en linfoma no-Hodgkin o leucemia linfoblastica cr6nica.

Ademas, GM-CSF que se une a las celulas mieloides puede usarse como agente que se une a celulas para unirse a celulas enfermas de la leucemia miel6gena aguda. IL-2, que se une a celulas T activadas, puede usarse para la prevenci6n del rechazo de injertos trasplantados, para la terapia y prevenci6n de la enfermedad de injerto contra el anfitri6n y para el tratamiento de la leucemia aguda de celulas T. MSH, que se une a los melanocitos, puede usarse para el tratamiento de melanoma.

El anticuerpo u otro agente de uni6n a la celula se hace reaccionar con el derivado del acido de la N-hidroxisuccinimida para producir un conjugado unido a amida.

Los conjugados preparados por los metodos anteriores pueden purificarse por tecnicas de cromatografia convencionales tales como exclusi6n por tamano, cromatografia de adsorci6n incluyendo, pero no limitandose a, intercambio i6nico, cromatografia de interacci6n hidr6foba, cromatografia de afinidad, cromatografia sobre hidroxiapatito ceramico o en Porapak o por HPLC. Tambien puede usarse la purificaci6n por dialisis o diafiltraci6n.

Preferiblemente, los conjugados entre anticuerpos monoclonales o agentes de uni6n a la celula y derivados de la presente invenci6n son los que se unen a traves de un enlace amido, como se ha descrito anteriormente. Dichos conjugados de uni6n a la celula se preparan por metodos conocidos tales como la modificaci6n de moleculas de farmacos unibles que poseen una funci6n carboxilica para conseguir el derivado de acido de la N-hidroxisuccinimida. Los grupos carboxilicos activados resultantes acilan despues los restos que contienen lisina del anticuerpo para producir conjugados unidos a amida. Por este metodo se preparan facilmente conjugados que contienen de 1 a 10 derivados unidos por un puente amido.

De acuerdo con un aspecto preferido, el agente de uni6n a la celula es un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal. De acuerdo con otro aspecto preferido, el agente de uni6n a la celula es un fragmento de anticuerpo con especificidad de antigeno, tal como sFV, Fab, Fab' o F(ab')2.

Acerca del uso de la molecula conjugada

La presente invenci6n tambien se refiere a las composiciones farmaceuticas que comprenden una molecula conjugada de la invenci6n o un derivado de tomaimicina como se defini6 anteriormente junto con un excipiente farmaceuticamente aceptable. La composici6n farmaceutica se describe en la reivindicaci6n 12.

La presente invenci6n tambien se refiere a un metodo in vitro o ex vivo para eliminar o inhibir el crecimiento de las celulas, preferiblemente poblaciones celulares seleccionadas, que comprende poner en contacto las celulas diana o el tejido que contiene celulas diana con una cantidad eficaz de la composici6n farmaceutica. Las poblaciones celulares seleccionadas son las celulas cancerosas y/o proliferativas.

La presente invenci6n tambien se refiere al uso de una molecula de conjugado o un derivado de tomaimicina como se defini6 anteriormente para la preparaci6n de un medicamento para tratar el cancer. El uso como se describe en la reivindicaci6n 13.

El metodo para inhibir el crecimiento de poblaciones celulares seleccionadas puede ponerse en practica in vitro, o ex vivo. Los ejemplos de usos in vitro incluyen tratamientos de cultivos celulares para destruir todas las celulas excepto variantes deseadas que no expresen el antigeno diana o para destruir las variantes que expresen un antigeno no deseado. Las condiciones de uso in vitro no clinico se determinan facilmente por el experto en la tecnica. Los ejemplos de usos ex vivo incluyen tratamientos de medula 6sea aut6loga antes de su trasplante en el mismo paciente para destruir celulas enfermas o malignas; tratamientos de medula 6sea antes de su trasplante para destruir celulas T competentes y prevenir la enfermedad de injerto contra el anfitri6n (GVHD). El tratamiento ex vivo clinico para eliminar celulas tumorales o celulas linfoides de medula 6sea antes del trasplante aut6logo en el tratamiento de cancer o en el tratamiento de enfermedad autoinmune o para eliminar celulas T y otras celulas linfoides de medula 6sea o de tejido alogenico antes del trasplante para prevenir la GVHD, puede realizarse como se indica a continuaci6n. Se recoge medula 6sea del paciente u otro individuo y despues se incuba en un medio que contiene suero al que se anade el agente citot6xico de la invenci6n, en un intervalo de concentraciones de aproximadamente 10 IM a 1 pM, durante aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 48 horas a aproximadamente 37°C. Las condiciones exactas de concentraci6n y tiempo de incubaci6n (= dosis) se determinan facilmente por el experto en la tecnica. Despues de la incubaci6n, las celulas de la medula 6sea se lavan con medio que contiene suero y se devuelven al paciente por infusi6n i.v. segun metodos conocidos. En circunstancias en las que el paciente recibe otro tratamiento tal como un curso de quimioterapia ablativa o irradiaci6n de todo el cuerpo entre el momento de la recolecci6n de la medula y la reinfusi6n de las celulas tratadas, las celulas de medula 6sea tratadas se conservan congeladas en nitr6geno liquido usando un equipo medico estandar. Para uso in vivo clinico, el agente citot6xico de la invenci6n se suministrara como disoluciones que se ensayan con respecto a la esterilidad y con respecto a los niveles de endotoxinas o como un s6lido liofilizado que puede redisolverse en agua esteril para inyecci6n. A continuaci6n se proporcionan ejemplos de protocolos adecuados de administraci6n de conjugados. Los conjugados se administran semanalmente durante 6 semanas como un bolo i.v. Las dosis de bolo se administran en 50 a 400 ml de disoluci6n salina normal a la que puede anadirse albumina de suero humano (por ej., de 0,5 a 1 ml de una disoluci6n concentrada de albumina de suero humano, 100 mg/ml). Las dosificaciones seran de aproximadamente 50 Ig a 10 mg/kg de peso corporal por semana, i.v. (intervalo de 10 Ig a 100 mg/kg por

inyecci6n). Seis semanas despues del tratamiento, el paciente puede recibir un segundo tratamiento. El experto en la tecnica puede determinar los protocolos clinicos especificos con respecto a la ruta de administraci6n, excipientes, diluyentes, dosificaciones, tiempos, etc., cuando lo justifique la situaci6n clinica.

Los ejemplos de condiciones medicas que pueden tratarse de acuerdo con los metodos in vivo o ex vivo de destrucci6n de poblaciones celulares seleccionadas incluyen tumor maligno de cualquier tipo incluyendo, por ejemplo, cancer de pulm6n, mama, colon, pr6stata, rin6n, pancreas, ovarios y 6rganos linfaticos; melanomas; enfermedades autoinmunes, tales como lupus sistemico, artritis reumatoide y esclerosis multiple; rechazos de injerto tales como rechazo de trasplante renal, rechazo de trasplante hepatico, rechazo de trasplante pulmonar, rechazo de trasplante cardiaco y rechazo de trasplante de medula 6sea; enfermedad del injerto frente al anfitri6n; infecciones viricas tales como infecci6n por CMV, infecci6n por VIH, SIDA etc.; infecci6n bacteriana e infecciones parasitarias tales como giardiasis, amebiasis, esquistosomiasis y otras, como determine un experto en la tecnica.

Una cantidad terapeuticamente eficaz puede determinarse facilmente por el medico a cargo del caso, como especialista en la materia, por medio del uso de tecnicas convencionales y observando los resultados obtenidos en circunstancias analogas. Para determinar la cantidad terapeuticamente eficaz, el medico a cargo del diagn6stico considera varios factores que incluyen, pero no se limitan a: la especie de sujeto; su tamano, edad y salud general; la enfermedad especifica implicada; el grado de complicaci6n o la gravedad de la enfermedad; la respuesta del sujeto individual; el compuesto particular administrado; el modo de administraci6n; las caracteristicas de biodisponibilidad de la preparaci6n administrada; el regimen posol6gico seleccionado; el uso de medicaci6n concomitante; y otras circunstancias relevantes.

La cantidad que se requiere para conseguir el efecto biol6gico deseado variara dependiendo de varios factores, incluyendo las caracteristicas quimicas (por ej., hidrofobia) de los compuestos empleados, la potencia de los compuestos, el tipo de enfermedad, la especie a la que pertenece el paciente, el estado de enfermedad del paciente, la via de administraci6n, la biodisponibilidad del compuesto por la via elegida, todos los factores que dictan las cantidades de dosificaci6n requeridas, la liberaci6n y el regimen que se va a administrar.

En terminos generales, los compuestos de esta invenci6n pueden proporcionarse en una disoluci6n acuosa de tamp6n fisiol6gico que contiene de 0,1 a 10 % p/v de compuesto para administraci6n parenteral. Los intervalos de las dosis tipicas son de 1 Ig/kg a 0,1 g/kg de peso corporal al dia; un intervalo de dosis preferido es de 0,01 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal al dia o una dosis equivalente en un nino. La dosificaci6n preferida de farmaco que se tiene que administrar probablemente dependera de variables tales como el tipo y grado de progresi6n de la enfermedad o trastorno, el estado de salud general del paciente particular, la eficacia biol6gica relativa del compuesto seleccionado, la formulaci6n del compuesto, la via de administraci6n (intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutanea u otra), las propiedades farmacocineticas del compuesto por la via de administraci6n elegida y la velocidad (embolada o infusi6n continua) y el programa de administraci6n (numero de repeticiones en un periodo de tiempo dado).

Las composiciones pueden administrarse convenientemente en forma de dosificaci6n unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica farmaceutica, por ejemplo, como se describe en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed.; Ed. Gennaro, A. R.; Lippincott williams & wilkins: Filadelfia, PA, 2.000.

Las preparaciones liquidas para administraci6n parenteral incluyen disoluciones, suspensiones y emulsiones, acuosas o no acuosas, esteriles. Las composiciones liquidas tambien pueden incluir agentes aglutinantes, tampones, conservantes, agentes quelantes, edulcorantes, aromatizantes y colorantes y similares. Los disolventes no acuosos incluyen: alcoholes, propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y esteres organicos tales como oleato de etilo. Los vehiculos acuosos incluyen mezclas de alcoholes y agua, medios tamponados y disoluci6n salina. En particular, pueden ser excipientes utiles para controlar la liberaci6n de los compuestos activos, los polimeros biocompatibles y biodegradables de lactida, copolimeros de lactida/glicolida o copolimeros de polioxietileno-polioxipropileno. Los vehiculos intravenosos pueden incluir fluidos y agentes para reponer nutrientes, agentes para reponer electr6litos tales como los basados en dextrosa de Ringer y similares. Otros sistemas de liberaci6n parenteral que podrian ser utiles para estos compuestos activos incluyen particulas de copolimero de etileno-acetato de vinilo, bombas osm6ticas, sistemas de infusi6n implantables y liposomas.

FIGURAS

Fig. 1: citotoxicidad in vitro del ester metilico del acido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico del ej. 1 ;

Fig. 2 : citotoxicidad in vitro del ester metilico del acido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acetico del ej. 2 ;

Fig. 3 : potencia de la citotoxicidad in vitro de compuestos 8 (IGP08) y 9 (IGP08-OMe) del ej. 8 ;

Fig. 4 representa los analisis de Espectro de Masas del conjugado huMy9-6 desglucosilado -4-(3,5-Bis-[(S)-2-et(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo (con 2,1 Farmaco/Ab por UV que es 2,1 derivado de tomaimicina por 1 anticuerpo, cuando se determina por UV) del ej. 11 ;

Fig. 5: Analisis del Espectro de Masas del conjugado huB4 desglucosilado -4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo (4,48 Farmaco/Ab por UV) del ej. 12 ;

Fig. 6 : Analisis MS de conjugado hu2H11 desglucosilado -4 -(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo (3,74 Farmaco/Ab por UV) del ej. 13 ;

Fig. 7: Analisis MS de conjugado huMy9-6 -3 -(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo (4,8 Farmaco/Ab por UV) del ej. 14 ;

Fig. 8: Analisis MS de conjugado hu2H11 -3 -(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo (4,08 Farmaco/Ab por UV) del ej. 15 ;

Fig. 9: Analisis MS de huB4-IGP08 desglucosilado (compuesto del ej. 18) ;

Fig. 10: propiedades de uni6n comparativas de huMy9-6 desnudo y huMy9-6-IGP08 (compuesto del ej.18) al antigeno CD33 ;

Fig. 11: potencia de la citotoxicidad in vitro de huB4-IGP08 (compuesto del ej. 18) frente a celulas Ramos (Ag-) y HL60/QC (Ag+);

Fig. 12: Analisis MS de huB4-IGP08 desglucosilado (3,1 Farmaco/Ab por UV) del ej. 19) ;

Fig. 13: propiedades de la citotoxicidad de huB4-IGP08 (compuesto del ej. 19) frente a celulas BJAB (Ag+), Ramos (Ag+) y MOLT-4 (Ag-);

Fig. 14: propiedades de uni6n comparativas de huB4 desnudo y huB4-IGP08 (compuesto del ej.19) ;

Fig. 15 : Analisis MS de hu2H11-IGP13 desglucosilado (4,7 Farmaco/Ab por UV) del ej. 21;

Fig. 16: propiedades de la citotoxicidad de hu2H11-IGP13 (compuesto del ejemplo 21) contra celulas PC3 (Ag+), MDA-MB-231 (Ag+) y SK-MEL-28 (Ag-) ;

Fig. 17: propiedades de la citotoxicidad del ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico del ej. 5 ;

Fig. 18: propiedades de la citotoxicidad del ester metilico del acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico del ej. 6 ;

Fig. 19: propiedades de la citotoxicidad del ester metilico del acido N-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico del ej. 7 ;

Fig. 20 : datos de la citotoxicidad in vitro para conjugado huMy9-6 -4 -(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo del ej.11 ;

Fig. 21: datos de la citotoxicidad in vitro para conjugado huB4 -4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo del ej. 12 ;

Fig. 22: datos de la citotoxicidad in vitro para conjugado hu2H11 -4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo del ej. 13 ;

Fig. 23 : datos de la citotoxicidad in vitro para conjugado huMy9-6 - 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo del ej. 14 ;

Fig. 24: datos de la citotoxicidad in vitro para conjugado hu2H11 -3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo del ej. 15.

Parte experimental

Metodo A1: Cromatografia Liquida de Alta Presion -Espectrometria de Masas (LCMS)

Se usa un software Micromass MassLynx y el analisis se realiza en un HPLC waters Alliance con una columna wATERS XBridge C18 de 3,5 Im (100x3 mm) usando eluci6n en gradiente con una mezcla de (A) metanol y (B) agua/acido f6rmico al 0,1% (gradiente: 5% de A: 95% de B hasta 95% de A: 5% de B durante 10 minutos, 95% de A: 5%de B disminuyendo a 5% de A: 95% de B durante 1 min, 5% de A: 95% de B durante 2 min) con un caudal de 1,1 ml/min; espectr6metro waters-Micromass Plataforma II con Electronebulizaci6n (ionizaci6n positiva y negativa); Serie de Diodos en linea (190-500 nm); detector auxiliar Sedere (Francia) detector Evaporativo de Luz Dispersa (ELS) Modelo SEDEX 85.

Metodo A2: Cromatografia Liquida de Alta Presion -Espectrometria de Masas (LCMS)

Se usa un software Micromass MassLynx y el analisis se realiza en un HPLC serie Agilent 1100 con una columna XBridge C18 de 2,5 Im (50x3 mm) usando eluci6n en gradiente con una mezcla de (A) acetonitrilo y (B) agua/acido f6rmico al 0,1% (gradiente: 5% de A: 95% de B hasta 100% de A durante 5 minutos, 100% de A durante 0,5 min, 100% de A disminuyendo a 5% de A: 95% de B durante 1 min, 5% de A: 95% de B durante 0,5 min) con un caudal de 1,1 ml/minuto; espectr6metro waters-Micromass ZQ con Electrospray (ionizaci6n positiva y negativa); Serie de Diodos en linea (210-254 nm).

Metodo A3: Cromatografia Liquida de Alta Presion -Espectrometria de Masas (LCMS)

El analisis se lleva a cabo en un waters UPLC-SQD con una columna ACQUITY BEH C18 de 1,7 Im - 2,1x50 mm, a 50"C, usando eluci6n en gradiente con una mezcla de (A) H2O / acido f6rmico al 0.1 % y (B) CH3CN / acido f6rmico al 0,1 % (gradiente : 95% de A: 5% de B disminuyendo a 50% de A: 50% de B durante 0.8 min, 50% de A: 50% de B disminuyendo a 100% de B durante 1,2 min, 100% de B durante 1,85 min, 100% de B hasta 95% de A: 5% de B durante 1,95 min) con un caudal de 1 ml/minuto; Electrospray (ionizaci6n positiva y/o negativa).

Metodo A4 : Cromatografia Liquida de Alta Presion -Espectrometria de Masas (LCMS)

El analisis se lleva a cabo en un espectr6metro wayers ZQ con una columna XBridge C18 de 2,5 Im (50x3 mm), a 70"C, usando eluci6n en gradiente con una mezcla de (A) acetonitrilo y (B) agua / acido f6rmico al 0,1 % (gradiente : 5% de A: 95% B hasta 100% A durante 5,3 min, 100% A durante 5,5 min, 5% A : 95% de B durante 6,3 min) con un caudal de 0,9 ml/min; Electrospray (ionizaci6n positiva y/o negativa).

Metodo B: Espectro de Resonancia Magnetica Nuclear de 1H (RMN)

Los espectros de RMN de 1H se registraron o en un espectr6metro BRUKER AVANCE DRX -500, un BRUKER AVANCE DRX -400 o un espectr6metro BRUKER AVANCE DRX -300. Se registraron los espectros de RMN de 13C indicados en un espectr6metro BRUKER AVANCE DRX -300

Metodo C: Espectros de masas por Ionizacion Quimica (Cl)

Los espectros Cl se registraron usando un espectr6metro de masas wATERS GCT (amoniaco).

Metodo D: Espectro de masas por Ionizacion Quimica (CI) Los espectros de masas CI se registraron usando un espectrometro de masas FINNIGAN SSQ 7000 (amoniaco)

Ejemplo 1 : Se puede preparar ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico como sigue :

A una suspensi6n de acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico (11,3 mg) en tetrahidrofurano (0,4 ml) se anadi6 carbonato de N,N'-disuccinimidilo (7,7 mg) y N,N-diisopropiletilamina (15,8 Il). Despues de 2,5 h a ta, se anadi6 acetato de etilo (6 ml) a la mezcla de reacci6n y se lav6 la disoluci6n organica dos veces con agua (4 ml) despues con una disoluci6n acuosa de cloruro de sodio, saturada (5 ml), se sec6 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 a vacio para dar un residuo. El residuo se purific6 por cromatografia sobre gel de silice (columna de Merck MiniVarioFlash 2,5 g , Si60 15-40 Im), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de MeOH (metanol) (A) / DCM (diclorometano) (B), (gradiente : 2% de A: 98% de B hasta 4% de A: 96%B) para dar ester N-hidroxisuccinimidilico del acido (4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-813

iloximetil]-fenoxi)-butirico (17,6 mg): LC/MS(Metodo A4): ES:m/z 846 (M+H)+;Tiempo de retenci6n (TR) = 3,89 min.;

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,75 (d, J=6,8 Hz, 6 H); 2,23 (m, 2H); 2,73 -2,87 (m, 6H); 2,97 (m, 4H); 3,84 -3,95 (m, 2H); 3,97 (s, 6H); 4,06 (m, 2H); 4,26 (m, 4H); 5,14 (d, J = 12,4 Hz, 2H) ; 5,21 (d, J = 12,4 Hz, 2H) ; 5,62 (m, 2H); 6,84 (s, 2H); 6,96 (s, 2H); 7,09 (s, 1H); 7,53 (s, 2H); 7,63 (m, 2H);

Se puede preparar acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico como sigue:

A una disoluci6n de ester metilico del acido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico (60 mg) en tetrahidrofurano (0,9 ml) se anadi6 MeOH (0,3 ml), agua (0,3 ml) y una disoluci6n acuosa de hidr6xido de litio (1 M, 87 Il). Despues de 3 horas, se diluy6 la mezcla de reacci6n con agua (10 ml) y se ajust6 el pH a 2 por adici6n de una disoluci6n acuosa de acido clorhidrico 1 N. La fase acuosa se extrajo tres veces con DCM (10 ml) y las disoluciones organicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se concentr6 a vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (columna Merck SuperVarioFlash 10 g, SiOH 15-40 Im), eluido con una mezcla de DCM/MeOH/acido acetico (100:4:0,5) para dar acido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1,.]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico: LC/MS (Metodo A2): ES : m/z=749 MH+ ; m/z=375 (M + 2H)2+ /2 ; TR = 3,7 min;

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6, 0 en ppm): 0= 1,69 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 1,95 (m, 2H) ; 2,39 (t, J = 6.5 Hz, 2H) ; 2,91 (m, 2H) ; 3,05 (m, 2H) ; 3,83 (s, 6H) ; 3,98 (m, 2H) ; 4,01 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,10 (m, 4H) ; 5,11 (d, J = 12.5 Hz, 2H) ; 5,20 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,55 (m, 2H) ; de 6,90 a 7,15 (m, 5H) ; 7,34 (s, 2H) ; 7,77 (m, 2H) ; 12,1 (m ancho, 1H).

Se puede preparar ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico como sigue :

A una disoluci6n enfriada (0°C) de ester metilico del acido 4-(3,5-bis-(hidroximetil-fenoxi)-butirico (50 mg) y trietilamina (110 Il) en THF (tetrahidrofurano) (1,4 ml) se le anadi6 cloruro de metanosulfonilo (46 Il). Despues de 1 h, la mezcla de reacci6n se diluy6 con DCM (10 ml) y se lav6 dos veces con agua (5 ml). La disoluci6n organica se sec6 sobre sulfato de sodio y se concentr6 al vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (columna de Merck SuperVarioFlash 10 g, SiOH 15-40 Im), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de MeOH (A)/DCM (B); (gradiente: 100% de B disminuyendo a 5% de A: 95% de B) para dar 71,8 mg del compuesto dimesilato. A una mezcla de tomaimicina (80mg), yoduro de potasio (49 mg), carbonato de potasio (122 mg) en DMF (dimetilformamida) (1 ml), se anadi6 una disoluci6n del compuesto di-mesilato (71,8 mg) en DMF (1,6 ml). Se agit6 la mezcla de reacci6n durante 16 h, a 30°C. Se anadi6 agua (12 ml) y se filtr6 el s6lido resultante, se lav6 con agua y se sec6 al vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (columna de Merck SuperVarioFlash 30 g; SiOH 15-40 Im), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de MeOH (A)/DCM (B), (gradiente : 100% de B disminuyendo a 5% de A: 95%B) para dar ester metilico del acido (4-(3,5-bis[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico (65,4 mg): LC/MS (Metodo A2): ES : m/z=763 MH+ ; m/z=382 (M + 2H)2+ /2 ; TR = 4,0 min;

RMN de 1H (500 MHz, CDCl3-d1, 0 en ppm) : 1,75 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 2,11 (m, 2H); 2,53 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 2,98 (m, 4H) ; 3,69 (s, 3H); 3,89 (m, 2H); 3,97 (s, 6H); 4,00 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,28 (s ancho, 4H) ; 5,12 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,19 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,61 (m, 2H); 6,82 (s, 2H); 6,92 (s, 2H); 7,06 (s, 1H) ; 7,52 (s, 2H); 7,64 (d, J = 4,5 Hz, 2H).

Se puede preparar ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-butirico como sigue :

A una disoluci6n de 3,5-bis-hidroximetilfenol (Felder, D.; Gutierrez Nava, M.; del Pilar Carreon, M.; Eckert, J. F.; Luccisano, M.; Schall, C.; Masson, P.; Gallani, J. L.; Heinrich, B.; Guillon, D.; Nierengarten, J. F. Helv. Chimica Acta 2002, 85, 288) (200 mg), yoduro de potasio (50 mg) y carbonato de potasio (540 mg) en THF (2,5 ml) se anadi6 ester metilico del acido 4-bromo-butirico (400 Il). Se agit6 la mezcla de reacci6n durante 20 h a temperatura ambiente despues se separ6 por filtraci6n la parte insoluble. Se concentr6 el liquido filtrado a vacio y se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (columna de Merck SuperVarioFlash 30 g; Si60 15-40 Im); usando eluci6n en gradiente con una mezcla de MeOH (A)/ DMC (B); (gradiente : 100% de B disminuyendo a 5% de A: 95%B) para dar ester metilico del acido 4-(3,5-bis-hidroximetil-fenoxi)-butirico (53,5 mg) : LC/MS (Metodo A2): ES : ES m/z=255 MH+ m/z = 237 (M + H -H2O)+;TR = 2,5 min;

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6, 0 en ppm): 0= 1,96 (m, 2H); 2,47 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 3,61 (s, 3H) ; 3,96 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 4,43 (d, J = 6,0 Hz, 4H) ; 5,11 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ; 6,71 (s, 2H) ; 6,82 (s, 1H).

Ejemplo 2: Acido 4-(3,� -bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acetico:

Se puede preparar acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acetico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de acido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico empezando con ester metilico del acido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acetico:

LC/MS (Metodo A2): ES : m/z=721 MH+ ; m/z=361 (M + 2H)2+ /2 ; TR = 3,5 min

Ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acetico

El ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acetico se puede preparar siguiendo el procedimiento para la preparaci6n del este metilico del acido 4-(3,5-bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico, partiendo del ester metilico del acido 4-(3,5-bis-hidroximetil-fenoxi)-acetico: LC/MS (Metodo A2):

ES : m/z=735 MH+ ; m/z=368 (M + 2H)2+ /2 ; TR = 3,8 min;

RMN de 1H (500 MHz, CDCl3-d1, 0 en ppm) : 0= 1,76 (d, J = 6,5 Hz, 6H) ; 2,96 (m, 4H) ; 3,78 (s, 3H); 3,88 (m, 2H); 3,97 (s, 6H); 4,27 (s ancho, 4H) ; 4,64 (s, 2H); 5,13 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,19 (d, J = 12,5 Hz, 2H) ; 5,60 (m, 2H); 6,80 (s, 2H); 6,96 (s, 2H); 7,11 (s, 1H); 7,53 (s, 2H); 7,63 (d, J = 4,5 Hz, 2H).

Ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-acetico :

Se puede preparar ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-acetico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 4-(3,5-bis-hidroximetil-fenoxi)-butirico, empezando con ester metilico del acido 4-bromo-acetico : LC/MS (Metodo A2): ES : m/z=227 MSH+ ; m/z=209 (M+H -H2O)+ ; TR = 1,9 min;

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6, 0 en ppm): 0 = 3,70 (s, 3H) ; 4,43 (d, J = 6,0 Hz, 4H) ; 4,74 (s, 2H) ; 5,14 (t, J = 6,0 Hz, 2H) ; 6,72 (s, 2H) ; 6,88 (s, 1H).

Ejemplo 3: Ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionico:

Se puede preparar ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi} -etoxi)-propi6nico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloxi metil]-fenoxi)-butirico, empezando con acido 3-(2{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico : LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 964 (M+H)+ ; TR = 0,90 min;

RMN de 1H (500 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,75 (dd, J=6,7 Hz, 6 H); 2,82 (m, 4 H) ; 2,89 (t, J=6,6 Hz, 2 H) ; 2,97 (m, 4H); 3,57-4,23 (m, 16H); 3,97 (s, 6H); 4,27 (m, 4H); 5,13 (d, J=12,7 Hz, 2 H) ; 5,20 (d, J=12,2 Hz, 2 H) ; 5,61 (m, 2 H) ; 6,82 (s, 2 H) ; 6,96 (s, 2 H) ; 7,07 (s, 1 H) ; 7,53 (s, 2H); 7,64 (d, J = 4,4 Hz, 2H).

acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico:

Se puede preparar acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi} -etoxi)-propi6nico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloxi metil]-fenoxi)-butirico, empezando con ester metilico del acido 3-(2-{2[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico : LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 867 (M+H)+; m/z 434 (M + 2H)2+ /2 ; TR = 0,84 min;

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,76 (dd, J=8,6, 1,5 Hz, 6 H) ; 2,61 (t, 2H); 2,94 -3,00 (m, 4 H) ; 3,63 3,75 (m, 8 H) ; 3,80 (t, J=6,5 Hz, 2 H) ; 3,85 -3,95 (m, 4 H) ; 3,98 (s, 6 H) ; 4,17 (t, J=4.9 Hz, 2 H) ; 4,27 (a s, 4H); 5,14 -5,21 (m, 2H); 5,18 (d, J=12,7 Hz, 2 H) ; 5,23 (d, 2 H) ; 5,23 (d, J = 12,7 Hz, 2H); 5,62 (td, J = 4,5; 2,2 Hz, 2H);

6.88 (d, J=0.5 Hz, 2 H) ; 6,97 -7,02 (m, 2H); 7,09 (s, 1H); 7,54 (s, 2H); 7,68 (d, J = 4,9 Hz, 2H) ; Ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico:

Se puede preparar ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro

5 pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico, empezando con ester metilico del acido 3-(2-{2-[2(3,5-Bis-hidroximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico: LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 881 (M+H)+ ; m/z 441 (M+2H)2+ /2 ; TR = 0,91 min;

10 RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,75 (d ancho, J=6,7 Hz, 6 H) ; 2,60 (t, J = 6,7 Hz, 2H) ; 2,97 (m, 4H); 3,54 -4,21 (m, 16H); 3,68 (s, 3H); 3,97 (s, 6H); 4,27 (m, 4 H) ; 5,13 (d, J = 12,2 Hz, 2H) ; 5,21 (d, J=12,2 Hz, 2 H) ; 5,61 (m, 2H); 6,83 (s, 2H); 6,96 (s, 2H); 7,08 (s, 1H); 7,53 (s, 2H); 7,64 (d, J = 4,2 Hz, 2H ).

Puede prepararse ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-bis-hidroximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi) propi6nico como se indica a continuaci6n:

A una disoluci6n de ester terc-butilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-hidroximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico (607 mg) en DCM (8,7 ml) se anadi6 acido trifluoroacetico (2,2 ml). Se agit6 la mezcla de reacci6n durante 3 dias a ta, despues se concentr6 a vacio y se disolvi6 el residuo obtenido en metanol (5 ml). A la disoluci6n metan6lica enfriada (0"C) se anadi6 (trimetilsilil)diazometano 2 M en hexanos (3,6 ml) hasta persistencia del color amarillo. 20 Despues se anadi6 acido acetico (10 Il) y la disoluci6n resultante se concentr6 a vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (Analogix Super Flash SiO2 SF25-40g), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de DCM (A) y MeOH (B) (gradiente : 99% de A: 1% de B disminuyendo a 90% de A: 10% B) para dar ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-hidroximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico (232 mg). LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 373 (M+H)+ ; m/z 395 (M+Na)+ ; TR = 0,50 min Ester terc-butilico del acido 3-(2-{2-[2

25 (3,5-Bis-hidroximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico:

Se puede preparar ester terc-butilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-hidroximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-butirico, empezando con ester terc-butilico del acido 3-{2-[2-(2-Bromo-etoxi)-etoxi]-etoxi}-propi6nico (patente internacional

30 wO 2004/091542) : LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 415 (M+H)+ ; m/z 432 (M+NH4)+ ; TR = 0,75 min

Ejemplo 4 : Ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 6-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo [2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenil)-hex--inoico

Se puede preparar ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a

5 tetrahidro-pirrolo [2,1c] [1,4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-hex-5-inoico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo [2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico, empezando con acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2,1c][1,4] benzodiazepin-5-ona-8-iloxi metil]-fenil)-hex-5-inoico: LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 854 (M+H)+ ; TR = 1,25 min

10 Acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]fenil)-hex-5-inoico

Se puede preparar acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c] [1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-hex-5-inoico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n del acido 4-(3,5

15 Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)butirico, empezando con ester metilico del acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloxi metil]-fenil)-hex-5-inoico: LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 757 (M+H)+ ; TR = 0,89 min;

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,76 (d, J=6,8 Hz, 6 H); 1,98 (m, 2H); 2,55 (m, 4 H) ; 2,97 (m, 4H);

20 3,91 (m, 2 H) ; 3,97 (s, 6H); 4,27 (m, 4 H) ; 5,15 (d, J=12,8 Hz, 2 H) ; 5,21 (d, J=12,8 Hz, 2 H) ; 5,61 (m, 2 H) ; 6,88 (s, 2 H) ; 7,48 (s, 3 H) ; 7,53 (s, 2 H) ; 7,67 (m, 2 H) Ester metilico del acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2,1c] [1,4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-hex-5-inoico

Se puede preparar ester metilico del acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c]

25 [1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-hex-5-inoico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona8-iloximetil]-fenoxi)-butirico, empezando con ester metilico del acido 6-(3,5-Bis-hidroximetil-fenil)-hex-5-inoico : LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 771 (M+H)+ ; TR = 1,00 min;

RMN de 1H (500 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,75 (d, J = 6,6 Hz, 6H) ; 1,93 (m, 2 H) ; 2,50 (m, 4 H) ; 2,96 (m, 4H) ;

30 3,69 (s, 3H); 3,90 (m, 2H); 3,97 (s, 6H); 4,27 (m, 4H); 5,12 (d, J=12,3 Hz, 2 H) ; 5,19 (d, J=12,3 Hz, 2 H) ; 5,61 (m, 2 H) ; 6,81 (s, 2 H) ; 7,43 (s, 3 H) ; 7,54 (s, 2H); 7,64 (d, J = 4,4 Hz, 2H).

Se prepara ester metilico del acido 6-(3,5-Bis-hidroximetil-fenil)-hex-5-inoico como sigue :

A una disoluci6n enfriada (0"C) de ester metilico del acido 6-[3,5-Bis-(terc-butil-dimetil-sililoximetil)-fenil]-hex-5-inoico

(140 mg) en tetrahidrofurano anhidro (0,3 ml) se anadi6 suavemente una disoluci6n de fluoruro de tetrabutilamonio 1

5 M en THF (716 Il). Despues de 75 min a ta, se anadi6 acetato de etilo (20 ml) y se lav6 la fase organica tres veces

con agua (5 ml) y una vez con una disoluci6n acuosa saturada de cloruro de sodio (5 ml), se sec6 sobre sulfato de

sodio y se concentr6 a vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice

(columna Merck SuperVarioFlash 15 g; Si60 15-40 Im), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de heptano (A)

/ acetato de etilo (B), (gradiente: 50% de A: 50% de B disminuyendo hasta 10% de A: 90%B) para dar ester metilico 10 del acido 6-(3,5-Bis-hidroximetil-fenil)-hex-5-inoico (64,3 mg) como un aceite amarillo palido. LC/MS (Metodo A3):

ES : m/z 263 (M+H)+ ; TR = 0,62 min

Se puede preparar ester metilico del acido 6-[3,5-Bis-(terc-butil-dimetil-sililoximetil)-fenil]-hex-5-inoico como sigue

A una disoluci6n de 1,3-Bis-hidroximetil-5-iodo-benceno (Zeng; F. ; Zimmerman, S. C. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118

15 (22); 5326-5327) (1,7 g) en diclorometano (10 ml), se anadieron trietilamina (3,59 ml), cloruro de terc-butildimetilsililo (2,91 g) y DMF (2 ml). Despues de 1 hora, se anadi6 acetato de etilo (200 ml) y se lav6 la fase organica tres veces con agua (50 ml) y una vez con una disoluci6n acuosa saturada de cloruro de sodio (50 ml), se sec6 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 a vacio para dar un residuo (3,65 g). A una disoluci6n del residuo previo (200 mg) en DMF (0,90 ml) se anadi6 yoduro de cobre(I) (7,7 mg), diclorobis(trifenilfosfina)paladio (II) (28,5 mg), ester metilico del

20 acido 5-hexinoico (102,4 mg) y trietilamina (113 Il). Despues de 45 min, se anadi6 acetato de etilo (40 ml) y se lav6 la fase organica tres veces con agua (10 ml) y una vez con una disoluci6n acuosa saturada de cloruro de sodio (10 ml), se sec6 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 a vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (columna de Merck SuperVarioFlash 30 g, Si60 15-40 Im), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de heptano (A) / acetato de etilo (B), (gradiente: 100% de A disminuyendo hasta 90% de

25 A: 10%B) para dar ester metilico del acido 6-(3,5-Bis-(terc-butil-dimetil-sililoximetil)-fenil]-hex-5-inoico (145,3 mg) como un aceite amarillo. MS(Metodo C) : cl: m/z 494 (M+NH4)+ ;

RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6, 0 en ppm): 0 = 0,07 (s, 12H) ; 0,89 (s, 18H); 2. 55 -2,69 (m, 2H); 3,63 (s, 3 H) ; 4,67 (s, 4H); 7,15 (s grande, 2H) ; 7,28 (s ancho, 1 H).

Ejemplo : Ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro30 pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionico:

Se puede preparar ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico, empezando con ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico: LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 882 (M+H)+; m/z 441,5 (M+2H)2+ /2 ; TR = 0,82 min;

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,76 (d, J=6,8 Hz, 6 H); 2,59 (t, J = 6,5 Hz, 2H) ; 2,97 (m, 4H); 3,58 3,72 (m, 9 H) ; 3,75 (t, J=6,5 Hz, 2 H) ; 3,80 -3,97 (m, 4 H) ; 4,00 (s, 6H); 4,20 (m ancho, 2 H) ; 4,27 (m, 4H); 5,31 5,42 (m, 4 H) ; 5,61 (m ancho, 2 H) ; 6,87 (s, 2 H) ; 7,02 - 7,15 (m ancho, 2 H) ; 7,56 (s, 2H); 7,65 (d, J = 4,4 Hz, 2H).

Ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico:

Se puede preparar ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-hidroximetil]-fenoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico, empezando con ester terc-butilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico: LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 374 (M+H)+ ; m/z 418 (M+HCO2H-H)-; TR = 0,31 min

Ester terc-butilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico:

A una disoluci6n de ester dietilico del acido 4-(2-{2-[2-(2-terc-butoxicarbonil-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6dicarboxilico (1,36 g) en etanol absoluto (72 ml) se le anadieron borohidruro s6dico (309 mg) y cloruro de calcio (921 mg). Despues de agitar durante 30 min, ces6 el desprendimiento de hidr6geno y la reacci6n se enfri6 rapidamente con agua. Despues de concentraci6n a presi6n reducida, se anadi6 cloruro de amonio y se extrajo la fase acuosa tres veces con acetato de etilo. Las disoluciones organicas combinadas se secaron sobre sulfato de magnesio y se concentraron al vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (Analogix Super Flash SiO2 SF25-80 g), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de DCM (A) y MeOH (B) (gradiente : 100% de A disminuyendo hasta 90% de A: 10% B) para dar ester terc-butilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bishidroximetil-piridin-4-iloxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico (720 mg): LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 416 (M+H)+ ; TR = 0,52 min

Ester dietilico del acido 4-(2-{2-[2-(2-terc-Butoxicarbonil-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6-dicarboxilico:

A una disoluci6n enfriada (0"C) de ester terc-butilico del acido 12-hidroxi-4,7,10-trioxadecanoico (1,91 ml) en DCM (12,9 ml) se anadi6 trietilamina (1,13 ml), se anadi6 cloruro de metanosulfonilo (622 Il). Despues de 3 horas, se concentr6 a vacio la mezcla de reacci6n para dar un residuo despues se disolvi6 en acetato de etilo (13 ml). Se separ6 por filtraci6n la parte insoluble, se lav6 dos veces con acetato de etilo (7 ml) y se concentraron a vacio las disoluciones organicas combinadas para dar un residuo (2,77 g). A una disoluci6n de 1,64 g del residuo en acetonitrilo seco (10 ml) se anadi6 el ester dietilico de acido quelidamico (Scrimin, P.; Tecilla, P.; Tonallato, U.; Vendrame, T. J. Org. Chem. 1.989, 54, 5.988) (1 g) y carbonato de potasio (2,88 g). Despues de calentar para hacerlo hervir a reflujo durante 24 h, se separ6 por filtraci6n la parte insoluble y se lav6 con acetato de etilo. Se concentr6 despues a vacio la fase organica para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (columna Merck SuperVarioPrep 200 g; Si60 15-40 Im), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de DCM (A) y MeOH (B) (gradiente: 100 % de A disminuyendo a 97 % de A: 3% de B) para dar ester dietilico del acido 4-(2-{2-[2-(2-terc-butoxicarbonil-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-piridin-2,6-dicarboxilico (1,36 g): LC/MS (Metodo A4): ES: m/z 500 (M+H)+ ; m/z 522 (M+Na)+ ; m/z 444 (M-C4H8+H)+ ; TR = 4,32 min

Ejemplo 6: Ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico :

la preparaci6n de ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico, empezando con acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico C/MS (Metodo 3) : ES : m/z 847 (M+H)+ ; m/z 424 (M+2H)2+ /2 ; TR = 0,80 min;

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 1,75 (d ancho, J=6,6 Hz, 6 H) ; 2,23 (m ancho, 2 H) ; 2,76 -2,89 (m ancho, 6 H) ; 2,97 (m ancho, 4 H) ; 3,91 (m ancho, 2 H) ; 4,00 (s ancho, 6 H) ; 4,14 (m ancho, 2 H) ; 4,27 (m ancho, 4 H) ; 5,28 (m ancho, 4 H) ; 5,61 (m ancho, 2 H) ; 6,87 (s ancho, 2 H) ; 7,03 (s ancho, 2 H) ; 7,56 (s ancho, 2 H) ; 7,65 (m ancho, 2 H)

Hidrocloruro del acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico:

Se puede preparar hidrocloruro del acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c] [1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)butirico, empezando con ester metilico del acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico: LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 750 (M+H)+ ; m/z 375,5 (M+2H)2+/2 m/z 332,5 (M-C4H6O2+2H)2+/2; TR = 0,73 min;

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,75 (d, J = 6,6 Hz, 6H) ; 2,02 (m, 2 H) ; 2,42 (m, 2H); 2,97 (m, 4H); 3,83 -4,14 (m, 4 H) ; 4,00 (s, 6H) ; 4,27 (m, 4H) ; 5,20-5,42 (m, 4H); 5,61 (m, 2H); 6,85 (s, 2H); 6,94 (s, 2H); 7,56 (s, 2H); 7,63 (m, 2H).

Ester metilico del acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico:

Se puede preparar ester metilico del acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c]

[1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona8-iloximetil]-fenoxi)-butirico, empezando con ester metilico del acido 4-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-butirico: LC/MS (Metodo A4): ES : m/z 764 (M+H)+ m/z 664 (M-C5H8O2+H)+ m/z 762 (M-H)-TR = 3,64 min ;

RMN de 1H (500 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,76 (d, J=6,8 Hz, 6 H); 2,12 (m, 2 H) ; 2,50 (t, J=7,3 Hz, 2 H) ; 2,97 (m, 4H); 3,68 (s, 3H); 3,90 (m, 2H); 4,00 (s, 6H); 4,07 (m ancho, 2 H) ; 4,27 (m, 4H); 5,29 (m ancho, 4 H) ; 5,61 (m, 2H); 6,86 (s, 2H); 6,99 (s ancho, 2 H) ; 7,56 (s, 2H); 7,65 (d, J = 4,4 Hz, 2H).

Ester metilico del acido 4-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-butirico:

Se puede preparar ester metilico del acido 4-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-butirico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-hidroximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico, empezando con ester terc-butilico del acido 4-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-butirico : LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 256 (M+H)+TR= 0,25 min

Ester terc-butilico del acido 4-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-butirico:

Se puede preparar ester terc-butilico del acido 4-(2,6-Bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)-butirico siguiendo el

10 procedimiento para la preparaci6n de ester terc-butilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-bis-hidroximetil-piridin-4-iloxi)etoxi]etoxi}-etoxi)-propi6nico, empezando con ester dietilico del acido 4-(3-terc-butoxicarbonil-propoxi)-piridin-2,6dicarboxilico: LC/MS (Metodo A4): ES : m/z 298 (M+H)+ ; m/z 156 (M-C8H14O2+H)+; TR = 2,45 min

Ester dietilico del acido 4-(3-terc-butoxicarbonil-propoxi)-piridin-2,6-dicarboxilico

15 Se puede preparar ester dietilico del acido 4-(3-terc-butoxicarbonil-propoxi)piridin-2,6-dicarboxilico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester dietilico del acido 4-(2-{2-[2-(2-terc-butoxicarbonil-etoxi)-etoxi]etoxi}etoxi)-piridin-2,6-dicarboxilico, empezando con ester terc-butilico del acido 4-bromo-butirico : LC/MS (Metodo A4): ES: m/z 382 (M+H)+ m/z 404 (M+Na)+ m/z 785 (2M+Na)+ m/z 240 (M-C8H14O2+H)+TR= 4,65 min

Ejemplo 7 : Ester metilico del acido N-[2-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1 20 c][1, 4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico :

Se puede preparar ester metilico del acido N-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etil]-N-metilsuccinamico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro

25 pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico, empezando con ester metilico del acido N-[2-(3,5Bis-hidroximetil-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico: LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 834 (M+H)+ TR = 0,87 min ;

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3-d1, 0 ppm) : 0= 1,75 (d, J = 6,6 Hz, 6H) ; 2,54 -3,21 (m, 11 H) ; 3,61 -4,17 (m, 6 H) ; 3,69 (s, 3H); 3,97 (s, 6H); 4,27 (m, 4 H) ; 5,10 -5,21 (m, 4 H) ; 5,61 (m, 2H); 6,82 (s, 2H); 6,91 -6,95 (m, 2 H) ; 7,06 7,12 (m, 1 H) ; 7,53 (s, 2H); 7,63 (d, J = 4,4 Hz, 2H).

Se puede preparar ester metilico del acido N-[2-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico como sigue :

A una disoluci6n enfriada (0"C) de acido N-[2-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico (225 mg) en metanol (1 ml), se anadi6 (trimetilsilil)diazometano 2 M en hexanos (840 Il) hasta persistencia del color amarillo. Despues de 40 min, se anadieron acetato de etilo (5 ml) y acido acetico (50 Il); despues, un minuto mas tarde, una disoluci6n acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio hasta pH=7. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo. Se lavaron las capas organicas combinadas con una disoluci6n acuosa saturada de cloruro de sodio, se sec6 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 a vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (columna Merck SuperVarioFlash 25 g, Si60 15-40 Im), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de DCM (A)/MeOH (B), (gradiente : 98% de A: 2% de B disminuyendo hasta 90% de A: 10% de B) para dar ester metilico del acido N-[2-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico (103 mg). LC/MS (Metodo A3): ES : m/z 348 (M+Na)+; m/z 326 (M+H)+ ; m/z 308 (M-H2O+H)+ ; TR = 0,43 min

Se puede preparar acido N-[2-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico como sigue :

Se puede preparar acido N-[2-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico siguiendo el procedimiento para la preparaci6n de acido N-[2-(3,5-Bis-hidroximetil-fenoxi)-etil]-succinamico, empezando con 3,5-Bis-hidroximetil-(2metilamino-etoxi)-benceno: LC/MS (Metodo A3):

ES : m/z 312 (M+H)+ ; m/z 294 (M-H2O+H)+ ; m/z 310 (M-H)- ; TR = 0,35 min

Hidrocloruro de 3,5-Bis-hidroximetil-(2-metilamino-etoxi)-benceno

A una disoluci6n de 1-(2- (terc -butoxicarbonil)-metilamino-etoxi)-3,5-bis-(terc-butil-dimetil-sililoxi metil)-benceno (590 mg) en dioxano (4 ml) se anadi6 una disoluci6n de acido clorhidrico 4 N en dioxano (3,3 ml). Despues de 15 h a ta, se filtr6 el s6lido resultante, se lav6 con dioxano y se sec6 a vacio para dar hidrocloruro de 3,5-bis-hidroximetil-(2metilamino-etoxi)-benceno (240 mg) como un polvo blanco. LC/MS (Metodo A2): ES : m/z 212 (M+H)+; TR = 0,14 min Se puede preparar 1-(2-(terc-butoxicarbonil)-metilamino-etoxi)-3,5-bis-(terc-butil-dimetil-sililoxi metil)-benceno como sigue :

A una disoluci6n de 1-(2- terc-butoxicarbonilamino-etoxi)-3,5-bis-(terc-butil-dimetil-sililoximetil)-benceno (270 mg) en tetrahidrofurano (5 ml) se anadi6 yodometano (70 Il) y se enfri6 la mezcla de reacci6n (0"C). A la disoluci6n enfriada, se anadi6 hidruro de sodio (68 mg). Despues de 1 hora, se permiti6 que la temperatura se calentara hasta temperatura ambiente. Despues de 16 horas, se anadi6 suavemente una mezcla de THF y agua 1:1 (2 ml), despues acido citrico hasta pH=2. La fase acuosa se extrajo tres veces con acetato de etilo. Se lavaron las capas organicas combinadas con una disoluci6n acuosa saturada de cloruro de sodio, se sec6 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 a vacio para dar un residuo. Se purific6 el residuo por cromatografia sobre gel de silice (columna Merck SuperVarioFlash 25 g, Si60 15-40 Im), usando eluci6n en gradiente con una mezcla de heptano (A) / acetato de etilo (B), (gradiente: 100% de A disminuyendo hasta 85% de A: 15% de B) para dar 1-(2-(terc-butoxicarbonil)metilamino-etoxi)-3,5-bis-(terc-butil-dimetil-sililoxi metil)-benceno (220 mg) : LC/MS (Metodo A2): ES : m/z 562 (M+Na)+ ; m/z 308 (M+H-C5H8O2 OSiC6H16)+ ; TR = 1,50 min

Se puede preparar 1-(2-terc-butoxicarbonil-amino-etoxi)-3,5-bis-(terc-butil-dimetil-sililoxi metil)-benceno como sigue :

A una disoluci6n enfriada (0°C) de 1-(2-terc-butoxicarbonilaminoetoxi)-3,5-bis-(hidroximetil)-benceno (600 mg) en DMF (8 ml) se le anadi6 terc-butildimetilclorosilano (913 mg) y trietilamina (936 Il). Despues de 18 horas, se anadi6 agua y se extrajo la fase acuosa dos veces con acetato de etilo. Se lavaron las capas organicas combinadas con

10 una disoluci6n acuosa saturada de cloruro de sodio, se sec6 sobre sulfato de magnesio y se concentr6 a vacio para dar 1-(2-terc-butoxicarbonilamino-etoxi)-3,5-bis-(terc-butil-dimetil-sililoxi metil)-benceno (1 g): LC/MS (Metodo A2): ES: m/z 548 (M+Na)+ ; m/z 294 (M+H-C5H8O2-OSiC6H16)+ ; TR=1,45 min

Ejemplo 8: Ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(3,� -Bis-[(S)-2-metiliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo [2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenil)-propanoico, compuesto 10

15 Esquema 1

Esquema 2

Compuesto 2: A una suspensi6n de hidruro de litio y aluminio 2,19 g; 54,8 mmoles) en THF anhidro (50 ml) se anadi6 disoluci6n de 5-bromoisoftalato de dimetilo (9,98 g; 36,5 mmoles) en THF (100 ml) a 0°C, durante un periodo de 1 h. Despues de terminar la adici6n, se agit6 la mezcla a ta durante 2 h. En ese tiempo, se anadieron 150 ml de THF. Se volvi6 a enfriar la mezcla a 0°C y se enfri6 rapidamente con NaCl acuoso saturado. Se separ6 por filtraci6n el precipitado blanco y se lav6 ademas el s6lido con THF extra (100 ml). Se sec6 la disoluci6n de THF combinada con Na2SO4, se filtr6 y se concentr6. La purificaci6n adicional con cromatografia por desorci6n subita sobre gel de silice (95:5 CH2Cl2/CH3OH) proporcion6 2 como un s6lido blanco (7,42 g; 95%).

Compuesto 3: Se suspendi6 compuesto 2 (3,36 g; 15,5 mmoles) en CH2Cl2 anhidro (31 ml). Se anadi6 TBSCl (5,14 g; 34,1 mmoles), seguido por imidazol (3,16 g; 46,5 mmoles). Se agit6 la mezcla a ta durante 1 h. Se separ6 por filtraci6n el precipitado blanco y se concentr6 el liquido filtrado con rotavapor. Se purific6 el residuo resultante por cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, 97:3 hexanos/EtOAc) para dar 3 como aceite incoloro (6,15 g; 89%): 1H R.M.N. (400 MHz, CDCl3) 0= 0,081 (s, 12H), 0,92 (s, 18H), 4,67 (s, 4H), 7,18 (s, 1H), 7,31 (s, 2H).

Compuesto 4: Un matraz que contiene compuesto 3 (4,16 g; 9,36 mmoles), acrilato de metilo (1,3 ml; 14,0 mmoles), Pd(OAc)2 (105 mg; 0,47 mmoles); P(o-tolil)3 (285 mg; 0,94 mmoles) y Et3N (9 ml) en 19 ml de CH3CN se calent6 para hacerlo hervir a reflujo en atm6sfera de arg6n, durante 16 h. Despues de enfriar a ta, se anadi6 H2O de hielo (20 ml). Se extrajo la mezcla con EtOAc (3x40 ml). Se lavaron las capas organicas combinadas con HCl 1 N, salmuera, se sec6 sobre Na2SO4 y se concentr6. La purificaci6n adicional del residuo con cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, hexanos/EtOAc 97:3) para dar 4 como aceite incoloro (3,91 g; 93%):

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0 0,089 (s, 12H); 0,93 (s, 18H); 3,79 (s, 3H); 4,72 (s, 4H); 6,41 (d, J = 16 Hz, 1H); 7,29 (s, 1H); 7,34 (s, 2H); 7,68 (d, J = 16 Hz, 1H). EIMS m/z 473 ([M]++Na).

Compuesto : Se hidrogen6 la mezcla de 4 (2,54 g; 5,63 mmoles) y Pd/C (563 mg) en 55 ml de EtOAc a presi6n atmosferica, durante 30 min. Despues se hizo pasar la disoluci6n por celite, se lav6 el s6lido con EtOAc extra (25 ml). Se concentraron las disoluciones de EtOAc combinadas para proporcionar como aceite incoloro (2,55 g; 99+%), que es suficientemente puro para la siguiente etapa.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0 = 0,067 (s, 12H); 0,91 (s, 18H); 2,60 (t, J = 8,0 Hz, 2H); 2,92 (t, J = 8,0 Hz, 2H); 3,65 (s, 3H); 4,68 (s, 4H); 7,00 (s, 2H); 7,12 (s, 1H). EIMS m/z 475 ([M]++Na).

Compuesto 6: A una disoluci6n de (1,48 g; 3,28 mmoles) en THF anhidro (33 ml) se anadieron 8,2 ml de disoluci6n 1 M de TBAF en THF, a 0°C. Despues de agitar a esta temperatura durante 1 h, se anadi6 NH4Cl acuoso saturado (30 ml) a la mezcla. Se extrajo la mezcla con EtOAc (3x40 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se sec6 sobre Na2SO4 y se concentr6. La purificaci6n adicional del residuo por cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, DCM/CH3OH 95:5) da 6 como aceite incoloro (625 mg; 85%), que se solidifica despues de dejarlo reposar en el refrigerador.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 2,59 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 2,91 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,63 (s, 3H), 4,61 (s, 4H), 7,08 (s, 2H), 7,16 (s, 1H).

Compuesto 7: Se disolvi6 el diol 6 (59 mg; 0,26 mmoles) en DCM (2,6 ml). Se enfri6 la disoluci6n a 0°C y se trat6 con Et3N (82 Il; 0,58 mmoles) y MsCl (46 Il; 0,58 mmoles). Se agit6 la mezcla a 0°C durante 30 min y se enfri6 rapidamente con H2O de hielo (2 ml). Se separaron las capas y se extrajo ademas la capa acuosa con DCM (3x2 ml). Se lavaron con salmuera las capas de DCM combinadas, se sec6 con Na2SO4 y se concentr6. Ademas secado con bomba de alto vacio proporcion6 7 como aceite amarillo palido, que se us6 inmediatamente en la siguiente etapa sin purificaci6n adicional.

Compuesto 8: A una mezcla de mon6mero de PBD (165 mg; 0,64 mmoles) y 7 (se asume que es 0,26 mmoles) en DMF (2,7 ml) se anadi6 K2CO3 (147 mg; 1,06 mmoles), KI (22 mg; 0,13 mmoles) y Bu4NI (49 mg; 0,13 mmoles) secuencialmente. Se agit6 la mezcla en arg6n a ta, durante 7 h. Despues se retir6 DMF con alto vacio. Se reparti6 el residuo entre DCM y agua y se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo ademas con DCM (3x3 ml). Las capas de DCM combinadas se lavaron con salmuera, se sec6 (Na2SO4) y se concentr6. La purificaci6n del residuo con cromatografia sobre gel de silice (CH2Cl2/CH3OH, 25:1) proporcion6 8 como s6lido similar a vidrio amarillo palido (101 mg; 54%). EIMS m/z 763 ([M]++Na+2H2O), 745 ([M]++Na+H2O), 727 ([M]++Na).

Compuesto 9: A una disoluci6n agitada de ester 8 metilico (16 mg; 0,023 mmoles) en THF-MeOH-H2O (3:1:1; 0,45 ml) se anadi6 LiOH ac. 1 M (0,025 ml; 1,1 eq.) a ta y se control6 la reacci6n por TLC. Despues de 3,5 h, se diluy6 la mezcla con H2O (5 ml) y se ajust6 el pH a 2 con HCl 1 N. Despues se extrajo la mezcla con DCM (3 X 5 ml). Las capas de DCM combinadas se lavaron con salmuera, se sec6 sobre Na2SO4 y se concentr6. La purificaci6n adicional por cromatografia por desorci6n subita sobre gel de silice (DCM:MeOH:AcOH = 100:4:0,5) proporcion6 el acido 9 deseado (8,2 mg; 60% brsm); EIMS m/z 749 ([M]++Na+2H2O); 731 ([M]++Na+H2O); 713 ([M]++Na); mas una pequena cantidad (- 2 mg) de ester 8 metilico.

Compuesto 10: A una disoluci6n de acido 9 (8,2 mg; 0,011 mmoles) en CH2Cl2 (1 ml) se anadieron poli-DCC (38 mg; 0,059 mmoles) y N-hidroxisuccinimida (NHS) (2,7 mg; 0,024 mmoles). Se agit6 la mezcla a ta, durante 2 h, despues se filtr6 por un pequeno lecho de celite, se lav6 con DCM, se concentr6. Se purific6 el residuo resultante por cromatografia por desorci6n subita (DCM:MeOH/100:3) para proporcionar el producto 10 deseado (7 mg; 81 %). EIMS m/z 874 ([M]++Na+2MeOH); 842 ([M]++Na+MeOH); 810 ([M]++Na).

Ejemplo 9 : Ester N-hidroxisuccinimidilico del acido (2-{2-[2-(2-{3-[3,� -Bis-(7-metoxi-2-metilen--oxo2,3,�,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2-a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}etoxi)-acetico, compuesto 20

Esquema 3

Compuesto 12: Se anadi6 NaOH acuoso (50%; 6,9 ml) a tetraetilenglicol (68,08 g; 350 mmoles). Se agit6 la mezcla a ta, durante 2 h, seguido por adici6n de yoduro de alilo (8 ml; 87,6 mmoles). Despues de agitar durante otras 24 h, se reparti6 la mezcla entre H2O y EtOAc (50/50 ml). La capa acuosa se extrajo ademas con EtOAc (5 x30 ml). Se 26

secaron las capas de EtOAc combinadas sobre Na2SO4 y se concentr6. La cromatografia por desorci6n subita del residuo (gel de silice, hexanos:EtOAc 4:6 a 0:1) proporcion6 12 como aceite incoloro:

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 2,44 (a s, 1H); 3,63 -3,71 (m, 16H); 3,99 -4,01 (m, 2H); 5,13 -5,17 (m, 1H); 5,22

-

5,27 (m, 1H); 5,84 -5,92 (m, 1H); 13C R.M.N. 0 61,8, 69,4, 70,4, 70,59, 70,61, 70,63, 72,2, 72,5, 117,0, 134,8. EIMS m/z 257 ([M]++Na).

Compuesto 13: A una suspensi6n de NaH (89 mg; 2,2 mmoles) en THF anhidro (2,5 ml) se le anade una disoluci6n de 12 (370 mg; 1,58 mmoles) en THF (5 ml) a 0°C, en arg6n. Se agit6 la mezcla a esta temperatura durante 30 min, despues ta durante otros 30 min. Se volvi6 a enfriar la mezcla a 0°C y se anadi6 gota a gota bromoacetato de metilo (0,29 ml; 3,16 mmoles) gota a gota. Despues de agitar a 0°C durante 1 h, se retir6 el bano de hielo y se continu6 la agitaci6n durante otras 24 h, a ta. La mezcla se filtr6 a traves de celite y se concentr6 el liquido filtrado. La purificaci6n adicional del residuo con cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, hexanos/EtOAc 1:1) dio 13 como aceite amarillo palido (220 mg):

RMN de 1H. (400 MHz, CDCl3) 0= 3,57 -3,74 (m, 19H), 3,98 -4,0 (m, 2H), 4,26 (s, 2H), 5,15 (d, J = 10,4Hz, 1H), 5,24 (dd, J = 16, 1,6Hz, 1H), 5,84 -5,93 (m, 1H); 13C N MR 0= 51,7, 68,6, 69,4, 70,56, 70,60, 70,62, 70,9, 72,2, 117,0, 134,8, 170,9. EIMS m/z 329 ([M]++Na).

Compuesto 14: Se calent6 para hacer hervir a reflujo un matraz que contiene compuesto 3 (1,30 g; 2,92 mmoles), 13 (0,986 g; 3,220 mmoles), Pd(OAc)2 (33 mg; 0,15 mmoles), P(o-tolil)3 (89 mg; 0,29 mmoles) y Et3N (2 ml) en 30 ml de CH3CN en atm6sfera de arg6n, durante 12 h. Despues de enfriar a ta, se retir6 el acetonitrilo por evaporaci6n y se anadi6 acetato de etilo (40 ml) y se hizo pasar la mezcla por celite, se enjuag6 con acetato de etilo y se concentr6. La purificaci6n adicional del residuo con cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, hexanos/EtOAc 6:4) para dar 14 (1,02 g) como aceite incoloro.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 0,076 (s, 12H), 0,92 (s, 18H), 3,61 -3,72 (m, 19H), 4,14 (s, 2H), 4,15 -4,17 (m, 2H), 4,69 (s, 4H), 6,23 -6,28 (m, 1H), 6,57 (d, J = 16,0Hz, 1H), 7,16(s, 1H), 7,19 (s, 2H); 13C R.M.N. 0= -5,2, 14,2, 18,4, 26,0, 51,7, 64,9, 68,6, 69,4, 70,57, 70,61, 70,64, 70,7, 70,9, 71,9, 122,8, 123,2, 125,9, 132,8, 136,5, 141,7,170,9. EIMS m/z 693 ([M]++Na).

Compuesto 1�: Se hidrogen6 una mezcla de 14 (0,062 g; 0,092 mmoles) y Pd/C (9 mg) en 2,5 ml de EtOAc a presi6n atmosferica, durante 30 min. Despues se hizo pasar la disoluci6n por celite, se lav6 el s6lido con EtOAc extra (10 ml). Se concentraron las disoluciones de EtOAc combinadas para proporcionar 1� como aceite incoloro que se us6 sin purificaci6n adicional.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 0,072 (s, 12H), 0,92 (s, 18H), 1,87 -1,89 (m, 2H), 2,64 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,43 3,70 (m, 21H), 4,14 (s, 2H), 4,68 (s, 4H), 6,98 (s, 2H), 7,10 (s, 1H). EIMS m/z 695 ([M]++Na).

Compuesto 16: A una disoluci6n de 1� de la etapa previa en THF anhidro (1,8 ml) se anadieron 0,23 ml de disoluci6n 1 M de TBAF en THF, a 0°C. Despues de agitar a esta temperatura durante 1 h, se anadi6 a la mezcla NH4Cl acuoso, saturado (2 ml). Se extrajo la mezcla con EtOAc (3x5 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se sec6 sobre Na2SO4 y se concentr6. La purificaci6n adicional del residuo con cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, CH2Cl2/CH3OH 95:5) dio 16 como aceite incoloro (27 mg; 85%).

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 1,86 -1,89 (m, 2H), 2,66 (t, J = 8,0 Hz, 2H), 3,40 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 3,50 -3,70 (m, 19H), 4,10 (s, 2H), 4,61 (s, 4H), 7,09 (s, 2H), 7,13 (s, 1H). EIMS m/z 467 ([M]++Na).

Compuesto 17: Se disolvi6 el diol 16 (26,8 mg; 0,06 mmoles) en DCM (1,2 ml). Se enfri6 la disoluci6n a 0°C y se trat6 con Et3N (18,5 Il, 0,13 mmoles) y MsCl (10,3 Il, 0,13 mmoles). Se agit6 la mezcla a 0°C durante 30 min y se enfri6 rapidamente con H2O de hielo (2 ml). Se separaron las capas y se extrajo ademas la capa acuosa con DCM (3x2 ml). Se lavaron con salmuera las capas de DCM combinadas, se sec6 con Na2SO4 y se concentr6. Secado ademas en bomba de alto vacio proporcion6 17 como aceite amarillo palido, que se us6 inmediatamente para la etapa siguiente sin purificaci6n adicional. EIMS m/z 623,1 ([M]++Na).

Compuesto 18: A una mezcla de mon6mero de PBD (40 mg; 0,15 mmoles) y 17 de la etapa previa en DMF (1,57 ml) se anadi6 K2CO3 (25 mg; 0,18 mmoles) y KI (10 mg; 0,06 mmoles) secuencialmente. Se agit6 la mezcla en arg6n a ta, durante 20 h. Despues se retir6 DMF con alto vacio. Se reparti6 el residuo entre DCM y agua y se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo ademas con DCM (3x3 ml). Las capas de DCM combinadas se lavaron con salmuera, se sec6 (Na2SO4) y se concentr6. La purificaci6n del residuo con cromatografia sobre gel de silice (DCM/CH3OH, 25:1) proporcion6 18 como s6lido parecido a cristal amarillo palido. EIMS m/z 1011,5 ([M]++Na+2CH3OH); 979,5 ([M]++Na+CH3OH); 947,5 ([M]++Na).

Compuesto 19: A una disoluci6n agitada de ester 18 metilico (16 mg; 0,017 mmoles) en THF-MeOH-H2O (3:1:1; 0,7 ml) se anadi6 LiOH ac. 1 M (0,019 ml; 1,1 eq.) a ta y se control6 la reacci6n por TLC (cromatografia de capa fina). Despues de 5 h, se diluy6 la mezcla con H2O (5 ml) y se ajust6 el pH a 2 con HCl 1 N. Despues se extrajo la mezcla con DCM (3x5 ml). Las capas de DCM combinadas se lavaron con salmuera, se sec6 sobre Na2SO4 y se concentr6.

Purificado ademas por cromatografia por desorci6n subita sobre gel de silice (DCM:MeOH:AcOH = 100:4:0,5) proporcion6 el acido 19 deseado. EIMS m/z 933,4 ([M]++Na)

Compuesto 20: A una disoluci6n de acido 19 (5,9 mg; 0,006 mmoles) en CH2Cl2 (1,0 ml) se anadieron EDC (2 mg; 0,0097 mmoles) y NHS (1,0 mg; 0,0084 mmoles). Se agit6 la mezcla a ta, durante 3 h, despues se filtr6 por un

5 pequeno lecho de celite, se lav6 con DCM y se concentr6 para proporcionar el producto 10 deseado que se us6 sin purificaci6n adicional ya que se encontr6 que el material se descomponia con la purificaci6n con silice. EIMS m/z 1030,4 ([M]++Na).

Ejemplo 10 : Ester N-hidroxisuccinimidilico del acido (3-{2-[2-(2-{3-[3,� -Bis-(7-metoxi-2-metilen--oxo2,3,�,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2-a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}

10 etoxi)-propionico, compuesto 31

Esquema 4

Compuesto 21: A una disoluci6n de tetraetilenglicol (162 ml, 940 mmoles) en THF anhidro (500 ml) se anadi6 sodio (215 mg; 9,4 mmoles). Cuando se disolvi6 el sodio, se anadi6 acrilato de terc-butilo (45 ml, 310 mmoles). Se agit6 la

15 mezcla durante 20 h, a ta y se neutraliz6 con 8 ml de HCl 1 N. Despues de retirar el disolvente, se reparti6 el residuo entre salmuera y EtOAc. La capa acuosa se extrajo ademas con EtOAc. Se lavaron las fases organicas combinadas con salmuera, se sec6 sobre Na2SO4 y se concentr6. Se purific6 el residuo resultante por cromatografia por desorci6n subita sobre gel de silice (hexanos:acetato de etilo= 4:6) proporcionando el ester 21 deseado.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 1,41 (s, 9H), 2,34 (br. S, 1H); 2,47 (t, J = 6,4Hz, 2H); 3,56 -3,71 (m, 18H). EIMS 20 m/z 345 ([M]++Na).

Compuesto 22: A una disoluci6n de hidrogenosulfato de tetrabutilamonio (1,27 g; 3,75 mmoles) y NaOH (225 mg; 5,63 mmoles) en H2O (7 ml) se anadi6 una mezcla de 21 (1,20 g; 3,75 mmoles) y bromuro de alilo (0,48 ml; 5,63

mmoles) en DCM (14 ml). Se agit6 vigorosamente el sistema de dos fases durante 45 min. Se separ6 la capa acuosa y se extrajo tres veces con DCM. Se concentraron las capas de DCM combinadas. La adici6n de Et2O (15 ml) dio como resultado precipitaci6n de bromuro de tetrabutilamonio que se separ6 por filtraci6n. El liquido filtrado se lav6 con salmuera, se sec6 sobre Na2SO4 y se concentr6. La purificaci6n adicional del residuo con cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, hexanos/EtOAc 1:1) dio 22 como aceite incoloro.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 1,42 (s, 9H), 2,47 (t, J = 6,4Hz, 2H), 3,56 - 3,70 (m, 18H), 4,00 (m, 2H), 5,15 (dq, J = 6,0, 1,2Hz, 1H), 5,25 (dq, J = 16, 1,6Hz, 1H), 5,84 -5,94 (m, 1H). EIMS m/z 385,2 ([M]++Na).

Compuesto 23: Se agit6 una disoluci6n de compuesto 22 (478 mg; 1,32 mmoles) en acido trifluoroacetico (9 ml) a ta, durante 1,5 h, en ese tiempo se consumi6 todo el material de partida. Se retir6 TFA a vacio y se sec6 ademas el residuo con ayuda de tolueno. El producto bruto se us6 directamente en la etapa siguiente.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 2,60 (t, J = 6,0Hz, 2H), 3,56 -3,70 (m, 18H), 4,01 (d, J = 5,6Hz, 2H), 5,16 (dd, J = 6,4, 1,2Hz, 1H), 5,25 (dd, J = 16, 1,6Hz, 1H), 5,84 - 5,94 (m, 1H). EIMS m/z 329,2 ([M]++Na).

Compuesto 24: La disoluci6n de acido 23 en DMF (6,6 ml) se trat6 con Cs2CO3 (451 mg; 1,38 mmoles) y MeI (90 Il; 1,45 mmoles). Se agit6 la mezcla a ta, durante 2 h. Despues se evapor6 DMF a alto vacio. Se suspendi6 el residuo en EtOAc y se separ6 por filtraci6n el s6lido. El filtrado se concentr6. La purificaci6n adicional del residuo con cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, hexanos/EtOAc 97:3) dio 24 como aceite incoloro.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 2,58 (t, J = 6,4Hz, 2H), 3,56 -3,70 (m, 18H), 4,00 (d, J = 5,6Hz, 2H), 5,14 (dd, J = 6,4, 1.2Hz, 1H), 5,24 (dd, J = 16, 1,6Hz, 1H), 5,84 - 5,94 (m, 1H). EIMS m/z 343,2 ([M]++Na).

Compuesto 2�: Se calent6 para hacer hervir a reflujo un matraz que contiene compuesto 3 (0,066 g; 0,15 mmoles), 24 (0,05 g; 0,16 mmoles), Pd(OAc)2 (1,7 mg; 0,0074 mmoles), P(o-tolil)3 (4,5 mg; 0,015 mmoles) y Et3N (0,1 ml) en 3 ml de CH3CN en atm6sfera de arg6n, durante 8 h. Despues de enfriar a ta, se retir6 el acetonitrilo por evaporaci6n y se anadi6 acetato de etilo (40 ml) y se hizo pasar la mezcla por celite, se enjuag6 con acetato de etilo. Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato s6dico y se concentr6. La purificaci6n adicional del residuo con cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, hexanos/EtOAc 6:4) para dar 2� como aceite incoloro:

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 0,076 (s, 12H), 0,92 (s, 18H), 2,57 (t, J = 6,4Hz, 2H), 3,57 -3,68 (m, 20H), 3,73 (t, J = 6,4Hz, 2H), 4,14 (d, J = 6,0Hz, 2H), 4,69 (s, 4H), 6,23 -6,29 (m, 1H), 6,56 (d, J = 16,0Hz, 1H), 7,16 (s, 2H), 7,19 (s, 1H). EIMS m/z 707,4 ([M]++Na).

Compuesto 26: Se hidrogen6 una mezcla de 2� (0,216 g; 0,31 mmoles) y Pd/C (32 mg) en 6,3 ml de EtOAc, a presi6n atmosferica, durante 30 min. Despues se hizo pasar la disoluci6n por celite, se lav6 el s6lido con EtOAc extra (10 ml). Se concentraron las disoluciones de EtOAc combinadas para proporcionar 26 como aceite incoloro que se us6 sin purificaci6n adicional.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 0,071 (s, 12H), 0,91 (s, 18H), 1,87 (m, 2H), 2,58 (t, J = 6,4Hz, 2H), 2,64 (t, 2H), 3,44 (t, J = 6,4Hz, 2H), 3,54 -3,67 (m, 20H), 3,72 (t, J = 6,4Hz, 2H), 4,68 (s, 4H), 6,98 (s, 2H), 7,10 (s, 1H). EIMS m/z 709,4 ([M]++Na).

Compuesto 27: A una disoluci6n de 26 de la etapa previa en THF anhidro (3 ml) se anadieron 0,38 ml de disoluci6n 1 M de TBAF en THF, a 0°C. Despues de agitar a esta temperatura durante 1 h, se anadi6 NH4Cl acuoso saturado (2 ml) a la mezcla. Se extrajo la mezcla con EtOAc (3 x5 ml). Las capas organicas combinadas se lavaron con salmuera, se sec6 sobre Na2SO4 y se concentr6. La purificaci6n adicional del residuo por cromatografia por desorci6n subita (gel de silice, CH2Cl2/CH3OH 95:5) da 27 como aceite incoloro.

RMN de 1H (400 MHz, CDCl3) 0= 1,87 (m, 2H), 2,56 (t, J = 6,4 Hz, 2H), 2,69 (t, J = 7,2 Hz, 2H), 3,42 (t, J = 6,4Hz, 2H), 3,54 -3,67 (m, 20H), 3,70 (t, J = 6,4Hz, 2H), 4,64 (s, 4H), 7,12 (s, 2H), 7,16 (s, 1H). EIMS m/z 481,3 ([M]++Na).

Compuesto 28: Se disolvi6 el diol 27 (54 mg; 0,126 mmoles) en DCM (2,4 ml). Se enfri6 la disoluci6n a 0°C y se trat6 con Et3N (41 Il, 0,29 mmoles) y MsCl (23 Il, 0,29 mmoles). Se agit6 la mezcla a 0°C durante 30 min y se enfri6 rapidamente con H2O de hielo (2 ml). Se separaron las capas y se extrajo ademas la capa acuosa con CH2Cl2 (3x2 ml). Se lavaron con salmuera las capas de DCM combinadas, se sec6 con Na2SO4 y se concentr6. Ademas secado con bomba de alto vacio proporcion6 28 como aceite amarillo palido, que se us6 inmediatamente en la siguiente etapa sin purificaci6n adicional. EIMS m/z 637,2 ([M]++Na).

Compuesto 29: A una mezcla de mon6mero de PBD (76 mg, 0,29 mmoles) y 28 de la etapa previa en DMF (2,9 ml) se anadi6 K2CO3 (49 mg, 0,35 mmoles) y KI (20 mg, 0,12 mmoles) secuencialmente. Se agit6 la mezcla en arg6n a ta, durante 20 h. Despues se retir6 DMF con alto vacio. Se reparti6 el residuo entre DCM y agua y se separaron las capas. La capa acuosa se extrajo ademas con DCM (3x3 ml). Las capas de DCM combinadas se lavaron con salmuera, se sec6 (Na2SO4) y se concentr6. La purificaci6n del residuo con cromatografia sobre gel de silice (DCM/CH3OH, 100:3) proporcion6 29 como s6lido parecido a cristal amarillo palido. EIMS m/z 1.025,6 ([M]++Na+2CH3OH); 993,5 ([M]++Na+CH3OH); 961,5 ([M]++Na).

Compuesto 30: A una disoluci6n agitada de ester 29 metilico (11,8 mg; 0,012 mmoles) en THF-MeOH-H2O (3:1:1; 0,5 ml) se anadi6 LiOH ac. 1 M (0,014 ml; 1,1 eq.) a ta y se control6 la reacci6n por TLC. Despues de 5 h, se enfri6 rapidamente la mezcla con AcOH (0,014 mmoles) y se evaporaron los volatiles. Purificado ademas por cromatografia por desorci6n subita sobre gel de silice (DCM:MeOH:AcOH = 95:5) proporcion6 el acido 30 deseado. EIMS m/z 947,5 ([M]++Na)

Compuesto 31: A una disoluci6n de acido 30 (4,6 mg; 0,005 mmoles) en DCM (1,0 ml) se anadieron EDC (1-etil-3(3-dimetilaminopropil) carbodiimida) como agente de acoplamiento (1,4 mg; 0,0075 mmoles) y NHS (0,74 mg; 0,0065 mmoles). Se agit6 la mezcla a ta, durante la noche, despues se filtr6 por un pequeno lecho de celite, se lav6 con DCM y se concentr6 para proporcionar el producto 31 deseado. Purificado ademas por cromatografia por desorci6n subita sobre gel de silice (DCM:MeOH = 100:3) proporcion6 el ester 31 de NHS deseado. EIMS m/z 1.022,5 ([M]++Na)

Ejemplo 11 : conjugado huMY9-6 -4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo

Se tratan 1,45 ml de una disoluci6n de anticuerpo huMy9-6 a una concentraci6n de 6,4 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene fosfato de potasio 0,05 M y cloruro de sodio 0,05 M, pH 8, con un exceso molar de 7,5 veces de una disoluci6n 9,5 mM de ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico del ejemplo 1 en dimetilacetamida (DMA) tal que la concentraci6n final de huMY9-6 es 5 mg/ml y la concentraci6n de DMA en el tamp6n es 20 %. La mezcla de reacci6n se agita a temperatura ambiente, durante 195 min., se filtr6 sobre MillexR-HV 0,45 IM (PVDF Durapore Millipore #SLHV013SL) y despues se carg6 en una columna de filtraci6n de gel de grado prep SuperdexTM 200 (Columna HiloadTM 16/60 GE# 17-1069-01) que se ha equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contiene fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5. Se recogen las fracciones que contienen anticuerpo conjugado, se mezcl6 y se concentr6 sobre Vivaspin 2 (10.000 MwCO HY Sartorius #VS02H02) para proporcionar producto (1,8 ml). Se analiz6 el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico (£319nm = 9087 M-1 cm-1 y £280nm = 12166 M-1 cm-1) y anticuerpo hu2H11 (£280nm = 206,539 M-1cm-1). Se enlaz6 un promedio de 2,1 restos de 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo por molecula de anticuerpo (1,6 mg/ml).

Ejemplo 12 : conjugado huB4-4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo

Se trata 3,4 ml de una disoluci6n de anticuerpo huB4 a una concentraci6n de 8 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene fosfato de potasio 0,05 M y cloruro de sodio 0,05 M, pH 8, con un exceso molar de 8 veces de una disoluci6n 11,5 mM de ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloxi metil]-fenoxi)-butirico del ejemplo 1 en DMA tal que la concentraci6n final de huB4 sea 5,6 mg/ml y la concentraci6n de DMA en el tamp6n sea 20 %. La mezcla de reacci6n se agita a temperatura ambiente, durante 3 h, se filtr6 sobre MillexR-HV 0,45 IM (PVDF Durapore Millipore #SLHV013SL) y despues se carg6 en una columna de filtraci6n de gel de grado prep SuperdexTM 200 (Columna HiloadTM 16/60 GE# 17-1069-01) que se ha equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contiene fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5. Se recogieron las fracciones que contenian anticuerpo conjugado, se mezclaron y se concentr6 sobre Vivaspin 15R (10.000 MwCO HY Sartorius #VS02H02) para proporcionar producto (5 ml). Se analiz6 el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico (£319nm = 9087 M-1 cm-1 y £280nm = 12166 M-1 cm-1) y anticuerpo huB4 (£280nm = 222,960 M-1cm-1). Se enlaz6 un promedio de 4,48 restos de 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo por molecula de anticuerpo (1,49 mg/ml).

Ejemplo 13 : conjugado hu2H11-4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo

Se tratan 3,45 ml de una disoluci6n de anticuerpo hu2H11 (vease la patente internacional wO 2008/010101 ; registrada por ATCC con el numero de registro PTA-7662) a una concentraci6n de 5,1 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene fosfato de potasio 0,05 M y cloruro de sodio 0,05 M, pH 8, con un exceso molar de 8 veces de una disoluci6n 10,5 mM de ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloxi metil]-fenoxi)-butirico del ejemplo 1 en DMA tal que la concentraci6n final de hu2H11 sea 4,3 mg/ml y la concentraci6n de DMA en el tamp6n sea 20 %. La mezcla de reacci6n se agita a temperatura ambiente, durante 3 h, se filtr6 sobre MillexR-HV 0,45 IM (PVDF Durapore Millipore #SLHV013SL) y despues se carg6 en una columna de filtraci6n de gel de grado prep SuperdexTM 200 (Columna HiloadTM 16/60 GE# 17-1069-01) que se ha equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contiene fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5. Se recogieron las fracciones que contenian anticuerpo conjugado, se mezclaron y se concentr6 sobre Vivaspin 15R (10.000 MwCO HY Sartorius #VS02H02) para proporcionar producto

(2,2 ml). Se analiz6 el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el ester metilico del acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico (£319nm = 9087 M-1 cm-1 y £280nm = 12166 M-1 cm-1) y anticuerpo hu2H11 (£280nm = 208,380 M-1cm-1). Se enlaz6 un promedio de 3,74 restos de 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo por molecula de anticuerpo (1,55 mg/ml).

Ejemplo 14 : conjugado huMY9-6 -3-(2-{2-[2-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo

Se tratan 8,2 ml de una disoluci6n de anticuerpo huMy9-6 a una concentraci6n de 7,2 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene acido N-(2-hidroxietil)-piperazin-N'-2-etanosulf6nico (HEPES) 0,05 M; cloruro de sodio 0,05 M y acido etilendiaminotetra-acetico 2 mM (AEDT), pH 8, con un exceso molar de 10 veces de una disoluci6n 10,4 mM de ester del acido N-hidroxisuccinimidilico de 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico del ejemplo 3 en DMA tal que la concentraci6n final de huMY9-6 es 3 mg/ml y la concentraci6n de DMA en el tamp6n es 20%. La mezcla de reacci6n se agita a temperatura ambiente, durante 3 h, se filtr6 sobre MillexR-SV 5 IM (PVDF Durapore Millipore #SLSV025SL) y despues se carg6 en una columna de filtraci6n de gel de grado prep SuperdexTM 200 (Columna HiloadTM 26/60 GE# 17-1071-01) que se ha equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contiene fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5. Se recogieron las fracciones que contenian anticuerpo conjugado, se combinaron y se concentr6 sobre Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k Millipore #UFC901024) para proporcionar producto (7 ml). Se analiz6 el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico (£319nm = 7566 M-1 cm -1 y £280nm = 7078 M-1 cm-1) y anticuerpo huMy9-6(£280nm = 206539 M-1cm-1). Se enlaz6 un promedio de 4,80 restos de 3(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo por molecula de anticuerpo (3,44 mg/ml).

Ejemplo 1� : conjugado hu2H11 -3-(2-{2-[2-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo

Se tratan 13,2 ml de una disoluci6n de anticuerpo hu2H11 a una concentraci6n de 4,7 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene acido N-(2-hidroxietil)-piperazin-N'-2-etanosulf6nico (HEPES) 0,05 M, cloruro de sodio 0,05 M y acido etilendiaminotetra-acetico (AEDT) 2 mM, pH 8, con glicofurol y un exceso molar de 10 veces de una disoluci6n 10,6 mM de ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico del ejemplo 3 en DMA tal que la concentraci6n final de hu2H11 es 3 mg/ml, la concentraci6n de glicofurol en el tamp6n es 10% y la concentraci6n de DMA en el tamp6n es 20 %. La mezcla de reacci6n se agita a temperatura ambiente, durante 3 h, se filtr6 sobre MillexR-SV 5 IM (PVDF Durapore Millipore #SLSV025SL) y despues se carg6 en una columna de filtraci6n de gel de grado prep SuperdexTM 200 (Columna HiloadTM 26/60 GE# 17-1071-01) que se ha equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contiene fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5. Se recogieron las fracciones que contenian anticuerpo conjugado, se combinaron y se concentr6 sobre Amicon Ultra-15 (Ultracel 10k Millipore #UFC901024) para proporcionar producto (3,6 ml). Se analiz6 el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2,1c][1,4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico (£319nm = 7566 M-1 cm-1 y £280nm = 7078 M-1 cm-1) y anticuerpo hu2H11 (£280nm = 208380 M-1cm-1). Se enlaz6 un promedio de 4,08 restos de 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo por molecula de anticuerpo (1,33 mg/ml).

Ejemplo 16 : conjugado hu2H11-6-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo [2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenil)-hex--inoilo

Se tratan 0,95 ml de una disoluci6n de anticuerpo hu2H11 a una concentraci6n de 3,2 mg/ml en un tamp6n acuoso que contenia fosfato de potasio 0,05 M y cloruro de sodio 0,05 M, pH 8, con un exceso molar de 8 veces de una disoluci6n 10,5 mM de ester N-hidroxisuccinimidilico del acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-hex-5-inoico del ejemplo 4 en DMA tal que la concentraci6n final de hu2H11 es 2,5 mg/ml y concentraci6n de DMA en el tamp6n es 20 %. La mezcla de reacci6n se agita a temperatura ambiente, durante 4 h, se filtr6 sobre MillexR-HV 0,45 IM (PVDF Durapore Millipore #SLHV013SL) y despues se carg6 en una columna de filtraci6n de gel de grado prep SuperdexTM 200 (Columna HiloadTM 16/60 GE# 17-1069-01) que se ha equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contiene fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5. Se recogieron las fracciones que contenian anticuerpo conjugado, se combinaron y se concentr6 sobre Amicon Ultra-4 (Ultracel 10k Millipore #UFC801096) para proporcionar producto (275 Il). Se analiz6 el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el ester metilico del acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidropirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-hex-5-inoico (£319 = 13594 M-1 cm-1y £280 = 19416 M-1 cm-1) y anticuerpo hu2H11 (£280nm = 208380 M-1 cm-1). Se enlaz6 un promedio de 1,75 restos de 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)

iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8-iloximetil]-fenil)-hex-5-inoilo por molecula de anticuerpo (0,48 mg/ml).

Ejemplo 17 : Preparacion de Disolucion Patron de IGP-08-NHS

Se prepararon disoluciones frescas de IGP-08-NHS (compuesto 10 del ej. 8) en un patr6n 0,005 M basado en un peso molecular de 787,81 en DMA. Se analiz6 la disoluci6n patr6n espectrofotometricamente usando un coeficiente de extinci6n de referencia determinado a 320 nm (£320 = 9137 M-1 cm-1).

Ejemplo 18: huMY9-6-IGP-08

Se selecciona anticuerpo huMy9-6 que se une al antigeno CD33 para la conjugaci6n de derivados de PBD. Se trata una disoluci6n de anticuerpo huMy9-6 en una concentraci6n de 5 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene acido N(2-hidroxietil)-piperazin-N'-2-etanosulf6nico (HEPES) 0,05 M y acido etilendiaminotetra-acetico (AEDT) 2 mM, pH 8, con un exceso molar de 6 veces de una disoluci6n de IGP-08-NHS (compuesto 10 del ejemplo 8) en DMA tal que la concentraci6n final de DMA en el tamp6n es 20%.

Se agita la mezcla de reacci6n a temperatura ambiente, durante 120 min. y despues se carga en una columna de filtraci6n de gel Sephadex G25 (Columna de Desalaci6n 26/10 HiPrep™ GE# 17-5087-01) que se habia equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contenia citrato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,135 M, pH 5,5. Se recogieron las fracciones que contenian anticuerpo conjugado y se combinaron para proporcionar producto. Se dializ6 la muestra combinada durante la noche contra el mismo tamp6n de eluci6n (citrato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,135 M, pH 5,5) para purificar ademas el producto. Se analiza el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el compuesto 8 del ejemplo 8 ( £320 = 9137 M-1 cm-1y £280=7743 M-1 cm-1) y anticuerpo huMy9-6(£280nm =206460 M-1cm-1). Se enlaz6 un promedio de 4,5 moleculas de PBD (Compuesto 9 del ejemplo 8) por molecula de anticuerpo.

Ejemplo 19: huB4-IGP-08

Se selecciona anticuerpo Hu-Anti-B4 que se une al antigeno CD19 expresado preferentemente en la superficie de las celulas de linfoma humano, para la conjugaci6n de derivados de PBD. Se trata una disoluci6n de anticuerpo huB4 en una concentraci6n de 8 mg/ml, en un tamp6n acuoso que contiene fosfato de potasio 0,05 M, cloruro de sodio 0,05 M y acido etilendiaminotetra-acetico (AEDT) 2 mM, pH 7,1 con un exceso molar de 5 veces de una disoluci6n de IGP-08-NHS (compuesto 10 del ejemplo 8) en dimetilacetamida (DMA) tal que la concentraci6n final de DMA en el tamp6n es 20 %. Se agita la mezcla de reacci6n a temperatura ambiente, durante 70 min y despues se carga en una columna de filtraci6n de gel Sephadex G25 (Columnas NAP™, GE# 17-0852-02) que se habian equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contenia fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5. Se recogieron las fracciones que contenian anticuerpo conjugado y se combinaron para proporcionar producto. Se dializ6 la muestra combinada durante la noche contra el mismo tamp6n de eluci6n (fosfato 0,010 M, cloruro de sodio 0,140 M, pH 6,5) para purificar ademas el producto. Se analiza el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el compuesto 8 del ej. 8 ( £320 = 9137 M-1 cm-1 y £280 = 7743

M-1

cm-1) y anticuerpo huB4 (£280nm = 222960 M-1cm-1). Se enlaz6 un promedio de 3,1 moleculas de PBD (Compuesto 9 del ejemplo 8) por molecula de anticuerpo.

Ejemplo 20: Preparacion de Disolucion Patron de IGP-13-NHS

Se prepararon disoluciones frescas de IGP-13-NHS (compuesto 31 del ej. 10) en un patr6n 0,0062 M basado en un peso molecular de 1.022,1 en DMA. Se analiz6 la disoluci6n patr6n espectrofotometricamente usando un coeficiente de extinci6n de referencia determinado a 320 nm (£320 = 9137 M-1 cm-1).

Ejemplo 21: hu2H11-IGP-13

Se selecciona anticuerpo hu2H11 que se une al antigeno EpCAM para la conjugaci6n de derivados de PBD. Se trata una disoluci6n de anticuerpo hu2H11 en una concentraci6n de 5 mg/ml en un tamp6n acuoso que contiene acido N(2-hidroxietil)-piperazin-N'-2-etanosulf6nico (HEPES) 0,05 M y acido etilendiaminotetra-acetico (AEDT) 2 mM, pH 8, con un exceso molar de 8 veces de una disoluci6n de IGP-13-NHS (compuesto 31 del ejemplo 10) en DMA tal que la concentraci6n final de DMA en el tamp6n es 15%. Se agita la mezcla de reacci6n a temperatura ambiente, durante 120 min. y despues se carga en una columna de filtraci6n de gel Sephadex G25 (Columna de Desalaci6n 26/10 HiPrep™ GE# 17-5087-01) que se habia equilibrado previamente en un tamp6n acuoso que contenia citrato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,135 M, pH 5,5. Se recogieron las fracciones que contenian anticuerpo conjugado y se combinaron para proporcionar producto. Se dializ6 la muestra combinada durante la noche contra el mismo tamp6n de eluci6n (citrato de sodio 0,01 M, cloruro de sodio 0,135 M, pH 5,5) para purificar ademas el producto. Se analiza el conjugado final espectrofotometricamente usando los coeficientes de extinci6n que se determinaron para el compuesto 29 del ejemplo 10 ( £320 = 9137 M-1 cm-1 y £280 = 7743 M-1 cm-1) y anticuerpo hu2H11 (£280nm = 215525

M-1

cm-1).Se enlaz6 un promedio de 4,7 moleculas de PBD (Compuesto 31 del ejemplo 10) por molecula de anticuerpo.

Ejemplo 22: EnsaYo de Union

Las afinidades de uni6n relativas del anticuerpo anti-B4 y su conjugado de tomaimicina en celulas Ramos que expresan el antigeno se determinan usando un ensayo basado en fluorescencia. Se anaden el conjugado anticuerpo -tomaimicina y el anticuerpo desnudo en concentraciones iniciales de1 a 10-7 M, en placas de 96 pozos y se valoran utilizando diluciones en serie de 3 veces, a fin de que haya duplicados para cada concentraci6n. Se anaden celulas Ramos 50.000 celulas por pozo, a cada pozo conteniendo distintas concentraciones del anticuerpo o conjugado, asi como a los pozos de control. Las placas se incubaron en hielo durante 3 horas. Despues del periodo de incubaci6n, se lavaron las celulas en la placa y se anade un anticuerpo secundario marcado para fluorescencia que se une a IgG humanizada, como anti-B4 y se incubaron las placas durante 1 hora en hielo. Se lavaron las placas de nuevo despues del periodo de incubaci6n y se fijaron las celulas con disoluci6n de formaldehido al 1%/PBS . Se ley6 la fluorescencia en cada pozo de las placas utilizando un analizador de fluorescencia FACSCalibur Becton Dickinson. Los datos se representaron graficamente como un porcentaje de la fluorescencia maxima obtenida para la concentraci6n mas alta de anticuerpo o conjugado.

Ejemplo 23: potencia Y especificidad in vitro de derivado de tomaimicina o conjugados de derivado de tomaimicina (ensaYo de viabilidad)

Protocolo general para usar:

Se anaden muestras de derivado de tomaimicina libre o conjugado de derivado de tomaimicina a una placa de cultivo de tejidos plana de 96 pozos y se valor6 usando diluciones en serie que oscilaban de 1x10-12 M a 3x10-7 M. Se anaden celulas de tumores positivas de antigeno o celulas de tumores negativas de antigeno a los pozos de tal manera que habia muestras por triplicado para cada concentraci6n de farmaco para cada linea celular. Las placas se incubaron a 37°C en una atm6sfera de CO2 al 5%, durante 4 dias.

Al final del periodo de incubaci6n, se anadieron 20 Il del reactivo de tetrazolio wST-8 sal monos6dica de (2-(2metoxi-nitrofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2-tetrazolio) a cada pozo y las placas se devuelven a la incubadora, durante 2 horas. Despues se mide la absorbancia en cada pozo de las placas utilizando el lector de placas de Molecular Devices a 450 nm. Se represent6 graficamente la fracci6n de supervivencia de celulas en cada concentraci6n de derivado de tomaimicina o conjugado.

Se analiz6 la citotoxicidad de los compuestos y su especificidad frente a los conjugados de la invenci6n contra las lineas celulares MOLT-4, BJAB, HL60/QC, HL60/ATCC y Ramos. Los resultados se ilustran en las figuras 1, 2, 3, 6 y

8.

Ejemplo 24 : ensaYo clonogenico

Procedimiento general para usar

Se pusieron en placas celulas MDA-MB-231 a 3.000 celulas por pozo, en dos placas de 6 pozos, separadas; Se pusieron en placas celulas PC-3 y SK-MEL-28, a 2.000 celulas por pozo, en dos placas separadas. Se anadi6 el(los) articulo(s) para analisis para dar concentraciones finales de 0, 5x10-13, 5x10-12, 5x10-11, 5x10-10 y 5x10-9 M por pozo (o intervalo de dosificaci6n similar) a cada placa. Por ejemplo, cuando se pusieron en placas celulas en 1 ml y 1 ml de una concentraci6n 2x del compuesto o conjugado de ensayo, se anadieron a los pozos apropiados para dar la concentraci6n final deseada en 2 mls. Se prepar6 la disoluci6n final del articulo para ensayo en el mismo medio que la linea celular; por lo tanto, se tuvieron que preparar diferentes diluciones de conjugado para cada linea celular diferente. Las placas de ensayo se pusieron en una incubadora a 37"C en CO2 al 5%. Se control6 el crecimiento celular y cuando las celulas en los pozos (control) "0" habian formado colonias pero no eran confluentes, normalmente 7 dias para estas lineas celulares, se retir6 el sobrenadante por aspiraci6n. Se lavaron las celulas una vez con PBS (Disoluci6n Tamp6n de Fosfato) y se aspir6 el sobrenadante. A cada pozo, se anadieron 0,5 ml por pozo de un violeta cristal al 0,1% / formalina al 10% /PBS. Se incubaron las placas a temperatura ambiente, durante 10-15 minutos. Se aspir6 el sobrenadante y se lavaron los pozos 3 veces con H2O destilada y despues se sec6 con aire. Se contaron las colonias en cada pozo y el numero de colonias en cada pozo dosificado se dividi6 entre el numero de colonias en el pozo "0" para dar la fracci6n de supervivencia. Despues se calcularon los valores IC50 a partir de los datos.

Los compuestos y las moleculas de conjugado descritas en los ejemplos han presentado un IC50 entre < 1 y 10.000 pM (veanse las figuras adjuntas y la Tabla I para valores especificos para las diversas lineas celulares).

Tabla I: datos in vitro (IC50 en pM) para los derivados de tomaimicina no conjugados para diversas lineas celulares.

Ramos

HL60�QC HL60�AT CC MDA-MB-231 PC-3 S�-MEL-28

compuesto 9 del esquema 2 (=IGP-08)

2.700 3.500 2.600

compuesto 8 del esquema 2 (=IGP-08-OMe)

8,0 1,1 4,0 17,0 27,0 10,0

compuesto 18 del esquema 3 (ester metilico de compuesto del ej.9)

5.000 5.000

N O NOO O N O N O HH O O O ester metilico del compuesto del ej. 2

1,4 12,0

N ONOO O N ON O HH O O O ester metilico del compuesto del ej. 1

< 0,76 < 0,76

N ONOO O N ON O HH O OH O compuesto del ej.1 en la forma acida

580,0 1.200,0 2.000,0

34 35

Ramos

HL60�QC HL60�AT CC MDA-MB-231 PC-3 S�-MEL-28

N ONOO O N O N O HH O O ����� �������� ���

1,2 2,2 12,0 27,0 15,0

N O NOO O N O N O HH O O O O O O ����� �������� ���

12,0 16,0 7,4 9,7

��� ������� 4 ��LDt�13�ha��

50,0 300,0 710,0

N O NOO N O N O N O HH O O O O O O ����� �������� ���

8,0 500,0 71,0

Ramos

HL60�QC HL60�AT CC MDA-MB-231 PC-3 S�-MEL-28

N O NOO N O N ON O HH O O O

1,7 11,0 8,7

O N O O O N O NOO O N ON O HH

9,0 500,0 90,0

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES

   1. Compuesto seleccionado del siguiente grupo:

   asi como los correspondientes esteres N-hidroxisuccinimidilicos.

   o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polim6rficas de estos compuestos o sus is6meros 6pticos, racematos, diastereois6meros o enanti6meros.
2. 2. Un compuesto segun la reivindicaci6n 1 que tiene la siguiente nomenclatura :

   acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-butirico ; acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8

   iloximetil]-fenoxi)-acetico;

   acido 3-(2-{2-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico; acido 6-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c] [1.4] benzodiazepin-5-ona-8

   iloximetil]-fenil)-hex-5-inoico;

   acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propi6nico; acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8

   iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico;

   acido N-[2-(3,5-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin-5-ona-8iloximetil]-fenoxi)-etil]-N-metil-succinamico; acido 4-(3,5-Bis-[(S)-2-metiliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin-5-ona-8

   iloximetil]-fenil)-propanoico;

   acido (2-{2-[2-(2-{3-[3,5-Bis-(7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-acetico; acido (3-{2-[2-(2-{3-[3,5-Bis-(7-metoxi-2-metilen-5-oxo-2,3,5,11a-tetrahidro-1H-benzo[e]pirrolo[1.2

   a][1.4]diazepin-8-iloximetil)-fenil]-propoxi}-etoxi)etoxi]-etoxi}-etoxi)-propanoico; asi como los correspondientes esteres N-hidroxisuccinimidilicos.

   o sus sales, hidratos o sales hidratadas aceptables farmaceuticamente o las estructuras cristalinas polim6rficas de estos compuestos o sus is6meros 6pticos, racematos, diastere6meros o enanti6meros.
3. 3. Una molecula de conjugado que comprende uno o mas compuesto(s) segun la reivindicaci6n 1 6 2 unida covalentemente a un agente de uni6n a la celula mediante el grupo ligante -COOHo

   de un ligante del (de los) compuesto(s).
4. 4. Un conjugado segun la reivindicaci6n 3 en donde el agente de uni6n a la celula esta modificado con un agente de modificaci6n para mejorar la reactividad de dicho agente de uni6n a la celula hacia el grupo ligante -COOH o

   del ligante del compuesto.

   �. Una molecula de conjugado de acuerdo con la reivindicaci6n 3 6 4, en la que dicho agente de uni6n a la celula se elige de anticuerpos o un fragmento de un anticuerpo que contenga al menos un sitio de uni6n, linfocinas, hormonas, factores de crecimiento, moleculas para transporte de nutrientes o cualquier otra molecula o sustancia de uni6n a la celula.

   5 6. Una molecula de conjugado de acuerdo con la reivindicaci6n 3 a 5, en la que dicho agente de uni6n a la celula se elige de anticuerpos monoclonales; anticuerpos quimericos; anticuerpos humanizados; anticuerpos totalmente humanos; anticuerpos monocatenarios; fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab', F(ab')2 y Fv, interferones; peptidos; linfocinas tales como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6; hormonas tales como insulina, TRH (hormonas liberadoras de tirotropina), MSH (hormona estimuladora de melanocitos), hormonas esteroideas, tales como

   10 andr6genos y estr6genos; factores de crecimiento y factores estimuladores de colonias tales como EGF, TGFa, factor de crecimiento semejante a insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF y GM-CSF; vitaminas, tales como folato y transferrina.
5. 7. Una molecula de conjugado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en la que el agente de uni6n a la celula y dicho(s) compuesto(s) estan unidos por un grupo amido.

   15 8. Proceso de preparaci6n de una molecula de conjugado unida por amida en la que el agente de uni6n a la celula se hace reaccionar con el compuesto acido de N-hidroxi-succinimida de la reivindicaci6n 1 6 2.
6. 9. Un proceso segun la reivindicaci6n 8 en donde el agente de uni6n a la celula esta modificado con un agente de modificaci6n para mejorar la reactividad de dicho agente de uni6n a la celula hacia el grupo ligante -COOH o

   20 del ligante del compuesto.

7. 10.

   Un proceso segun las reivindicaciones 8 6 9 en donde el agente de uni6n a la celula es una anticuerpo o un anticuerpo monoclonal.

8. 11.

   Un proceso segun las reivindicaciones 8 a 10 en donde el conjugado se purifica mediante cromatografia de exclusi6n de tamano, cromatografia de adsorci6n, cromatografia de intercambio i6nico, cromatografia de

   25 interacci6n hidr6foba, cromatografia de afinidad, HPLC, cromatografia sobre hidroxiapatita, dialisis o diafiltraci6n.
9. 12. Una composici6n farmaceutica que comprende una molecula de conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o un compuesto como se define en las reivindicaciones 1 o 2 junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable.

   30 13. Uso de una cantidad efectiva de una molecula de conjugado como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7 o un compuesto como se define en las reivindicaciones 1 o 2, junto con un vehiculo farmaceuticamente aceptable para la preparaci6n de un medicamento para tratar el cancer.
10. 14. Compuesto seleccionado del siguiente grupo:

    Fig. 1. Curvas de la determinacion de la potencia in vitro del ester metilico del acido 4-(3,� -Bis-[(S)-2-et(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro- pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirico del ej. 1.

    Fig. 2. Curvas de la determinacion de la potencia in vitro del ester metilico del acido 4-(3,� -Bis-[(S)-2-et(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-acetico del ej. 2.

    Fig. 3. Curvas de la determinacion de la potencia in vitro de compuestos 8 (IGP08) Y 9 (IGP08-OMe) del ejemplo 8 mostrando maYor potencia para el ester IGP08-OMe que para el acido IGP08

    Fig. 4. Analisis MS (espectro de masas) del conjugado huMY9-6 desglucosilado -4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)iliden-7-metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo (2,1 Farmaco�Ab por UV) del ej. 11

    D0 D1 D2 D3

    Fig. �. Analisis MS del conjugado huB4 desglucosilado -4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo (4,48 F�A por UV) del ej. 12

    4�1

    Fig. 6. Analisis MS del conjugado hu2H11 desglucosilado-4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4] benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo (3,74 F�A por UV) del ej. 13

    Fig. 7. Analisis MS del conjugado huMY9-6 -3 -(2-{2-[2-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo (4,80 F�A por UV) del ej. 14

    Fig. 8. Analisis MS de conjugado hu2H11 desglucosilado-3-(2-{2-[2-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)propionilo (4,08 F�A por UV) del ej. 1� Fig. 9. Analisis por espectro de masas de huMY9-6 desglucosilado -IGP08; (Farmacos�Anticuerpo = 4,2) del ejemplo 18

    Fig. 13. Citotoxicidad: huB4-IGP08 (3,1 F�A) frente a celulas B�AB (Ag�), Ramos (Ag�) Y MOLT-4 (Ag-)

    Fig. 14. Union de anticuerpo hu-B4 Y conjugado huB4-IGP08 del ejemplo 19 Fig. 1�. Analisis MS de hu2H11 desglucosilado - IGP-13 (4,7 F�A por UV) del ej. 21

    Fig.17. Datos de citotoxicidad in vitro para ester metilico del acido 3-(2-{2-[2-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-etoxi]-etoxi}etoxi)-propionico del ej.

    Fig.18. Datos de citotoxicidad in vitro para el ester metilico del acido 4-(2,6-Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-piridin-4-iloxi)-butirico del ej. 6

    Fig. 20. Datos de citotoxicidad in vitro para conjugado huMY9-6 - 4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo del ej. 11, en celulas HL60�ATCC (Ag�) Y Ramos (Ag-)

    Fig. 21: Datos de citotoxicidad in vitro para conjugado huB4 -4-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi-1,2,3,11atetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-butirilo del ej. 12, en celulas Ramos (Ag�) Y MOLT-4 (Ag-) Fig. 23 Datos de citotoxicidad in vitro para conjugado huMY9-6 -3 -(2-{2-[2-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7metoxi-1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)propionilo del ej. 14, en celulas HL60�ATCC (Ag�) Y Ramos (Ag-)

    Fig Fig. 24 Datos de citotoxicidad in vitro para conjugado hu2H11 -3-(2-{2-[2-(3,� -Bis-[(S)-2-et-(E)-iliden-7-metoxi1,2,3,11a-tetrahidro-pirrolo[2.1c][1.4]benzodiazepin--ona-8-iloximetil]-fenoxi)-etoxi]-etoxi}-etoxi)-propionilo del ej. 1�, en celulas MDA-MB-231 (Ag�), PC-3 (Ag�) Y S�-MEL-28 (Ag-)