EA019938B1

EA019938B1 - Цитотоксические средства, включающие новые соединения томаймицина, и их терапевтическое применение

Info

Publication number: EA019938B1
Application number: EA201070163A
Authority: EA
Inventors: Эрве Бушар; Рави В. Дж. Чари; Ален Коммерсон; Юнхун Дэн; Лоранс Гози
Original assignee: Санофи-Авентис
Priority date: 2007-07-19
Filing date: 2008-07-18
Publication date: 2014-07-30
Also published as: IL203318A; ATE530553T1; ME00969B; US20100316656A1; GT201000008A; JP5551070B2; EP2170890B1; SI2170890T1; CY1114922T1; DK2170890T3; HRP20120067T1; SI2019104T1; HK1144289A1; WO2009016516A3; DK2019104T3; CL2008002139A1; PE20130590A1; WO2009016516A2; EA201070163A1; CY1112278T1

Abstract

Изобретение относится к новым производным томаймицина, содержащим линкер. Изобретение также относится к конъюгатным молекулам, которые содержат одно или более указанных производных томаймицина, ковалентно связанных с агентом, связывающимся с клеткой, посредством сшивающей группы, присутствующей на линкере производного соединения томаймицина. Изобретение также относится к получению производных соединений томаймицина и конъюгатных молекул.

Description

Настоящее изобретение относится к новым производным томаймицина и к их терапевтическому применению в качестве цитотоксических средств. Терапевтическое применение основано на направленной доставке производных томаймицина к определенной популяции клеток путем химического связывания производного томаймицина со связывающимся с клеткой агентом. Изобретение также относится к конъюгатным молекулам, содержащим одно или более из указанных производных томаймицина, химически связанных со связывающимся с клеткой агентом, необязательно модифицированным.

Предыдущий уровень техники в данной области

К настоящему времени появилось множество сообщений о предпринятых попытках осуществления направленной доставки к опухолевым клеткам конъюгата моноклональное антитело-лекарственное средство (8е1а е! а1., ίη 1ттипо-сои)ида!ек, 189-216 (С. Уоде1, еб. 1987); Ойоке е! а1., ίη Тагде!еб Этидк 1-22 (Е. Оо1бЬегд, еб. 1983); Э|епег е! а1., ίη АпйЬобу теб1а!еб бейуегу кук!етк, 1-23 (1. КобтеП, еб. 1988); Р1е1ег8/ е! а1., ίη АпйЬобу теб1а!еб бейуегу кук!етк, 25-53 (1. Коб^е11, еб. 1988); Вито1 е! а1., ίη АпйЬобу теб1а!еб бейуегу кук!етк, 55-79 (1. Коб^е11, еб. 1988); О.А. Р|е1егкх & К. Кгаиег, 2, 1. Эгид Татдейпд, 183-215 (1994); К.УЭ. Сйап, 31 Абу. Эгид Оейуегу Неук., 89-104 (1998); \У.А. В1ай1ег & К.У.1. Сйап, ίη Апйсапсег Адеп!к, Егопйегк ίη Сапсег Сйето!йегару, 317-338, АС8 8утрокшт 8епек 796; Орта е! а1. ебк, Атепсап Сйет1са1 8осю1у 2001; ТМ. ЬатЬег1, 5 Сиггеп! Оршюп ίη Рйагтасо1оду, 543-549 (2005); Р.К. Натапп, 15 Ехрег! Ор1йоп оп Тйегареийск Ра!еп!к, 1087-1103 (2005)). Все ссылки и патенты, цитируемые в описании, включены в него посредством ссылки.

Цитотоксические лекарственные средства, такие как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С и хлорамбуцил, были конъюгированы с рядом мышиных моноклональных антител. В некоторых случаях молекулы лекарственных средств соединяли с молекулами антител через промежуточную молекулу-носитель, такую как сывороточный альбумин (Оатпей е! а1., 46, Сапсег Кек. 2407-2412 (1986); Ойкала е! а1. 23, Сапсег Iттиηо1. 1ттипо!йег. 81-86 (1986); Еп6о е! а1., 47 Сапсег Кек. 1076-1080 (1980)), декстран (ΗιιπνίΙζ е! а1., 2 Арр1. Вюсйет. 25-35 (1980); МапаЫ е! а1., 34 Вюсйет. Рйагтасо1. 289-291 (1985); Э111тап е! а1., 46 Сапсег Кек., 4886-4891 (1986); 8йоуа1 е! а1., 85, Ргос. №111. Асаб. δοί, 8276-8280 (1988)) или полиглутаминовая кислота (Ткикаба е! а1., 73, 1. №111. Сапс. 1пй., 721-729 (1984); Ка!о е! а1., 27 1. Меб. Сйет., 1602-1607 (1984); Ткикаба е! а1., 52, Вг. 1. Сапсег, 111116 (1985)).

Широкий ряд линкерных технологий использовали для получения таких иммуноконъюгатов, при этом исследовали как расщепляемые, так и нерасщепляемые линкеры. В большинстве случаев можно было наблюдать высокий цитотоксический потенциал лекарственных средств, однако, если молекулы лекарственных средств могли быть высвобождены из конъюгатов в немодифицированном виде у целевого (таргетированного) участка, то использовали расщепляемый линкер. Тесты цитотоксичности ίη уйто, однако, выявили, что конъюгаты антитело-лекарственное средство могли убивать не только антигенположительные клетки, но также и другие соседние клетки, независимо от экспрессии антигена на их поверхности. Данное явление было названо эффектом свидетеля. Такой эффект был обнаружен в конъюгатах анти-СапАд антитело, йиС242, с мейтансиноидами и с аналогом СС1065 (Епсккоп е! а1., 66 Сапсег Кек., 4426-4433 (2006); Койип е! а1., 66 Сапсег Кек., 3214-3221 (2006)). До сих пор лишь конъюгаты, связанные посредством расщепляемой связи, такой как восстанавливаемая дисульфидная связь, проявляли неспецифическую цитотоксичность, в то время как конъюгаты, связанные через невосстанавливаемую тиоэфирную связь, не проявляли эффекта свидетеля.

Сильнодействующие цитотоксические эффекторные молекулы, связанные с таргетирующими средствами, такими как антитела, могли бы образовывать эффективные производные лекарственных средств после внутриклеточного процессинга конъюгата. Это могло бы произойти, если образованные клеточные метаболиты проявляли бы нежелательные или нелегко контролируемые побочные эффекты. Для того чтобы контролировать токсичность конъюгатов антитело-лекарственное средство, чрезвычайно благоприятным может оказаться использование нерасщепляемых линкеров.

Другим главным недостатком большинства конъюгатов антитело-лекарственное средство является их неспособность обеспечивать достаточную концентрацию лекарственного средства у таргетированного участка из-за ограниченного числа таргетированных антигенов и относительно умеренной цитотоксичности канцеростатических лекарственных средств, подобных метотрексату, даунорубицину и винкристину. Для достижения существенной цитотоксичности становится необходимым связывание большого числа молекул лекарственного средства, либо прямо с антителом, либо через полимерную молекулуноситель. Однако такие сильно модифицированные антитела часто хуже связываются с антигеноммишенью и быстро выводятся ίη у1уо из кровотока. Таким образом, альтернативой является использование наиболее эффективных молекул лекарственных средств, таких как молекулы, представленные в описании ниже.

Нерасщепляемые линкеры также использовали при конъюгировании. В частности, ими интересовались исследователи с целью применения в радиоиммунотерапии. Их также использовали при соединении токсинов с моноклональными антителами, например, экзотоксина Ркеиботопак с МАЬ 9.2.27 с использованием гетеробифункционального малеимида сукцинимидил 4-(№малеимидометил)циклогексан-1

- 1 019938 карбоксилата (8МСС) (ЕР 306943). Конъюгат МЛЬ с токсином оказался более специфичным ίη νίίτο по отношению к положительной клеточной линии, чем соответствующий конъюгат, связанный дисульфидной связью, и, следовательно, менее токсичным, как проверено на мышиной модели. Неспецифическая токсичность снижается в значительной степени при использовании нерасщепляемого линкера. Такой нерасщепляемый линкер использовали в случае трастузумаба (Герцептина), который таргетирует НЕР.2рецептор (ЕгЬВ), НЕКК2 является ключевой мишенью, и исследовали возможности максимального повышения эффекта использования МАЬ для ингибирования данного рецептора. Одним подходом является усиление эффективности трастузумаба (герцептина) путем соединения его с химиотерапевтическим средством, таким образом, делая возможным осуществление цитотоксической терапии на клеточном уровне (Вапкоп апй ЗНхукохузкС 63 (8ирр1. 1) Опсо1оду, 17-24 (2002)). Существуют другие варианты 8МСС-реагента, например водорастворимый сульфосукцинимидил 4-(Ы-малеимидометил)циклогексан1-карбоксилат (сульфо-8МСС), который использовали в реакциях конъюгирования. Другие нерасщепляемые линкеры включают, в частности, Ы-сукцинимидил-8-ацетилтиоацетат (8АТА), 8АТА-8МСС, 2иминотиазол (21Т) и 21Т-8МСС (Еои1оп е! а1., 10, Вюсоищда!е СНет., 867-876 (1999)). Поперечно связанные реагенты, содержащие фрагмент, основанный на галогенацетиле, также использовали, и они включали Ы-сукцинимидил-4-(йодацетил)аминобензоат (81АВ), Ν-сукцинимидилйодацетат (81А), Νсукцинимидилбромацетат (8ВА) и Ν-сукцинимидил 3-(бромацетамидо)пропионат (8ВАР). Указанные поперечно связанные реагенты образуют нерасщепляемые линкеры, произведенные из галогенацетилоснованных фрагментов. Несмотря на указанные выше трудности, были описаны связанные с молекулами лекарственных средств пригодные цитотоксические средства, включающие связывающиеся с клеткой фрагменты и группу цитотоксических лекарственных средств, известных как мейтансиноиды (патент США 5208020, патент США 5416064 и публикация Р.У.Т СТагг 31 Ай\^гапсей Эгид Ое1кегу Ре\'1е\\'5 89104 (1998)). Аналогично были описаны пригодные цитотоксические средства, включающие связывающиеся с клеткой фрагменты и аналоги и производные эффективного противоопухолевого антибиотика СС-1065 (патент США 5475092, патент США 5585499 и патент США 6756397).

Производные томаймицина представляют собой пирроло[1,4]бензодиазепины (РВЭ), известный класс соединений, проявляющих их биологические свойства путем ковалентного связывания с Ν2 гуанина в малой бороздке ДНК. Производные РВЭ включают ряд связывающихся веществ в малой бороздке, таких как антрамицин, неотрамицин и ОС-81. Противоопухолевая активность томаймицина, однако, ограничена из-за его неспецифической токсичности в отношении нормальных клеток. Поэтому существует необходимость повышения терапевтической активности и уменьшения неспецифических токсических эффектов соединений томаймицина. Авторы настоящего изобретения показали, что эту проблему можно решить с помощью направленной доставки соединений томаймицина путем связывания их со связывающимися с клеткой агентами. Кроме того, существует необходимость разработки производных томаймицина, которые являются растворимыми и устойчивыми в водных растворах. Кроме того, томаймицин является недостаточно эффективным для использования его в конъюгатах, содержащих связывающиеся с клетками агенты.

Недавно были описаны несколько новых производных РВЭ и их противоопухолевая активность в предклинических моделях (\УО 00/12508 и \УО 2005/085260). Однако первоначальные клинические испытания на человеке указывают на то, что соединения данного класса являются чрезвычайно токсичными с учетом очень малой дозы, которая может быть введена человеку (I. Риζаηον, Ргос. ААСК-кС1ЕОКТС !п(егпа11опа1 СопСегепсе, РЫ1айе1рЫа, И8А 2005, АЬЧгас! #В117). Поэтому желательно разработать альтернативные производные, проявляющие меньше побочных эффектов без нарушения цитотоксической активности.

Предшествующий уровень техники

Международные заявки \УО 2007/085930 и \УО 2008/010101 описывают производные томаймицина, которые могут связываться со связывающимся с клеткой агентом через линкер, но линкер не является линкером, определенным для соединений согласно изобретению.

Статья Те!тайейтоп Ье!!ег8, νο1. 29, № 40, р. 5105-5108 описывает производные томаймицина, ссылка (13)-(15), без какого-либо линкера.

Международная заявка \¥О 2005/085250 описывает димеры РВЭ общей формулы РВЭ-А-У-Х(Не1)_па-Ь- (Не1)_пЬ-Ь- (Не!)_пс-Т-(Не!')_пй-Е- (Не1')_пе-Е-(Не1')_п£-Х'-¥'-А'-РВО', где Не! и Не!' означают аминогетероариленовые группы формулы -1-0-1' или Т-О-1-, где О означает необязательно замещенный гетероарилен, п_а-п_С являются целыми числами между 0 и 5, Ь может быть β-аланином, глицином, 4аминомасляной кислотой или простой связью. Оба X и X' означают либо -ΝΠ-, либо -С(=О)-, и Υ и Υ' означают двухвалентные группы, так что НТ означает алкил, гетероциклическую или арильную группу или простую связь. Группы А и А' выбирают из О, 8, NΠ или простой связи. Т является двухвалентным линкером формулы -кН-Р-кН- или -С(=О)-Р-С(=О)-, где О является двухвалентной группой, так что ОН означает алкил, гетероциклическую или арильную группу (необязательно замещенную). Соединения согласно общей формуле, все, содержат -кН- или -С(=О)-, как X и X', и -кН-О-кН- или -С(=О)Ю-С(=О)-, которые не представляют собой случай для соединений согласно изобретению.

Международная заявка \¥О 2005/023814 описывает димеры РВЭ, у которых атом азота кЮ защи

- 2 019938 щен посредством Кю-СОО-, содержащим мостик -Х-КХ-, где Я означает алкиленовую группу, необязательно прерываемую одним или более гетероатомами Ν, О или δ и/или ароматическими кольцами, и X является О, δ или ΝΗ. Упоминания о линкере на мостике -Х-Я''-Х- не имеется. Кроме того, соединения согласно изобретению не имеют защиты у азота N10.

Статья Еигореап 1оигпа1 о! Меб1С1иа1 СйетЩгу, νοί. 40, № 7, р. 641-654, описывает димеры ΡΒΌ, ссылки (38)-(40), которые не содержат какого-либо линкера, как соединения согласно изобретению.

Статья Ехрег! ορίηίοη; Мопос1оиа1 апбЬобу-бгид сопщда!е8, ЛкЫеу риЬйсабопк, νοί. 15, № 9, 2005, р. 1087-1103, ΙδδΝ: 1354-3774, не описывает соединения согласно изобретению, и статья Сапсег Яе§. 2006, 66(8), р. 4426-4433 описывает мейтансиноид, соединенный со связывающимися с клеткой агентами.

Сущность изобретения

Изобретение относится к новым соединениям томаймицина, подробно охарактеризованным далее в разделе Соединения томаймицина. Изобретение также относится к конъюгатным молекулам, которые включают одно или более из указанных выше соединений томаймицина, ковалентно соединенных со связывающимся с клеткой агентом через сшивающую группу, которая присутствует на линкере соединения томаймицина. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей указанные конъюгат или соединение томаймицина, к применению указанного соединения томаймицина для получения лекарственного средства и к способу получения конъюгатных молекул.

Подробное описание изобретения

Определения.

Алк представляет собой алкил, алкен или алкин;

алкил означает алифатическую углеводородную группу, которая может быть прямой или разветвленной, содержащую от 1 до 20 атомов углерода в цепи, или циклическую группу, содержащую от 3 до 10 атомов углерода. Предпочтительные алкильные группы содержат от 1 до 12 атомов углерода в цепи. Разветвленная означает, что одна или более низшие алкильные группы, такие как метил, этил или пропил, присоединены к линейной алкильной цепи. Примеры алкильных групп включают метил, этил, нпропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, н-пентил, 3-пентил, октил, нонил, децил, циклопентил и циклогексил;

алкен означает алифатическую углеводородную группу, содержащую углерод-углеродную двойную связь, и которая может быть прямой или разветвленной, содержащую от 2 до 15 атомов углерода в цепи. Предпочтительные алкенильные группы содержат от 2 до 12 атомов углерода в цепи и более предпочтительно приблизительно от 2 до 4 атомов углерода в цепи. Типичные алкенильные группы включают этенил, пропенил, н-бутенил, изобутенил, 3-метилбут-2-енил, н-пентенил, гептенил, октенил, ноненил, деценил;

алкин означает алифатическую углеводородную группу, содержащую углерод-углеродную тройную связь, и которая может быть прямой или разветвленной, содержащую от 2 до 15 атомов углерода в цепи. Предпочтительные алкинильные группы содержат от 2 до 12 атомов углерода в цепи и более предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода в цепи. Типичные алкинильные группы включают этинил, пропинил, н-бутинил, 2-бутинил, 3-метилбутинил, н-пентинил, гептинил, октинил и децинил;

атом галогена относится к атому фтора, хлора, брома или йода; предпочтительно к атому фтора и хлора;

арил означает ароматическую моноциклическую или мультициклическую углеводородную кольцевую систему, содержащую от 6 до 14 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 10 атомов углерода. Типичные арильные группы включают фенил или нафтил;

Не! означает гетероцикл или гетероарил;

термины гетероцикл или гетероциклическая группа относятся к насыщенным, частично ненасыщенным или ненасыщенным, неароматическим стабильным 3-14-, предпочтительно 5-10-членным моно-, би- или мультициклическим кольцам, где по меньшей мере один член кольца является гетероатомом. Обычно гетероатомы включают, но не ограничиваются ими, атомы кислорода, азота, серы, селена и фосфора. Подходящие гетероциклы также описаны в публикации ТНе НаибЬоок о! СйетЩгу апб Рйуыск, 76!Н Ебйюп, СЯС Ргекк, 1пс., 1995-1996, р. 2-25 до 2-26, данные о которых включены в описание посредством ссылки.

Предпочтительные неароматические гетероциклические группы включают, но не ограничиваются ими, пирролидинил, пиразолидинил, имидазолидинил, оксиранил, тетрагидрофуранил, диоксоланил, тетрагидропиранил, диоксанил, диоксоланил, пиперидил, пиперазинил, морфолинил, пиранил, имидазолинил, пирролинил, пиразолинил, тиазолидинил, тетрагидротиопиранил, дитианил, тиоморфолинил, дигидропиранил, тетрагидропиранил, дигидропиранил, тетрагидропиридил, дигидропиридил, тетрагидропиридинил, дигидротиопиранил, азепанил, а также конденсированные системы, образующиеся в результате конденсации с фенильной группой;

термин гетероарил или ароматические гетероциклы относится к 5-14-, предпочтительно 5-10членному ароматическому гетеро-, моно-, би- или мультициклическому кольцу. Примеры включают пирролил, пиридил, пиразолил, тиенил, пиримидинил, пиразинил, тетразолил, индолил, хинолинил, пу

- 3 019938 ринил, имидазолил, тиенил, тиазолил, бензотиазолил, фуранил, бензофуранил, 1,2,4-тиадиазолил, изотиазолил, триазолил, тетразолил, изохинолил, бензотиенил, изобензофурил, пиразолил, карбазолил, бензимидазолил, изоксазолил, пиридил-И-оксид, а также конденсированные системы, образующиеся в результате конденсации с фенильной группой;

алкил, циклоалкил, алкенил, алкинил, арил, гетероарил, гетероцикл и т.п. относятся также к соответствующим алкилену, циклоалкилену, алкенилену, алкинилену, арилену, гетероарилену, гетероциклену и т.п. группам, которые образуются путем удаления двух атомов водорода;

нерасщепляемые линкеры означает любую группу, подходящую для соединения ковалентной связью указанного выше производного томаймицина со связывающимся с клеткой агентом, где указанная выше группа не содержит дисульфидных групп, кислотолабильных групп, фотолабильных групп, неустойчивых к действию пептидаз групп и неустойчивых к действию эстераз групп. Предпочтительно указанные выше нерасщепляемые линкеры содержат концевую карбоксигруппу или амидную группу или их предшественники. Линкер не расщепляется в течение внутриклеточного процессинга после интернализации конъюгатной молекулы внутрь клетки и потенциального протеолиза со связывающимся с клеткой агентом;

выражение сшиваемые с агентом, связывающимся с клеткой относится к производным томаймицина, содержащим по меньшей мере один линкер, который, в свою очередь, содержит сшивающую группу или ее предшественник, подходящую для связывания указанных выше производных с агентом, связывающимся с клеткой; предпочтительными сшивающими группами являются карбокси, амидные связи или их предшественники;

выражение сопряженный с агентом, связывающимся с клеткой, относится к конъюгатной молекуле, включающей по меньшей мере одно производное томаймицина, связанное со связывающимся с клеткой агентом через подходящую сшивающую группу, или ее предшественник; предпочтительными сшивающими группами являются нерасщепляемые связи или их предшественники;

предшественник данной группы относится к любой группе, из которой может образоваться данная группа путем какого-либо снятия защитных групп, химической модификации или реакции сочетания;

пациент относится либо к животному, такому как ценное животное для селекции, компании или для сохранения, или предпочтительно человеку или ребенку, который поражен или может быть поражен одним или более заболеваниями и состояниями, представленными в описании;

терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения согласно настоящему изобретению, которое проявляет эффективность в предотвращении, ослаблении, исключении, лечении или контролировании симптомов представленных в описании заболеваний и состояний. Термин контролирование предполагает относиться ко всем способам, где может быть достигнуто замедление, приостановка, подавление или прекращение развития заболеваний и состояний, представленных в описании, но необязательно указывает на полное исключение всех симптомов заболевания или состояния, и предназначен включить профилактическое лечение;

фармацевтически приемлемые относится к таким соединениям, материалам, носителям, композициям или дозированным формам, которые являются, в сфере тщательного медицинского обследования, подходящими для контакта с тканями человека и животных без излишней токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблемных осложнений, соизмеримых с допустимым отношением польза/риск;

фармацевтически приемлемые соли относятся к производным описанных соединений, где родительское соединение модифицировано путем образования из него солей с кислотой или основанием. Фармацевтически приемлемые соли включают общепринятые нетоксичные соли или четвертичные аммониевые соли родительского соединения, образованные, например, из нетоксичных неорганических или органических кислот. Например, такие обычные нетоксичные соли включают соли, произведенные из неорганических кислот, таких как хлористо-водородная, бромисто-водородная, серная, сульфаминовая, фосфорная, азотная и т.п.; и соли, полученные из органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, янтарная, винная, лимонная, метансульфокислота, бензолсульфокислота, глюкуроновая, глутаминовая, бензойная, салициловая, толуолсульфокислота, щавелевая, фумаровая, малеиновая, молочная кислота и т.п. Кроме того, дополнительные соли включают аммониевые соли, такие как трометамин, меглумин, эполамин и т.д., соли металлов, таких как натрий, калий, кальций, цинк или магний. Фармацевтически приемлемые соли согласно настоящему изобретению могут быть синтезированы из родительского соединения, содержащего основный или кислотный фрагмент, обычными химическими способами. Обычно такие соли могут быть получены путем взаимодействия свободных кислотных или основных форм указанных соединений со стехиометрическим количеством соответствующего основания или кислоты в воде или в органическом растворителе или в смеси из двух компонентов. Обычно неводные среды, подобные эфиру, этилацетату, этанолу, изопропанолу или ацетонитрилу, являются предпочтительными. Перечень подходящих солей находится в К.еттд1ои'8 Рйагтасеибса1 Заеисек, 17111 еб., Маск РиЫщЫид Сотрапу, Еа^оп, РА, 1985, р. 1418, раскрытие которых включено в описание посредством ссылки;

- 4 019938 лечение или терапия означает обратимость, ослабление, торможение развития или предотвращение нарушения или состояния, к которому такой термин применим, или одного или более симптомов такого нарушения или состояния;

терапевтически эффективное количество означает количество соединения/лекарственного средства согласно настоящему изобретению, эффективное в предотвращении или лечении упомянутого выше патологического состояния;

фармацевтически или фармацевтически приемлемые относятся к молекулярным сущностям и композициям, которые не проявляют неблагоприятную, аллергическую или другую нежелательную реакцию при введении животному или человеку по необходимости;

фармацевтически приемлемый наполнитель включает носители, разбавители, адъюванты или связующие вещества, такие как консерванты или антиоксиданты, наполнители, дезинтегрирующие средства, смачивающие средства, эмульгирующие средства, суспендирующие средства, растворители, диспергирующие среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотоничные и задерживающие всасывание средства и т.п. Использование таких сред и средств для фармацевтически активных веществ хорошо известно в данной области. За исключением случаев, когда любая обычная среда или средство не совмещается с активным ингредиентом, его использование в терапевтических композициях рассматривается. Дополнительные активные ингредиенты также могут быть включены в композиции в качестве подходящих терапевтических комбинаций.

Соединения томаймицина

Изобретение основано на синтезе новых производных томаймицина, которые сохраняют высокую цитотоксичность и которые могут быть эффективно присоединены к агентам, связывающимся с клеткой, нерасщепляемыми линкерами, такие конъюгаты демонстрируют высокую эффективность при уничтожении опухолевых клеток. Предварительно было показано, что связывание высокоцитотоксичных лекарственных средств с антителами с использованием расщепляемой связи, такой как дисульфидная связь, приводит к высвобождению полностью активных лекарственных средств внутри клетки, и такие конъюгаты проявляют цитотоксичность в специфическом для антигена способе (патент США 6340701; патент США 6327738; патент США 6436931). Однако полученные в указанной области техники данные показывают, что крайне трудно модифицировать имеющиеся лекарственные средства без снижения их цитотоксического потенциала. Описанное изобретение преодолевает указанные трудности путем модификации описанных производных томаймицина химическими фрагментами. В результате, описанные новые производные томаймицина сохраняют и в некоторых случаях даже усиливают цитотоксический эффект производных томаймицина. Комплексы связывающийся с клеткой агент-производное томаймицина в полной мере обеспечивают цитотоксическое действие производных томаймицина, что способствует их применению в таргетировании исключительно нежелательных клеток, следовательно, позволяет избежать побочных эффектов, обусловленных повреждением нетаргетированных здоровых клеток. Таким образом, изобретение относится к пригодным средствам для удаления пораженных болезнью или аномальных клеток, которые предполагается уничтожить или лизировать, таких как опухолевые клетки (особенно клетки солидных опухолей).

Томаймицин

Цитотоксическое средство согласно настоящему изобретению включает одно или более производных томаймицина, необязательно соединяемых или связанных с агентом, связывающимся с клеткой, через нерасщепляемую сшивающую группу. Сшивающая группа является частью химического фрагмента, который ковалентно связан с производным томаймицина посредством обычных способов.

Согласно одному аспекту изобретение относится к соединению томаймицина формулы (I)

(I) где ---- представляет собой необязательную простую связь;

представляет собой либо простую связь, либо двойную связь;

при условии, что когда .7 представляет собой простую связь, и и и', одинаковые или различные, независимо

- 5 019938 представляют собой Н, и одинаковые или различные, независимо выбирают из группы, состоящей из -ОН, -ОК, -ОСОВ -СООВ, -ОСООВ, -ΟΟΟΝΒΒ', циклического карбамата, такого, что N10 и С11 являются частью цикла, -ΝΒί,ΌΝΒΒ'. -ΟС8NНΒ, циклического тиокарбамата, такого, что N10 и С11 являются частью цикла, -8Н, -8В, -8ОВ, -8ООВ, -8О₃ ^-, -NΒ8ΟΟΒ', -ΝΒΒ', циклического амина, такого, что N10 и С11 являются частью цикла, -NΒΟΒ', -NΒСΟΒ', -Ν₃, -СН На1, триалкила или триарилфосфония;

когда .7—т~ представляет собой двойную связь, и и и' отсутствуют, и представляют собой Н;

В!, В₂, В!', В₂' являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из Н, галогенида или алкила, необязательно замещенного одной или более группами На1, СН NΒΒ', СЕ₃, ОВ, арилом, Не!, 8(О)_ЧВ, или В1 и В₂ и В₁' и В₂' вместе образуют двойную связь, включающую группу=В и=В' соответственно;

В и В' являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из алкенила, необязательно замещенного одной или более группами На1, СП NΒΒ', СЕ₃, ОВ, 8В, 8ОВ, 8О₂В, арилом, Не!, или В и В' представляют собой атом кислорода;

A, А' являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из алкила или алкенила, каждая группа необязательно замещена одной или более группами На1, 6Ν, NΒΒ', СЕ₃, ОВ, 8В, 8ОВ, 8О₂В, арилом, Не!, алкилом, алкенилом;

Υ, Υ' являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из Н, ОВ;

Т означает -ΝΒ- или 4-10-членный арил, циклоалкил, гетероциклическую группу, гетероарил или линейный или разветвленный алкил, каждый замещен одним или более нерасщепляемым линкером(ами) и необязательно замещен одной или более группами На1, 6Ν, NΒΒ', СЕ₃, В, ОВ, 8ОВ или 8О₂В;

η, п', одинаковые или различные, равны 0 или 1;

с.| равно 0, 1 или 2;

B, В' являются равными или различными и независимо выбранными из групп Н, алкила, арила, каждая группа необязательно замещена На1, ίΝ, СООН, СООВ, ^Ν^ СΟNΒΒ', NΒΒ', СЕ₃, В, ОВ, 8ОВ, 8О2В, арилом, Не!;

где алкильная группа содержит от 1 до 20 атомов углерода, алкенильная группа содержит от 2 до 15 атомов углерода, арильная группа содержит от 6 до 14 атомов углерода, циклоалкильная группа содержит от 3 до 10 атомов углерода, гетероциклическая группа представляет собой неароматическое 3-14членное моно-, би- или мультициклическое кольцо, где по меньшей мере один член кольца является гетероатомом, и гетероарильная группа представляет собой 5-14-членное ароматическое моно-, би- или мультициклическое кольцо, где по меньшей мере один член кольца является гетероатомом;

или его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или гидратным солям, оптическим изоме рам, рацематам, диастереомерам или энантиомерам; причем линкер имеет формулу арил(ОСН₂СН₂), -, -алкил(ОСН₂СН₂)₁-, группа(ОСН₂СН₂), -, -циклоалкилалкил-,

-О-Э-(2)рС(=О)-2'В'', где О означает простую, двойную или тройную связь, -О-, -8- или -ΝΒ-;

Ό означает простую связь или -Е-, -Ε-NΒ-Е-, -Е-О-, -Е-О-Е-, -Ε-ΝΕ-СО-, ^-^ΝΕ-, -Ε-NΒ-СΟ-Е-, -Е-СО-ЛВ-Е-, -Е-СО-, -СО-Е-, -Е-СО-Е, -Е-8-, -Е-8-Е-, -Е-1ХВ-С8-, -Е^^В-, -Е-ЛВ^-Е-, -Е^-ЛВ-Е-;

Е и Е являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из линейных или разветвленных групп -(ОСН₂СН₂)₁-алкил(ОСН₂СН₂),-, -алкил(ОСН₂СН₂)₁-алкил-, -(ОСН₂СН₂),-, -(ОСН₂СН₂)₁циклоалкил(ОСН₂СН₂),-, -(ОСН₂СН₂)₁-гетероциклическая группа(ОСН₂СН₂),-, -(ОСН₂СН₂)₁-(ОСН₂СН₂)₁-гетероарил(ОСН₂СН₂),-, -алкил(ОСН₂СН₂)₁-алкил(ОСН₂СН₂),-,

-алкил(ОСН₂СН₂)₁-циклоалкил(ОСН₂СН₂),-, -алкил(ОСН₂СН₂)₁-гетероциклическая -алкил(ОСН₂СН₂)₁-арил(ОСН₂СН₂)]-, -алкил(ОСН₂СН₂)₁-гетероарил(ОСН₂СН₂),-,

-алкилциклоалкил-, -гетероциклическая группа-алкил-, -алкил-гетероциклическая группа-, -алкиларил-, -арилалкил-, -алкилгетероарил-, -гетероарилалкил-;

ί и ф идентичные или различные, являются целыми числами и независимо выбранными из 0, 1-2000;

Ζ означает линейный или разветвленный алкил, циклоалкил, арил, гетероарил, гетероциклил, аралкил, циклоалкил, гетероаралкил или гетероциклилалкил, необязательно замещенные способствующими солюбилизации функциональными группами, такими как аминогруппа, простой эфир, сульфогруппа и карбоксильная группа;

р равно 0 или 1;

или линкер выбран из следующих групп:

- 6 019938

- (СК₁₃К₁₄) _Е (СЕ₁₅К1₆) _и (ОСН₂СН₂) _уСОИ ' К' ',

- (СЕ₁₃Е₁₄) _е (ОСН₂СН₂) _уО (СК1₅К1₆) _исог' К' ' ,

- (СК₁₃Кц)_ь(СК₁₇=СЕ₁₈) (СК₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСО2'Н^г ',

- (ск_иК1₄) _ь (ыр._1Эсо) (ск₁₅К1₆) _и (осн₂сн₂) _усог ^ГК ' ',

- (СК₁₃К₁₄)_Ь(ОСО) (ск₁₆к₁₆)_и(осн₂сн₂)_усог'н'

-(СКиКцЦССО) (СЕ₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уС02'К'

- <СК₁₃К14}_е(СО1«г1_Э) (СК₁₅К₁₆)_и(0СН₂СН₂)_уСО2'Е’ ',

- (ΟΕχ₃Κχ₄} (; - фенил - СО (СК15К16) ₄ΟΟΖ ^г Н ^{1 г} _г

- (СК₁₃К1₄) _ь-фурил-СО(СК₁₅К1б)_иСО2'В’

- (СК₁₃Е₁₄}_г-оксазолил-СО(СК1₅В1б)_г1СОг'К' ',

- (СЕ₁₃Е1₄} _1;-тиазолил-СО(СЕ₁₃Е1б)_иС02 ^гй' ' ,

- (СЕ₁₃Е14) с - тиенил - СО (СЕ₁₅Е1₆) _υΟΟΖ ' К ' ',

- (СЕ1₃Е1₄) - имидазолил — СО (СЕ15ЕХ6) ₄ΟΟΖ ¹ Е^{1 1} ₍

- (СЕ1₃Ех₄) _ь-пиперазино-С0 (СЕх_БК1₆) _иСОг' Е' ',

- (СЕ₁₃Е1₄) х-фенил-ОСОг'Е' ' ,

- (СЕх₃Ех₄) е-фурил-осог'К' ', - (СЕх₃Е₁₄) х-оксазолил-<2СОг Έ' ',

- (сЕх₃Е14 ) χ-тиазолил-осог' К' ', - (СЕхзЕц) _е-тиенил-осог ’ К ' ',

- {СЕ1зЕ1₄} с-имидазолил-φΟΟΖ'К' ', - {СЕх₃Е1₄) χ-пиперазино-ОСОг 'К' '

- (С=С) - (СЕ₁₃К₁₄)_ь{СК₁₅Е₁₅)_и(ОСН2СН₂)_уСО2’К’ ’ ,

- 7 019938

-Ο (σΚυΚχί) е (СН₁₅Н1с) и (ОСН2СН2 ) уСОй ' К ' ’ ,

-οίσκ^ιΜΝΗχίΟΟ) (сЕ1₅к₁₆)_и(осн2Сн_г)_усог'к'

-О (СЕ₁₃Е₁₄} _ь {СВ₁₇=СК₁₈) (СВ₁₅В₁₆) _и (ОСН₂СН₂) _усог' К , -О-фенил-ОСОг'К'', -О-фурил-φΟΟΖ'В'', -О-оксазолил-фСОг'К'', -О-тиазолил-фСОг'К'', -О-тиенил-ΟΟΟΖ'К'',

-О-имидазолил-ОСОг'В'

-О-морфолино-ОСОЙ'К'’, -О-пиперазино-фСОгΈ'',

-ОСО-(СЕ₁₃Е₁₄)_Ъ(ЫЕ₁₉СО) (СЕ₁₅Е1₆) ц (ОСН₂СН₂) _γΟΟΖ ' В' ',

-осо(се₁₃е₁₄) _ь (се₁₇=св₃₈) (се₁₅е₁₆) _и(осн₂сн₂)_усог'к'

-осонр.· - (се₁₃е₁₄ ) е (СЕ₁₅Е₁₆) _и (осн₂сн₂) _усог' К ,

-ОСО-фенил-ОСОг'К'', -ОСО-фурил-фСОг'К'',

-ОСО-оксазолил-фСОг' В' ’ , -ОСО-тиазолил-фСОг ' В'', -ОСО-тиенил-ΟΟΟΖ'В’

-ОСО-имидазолил-фСОг'К'', -ОСО-пиперазино-фСС^ 'В' ', или -СО{СЕ₁₃Е₁₄) ь (СЕхьЕхе) _и (ОСН₂СН₂} _ΥΟΟΖ Έ ' ',

-СО-(СЕ₁₃Е₁₄)_с(СК₁₇=СВ₁₈) (СВх^бМОСНгСНДуСОг'В' ',

-соив₁₂ (се₁₃е₁₄) _е (св₁₅е₁₆) _и (осн₂сн₂) уСог' в'',

-СО-фенил-φΟΟΖ^ГН'', -СО-фурил-фСОг^ГК'', -СО-оксазолил-фСОЙ'В¹', -СО-тиазолил-фСОг’В'', -СО-тиенил-φΟΟΖ'К'’,

-СО-имидазолил-ΦΦΟΖ ’ В' ’ , -СО-пиперазино-фСОг 'К ' ' ,

-СО-пиперидино-фСОг'В'',

-νε₁₉ (се₁₃к₁₄ ) б ( се₁₅е₁₆ ) _и (осн₂сн₂) _усог' к' ’,

-ЫЕ₁₉СО (СЕ₁₃Е₁₄) ь (СЕ₁₅Е_1в) и (осн₂сн₂) _усог' В ’ ' ,

-ие₁₉(сЕ1₃е₁₄)_1;(се₁7=се₁₈) (св₁₅в₁₆)_и(осн₂сн₂)_усог'к'

-ИЕ1₉СО(СЕ_пЕ₁₄)_е{СЕ₁₇=СЕ₁₈) (СЕ1₅К₁₆) _и(ОСН₂СН₂) ,,.ΟΟΖ ' В ' ' ,

-ΝΒι₉σθΝΕ₁₂ (СВ₁₃К1₄) _п (СЕ1₅Е₁₆) _и (осн₂сн₂) _усог' К , -НЕ1₉СОКК1₂<СК₁₃Е₁₄)_1;(СВ₁7=СЕ₁₈) (СВ₁₅Е₁₆}_ц(ОСН₂СН2)уСОг'В' ', -ИНхэСО-фенил-фСОг'В'-НЕ_1эСО-фурил-фСОг ' К'’,

-ИВ₁₉СО-оксазолил-фСО2'В'', -ЫК₁₉СО-тиазолил-фСФ2'В'', -ИВ₁₉СО-тиенил-фСО2'К’ ', -ИЕ1₉СО-имидазолил-фСОг'В' -ПЕ1₉С0-морфолино-фС02'В' ', -ЫЕ₁₉СО-пиперазино-фСОг 'В' -ЫВхдСО-пиперидино-ОСОг'В'

-ΝΒ15-фенил-<2ΟΟΖ 'В' ', -ΝΚ₁₉-фурил-ΦΦΟΖ 'К ' ',

-МК₁₉-оксазолил-фСОг'В' ¹, -ΝΕ₁₉-тиазолил-ФСО2¹ В'',

-ΝΚχ₉ - тиенил-φΟΟΖ ' В ' ', -1ЯЕ₁₉-имидазолил-0СОг ' В '

-Ж19-пиперазино-фСОг'В' -НК1₉-пиперидино-фС02'В' ’ , -ЫКхгСО-ИВхг-фенил-ОСОг'В' ', -Ж₁₉СО-НЕ₁₂-ОКсазолил-фС02 ' В.' -НВ₁₉СО-ИЕ₁₂-тиазолил-фСОг ' К ' -КВ1₉СО-ИЕ₁₂-тиенил-фСО2 ' К'

-ЫЕхаСО-ЫЕхг-ПИПеридино-ОСОг ' К ' ',

-5{О)д(СЕ₁₃Е1₄)_е (СК₁₅Е₁₆) _ц (ОСН₂СН₂) _уСОг ’ К' ' ,

-б(О)_ч(СЕ₁₃Е1₄)_Е(СЕ₁₇=СВ_1в) (СЕ₁₅Е_1е) _и (0СН₂СН₂) _γΟΟΖ ' В ’ ',

- 5СОЫК1₂ (СЕ₁₃К₁₄) _ь (СК1₅В₁₆) _и (ОСН₂СН₂) _усог' К ,

-5С0-пиперазино-фС02'В'' и -ЗСО-пиперидино-фСОИ'В'', где О означает прямую связь или линейный алкил или разветвленный алкил, содержащий 1-10 ато

- 8 019938 мов углерода, или полиэтиленгликолевую связывающую группу с 2-20 повторяющимися этиленоксидными звеньями;

Я₁₉ и Я₁₂ являются одинаковыми или различными группами и означают линейный алкил, разветвленный алкил или циклический алкил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, или арил или гетероциклическую группу, и Я₁₂, кроме того, может означать Н;

Я₁₃, Я₁₄, Я₁₅ и Я₁₆ являются одинаковыми или различными группами и означают Н или линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода;

Я₁₇ и Я₁₈ означают Н или алкил;

с.| равно 0, 1 или 2;

и означает целое число от 1 до 10 и также может быть равно 0;

означает целое число от 1 до 10 и также может быть равно 0;

у означает целое число от 1 до 20 и также может быть равно 0;

Ο(=Θ)-Ζ'Κ представляет собой карбонил, содержащий функциональную группу, где

Ζ' представляет собой простую связь или -О-, -8-, -ΝΚ- и

Я'' представляет собой Н, алкил, циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу, каждая группа необязательно замещена одним или более На1, ΟΝ, ΝΚΚ', СР₃, Я, ОЯ, 8ОЯ, 8О₂Я, арилом, Не!.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения и являются одинаковыми или различными и означают -ОН, -ОМе, -ОЕ1, -ΝΗί.ΌΝΗ₂. -8Ме.

Предпочтительно соединение томаймицина определено следующей формулой (II):

или где А, А', ^', Υ, Υ', Т, η, п', Я_ь Я/, Я₂ или Я₂' определены выше.

Согласно другому аспекту изобретение относится к соединениям томаймицина формулы

где А, А', Υ, Υ', Т, η, η' определены выше.

В предпочтительном варианте в предложенных выше соединениях томаймицина

А=А' представляет собой линейный незамещенный алкил;

Υ=Υ' представляет собой О-алкил;

Т означает 4-10-членный арил или гетероарил либо фенильную или пиридильную группу и необязательно является замещенным одной или более группами На1, ΟΝ, NЯЯ', СР₃, Я, ОЯ, 8ОЯ или 8О₂Я;

С означает простую связь или -О-;

Ό означает простую связь, или -Е-, или -Е-О-;

Е является линейной или разветвленной группой -алкил- или -алк(ОСН₂СН₂)₁-;

Ζ является линейной или разветвленной группой -алкил-;

р равно 0;

Ζ' означает О;

Я'' означает Н, или линейную или разветвленную группу -алкил-, или необязательно замещенную

О гетероциклическую группу, или сукцинимидную группу

-Ζ'Β означает -ОН, -О-алкил или

- 9 019938 указанный выше линкер выбран из

- (СК1₃В₁₄)_1:(СК₁₅К1₆)_и(ОСН₂СН_г)_уСО2'К;

- (СВ₁зВ_Х4),_;(ОСН_гСН_г)_уО(СН1₅В1₆)_иС02'К’ ’ ,

-О(СК₁₃К₁₄) с(СВ₁₅В₁₆)_и(0СН₂СН₃)_уСО2'В' ' ,

-О(СК₁₃К₁₄) игТКиСО) (СВ₁₅В₁₆)_и(ОСН₂СН_г)_уСО2'К'

- (ОС) - (СН1₃К₁₄) ь(СК₁₃К₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСОг'К' ' , -СДСКпНхЩСОг’В' ' ;

- (ОСН₂СН_г)_уСОг'Р'

- (ОС) - (σΚ₁₃Κ₁₄)ίΟΟΖ'Κ' ' ;

-О(СВ₁₃К₁₄ШКК_1эССЭ (СК₁₅К₁₆) _иСО2 ' К ' или

- (СН₁₃В₁₄) _с (ОСН₂СН₂) _усог' В .

Предпочтительно соединение томаймицина представляет собой соединение формулы

где фрагмент -0-Ό-(Ζ)ρ-0(=Θ)-Ζ'Β'' определен в пп.1 или 9-16;

М представляет собой СН или N.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к соединению томаймицина, выбранному из группы, состоящей из

4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил] фенокси)масляной кислоты;

4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил] фенокси)уксусной кислоты;

3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты;

6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иновой кислоты;

3- (2-{2-[2-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты;

4- (2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты;

№[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин5-он-8-илоксиметил]фенокси)этил]-№метилсукцинамовой кислоты;

4-(3,5-бис-[(8)-2-метилиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он8-илоксиметил] фенил)пропановой кислоты;

(2-{2-[2-(2-{3-[3,5-бис-(7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11а-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2а][1,4]диазепин-8-илоксиметил)фенил]пропокси}этокси)этокси]этокси}этокси)уксусной кислоты;

(3-{2-[2-(2-{3-[3,5-бис-(7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11а-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2а][1,4]диазепин-8-илоксиметил)фенил]пропокси}этокси)этокси]этокси}этокси)пропановой кислоты;

а также их соответствующих Ν-гидроксисукцинимидильных сложных эфиров, или фармацевтически приемлемых солей, гидратов или гидратных солей, или их оптических изоме ров, рацематов, диастереомеров или энантиомеров.

В еще одном другом аспекте настоящее изобретение относится к соединению томаймицина, выбранному из группы

- 10 019938

а также соответствующим Н=-гидроксисукцинимидильным сложным эфирам, или его фармацевтически приемлемым солям, гидратам или гидратным солям, или оптическим изомерам, рацематам, диастереомерам или энантиомерам указанного выше соединения.

Относительно получения соединений

Соединения могут быть синтезированы путем использования или приспособления способов, описанных ниже, или вариантами способов, определенных специалистом в данной области. Соответствующие модификации и замещения будут очевидны и хорошо известны или легко получаемы на основе научной литературы специалистами в данной области. В частности, такие способы можно найти в К.С. Ьагоск, Сошргейеп81уе Огдашс Тгапзкогшайопз, ^йеу-УСН РиЬйзйегз, 1999.

Следует понимать, что соединения согласно настоящему изобретению могут содержать один или более асимметрически замещенных атомов углеродов и могут быть выделены в оптически активных или рацемических формах. Таким образом, предполагаются все хиральные, диастереомерные, рацемические формы и все геометрические изомерные формы структуры, если не указана особо специфическая стереохимия или изомерная форма. В данной области хорошо известно, как получить и выделить такие оптически активные формы. Например, смеси стереоизомеров могут быть отделены обычными способами, включающими, но не ограниченные ими, разделение рацемических форм, стандартное, с обращенной

- 11 019938 фазой или хиральную хроматографию, предпочтительно образование соли, перекристаллизацию и т.п., или путем хирального синтеза либо из хиральных исходных материалов, либо преднамеренным синтезом хиральных центров-мишеней. В реакциях, представленных в описании ниже, может оказаться необходимым защитить активные функциональные группы, например, гидрокси, амино, имино, тио или карбоксигруппы, присутствие которых является желательным в конечном продукте, чтобы избежать нежелательного участия в реакциях. Общепринятые защитные группы могут быть использованы в соответствии с обычной практикой, например, см. Т.^. Сгсспс апб Р.С.М. \Уи1к в РгоЮебус Огоирк ίη Огдашс Сйет1к1гу, 3^гб еб., ίοΐιη ^беу апб 8опк, 1999; 1Р.\У. МсОт1е в РгсИесбуе Огоирк ίη Огдашс 8уп111ек1к, Р1епит Ргекк, 1973.

Некоторые реакции могут быть осуществлены в присутствии основания. Особого ограничения относительно природы основания, которое предназначено для использования в данной реакции, не имеется, и любое основание, обычно используемое в реакциях данного типа, может быть использовано в равной степени, при условии, что оно не оказывает неблагоприятного воздействия на другие части молекулы. Примеры подходящих оснований включают гидроксид натрия, карбонат калия, триэтиламин, гидриды щелочных металлов, такие как гидрид натрия и гидрид калия; соединения алкиллития, такие как метиллитий и бутиллитий; и алкоголяты щелочных металлов, такие как метилат натрия и этилат натрия. Обычно реакции осуществляют в подходящем растворителе. Ряд растворителей может быть использован при условии, что они не оказывают неблагоприятного воздействия на реакцию или на используемые реагенты. Примеры подходящих растворителей включают углеводороды, которые могут быть ароматическими, алифатическими или циклоалифатическими углеводородами, такими как гексан, циклогексан, бензол, толуол и ксилол; амиды, такие как диметилформамид; спирты, такие как этанол и метанол, и простые эфиры, такие как диэтиловый эфир и тетрагидрофуран. Взаимодействия могут иметь место в широком диапазоне температур. В основном, реакцию можно осуществлять при температуре от -20°С до 150°С (более предпочтительно приблизительно от комнатной температуры до 100°С). Время, требуемое для реакции, также может изменяться в значительной степени, в зависимости от многих факторов, особенно от температуры реакции и природы реагентов. Однако только если реакция протекает эффективно при предпочтительных условиях, описанных выше, периода времени от 3 до 20 ч обычно бывает достаточно.

Полученные таким образом соединения могут быть извлечены из реакционной смеси обычными способами. Например, соединения могут быть извлечены путем отгонки растворителя из реакционной смеси или, если необходимо, после дистилляции растворителя из реакционной смеси, вылить остаток в воду с последующей экстракцией органическим растворителем, несмешиваемым с водой, и дистилляцией растворителя из экстракта. Кроме того, продукт, если желательно, можно также очистить различными хорошо известными способами, такими как перекристаллизация, переосаждение или различные методы хроматографии, особенно колоночная хроматография или препаративная тонкослойная хроматография.

Первый путь синтеза.

Согласно первому пути синтеза способ получения соединений, где Т содержит концевую карбоксигруппу, включает стадию удаления защиты с соединений формулы

где Υ, Υ', X, А, А', X', η, п', ^', и, и', -—, Κμ К₂, К/, К₂', являются такими, как определено выше, и Т' соответствует Т, где концевая карбоксигруппа защищена Ν-сукцинимидной группой или этерифицирована.

Типичной реакцией удаления защитной группы является гидролиз соединения формулы (I), где Т' соответствует Т, где концевая карбоксигруппа представлена в виде сложного эфира. Указанную выше реакцию гидролиза обычно проводят в основных условиях, в присутствии органического или минерального основания, такого как ЫОН, с последующим добавлением органической или минеральной кислоты, такой как хлористо-водородная кислота.

- 12 019938

Указанные соединения могут быть получены путем сочетания соответствующих соединений формул (IV), (IV') и (V)

где Ьд является удаляемой группой, такой как галоген, -ОМ§ (мезилат), -ОТ (тозилат) или -РОРЬ₃ ⁺(промежуточное соединение, образованное в реакции Мицуноби).

Соединения формул (IV) и (IV') являются хорошо известными, описанными, например, в АО 00/12508, АО 00/12507, АО 2005/040170, АО 2005/085260, или являются коммерчески доступными, и/или являются доступными при использовании полного синтеза (М. Моп с1 а1., 42 Тс1га11сбгоп. 37933806, 1986), или продуцируются видом §1гер1ошусе8, в частности, при использовании процедуры, описанной во французском патенте ГК 1516743, или могут быть получены посредством применения или приспособления иллюстративных процедур, описанных в примерах.

Соединения формулы (V) могут быть получены из соответствующих соединений формулы НО-АпТ'-А'п'-ОН (VI). Реакцию обычно проводят в присутствии РРЬ₃ и СНа1₄ или путем взаимодействия с сульфонилхлоридом (метансульфонилхлорид или мезилхлорид) в присутствии основания, такого как триэтиламин или гидроксид калия, предпочтительно триэтиламин. Соединения формулы (VI) могут быть получены из соответствующих соединений формулы НО-Ап-Т''-А'п'-ОН (VII), где Т'' является предшественником группы Т. Предшественник группе Т относится к любой группе, которая может привести к Т любым способом удаления защиты, химической модификации или связывания. Предпочтительно Т получают путем связывания Т' с комплементарной частью, где Т' и комплементарная часть включают функции, которые являются реактивными друг к другу, например, Т' содержит функциональную гидроксильную группу, и комплементарная часть представляет собой бромистое соединение. Типичный пример указанной реакции описан ниже

Обычно данную реакцию осуществляют в присутствии карбоната калия.

Соединения формулы (VII) могут быть коммерчески доступными или получены путем приспособления или использования известных способов или согласно примерам.

Пример неограничивающей изобретение схемы данного пути синтеза представлен ниже

Второй путь синтеза.

Согласно второму пути синтеза соединения могут быть получены из соответствующего соединения формулы (III)

- 13 019938 где Υ, Υ', X, А, А', X', η, η', А. А', и, и', -—, ' К₂, К/, К₂' являются такими, как определено выше, и Т'' является необязательно защищенным предшественником группы Т.

Предшественник группе Т относится к любой группе, которая может привести к Т путем химической модификации или связывания. Предпочтительно Т получают путем связывания Т' с соответствующей комплементарной частью, где Т' и комплементарная часть включают функции, которые являются реактивными друг к другу, например, Т' содержит аминную функцию, и комплементарная часть содержит кислотную функцию. Обычно такую реакцию осуществляют в присутствии Ν-гидроксисукцинимида и НОВТ (Ν-гидроксибензотриазол).

Соединение формулы (III) может быть получено путем связывания соответствующих соединений формул (IV), (IV') и (V')

где Ьд является удаляемой группой, такой как галоген или -ОМ§, -ОТ или -ОРРй₃ ⁺ (интермедиат, образованный в реакции Мицуноби).

Соединения формулы (V') могут быть получены из соответствующих соединений формулы НО-ΑηТ''-А'п'-ОН (VII), где Т'' является необязательно защищенной предшествующей группой Т'. Данную реакцию обычно осуществляют в присутствии РР11₃ и СНа1₄ или путем мезилирования гидроксифункций. Соединения формулы (VII) могут быть коммерчески доступными или получены путем приспособления или использования известных способов или согласно примерам.

Третий путь синтеза.

Согласно третьему пути синтеза соединения, имеющие симметричную структуру (К₁=К₁', К₂=К₂' и Υ=Υ'), могут быть получены циклизацией соответствующих соединений формулы (VIII)

где Υ, X, X', А, А', η, п', К!, К₂, Т являются такими, как определено выше.

Обычно указанную реакцию осуществляют в присутствии реагента, такого как гидросульфит натрия (Ыа₂8₂О₄), в подходящем растворителе, таком как смесь ТГФ/вода, с последующим добавлением МеОН и АсС1.

Соединения формулы (VIII) могут быть получены из соответствующих соединений формулы (IX)

Данную реакцию осуществляют в присутствии реагента, такого как гидрид диизобутилалюминия (ОШАЬ-Н) в подходящем растворителе, таком как толуол. Соединения формулы (IX) могут быть получены путем связывания соответствующих соединений формул (X) и (XI)

Обычно данную реакцию осуществляют путем добавления к (X) реагента, такого как оксалилхлорид, в подходящем растворителе, таком как ДМФ, с последующим добавлением (XI) в подходящем растворителе, таком как ТГФ.

- 14 019938

Типичная неограничивающая изобретение схема для данного пути представлена ниже

Представленные выше реакции могут быть осуществлены специалистом в данной области путем использования или приспособления способов, иллюстрированных в примерах, приведенных в описании. Кроме того, способы, представленные в описании, могут включать дополнительную стадию(и) выделения любых конечных или промежуточных продуктов. Указанную стадию может осуществить специалист в данной области любым из известных стандартных способов, таких как методы извлечения, описанные выше. Исходные продукты являются коммерчески доступными или могут быть получены путем использования или приспособления любых известных способов или способами, описанными в примерах. Синтез также можно осуществлять в одну стадию как многокомпонентную реакцию.

Относительно конъюгатной молекулы

Настоящее изобретение также относится к конъюгату, включающему одно или более охарактеризованное(ых) выше соединение(й) томаймицина, связывающимся с клеткой, посредством сшивающей группы линкера соединения томаймицина, где связывающийся с клеткой агент выбран из антител или фрагмента антитела, который содержит по меньшей мере один сайт связывания, лимфокинов, гормонов, факторов роста и молекул, переносящих биогенные вещества.

В предпочтительном варианте указанный выше связывающийся с клеткой агент выбран из моноклональных антител; химерных антител; гуманизированных антител; полностью человеческих антител; одноцепочечных антител; фрагментов антител, таких как РаЬ, РаЬ', Р(аЬ')₂Р_у; интерферонов; пептидов; лимфокинов, таких как 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-6; гормонов, таких как инсулин, ТКН (гормон, освобождающий тиреотропин), М8Н (меланоцитстимулирующий гормон), стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены; факторов роста и колониестимулирующих факторов, таких как ЕСР. ТСРа. инсулиноподобный фактор роста (1СР-1, ЮР-П), 6-С8Р, М-С8Р и 6М-С8Р; витаминов, таких как фолат и трансферрин.

Предпочтительно связывающийся с клеткой агент и указанное выше соединение томаймицина связываются посредством амидной группы. В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения конъюгата, включающему стадию, на которой охарактеризованное выше соединение томаймицина, где линкер содержит концевую карбоксигруппу, которая необязательно активирована с образованием амидной группы, или ее предшественник, подвергают взаимодействию с агентом, связывающимся с клеткой, так, что соединение томаймицина и связывающийся с клеткой агент связываются посредством амидной связи.

Предпочтительно связывающийся с клеткой агент представляет собой антитело или моноклональное антитело.

Предпочтительно конъюгат очищают гель-фильтрационной хроматографией, адсорбционной хроматографией, ионообменной хроматографией, хроматографией с гидрофобным взаимодействием, аффинной хроматографией, ВЭЖХ, хроматографией на керамическом гидроксиапатите, диализом или диафильтрацией.

Конъюгаты, содержащие от 1 до 10 единиц лекарственного средства производного томаймицина, связанных амидной связью, легко получают указанным ниже способом.

Раствор антитела при концентрации 8 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05 М фосфата калия, 0,05 М хлорида натрия и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), при рН 8, обрабатывают 5кратным молярным избытком раствора Ν-гидроксисукцинимидного производного димера томаймицина в диметилацетамиде (ΌΜΑ) таким образом, что конечная концентрация ΌΜΑ в буфере составляет 20%.

- 15 019938

Реакционную смесь перемешивают в течение 70 мин при комнатной температуре (кт). Конъюгат антитело-производное томаймицина очищают и отделяют от непрореагировавшего лекарственного средства и другого низкомолекулярного материала гель-фильтрацией посредством колонки с 8ерйабех С-25 или 8ер11асгу1 8300 или 8ирегбех 200. Образец также может быть диализован в течение ночи в буфере при рН 6,5 для очистки продукта. Число фрагментов производного томаймицина, связанных с молекулой антитела, можно определить путем измерения отношения абсорбции при 320 нм и 280 нм. В среднем, 1-10 молекул производного томаймицина/молекулу антитела можно соединить амидной связью данным способом. Влияние конъюгирования на сродство к связыванию с антиген-экспрессирующими клетками можно определить с помощью способов, ранее описанных Ь1и е! а1., 93 Ргос. Ыа!1. Лсаб. 8с1. 8618-8623 (1996). Цитотоксичность производных томаймицина и их конъюгатов с антителом относительно клеточных линий можно измерить методом обратной экстраполяции кривых клеточной пролиферации, как описано в публикации Со1бтасйег е! а1., 135 1. 1ттипо1. 3648-3651 (1985). Цитотоксичность указанных соединений относительно адгезивных клеточных линий можно определить посредством клоногенного анализа, как описано Со1бтасйег е! а1., 102 1. Се11 Бю1. 1312-1319 (1986).

Характерными конъюгатами согласно изобретению являются конъюгаты производных томаймицина с антителами, фрагментами антител, эпидермальным фактором роста (ЕСЕ), меланоцитстимулирующим гормоном (М8Н), тиреотропным гормоном (Т8Н), эстрогеном, аналогами эстрогена, андрогеном и аналогами андрогена. Характерные примеры получения различных конъюгатов производных и агентов, связывающихся с клеткой, описаны ниже.

Амидные линкеры: например, моноклональным антителом ΜΥ9 является мышиное 1дС₁ антитело, которое специфически связывается с антигеном СЭ33 {ΕΌ. СпГПп е! а1. 8 Ьеикет1а Кез., 521 (1984)} и может быть использовано, если клетки-мишени экспрессируют СО33, который экспрессируется клетками при остром миелоидном лейкозе (ЛМЬ). Аналогично, моноклональное антитело анти-В4 является мышиным иммуноглобулином 1дС1, связывающимся с антигеном СЭ19 на В-клетках {Ыаб1ег е! а1., 131 1. 1ттипо1., 244-250 (1983)} и может быть использовано, если клетки-мишени являются В-клетками или пораженными клетками, которые экспрессируют данный антиген, такими как при неходжкинской лимфоме или хроническом лимфобластном лейкозе.

Кроме того, фактор СМ-С8Е, который связывается с миелоидными клетками, может быть использован в качестве связывающегося с клеткой агента для клеток при остром миелоидном лейкозе. 1Ь-2, связывающийся с активированными Т-клетками, может быть использован для предотвращения отторжения трансплантата, для терапии и предотвращения реакции трансплантат-против-хозяина и для лечения острого Т-клеточного лейкоза. М8Н, который связывается с меланоцитами, может быть использован для лечения меланомы.

Антитело или другой связывающийся с клеткой агент взаимодействует с Νгидроксисукцинимидным производным карбоновой кислоты с получением амид-связанного конъюгата.

Конъюгаты, полученные описанными выше способами, могут быть очищены стандартными способами хроматографии, такими как гель-фильтрация, адсорбционная хроматография, включающая, но не ограниченная ими, ионообменную хроматографию, хроматографию с гидрофобным взаимодействием, аффинную хроматографию, хроматографию на керамическом гидроксиапатите или на Рогарак, или ВЭЖХ. Очистка диализом или диафильтрацией также может быть использована.

Предпочтительно конъюгаты между моноклональными антителами или связывающимися с клеткой агентами и производными согласно настоящему изобретению представляют собой такие конъюгаты, которые связываются через амидную связь, как описано выше. Такие связывающиеся с клеткой конъюгаты получают известными способами, такими как модификация связываемых молекул лекарственных средств, обладающих карбоксильной функцией, с получением Ν-гидроксисукцинимидного производного карбоновой кислоты. Затем активированные карбоксильные группы ацилируют остатки лизина, содержащиеся в молекуле антитела, с получением конъюгатов, связанных амидной связью. Конъюгаты, содержащие от 1 до 10 производных, связанных через амидный мостик, легко получают указанным способом.

Согласно предпочтительному аспекту агентом, связывающимся с клеткой, является антитело, в частности, моноклональное антитело. Согласно другому предпочтительному аспекту, связывающимся с клеткой агентом является антиген-специфический фрагмент антитела, такой как зЕУ, ЕаЬ, ЕаЬ' Е(аЬ')₂. Относительно использования конъюгатной молекулы

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим конъюгатную молекулу согласно изобретению или производное томаймицина, как определено выше, вместе с фармацевтически приемлемым носителем.

Настоящее изобретение также относится к применению конъюгатной молекулы или производного томаймицина, как определено выше, для получения лекарственного средства с целью лечения рака. В результате контакта фармацевтической копозиции согласно настоящему изобретению с клеткамимишенями или содержащей их тканью ίη νίΙΐΌ. ίη у1уо или ех у1уо происходит ингибирование роста выбранных клеточных полуляций. Примеры использования ίη уйто включают обработки клеточных культур с целью уничтожения всех клеток за исключением желаемых вариантов, которые не экспрессируют ан

- 16 019938 тиген-мишень; или с целью уничтожения вариантов, которые экспрессируют нежелательный антиген. Условия неклинического использования ш νίΙΐΌ легко определяет специалист в данной области. Примеры использования ех νί\Ό включают обработки аутологичного костного мозга до его пересадки тому же больному, чтобы уничтожить пораженные или злокачественные клетки, обработки костного мозга до его пересадки, чтобы уничтожить компетентные Т-клетки и предотвратить реакцию трансплантат-противхозяина (ΟνΗΌ).

Клиническая обработка ех νί\Ό с целью удаления опухолевых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга до аутологичной трансплантации при лечении рака или при лечении аутоиммунного заболевания, или с целью удаления Т-клеток и других лимфоидных клеток из аллогенного костного мозга или ткани до пересадки, чтобы предотвратить ΟνΗΌ, может быть осуществлена следующим образом. Костный мозг берут у больного или другого индивидуума и затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, к которой добавляют цитотоксическое средство согласно изобретению, концентрации колеблются приблизительно от 10 мкМ до 1 пМ, в течение приблизительно от 30 мин до 48 ч приблизительно при 37°С. Точные условия концентрации и времени инкубации (=доза) легко определяет специалист в данной области. После инкубации клетки костного мозга промывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают больному путем внутривенной (ί.ν.) инфузии известными способами. В случаях, когда больной получает другое лечение, такое как курс абляционной химиотерапии или тотальное облучение всего организма, между временем забора костного мозга и реинфузией обработанных клеток, обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте, используя стандартное медицинское оборудование. Для клинического использования ш νί\Ό цитотоксическое средство согласно изобретению будет подаваться в виде растворов, которые проверяют на стерильность и уровни эндотоксинов, или в виде лиофилизированного твердого вещества, которое может быть растворено в стерилизованной воде для инъекции. Примерами подходящих протоколов введения конъюгатов являются следующие примеры. Конъюгаты дают еженедельно в течение 6 недель в виде ί.ν. болюса. Дозы болюса дают в 50-400 мл обычного физиологического раствора, к которому можно добавить сывороточный альбумин человека (например, от 0,5 до 1 мл концентрированного раствора сывороточного альбумина человека, 100 мг/мл). Дозировки будут составлять приблизительно от 50 мкг до 100 мг/кг массы тела в неделю, ί.ν. (диапазон от 10 мкг до 100 мг/кг на инъекцию). Через шесть недель после лечения больной может получить второй курс лечения. Отдельные клинические протоколы относительно способа введения, наполнителей, разбавителей, дозировок, времени и т.д. может составить специалист в данной области на основании клинического состояния. Примеры медицинских состояний, которые можно подвергать лечению согласно ш νί\Ό или ех νί\Ό способам уничтожения выбранных клеточных популяций, включают злокачественные опухоли любого типа, включающие, например, рак легкого, молочной железы, толстой кишки, простаты, почки, поджелудочной железы, яичника и органов лимфатической системы; меланомы; аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка, ревматоидный артрит и рассеянный склероз; отторжения трансплантата, такие как отторжение почечного трансплантата, отторжение трансплантата печени, отторжение трансплантата легкого, отторжение трансплантата сердца и отторжение трансплантата костного мозга; реакция трансплантат-против-хозяина; вирусные инфекции, такие как инфекция СМV, инфекция Ηΐν, ΛΙΌδ и т.п.; бактериальная инфекция и паразитарные инфекции, такие как гиардиоз, амебиаз, шистосомоз и другие, определяемые специалистом в данной области. Терапевтически эффективное количество может легко определить лечащий врач, как специалист в данной области, путем использования обычных методов и наблюдения результатов, полученных в аналогичных ситуациях. При определении терапевтически эффективного количества ряд факторов рассматривается лечащим врачом, включающих, но не ограниченных ими, вид субъекта, его размер, возраст и общее состояние здоровья; отдельное заболевание; степень поражения болезнью или тяжесть заболевания; ответ индивидуального субъекта; отдельное введенное соединение; способ введения; характеристику биодоступности введенного препарата; выбранный дозовый режим; использование сопутствующего лекарственного препарата и другие существенные обстоятельства.

Количество, требуемое для достижения желаемого биологического эффекта, будет изменяться в зависимости от ряда факторов, включающих химические характеристики (например, гидрофобность) используемых соединений, эффективность соединений, тип заболевания, вид, к которому больной принадлежит, стадию заболевания, способ введения, биодоступность соединения при выбранном способе введения, все факторы, обусловливающие требуемые дозовые количества, доставку и режим введения.

В общих чертах, соединения согласно данному изобретению могут быть предоставлены в водном физиологическом буферном растворе, содержащем от 0,1 до 10% мас./об. соединения для парентерального введения. Типичные диапазоны доз составляют от 1 мкг/кг до 0,1 г/кг массы тела в день; предпочтительная область доз составляет от 0,01 мг/кг до 10 мг/кг массы тела в день или эквивалентная доза для ребенка. Предпочтительная дозировка лекарственного средства, предназначенного для введения, вероятно, зависит от таких переменных параметров, как тип заболевания и степень развития заболевания или нарушения, общий статус здоровья отдельного больного, относительная биологическая эффективность выбранного соединения, композиция соединения, способ введения (внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный, подкожный или другой), фармакокинетические свойства соединения, обусловлен- 17 019938 ные выбранным способом доставки, и скорость (болюс или непрерывная инфузия) и режим введений (число повторений в данный период времени).

Обычно композиции могут быть введены в стандартной лекарственной форме и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в фармацевтической области, например, как описано в публикации Кетшд!ои: Тйе 8с1еисе апб Ргасбсе о£ Рйагтасу, 20^4й еб.; Сеииаго, А.К, Еб.; ЫрртсоИ АбПапъ & АПкиъ: Рйбабе1рй1а, РА, 2000.

Жидкие препараты для парентерального введения включают стерилизованные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Жидкие композиции также могут включать связующие вещества, буферы, консерванты, хелатирующие средства, подсластители, ароматические и красящие средства и т.п. Неводные растворители включают спирты, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Водные носители включают смеси спиртов и воды, забуференные среды и физиологический раствор. В частности, биосовместимый, биодеградируемый полимер лактида, сополимер лактид/гликолид или сополимеры полиоксиэтилен-полиоксипропилен могут быть пригодными наполнителями для контролирования высвобождения активных соединений. Внутривенные наполнители могут включать жидкие и питательные добавки, добавки электролитов, такие как добавки, основанные на растворе Рингера-декстрозы, и т.п. Другие потенциально пригодные парентеральные системы доставки для указанных активных соединений включают частицы сополимера этилен-винилацетат, осмотические насосы, имплантируемые инфузионные системы и липосомы.

Предпочтительная дозировка лекарственного средства, предназначенного для введения, вероятно, зависит от таких переменных параметров, как тип заболевания и степень развития заболевания или нарушения, общий статус здоровья отдельного больного, относительная биологическая эффективность выбранного соединения, композиция соединения, способ введения (внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный, подкожный или другой), фармакокинетические свойства соединения, обусловленные выбранным способом доставки, скорость (болюс или непрерывная инфузия) и режим введений (число повторений в данный период времени).

Обычно композиции могут быть введены в стандартной лекарственной форме и могут быть получены любым из способов, хорошо известных в фармацевтической области, например, как описано в публикации Кетшд!ои: ТНе 8с1еисе апб Ргасбсе о£ Рйагтасу, 20^4й еб.; Сеииаго, Л.Р., Еб.; ЫрртсоИ АПйапъ & АПкиъ: Рйбабе1рй1а, РА, 2000.

Фигуры

Фиг. 1: 1и νίΙΐΌ цитотоксичность метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил] фенокси)масляной кислоты примера 1.

Фиг. 2: 1и νίΙΐΌ цитотоксичность метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил] фенокси)уксусной кислоты примера 2.

Фиг. 3: 1и уйго цитотоксическая активность соединений 8 (1СР08) и 9 (1СР08-ОМе) примера 8.

Фиг. 4 представляет собой данные масс-спектрального анализа дегликозилированного йиМу9-6 - 4(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)бутирильного конъюгата (имеющий отношение 2,1 лекарственное средство/антитело посредством УФ, т.е. 2,1 единиц производного томаймицина на 1 единицу антитела, как определено посредством УФ) примера 11.

Фиг. 5 представляет собой данные масс-спектрального анализа дегликозилированного йиВ4 - 4-(3,5бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)бутирильного конъюгата (4,48 лекарственное средство/антитело посредством УФ) примера 12.

Фиг. 6: данные МС-анализа дегликозилированного йи2Н11 - 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8

- 18 019938 илоксиметил]фенокси)бутирильного конъюгата (3,74 лекарственное средство/антитело посредством УФ) примера 13.

Фиг. 7: данные МС-анализа 1иМу9-6 - 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильного конъюгата (4,8 лекарственное средство/антитело посредством УФ) примера 14.

Фиг. 8: данные МС-анализа 1и2Н11 - 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильного конъюгата (4,08 лекарственное средство/антитело посредством УФ) примера 15.

Фиг. 9: данные МС-анализа дегликозилированного 1шВ4-1СР08 (соединение примера 18).

Фиг. 10: сравнительные свойства связывания оголенных антител 1шМу9-6 и 1иМу9-6-1СР08 (соединение примера 18) с антигеном СЭ33.

Фиг. 11: ίη νίΐτο цитотоксическая активность 1шВ4-1СР08 (соединение примера 18) против клеток Яаток (Ад-) и НЬ60^С (Ад+).

Фиг. 12: данные МС-анализа дегликозилированного 1шВ4-1СР08 (3,1 лекарственное средство/антитело посредством УФ) примера 19.

Фиг. 13: цитотоксические свойства 1шВ4-1СР08 (соединение примера 19) против клеток ΒΪΛΒ (Ад+), Яаток (Ад+) и МОЬТ-4 (Ад-).

Фиг. 14: сравнительные свойства связывания оголенных антител 1шВ4 и 1шВ4-1СР08 (соединение примера 19).

Фиг. 15: данные МС-анализа дегликозилированного 1и2Н11-1СР13 (4,7 лекарственное средство/антитело посредством УФ) примера 21.

Фиг. 16: цитотоксические свойства Ри2Н11-1СР13 (соединение примера 21) против клеток РС3 (Ад+), МЭА-МВ-231 (Ад+) и 8К-МЕБ-28 (Ад-).

Фиг. 17: цитотоксические свойства метилового эфира 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты примера 5.

Фиг. 18: цитотоксические свойства 4-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты примера 6.

Фиг. 19: цитотоксические свойства метилового эфира №[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил] фенокси)этил] -Νметилсукцинамовой кислоты примера 7.

Фиг. 20: ίη νίΐτο данные цитотоксичности 1иМу9-6 - 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2, 3,11 а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4] бензодиазепин-5 -он-8-илоксиметил] фенокси)бутирильного конъюгата из примера 11.

Фиг. 21: ίη νίΐτο данные цитотоксичности 1шВ4 - 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил] фенокси)бутирильного конъюгата из примера 12.

Фиг. 22: ίη νίΐτο данные цитотоксичности 1и2Н11 - 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил] фенокси)бутирильного конъюгата из примера 13.

Фиг. 23: ίη νίΐτο данные цитотоксичности 1шМу9-6 - 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильного конъюгата из примера 14.

Фиг. 24: ίη νίΐτο данные цитотоксичности 1и2Н11 - 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильного конъюгата из примера 15.

Экспериментальная часть

Метод А1. Высокоэффективная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия (ЖХМС) (ЬСМ8).

Программу М1сгота88 Ма88^уηx использовали и анализ осуществляли на приборе ВЭЖХ \Уа1ег5 А1Намсе с колонкой ^АТЕЯ8 ХВпбде С18 3,5 мкм (100x3 мм), используя градиентную элюцию смесью (А) метанола и (В) воды/0,1% муравьиной кислоты (градиент: от 5% А: 95% В вплоть до 95% А: 5% В в течение 10 мин, от 95% А: 5% В вплоть до 5% А: 95% В в течение 1 мин, 5% А: 95% В в течение 2 мин), со скоростью потока 1,1 мл/мин; спектрометр ^аΐе^8-М^с^οта88 ΡΙηΙίοπη II с электрораспылением (положительная и отрицательная ионизация); присоединенная в цепь диодная матрица (190-500 нм); добавочный детектор 8ебете (Ргаисе) модель 8ЕЭЕХ 85 испарительный детектор светорассеяния (ЕЬ8).

Метод А2. Высокоэффективная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия (ЖХМС).

Программу М1сгота88 Ма^Б-унх использовали и анализ осуществляли на приборе АдПеШ 1100 серии ВЭЖХ с колонкой ХВпбде С18 2,5 мкм (50x3 мм), используя градиентную элюцию смесью (А) аце

- 19 019938 тонитрила и (В) воды/0,1% муравьиной кислоты (градиент: от 5% А: 95% В вплоть до 100% А в течение 5 мин, 100% А в течение 0,5 мин, от 100% А вплоть до 5% А: 95% В в течение 1 мин, 5% А: 95% В в течение 0,5 мин), со скоростью потока 1,1 мл/мин; спектрометр Аа1ег8-М1сгота88 ΖΡ с электрораспылением (положительная и отрицательная ионизация); присоединенная в цепь диодная матрица (210-254 нм).

Метод А3. Высокоэффективная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия (ЖХМС).

Анализ осуществляли на приборе Аа1ег§ ИРЕС-8РИ с колонкой АС’РШТУ ВЕН С₁₈ 1,7 мкм 2,1x50 мм при 50°С, используя градиентную элюцию смесью (А) Н₂О/0,1% муравьиной кислоты и (В) СН₃СХ/0,1% муравьиной кислоты (градиент: от 95% А: 5% В вплоть до 50% А: 50% В в течение 0,8 мин, от 50% А: 50% В вплоть до 100% В в течение 1,2 мин, 100% В в течение 1,85 мин, от 100% В вплоть до 95% А: 5% В в течение 1,95 мин), со скоростью потока 1 мл/мин; электрораспыление (положительная и/или отрицательная ионизация).

Метод А4. Высокоэффективная жидкостная хроматография - масс-спектрометрия (ЖХМС).

Анализ осуществляли на спектрометре Аа1ег§ ΖΡ с колонкой ХВпбде С18 2,5 мкм (50x3 мм) при 70°С, используя градиентную элюцию смесью (А) ацетонитрила и (В) воды/0,1% муравьиной кислоты (градиент: от 5% А: 95% В вплоть до 100% А в течение 5,3 мин, 100% А в течение 5,5 мин, 5% А: 95% В в течение 6,3 мин), со скоростью потока 0,9 мл/мин; электрораспыление (положительная и/или отрицательная ионизация).

Метод В. Спектры Ή ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (ΝΜΚ).

Спектры ¹Н ЯМР записывали либо на спектрометре ВКИКЕК АVАNСΕ ИКХ-500, ВКИКЕК АVАNСЕ ИКХ-400 или на спектрометре ВКИКЕК АVАNСЕ ИКХ-300. Спектры ¹³С ЯМР записывали на спектрометре ВКИКЕК АVАNСЕ ИКХ-300.

Метод С. Масс-спектрометрия с химической ионизацией (СГ).

Масс-спектры О записывали, используя масс-спектрометр ААТЕК8 ОСТ (аммиак).

Метод Ό. Масс-спектрометрия с химической ионизацией (0Ί).

Масс-спектры О записывали, используя масс-спектрометр ΕINNIОАN 88Р 7000 (аммиак).

Пример 1.

Ν-гидроксисукцинимидильный сложный эфир 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты может быть

тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты (11,3 мг) в тетрагидрофуране (0,4 мл) добавляли Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат (7,7 мг) и Ν,Νдиизопропилэтиламин (15,8 мкл). После 2,5 ч при комнатной температуре к реакционной смеси добавляли этилацетат (6 мл), органический раствор промывали дважды водой (4 мл), затем насыщенным водным раствором хлорида натрия (5 мл), сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме до получения остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск МииУапоНаШ колонка 2,5 г, 8160 15-40 мкм), используя градиентную элюцию смесью МеОН (метанол) (А)/ДХМ (дихлорметан) (В), (градиент: от 2% А: 98% В вплоть до 4% А: 96% В) с получением 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты Ν-гидроксисукцинимидильного эфира (17,6 мг): ЖХ/МС (метод А4): Е8: т/ζ 846 (М+Н)⁺;

время удерживания (КТ)=3,89 мин.

Ή ЯМР (400 МГц, СИС1₃-б1, δ м.д.): δ=1,75 (д, 1=6,8 Гц, 6Н); 2,23 (м, 2Н); 2,73-2,87 (м, 6Н); 2,97 (м, 4Н); 3,84-3,95 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,06 (м, 2Н); 4,26 (м, 4Н); 5,14 (д, 1=12,4 Гц, 2Н); 5,21 (д, 1=12,4 Гц, 2Н); 5,62 (м, 2Н); 6,84 (с, 2Н); 6,96 (с, 2Н); 7,09 (с, 1Н); 7,53 (с, 2Н); 7,63 (м, 2Н).

4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенокси)масляную кислоту получали следующим образом:

тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты (60 мг) в

- 20 019938 тетрагидрофуране (0,9 мл) добавляли МеОН (0,3 мл), воду (0,3 мл) и водный раствор гидроксида лития (1 М, 87 мкл). После 3 ч реакционную смесь разбавляли водой (10 мл) и рН доводили до 2 путем добавления 1н. водного раствора хлористо-водородной кислоты. Водную фазу экстрагировали три раза ДХМ (10 мл) и объединенные органические растворы сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме до получения остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск 8ирегУапоЕ1акй колонка 10 г, 81ОН 15-40 мкм), элюировали смесью ДХМ/МеОН/уксусная кислота (100:4:0,5) с получением 4(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)масляной кислоты: ЖХ/МС (метод А2): Е8: ш/х=749 МН⁺; ш/х=375 (М+2Н)²⁺/2;

ВТ=3,7 мин.

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆, δ в м.д.): δ=1,69 (д, 1=6,5 Гц, 6Н); 1,95 (м, 2Н); 2,39 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 2,91 (м, 2Н); 3,05 (м, 2Н); 3,83 (с, 6Н); 3,98 (м, 2Н); 4,01 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 4,10 (м, 4Н); 5,11 (д, 1=12,5 Гц, 2Н); 5,20 (д, 1=12,5 Гц, 2Н); 5,55 (м, 2Н); от 6,90 до 7,15 (м, 5Н); 7,34 (с, 2Н); 7,77 (м, 2Н); 12,1 (ушир.м, 1Н).

Метиловый эфир 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты получали

К охлажденному (0°С) раствору метилового эфира 4-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)масляной кислоты (50 мг) и триэтиламина (110 мкл) в ТГФ (тетрагидрофуран) (1,4 мл) добавляли метансульфонилхлорид (46 мкл). После 1 ч реакционную смесь разбавляли ДХМ (10 мл) и промывали дважды водой (5 мл). Органический раствор сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме до получения остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск 8ирегУаг1оЕ1акй колонка 10 г, 81ОН 1540 мкм), используя градиентную элюцию смесью МеОН (А)/ДХМ (В), (градиент: от 100% В вплоть до 5% А: 95% В) с получением 71,8 мг соединения в виде димезилата. К смеси томаймицина (80 мг), йодида калия (49 мг), карбоната калия (122 мг) в ДМФА (диметилформамид) (1 мл) добавляли раствор димезилата соединения (71,8 мг) в ДМФА (1,6 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 16 ч при 30°С. Воду (12 мл) добавляли и выпавшее в осадок твердое вещество фильтровали, промывали водой и сушили в вакууме с получением остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск 8ирегУапоЕ1ак11 колонка 30 г, 81ОН 15-40 мкм), используя градиентную элюцию смесью МеОН (А)/ДХМ (В), (градиент: от 100% В вплоть до 5% А: 95% В), с получением метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)масляной кислоты (65,4 мг): ЖХ/МС (метод А2): Е8: ш/х=763 МН⁺; ш/х=382 (М+2Н)²⁺/2;

ВТ=4,0 мин.

¹Н ЯМР (500 МГц, СПС1₃-б₁, δ в м.д.): 1,75 (д, 1=6,5 Гц, 6Н); 2,11 (м, 2Н); 2,53 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 2,98 (м, 4Н); 3,69 (с, 3Н); 3,89 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,00 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 4,28 (ушир.с, 4Н); 5,12 (д, 1=12,5 Гц, 2Н); 5,19 (д, 1=12,5 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2Н); 6,82 (с, 2Н); 6,92 (с, 2Н); 7,06 (с, 1Н); 7,52 (с, 2Н); 7,64 (д, 1=4,5 Гц, 2Н).

Метиловый эфир 4-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)масляной кислоты получали следующим образом:

К раствору 3,5-бис-гидроксиметилфенола (Ее1бет, Ό.; СиНсггех ^уа, М.; бе1 Рйат Саггеоп, М.; Ескег!, 1.Е.; Ьисс1капо, М.; 8сйа11, С.; Маккоп, Р.; 6а11аш, 1.Ь.; НетпсЕ В.; Ош11оп, Ό.; Метепдайеп, ГЕ. Не1у. Сйтпса Ас!а 2002, 85, 288) (200 мг), йодида калия (50 мг) и карбоната калия (540 мг) в ТГФ (2,5 мл) добавляли метиловый эфир 4-броммасляной кислоты (400 мкл). Реакционную смесь перемешивали в течение 20 ч при комнатной температуре, затем нерастворившуюся часть отфильтровывали. Фильтрат концентрировали в вакууме и остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск 8ирегУаг1оЕ1акй колонка 30 г, 8160 15-40 мкм), используя градиентную элюцию смесью МеОН (А)/ДХМ (В), (градиент: от 100% В вплоть до 5% А: 95% В), с получением метилового эфира 4-(3,5-бис

- 21 019938 гидроксиметилфенокси)масляной кислоты (53,5 мг): ЖХ/МС (метод А2): Е8: ιη/ζ=255 МН⁺; ιη/ζ=237 (М+Н-Н₂О)⁺;

КТ=2,5 мин.

^!Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-бе, δ в м.д.): δ=1,96 (м, 2Н); 2,47 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 3,61 (с, 3Н); 3,96 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 4,43 (д, 1=6,0 Гц, 4Н); 5,11 (т, 1=6,0 Гц, 2Н); 6,71 (с, 2Н); 6,82 (с, 1Н).

Пример 2.

4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил] фенокси)уксусная кислота

4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенокси)уксусная кислота может быть получена согласно способу получения 4-(3,5бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидро[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)уксусной кислоты: ЖХ/МС (метод А2): Е8: ιη/ζ=721 МН⁺; ш/х=361 (М+2Н)²⁺/2;

КТ=3,5 мин.

Метиловый эфир 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5 -он-8 -илоксиметил] фенокси)уксусной кислоты

Метиловый эфир 4-(3,5)-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)уксусной кислоты может быть получен согласно способу получения метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил] фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 4-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)уксусной кислоты: ЖХ/МС (метод А2): Е8: ™/ζ=735 МН⁺; т/ζ 368 (М+2Н)²⁺/2;

КТ=3,8 мин.

¹Н ЯМР (500 МГц, СПС1₃-б₁, 5 в м.д.): δ=1,76 (д, 1=6,5 Гц, 6Н); 2,96 (м, 4Н); 3,78 (с, 3Н); 3,88 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (ушир.с, 4Н); 4,64 (с, 2Н); 5,13 (д, 1=12,5 Гц, 2Н); 5,19 (д, 1=12,5 Гц, 2Н); 5,60 (м, 2Н); 6,80 (с, 2Н); 6,96 (с, 2Н); 7,11 (с, 1Н); 7,53 (с, 2Н); 7,63 (д, 1=4,5 Гц, 2Н).

Метиловый эфир 4-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)уксусной кислоты

Метиловый эфир 4-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)уксусной кислоты получали согласно способу получения метилового эфира 4-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 4-бромуксусной кислоты: ЖХ/МС (метод А2): Е8: ιη/ζ=227 МН⁺; т/ζ 209 (М+Н-Н₂О)⁺;

КТ=1,9 мин.

¹Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆, δ в м.д.): δ=3,70 (с, 3Н); 4,43 (д, 1=6,0 Гц, 4Н); 4,74 (с, 2Н); 5,14 (т, 1=6,0 Гц, 2Н); 6,72 (с, 2Н); 6,88 (с, 1Н).

- 22 019938

Пример 3.

к-гидроксисукцинимидильный эфир 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)-

к-гидроксисукцинимидильный эфир 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты может быть получен согласно способу получения к-гидроксисукцинимидильного эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения 3-(2-{2-[2(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовую кислоту: ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 964 (М+Н)⁺;

КТ=0,90 мин.

Ή ЯМР (500 МГц, СОС1₃-й₁, δ м.д.): δ=1,75 (дд, 1=6,7 Гц, 6Н); 2,82 (м, 4Н); 2,89 (т, 1=6, 6 Гц, 2Н); 2,97 (м, 4Н); 3,57-4,23 (м, 16Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,13 (д, 1=12,7 Гц, 2Н); 5,20 (д, 1=12,2 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2Н); 6,82 (с, 2Н); 6,96 (с, 2Н); 7,07 (с, 1Н); 7,53 (с, 2Н); 7,64 (д, 1=4,4 Гц, 2Н).

3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовая кислота

тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовую кислоту можно получать согласно способу получения 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты: ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 867 (М+Н)⁺; т/ζ 434 (М+2Н)²⁺/2;

КТ=0,84 мин.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃-й_ь δ м.д.): δ=1,76 (дд, 1=8,6, 1,5 Гц, 6Н); 2,61 (т, 2Н); 2,94-3,00 (м, 4Н); 3,63-3,75 (м, 8Н); 3,80 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 3,85-3,95 (м, 4Н); 3,98 (с, 6Н); 4,17 (т, 1=4,9 Гц, 2Н); 4,27 (ушир.с, 4Н); 5,14-5,21 (м, 2Н); 5,18 (д, 1=12,7 Гц, 2Н); 5,23 (д, 2Н); 5,23 (д, 1=12,7 Гц, 2Н) 5,62 (тд, 1=4,5, 2,2 Гц, 2Н); 6,88 (д, 1=0,5 Гц, 2Н); 6,97-7,02 (м, 2Н); 7,09 (с, 1Н); 7,54 (с, 2Н); 7,68 (д, 1=4,9 Гц, 2Н).

Метиловый эфир 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты

Метиловый эфир 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)- 23 019938 пропионовой кислоты получали согласно способу получения метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 3-(2-{2-[2([3,5-бис-гидроксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты: ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 881 (М+Н)⁺; т/ζ 441 (М+2Н)²⁺/2;

КТ=0,91 мин.

Ή ЯМР (400 МГц, СОСз-бь δ м.д.): δ=1,75 (ушир.д, 1=6,7 Гц, 6Н); 2,60 (т, 1=6,7 Гц, 2Н); 2,97 (м, 4Н); 3,54-4,21 (м, 16Н); 3,68 (с, 3Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,13 (д, 1=12,2 Гц, 2Н); 5,21 (д, 1=12,2 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2Н); 6,83 (с, 2Н); 6,96 (с, 2Н); 7,08 (с, 1Н); 7,53 (с, 2Н); 7,64 (д, 1=4,2 Гц, 2Н).

Метиловый эфир 3-(2-{2-[2-([3,5-бис-гидроксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты может быть получен следующим образом:

К раствору трет-бутилового эфира 3-(2-{2-[2-([3,5-бисгидроксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты (607 мг) в ДХМ (8,7 мл) добавляли трифторуксусную кислоту (2,2 мл). Реакционную смесь перемешивали в течение 3 дней при комнатной температуре, затем концентрировали в вакууме и полученный остаток растворяли в метаноле (5 мл). К охлажденному (0°С) метанольному раствору добавляли 2 М раствор (триметилсилил)диазометана в гексанах (3,6 мл) до сохранения желтого окрашивания. Затем добавляли уксусную кислоту (10 мкл) и полученный раствор концентрировали в вакууме с образованием остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Апа1од1х 8ирег Р1акй 81О₂ 8Г25-40 г), используя градиентную элюцию смесью ДХМ (А) и МеОН (В) (градиент: от 99% А: 1% В вплоть до 90% А: 10% В), с получением метилового эфира 3-(2-{2[2-([3,5-бис-гидроксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты (232 мг). ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 373 (М+Н)⁺; т/ζ 395 (Μ+Ν)⁺;

КТ=0,50 мин.

трет-Бутиловый эфир 3-(2-{2-[2-([3,5-бис-гидроксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты

трет-Бутиловый эфир 3-(2-{2-[2-([3,5-бис-гидроксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты может быть получен согласно способу получения метилового эфира 4-(3,5-бисгидроксиметилфенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения трет-бутиловый эфир 3-{2-[2-(2-бромэтокси)этокси]этокси}пропионовой кислоты (\УО 2004/091542): ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 415 (М+Н)⁺; т/ζ 432 (Μ+ΝΗ₄)⁺;

КТ=0,75 мин.

Пример 4.

Ν-гидроксисукцинимидильный эфир 6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иновой кислоты

Ν-гидроксисукцинимидильный эфир 6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иновой кислоты может быть получен согласно способу получения Ν-гидроксисукцинимидильного эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения 6-(3,5-бис-[(8)-2эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенил)гекс-5-иновую кислоту: ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 854 (М+Н)⁺;

КТ=1,25 мин.

- 24 019938

6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иновая кислота

6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иновую кислоту можно получить согласно способу получения 4-(3,5бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенил)гекс-5-иновой кислоты: ЖХ/МС (метод Α3): Е8: т/ζ 757 (М+Н)⁺;

КТ=0,89 мин.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃-6₁, δ м.д.): δ=1,76 (д, 1=6,8 Гц, 6Н); 1,98 (м, 2Н); 2,55 (м, 4Н); 2,97 (м, 4Н); 3,91 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,15 (д, 1=12,8 Гц, 2Н); 5,21 (д, 1=12,8 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2Н); 6,88 (с, 2Н); 7,48 (с, 3Н); 7,53 (с, 2Н); 7,67 (м, 2Н).

Метиловый эфир 6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]-

Метиловый эфир 6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иновой кислоты может быть получен согласно способу получения метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 6-(3,5-бис-гидроксиметилфенил)гекс-5-иновой кислоты: ЖХ/МС (метод Α3): Е8: т/ζ 771 (М+Н)⁺;

КТ=1,00 мин.

Ή ЯМР (500 МГц, СОС1₃-6₁, δ м.д.): δ=1,75 (д, 1=6,6 Гц, 6Н); 1,93 (м, 2Н); 2,50 (м, 4Н); 2,96 (м, 4Н); 3,69 (с, 3Н); 3,90 (м, 2Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,12 (д, 1=12,3 Гц, 2Н); 5,19 (д, 1=12,3 Гц, 2Н); 5,61 (м, 2Н); 6,81 (с, 2Н); 7,43 (с, 3Н); 7,54 (с, 2Н); 7,64 (д, 1=4,4 Гц, 2Н).

Метиловый эфир 6-(3,5-бис-гидроксиметилфенил)гекс-5-иновой кислоты получали следующим образом:

К охлажденному (0°С) раствору метилового эфира 6-[3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)фенил]гекс-5-иновой кислоты (140 мг) в безводном тетрагидрофуране (0,3 мл) осторожно добавляли 1 М раствор тетрабутиламмонийфторида в ТГФ (716 мкл). После 75 мин при комнатной температуре добавляли этилацетат (20 мл), органическую фазу промывали три раза водой (5 мл) и один раз насыщенным водным раствором хлорида натрия (5 мл), сушили над сульфатом натрия и концентрировали в вакууме с получением остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск 8ирегУапоР1акк

- 25 019938 колонка 15 г, 8160 15-40 мкм), используя градиентную элюцию смесью гептан (А)/этилацетат (В), (градиент: от 50% А: 50% В вплоть до 10% А: 90% В, с получением метилового эфира 6-(3,5-бисгидроксиметилфенил)гекс-5-иновой кислоты (64,3 мг) в виде масла бледно-желтого цвета. ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 263 (М+Н)⁺;

КТ=0,62 мин.

Метиловый эфир 6-[3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)фенил]гекс-5-иновой кислоты получали следующим образом:

К раствору 1,3-бис-гидроксиметил-5-йодбензола (Уепд, Е., 21ттеттап, 8.С. I. Ат. Сйет. 8ос. 1996, 118 (22), 5326-5327) (1,7 г) в дихлорметане (10 мл) добавляли триэтиламин (3,59 мл), третбутилдиметилсилилхлорид (2,91 г) и ДМФА (2 мл). После 1 ч этилацетат (200 мл) добавляли и органическую фазу промывали три раза водой (50 мл) и один раз насыщенным водным раствором хлорида натрия (50 мл), сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме с получением остатка (3,65 г). К раствору полученного остатка (200 мг) в ДМФА (0,90 мл) добавляли йодид меди(1) (7,7 мг), дихлоро-бис(трифенилфосфин)палладий(П) (28,5 мг), метиловый эфир 5-гексиновой кислоты (102,4 мг) и триэтиламин (113 мкл). После 45 мин этилацетат (40 мл) добавляли и органическую фазу промывали три раза водой (10 мл) и один раз насыщенным водным раствором хлорида натрия (10 мл), сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме с получением остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск 8ирегУапоЕ1акй колонка 30 г, 8160 15-40 мкм), используя градиентную элюцию смесью гептан (А)/этилацетат (В), (градиент: от 100% А вплоть до 90% А: 10% В), с получением метилового эфира 6-[3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)фенил]гекс-5-иновой кислоты (145,3 мг) в виде желтого масла. МС (метод С): С1: т/ζ 494 (Μ+ΝΗ₄)⁺.

Ή ЯМР (400 МГц, ДМСО-б₆, δ в м.д.): δ=0,07 (с, 12Н); 0,89 (с, 18Н); 2,55-2,69 (м, 2Н); 3,63 (с, 3Н); 4,67 (с, 4Н); 7,15 (большой с, 2Н); 7,28 (ушир.с, 1Н).

Пример 5.

Метиловый эфир 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой ки-

[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты может быть получен согласно способу получения метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты:

ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 882 (М+Н)⁺; т/ζ 441,5 (М+2Н)²⁺/2;

КТ=0,82 мин.

Ή ЯМР (400 МГц, СПС1₃-б_ь δ м.д.): δ=1,76 (д, 1=6,8 Гц, 6Н); 2,59 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 2,97 (м, 4Н); 3,58-3,72 (м, 9Н); 3,75 (т, 1=6,5 Гц, 2Н); 3,80-3,97 (м, 4Н); 4,00 (с, 6Н); 4,20 (ушир.м, 2Н); 4,27 (м, 4Н); 5,31-5,42 (м, 4Н); 5,61 (ушир.м, 2Н); 6,87 (с, 2Н); 7,02-7,15 (ушир.м, 2Н); 7,56 (с, 2Н); 7,65 (д, 1=4,4 Гц, 2Н).

- 26 019938

Метиловый эфир 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты

Метиловый эфир 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты может быть получен согласно способу получения метилового эфира 3-(2-{2-[2([3,5-бис-гидроксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты, используя в качестве исходного соединения трет-бутиловый эфир 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты: ЖХ/МС (метод А3): Εδ: т/ζ 374 (М+Н)⁺; т/ζ 418 (М+НСО₂Н-Н)^-;

ЯТ=0,31 мин.

трет-Бутиловый эфир 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты

К раствору диэтилового эфира 4-(2-{2-[2-(2-трет-бутоксикарбонилэтокси)этокси]этокси}этокси)пиридин-2,6-дикарбоновой кислоты (1,36 г) в абсолютном этаноле (72 мл) добавляли боргидрид натрия (309 мг) и хлорид кальция (921 мг). После перемешивания в течение 30 мин выделение водорода прекращалось и реакцию гасили водой. После концентрирования при пониженном давлении хлорид аммония добавляли и водную фазу экстрагировали три раза этилацетатом. Объединенные органические растворы сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме с получением остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Апа1од1х δиρе^ Б1аФ δίθ₂ δΡ25-80 г), используя градиентную элюцию смесью ДХМ (А) и МеОН (В) (градиент: от 100% А вплоть до 90% А: 10% В), с получением трет-бутилового эфира 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты (720 мг): ЖХ/МС (метод А3): Εδ: т/ζ 416 (М+Н)⁺;

ЯТ=0,52 мин.

Диэтиловый эфир 4-(2-{2-[2-(2-трет-бутоксикарбонилэтокси)этокси]этокси}этокси)пиридин-2,6дикарбоновой кислоты

о о

К охлажденному (0°С) раствору трет-бутилового эфира 12-гидрокси-4,7,10-триоксадекановой кислоты (1,91 мл) в ДХМ (12,9 мл) добавляли триэтиламин (1,13 мл), добавляли метансульфонилхлорид (622 мкл). После 3 ч реакционную смесь концентрировали в вакууме с получением остатка, затем остаток растворяли в этилацетате (13 мл). Нерастворившуюся часть удаляли фильтрованием, раствор промывали дважды этилацетатом (7 мл) и объединенные органические растворы концентрировали в вакууме до получения остатка (2,77 г). К раствору остатка 1,64 г в сухом ацетонитриле (10 мл) добавляли диэтиловый эфир хелидамовой кислоты (Ъсптт, Р.; ТесШа, Р.; Топе11а!о, и.; Vепб^ате. Т. I. Огд. СНет. 1989, 54, 5988) (1 г) и карбонат калия (2,88 г). После кипячения с обратным холодильником в течение 24 ч нерастворившуюся часть удаляли фильтрованием и раствор промывали этилацетатом. Затем органическую фазу концентрировали в вакууме с получением остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск δиρе^Vа^^οΡ^еρ колонка 200 г, δί60 15-40 мкм), используя градиентную элюцию смесью ДХМ (А) и МеОН (В) (градиент: от 100% А вплоть до 97% А: 3% В), с получением диэтилового эфира 4-(2-{2-[2(2-трет-бутоксикарбонилэтокси)этокси]этокси}этокси)пиридин-2,6-дикарбоновой кислоты (1,36 г):

ЖХ/МС (метод А4): Εδ: т/ζ 500 (М+Н)⁺; т/ζ 522 (Μ+Ν)⁺; т/ζ 444 (М-С₄Н₈+Н)⁺;

ЯТ=4,32 мин.

- 27 019938

Пример 6.

Ν-гидроксисукцинимидильный эфир 4-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты

тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты может быть получен согласно способу получения Ν-гидроксисукцинимидильного эфира 4-(3,5-бис-[(8)2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения 4-(2,6-бис-[(8)-2эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляную кислоту: ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 847 (М+Н)⁺; т/ζ 424 (М+2Н)²⁺/2;

КТ=0,80 мин.

¹Н ЯМР (400 МГц, СОС1₃-б₁, δ м.д.): 1,75 (ушир.д, 1=6,6 Гц, 6Н); 2,23 (ушир.м, 2Н); 2,76-2,89 (ушир.м, 6Н); 2,97 (ушир.м, 4Н); 3,91 (ушир.м, 2Н); 4,00 (ушир.с, 6Н); 4,14 (ушир.м, 2Н); 4,27 (ушир.м, 4Н); 5,28 (ушир.м, 4Н); 5,61 (ушир.м, 2Н); 6,87 (ушир.с, 2Н); 7,03 (ушир.с, 2Н); 7,56 (ушир.с, 2Н); 7,65 (ушир.м, 2Н).

Гидрохлорид 4-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты

бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты может быть получен согласно способу получения 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 4-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты: ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 750 (М+Н)⁺; т/ζ 375,5 (М+2Н)²⁺/2; т/ζ 332,5 (М-С₄Н₆О₂+2Н)²⁺/2;

КТ=0,73 мин.

¹Н ЯМР (400 МГц, СОСМь δ м.д.): δ=1,75 (д, 1=6,6 Гц, 6Н); 2,02 (м, 2Н); 2,42 (м, 2Н); 2,97 (м, 4Н); 3,83-4,14 (м, 4Н); 4,00 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,20-5,42 (м, 4Н); 5,61 (м, 2Н); 6,85 (с, 2Н); 6,94 (с, 2Н); 7,56 (с, 2Н); 7,63 (м, 2Н).

Метиловый эфир 4-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты

Метиловый эфир 4-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты может быть получен согласно способу получения метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир 4-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)масляной кислоты: ЖХ/МС (метод А4): Е8: т/ζ 764 (М+Н)⁺; т/ζ 664 (М-С₅Н₈О₂+Н)⁺; т/ζ 762 (М-Н)^-;

КТ=3,64 мин.

¹Н ЯМР (500 МГц, СОСЫь δ м.д.): δ=1,76 (д, 1=6,8 Гц, 6Н); 2,12 (м, 2Н); 2,50 (т, 1=7,3 Гц, 2Н); 2,97

- 28 019938 (м, 4Н); 3,68 (с, 3Н); 3,90 (м, 2Н); 4,00 (с, 6Н); 4,07 (ушир.м, 2Н); 4,27 (м, 4Н); 5,29 (ушир.м, 4Н); 5,61 (м, 2Н); 6,86 (с, 2Н); 6,99 (ушир.с, 2Н); 7,56 (с, 2Н); 7,65 (д, 1=4,4 Гц, 2Н).

Метиловый эфир 4-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)масляной кислоты

Метиловый эфир 4-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)масляной кислоты может быть получен согласно способу получения метилового эфира 3-(2-{2-[2-([3,5-бис-гидроксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты, используя в качестве исходного соединения трет-бутиловый эфир 4-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)масляной кислоты: ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 256 (М+Н)⁺;

КТ=0,25 мин.

трет-Бутиловый эфир 4-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)масляной кислоты

трет-Бутиловый эфир 4-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4-илокси)масляной кислоты может быть получен согласно способу получения 3-(2-{2-[2-(2,6-бис-гидроксиметилпиридин-4илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты, используя в качестве исходного соединения диэтиловый эфир 4-(3-трет-бутоксикарбонилпропокси)пиридин-2,6-дикарбоновой кислоты: ЖХ/МС (метод А4): Е8: т/ζ 298 (М+Н)⁺; т/ζ 156 (М-С₈Н₁₄О₂+Н)⁺;

КТ=2,45 мин.

Диэтиловый эфир 4-(3-трет-бутоксикарбонилпропокси)пиридин-2,6-дикарбоновой кислоты

Диэтиловый эфир 4-(3-трет-бутоксикарбонилпропокси)пиридин-2,6-дикарбоновой кислоты может быть получен согласно способу получения диэтилового эфира 4-(2-{2-[2-(2-третбутоксикарбонилэтокси)этокси]этокси}этокси)пиридин-2,6-дикарбоновой кислоты, используя в качестве исходного соединения трет-бутиловый эфир 4-броммасляной кислоты: ЖХ/МС (метод А4): Е8: т/ζ 382 (М+Н)⁺; т/ζ 404 (М+ка)⁺; т/ζ 785 (2М+ка)⁺; т/ζ 240 (М-С₈Н₁₄О₂+Н)⁺;

КТ=4,65 мин.

Пример 7.

Метиловый эфир к-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][ 1,4]бензодиазепин-5 -он-8-илоксиметил] фенокси)этил] -к-метилсукцинамовой кислоты

Метиловый эфир к-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло [2,1с][1,4] бензодиазепин-5 -он-8-илоксиметил] фенокси)этил] -к -метилсукцинамовой кислоты может быть получен согласно способу получения метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)масляной кислоты, используя в качестве исходного соединения метиловый эфир к-[2-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)этил]-к-метилсукцинамовой кислоты: ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 834 (М+Н)⁺;

- 29 019938

КТ=0,87 мин.

Ή ЯМР (400 МГц, СПС1₃-б_ь δ м.д.): δ=1,75 (д, 1=6,6 Гц, 6Н); 2,54-3,21 (м, 11Н); 3,61-4,17 (м, 6Н); 3,69 (с, 3Н); 3,97 (с, 6Н); 4,27 (м, 4Н); 5,10-5,21 (м, 4Н); 5,61 (м, 2Н); 6,82 (с, 2Н); 6,91-6,95 (м, 2Н); 7,06-

7,12 (м, 1Н); 7,53 (с, 2Н); 7,63 (д, 1=4,4 Гц, 2Н).

Метиловый эфир №[2-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)этил]-Ы-метилсукцинамовой кислоты может быть получен следующим образом:

К охлажденному (0°) раствору №[2-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)этил]-Ы-метилсукцинамовой кислоты (225 мг) в метаноле (1 мл) добавляли 2 М раствор (триметилсилил)диазометана в гексанах (840 мкл) до сохранения желтого окрашивания. После 40 мин этилацетат (5 мл) и уксусную кислоту (50 мкл) добавляли, затем через 1 мин добавляли насыщенный водный раствор бикарбоната натрия до рН 7. Водную фазу экстрагировали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме до получения остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск 8ире^Vа^^оΠа5Й колонка 25 г, 8160 15-40 мкм), используя градиентную элюцию смесью ДХМ (А)/МеОН (В), (градиент: от 98% А: 2% В вплоть до 90% А: 10% В), с получением метилового эфира №[2-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)этил]Ν-метилсукцинамовой кислоты (103 мг). ЖХ/МС (метод А3): Е8: т/ζ 348 (М+№1)'; т/ζ 326 (М+Н)⁺; т/ζ 308 (М-Н2О+Н)⁺;

КТ=0,43 мин.

№[2-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)этил]-Ы-метилсукцинамовая кислота может быть получена следующим образом:

№[2-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)этил]-Ы-метилсукцинамовая кислота может быть получена согласно способу получения №[2-(3,5-бис-гидроксиметилфенокси)этил]сукцинамовой кислоты, используя в качестве исходного соединения 3,5-бис-гидроксиметил(2-метиламиноэтокси)бензол: ЖХ/МС (метод 3): Е8: т/ζ 312 (М+Н)⁺; т/ζ 294 (М-Н₂О+Н)⁺; т/ζ 310 (М-Н)^-;

КТ=0,35 мин.

Гидрохлорид 3,5-бис-гидроксиметил(2-метиламиноэтокси)бензола

К раствору 1-(2-(трет-бутоксикарбонил)метиламиноэтокси)-3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)бензола (590 мг) в диоксане (4 мл) добавляли 4н. раствор хлористо-водородной кислоты в диоксане (3,3 мл). После 15 ч при комнатной температуре образовавшееся твердое вещество фильтровали, промывали диоксаном и сушили в вакууме с получением гидрохлорида 3,5-бис-гидроксиметил(2метиламиноэтокси)бензола (240 мг) в виде белого порошка. ЖХ/МС (метод А2): Е8: т/ζ 212 (М+Н)⁺;

КТ=0,14 мин.

1-(2-(трет-Бутоксикарбонил)метиламиноэтокси)-3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)бензол может быть получен следующим образом:

К раствору 1-(2-трет-бутоксикарбониламиноэтокси)-3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)

- 30 019938 бензола (270 мг) в тетрагидрофуране (5 мл) добавляли йодметан (70 мкл) и реакционную смесь охлаждали (0°С). К охлажденному раствору добавляли гидрид натрия (68 мг). После 1 ч реакционную смесь оставляли нагреваться до комнатной температуры. После 16 ч смесь ТГФ и воды 1:1 (2 мл) осторожно добавляли, затем добавляли лимонную кислоту до рН 2. Водную фазу экстрагировали три раза этилацетатом. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме с получением остатка. Остаток очищали хроматографией на силикагеле (Мегск 8ирегУапоЕ1азБ колонка 25 г, 8160 15-40 мкм), используя градиентную элюцию смесью гептан (А)/этилацетат (В), (градиент: от 100% А вплоть до 85% А: 15% В), с получением 1-(2-(трет-бутоксикарбонил)метиламиноэтокси)-3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)бензола (220 мг): ЖХ/МС (метод А2): Е8: т/ζ 562 (М+№)⁺; т/ζ 308 (М+Н-С₅Н₈О₂-О81С₆Н₁₆)⁺;

КТ=1,50 мин.

1-(2-трет-Бутоксикарбониламиноэтокси)-3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)бензол может быть получен следующим образом:

К охлажденному (0°С) раствору трет-бутоксикарбониламиноэтокси-3,5-бис(гидроксиметил)бензола (600 мг) в ДМФА (8 мл) добавляли трет-бутилдиметилхлорсилан (913 мг) и триэтиламин (936 мкл). После 18 ч воду добавляли и водную фазу экстрагировали дважды этилацетатом. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом магния и концентрировали в вакууме с получением 1-(2-третбутоксикарбониламиноэтокси)-3,5-бис-(трет-бутилдиметилсилилоксиметил)бензола (1 г): ЖХ/МС (метод А2): Е8: т/ζ 548 (\ΓΝι)'; т/ζ 294 (М+Н-С₅Н₈О₂-О81С₆Н₁₆)⁺;

КТ=1,45 мин.

Пример 8.

Ν-гидроксисукцинимидильный эфир 4-(3,5-бис-[(8)-2-метилиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенил)пропионовой кислоты, соединение 10

Схема 1

- 31 019938

Соединение 2: к суспензии литийалюминийгидрида (2,19 г, 54,8 ммоль) в безводном ТГФ (50 мл) добавляли раствор диметил 5-бромизофталата (9,98 г, 36,5 ммоль) в ТГФ (100 мл) при 0°С в течение 1 ч. По окончании добавления смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. К этому времени добавляли 150 мл ТГФ. Смесь вновь охлаждали до 0°С и реакцию гасили насыщенным водным раствором №1С1. Образовавшийся белый осадок отфильтровывали и затем твердое вещество промывали дополнительным количеством ТГФ (100 мл). Объединенный раствор в ТГФ сушили над Ыа₂8О₄, фильтровали и концентрировали. Дальнейшая очистка флэш-хроматографией на силикагеле (95:5, СН₂С1₂/СН₃ОН) привела к соединению 2 в виде белого твердого вещества (7,42 г, 95%).

Соединение 3: соединение 2 (3,36 г, 15,5 ммоль) суспендировали в безводном СН₂С1₂ (31 мл). ТВ8С1 (5,14 г, 34,1 ммоль) добавляли с последующим добавлением имидазола (3,16 г, 46,5 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Образовавшийся белый осадок отфильтровывали и фильтрат концентрировали посредством роторного испарителя. Полученный остаток очищали флэшхроматографией (силикагель, 97:3 гексаны/ЕЮАс) с получением 3 в виде бесцветного масла (6,15 г, 89%).

Ή ЯМР (400 МГц, СБС1₃): 5=0,081 (с, 12Н); 0,92 (с, 18Н); 4,67 (с, 4Н); 7,18 (с, 1Н); 7,31 (с, 2Н).

Соединение 4: колбу, содержащую соединение 3 (4,16 г, 9,36 ммоль), метилакрилат (1,3 мл, 14,0 ммоль), Рб(ОАс)₂ (105 мг, 0,47 ммоль), Р(о-толил)₃ (285 мг, 0,94 ммоль) и Εΐ₃Ν (9 мл) в 19 мл СН₃СИ, нагревали с обратным холодильником в атмосфере аргона в течение 16 ч. После охлаждения до комнатной температуры добавляли ледяную воду (20 мл). Смесь экстрагировали ЕЮАс (3x40 мл). Объединенные органические слои промывали 1н. НС1, насыщенным раствором соли, сушили над Иа₂8О₄ и концентрировали. Дальнейшей очисткой остатка флэш-хроматографией (силикагель, 97:3 гексаны/ЕЮАс) получали 4 в виде бесцветного масла (3,91 г, 93%).

Ή ЯМР (400 МГц, СБС1₃): 5=0,089 (с, 12Н); 0,93 (с, 18Н); 3,79 (с, 3Н); 4,72 (с, 4Н); 6,41 (д, 1=16 Гц, 1Н); 7,29 (с, 1Н); 7,34 (с, 2Н); 7,68 (д, 1=16 Гц, 1Н).

Е1М8 т/ζ 473 ([М]⁺+Иа).

Соединение 5: смесь 4 (2,54 г, 5,63 ммоль) и Рб/С (563 мг) в 55 мл ЕЮАс подвергали гидрированию при атмосферном давлении в течение 30 мин. Затем раствор пропускали через слой целита, твердое вещество промывали добавочным количеством ЕЮАс (25 мл). Объединенные ЕЮАс растворы концентрировали с получением 5 в виде бесцветного масла (2,55 г, 99+%), которое является достаточно чистым для использования на следующей стадии.

Ή ЯМР (400 МГц, СБС1₃): 5=0,067 (с, 12Н); 0,91 (с, 18Н); 2,60 (т, 1=8,0 Гц, 2Н); 2,92 (т, 1=8,0 Гц, 2Н); 3,65 (с, 3Н); 4,68 (с, 4Н); 7,00 (с, 2Н); 7,12 (с, 1Н).

Е1М8 т/ζ 475 ([М]⁺+Иа).

Соединение 6: к раствору 5 (1,48 г, 3,28 ммоль) в безводном ТГФ (33 мл) добавляли 8,2 мл 1 М раствора ТВАЕ в ТГФ при 0°С. После перемешивания при указанной температуре в течение 1 ч к смеси добавляли насыщенный водный раствор ИН₄С1 (30 мл). Смесь экстрагировали ЕЮАс (3x40 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над Иа₂8О₄ и концентрировали. Дальнейшая очистка остатка флэш-хроматографией (силикагель, 95:5 ДХМ/СН₃ОН) привела к 6 в виде бесцветного масла (625 мг, 85%), которое затвердевало после оставления в холодильнике.

Ή ЯМР (400 МГц, СБС1₃): 5=2,59 (т, 1=8,0 Гц, 2Н), 2,91 (т, 1=8,0 Гц, 2Н), 3,63 (с, 3Н), 4,61 (с, 4Н), 7,08 (с, 2Н), 7,16 (с, 1Н).

Соединение 7: диол 6 (59 мг, 0,26 ммоль) растворяли в ДХМ (2,6 мл). Раствор охлаждали до 0°С и обрабатывали Е1₃И (82 мкл, 0,58 ммоль) и МЮ1 (46 мкл, 0,58 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин и реакцию гасили ледяной водой (2 мл). Слои разделяли и далее водный слой экстрагировали ДХМ (3x2 мл). Объединенные ДХМ-слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над

- 32 019938 №ь8О.-| и концентрировали. Затем сушили в высоком вакууме с получением 7 в виде бледно-желтого масла, которое использовали сразу на следующей стадии без дальнейшей очистки.

Соединение 8: к смеси мономера ΡΒΌ (165 мг, 0,64 ммоль) и 7 (предположительная концентрация 0,26 ммоль) в ДМФА (2,7 мл) последовательно добавляли К₂СО₃ (147 мг, 1,06 ммоль), ΚΙ (22 мг, 0,13 ммоль) и Βυ₄ΝΙ (49 мг, 0,13 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 7 ч. Затем ДМФА удаляли в высоком вакууме. Остаток распределяли между ДХМ и водой и слои разделяли. Далее, водный слой экстрагировали ДХМ (3x3 мл). Объединенные ДХМ-слои промывали насыщенным раствором соли, сушили (№1₂8О₄) и концентрировали. Очисткой остатка хроматографией на силикагеле (25:1, СН₂С1₂/СН₃ОН) получали 8 в виде бледно-желтого стеклообразного твердого вещества (101 мг, 54%).

Е1М8 т/ζ 763 ([М]⁺+№+2Н2О), 745 ([М]⁺+№+Н2О), 727 (|\1| \а).

Соединение 9: к перемешиваемому раствору метилового эфира 8 (16 мг, 0,023 ммоль) в смеси ТГФМеОН-Н₂О (3:1:1, 0,45 мл) добавляли 1 М водный раствор ЫОН (0,025 мл, 1,1 экв.) при комнатной температуре и реакцию контролировали ТСХ. После 3,5 ч смесь разбавляли Н₂О (5 мл) и рН доводили до 2 1н. НС1. Затем смесь экстрагировали ДХМ (3x5 мл). Объединенные ДХМ-слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над №1₂8О₄ и концентрировали. Далее, очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ:МеОН:АсОН=100:4:0,5) получали желаемую кислоту 9 (8,2 мг, 60% с учетом извлеченного исходного материала (Ьгкт)), Е1М8 т/ζ 749 ([М]⁺+Nа+2Н₂Ο), 731 ([М]+Nа+Н₂Ο), 713 ([М]+№); плюс небольшое количество (~2 мг) метилового эфира 8.

Соединение 10: к раствору кислоты 9 (8,2 мг, 0,011 ммоль) в СН₂С1₂ (1 мл) добавляли поли-ЭСС (38 мг, 0,059 ммоль) и Ν-гидроксисукцинимид (ΝΉ8) (2,7 мг, 0,024 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, затем фильтровали через небольшой слой целита, промывали ДХМ, концентрировали. Полученный остаток очищали флэш-хроматографией (ДХМ: МеОН/100:3) с получением желаемого продукта 10 (7 мг, 81%).

Е1М8 т/ζ 874 ([М]⁺+№+2МеОН), 842 ([М]⁺+№+МеОН), 810 ([М]⁺+№).

Пример 9.

Ν-гидроксисукцинимидильный эфир (2-{2-[2-(2-{3-[3,5-бис-(7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11атетрагидро-1Н-бензо [е]пирроло [1,2-а][1,4]диазепин-8-илоксиметил)фенил]пропокси}этокси)этокси] этокси}этокси)уксусной кислоты, соединение 20

Соединение 12: водный раствор №ОН (50%, 6,9 мл) добавляли к тетраэтиленгликолю (68,08 г, 350 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч с последующим добавлением аллилйодида (8 мл, 87,6 ммоль). После перемешивания в течение дополнительных 24 ч смесь распределяли между Н₂О и Е!ОАс (50/50 мл). Далее водный слой экстрагировали Е!ОАс (5x30 мл). Объединенные Е!ОАс-слои сушили над №1₂8О₄ и концентрировали. Флэш-хроматографией остатка (силикагель, гексаны:Е!ОАс от 4:6 до 0:1) получали 12 в виде бесцветного масла.

- 33 019938

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=2,44 (ушир.с, 1Н); 3,63-3,71 (м, 16Н); 3,99-4,01 (м, 2Н); 5,13-5,17 (м, 1Н); 5,22-5,27 (м, 1Н); 5,84-5,92 (м, 1Н);

¹³С ЯМР δ 61,8, 69,4, 70,4, 70,59, 70,61, 70,63, 72,2, 72,5, 117,0, 134,8.

Е1М8 т/ζ 257 (|\1| У1).

Соединение 13: к суспензии ΝιΗ (89 мг, 2,2 ммоль) в безводном ТГФ (2,5 мл) добавляли раствор 12 (370 мг, 1,58 ммоль) в ТГФ (5 мл) при 0°С в атмосфере аргона. Смесь перемешивали при указанной температуре в течение 30 мин, затем при комнатной температуре в течение еще 30 мин. Реакционную смесь вновь охлаждали до 0°С и метилбромацетат (0,29 мл, 3,16 ммоль) добавляли по каплям. После перемешивания при 0°С в течение 1 ч баню со льдом отставляли и перемешивание продолжали в течение дополнительных 24 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь фильтровали через слой целита и фильтрат концентрировали. Дальнейшая очистка остатка флэш-хроматографией (силикагель, 1:1 гекса^^ΐΘΑ^ привела к 13 в виде светло-желтого масла (220 мг).

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=3,57-3,74 (м, 19Н); 3,98-4,0 (м, 2Н); 4,26 (с, 2Н); 5,15 (д, 1=10,4 Гц, 1Н); 5,24 (дд, 1=16, 1,6 Гц, 1Н); 5,84-5,93 (м, 1Н);

¹³С ЯМР δ=51,7, 68,6, 69,4, 70,56, 70,60, 70,62, 70,9, 72,2, 117,0, 134,8, 170,9.

Е1М8 т/ζ 329 ([М]⁺+№).

Соединение 14: колбу, содержащую соединение 3 (1,30 г, 2,92 ммоль), 13 (0,986 г, 3,220 ммоль), Р6(ОЛс)₂ (33 мг, 0,15 ммоль), Р(о-толил)₃ (89 мг, 0,29 ммоль) и Εΐ₃Ν (2 мл) в 30 мл СН₃С’Н нагревали с обратным холодильником в атмосфере аргона в течение 12 ч. После охлаждения до комнатной температуры ацетонитрил удаляли упариванием и добавляли этилацетат (40 мл), смесь пропускали через слой целита, смывали с целита этилацетатом и концентрировали. Дальнейшая очистка остатка флэшхроматографией (силикагель, 6:4 гексаны/ЕΐОΑс) привела к 14 (1,02 г) в виде бесцветного масла.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=0,076 (с, 12Н); 0,92 (с, 18Н); 3,61-3,72 (м, 19Н); 4,14 (с, 2Н); 4,15-4,17 (м, 2Н); 4,69 (с, 4Н); 6,23-6,28 (м, 1Н); 6,57 (д, 1=16,0 Гц, 1Н); 7,16 (с, 1Н); 7,19 (с, 2Н);

¹³С ЯМР δ=-5,2, 14,2, 18,4, 26,0, 51,7, 64,9, 68,6, 69,4, 70,57, 70,61, 70,64, 70,7, 70,9, 71,9, 122,8, 123,2, 125,9, 132,8, 136,5, 141,7, 170,9.

Е1М8 т/ζ 693 ([М]⁺+№).

Соединение 15: смесь 14 (0,062 г, 0,092 ммоль) и Р6/С (9 мг) в 2,5 мл ЕΐОΑс подвергали гидрированию при атмосферном давлении в течение 30 мин. Затем раствор пропускали через слой целита, твердое вещество промывали добавочным количеством ЕΐОΑс (10 мл). Объединенные ЕΐОΑс-растворы концентрировали с получением соединения 15 в виде бесцветного масла, которое использовали без дальнейшей очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=0,072 (с, 12Н); 0,92 (с, 18Н); 1,87-1,89 (м, 2Н); 2,64 (т, 1=8,0 Гц, 2Н); 3,43-3,70 (м, 21Н); 4,14 (с, 2Н); 4,68 (с, 4Н); 6,98 (с, 2Н); 7,10 (с, 1Н).

Е1М8 т/ζ 695 ([М]⁺+№).

Соединение 16: к раствору 15 из предыдущей стадии в безводном ТГФ (1,8 мл) добавляли 0,23 мл 1 М раствора ТΒЛР в ТГФ при 0°С. После перемешивания при указанной температуре в течение 1 ч насыщенный водный раствор ИН₄С1 (2 мл) добавляли к смеси. Смесь экстрагировали ЕΐОΑс (3x5 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над №ь8О₄ и концентрировали. Дальнейшая очистка остатка флэш-хроматографией (силикагель, 95:5 СН₂С1₂/СН₃ОН) привела к 16 в виде бесцветного масла (27 мг, 85%).

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=1,86-1,89 (м, 2Н); 2,66 (т, 1=8,0 Гц, 2Н); 3,40 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,503,70 (м, 19Н); 4,10 (с, 2Н); 4,61 (с, 4Н); 7,09 (с, 2Н); 7,13 (с, 1Н).

Е1М8 т/ζ 467 ([М]⁺+№).

Соединение 17: диол 16 (26,8 мг, 0,06 ммоль) растворяли в ДХМ (1,2 мл). Раствор охлаждали до 0°С и обрабатывали Εΐ₃Ν (18,5 мкл, 0,13 ммоль) и МкС1 (10,3 мкл, 0,13 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин и реакцию гасили ледяной Н₂О (2 мл). Слои разделяли и далее водный слой экстрагировали ДХМ (3x2 мл). Объединенные ДХМ-слои промывали насыщенным раствором соли, сушили с №ь8О₄ и концентрировали. Дальнейшая сушка с помощью высоковакуумного насоса привела к 17 в виде бледно-желтого масла, которое использовали сразу на следующей стадии без дальнейшей очистки.

Е1М8 т/ζ 623,1 ([М]⁺+№).

Соединение 18: к смеси мономера ΡΒΌ (40 мг, 0,15 ммоль) и 17 из предыдущей стадии в ДМФА (1,57 мл) последовательно добавляли К₂СО₃ (25 мг, 0,18 ммоль) и ΚΙ (10 мг, 0,06 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 20 ч. Затем ДМФА удаляли в высоком вакууме. Остаток распределяли между ДХМ и водой и слои разделяли. Далее, водный слой экстрагировали ДХМ (3x3 мл). Объединенные ДХМ-слои промывали насыщенным раствором соли, сушили (№₂8О₄) и концентрировали. Очисткой остатка хроматографией на силикагеле (25:1, ДХМ/СН₃ОН) получали 18 в виде бледно-желтого твердого стеклообразного вещества.

Е1М8 т/ζ 1011,5 ([М]⁺+№+2СН3ОН), 979,5 ([М]⁺+№+СН3ОН), 947,5 ([М]⁺+№).

Соединение 19: к перемешиваемому раствору метилового эфира 18 (16 мг, 0,017 ммоль) в смеси ТГФ-МеОН-Н₂О (3:1:1, 0,7 мл) добавляли 1 М водный раствор ЫОН (0,019 мл, 1,1 экв.) при комнатной

- 34 019938 температуре и реакцию контролировали ТСХ (тонкослойная хроматография). После 5 ч смесь разбавляли Н₂О (5 мл) и рН доводили до 2 1н. НС1. Затем смесь экстрагировали ДХМ (3x5 мл). Объединенные ДХМслои промывали насыщенным раствором соли, сушили №₂8О₄ и концентрировали. Дальнейшей очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ:МеОН:АсОН=100:4:0,5) получали желаемую кислоту 19.

Е1М8 т/ζ 933,4 ([М]+№).

Соединение 20: к раствору кислоты 19 (5,9 мг, 0,006 ммоль) в СН₂С1₂ (1,0 мл) добавляли ЕЭС (2 мг, 0,0097 ммоль) и ΝΗ8 (1,0 мг, 0,0084 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, затем фильтровали через небольшой слой целита, промывали ДХМ и концентрировали с получением желаемого продукта 10, который использовали без дальнейшей очистки, поскольку было найдено, что он разлагается при очистке на силикагеле.

Е1М8 т/ζ 1030,4 (|\1| \а).

Пример 10.

Ν-гидроксисукцинимидильный эфир (3-{2-[2-(2-{3-[3,5-бис-(7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11атетрагидро-1Н-бензо [е]пирроло [ 1,2-а] [1,4]диазепин-8-илоксиметил)фенил]пропокси}этокси)этокси] этокси}этокси)пропионовой кислоты, соединение 31

Схема 4

тетраэтиленгликоль грет бутилакрилат

Соединение 21: к раствору тетраэтиленгликоля (162 мл, 940 ммоль) в безводном ТГФ (500 мл) добавляли натрий (215 мг, 9,4 ммоль). Когда натрий растворялся, трет-бутилакрилат (45 мл, 310 ммоль) добавляли. Смесь перемешивали в течение 20 ч при комнатной температуре и нейтрализовали 8 мл 1н. НС1. После удаления растворителя остаток распределяли между насыщенным раствором соли и ЕЮАс. Далее, водный слой экстрагировали ЕЮАс. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над №ь8О₄ и концентрировали. Полученный остаток очищали флэшхроматографией на силикагеле (гексаны:этилацетат=4:6) с получением желаемого сложного эфира 21.

Ή ЯМР (400 МГц, СЭС1₃): δ=1,41 (с, 9Н); 2,34 (ушир.с, 1Н); 2,47 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,56-3,71 (м, 18Н).

Е1М8 т/ζ 345 ([М]⁺+№).

Соединение 22: раствор гидрогенсульфата тетрабутиламмония (1,27 г, 3,75 ммоль) и №ЮН (225 мг, 5,63 ммоль) в Н₂О (7 мл) добавляли к смеси 21 (1,20 г, 3,75 ммоль) и аллилбромида (0,48 мл, 5,63 ммоль) в ДХМ (14 мл). Двухфазную систему энергично перемешивали в течение 45 мин. Водный слой отделяли и экстрагировали три раза ДХМ. Объединенные ДХМ-слои концентрировали. Добавление ЕьО (15 мл)

- 35 019938 приводило к осаждению тетрабутиламмонийбромида, который отделяли фильтрацией. Фильтрат промывали насыщенным раствором соли, сушили над Ν₂8Ο₄ и концентрировали. Дальнейшей очисткой флэшхроматографией (силикагель, 1:1 гексаны/Е!ОАс) получали 22 в виде бесцветного масла.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=1,42 (с, 9Н); 2,47 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,56-3,70 (м, 18Н); 4,00 (м, 2Н); 5,15 (дкв, 1=6,0, 1,2 Гц, 1Н); 5,25 (дкв, 1=16, 1,6 Гц, 1Н); 5,84-5,94 (м, 1Н).

Е1М8 т/ζ 385,2 (|\1| Νι).

Соединение 23: раствор соединения 22 (478 мг, 1,32 ммоль) в трифторуксусной кислоте (9 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, при таком времени весь исходный материал расходовался. ТФУ удаляли в вакууме и далее остаток сушили с помощью толуола. Неочищенный продукт использовали непосредственно на следующей стадии.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=2,60 (т, 1=6,0 Гц, 2Н); 3,56-3,70 (м, 18Н); 4,01 (д, 1=5,6 Гц, 2Н); 5,16 (дд, 1=6,4, 1,2 Гц, 1Н); 5,25 (дд, 1=16, 1,6 Гц, 1Н); 5,84-5,94 (м, 1Н).

Е1М8 т/ζ 329,2 ([М]⁺+№).

Соединение 24: раствор кислоты 23 в ДМФА (6,6 мл) обрабатывали Ск₂СО₃ (451 мг, 1,38 ммоль) и Ме1 (90 мкл, 1,45 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем, ДМФ упаривали в высоком вакууме. Остаток суспендировали в Е!ОАс и образовавшееся твердое вещество отфильтровывали. Фильтрат концентрировали. Дальнейшая очистка остатка флэш-хроматографией (силикагель, 97:3 гексаны/Е!ОАс) привела к 24 в виде бесцветного масла.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=2,58 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,56-3,70 (м, 18Н); 4,00 (д, 1=5,6 Гц, 2Н); 5,14 (дд, 1=6,4, 1,2 Гц, 1Н); 5,24 (дд, 1=16, 1,6 Гц, 1Н); 5,84-5,94 (м, 1Н).

Е1М8 т/ζ 343,2 ([М]⁺+№).

Соединение 25: колбу, содержащую соединение 3 (0,066 г, 0,15 ммоль), соединение 24 (0,05 г, 0,16 ммоль), Рб(ОАс)₂ (1,7 мг, 0,0074 ммоль), Р(о-толил)₃ (4,5 мг, 0,015 ммоль) и Βΐ₃Ν (0,1 мл) в 3 мл СН₃С№ нагревали с обратным холодильником в атмосфере аргона в течение 8 ч. После охлаждения до комнатной температуры ацетонитрил удаляли упариванием, добавляли этилацетат (40 мл), смесь пропускали через слой целита и слой целита промывали этилацетатом. Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над сульфатом натрия и концентрировали. Дальнейшая очистка остатка флэш-хроматографией (силикагель, 6:4 гексаны/Е!ОАс) привела к 25 в виде бесцветного масла.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=0,076 (с, 12Н); 0,92 (с, 18Н); 2,57 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,57-3,68 (м, 20Н); 3,73 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 4,14 (д, 1=6,0 Гц, 2Н); 4,69 (с, 4Н); 6,23-6,29 (м, 1Н); 6,56 (д, 1=16,0 Гц, 1Н); 7,16 (с, 2Н); 7,19 (с, 1Н).

Е1М8 т/ζ 707,4 ([М]⁺+№).

Соединение 26: смесь 25 (0,216 г, 0,31 ммоль) и Рб/С (32 мг) в 6,3 мл Е!ОАс подвергали гидрированию при атмосферном давлении в течение 30 мин. Затем раствор пропускали через слой целита, твердое вещество промывали добавочным количеством Е!ОАс (10 мл). Объединенные Е!ОАс-растворы концентрировали с получением соединения 26 в виде бесцветного масла, которое использовали без дальнейшей очистки.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=0,071 (с, 12Н); 0,91 (с, 18Н); 1,87 (м, 2Н); 2,58 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 2,64 (т, 2Н); 3,44 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,54-3,67 (м, 20Н); 3,72 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 4,68 (с, 4Н); 6,98 (с, 2Н); 7,10 (с, 1Н).

Е1М8 т/ζ 709,4 ([М]⁺+№).

Соединение 27: к раствору 26 из предыдущей стадии в безводном ТГФ (3 мл) добавляли 0,38 мл 1 М раствора ТВАЕ в ТГФ при 0°С. После перемешивания при указанной температуре в течение 1 ч к смеси добавляли насыщенный водный раствор ΝΗ₄Ο (2 мл). Смесь экстрагировали Е!ОАс (3x5 мл). Объединенные органические слои промывали насыщенным раствором соли, сушили над №ь8О₄ и концентрировали. Дальнейшей очисткой остатка флэш-хроматографией (силикагель, 95:5 СН₂С1₂/СН₃ОН) получали 27 в виде бесцветного масла.

Ή ЯМР (400 МГц, СОС1₃): δ=1,87 (м, 2Н); 2,56 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 2,69 (т, 1=7,2 Гц, 2Н); 3,42 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 3,54-3,67 (м, 20Н); 3,70 (т, 1=6,4 Гц, 2Н); 4,64 (с, 4Н); 7,12 (с, 2Н); 7,16 (с, 1Н).

Е1М8 т/ζ 481,3 ([М]⁺+№).

Соединение 28: диол 27 (54 мг, 0,126 ммоль) растворяли в ДХМ (2,4 мл). Раствор охлаждали до 0°С и обрабатывали Βΐ₃Ν (41 мкл, 0,29 ммоль) и МкС1 (23 мкл, 0,29 ммоль). Смесь перемешивали при 0°С в течение 30 мин и реакцию гасили ледяной Н₂О (2 мл). Слои разделяли и далее водный слой экстрагировали ДХМ (3x2 мл). Объединенные ДХМ-слои промывали насыщенным раствором соли, сушили с №ь8О₄ и концентрировали. Дальнейшая сушка с помощью высоковакуумного насоса привела к 28 в виде бледно-желтого масла, которое использовали сразу на следующей стадии без дальнейшей очистки.

Е1М8 т/ζ 637,2 ([М]⁺+№).

Соединение 29: к смеси мономера РВЭ (76 мг, 0,29 ммоль) и 28 из предыдущей стадии в ДМФА (2,9 мл) последовательно добавляли К₂СО₃ (49 мг, 0,35 ммоль) и К1 (20 мг, 0,12 ммоль). Смесь перемешивали в атмосфере аргона при комнатной температуре в течение 20 ч. Затем ДМФА удаляли в высоком вакууме. Остаток распределяли между ДХМ и водой и слои разделяли. Далее водный слой экстрагировали ДХМ (3x3 мл). Объединенные ДХМ-слои промывали насыщенным раствором соли, сушили (№ь8О₄)

- 36 019938 и концентрировали. Очисткой остатка хроматографией на силикагеле (100:3, ДХМ/СН3ОН) получали 29 в виде бледно-желтого твердого стеклообразного вещества.

Е1М8 т/ζ 1025,6 ([М]⁺+ка+2СН3ОН), 993,5 ([М]⁺+ка+СН3ОН), 961,5 ([М]⁺+ка).

Соединение 30: к перемешиваемому раствору метилового эфира 29 (11,8 мг, 0,012 ммоль) в смеси ТГФ-МеОН-Н₂О (3:1:1, 0,5 мл) добавляли 1 М водный раствор ЫОН (0,014 мл, 1,1 экв.) при комнатной температуре и реакцию контролировали ТСХ. После 5 ч реакцию гасили АсОН (0,014 ммоль) и летучие компоненты удаляли путем выпаривания. Дальнейшей очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ:МеОН=95:5) получали желаемую кислоту 30.

Е1М8 т/ζ 947,5 ([М]⁺+ка).

Соединение 31: к раствору кислоты 30 (4,6 мг, 0,005 ммоль) в ДХМ (1,0 мл) добавляли ЕЭС (1этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид) в качестве связывающего средства (1,4 мг, 0,0075 ммоль) и кН8 (0,74 мг, 0,0065 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи, затем фильтровали через небольшой слой целита, промывали ДХМ и концентрировали с получением желаемого продукта 31. Дальнейшей очисткой флэш-хроматографией на силикагеле (ДХМ:МеОН=100:3) получали желаемый кН8-эфир 31.

Е1М8 т/ζ 1022,5 ([М]⁺+ка).

Пример 11.

НиМу9-6 - 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)бутирильный конъюгат.

1.45 мл раствора антитела 1шМу9-6 при концентрации 6,4 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05 М фосфата калия и 0,05 М хлорида натрия, рН 8, обрабатывали 7,5-кратным молярным избытком 9,5 мМ раствора к-гидроксисукцинимидильного эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты из примера 1 в диметилацетамиде (ОМА) так, что конечная концентрация антитела 1шМТ9-6 составляла 5 мг/мл и концентрация ОМА в буфере составляла 20%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 195 мин, фильтровали через М111ех^к-НУ 0,45 мкм (РУЭЕ Оигароге М1Шроге #8ЕНУ0138Ь) и затем наносили на колонку для гель-фильтрации 8ирегйех™ 200 ргер дгайе (Н11оай™ 16/60 Со1итп СЕ# 17-1069-01), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,010 М фосфата, 0,140 М хлорида натрия, рН 6,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали, объединяли и концентрировали на УКакрш 2 (10000 М\УСО НТ 8аг1опи5 #У802Н02) с получением продукта (1,8 мл). Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, которые были определены для метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден7-метокси-1,2,3,11 а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4] бензодиазепин-5 -он-8 -илоксиметил] фенокси)масляной кислоты (е319нм=9087 М^-1см^-1 и е280нм=12166 М^-1см^-1) и антитела НиМу9-6 (е_280нм=206,539 М^-1см^-1). В среднем 2,1 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин5-он-8-илоксиметил]фенокси)бутирильных фрагментов связывалось с молекулой антитела (1,6 мг/мл).

Пример 12.

1шВ4 - 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)бутирильный конъюгат.

3,4 мл раствора антитела 1шВ4 при концентрации 8 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,0 5 М фосфата калия и 0,0 5 М хлорида натрия, рН 8, обрабатывали 8-кратным молярным избытком 11,5 мМ раствора к-гидроксисукцинимидильного эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты из примера 1 в ОМА так, что конечная концентрация антитела 1шВ4 составила 5,6 мг/мл и концентрация ОМА в буфере составила 20%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, фильтровали через М111ех^к-НУ 0,45 мкм (РУЭЕ Эигароге М1Шроте #8ЕНУ0138Е) и затем наносили на колонку для гель-фильтрации 8ирегйех™ 200 ргер дгайе (Нйоай™ 16/60 Со1итп СЕ# 17-1069-01), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,010 М фосфата, 0,140 М хлорида натрия, рН 6,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали, объединяли и концентрировали на Указрш 15Κ (10000 М\УСО НТ 8аг1опи5 #У802Н02) с получением продукта (5 мл). Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, которые были определены для метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты (е319нм=9087 М^-1см^-1 и е280нм=12166 М^-1см^-1) и антитела ЬиВ4 (е_280нм=222,960 М^-1см^-1). В среднем 4,48 4-(3,5-бис-[(8)-2эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)бутирильных фрагментов связывалось с молекулой антитела (1,49 мг/мл).

Пример 13.

1ш2Н11 - 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)бутирильный конъюгат.

3.45 мл раствора антитела Ьи2Н11 (см. \УО 2008/010101; зарегистрировано АТСС под инвентарным номером РТА-7662) при концентрации 5,1 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05 М фосфата калия и

- 37 019938

0,05 М хлорида натрия, рН 8, обрабатывали 8-кратным молярным избытком 10,5 мМ раствора Νгидроксисукцинимидильного эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты из примера 1 в ОМА так, что конечная концентрация антитела 1и2Н11 составила 4,3 мг/мл и концентрация ОМА в буфере составила 20%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, фильтровали через МШех^-НУ 0,45 мкм (РУЭЕ Энгароге М1Шроге #8ЬНУ0138Ь) и затем наносили на колонку для гель-фильтрации 8ирегбех™ 200 ргер дгабе (НПоаб™ 16/60 Со1итп СЕ# 17-1069-01), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,010 М фосфата, 0,140 М хлорида натрия, рН 6,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали, объединяли и концентрировали на УКазрт 15К (10000 М\УС’О НΥ 8аг1ог1нз #У802Н02) с получением продукта (2,2 мл). Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, которые были определены для метилового эфира 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с] [1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты (е_319нм=9087 М^-1 см^-1 и е280нм=12166 М^-1см^-1) и антитела 1и2Н11 (е280нм=208,380 М^-1см^-1). В среднем 3,74 4- (3,5-бис[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)бутирильных фрагментов связывалось с молекулой антитела (1,55 мг/мл).

Пример 14.

1шМу9-6 - 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильный конъюгат.

8.2 мл раствора антитела 1шМу9-6 при концентрации 7,2 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05

М №(2-гидроксиэтил)пиперазин-Ы'-2-этансульфокислоты (НЕРЕ8), 0,05 М хлорида натрия и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 8, обрабатывали 10-кратным молярным избытком 10,4 мМ раствора Ν-гидроксисукцинимидильного эфира 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло [2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты из примера 3 в ОМА так, что конечная концентрация антитела 1шΜΥ9-6 составила 3 мг/мл и концентрация ОМА в буфере составила 20%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, фильтровали через МШех⁹ 8У 5 мкм (РУЭЕ Энгароге М1Шроге #8Ь8У0258Ь) и затем наносили на колонку для гель-фильтрации 8ирегбех™ 200 ргер дгабе (Нбоаб™ 26/60 Со1итп СЕ# 17-1071-01), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,010 М фосфата, 0,140 М хлорида натрия, рН 6,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали, объединяли и концентрировали на Аткоп и1!га-15 (И1!гасе1 10к М1Шроге #ИЕС901024) с получением продукта (7 мл). Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, определенные для метилового эфира 3(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты (е₃1_9нм=7566 М^-1см^-1 и е_280нм=7078 М^-1см^-1) и антитела 1шМу9-6 (е_280нм=206,539 М^-1см^-1). В среднем 4,80 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильных фрагментов связалось с молекулой антитела (3,44 мг/мл).

Пример 15.

1и2Н11 - 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильный конъюгат.

13.2 мл раствора антитела 1и2Н11 при концентрации 4,7 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05 М №(2-гидроксиэтил)пиперазин-Ы'-2-этансульфокислоты (НЕРЕ8), 0,05 М хлорида натрия и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 8, обрабатывали гликофуролом и 10-кратным молярным избытком 10,6 мМ раствора Ν-гидроксисукцинимидильного эфира 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты из примера 3 в ОМА так, что конечная концентрация антитела 1и2Н11 составила 3 мг/мл, концентрация гликофурола в буфере составила 10%, и концентрация ОМА в буфере составила 20%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, фильтровали через М111ех^К-8У 5 мкм (РУЭЕ Энгароге М1Шроге #8Ь8У0258Ь) и затем наносили на колонку для гель-фильтрации 8ирегбех™ 200 ргер дгабе (НПоаб™ 26/60 Со1итп СЕ# 17-1071-01), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,010 М фосфата, 0,140 М хлорида натрия, рН 6,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали, объединяли и концентрировали на Аткоп И1!га-15 (и1!гасе1 10к М1Шроге #ИЕС901024) с получением продукта (3,6 мл). Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, определенные для метилового эфира 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты (е319нм=7566 М^-1см^-1 и е280нм=7078 М^-1см^-1) и антитела 1и2Н11 (е_280нм=208,380 М^-1см^-1). В среднем 4,08 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенокси)этокси]

- 38 019938 этокси}этокси)пропионильных фрагментов связалось с молекулой антитела (1,33 мг/мл).

Пример 16.

1и2Н11 - 6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иноильный конъюгат.

0,95 мл раствора антитела 1и2Н11 при концентрации 3,2 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05 М фосфата калия и 0,05 М хлорида натрия, рН 8, обрабатывали 8-кратным молярным избытком 10,5 мМ раствора Ν-гидроксисукцинимидильного эфира 6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иновой кислоты из примера 4 в ОМА так, что конечная концентрация антитела 1и2Н11 составила 2,5 мг/мл и концентрация ОМА в буфере составила 20%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, фильтровали через МШех^-НУ 0,45 мкм (РУЭР ^и^арο^е М^11^рο^е #8ЬНУ0138Ь) и затем наносили на колонку для гель-фильтрации 8иретбех™ 200 ргер дтабе (ΉΠοπά'™ 16/60 Сο1итη СЕ# 17-1069-01), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,010 М фосфата, 0,140 М хлорида натрия, рН 6,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали, объединяли и концентрировали на Ат^сοη иИта-4 (иИтасе1 10к М^11^рο^е #ИРС801096) с получением продукта (275 мкл). Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, определенные для метилового эфира 6-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]фенил)гекс-5-иновой кислоты (ез1э_нм=13594 М^-1см^-1 и 8280нм=19416 М^-1см^-1) и антитела 1и2Н11 (е280нм=208,380 М^-1см^-1). В среднем 1,75 6(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенил)гекс-5-иноильных фрагментов связалось с молекулой антитела (0,48 мг/мл).

Пример 17.

Приготовление исходного раствора ЮР-08-Ж8.

Растворы IСΡ-08-NН8 (соединение 10 примера 8) были свежеприготовленными до концентрации 0,005 М исходного раствора на основании молекулярной массы, составляющей 787,81, в ОМА. Исходный раствор анализировали спектрофотометрически, используя ссылочный коэффициент экстинкции, определенный при 320 нм (ε₃₂₀=9 1 37 М^-1см^-1).

Пример 18.

ЬиМу9-6-ЮР-08.

Антитело 1шМу9-6, которое связывается с антигеном СЭ33, выбирали для конъюгирования с производными РВЭ. Раствор антитела 1шМу9-6 при концентрации 5 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05 М №(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-2-этансульфокислоты (НЕРЕ8) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 8, обрабатывали 6-кратным молярным избытком раствора ЮР-08-Ж8 (соединение 10 примера 8) в ОМА так, что конечная концентрация ОМА в буфере составила 20%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 120 мин и затем наносили на колонку для гель-фильтрации с 8еркабех С25 (Н1Ргер™ 26/10 колонка для обессоливания СЕ# 17-5087-01), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,01 М цитрата натрия, 0,135 М хлорида натрия, рН 5,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали и объединяли с получением продукта. Объединенный материал диализовали в течение ночи против такого же элюционного буфера (0,01 М цитрата натрия, 0,135 М хлорида натрия, рН 5,5) для осуществления очистки продукта. Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, определенные для соединения 8 примера 8 (е_320нм=9137 М^-1см^-1 и е280нм=7743 М^-1см^-1) и антитела 1шМу9-6 (е280нм=206,460 М^-1см^-1). В среднем, 4,5 молекул РВЭ (соединение 9 примера 8) связалось с молекулой антитела.

Пример 19.

ЬиВ4-ЮР-08.

Антитело 1ш-анти-В4, которое связывается с антигеном СЭ19, предпочтительно экспрессированным на поверхности клеток лимфомы человека, выбирали для конъюгирования с производными РВЭ. Раствор антитела 1шВ4 при концентрации 8 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05 М фосфата калия, 0,05 М хлорида натрия и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 7,1, обрабатывали 5кратным молярным избытком раствора IСΡ-08-NН8 (соединение 10 примера 8) в диметилацетамиде (ОМА) так, что конечная концентрация ОМА в буфере составила 20%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 70 мин и затем наносили на колонку для гель-фильтрации с 8ерЬабех С25 ^АР™ ί.’οΐιιιηηδ, СЕ# 17-0852-02), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,010 М фосфата, 0,140 М хлорида натрия, рН 6,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали и объединяли с получением продукта. Объединенный материал диализовали в течение ночи против такого же элюционного буфера (0,010 М фосфата, 0,140 М хлорида натрия, рН 6,5) для осуществления очистки продукта. Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, определенные для соединения 8 примера 8 (е_320нм=9137 М^-1см^-1 и е280нм=7743 М^-1см^-1) и антитела 1шВ4 (е280нм=222,960 М^-1см^-1). В среднем, 3,1 молекул РВЭ (соединение 9 примера 8) связалось с молекулой антитела.

- 39 019938

Пример 20.

Приготовление исходного раствора ΙΟΡ-13-ΝΗδ.

Растворы ΙΟΡ-13-ΝΗδ (соединение 31 примера 10) были свежеприготовленными до концентрации 0,0062 М исходного раствора на основании молекулярной массы, составляющей 1022,1, в ΌΜΑ. Исходный раствор анализировали спектрофотометрически, используя ссылочный коэффициент экстинкции, определенный при 320 нм (е_320нм=9137 М^-1см^-1).

Пример 21.

Ηο2Η11-ΙΟΡ-13.

Антитело Ьи2Ш1, которое связывается с антигеном ЕрСАМ, выбирали для конъюгирования с производными ΡΒΌ. Раствор антитела 11112Η11 при концентрации 5 мг/мл в водном буфере, содержащем 0,05 М №(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-2-этансульфокислоты (ΗΕΡΕδ) и 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), рН 8, обрабатывали 8-кратным молярным избытком раствора ΙΟΡ-08-ΝΗδ (соединение 31 примера 8) в ΌΜΑ так, что конечная концентрация ΌΜΑ в буфере составила 15%. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 120 мин и затем наносили на колонку для гельфильтрации с δеρНабеx Ο25 (ΗίΡι^™ 26/10 колонка для обессоливания ΟΕ# 17-5087-01), которую предварительно уравновешивали в водном буфере, содержащем 0,01 М цитрата натрия, 0,135 М хлорида натрия, рН 5,5. Конъюгированные, содержащие антитело фракции собирали и объединяли с получением продукта. Объединенный материал диализовали в течение ночи против такого же элюционного буфера (0,01 М цитрата натрия, 0,135 М хлорида натрия, рН 5,5) для осуществления очистки продукта. Конечный конъюгат анализировали спектрофотометрически, используя коэффициенты экстинкции, определенные для соединения 29 примера 10 (е_320нм=9137 М^-1см^-1 и е280нм=7743 М^-1см^-1) и антитела 11112Η11 (е280нм=215,525 М^-1см^-1). В среднем 4,7 молекул ΡΒΌ (соединение 31 примера 10) связалось с молекулой антитела.

Пример 22.

Анализ связывания.

Относительные значения сродства к связыванию антитела анти-В4 и его конъюгата с томаймицином с антиген-экспрессирующими клетками Каток определяли, используя иммунофлуоресцентный метод. Конъюгат антитело-томаймицин и оголенное антитело при исходных концентрациях 1 х 10^-7 М добавляли к 96-луночным круглодонным планшетам и титровали, используя 3-кратные серийные разведения, в двух повторностях для каждой концентрации. Клетки Каток добавляли при 50000 клеток на лунку к каждой лунке, содержащей различные концентрации антитела или конъюгата, а также к контрольным лункам. Планшеты инкубировали на льду в течение 3 ч. После периода инкубации клетки в планшетах промывали и меченое флуоресцирующее вторичное антитело, которое связывается с гуманизированным ΙβΟ, подобным анти-В4, добавляли и планшеты инкубировали в течение 1 ч на льду. Планшеты вновь промывали после периода инкубации и клетки фиксировали раствором 1% формальдегида/ΡΒδ. Значения флуоресценции в каждой лунке планшетов считывали, используя флуоресцентный анализатор Βес!οη П1ск1пкоп ΕΑСδСаί^Ьи^. Данные наносили на график как процент максимальной флуоресценции, полученной при самой высокой концентрации антитела или конъюгата.

Пример 23.

Ф νίΙΐΌ эффективность и специфичность производного соединения томаймицина или конъюгатов производного томаймицина (анализ жизнеспособности клеток).

Общий используемый протокол.

Образцы свободного производного томаймицина или конъюгата производного томаймицина добавляли к 95-луночному плоскодонному планшету для культуры ткани и титровали, используя серийные разведения, изменяющиеся от 1х10^-12 до 3х10^-7 М.

Антигенположительные опухолевые клетки или антигенотрицательные опухолевые клетки добавляли к лункам таким образом, чтобы осуществить три повторения эксперимента для каждой концентрации лекарственного средства для каждой линии клеток. Планшеты инкубировали при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в течение 4 дней.

В конце периода инкубации 20 мкл тетразолиевого реагента \VδТ-8 (2-(2-метоксинитрофенил)-3-(4нитрофенил)-5-(2,4-дисульфофенил)-2-тетразолий, мононатриевая соль) добавляли к каждой лунке и планшеты вновь помещали в инкубатор на 2 ч. Затем абсорбцию в каждой лунке планшетов измеряли, используя прибор для считывания планшетов Мо1еси1аг Ое\зсек при 450 нм. Величину фракции выживших клеток при каждой концентрации производного томаймицина или конъюгата наносили на график.

Цитотоксичность соединений и их специфичность в сравнении с конъюгатами согласно изобретению против линий клеток МОЬТ-4, ΒΙΑΒ, Η^60/^С. ΗΕ-60/АТСС и Каток тестировали. Результаты иллюстрированы на фиг. 1, 2, 3, 6 и 8.

- 40 019938

Пример 24.

Клоногенный анализ.

Общая используемая процедура.

Клетки МОА-МВ-231 помещали в планшеты в количестве 3000 клеток на лунку в двух отдельных 6-луночных планшетах; клетки РС-3 и 8К-МЕЬ-28 помещали в планшеты в количестве 2000 клеток на лунку в 2 отдельных планшетах. Испытуемый образец (образцы) добавляли с получением конечных концентраций 0,5х10^-13, 5х10^-12, 5х10^-11, 5х10^-10 и 5х10^-9 М на лунку (или подобный диапазон дозировок) для каждого планшета. Например, когда клетки высевали в объеме 1 мл и 1 мл 2х концентрации испытуемого соединения или конъюгата добавляли к соответствующим лункам, то получали конечную желаемую концентрацию в объеме 2 мл. Конечный раствор испытуемого образца был приготовлен в такой же среде, что и линия клеток; поэтому различные разведения должны быть сделаны для каждой отличной клеточной линии. Планшеты помещали в инкубатор при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Рост клеток контролировали, и когда клетки в 0 (контроль) лунках образовывали колонии, но не были конфлюентными, обычно в течение 7 дней для указанных линий клеток, супернатант удаляли отсасыванием. Клетки промывали один раз РВ8 (фосфатно-солевой буферный раствор) и супернатант отсасывали. К каждой лунке добавляли 0,5 мл на лунку 0,1% кристаллический фиолетовый краситель/10% формалин/РВ8. Планшеты инкубировали при комнатной температуре в течение 10-15 мин. Супернатант удаляли отсасыванием и лунки промывали 3 раза дистиллированной водой и затем сушили на воздухе. Колонии в каждой лунке просчитывали и число колоний в каждой исследуемой лунке делили на число колоний в 0 лунке для определения фракции выживших клеток. Затем, величины Κ''₅₀ рассчитывали, исходя из полученных данных.

Соединения и конъюгатные молекулы, описанные в примерах, имели величины Κ''₅₀ между <1 и 10000 пМ (см. приложенные фигуры и таблицу относительно отдельных величин для различных клеточных линий).

- 41 019938

Ш νίΐго данные (ГС50 в пМ) для неконъюгированных производных томаймицина для различных клеточных линий

	Катов	НЕбО/ОС	Н1.60/АТСС	МОАМВ-231	РС-3	8К- МЕЬ- 28
Соединение 9 из схемы 2 (=1СР-08)	2700	3500	2600
Соединение 8 из схемы 2 (=1СР-08ОМе)	8,0	1,1	4,0	17,0	27,0	10,0
Соединение 18 из схемы (метиловый эфир соединения из примера 9)	5000		5000
X Метиловый эфир соединения ш примет 2	1,4		12,0
Ж Жж Метиловый эфир соединения из прмимм 1	<0,76		<0,76
ΧΎ Η./=^Ν 0 γΖ'γΤ. Н 0 ’ ¹ О Соединение из примем 1 в виде кислоты	580,0	1200,0	2000,0
Ё л£ГЖ Метиловый эфир соединения на примере 4	1,2		2,2	12,0	27,0	15,0
А ° Метиловый эфир соединения на примера 3			12,0	16,0	7,4	9,7
Соединение 29 из схемы 4 (=ЮР-13- ОМе)				50,0	300,0	710,0
г—.~-Г Жж Метиловый эфир соединения из примера 5				8,0	500,0	71,0
Ж ЖЖ Метиловый эфир соединения на примера в				1,7	11,0	8,7
гЛ-Л- ЖЖ- Метиловый эфир соединения на примера 7				9,0	500,0	90,0

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1.2 л о >7 1.1 : Ф § 1.0 : X 0.» 3 а 0.8 со 5 0.Т 36 0.6 ^; л . - : К ЗЕ 0.4 : г 0.3 ; ф а. 0.2 : е 0.1 : 0.0 -

Фиг. 19

МОА-мв-231 клетки ЯгОеИЗ м РОЗ клетки 5,0е4 о м $к-м£Ь2& клетки ЗДе-И М

- 58 019938

Ιη νΐίΓΟ данные цитотоксичности ЬиМу9-6 -4-(3,5-бис-[(8)-2-эт>(Е)-илиден7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5ч>н·

8-илоксиметил]фенокси)бутирильнрго конъюгата из примера 11 по отношению к клеткам ЙЬбЬ/АТСС (Ад+) и Ратоз (Ад·)

ЬиМУЭ-б-томаймицин-З.З ИА [Концентрация], М

|с_и,м НЬбО/АТСС* 7,2 10” Рато5^л >5 10·« Избирательность >694Х

Фиг. 20

Фиг. 21

- 59 019938

1η νίΐτο данные цитотоксичности Ьи2Н11 - 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден7-метокси-1,2,3,11 а-тетрагидропирропо(2,1 с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)бутирильного конъюгата из примера 13 по отношению к клеткам МОА-МВ-231 (Ад+), РС-3 (Ад+) и ЗК-МЕБ28 (Ад·) [Концентрация), М

МРА-МВ-231 клетки 5,4е-13М РС-3 клетки 1,2е-12 М 8К-МЕ1-28 клетки > 3,Ое-0 И

Фиг. 22

Ιη νίίΓΟ данные цитотоксичности КиМу9-6 - 3-(2-{2-[2-|3,5-бцсф(8)-2-эт-{Е)-илиден-7-метокси· 1,2,3,11а-тетрагидропир¹роло[2,1с][1₎4]б'ензодиазепин-5-он-8· илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильного конъюгата из примера 14 по отношению к клеткам ЮО/АТСС (Ад+) и Катоз (Ад-)

Цитотоксичность: МиМуЭ-б-томаймицин, 4,79 С/А

Клетки Яатос @ 2000 клеток/лунку, 5-дневное воздействие, разработанное для 4,5 часов, 1Ν8Τ;

Клетки НЬбО/АТСС @ 5000 клеток/лунку, 7-дневное воздействие, разработанное с И8Т для 2 часов κπβτκιι ]> 1.чГ>-амг {

Фиг. 23

- 60 019938

Ιη νϊίΓο данные цитотоксичности Ιιιι2Η11 · 3-(2-(2-(2-(3,5-6^[(3)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3₁11а-тетрагидропирроло{2,1с]{1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)эгокси]этокси}эхок₽и)пропионильного конъюгата из примера 15 по отношению к клеткам ΜϋΑ-ΜΒ-231 (Ад+), РС-3 (Ад+) и 8Κ-ΜΕΙ.-28 (Ад-)

Цитотоксичность: Ьи2Н11 -томаймицин

1.5-

-0,1 .....Ι_Ί--—τπτη ......... гт™,

10·” 10'” 10-*¹ 10^й* 10’’ Ю* [Концентрация], М

Фракция выживших клеток [Концентрация], М

Фиг. 3

- 50 019938

МС (масс-спектральный) анализ дегликозилированного антитела ЬиМу9-6 · 4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)илиден-7-метокси-1,2,3,11 а-тетрагидропирроло[2,1 с ][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)бутирильного конъюгата (отношение 2,1 лекарственное средство/антитело, определено посредством УФ) из примера 11

ОО 01 Ω2 Ω3

Фиг. 4

- 51 019938

МС-анализ дегликозилированного антитела ЬиМу9-6 - 3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е}· илидеН’7-метокси-1,2,3,11а-те'грагидропирроло[2,'1с][1,4]бензодиазепин5юн-8-илоксиметил|фенокси)этокси]этокси)этокси)пропионильного конъюгата (отношение 4,80 О/А, определено посредством УФ) из примера 14

Фиг. 7

- 52 019938

МС-анализ дегликозилированного антитела ήιι2Η11 З-^бг-^бЗ.Э-бисфЗ^г-эт-^-илиден-У-метокси-ЪгдПатетрагидропирроло[2,1с|[1,4]бензодиазепин-5-он-8· илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионильного конъюгата (отношение 4,08 О/А, определено посредством УФ) из примера 15 во ϋ1 02 03 04 05 06

Фиг. 8

- 53 019938

Связывание антитела киМу9-6 и конъюгата 11иМу9-6 - 16 РОЗ с антигеном СЭЗЗ из примера 18

Средняя интенсивность флуоресценции

Конъюгат/антитело ЕС 50 ΙιυΜΥθ-6-ΙβΡ08 6,631е-10 М ΙιοΜΥΜ антитело 3,073е-10 м

Данные

Фиг. 10

Катоа ИЗ РОВ

НЪбО/ОС Ι6Ρ08

Концентрация (М)

Н160/ОС (Ад+) и Катов (Ад·)

Конъюгат (нМ) НЪбО/ОС Катов МуЭ-б-ЮР-08 0,0029 11

Фиг. 11

- 54 019938

Фиг. 13 отношению к клеткам ΒΰΑΒ (Ад+),

ЕМАВ клетки Каптое клетки МОБТ-4 клетки

ΒϋΑΒ клетки < 7,6ε-13 М Ватоз клетки < 7,6е-13 М моьт-4 клетки > 5,0е-9 М

- 55 019938

Связывание антитела ЬиВ4 и конъюгата КиВ4- ЮР08 из примера 19

X

5025 (X к X

о. О □ Β4-ΙΟΡ08 • В4 Антитело

Ю+гл Ю'¹¹'⁵ Ю^{-10 0} Ю^{-9 6} Ю⁶·⁵ К)·⁷·⁵ 10·®·° 10“°·° [Концентрация], М

Конъюгат/антитело ЕС 50 НцВЯСРОа 7,779е-11 М ЬиВ4 антитело 4,538е-11 М

Фиг. 14

МС-анализ дегликозилированного антитела Ьи2Н11 - ЮР-13 (4,7 0/А посредством УФ) из примера 21

Дегликозилироваиное антитело 1ш2Н11 - Ι6Ρ13 (РЕ6 нерасщепляемая связь)

А1ех_111607_1_СТ_8ЕС„2Н111ΘΡ13_2 10 (7,274) ТОР М5 ЕЗ+

Л0 ϋ1 02 ОЗ

Фиг. 15

- 56 019938

Ιη νίίτο данные цитотоксичности 1ш2Н11 - ЮР-13 с увеличивающимися дозировками лекарственного средства по отношению к линиям клеток РС-3 (Ад+), ΜϋΑ-ΜΒ-231 (Ад+) и 8К-МЕ1-28 (Ад·)

11 и2Н11 - ΙΘΡ13 против клеток РС-3 (ЕрйА2*·),

ΜϋΑ-ΜΒ-231 (Ερίι А2+) & 8К-МЕ1-28 (Ер11А2-)

-*-МОА-МВ-231 (4,7 Ц/А)

10-13 _1влг 10-н <10-10 щ-о ю-о ₁₀-7 [Ки2Н11-ЮР13], М

Ю60 Конъюгат РС-3 МОА-МВ-231 !ЗК-МЕ1-23 1)ч2Н1ИвР13 {2.1 О/А) Ьи2Н11Ч6Р13(3.2ОГА) 1ш2Н114ОР13 (4,0 О/А) Ьи2Н11-16Р13{4,7О/А1 β,Οο-12 М 4,00-12 и 3,50-12 М 2,5е-12М бЛе-12 М 6Λ&Ί2М 4_т5е-12 М 2₊5е-12 М : 1,8е-8М | 1,8е-8М 1 5, Зе-9 М ί ЗЛе-9 М

Фиг. 16

Фиг. 17

- 57 019938

Ιη νίίτο данные цитотоксичности метилового эфира 4-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден· 7-метокси-1,2,3,11 а-тетрагидролирроло[2,1с][1,4]бензодиазелин-5-он-8· илоксиметил]пиридин-4-илокси)масляной кислоты из примера 6

Фиг. 18

Клетки МОА-М8-231, РС-3 & 8К-МЕЬ28 в клоногенном анализе при непрерывном воздействии лекарственных средств

Ιη νίΐΓΟ данные цитотоксичности метилового эфира Ν·[2·(3,5·6ηο·[(5)·2·3γ·(Ε)· илиден-7-метокси-1,2,3,11 а-тетрагидропирроло[2,1 с] [ 1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил1фенокси)этил]-М-метилсукцинамовой кислоты из примера 7

Клетки ΜϋΑ-ΜΒ-231, РС-3 & 8К-МЕ1.-28 в клоногенном анализе при непрерывном воздействии лекарственных средств

1. Соединение томаймицина формулы (I) где Я₁ и В₂ и В₁' и В₂' вместе образуют двойную связь, включающую группу =В и =В' соответственно, где В=В' - =СН₂ или =СН-СН₃;

A, А' являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из линейной незамещенной алкильной группы;

Υ, Υ' являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из группы О-алкил;

Т означает фенильную или пиридильную группу, замещенную одним или более нерасщепляемым линкером(ами), и необязательно замещен одной или более группами На1, СИ, ИВВ', СБ₃, В, ОК, 8ОВ или 8О2В;

B, В' являются равными или различными и независимо выбранными из групп Н, алкила, арила, каждая группа необязательно замещена На1, СИ, СООН, СООВ, СОИНВ, СОИВВ', ΝΒΒ', СБ₃, В, ОВ, ЗОВ, 8О₂В, арилом, Не!;

или его фармацевтически приемлемые соли, гидраты или гидратные соли, оптические изомеры, ра цематы, диастереомеры или энантиомеры указанного выше соединения; причем линкер имеет формулу

-С-Э-(2)рС(=О)-2'В, где С означает простую, двойную или тройную связь, -О-, -8- или -ИВ-;

Ό означает простую связь или -Е-, -Е-ИВ-Б-, -Е-О-, -Е-О-Б-, -Е-ИВ-СО-, -Е-СОИВ-, -Е-ИВ-СО-Б-, -Е-СО-ИВ-Б-, -Е-СО-, -СО-Е-, -Е-СО-Б, -Е-8-, -Е-8-Б-, -Е-ИВ-С8-, -Е-С8-ИВ-, -Е-ИВ-С8-Б-, -Е-С8-ИВ-Б-;

Е и Б являются одинаковыми или различными и независимо выбранными из линейных или разветвленных групп -(ОСН₂СН₂)₁-алкнл(ОСН₂СН₂)]-, -алкил(ОСН₂СН₂)₁-алкил-, -(ОСН₂СН₂),-, -(ОСН₂СН₂)₁циклоалкил(ОСН₂СН₂),-, -(ОСН₂СН₂)₁-гетероциклическая группа(ОСН₂СН₂),-, -(ОСН₂СН₂)₁-(ОСН₂СН₂)₁-гетероарил(ОСН₂СН₂),-, -алкил^СН^Н^-алкил^СН^НД,-,

-алкил(ОСН₂СН₂)₁-циклоалкил(ОСН₂СН₂)]-, -алкил(ОСН₂СН₂)₁-гетероциклическая -алкил^СН^Н^-арил^СН^НД,-, -алкил^СН^Н^-гетероарил^СН^Н^-,

-алкилциклоалкил-, -гетероциклическая группа-алкил-, -алкил-гетероциклическая арил(ОСН₂СН₂), -, -алкил(ОСН₂СН₂)₁-, группа(ОСН₂СН₂), -, -циклоалкилалкил-, группа-, -алкиларил-, -арилалкил-, -алкилгетероарил-, -гетероарилалкил-;

ΐ и идентичные или различные, являются целыми числами и независимо выбранными из 0, 1-2000;

р равно 0 или 1;

или линкер выбран из следующих групп:

- 43 019938

- (ск₁₃к₁₄)_с(ск₁₅к₁₆)_и(осн₂сн₂)_усог'к'',

- (СЕ₁₃Е₁₄)_с(ОСН₂СН₂)_уО(СЕ₁₅Е₁₆)_иСОг'В'

- (СК₁₃Кы)в (СК₁₇=СЕ₁₃) (СЕ₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСОг’К' ' ,

- (СЕ^ЕцЫИЕ^СО) (СЕ₁₅В_1в)_ц{ОСН₂СН₂)_уСОг'В'

- ( се₁₃е₁₄ ) (осо) ( се₁₅к₁₆ ) _и (осн₂сн₂) _усог^г к ,

- (СЕ_1ЭЕ₁₄}_Ь(СО) (СК₁₅К1б) и (ОСН₂СН₂) ,,.οοζ Έ ' ',

- (СКхзКы) Ь (С0МЕ19) (СЕ₁₅Е1_в) _и (ОСН₂СН_;) _ΥΟΟΖ ’ К ' ' ,

- (СЕ13Е14) £ - фенил - СО (СЕузЕуб) ,,ΟΟΖ * Е ^г ' ,

- ( се₁₃е₁₄ ) _е - фурил - со ( се₁₅е₁₆ ) _исог' в ,

- (СЕ1₃Е₁₄)-оксазолил-СО (СЕ1₅Е1₆) ,,ΟΟΖ ' К ' ' ,

- (СЕ13Е14) ^-тиазолил-СО (СЕ1₅Е1₆) _цСОг Έ ' ',

- (СЕ13Е14) с-тиенил-СО (СЕ₁₅Е₁₆)_иСОг‘Е- ’,

- (СЕ₁₃Е₁₄) (.-имидазолил-СО (СК₁₅Е₁₆) _иСОг ' Е ' ',

- ( СЕ1зК₁₄ ) с - пиперазино - СО (СЕ__ьЕ_1в) _иСОг Έ ' ',

- (СЕ13В14) с-фенил-ΟΟΟΖ Έ' ' ,

- (СЕ13Е14) с-фурил-ΟΟΟΖ Έ’ ', - (СЕ13Е14) с-оксазолил-ΟΟΟΖ ^ГК' ',

- (СЕ13Е14) ₆ - тиазолил -0ΟΟΖ' К ' ', - (СК13Е14) с-тиенил-ΟΟΟΖ ' К ' ',

- (СЕхзЕ^) _с-имидазолил-ζ)ΟΌΖ ' В.' ', - (СЕ₁₃Е₂₄) с-пиперазино

0ΟΟΖ' К ,

- (С=С) - (СЕ₁₃Е₁₄) (; (СЕ₁₅Е₁₆) _и (ОСН₂СН₂) _γΟΟΖ ' К ' ' ,

-о(се₁₃е₁₄) _ь (се₁₅Е1₆)_и(осн₂сн₂) _усог έ' -,

-О(СК₁₃Кх4) _Ь(]Ж₁₉СО) (СЕ₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСОг'Е' ', -О(СКхзЕ₁4)_(: (СЕ₁₇=СКхв) (СЕ₁₅Е₁₆}_и(ОСН₂СН₂)_уСОг'Е' -О-фенил-ОСОг'Е’ ', -о-фурил-осог'В'', -0-оксазолил осог'в'',

-О-тиазолил-ΟΟΟΖ Έ ’ ', -О-тиенил-ζ)ΟΟΖ ' В' ', -О-имидазолил-ОЗСОг'В'

-О-морфолино-ОСОЗ'В'', -О-пиперазино-ΟΟΟΖ'К'',

- ОСО- (СЕХЗЕХ4) (, ШК₁₉СО) (СЕ₁₅К₁₆) _и (ОСН₂СН₂) ,.,οοζ' В , -ОСО(СЕ₁₃Е₁4)_1;(СЕ₁₇=СВ₁з) (СВ₁₅Е1₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСОг'В'

-ОСОНК12 (СЕ₁₃Е₁₄) _ь (СЕ₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)уСОг ’ В , -ОСО-фенил-ОСОг'В’', -ОСО-фурилΌΟΟΖ'К'', -ОСО-оксазолил-ОСОг’В'’, -ОСО-тиаэолил-ΟΟΟΖ'В'', -ОСО-тиенил-ОСОг'В'',

-ОСО-имидазолил-ΟΟΟΖ'В'', -ОСО-пиперазино-ΟΟΟΖΈ'', или

- 44 019938

-со (се₁₃в₁₄) _с (ск₁₅В1б) и (осн₂сн₂) _усоз' к'',

-СО- (СЕ₁₃Е₁₄) _ь (СЕ₁₇=СЕ₁₈) (СК1₅К₁₆) _и (ОСН₂СН₂) _усог' В ’ ' ,

- οονε₁₂ (СЕ₁₃В₁₄) е ( се₁₅е₁₆ ) _и (осн₂сн₂) _ΥΟΟΖ'В ,

-СО-фенил-ΟΟΟΖΈ'', -СО-фурил-ОСОΖ’К'', -СО-оксаволилосог'к'',

-СО-тиазолил-ОСОг'В' ', - СО-тиенил-ΟΟΟΖ'Β' ',

- СО-имида золил ΌΟΟΖ’Н’', -СО-пиперазино-ΟΟΟΖ Ή’', -СО-пиперидино-ОСОг’Н'',

-ΝΕ₁₉ (СКпЕц) с (се₁₅е₁₆) _и (ОСН₂СН₂) _усог' В , -ИЕ₁₅СО(СЕ₁₃Е1₄) _е (СЕ₁₅Е1₆) _и (ОСН₂СН₂) ,.ΟΌΖ ’Н , -ΝΕ₁₉(ΟΕ₁₃Ει₄)_1;(ΟΕ₁₇=ΟΕ₁₈) (СЕ₁₅Е_1<;)_и(ОСН₂СН_г)_уСО2'К’ -МЕ₁₉СО (СК_гзН₁₄) _с ( СК₁₇=СЕ₁₈ ) (СЕ₁₅К_гб) _ц (ОСН₂СН₂) _усог' К , -νε₁₉οονε₁₂ ( ск₁₃е₁₄ ) е < се₁₅е₁₆ ) _и (осн₂сн₂) _усог' Е , -ЫЕ₁₉СОЫН₁₂{СК₁₃К₁₄)е(СК₁₇-СЕ₁₈) (СК₁₅Е₁₆) _и (ОСН₂СН₂} _уСОг ' К ' ' , -ΝΕ13ΟΟ-фенил-осог Ή^Γ', -иЕ1₉со-фурил-осог'в'', -Ж1₉СО-оксаэолил-0СО2 ' К' -ЫВ₁₉СО-тиазолил-ОСОг'В' ', -ΝΕ_ϊ9ΟΟ-тиенил-ΟΟΟΖ'В'-ЫЕ₁₉С0-имидазолил-0С0г’К' -ИЕ1₉СО-морфолино-ОСОгΈ'-ЫЕ1₉СО-пиперазино-0СОг'В' -МЕ1_ЭСО-пиперидино-ОСОг'К ' ',

-КК1₉-фенил-ОСОг'В' -ИЕ₁₉-фурил-0СОг'В' ' ,

-ЫКхз-оксазолил-ОСОг 'В' ', -ЫВ1₉-тиазолил-0СОг Έ’ ', -ЫВ1₉-тиенил-ОСОЗ'В’', -МВ₁₉-имидазолил-ОСОг'В’ ', -ИЕ₁₉-пиперазино-ОСОг'В'-ЫВ1₉-пиперидино-0СОг'В' -ΝΕ₁₉ΟΟ-ΝΚι₂-φΘΗΜη-0σθΖ' В' -МВ1₉СО-ПВ₁₂-оксазолил-ОСОг ' В' ',

- ΝΕ1₉ΟΟ-ΝΕ1₂-тиа золил - ΟΟΟΖ Έ' ’, -ΝΕ₁₉ΟΟ-ΝΚ₁₂-τηθη?γπ-0ΟΟΖ Ή' ' , -ЫВ1₉СО-ЫВ1₂-пиперидино-ОСОг 'К ’ ',

-3 (О)д(СК₁₃К₁₄)1 (СВ₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)уСОг’К’ ' , -8(О)д(СЕ₁₃В₁₄)_с(СК1^СЕ₁₈) (СК₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСОг’В' -3ΟΟνε₁₂ (се₁₃й₁₄) _е(ск₁₅к₁₆)_и(осн₂сн₂)усог'к'', -ЗСО-пипераэино-ОСОг'К'' и -ЗСО-пиперидино-ОСОг’К'', где О означает прямую связь или линейный алкил или разветвленный алкил, содержащий 1-10 атомов углерода, или полиэтиленгликолевую связывающую группу с 2-20 повторяющимися этиленоксидными звеньями;

К₁₉ и К₁₂ являются одинаковыми или различными группами и означают линейный алкил, разветвленный алкил или циклический алкил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, или арил или гетероциклическую группу, и К₁₂, кроме того, может означать Н;

К₁₃, К₁₄, К₁₅ и К₁₆ являются одинаковыми или различными группами и означают Н или линейный или разветвленный алкил, содержащий от 1 до 4 атомов углерода;

Κι; и Κι₈ означают Н или алкил;

с.| равно 0, 1 или 2;

ΐ означает целое число от 1 до 10 и также может быть равно 0;

С(=О)^'К представляет собой карбонил, содержащий функциональную группу, где

Ζ' представляет собой простую связь или -О-, -8-, -ΝΚ-;

К'' представляет собой Н, алкил, циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу, каждая группа необязательно замещена одним или более На1, ΟΝ, ΝΚΚ', СР₃, К, ОК, 8ОК, 8О₂К, арилом, Не1.

- 45 019938

(3-{2-[2-(2-{3-[3,5-бис-(7-метокси-2-метилен-5-оксо-2,3,5,11-тетрагидро-1Н-бензо[е]пирроло[1,2а][1,4]диазепин-8-илоксиметил)фенил]пропокси}этокси)этокси]этокси}этокси)пропановой кислоты;

а также их соответствующих Ν-гидроксисукцинимидильных сложных эфиров, или фармацевтически приемлемых солей, гидратов или гидратных солей, или их оптических изомеров, рацематов, диастереомеров или энантиомеров.

13. Соединение томаймицина, выбранное из группы о

- 47 019938 а также соответствующие ^-гидроксисукцинимидильные сложные эфиры, или его фармацевтически приемлемые соли, гидраты, или гидратные соли, или оптические изомеры, рацематы, диастереомеры, или энантиомеры указанного выше соединения.

14. Конъюгат, включающий одно или более соединение(й) томаймицина по любому из пп.1-13, ковалентно связанное с агентом, связывающимся с клеткой, посредством сшивающей группы линкера соединения томаймицина, где связывающийся с клеткой агент выбран из антител или фрагмента антитела, который содержит по меньшей мере один сайт связывания, лимфокинов, гормонов, факторов роста и молекул, переносящих биогенные вещества.

15. Конъюгат по п.14, где указанный выше связывающийся с клеткой агент выбран из моноклональных антител; химерных антител; гуманизированных антител; полностью человеческих антител; одноцепочечных антител; фрагментов антител, таких как ЕаЬ, ЕаЬ', Е(аЬ')₂Е_у; интерферонов; пептидов; лимфокинов, таких как 1Ь-2, 1Ь-3, ГБ-4, ГБ-6; гормонов, таких как инсулин, ΤΒΗ (гормон, освобождающий тиреотропин), Μ8Η (меланоцитстимулирующий гормон), стероидные гормоны, такие как андрогены и эстрогены; факторов роста и колониестимулирующих факторов, таких как ЕСЕ, ТСЕа, инсулиноподобный фактор роста (1СЕ-1, 1СЕ-11), С-С8Е, М-С8Е и СМ-С8Е; витаминов, таких как фолат и трансферрин.

16. Конъюгат по п.14 или 15, где связывающийся с клеткой агент и указанное выше соединение томаймицина связываются посредством амидной группы.

17. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.14-16 или соединение томаймицина по любому из пп.1-13 с фармацевтически приемлемым носителем.

18. Применение эффективного количества конъюгата по любому из пп.14-16 для получения лекарственного средства для лечения рака.

19. Применение эффективного количества соединения томаймицина по любому из пп.1-13 для получения лекарственного средства для лечения рака.

20. Способ получения конъюгата, включающий стадию, на которой соединение томаймицина по любому из пп.1-13, где линкер содержит концевую карбоксигруппу, которая необязательно активирована с образованием амидной группы, или ее предшественник, подвергают взаимодействию с агентом, связывающимся с клеткой, так, что соединение томаймицина и связывающийся с клеткой агент связываются посредством амидной связи.

21. Способ по п.20, где связывающийся с клеткой агент представляет собой антитело или моноклональное антитело.

22. Способ по п.21, где конъюгат очищают гель-фильтрационной хроматографией, адсорбционной хроматографией, ионообменной хроматографией, хроматографией с гидрофобным взаимодействием, аффинной хроматографией, ВЭЖХ, хроматографией на керамическом гидроксиапатите, диализом или диафильтрацией.

- 48 019938

- 49 019938

Кривые ίη νίίΓΟ эффективности соединений 8 (1СР08) и 9 (10Р08-ОМе) из примера 8, демонстрирующие более высокую эффективность сложного эфира 16Р08*ОМе, чем кислоты ЮР08 ¹·⁷’ Капю5 клетки

2. Соединение томаймицина по п.1, где С означает простую связь или -О-.

3. Соединение томаймицина по любому из предыдущих пунктов, где Ό означает простую связь, или -Е-, или -Е-О-.

4. Соединение томаймицина по любому из предыдущих пунктов, где Е является линейной или разветвленной группой -алкил- или -алк(ОСН₂СН₂)₁-.

5. Соединение томаймицина по любому из предыдущих пунктов, где Ζ является линейной или разветвленной группой -алкил-.

6. Соединение томаймицина по любому из предыдущих пунктов, где р равно 0.

7. Соединение томаймицина по любому из предыдущих пунктов, где Ζ' означает -О-.

8. Соединение томаймицина по любому из предыдущих пунктов, где Я'' означает Н, или линейную или разветвленную группу -алкил-, или необязательно замещенную гетероциклическую группу, или сук цинимидную группу ^о

9. Соединение томаймицина по любому из предыдущих пунктов, где -Ζ'Κ означает -ОН, -О-алкил о

-СГ или °

10. Соединение томаймицина по п.1, где указанный выше линкер выбран из

- (СЕ₁₃К₁₄)_Ь (СК₁₅К₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСОг'К' ' ;

- (СЕ₁₃Е₁₄) _ь(ОСН₂СН_г)_уО(СК1₅К1₆)_иСОг'К' ',

-О (СЕ₁₃Е₁₄) с (СК₁₅К₁₆) _и (ОСН₂СН₂ ) _уСО2 ' К ,

-О(СК₁₃Я₁₄)с(МК_15>СО) (СЕ₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСОг'Е' '

- (С=С) - (СЕ₁₃Е₁₄),:(СЕ₁₅Е₁₆)_и(ОСН₂СН₂)_уСО2'К' -ОССЕ^Е^сСОг'Е'

- (ОСН₂СН₂) уСОг'Е' ' ;

- (с=с) - ( ск₁₃е₁₄ ) +сог^г к ;

-О(СК₁₃Е₁₄)_с(МК₁₉СО) (СЕ₁₃Е_1е)_иСОг'К- ' ;

- (ск^к^мосНзСНДуСог'К''.

11. Соединение томаймицина по п. 1 формулы где фрагмент -С-Б-^)_р-С(=О)^'К определен в пп.1-10;

М представляет собой СН или Ν.

12. Соединение томаймицина, выбранное из группы, состоящей из

4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенокси)масляной кислоты;

4-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5он-8-илоксиметил]фенокси)уксусной кислоты;

3-(2-{2-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8илоксиметил]фенокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты;

- 46 019938

3- (2-{2-[2-(2,6-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11атетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин-5-он-8-илоксиметил]пиридин-4илокси)этокси]этокси}этокси)пропионовой кислоты;

Ы-[2-(3,5-бис-[(8)-2-эт-(Е)-илиден-7-метокси-1,2,3,11а-тетрагидропирроло[2,1с][1,4]бензодиазепин5-он-8-илоксиметил]фенокси)этил]-Ы-метилсукцинамовой кислоты;

3,7 О/А против клеток νϋΑ-ΜΒ-231, РС-3 & 8Κ-ΜΕΙ.-28 в клоногенном анализе при непрерывном воздействии лекарственных средств