ES2347205T3 - Composicion de cepas de lactobacilo y aplicacion de la composicion de cepas de lactobacilo. - Google Patents
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Abstract
Uso de una composición de las cepas de bacterias Lactobacillus, que incluyen tres cepas: Lactobacillus fermentum 57A depositada con el número B/00007, Lactobacillus plantarum 57B depositada con el número B/00008 y Lactobacillus gasseri 57C depositada con el número B/00009, que presentan la capacidad de coagregación y cuyas cantidades relativas se determinan por la proporción de 0,5:0,5:1, respectivamente, para la fabricación de un medicamento que puede administrarse por vía oral con afinidad diversificada por el epitelio del tracto digestivo y de la vagina, para la colonización de la vagina y el ano.
Description
Composición de cepas de lactobacilo y aplicación
de la composición de cepas de lactobacilo.
El objeto de la solicitud es la composición de
cepas de Lactobacillus en la producción de la preparación
farmacéutica.
La composición de la microflora vaginal es
diversa y depende de la etapa de la vida en la que está una mujer y
es estrictamente dependiente de la actividad hormonal del cuerpo.
Cruickshank y Sherman, quiénes describieron la microflora vaginal
del feto en el útero, de lactantes, niñas antes de la pubertad, y
mujeres en edad de procrear y tras la menopausia, presentaron
conocimientos básicos del ecosistema vaginal. En el útero, la vagina
fetal es estéril, sin embargo, 2-3 semanas tras el
nacimiento, la composición cuantitativa de la microflora es casi la
misma que la composición cuantitativa de la microflora de la vagina
de una mujer adulta, lo que es la consecuencia de la estimulación de
estrógenos por parte de la madre. Antes de la aparición de la
primera menstruación, el entorno vaginal está dominado por bacterias
tales como S. epidermidis, Bacteroides spp., Peptococcus spp.,
Porphyromonas spp., G. vaginalis. Durante el periodo
reproductivo, el entorno vaginal está dominado en su mayoría por la
población bacteriana del género Lactobacillus. En el pasado,
se creía que este género estaba representado por una única cepa, es
decir Lactobacillus acidophilus. Durante la última
década, el desarrollo de métodos moleculares modernos permitió
organizar la clasificación de la mayoría de las bacterias, lo que
demostró que la especie Lactobacillus acidophilus no
es homogénea y es parte de un complejo de algunas otras especies
tales como L. crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum, L.
acidophilus sensu stricto, L. gasseri, L. johnsoni. Osando
métodos moleculares modernos, especialmente la técnica de
secuenciación de ADN, así como procedimientos de cultivo modificados
se demostró que las especies más comunes encontradas en el entorno
vaginal natural de mujeres sanas son algunas diversas especies, que
son parte del complejo de acidophilus tales como L.
johnsoni, L. gasseri, L. acidophilus, L. crispatus, y sobre todo
L. plantarum y
L. fermentum.
L. fermentum.
Los mecanismos mediante los cuales las bacterias
del género Lactobacillus afectan al entorno vaginal todavía
no se entienden completamente. Sin embargo, se conoce ampliamente
que:
- \bullet
- sintetizan sustancias antimicrobianas, tales como ácidos láctico, acético, piroglutámico, con el fin de disminuir el pH del entorno vaginal para obtener los valores de 3,7-4,6,
- \bullet
- sintetizan proteínas y/o péptidos cortos con una estructura muy compleja, que se parecen a bacteriocinas, que se adhieren a los receptores en la superficie de bacterias susceptibles conduciendo a su lisis y finalmente su muerte,
- \bullet
- compiten con otros microorganismos, especialmente patógenos, por las sustancias nutritivas y por los receptores epiteliales de la vagina,
- \bullet
- modifican toxinas y receptores de toxinas,
- \bullet
- producen peróxido de hidrógeno, algunas cepas de Lactobacillus, que producen H_{2}O_{2}, dominan la población de microbios de la vagina sana,
- \bullet
- ejercen diferentes efectos inmunomoduladores sobre el sistema inmunológico del huésped.
\vskip1.000000\baselineskip
Debido a estas muchas propiedades diferentes,
las bacterias del género Lactobacillus pueden mantener un
determinado estado biológico de equilibrio de la vagina, evitando el
numeroso crecimiento de poblaciones de microorganismos patógenos que
residen en el tracto genital de la mujer, lo que también disminuye
el riesgo de aparición de vaginosis bacteriana.
Debido al hecho de que la mayoría de las
infecciones del tracto genitourinario en mujeres están provocadas
por el desequilibrio de la microflora vaginal, las formas de
prevención así como el tratamiento están dirigidos hacia el
reestablecimiento del equilibrio microbiano correcto.
En 1992, se llevó a cabo un experimento en los
Estados Unidos (Hilton E, Isenberg HD, Alperstein P, France K,
Borenstein MT. Ingésting of yogurt containing Lactobacillus
acidophilus as prophylaxis for candidal vaginitis. Ann Item.
Med 1992; 116: 353-357), que implicaba un consumo de
yogur que contenia Lactobacillus acidophilus
diariamente durante 6 meses por 35 mujeres con candidiasis
recurrente de vulva y vagina con el fin de prevenir la enfermedad
recurrente. El criterio de valoración del experimento era la
colonización de la vagina y el ano por Candida y
Lactobacillus así como la candidiasis. Trece pacientes
terminaron el experimento, sin embargo, el análisis se realizó para
33 de ellas. Durante el periodo de 6 meses, se encontró una
disminución relevante en el número de infecciones provocadas por
Candida en personas que tenían colonización (ano y vagina)
por Candida. Se realizó un experimento con el uso de un yogur
regular que contenía L. acidophilus, que producía una
cantidad moderada de H_{2}O_{2}. No se identificaron las cepas
de L. acidophilus aisladas a partir de las mujeres. Sin
embargo, se observó una relación estrecha entre la presencia de
L. acidophilus en el ano y la vagina: si L.
acidophilus estaba ausente en el ano, la probabilidad de su
presencia en la vagina era del 15,5%, por otro lado, si estaba
presente en el ano, la probabilidad de su presencia en la vagina era
del 54,8% (P < 0,001). Los autores concluyeron que la cepa
intestinal de L. acidophilus estaba colonizando la vagina,
sin embargo, debido a la falta de evidencia molecular, era imposible
de demostrar.
Se realizó un experimento similar en 1996 en
Israel (Shalev E, Battino S, Weiner E, Colodner R, Keness Y.
Ingestión of yogurt containing Lactobacillus
acidophilus compared with pasteurized yogurt as prophylaxis
for recurrent candidal vaginitis and bacterial vaginosis. Arch Fam
Med 1996; 5: 593-596) basándose en el mismo
protocolo y con el uso de yogur que contenía L. acidophilus
que producía H_{2}O_{2}. Los datos obtenidos en este experimento
no mostraron una actividad profiláctica sobre la blastomicosis
vaginal recurrente (el yogur que contenia bacterias muertas mostró
el mismo efecto), sin embargo, mostró un efecto sobre la vaginosis
bacteriana, al mismo tiempo que aumentaba el número de mujeres con
colonización por L. acidophilus. Además, se observó una
colonización coexistente del ano y la vagina por Candida.
En 2001, se llevó a cabo un experimento
aleatorizado abierto en Finlandia (Kontiokari T, Sundqvist K,
Nuutinen M, Pokka T, Koskela M, Uhari M. Randomized trial of
cranberry-lingonberry juice and Lactobacillus
GG drink for the prevention of urinary tract infections in
women. Brit Med J 2001; 322: 1571-1573) sobre la
posibilidad de prevenir infecciones recurrentes del tracto urinario
en mujeres con el uso de zumo de arándano agrio y arándano rojo o
bebida de Lactobacillus GG. El experimento duró 12 meses e
implicó la observación de infecciones recurrentes en 150 mujeres
divididas en 3 grupos, a quienes se les diagnosticó previamente una
infección del tracto urinario (>10^{5} bacterias/mi de orina).
El parámetro final del experimento era la observación de una
infección recurrente. En comparación con el zumo de arándano
agrio/arándano rojo, no se observó un efecto positivo de
Lactobacillus GG. La causa de esto puede ser que
Lactobacillus GG, al ser una cepa intestinal tipica, no
coloniza el orificio de la uretra/vagina.
En 2003, se llevó a cabo un experimento clínico
aleatorizado con el uso de placebo (Reid G, Charbonneau D, Erb J,
Kochanowski B, Beuerman D, Poehner R, Bruce AW. Oral use of
Lactobacillus rhamnosus GR-1 and L.
fermentum RC-14 significantly alters flora
vaginal: randomized, placebo-controlled trial in 64
healthy women. FEMS Immunol Med Microbiol 2003; 35:
131-134) con el fin de verificar el efecto de
Lactobacillus rhamnosus GR-1 y L.
fermentum RC-14 administrados por vía oral
durante 60 días sobre la flora vaginal de 64 mujeres sanas. El
análisis microscópico mostró que el 37% de las mujeres examinadas
volvían a su flora normal en comparación con el 13% de las mujeres
del grupo control. El cultivo mostró un aumento relevante en el
número de Lactobacillus, y una disminución en el número de
levaduras y bacilos intestinales. El producto probiótico se
consideró seguro en la administración diaria.
En 2004, los mismos autores llevaron a cabo otro
experimento en el que se administraron las mismas cepas (Reid G,
Burton J, Hammond JA, Bruce AW. Nucleic acid-based
diagnosis of bacterial vaginosis and improved management using
probiotic lactobacilli. J Med Food 2004; 7: 223-228)
a 59 mujeres con vaginosis bacteriana no sintomática diagnosticada
con la ayuda de DGGE. Tras 2 meses de administración de producto
probiótico, se demostró el reestablecimiento de la flora microbiana
de la vagina, dominada por Lactobacillus.
La migración (colonización cruzada) de bacterias
desde el ano hacia la vagina también implica patógenos tales como:
Streptococcus agalactiae, cepas uropatógenas de
Escherichia coli o Staphylococcus aureus. En un
artículo publicado recientemente (Warner JE, Onderdonk AB. Diversity
of toxic shock syndrome toxin I-positive
Staphylococcus aureus isolates. Appl Environ Microbiol 2004;
70: 6931-6935) se demostró, con el uso del método de
PFGE, que las mismas cepas de S. aureus están presentes en
ambos lugares en el 59% de las mujeres examinadas.
Debe observarse que existe una falta de pruebas
en la bibliografía para la migración o colonización cruzada del ano
y la vagina por las mismas cepas de Lactobacillus. Esto puede
deberse al hecho de que en el pasado, no se conocían los métodos de
tipificación molecular adecuados. Adicionalmente, la administración
de las cepas de Lactobacillus con productos lácteos no es
posible en todos los pacientes debido a motivos dietéticos. Las
cepas de Lactobacillus descritas, administradas por vía oral,
mostraban una supervivencia inadecuada en el tracto digestivo y
requerían la protección de cápsulas especiales. Por otra parte, las
cepas de Lactobacillus que pueden sobrevivir no se unen bien
al epitelio vaginal (por ejemplo Lactobacillus rhamnosus GC;
(Colodner R.). Además, la adherencia de lactobacilos de fuentes
lácteas no es suficiente (Overman BA, "J. Nurse Midwifery"). La
única composición conocida que es adecuada para la administración
oral y presenta eficacia suficiente en la colonización del epitelio
vaginal se dio a conocer en el documento US 6.479.051.
Se conoce a partir de la descripción de la
patente polaca n.º 189577, el uso del emparejamiento entre bacterias
de ácido láctico de la especie Lactobacillus brevis y
Lactobacillus salivarius subespecie salicinius para la
producción de una composición farmacéutica usada para su
administración vaginal con el fin de tratar la vaginosis y las
infecciones vaginales. La descripción de la patente mencionada
también revela la composición farmacéutica que contiene las
bacterias de ácido láctico emparejadas de la especie
Lactobacillus brevis y Lactobacillus salivarius
subespecie salicinius. Basándose en los datos obtenidos
(Strus M., The basics in using probiotics administered into the
vagina during the infections of genitourinary tract. Infections,
2005, 4, 40-43) se concluye que la microflora
vaginal de mujeres sanas está compuesta principalmente por unos
pocos géneros de Lactobacillus. Se demostró que con la mayor
frecuencia las cepas aisladas eran las cepas del complejo de L.
acidophilus, así como las cepas: L. fermentum y L.
plantarum. Las cepas usadas, basándose en la descripción de la
patente n.º 189577, no eran características para la población de
mujeres polacas. Adicionalmente, la forma de administración
(vaginal) es incómoda para su uso diario.
Strus M, infectious diseases in obstetrics and
gynecology, 2005, volumen 13, n.º 2 da a conocer otros lactobacilos
vaginales con propiedades probióticas.
Existen cepas nuevas conocidas a partir de la
descripción de la patente polaca n.º P-373518:
Lactobacillus fermentum 57A depositada con el número
B/00007, Lactobacillus plantarum 57B depositada con el
número B/00008, Lactobacillus gasseri 57C depositada
con el número B/00009, Lactobacillus plantarum 78B
depositada con el número B/00010.
El objeto de la invención es el uso de la
composición según la reivindicación 1.
Las cepas mencionadas anteriormente se
obtuvieron a partir de la cavidad vaginal posterior de una mujer
sana que tenia una flora vaginal normal. Las pruebas realizadas
mostraron que las cepas Lactobacillus plantarum 57B,
Lactobacillus fermentum 57A, Lactobacillus
gasseri 57C cumplen con todos los requisitos establecidos
para los productos probióticos. Basándose en las pruebas realizadas
puede concluirse que las cepas nuevas son más favorables en
comparación con las otras cepas sometidas a prueba. Además, cada una
de cepas depositadas y seleccionadas posee una fuerte característica
principal. La cepa Lactobacillus plantarum 57B es
característica para características antagonistas fuertes
especialmente para patógenos tales como: Gardnerella
vaginalis y Escherichia coli, Lactobacillus
fermentum 57A se adhiere muy bien al epitelio del huésped y
Lactobacillus gasseri 57C produce grandes cantidades
de peróxido de hidrógeno.
El propósito de la invención es el desarrollo de
una composición de cepas del género Lactobacillus que puede
usarse para reestablecer eficazmente la flora bacteriana apropiada
de la vagina administrándola de la forma más cómoda.
La esencia de la solicitud es el uso de la
composición que contiene las cepas Lactobacillus
fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B y
Lactobacillus gasseri 57C, que posee características
especiales que muestran una naturaleza fuertemente diversificada en
el campo de la afinidad por el epitelio del tracto digestivo y de la
vagina que permite la colonización de la vagina y el ano tras la
migración a través de los intestinos, y las características de
coagregación que permiten un efecto sinérgico de cada componente. La
composición puede unirse con cualquier sustancia complementaria y/o
portador farmacéuticamente compatible. La composición se administra
por vía oral, en forma de una cápsula.
La aplicación de una composición de cepas nuevas
del género Lactobacillus, que contiene Lactobacillus
fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B y
Lactobacillus gasseri 57C de características
especiales tales como: afinidad diversificada por los epitelios del
tracto digestivo y de la vagina que permite la colonización del
orificio del ano y la vagina tras atravesar los intestinos, y su
capacidad de coagregación que permite una acción sinérgica, para la
producción de una preparación farmacéutica para su administración
oral con el fin de reestablecer la flora bacteriana natural de la
vagina y el ano.
La aplicación de la composición consiste en la
preparación de una parte de la preparación farmacéutica compuesta
por cepas liofilizadas de bacterias Lactobacillus
fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B y
Lactobacillus gasseri 57C y sustancias complementarias
y/o un portador farmacéuticamente compatible, encerrados en una
cápsula.
Sorprendentemente, se encontró que la
composición de cepas del género Lactobacillus posee una
capacidad única de colonizar simultáneamente la vagina y el ano. Las
cepas usadas del género Lactobacillus no se ven influenciadas
por las condiciones típicas del tracto digestivo, por tanto, la
composición está predestinada para su administración oral.
Sorprendentemente, se concluyó que las cepas del
género Lactobacillus de la composición poseen una
característica única de coagregación mutua.
La cepa Lactobacillus fermentum
57A tiene una muy buena afinidad por el epitelio intestinal y posee
la capacidad de adherirse a ese epitelio, y por tanto, puede crear
condiciones para su colonización. Puesto que la cepa
Lactobacillus gasseri 57C tiene una muy buena afinidad
por el epitelio de la vagina y no posee una fuerte tan afinidad por
el epitelio intestinal, no podría colonizar tal superficie por si
misma. El fenómeno de coagregación con otras cepas también permite,
indirectamente, que se participe en la colonización del epitelio
intestinal, y por tanto, el ano. De esta manera, numerosas
poblaciones de Lactobacillus gasseri surgen en el
tracto digestivo, que tienen una mayor posibilidad de cruzar al
epitelio vaginal, que es un hábitat natural para este género, y por
el que muestran un alto grado de afinidad. Por tanto, tal
entrecruzamiento facilitado por Lactobacillus gasseri
57C y las otras dos cepas al ecosistema vaginal debido a la
coagregación provoca una rápida colonización del epitelio
vaginal.
Se demostró la supervivencia de las cepas de
Lactobacillus a pH bajo basándose el método de Lankaputra y
Shah modificado (1995). Se hicieron crecer los Lactobacillus
fermentum 57A, Lactobacillus plantarum 57B y
Lactobacillus gasseri 57C estudiados en medio MRS
liquido. Se hizo crecer el cultivo en condiciones anaerobias a 37ºC
durante 24 horas. Tras ese tiempo, usando el método de diluciones
múltiples, se determinó la densidad de cada una de las cepas. A
continuación, con el uso de HCl 1 N, se disminuyó el pH del medio de
cultivo hasta el valor de 1,2, que es igual al pH del jugo gástrico.
Además, se incubaron los cultivos durante 20 minutos en condiciones
anaerobias a 37ºC, y entonces se inocularon con el fin de determinar
el grado de reducción en poblaciones bacterianas estudiadas debido a
las condiciones de pH bajo. Se muestran los resultados en la tabla
1.
Se demostró la supervivencia de las cepas de
Lactobacillus en jugo gástrico artificial basándose en el
método de Pederson y et al. modificado (2004). Se hicieron
crecer las cepas estudiadas de Lactobacillus fermentum
57A, Lactobacillus plantarum 57B y
Lactobacillus gasseri 57C en medio MRS líquido. Se
llevó a cabo el cultivo en condiciones anaerobias a 37ºC durante 24
horas. A continuación, se transfirieron 100 \mul de cada cultivo
de cepa con la densidad de aproximadamente
10^{8}-10^{9} u.f.c./1 ml a 10 ml del jugo
gástrico artificial (7 ml de HCl al 36%, 3,6 g de pepsina [Difco], 2
g de NaCl por 1 l de agua destilada) con el pH de 2,5 establecido
con el uso de HCl 1 N. Se determinó la densidad inicial de cada una
de las cepas bacterianas aplicando el método de dilución en serie. A
continuación, se incubaron los cultivos durante 20 minutos en
condiciones anaerobias a 37ºC tras lo cual se inocularon las cepas
en diluciones consecutivas con el fin de determinar el grado de
reducción de las poblaciones bacterianas sometidas a prueba debido a
la naturaleza del jugo gástrico artificial. Se muestran los
resultados en la tabla 2.
Para determinar la resistencia de las cepas de
Lactobacillus sometidas a prueba en sales biliares, se usó el
método de Dashkiewicz y Feighner (1989). Este método emplea la
adición del colorante indicativo carmesí de bromocresol [POCH] en la
cantidad de 0,17 g/l así como sales biliares [OXGAL de la empresa
Difco] en las siguientes concentraciones: 1 g/l, 2 g/l, 5 g/l, 10
g/l, 20 g/l. Entonces se usó medio MRS permanente/base preparado de
esta manera para inocular 10 \mul de cultivos de cepas de
Lactobacillus líquidos preparados previamente usando el
método de reducción, que entonces se incubaron en condiciones
anaerobias convencionales durante 48 horas. Cuando se completó la
incubación, las colonias de las cepas resistentes a la concentración
dada de sales biliares viraron a amarillo claro así como su medio de
crecimiento viró desde el color violeta hacia el amarillo. Se
midieron la intensidad del crecimiento de las cepas sometidas a
prueba y la coloración amarilla de los medios usando la escala
semicuantitativa desde - hasta +++.
Se muestran los resultados en la tabla 3.
Se llevó a cabo el cultivo tisular de la linea
CaCo2 usando el método de pases múltiples durante el periodo de 20
días con el fin de obtener una monocapa. El medio usado era un medio
DMEM (medio esencial minimo de Dulbecco) (Gibco) con una adición del
10% de suero bovino fetal inactivado. Adicionalmente, el medio
contenía 3 mM/ml de L-glutamina y antibióticos:
estreptomicina 100 \mug/ml^{-1} y penicilina 100 U/ml^{-1} .
Se llevaron a cabo los cultivos a la temperatura de 37ºC en
atmósfera de humedad aumentada que contenía un 10% de CO_{2}, en
la que se cambió el medio dos veces por semana.
Se cultivaron las cepas de Lactobacillus
sometidas a prueba (individualmente y después en una forma mixta)
durante 48 h en 5 ml de caldo MRS en una incubadora, a 37ºC, en
condiciones anaerobias, y entonces se centrifugaron en su conjunto
(2.000 rpm durante 10 min.). Entonces se desechó el sobrenadante y
se añadió a las bacterias, que estaban depositadas en el fondo del
tubo de ensayo, caldo MRS reciente con un volumen de 1 ml y se
verificó la densidad usando diluciones decimales proporcionando el
valor final en unidades de u.f.c./ml. La densidad inicial para la
cepa 57A era de 8x10^{7}, para la cepa 57B era de 2,5x10^{8},
para 57C era de 8x10^{7}, y para la mezcla era de 2x10^{9}.
A continuación, se tomaron 100 \mul de cada
una de las suspensiones de cepas bacterianas sometidas a prueba y se
añadieron a 900 \mul del medio de cultivo tisular DMEM. Entonces
se añadieron las mezclas preparadas de esta manera a los pocilios
que contenían células de la línea celular CaCo2. Se incubaron las
células de la línea tisular con las cepas sometidas a prueba a 37ºC
en atmósfera enriquecida con un 10% de CO_{2} durante 30 minutos.
Tras la incubación, se lavaron las células dos veces con PBS para
eliminar las bacterias que no estaban unidas, y entonces se fijaron
con formaldehído al 3,7% a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras
la fijación, se lavaron las células de nuevo con PBS y se tiñeron
con cristal violeta durante 3 minutos. Se observó la muestra con
microscopio a una magnitud de 1000x. Se contaron las células de
Lactobacillus y Bifidobacterium en 20 zonas visuales
de la muestra y se obtuvieron los valores promedio a partir de las
20 zonas. La interpretación de los datos se basó en la siguiente
leyenda:
La leyenda referente a la descripción del grado
de adherencia de las bacterias sometidas a prueba del género
Lactobacillus al epitelio
intestinal-CaCo2.
Las cepas sometidas a prueba L. fermentum
57A, L. plantarum 57B, L. gasseri 57C mostraron una
gran resistencia tanto para el pH bajo (igual al valor de pH
presente en el jugo gástrico) así como para el jugo gástrico
artificial que contenía pepsina, la enzima que se encuentra en el
jugo gástrico.
En el caso de la resistencia a sales biliares,
las cepas L. fermentum 57A, L. plantarum 57B muestran
una resistencia alta, similar para las sales biliares, al contrario
que L. gasseri 57C, que pierde su viabilidad a una
concentración de sales biliares de 2 g/l. Analizando los datos
anteriores, puede predecirse que las cepas L. fermentum 57A,
L. plantarum 57B, L. gasseri 57C sin ninguna pérdida
sustancial en el número de poblaciones pueden sobrevivir a las
condiciones desfavorables presentes en el estómago humano. En el
caso de la influencia de las sales biliares, las cepas L.
fermentum 57A, L. plantarum 57B tampoco deben cambiar de
manera significativa sus poblaciones, mientras que sólo la cepa
L. gasseri 57C, que tiene una mayor viabilidad para las sales
biliares, puede disminuir su número de poblaciones en unos pocos
logaritmos. El análisis anterior proporciona evidencia de la
posibilidad de usar las cepas L. fermentum 57A, L.
plantarum 57B, L. gasseri 57C administradas por vía oral,
para la colonización de la vagina y el ano. Las cepas sometidas a
prueba L. fermentum 57A, L. plantarum 57B, L.
gasseri 57C mostraron una adherencia muy diversificada a la
linea celular intestinal CaCo2. Parece que sólo la cepa L.
fermentum 57A tiene una posibilidad de adherirse al epitelio
intestinal humano, mientras que las otras dos cepas no muestran este
tipo de capacidad. Basándose en estos datos, puede predecirse que la
densidad de Lactobacillus en el punto final del intestino
grueso en comparación con la densidad administrada en forma de
preparación oral puede experimentar una pequeña disminución no sólo
debido a la naturaleza del jugo gástrico sino también como resultado
de las buenas propiedades de adherencia de la cepa L.
fermentum 57A.
Las cepas de Lactobacillus aisladas
tienen una capacidad única de coagregación mutua gracias a lo cual
pueden encontrarse en una combinación natural (coagregado) como una
mezcla de 2 ó 3 cepas concentradas juntas debido a las interacciones
de superficie. Este tipo de afinidad entre cepas seleccionadas de
manera natural que colonizan el mismo nicho ecológico conduce a la
actuación conjunta en la adquisición de receptores en la superficie
epitelial, la acción antagónica frente a otros, principalmente
frente a componentes patógenos de la microflora y para una mejor
utilización de las fuentes de energía disponibles. Se visualizó el
fenómeno de coagregación en un ejemplo, en el que:
La figura 1 muestra la coagregación de cepas que
componen la composición. Fotografía macroscópica de una colonia que
muestra la presencia de dos componentes morfológicamente diferentes
de una única colonia (a la izquierda L. fermentum, a la
derecha L. plantarum).
La figura 2 representa la imagen de bandas
separadas electroforéticamente tras la reacción de PCR (ADN aislado
de un coagregado), en la que se usó un iniciador específico para el
género L. plantarum, que confirma la presencia de L.
plantarum 57B en el coagregado mostrado en la figura 1.
La figura 3 representa la imagen de bandas
separadas electroforéticamente tras la reacción de PCR (ADN aislado
de un coagregado), en la que se usó un iniciador especifico para el
género L. fermentum, que confirma la presencia de la cepa
L. fermentum 57A en el coagregado mostrado en la figura
1.
La composición de las cepas de
Lactobacillus tiene una capacidad única de colonizar tanto el
tracto digestivo así como la vagina, lo que es una consecuencia de
la diversidad y la acción conjunta de cada uno de sus componentes
individuales. Puede observarse basándose en el examen de la
capacidad de colonizar el ano y la vagina in vivo durante los
ensayos clínicos que los dos componentes de la composición
(Lactobacillus fermentum 57A y Lactobacillus
plantarum 57B) tras la administración oral están presentes en
un mayor número en la superficie epitelial anal, mientras que el
otro (Lactobacillus gasseri 57C) está presente, en un
mayor número, en el epitelio vaginal.
La figura 4 representa una imagen macroscópica
que muestra colonias morfológicamente diversificadas que representan
poblaciones de Lactobacillus que colonizan el epitelio anal
(imagen de la izquierda, dominio por L. plantarum 57B) y la
vagina (imagen de la derecha, dominio por L. gasseri 57C) .
Se tomó la muestra de una mujer que estuvo tomando la composición de
cepas de Lactobacillus durante 21 días. Puede observarse la
afinidad diversificada de las cepas de Lactobacillus en ambos
lugares en forma de diferencias en los números de colonias
individuales.
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Ejemplo I de
realización
Se llevó a cabo el ensayo clínico para un grupo
de 18 mujeres sanas sin ningún síntoma clínico de infecciones del
tracto genital, sin embargo, con infecciones vaginales recurrentes.
Las pruebas mostraron que la administración oral de la composición
de cepas de Lactobacillus según la invención daba como
resultado:
- 1.
- disminución del pH vaginal en 0,4,
- 2.
- disminución del indicador de la escala de Nugent en 2 unidades,
- 3.
- aumento del número de cepas de Lactobacillus en el epitelio vaginal en 2 logaritmos (logaritmo de u.f.c./ml).
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Ejemplo II de
realización
Una cápsula de la preparación farmacéutica
contiene:
- \bullet
- principio activo - 10^{9} de cepas liofilizadas de Lactobacillus en las siguientes proporciones: un 50% de Lactobacillus gasseri 57C, un 25% de Lactobacillus fermentum 57A, un 25% de Lactobacillus plantarum 57B,
- \bullet
- sustancias adicionales: lactosa, manitol, nitrógeno glutamina, estearato de magnesio.
\vskip1.000000\baselineskip
La preparación se administra por vía oral,
1-2 cápsulas al día con agua.
La preparación farmacéutica se usa como
complemento para reestablecer y/o complementar la flora bacteriana
natural del tracto genitourinario así como ayudar a mantener el pH
vaginal apropiado.
Claims (4)
1. Uso de una composición de las cepas de
bacterias Lactobacillus, que incluyen tres cepas:
Lactobacillus fermentum 57A depositada con el número
B/00007, Lactobacillus plantarum 57B depositada con el
número B/00008 y Lactobacillus gasseri 57C depositada
con el número B/00009, que presentan la capacidad de coagregación y
cuyas cantidades relativas se determinan por la proporción de
0,5:0,5:1, respectivamente, para la fabricación de un medicamento
que puede administrarse por vía oral con afinidad diversificada por
el epitelio del tracto digestivo y de la vagina, para la
colonización de la vagina y el ano.
2. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la composición de las cepas del género
Lactobacillus se combina con un portador farmacéuticamente
compatible.
3. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque la composición de las cepas del género
Lactobacillus se prepara en forma de una cápsula.
4. Uso según la reivindicación 1,
caracterizado porque a la composición de las cepas del género
Lactobacillus se le añade lactosa, manitol, estearato de
magnesio.
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