ES2339953T3 - Glicoformas ligadas a o de factor vii y metodo de produccion de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr, donde la preparación contiene un modelo de glicosilación ligado a serina/treonina que es uniforme al menos en un 80%.
Description
Glicoformas ligadas a O de factor VII y método
de producción de la misma.
La presente invención se refiere a las
composiciones que comprenden polipéptidos del factor VII que tienen
patrones alterados de la glicosilación ligada a O.
La actividad biológica de muchas glicoproteínas
depende en gran medida de la presencia o ausencia de estructuras
particulares de oligosacáridos fijadas a la glicoproteína. El modelo
de glicosilación de una glicoproteína terapéutica puede afectar a
numerosos aspectos de la eficacia terapéutica, tal como, p. ej,
solubilidad, resistencia al ataque proteolítico, inactivación
térmica, inmunogenicidad, vida media, bioactividad,
biodisponibilidad, y estabilidad.
La glicosilación es una modificación compleja
post-transicional que es dependiente de las células.
Después de la traducción, las proteínas se transportan al retículo
endoplásmico (ER), se glicosilan y se envían al Golgi para el
procesamiento adicional y el objetivo posterior y/o la secreción.
Durante la glicosilación, se forman bien las glicoproteínas ligadas
a N o las ligadas a O.
Las proteínas del suero implicadas en la
coagulación o la fibrinólisis, incluyendo, p. ej., el factor VII y
el factor IX están demostrando ser útiles para los agentes
terapéuticos para tratar una variedad de condiciones patológicas.
Por consiguiente, existe una creciente necesidad de formulaciones
que comprenden estas proteínas que son farmacéuticamente aceptables
y muestran una eficacia clínica uniforme y predeterminada.
Debido a las muchas desventajas de utilizar
plasma humano como una fuente de productos farmacéuticos, se
prefiere producir estas proteínas en sistemas recombinantes. Las
proteínas coagulantes, no obstante, están sujetas a una variedad de
modificaciones co- y postraduccionales, incluyendo, p. ej., la
glicosilación ligada a asparagina (ligada a N); la glicosilación
ligada a serina o treonina (ligada a O); y la
\gamma-carboxilación de residuos de glu. Estas
modificaciones pueden ser cualitativamente o cuantitativamente
diferentes cuando se utiliza células heterólogas como huéspedes para
la producción a gran escala de proteínas. En particular, la
producción en células heterólogas frecuentemente resulta en un
conjunto diferente de glicoformas, cuyos polipéptidos idénticos
tienen estructuras de oligosacáridos diferentes ligadas de manera
covalente.
En diferentes sistemas, las variaciones en la
estructura del oligosacárido de proteínas terapéuticas han estado
ligadas a, entre otras cosas, cambios en la inmunogenicidad y en el
espacio in vivo. Así, hay una necesidad en la técnica de
composiciones y métodos que proporcionan preparaciones que
comprenden el factor VII humano recombinante o el factor VII
modificado o polipéptidos relacionados con el factor VII que
contienen patrones de glicoformas predeterminados.
La presente invención se refiere a preparaciones
que comprenden polipéptidos del factor VII que exhiben patrones
glicoformes predeterminados ligados a serina o a treonina. Las
preparaciones son al menos aproximadamente el 80% homogéneas con
respecto a los glicanos o cadenas de oligosacáridos adjuntos,
preferiblemente al menos aproximadamente el 90%, al menos
aproximadamente el 95%, o al menos aproximadamente el 98%
homologas.
Como se utiliza en este caso, un modelo de
glicoforma se refiere a la distribución dentro de la preparación de
cadenas de oligosacáridos que tienen estructuras variables que están
ligadas covalentemente a un residuo de serina o de treonina
localizado en un dominio de tipo EGF en el esqueleto de adición de
amino del polipéptido.
En un aspecto, la invención proporciona una
preparación de un polipéptido del factor VII que contiene un motivo
Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys
y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente
Glc-O-Ser/Thr, dicha preparación
conteniendo un modelo de glicosilación ligado a serina/treonina, que
es al menos uniforme en un 80%.
En una forma de realización de la invención, el
modelo de glicosilación es al menos uniforme en un 80%,
preferiblemente al menos en un 85%, al menos en un 90%, al menos en
un 95%, o al menos uniforme en un 98%.
En una forma de realización, los glicanos
ligados a serina/treonina son
Xyl-Xyl-Glc-; en otra, los glicanos
son Xyl- Glc-; en aún otra, los glicanos son Glc-.
En una forma de realización preferida, la
glicoproteína se selecciona del grupo de: factor VII humano,
variantes de la secuencia del factor VII. En una forma de
realización, la glicoproteína es una variante del factor VII donde
la proporción entre la actividad de la variante del factor VII y la
actividad del factor VIIa humano nativo (de tipo salvaje FVIIa) es
al menos aproximadamente 1,25 cuando se prueba en el "ensayo de
hidrólisis in vitro" como se describe en la presente
descripción, preferiblemente al menos aproximadamente 2,0, o al
menos aproximadamente 4,0.
En otro aspecto, la invención proporciona
métodos para la fabricación de preparaciones de polipéptidos del
factor VII que contienen motivos
Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys
y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente
Glc-O-Ser/Thr, dichas preparaciones
conteniendo un modelo de glicosilación ligado a serina/treonina que
es al menos uniforme en un 80%. Los métodos son útiles para
remodelar o alterar el modelo de glicosilación presente en un
polipéptido del factor VII en su expresión inicial.
Más particularmente, la presente invención
proporciona una metodología enzimática general para la modificación
de glicanos (en glicanos particulares ligados a O) de polipéptidos
del factor VII, para mejorar o realzar sus propiedades
farmacéuticas. Un método implica el tratamiento del polipéptido del
factor VII con xilosidasas para eliminar cualquier residuo de xilosa
terminal; otros métodos incluyen la fijación de residuos de xilosa a
la glucosa expuesta o los residuos de xilosa en el polipéptido del
factor VII por el tratamiento con xilosiltransferasas; un tercer
método incluye la fijación de residuos de glucosa a residuos de
aminoácidos de serina y/o de treonina en el esqueleto del
polipéptido del factor VII creando de este modo un polipéptido
glicosilado de factor VII.
La Fig. 1 muestra la glicosilación de la serina
52 del factor VII-wt.
La Fig. 2 muestra un mapeo de la
O-glicosilación del factor VII.
La Fig. 3 muestra un esquema de reacción para la
fabricación de una preparación de glicoproteínas que exhibe una
glicosilación predeterminada ligada a serina/treonina.
La Fig. 4 muestra un cromatograma de primeras
fracciones "A" y "B" que muestran el ciclo HIC.
La Fig. 5 muestra un cromatograma obtenido
recargando la fracción "A" sobre la columna HIC;
Glc-O-Ser52-FVII fue
identificado en la fracción del valor máximo, la fracción 10.
La Fig. 6 muestra un cromatograma obtenido
recargando la fracción "B" sobre la columna HIC;
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII
fue identificado en la fracción del valor máximo, la fracción
15.
La Fig. 7A muestra un mapa del péptido tríptico
de la fracción del valor máximo, la fracción 10; la flecha indica el
glicopéptido Glc-O-Ser52 O.
La Fig. 7B muestra un mapa del péptido tríptico
de la fracción del valor máximo, la fracción 15; la flecha indica el
glicopéptido
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52
O.
La Fig. 8A muestra un análisis de la masa total
de la fracción del valor máximo, la fracción 10; la flecha indica la
glicoforma
Glc-O-Ser52-rFVIIa
O.
La Fig. 8B muestra un análisis de la masa total
de la fracción del valor máximo, la fracción 15; la flecha indica la
glicoforma
Xyl-Xyl-Glc-O-rFVIIa
O.
Las abreviaturas siguientes se utilizan
aquí:
- Glc
- = glucosilo
- Xil
- = xilosilo
- Ser
- = serina (código de una letra: S)
- Thr
- = treonina (código de una letra: T)
- Pro
- = prolina (código de una letra: P)
- Cys
- = cisteína (código de una letra: C)
- FVII
- = factor VII
- FVIIa
- = factor VII activado (bicatenario)
- FIX
- = factor IX
- FlXa
- = factor IX activado (bicatenario)
Como se utiliza en este caso, un "modelo de
glicoforma" (o "modelo de glicosilación") se refiere a la
distribución dentro de la preparación de cadenas de oligosacáridos
que tienen estructuras variables que son ligados covalentemente a un
residuo de serina o de treonina localizado en el esqueleto de
adición de amino del polipéptido.
La "homogeneidad" se refiere a la
consistencia estructural a través de la población de polipéptidos
con glicanos conjugados. Así, de una preparación de la glicoproteína
se dice que es aproximadamente el 100% homólogo si todas las
moléculas de la glicoproteína contenidas contienen glicanos
idénticos fijados al sitio de glicosilación pertinente. Por ejemplo,
de una preparación de polipéptidos del factor VII se dice que es al
menos un 90% homologa si al menos el 90% de las moléculas del
polipéptido del factor VII contienen el glicano de interés fijado a
la serina 52 (p. ej.,
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52).
"Glicoforma uniforme" o "glicosilación
uniforme" o "modelo de glicosilación uniforme", cuando se
refiere a una especie de glicopéptido, se refiere al porcentaje de
fracciones aceptoras, es decir, residuos de serina o de treonina,
que se glicosilan por el glicano de interés. Por ejemplo, en el caso
del factor VII, unos patrones de glicosilación sustancialmente
uniformes existen si sustancialmente todos (como se ha definido
abajo) los residuos de serina en la posición 52 se glicosilan con el
glicano de interés. Es entendido por los expertos en la técnica que
la materia prima puede contener residuos de serina glicosilados y/o
de treonina que son glicosilados con unas especies que tienen la
misma estructura que el glicano de interés. Así, el porcentaje de
glicosilación calculado incluye los residuos de serina/treonina que
se glicosilan con el glicano de interés según la invención, al igual
que aquellos residuos de serina/treonina glicosilados ya con el
glicano de interés en la materia prima.
Al menos aproximadamente el 80%, tal como al
menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, o al
menos aproximadamente el 98% de los residuos de serina/treonina en
el polipéptido del factor VII se glicosila con un glicano
predeterminado y específico o un glicano de interés. El modelo de
glicosilación suele ser determinado por uno o más métodos conocidos
por los expertos en la técnica, tal como, p. ej., digestión tríptica
(HPLC) seguidos de cromatografía en fase líquida de alto
rendimiento, cromatografía líquida-espectrometría
de masas (LC-MS), tiempo de masa de desorción láser
asistida por matriz de espectrometría de vuelo (MALDITOF),
electroforesis capilar, y similares.
El término "fracción aceptora" se destina a
comprender el grupo o la fracción al que un grupo deseado de oligo-
o monosacáridos es transferido tal como, sin limitación, el residuo
de serina/treonina localizado dentro de un modelo
Cys-X1-Ser/Thr
X2-Pro-Cys, un residuo de Glc
covalentemente ligado a un residuo de serina/treonina de este tipo,
o un residuo de Xyl covalentemente ligado a un residuo de Glc o un
residuo de Xyl en una fracción
Glc-O-Ser/Thr o
Xyl-Glc-O-Ser/Thr,
respectivamente.
El término "fracción donante de sacárido"
se destina a comprender una molécula donante de sacárido activada
(p. ej., una estructura deseada de oligo- o monosacáridos tal como,
por ejemplo, un donante de xilosilo-xilosilo, un
donante de xilosilo, o un donante de glicosilo) que tiene un grupo
de salida (p. ej., UDP-xilosa o
UDP-glucosa) adecuado para la fracción donante que
actúa como un sustrato para la enzima catalizante pertinente (p. ej.
glicosiltransferasa, xilosidasa o xilosiltransferasa).
Se considera que los oligosacáridos tienen un
extremo reductor y un extremo no reductor, incluso el sacárido en el
extremo reductor de hecho es un azúcar reductor. Conforme a la
nomenclatura aceptada, los oligosacáridos se representan aquí con el
extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la
derecha (p. ej.,
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser).
Como se utiliza en este caso, el término
"glicano" o, intercambiable, "cadena de azúcar", "cadena
de oligosacárido" o "fracción de oligosacárido" se refiere a
la estructura entera de oligosacáridos que está ligado
covalentemente a un único residuo de serina/treonina. El glicano
puede comprender una o más unidades sacáridas; ejemplos de glicanos
incluyen, p. ej., Glc-, Xyl-Glc-, y
Xyl-Xyl-Glc-.
El término "sitio de
O-glicosilación" se destina a indicar el sitio de
glicosilación a serina/treonina (es decir, Ser o Thr) localizado
dentro del motivo
Cys1-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys2
donde Cys1 y Cys2 son las primeras y las segundas cisteínas
conservadas de la repetición EGF y X1 y X2 es independientemente
cualquier aminoácido. Estos incluyen el sitio de glicosilación en la
posición Ser-52 (S52) de wt-FVII
humano y los residuos correspondientes en polipéptidos homólogos
tales como, sin limitación, variantes de secuencia de FVII y
polipéptidos FIX. El término "residuos correspondientes" se
destina a indicar el residuo de aminoácido Ser o Thr correspondiente
al residuo Ser52 del factor VII de tipo salvaje (véase la Fig. 1)
cuando las secuencias están alineadas. La homología/identidad de la
secuencia de aminoácidos convenientemente se determina a partir de
secuencias alineadas, usando un programa de ordenador adecuado para
la alineación de secuencias, tal como, p. ej., el programa ClustalW,
versión 1.8, 1999 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acid
Research, 22: 4673-4680). Por ejemplo, el residuo
Ser52 del factor VII-wt corresponde al residuo Ser53
del factor IX-wt. Además, se debe entender que las
variantes de polipéptidos pueden ser creadas conteniendo motivos
Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys
no de origen natural y conteniendo de este modo sitios de
O-glicosilación no de origen natural que pueden ser
glicosilados conforme a la presente invención. En una forma de
realización de la invención, el sitio de
O-glicosilación es un sitio de glicosilación de
serina y el motivo es
Cys1-X1-Ser-X2-Pro-Cys2.
En otra forma de realización, el sitio de
O-glicosilación es un sitio de glicosilación de
treonina y el motivo es
Cys1-X1-Thr-X2-Pro-Cys2.
El término "glucosa terminal" se destina a
comprender residuos de glucosa ligados como el residuo de azúcar
terminal en un glicano, o la cadena de oligosacáridos, es decir, el
azúcar terminal de cada antena es la glucosa. El término "xilosa
terminal" se destina a comprender residuos de xilosa ligados como
el residuo de azúcar terminal en un glicano, o cadena de
oligosacáridos.
\vskip1.000000\baselineskip
La proteína
O-glicosiltransferasa puede ser preparada como se
describe, p. ej., en Shao et al. (Glycobiology 12(11):
763-770 (2002)).
Las enzimas alfa-xilosidasa
pueden ser preparadas, p. ej., como se describe por Monroe et
al. (Plant Physiology and Biochemistry
41:877-885 (2003)).
La enzima,
UDP-D-xilosa:
\beta-D-glucósido
\alpha-1,3-D-xilosiltransferasa
puede ser preparada a partir de células HepG2 como se describe por
Omichi et al. (Eur. J. Biochem. 245:143-146
(1997)).
La enzima,
UDP-D-xilosa:
\alpha-D-xylósido
\alpha-1,3-xilosiltransferasa
puede ser obtenida a partir de células HepG2 como se describe por
Minamida et al. ((J.Biochem. (Tokio) 120:
1002-1006 (1996)).
La
UDP-beta-D-glucosa
está comercialmente disponible de, p. ej., Sigma (Sigma U4625).
La UDP-D-xilosa
está comercialmente disponible de, p. ej., Sigma (Sigma U5875).
\vskip1.000000\baselineskip
El motivo:
Cys-X1-Serfrhr-X2-Pro-Cys
parece ser principalmente encontrado en los dominios de proteínas
multimodulares del factor de crecimiento epidérmico (EGF) tal como
los factores de coagulación y los factores fibrinolíticos. El motivo
es una secuencia de consenso para la modificación de la
O-glucosa por lo cual se forma un enlace de glucosa
de serina (Gic-O-Ser) o de glucosa
de treonina (Glc-O-Thr). Los
factores de coagulación VII, IX, X y XII al igual que la proteína
plasmática Z, la fibrilina y la trombospondina han mostrado todos
contener la secuencia de consenso
Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys.
De estos, los factores VII y IX y la proteína Z se ha descrito que
contienen la secuencia de consenso
Cys-X1-Ser-X2-Pro-Cys.
El factor VII (proconvertina) es una proteasa de
serina dependiente de la vitamina K que participa en el proceso de
la coagulación de la sangre para participar en la activación de
protrombina en trombina. El FVII se activa en el FVIIa por el
contacto con el factor tisular expuesto (TF) en los sitios de herida
de la pared del vaso.
\vskip1.000000\baselineskip
Como se utiliza en este caso, los términos
"polipéptido del factor VII" o "polipéptido FVII"
significa cualquier proteína que comprende la secuencia de
aminoácidos 1-406 del factor VIIa humano de tipo
salvaje (es decir, un polipéptido que tiene la secuencia de
aminoácidos divulgada en la patente de EEUU nº. 4,784,950), las
variantes en esto al igual que los polipéptidos relacionados con el
Factor VII, los derivados del factor VII y los conjugados del factor
VII. Esto incluye variantes FVII, polipéptidos relacionados con el
Factor VII, derivados del factor VII y conjugados del factor VII que
exhiben la misma actividad biológica o mejorada en relación con el
factor VIIa humano de tipo salvaje.
El término "factor VII" se destina a
comprender polipéptidos del factor VII en su forma (zimógeno) no
dividida, al igual que estos que han sido procesados
proteolíticamente para producir sus formas bioactivas respectivas,
lo que puede ser designado el factor VIIa. Típicamente, el factor
VII se escinde entre los residuos 152 y 153 para producir el factor
VIIa. Las variantes del factor VII de este tipo pueden exhibir las
propiedades diferentes en relación con el factor VII humano,
incluyendo estabilidad, unión de fosfolípidos, actividad específica
alterada, y similares.
Como se utiliza en este caso, "FVIIa humano de
tipo salvaje" es un polipéptido que tiene la secuencia amino
añadida divulgada en la patente de EEUU nº. 4,784,950.
Como se utiliza en este caso, "polipéptidos
relacionados con el factor VII" comprende los polipéptidos,
incluyendo las variantes, en los que la actividad biológica del
factor VIIa ha sido modificada, tal como reducida, en relación con
la actividad del factor VIIa de tipo salvaje. Estos polipéptidos
incluyen, sin limitación, el factor VII o el factor VIIa en lo que
las alteraciones específicas de la secuencia amino añadida han sido
introducidas que modifican o disgregan la bioactividad del
polipéptido.
El término "factor VII derivado" como se
utiliza en este caso, se destina a designar un polipéptido de FVII
que exhibe la misma actividad biológica o mejorada en relación con
el factor VII de tipo salvaje, donde una o más de las adiciones de
aminos del péptido parental ha(n) sido genéticamente y/o
químicamente y/o enzimáticamente modificada(s),
p. ej. por aliquilación, glicosilación, PEGilación, acilación, formación de áster o formación de amida o similares. Esto incluye pero no se limita al factor VIIa humano PEGilado, al factor VIIa humano de cisteína PEGilado y a sus variantes. Ejemplos no limitativos de derivados del factor VII incluyen los derivados del FVII GlicoPegilado como se divulga en WO 03/31464 y las solicitudes de patente estadounidenses US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557, y US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); conjugados de FVII como se divulga en WO 01/04287, solicitud de patente estadounidense 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) y WO 02/02764, solicitud de patente estadounidense 20030211094 (Universidad de Minnesota).
p. ej. por aliquilación, glicosilación, PEGilación, acilación, formación de áster o formación de amida o similares. Esto incluye pero no se limita al factor VIIa humano PEGilado, al factor VIIa humano de cisteína PEGilado y a sus variantes. Ejemplos no limitativos de derivados del factor VII incluyen los derivados del FVII GlicoPegilado como se divulga en WO 03/31464 y las solicitudes de patente estadounidenses US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557, y US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); conjugados de FVII como se divulga en WO 01/04287, solicitud de patente estadounidense 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) y WO 02/02764, solicitud de patente estadounidense 20030211094 (Universidad de Minnesota).
El término "actividad biológica mejorada"
se refiere a los polipéptidos FVII con i) la misma actividad
proteolítica o aumentada en comparación con el factor VIIa humano
recombinante de tipo salvaje o ii) a los polipéptidos FVII con
sustancialmente la misma actividad de unión a TF o aumentada en
comparación con el factor VIIa humano recombinante de tipo salvaje o
iii) a los polipéptidos FVII con sustancialmente la misma vida media
en plasma sanguíneo o aumentada en comparación con el factor VIIa
humano recombinante de tipo salvaje. El término "factor VIIa
humano PEGilado" significa el factor VIIa humano, con una
molécula PEG conjugada a un polipéptido del factor VIIa humano. Debe
entenderse que la molécula PEG puede ser fijada a cualquier parte
del polipéptido del factor VIIa incluyendo cualquier residuo de
aminoácidos o fracción de carbohidrato del polipéptido del factor
VIIa. El término "factor VIIa humano de cisteína PEGilado"
significa el factor VIIa con una molécula PEG conjugada a un grupo
sulfhidrilo de una cisteína introducida en el factor VIIa
humano.
Ejemplos no limitativos de variantes del factor
VII que tienen la misma actividad proteolítica o aumentada en
comparación con el factor VIIa humano recombinante de tipo salvaje
incluyen S52A-FVIIa, S60A-FVIIa
(Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352:
182-192, 1998); variantes del FVIIa que exhiben una
estabilidad proteolítica aumentada se divulgan en la patente EEUU
nº. 5,580,560; el factor VIIa que ha sido proteolíticamente
escindido entre los residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y
316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng.
48:501-505, 1995); formas oxidadas del factor VIIa
(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys.
363:43-54, 1999); variantes del FVII como se divulga
en PCT/DK02/00189 (correspondiente a WO 02/077218); y las variantes
del FVII que exhiben una estabilidad proteolítica aumentada como se
divulga en WO 02/38162 (Scripps Research Institute); variantes del
FVII que tienen un dominio Gla modificado y que exhiben una unión de
membrana mejorada como se divulga en WO 99/20767, patentes
estadounidenses US 6017882 y US 6747003, solicitud de patente
estadounidense 20030100506 (Universidad de Minnesota) y WO 00/66753,
solicitudes de patentes estadounidenses US 20010018414, US
2004220106, y US 200131005, patentes estadounidenses US 6762286 y US
6693075 (Universidad de Minnesota); y variantes del FVII como se
divulga en WO 01/58935, patente estadounidense US 6806063, solicitud
de patente estadounidense 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465
(Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO 04/083361 (Maxygen
ApS), y WO 04/111242 (Maxygen ApS), al igual que en WO 04/108763
(Canadian Blood Services).
Ejemplos no limitativos de variantes del FVII
que tienen una actividad biológica aumentada en comparación con el
FVIIa de tipo salvaje incluyen las variantes del FVII como se
divulga en WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635
(correspondiente a WO 03/027147), solicitud de patente danesa PA
2002 01423 (correspondiente a WO 04/029090), solicitud de patente
danesa PA 2001 01627 (correspondiente a WO 03/027147); WO 02/38162
(Scripps Research Instiute); y variantes del FVIIa con una actividad
mejorada como se divulga en JP 2001061479
(Chemo-Sero-Therapeutic Res
Inst.).
que tiene sustituciones, adiciones
o deleciones en la secuencia de adiciones de amino de 233Thr a
240Asn; FVII teniendo sustituciones, adiciones o deleciones en la
secuencia de aminoácidos de 304Arg a 329Cys; y FVII teniendo
sustituciones, adiciones o deleciones en la secuencia de aminoácidos
de 153IIe a
223Arg.
Variantes del factor VII que tienen
sustancialmente la misma actividad biológica o mejorada en relación
con el factor VIIa de tipo salvaje comprenden aquellos que exhiben
al menos aproximadamente el 25%, tal como, p. ej., al menos
aproximadamente el 50%, al menos aproximadamente el 75%, al menos
aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 120%, al menos
aproximadamente el 130% o al menos aproximadamente el 150% de la
actividad específica del factor VIIa de tipo salvaje que ha sido
producido en el mismo tipo de célula, cuando se prueba en uno o
varios ensayos de coagulación, ensayo de proteólisis, o ensayo de
enlace de TF como se ha descrito anteriormente. Las variantes del
factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente
reducida en relación con el factor VIIa de tipo salvaje son aquellos
que exhiben menos de aproximadamente el 25%, preferiblemente menos
de aproximadamente el 10%, más preferiblemente menos de
aproximadamente el 5% y lo más preferiblemente menos de
aproximadamente el 1% de la actividad específica del factor VIIa de
tipo salvaje que ha sido producido en el mismo tipo de célula cuando
se prueba en uno o varios ensayos de coagulación, ensayo de
proteólisis, o ensayo de enlace de TF como se describe a
continuación. Las variantes del factor VII que tienen una actividad
biológica sustancialmente modificada en relación con el factor VII
de tipo salvaje incluyen, sin limitación, las variantes del factor
VII que exhiben una actividad proteolítica del factor X
independiente de TF y aquellas que se enlazan a TF, pero no dividen
el factor X.
La actividad biológica del factor VIIa en la
coagulación sanguínea deriva de su capacidad de (i) enlazar con el
factor tisular (TF) y (ii) catalizar la rotura proteolítica del
factor IX o factor X para producir el factor IX o X activado (factor
IXa o Xa, respectivamente). Para objetivos de la invención, la
actividad biológica del factor VIIa puede ser cuantificada midiendo
la capacidad de una preparación de promover la coagulación de la
sangre usando el plasma deficiente del factor VII y la
tromboplastina, como se describe, p. ej., en la patente de EEUU nº.
5,997,864. En este ensayo, la actividad biológica se expresa como la
reducción en el tiempo de coagulación en relación con una muestra de
control y se convierte a "unidades del factor VII" por
comparación con un nivel de suero humano agrupado que contiene 1
unidad/ml de la actividad del factor VII. Alternativamente, la
actividad biológica del factor VIIa puede ser cuantificada por (i)
medición de la capacidad del factor VIIa de producir el Factor Xa en
un sistema que comprende TF incluido en una membrana lipídica y el
factor X. (Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919- 19924,
1997); (ii) medición de la hidrólisis del factor X en un sistema
acuoso (véase, "General Methods" abajo); (iii) medición
de su unión física a TF utilizando un instrumento basado en la
resonancia del plasmón de la superficie (Persson, FEBS Letts.
413:359-363, 1997) (iv) medición de la hidrólisis de
un sustrato sintético (véase, "General Methods" abajo);
y (v) medición de la generación de trombina en un sistema
independiente del TF in vitro (véase, "General
Methods" abajo).
En la puesta en práctica de la presente
invención, el modelo de oligosacáridos puede ser determinado
utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin
limitación: cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC);
electroforesis capilar (CE); resonancia magnética nuclear (RMN);
espectrometría de masas (MS) utilizando técnicas de ionización tal
como bombardeo con átomos rápidos, electrospray, o desorción láser
asistida por matriz (MALDI); cromatografía gaseosa (GC); y
tratamiento con exoglicosidasas conjuntamente con el intercambio de
aniones (AIE)-HPLC, cromatografía de exclusión por
tamaños (SEC), o MS. véase, p. ej., Weber et al., Anal.
Biochem. 225:135 (1995); Klausen et al., J. Chromatog.
718:195 (1995); Morris et al., en Mass Spectrometry of
Biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker,
(1990), págs 137-167; Conboy et al., Biol.
Mass Spectrom. 21:397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554
(1990); Sutton et al., Anal. Biochem. 318:34 (1994); Harvey
et al., Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994). Un método
para realizar la O-glicosilación de péptidos
pequeños se describe en WO A 9518232.
El contenido relativo de
O-glicoformas puede ser determinado, por ejemplo,
por el mapeo de péptidos trípticos. En breve, los polipéptidos del
factor VII se digieren con tripsina y los polipéptidos que contienen
el sitio de la O-glicosilación se separan según la
estructura del glicano por cromatografía RP-HPLC,
espectrometría de masas u otra técnica de separación analítica
adecuada. Si es necesario para obtener una separación adecuada, el
polipéptido del factor VII puede reducirse y alquilarse antes de la
digestión con tripsina y la cadena del polipéptido que contiene el
sitio de la O-glicosilación se purifica por, p. ej.
cromatografía RP-HPLC. Entonces el polipéptido del
factor VII purificado se somete a la digestión tríptica seguida por
el análisis como se ha descrito anteriormente.
El origen del polipéptido del factor VII aceptor
no es un aspecto crítico de la invención. Típicamente, el
polipéptido del factor VII será expresado en una célula procariota
cultivada o una célula eucariota tal como una célula mamífera, de
insecto, de levadura, fúngica o vegetal. La proteína, no obstante,
puede también ser aislada de una fuente natural tal co-
mo plasma, suero o sangre. El polipéptido del factor VII puede bien ser una proteína de longitud total o un fragmento.
mo plasma, suero o sangre. El polipéptido del factor VII puede bien ser una proteína de longitud total o un fragmento.
La invención proporciona composiciones que
incluyen especies de polipéptidos del factor VII que tienen un
modelo de glicosilación sustancialmente uniforme. Los métodos son
útiles para remodelar o alterar el modelo de la glicosilación
presente en un polipéptido del factor VII en su expresión inicial.
Así, los métodos de la invención proporcionan unos medios prácticos
para la preparación a gran escala de glicoformas que tienen patrones
de derivatización uniformes preseleccionados o predeterminados. Los
métodos son particularmente bien adecuados para la modificación de
péptidos terapéuticos, incluyendo pero no limitado a, polipéptidos
del factor VII que son incompletamente glicosilados durante la
producción en células de cultivo celular o animales transgénicos. No
obstante, las preparaciones y composiciones de la invención pueden
también ser preparadas por la purificación de fuentes naturales, tal
como el plasma, el suero o la sangre, o fluidos de cultivo celular y
por el aislamiento de las glicoformas deseadas de los mismos.
Los polipéptidos del factor VII para ser
remodelados conforme a la invención típicamente se preparan por los
procesos de cultivo celular. Las células huéspedes adecuadas
incluyen, sin limitación, las células humanas que expresan un gen
endógeno tal como, p. ej., un gen de factor VII. En estas células,
el gen endógeno puede ser intacto o puede haber sido modificado
in situ, o una secuencia exterior del gen endógeno puede
haber sido modificada in situ para alterar la expresión del
gen endógeno del polipéptido del factor VII. Cualquier célula humana
capaz de expresar un gen endógeno del polipéptido del factor VII
puede ser utilizada. Por otra parte, las células huéspedes incluidas
son células huéspedes heterólogas programadas para expresar un
polipéptido del factor VII, de un gen recombinante. Las células
huéspedes pueden ser células vertebradas, de insecto, o fúngicas.
Preferiblemente, las células son células mamíferas capaces del
espectro entero de glicosilación mamífera ligada a N; glicosilación
ligada a O; y \gamma-carboxilación. Véase, p. ej.,
la patente de EEUU Nos. 4,784,950. Las líneas celulares de mamíferos
preferidas incluyen las líneas celulares CHO (ATCC CCL 61),
COS-1 (ATCC CRL 1650), de riñón de bebé hámster
(BHK) y HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol.
36:59-72, 1977). Una línea celular BHK preferida es
la línea celular tk^{-} ts13 BHK (Waechter y Baserga,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:1106-1110, 1982), en lo
sucesivo referidas como células BHK 570. La línea celular BHK 570
está disponible de la American Type Culture Collection, 12301
Parklawn Dr., Rockville, MD 20852, bajo el número de acceso de ATCC
CRL 10314. Una línea celular tk^{-} ts13 BHK también está
disponible de la ATCC bajo el número de acceso CRL 1632. Además, una
serie de otras líneas celulares puede ser utilizada, incluyendo
células de Rat Hep I (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600), de Rat Hep
II (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), de pulmón
humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y DUKX (línea
celular CHO) (Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sd. EEUU
77:4216-4220, 1980 )). (Células DUKX también
referidas como células CXB11), y DG44 (línea celular CHO) (Cell,
33:405, 1983, y Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986).
También son útiles las células 3T3, células Namalwa, mielomas y las
fusiones de mielomas con otras células. Células huéspedes adecuadas
incluyen las células BHK 21 que han sido adaptadas para crecer en la
ausencia de suero y han sido programadas para expresar el factor
VII. Las células pueden ser células mutantes o recombinantes que
expresan un espectro cualitativamente o cuantitativamente diferente
de enzimas de glicosilación (tal como, p. ej., las glicosil
transferasas y/o las glicosidasas) que el tipo celular del que
fueron derivadas. Las células también pueden ser programadas para
expresar otros péptidos heterólogos o proteínas, incluyendo, p. ej.,
formas truncadas del factor VII. Las células huéspedes también
pueden ser células CHO que han sido programadas para coexpresar el
polipéptido del factor VII de interés (es decir, un polipéptido del
factor VII o relacionado con el factor VII) y otro péptido
heterólogo o polipéptido tal como, p. ej., una enzima modificante o
un fragmento del factor VII.
La presente invención comprende métodos para
producir una preparación comprendiendo un modelo de glicoforma
predeterminado ligado a serina/treonina como se describe
anteriormente y, en otras formas de realización, métodos para
optimizar la distribución de la glicoforma de un polipéptido del
factor VII (véase la figura 3). Las etapas del proceso individuales
descritas pueden ser aplicadas en diferentes combinaciones para
obtener el modelo de la glicoforma deseada. Ejemplos no limitativos
se dan abajo.
En un aspecto, estos métodos se realizan en las
fases de:
- (a)
- obtener una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr de una célula en la que se prepara; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o mediante el aislamiento del polipéptido del factor VII de una fuente natural;
- (b)
- contactar la preparación del polipéptido del factor VII con un donante activado de la fracción deseada del mono- u oligosacárido y una enzima adecuada para la transferencia del grupo deseado de mono- u oligosacáridos en condiciones apropiadas para la transferencia del grupo de mono- u oligosacáridos de la fracción donante a la fracción aceptora, produciendo de este modo el polipéptido del factor VII con un modelo alterado de glicosilación.
En otro aspecto, estos métodos se realizan en
las fases de:
- (aa)
- obtener una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr de una célula en la que es preparada; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o por el aislamiento del polipéptido del factor VII de una fuente natural;
- (bb)
- contactar la preparación del polipéptido del factor VII con una enzima adecuada para la eliminación del grupo terminal de mono- u oligosacáridos en condiciones apropiadas para la eliminación de dicho grupo de mono- u oligosacáridos, produciendo de este modo el polipéptido del factor VII con un modelo alterado de glicosilación.
En una forma de realización, los métodos
comprenden una combinación de las fases (b) y (bb). En una forma de
realización, los métodos comprenden además una fase de aislamiento
del polipéptido del factor VII con un modelo alterado de
glicosilación.
En una forma de realización, los métodos
comprenden otra fase de:
El análisis de la estructura de los
oligosacáridos ligados a los polipéptidos del factor VII para
determinar un modelo de glicoforma, y, opcionalmente, la repetición
de las fases (b) y/o (bb) hasta que un modelo de glicoforma deseado
sea conseguido.
Estos métodos pueden comprender además la fase
de someter preparaciones que tienen patrones de glicoforma
predeterminados a al menos una prueba de bioactividad (incluyendo,
p. ej., coagulación, proteólisis de factor X, o unión de TF) u otra
funcionalidad (tal como, p. ej., perfil farmacocinético o
estabilidad), y correlacionar patrones de glicoforma particulares
con una bioactividad particular o perfiles de funcionalidad para
identificar un modelo de glicoforma deseado.
En una forma de realización, el modelo de
glicoforma deseado es una glicosilación de
glucosa-O-serina/treonina
sustancialmente uniforme: en esta forma de realización, donde el
polipéptido del factor VII inicialmente obtenido contiene una xilosa
terminal, el método (Método B) comprende las fases de:
- (a)
- obtención de una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr de una célula en la que se prepara; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o mediante el aislamiento del polipéptido del factor VII de una fuente natural;
- (b)
- contacto de la preparación obtenida en la fase (a) con una xilosidasa en condiciones apropiadas para la eliminación de residuos de xilosa del polipéptido del factor VII, produciendo de este modo el polipéptido del factor VII con un modelo alterado de glicosilación.
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de aislamiento del polipéptido del factor VII
preparado en la fase b con una glicosilación
Glc-O-Ser/Thr.
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de análisis de la estructura de los oligosacáridos
ligados a los polipéptidos del factor VII para determinar un modelo
de glicoforma, y, opcionalmente, la repetición de la fase (b) hasta
que se haya conseguido el modelo de glicoforma deseado.
En otra forma de realización para hacer un
modelo de glicoformas deseado en forma de una glicosilación de
glucosa O-serina/reonina sustancialmente
uniforme, el método (Método C) comprende las fases de:
- (a)
- obtener una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys, p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o mediante el aislamiento del polipéptido del factor VII de una fuente natural;
- (b)
- contactar la preparación obtenida en la fase (a) con una O-glucosiltransferasa y un donante activado de glucosa en condiciones apropiadas para transferir un residuo de glucosa de la fracción donante de glucosa a la fracción aceptora de serina/treonina, produciendo de este modo el polipéptido del factor VII con un modelo alterado de glicosilación.
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de aislamiento del polipéptido del factor VII
preparado en la fase b con una glicosilación
Glc-O-Ser/Thr.
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de análisis de la estructura de los oligosacáridos
ligados a los polipéptidos del factor VII para determinar un modelo
de glicoforma, y, opcionalmente, la repetición de la fase (b) hasta
que se haya conseguido el modelo de glicoforma deseado.
\newpage
En una forma de realización, el patrón de
glicoforma deseado es una glicosilación de
xilosa-glucosa-O-serina/treorina
sustancialmente uniforme: en esta forma de realización, el método
(Método A1) comprende las fases de:
- (a)
- obtener una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o mediante el aislamiento del polipéptido del factor VII de una fuente natural;
- (b)
- contactar la preparación obtenida en la fase (a) con UDP-D-xilosa: \beta-D-glucósido \alpha-1,3-D-xilosiltransferasa y un donante activado de xilosilo en condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa de la fracción donante de xilosa a la fracción aceptora, produciendo de este modo el polipéptido del factor VII con un modelo alterado de glicosilación.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de aislamiento del polipéptido del factor VII
preparado en la fase b con una glicosilación
Xyl-Glc-O-Ser/Thr.
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de análisis de la estructura de los oligosacáridos
ligados a los polipéptidos del factor VII para determinar un modelo
de glicoforma, y, opcionalmente, la repetición de la fase (b) hasta
que se haya conseguido el modelo de glicoforma deseado.
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de eliminación de residuos terminales de xilosa
sometiendo a la preparación obtenida en la fase (a) al Método B
antes de la fase (b).
En una forma de realización, el modelo de
glicoforma deseado es una glicosilación de
xilosa-xilosa-glucosa-O-serina/treonina
sustancialmente uniforme: en esta forma de realización, el método
(Método A2) comprende las fases de:
- (a)
- obtención de una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o mediante el aislamiento del polipéptido del factor VII de una fuente natural;
- (b)
- contacto de la preparación obtenida en la fase (a) con UDP-D-xilosa: \beta-D-glucósido \alpha-1,3-D-xilosiltransferasa y un donante activado de xilosilo en condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa de la fracción donante de xilosa a la fracción aceptora, produciendo de este modo el polipéptido del factor VII con un modelo alterado de glicosilación.
- (c)
- contactar la preparación obtenida en la fase (b) con una UDP-D-xilosa: \beta-D-glucósido \alpha-1,3-D-xilosiltransferasa y un donante activado de xilosilo en condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa de la fracción donante de xilosa a la fracción aceptora, produciendo de este modo el polipéptido del factor VII con un modelo alterado de glicosilación.
\vskip1.000000\baselineskip
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de aislamiento de la preparación obtenida en la fase
(b) antes de someter la preparación a la fase (c).
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de aislamiento del polipéptido del factor VII
preparado en la fase (c) con una glicosilación
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser/Thr.
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de análisis de la estructura de los oligosacáridos
ligados a los polipéptidos del factor VII para determinar un modelo
de glicoforma, y, opcionalmente, la repetición de la fase (b) y/o la
fase (c) hasta que se haya conseguido el modelo de glicoforma
deseado.
En una forma de realización, el método incluye
además la fase de eliminación de residuos terminales de xilosa
sometiendo la preparación obtenida en la fase (a) al Método B antes
de la fase (b).
En diferentes formas de realización, el
polipéptido del factor VII exhibe glicosilación
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser
sustancialmente uniforme, glicosilación
Xyl-Glc-O-Ser, y
glicosilación Glc-O-Ser; Ser siendo
la serina del motivo Cys-X1-Ser-
X2-Pro-Cys contenido (X1 y X2
independientemente siendo cualquier residuo de aminoácido). En
otras, diferentes formas de realización, el polipéptido del factor
VII exhibe glicosilación
Xyl-Xyl-Glc-O-Thr
sustancialmente uniforme, glicosilación
Xyl-Glc-O-Thr, y
glicosilación Glc-O-Thr; Thr siendo
la treonina del motivo
Cys-X1-Thr-X2-Pro-Cys
contenido (X1 y X2 independientemente siendo cualquier residuo de
aminoácido).
\newpage
En formas de realización preferidas, la
preparación del polipéptido del factor VII se selecciona en la lista
de:
- Polipéptidos del factor VII que exhiben glicosilación Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme,
- Polipéptidos del factor VII que exhiben glicosilación Xyl-Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme,
- Polipéptidos del factor VII que exhiben glicosilación Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme,
- Polipéptidos relacionados con el factor VII que exhiben glicosilación Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme,
- Polipéptidos relacionados con el factor VII que exhiben glicosilación Xyl-Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme,
- Polipéptidos relacionados con el factor VII que exhiben glicosilación Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme,
- Variantes del factor VII que exhiben glicosilación Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme,
- Variantes del factor VII que exhiben glicosilación Xyl-Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme,
- Variantes del factor VII que exhiben glicosilación Glc-O-Ser52 sustancialmente uniforme.
Debe entenderse que oligosacáridos tales como
Xyl-Xyl- pueden también ser transferidos a la
fracción aceptora Glc-O-Ser/Thr
usando una enzima de transferencia adecuada y un donante activado de
Xyl-Xyl-.
Método cromatográfico: la presente
invención también comprende métodos cromatográficos de interacción
hidrofóbica para producir una preparación comprendiendo un modelo de
glicoforma predeterminado ligado a serina/treonina como se describe
anteriormente, y para purificar un polipéptido del factor VII
O-glicosilado con un modelo de glicoforma deseado de
una composición comprendiendo dicho polipéptido del factor VII y
polipéptidos del factor VII teniendo patrones de glicoformas
indeseados.
En un aspecto, el método comprende las fases
siguientes:
- (a)
- obtención de una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr de una célula en la que se prepara; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o mediante el aislamiento del polipéptido del factor VII de una fuente natural;
- (b)
- enlace del polipéptido del factor VII a un material de interacción hidrofóbica usando una solución que comprende agua, opcionalmente un componente de sal, y opcionalmente un tampón,
- (c)
- opcionalmente lavado del material de interacción hidrofóbica usando una solución que comprende agua, opcionalmente un componente de sal, y opcionalmente un tampón para eluir contaminantes del material de interacción hidrofóbica;
- (d)
- lavado del material de interacción hidrofóbica usando una solución que comprende un modificador orgánico, agua, opcionalmente un componente de sal, y opcionalmente un tampón, a un gradiente lineal o un gradiente de fase o ¡socráticamente en componente de sal para separar el polipéptido del factor VII con un modelo de glicoforma deseado del polipéptido del factor VII que no tiene la glicoforma deseada del material de interacción hidrofóbica;
- (e)
- recogida de la fracción conteniendo el polipéptido del factor VII teniendo el modelo de glicoforma deseado.
En una forma de realización, los métodos
descritos anteriormente incluyen además la fase de repetición de las
fases (a) a (e) sometiendo la preparación obtenida en la fase (e) a
las fases (a) a (e). Esta fase adicional puede ser repetida más de
una vez si se considera necesario.
Debe entenderse que las preparaciones según la
invención pueden también ser preparadas por un proceso comprendiendo
una combinación de fases de purificación por la cual especies de
polipéptidos del factor VII que tienen la glicosilación deseada son
capturadas del líquido de cultivo celular o de la fuente natural de
origen y los métodos enzimáticos descritos anteriormente.
Los métodos descritos anteriormente pueden
comprender además la fase de someter preparaciones que tienen
patrones de glicoformas predeterminados en al menos una prueba de
bioactividad (incluyendo, p. ej., coagulación, proteólisis de factor
X, o unión de TF) u otra funcionalidad (tal como, p. ej., perfil
farmacocinético o estabilidad), y correlacionar patrones de
glicoformas particulares con bioactividad particular o perfiles de
funcionalidad para identificar un modelo de glicoforma deseado.
Otros tratamientos enzimáticos pueden ser usados
en relación con los métodos anteriores para modificar el modelo de
oligosacáridos de glicanos ligados a N o a O de una preparación;
tales tratamientos incluyen, sin limitación, tratamiento con uno o
más de sialidasa (neuraminidasa), galactosidasa, fucosidasa;
galactosil transferasa, fucosil transferasas, y/o sialiltransferasa,
en una secuencia y en condiciones que consiguen una modificación
deseada en la distribución de cadenas de oligosacáridos que tienen
estructuras terminales particulares. Las glicosil transferasas están
comercialmente disponibles de Calbiochem (La Jolla, CA) y las
glicosidasas están comercialmente disponibles de Glyko, Inc.,
(Novato, CA).
Como se utiliza en este caso, una "preparación
de polipéptidos del factor VII" se refiere a una pluralidad de
glicoformas de polipéptidos del factor VII que han sido separadas de
la célula en la que fueron sintetizadas. La preparación de
polipéptidos del factor VII incluye formas inactivadas, formas
activadas, polipéptidos funcionalmente relacionados tales como, p.
ej., variantes y formas químicamente modificadas, que han sido
separadas de la célula en la que fueron sintetizadas.
Por ejemplo, como se utiliza en este caso, una
"preparación de factor VII" se refiere a una pluralidad de
polipéptidos del factor VII, polipéptidos del factor VIIa, o
polipéptidos relacionados con el factor VII, incluyendo variantes y
formas químicamente modificadas, que han sido separadas de la célula
en la que fueron sintetizados o aislados de una fuente natural.
La separación de polipéptidos del factor VII de
su célula de origen puede ser conseguida por cualquier método
conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, eliminación de
medio de cultivo celular conteniendo el producto deseado de un
cultivo celular adherente; centrifugado o filtración para eliminar
células no adherentes; y similares.
Opcionalmente, los polipéptidos pueden ser
nuevamente purificados. La purificación puede ser conseguida usando
cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación,
cromatografía de afinidad, tal como, p. ej., en un
anti-factor VII (véase, p. ej., Wakabayashi et
al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; y Thim et al.,
Biochem. 27:7785, 1988); cromatografía de interacción hidrofóbica;
cromatografía de intercambio de iones; cromatografía por exclusión
de tamaño; procedimientos electroforéticos (p. ej.,
isoelectroenfoque preparatorio (IEF), solubilidad diferencial (p.
ej., precipitación con sulfato de amonio), o extracción y similares.
Véase, generalmente, Scopes, Protein Purification, Springer Verlag,
Nueva York, 1982; y Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden,
editores, VCH Publishers, Nueva York, 1989. Después de la
purificación, la preparación contiene preferiblemente menos de
aproximadamente el 10% en peso, más preferiblemente menos de
aproximadamente el 5% y lo más preferiblemente menos de
aproximadamente el 1%, de proteínas no relacionadas derivadas de la
célula huésped.
Polipéptidos del factor VII y relacionados con
el factor VII respectivamente, pueden ser activados por rotura
proteolítica, usando el factor XIIa u otras proteasas que tienen
especificidad similar a la tripsina, tal como, p. ej., factor IXa,
calicreína, factor Xa, y trombina. Véase, p. ej., Osterud et
al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, patente US nº. 4,456,591;
y Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983).
Alternativamente, el factor VII, puede ser activado pasándolo a
través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal
como Mono Q® (Pharmacia) o similares. El resultante polipétido del
factor VII activado puede entonces ser formulado y administrado como
se describe abajo.
Las preparaciones de polipéptidos del factor VII
que tienen patrones de oligosacáridos predeterminados según la
invención (incluyendo polipéptidos del factor VII, polipéptidos
relacionados con el factor VII) exhiben propiedades funcionales
mejoradas en relación con preparaciones de referencia. Las
propiedades funcionales mejoradas pueden incluir, sin limitación, a)
propiedades físicas tales como, p. ej., estabilidad de
almacenamiento; b) propiedades farmacocinéticas tales como, p. ej.,
biodisponibilidad y vida media; c) inmunogenicidad en seres humanos,
y d) actividad biológica, tal como, p. ej., actividad
coagulante.
Una preparación de referencia se refiere a una
preparación comprendiendo un polipéptido que es idéntico a aquel que
está contenido en la preparación de la invención con el que se
compara (tal como, p. ej., el factor VII de tipo salvaje o una
variante particular o forma químicamente modificada) salvo para
exhibir un modelo de glicosilación diferente ligado a
serina/treonina.
La estabilidad de almacenamiento de una
preparación de polipéptidos del factor VII puede ser evaluada
midiendo (a) el tiempo requerido durante el 20% de la bioactividad
de una preparación hasta deteriorarse cuando se almacena como un
polvo seco a 25ºC y/o (b) el tiempo requerido para una duplicación
en la proporción de (p. ej., el factor VIIa) agregados de dicho
polipéptido del factor VII en la preparación.
En algunas formas de realización, las
preparaciones de la invención exhiben un aumento de al menos
aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente el
60% y más preferiblemente al menos aproximadamente el 100%, en el
tiempo requerido para el 20% de la bioactividad hasta deteriorarse
en relación con el tiempo requerido para el mismo fenómeno en una
preparación de referencia, cuando ambas preparaciones son
almacenadas como polvos secos a 25ºC. Las mediciones de bioactividad
pueden ser realizadas usando cualquier ensayo de coagulación, ensayo
de proteolisis, ensayo de enlace de TF, o ensayo de generación de
trombina independiente de TF.
En algunas formas de realización, las
preparaciones de la invención exhiben un aumento de al menos
aproximadamente el 30%, preferiblemente al menos aproximadamente el
60%, y más preferiblemente al menos aproximadamente el 100%, en el
tiempo requerido para la duplicación de agregados en relación con
una preparación de referencia, cuando ambas preparaciones son
almacenadas como polvos secos a 25ºC. El contenido de agregados
puede ser determinado según métodos conocidos por el experto en la
materia, tal como, p. ej., métodos de HPLC de permeación en gel. Por
ejemplo, el contenido de agregados del factor VII se determina por
HPLC de permeación en gel en una columna de proteína Pak 300 SW (7.5
x 300 mM) (Waters, 80013) de la siguiente manera. La columna se
equilibra con eluyente A (0,2 M de sulfato de amonio, 5%
isopropanol, pH ajustado a 2,5 con la adición de fósforo, y el pH
entonces se ajusta a 7,0 con trietilamina), después de la cual 25
\mug de muestra se aplica a la columna. La elución es con eluyente
A de una velocidad de flujo de 0,5 ml/min durante 30 min, y la
detección se consigue por la medición de la absorbencia a 215 nm. El
contenido de agregados es calculado como el área del valor máximo de
los agregados del factor VII/área total de valores máximos del
factor VII (monómero y agregados).
"Biodisponibilidad" se refiere a la
proporción de una dosis administrada de una preparación de
polipéptidos del factor VII (p. ej., del factor VII o relacionado
con el factor VII) que puede ser detectada en plasma a tiempos
predeterminados después de la administración. Típicamente, la
biodisponibilidad se mide en animales de experimentación
administrando una dosis de entre aproximadamente
25-250 \mug/kg de la preparación; obteniendo
muestras de plasma a tiempos predeterminados después de la
administración; y determinando el contenido de polipéptidos del
factor VII (p. ej., del factor VII o relacionados con el factor VII)
glicosilados en las muestras usando uno o más de un ensayo de
coagulación (o cualquier bioensayo), un inmunoensayo, o un
equivalente. Los datos típicamente son visualizados gráficamente
como polipéptido del factor VII v. tiempo y la biodisponibilidad se
expresa como el área bajo la curva (AUC). La biodisponibilidad
relativa de una preparación de la prueba se refiere a la proporción
entre el AUC de la preparación de la prueba y aquel de la
preparación de referencia.
En algunas formas de realización, las
preparaciones de la presente invención exhiben una biodisponibilidad
relativa de al menos aproximadamente el 110%, preferiblemente al
menos aproximadamente el 120%, más preferiblemente al menos
aproximadamente el 130% y lo más preferiblemente al menos
aproximadamente el 140% de la biodisponibilidad de una preparación
de referencia. La biodisponibilidad puede ser medida en cualquier
especies de mamíferos, preferiblemente perros, y los tiempos
predeterminados usados para calcular AUC pueden comprender
diferentes incrementos de 10 min-8 h.
"Vida media" se refiere al tiempo requerido
para la concentración del plasma de (p. ej., polipéptidos del factor
VII de polipéptidos relacionados con el factor VII) el polipéptido
del factor VII para reducir de un valor particular a la mitad de
este valor. La vida media puede ser determinada usando el mismo
procedimiento en cuanto a la biodisponibilidad. En algunas formas de
realización, las preparaciones de la presente invención exhiben un
aumento en la vida media de al menos aproximadamente 0,25 h,
preferiblemente al menos aproximadamente 0,5 h, más preferiblemente
al menos aproximadamente 1 h, y lo más preferiblemente al menos
aproximadamente 2 h, en relación con la vida media de una
preparación de referencia.
"Inmunogenicidad" de una preparación se
refiere a la capacidad de la preparación, cuando se administra a un
humano, para suscitar una respuesta inmune deletérea, sea humoral,
celular, o ambas. De los polipéptidos del factor VIIa y los
polipéptidos relacionados con el factor VIIa se sabe que no suscitan
respuestas inmunes detectables en seres humanos. Sin embargo, en
cualquier subpoblación humana, pueden existir individuos que exhiben
sensibilidad a proteínas particulares administradas. La
inmunogenicidad puede ser medida cuantificando la presencia de
anticuerpos del anti-factor VII y/o células T que
responden al factor VII en un individuo sensible, usando métodos
convencionales conocidos en la técnica. En algunas formas de
realización, las preparaciones de la presente invención exhiben una
reducción en la inmunogenicidad en un individuo sensible de al menos
aproximadamente el 10%, preferiblemente al menos aproximadamente el
25%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 40% y lo más
preferiblemente al menos
aproximadamente el 50%, en relación con la inmunogenicidad para este individuo de una preparación de referencia.
aproximadamente el 50%, en relación con la inmunogenicidad para este individuo de una preparación de referencia.
Las preparaciones de la presente invención
pueden ser usadas para tratar cualquier síndrome que responde a la
glicoproteína pertinente. Síndromes del factor VII, de FIX y que
responden a FX, respectivamente, incluyen síndromes tales como, p.
ej., trastornos del sangrado, incluyendo, sin limitación, éstos
causados por deficiencias del factor de coagulación (p. ej.,
hemofilia A y B o deficiencia de factores de coagulación XI o VII);
por trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand, o por
inhibidores del factor de coagulación, o hemorragia excesiva de
cualquier causa. Las preparaciones también pueden ser administradas
a pacientes en asociación con cirugía u otro traumatismo o a
pacientes que reciben una terapia anticoagulante.
Preparaciones que comprenden polipéptidos
relacionados con el Factor VII según la invención, que tienen
bioactividad sustancialmente reducida en relación con el factor VII
de tipo salvaje, pueden ser usadas como anticoagulantes, tal como,
p. ej., en pacientes sometidos a angioplastia u otros procedimientos
quirúrgicos que pueden aumentar el riesgo de trombosis u oclusión de
vasos sanguíneos como ocurre, p. ej., en la restenosis. Otras
indicaciones médicas para las que se prescribe anticoagulantes
incluyen, sin limitación, trombosis de vena profunda, embolia
pulmonar, ictus, coagulación diseminada intravascular (CID),
deposición de fibrina en pulmones y ríñones asociada a endotoxemia
gram-negativa, infarto de miocardio; síndrome de
dificultad respiratoria aguda (ARDS), síndrome de respuesta
inflamatoria sistémica (SIRS), síndrome urémico hemolítico (SUH),
MOF, y TTP.
Composiciones farmacéuticas comprendiendo
preparaciones del factor VII y relacionadas con el factor VII según
la presente se destinan principalmente a la administración
parenteral para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico.
Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas se administran
parenteralmente, es decir, por vía intravenosa, por vía subcutánea,
o por vía intramuscular. Pueden ser administradas por infusión
continua o pulsátil.
Composiciones farmacéuticas o formulaciones
comprenden una preparación según la invención en combinación con,
preferiblemente disuelta en, un portador farmacéuticamente
aceptable, preferiblemente un portador acuoso o diluyente. Una
variedad de portadores acuosos puede ser usada, tal como agua, agua
tamponado, el 0,4% de solución salina, el 0,3% de glicina y
similares. Las preparaciones de la invención también pueden ser
formuladas en preparaciones de liposomas para la entrega o la
orientación hacia los sitios de herida. Preparaciones de liposomas
generalmente se describen en, p. ej., patentes US nº. 4,837,028,
4,501,728, y 4,975,282. Las composiciones pueden ser esterilizadas
por técnicas de esterilización convencionales, bien conocidas. Las
soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para el uso o
filtradas en condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación
liofilizada siendo combinada con una solución acuosa estéril antes
de la administración.
Las composiciones pueden contener sustancias
auxiliares o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, incluyendo,
sin limitación, agentes ajustadores del pH y agentes tampones y/o
agentes ajustadores de la tonicidad, tales como, por ejemplo,
acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de
potasio, cloruro de calcio, etc.
La concentración de polipéptidos del factor VII
o polipéptidos relacionados con el factor VII en estas formulaciones
puede variar mucho, es decir, de menos de aproximadamente el 0,5% en
peso, normalmente a o al menos aproximadamente al 1% en peso hasta
tanto como el 15 o el 20% en peso y será seleccionado principalmente
por volúmenes de fluido, viscosidades, etc., conforme al modo
particular de administración seleccionado.
Así, una composición farmacéutica típica para la
infusión intravenosa podría estar formada para contener 250 ml de
solución estéril de Ringer y 10 mg de la preparación. Métodos reales
para preparar composiciones parenteralmente administrables serán
conocidos o aparentes para los expertos en la técnica y son
descritos en más detalle en, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical
Sciences, 18a ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990).
Las composiciones conteniendo las preparaciones
de la presente invención pueden ser administradas para tratamientos
profilácticos y/o terapéuticos. En usos terapéuticos, las
composiciones se administran a un sujeto ya sufriendo de una
enfermedad, como se ha descrito anteriormente, en una cantidad
suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la enfermedad
y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para realizar esto se
define como "cantidad terapéuticamente eficaz". Cantidades
eficaces para cada fin dependerán de la gravedad de la enfermedad o
herida al igual que del peso y estado general del sujeto. En
general, no obstante, la cantidad eficaz variará de aproximadamente
0,05 mg a aproximadamente 500 mg de la preparación al día para un
sujeto de 70 kg, con dosificaciones de aproximadamente 1,0 mg a
aproximadamente 200 mg de la preparación siendo usadas más
comúnmente al día. Será entendido que la determinación de una
dosificación apropiada puede ser conseguida usando la
experimentación rutinaria, por la construcción de una matriz de
valores y por una prueba de diferentes puntos en la matriz.
La entrega local de las preparaciones de la
presente invención, tal como, por ejemplo, la aplicación tópica,
puede ser realizada, p. ej., mediante una pulverización, perfusión,
catéteres de doble balón, espirales, incorporadas en injertos
vasculares o espirales, hidrogeles usados para cubrir catéteres de
balón, u otros métodos bien establecidos. De cualquier manera, las
composiciones farmacéuticas deberían proveer una cantidad de la
preparación suficiente para tratar eficazmente al sujeto.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
además pueden comprender otros agentes bioactivos, tales como, p.
ej., coagulantes o anticoagulantes no relacionados con el factor
VII.
Los ensayos de
\alpha-xilosidasa se realizan en un tampón
apropiado, p. ej. 50 mM de acetato de sodio, pH 4,5, conteniendo un
sustrato adecuado, p. ej. los O-glicopéptidos que
pueden ser obtenidos del mapa de O-glicopéptidos de
la glicoproteína pertinente (p. ej., rFVIIa). La reacción se detiene
después de un tiempo apropiado que puede ser determinado
experimentalmente, por p. ej. la adición de ácido trifluoroacético,
y las mezclas de ensayo son analizadas por HPLC.
Los ensayos de
\alpha-xitosiltransferasa se realizan en un tampón
apropiado, p. ej. 10 mM de Hepes, pH 7,2, el 0,1% de Tritón
X-100, 0,5 mM de UDP-xilosa (Sigma
U5875), conteniendo un sustrato adecuado, p. ej. los
O-glicopéptidos que pueden ser obtenidos del mapa de
O-glicopéptidos de la glicoproteína pertinente (p.
ej., rFVIIa) o los oligosacáridos piridilo-aminados
preparados como se describe en Minamida et al. (Minamida
et al., Detection of
UDP-D-xylose:
\alpha-D-xyloside
\alpha1-3xylosyltransferase activity in human
hepatoma cell line Hep2. J. Biochem. 120 1002-1006,
1996). La reacción se detiene después de un tiempo apropiado, que
puede ser determinado experimentalmente, por p. ej. la adición de
ácido trifluoroacético, y las mezclas de ensayo son analizadas por
HPLC.
Los ensayos de
\alpha-xilosidasa y de
\alpha-xilosiltransferasa se optimizan para el
tiempo y, opcionalmente para la temperatura y el pH.
Los ensayos de
O-glucosiltransferasa se realizan, p. ej., como se
describe por Shao et al. (Glycobiology 12(11)
763-770 2002).
Un ensayo adecuado para la prueba para la
actividad del factor VIIa y de este modo la selección de variantes
adecuadas del factor VIIa pueden ser realizadas como una simple
prueba preliminar in vitro. El ensayo también es adecuado
para seleccionar variantes adecuadas del factor VIIa.
Las variantes del factor VIIa nativo (de tipo
salvaje) y del factor VIIa (ambos denominados en lo sucesivo
"factores VIIa") pueden ser evaluadas para actividades
específicas. También pueden ser evaluadas en paralelo para comparar
directamente sus actividades específicas. El ensayo se realiza en
una placa de microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El
sustrato cromogénico
D-IIe-Pro-Arg-p-nitroanilida
(S-2288, Chromogenix, Suecia), concentración final
de 1 mM, se añade al factor VIIa (concentración final de 100 nM) en
50 mM Hepes, pH 7,4, conteniendo 0,1 M NaCl, 5 mM CaCl_{2} y 1
mg/ml de albúmina de suero bovino. La absorbencia a 405 nm se mide
continuamente en un lector de placas spectraMax™ 340 (Molecular
Devices, EEUU). La absorbencia desarrollada durante una incubación
de 20 minutos, después de la sustracción de la absorbencia en un
pocilio en blanco no conteniendo ninguna enzima, se usa para
calcular la proporción entre las actividades de la variante del
factor VIIa y factor VIIa de tipo salvaje:
Proporción =
(A_{405} nm variante del factor VIIa)/(A_{405} nm factor VIIa de
tipo
salvaje).
Basado en esto, variantes del factor VIIa con
una actividad comparable o superior al factor VIIa nativo pueden ser
identificadas, tal como, por ejemplo, variantes donde la proporción
entre la actividad de la variante y la actividad del factor VII
nativo (FVII de tipo salvaje) es alrededor de, contra superior a
1,0.
La actividad del factor VIIa o variantes del
factor VIIa también pueden ser medidas usando un sustrato
fisiológico tal como el factor X, adecuadamente a una concentración
de 100-1000 nM, donde el Factor Xa generado es
medido después de la adición de un sustrato cromogénico adecuado
(por ejemplo S-2765). Además, el ensayo de la
actividad se puede realizar a temperatura fisiológica.
El factor VIIa nativo (de tipo salvaje) y la
variante del factor VIIa (ambos denominados en lo sucesivo "factor
VII") se ensayan en paralelo para comparar directamente sus
actividades específicas. El ensayo se realiza en una placa de
microtitulación (MaxiSorp, Nunc, Dinamarca). El factor VIIa (10 nM)
y el factor X (0,8 microM) en 100 microL 50 mM Hepes, pH 7,4,
conteniendo 0,1 M de NaCl, 5 mM de CaCl_{2} y 1 mg/ml de albúmina
de suero bovino, se incuban durante 15 min. La división del factor X
se detiene entonces por la adición de 50 microL 50 mM Hepes, pH 7,4,
conteniendo 0,1 M NaCl, 20 mM EDTA y 1 mg/ml albúmina de suero
bovino. La cantidad del Factor Xa generado se mide por la adición
del sustrato cromogénico
Z-D-Arg-Gly-Arg-P-nitroanilida
(S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final
de 0,5 mM. La absorbencia a 405 nm se mide continuamente en un
lector de placas SpectraMax™ 340 (Molecular Devices, EEUU). La
absorbencia desarrollada durante 10 minutos, después de la
sustracción de la absorbencia en un pocilio en blanco no conteniendo
ningún FVIIa, se usa para calcular la proporción entre las
actividades proteolíticas de la variante del factor VIIa y del
factor VIIa de tipo salvaje:
Proporción =
(A_{405} nm variante del factor VIIa)/(A_{405} nm factor VIIa de
tipo
salvaje).
Basado en esto, las variantes del factor VIIa
con una actividad comparable o superior al factor VIIa nativo puede
ser identificada, tal como, por ejemplo, variantes donde la
proporción entre la actividad de la variante y la actividad del
factor VII nativo (de tipo salvaje FVII) es alrededor de 1, contra
superior a 1,0.
La capacidad de polipéptidos del factor VII o
relacionados con el factor VII (p. ej., variantes) para generar
trombina puede ser medida en un ensayo comprendiendo todos los
factores de coagulación pertinentes e inhibidores a concentraciones
fisiológicas y plaquetas activadas (como se describe en p. 543 en
Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99,
542-547 que se incorpora en la presente como
referencia).
La actividad de los polipéptidos del factor VII
también puede ser medida usando un ensayo de coágulo de una etapa
esencialmente como se describe en WO 92/15686 o US 5,997,864.
Brevemente, la muestra que debe evaluarse se diluye en 50 mM Tris
(pH 7,5), el 0,1% de BSA y 100 \mul se incuba con 100 \mul de
plasma deficitario del factor VII y 200 \mul de tromboplastina C
conteniendo 10 mM Ca2+. Los tiempos de coagulación se miden y se
comparan con una curva estándar usando un estándar de referencia o
un grupo de plasma humano normal citratado en diluciones en
serie.
serie.
Esencialmente el mismo, excepto que el factor
tisular recombinante humano se usa en su lugar para la
tromboplastina C.
\vskip1.000000\baselineskip
Ensayos adecuados para probar para la actividad
del factor IX, y proveer de este modo medios para seleccionar
variantes del factor IX adecuadas para el uso en la presente
invención, pueden ser realizados como simples pruebas in
vitro como se describe, por ejemplo, en Wagenvoord et
al., Haemostasis 1990,20(5):276-88.
La actividad biológica del factor IX también
puede ser cuantificada midiendo la capacidad de una preparación para
corregir el tiempo de coagulación del plasma deficitario del factor
IX, p. ej., como se describe en Nilsson et al., 1959.(Nilsson
IM, Blombaeck M, Thilen A, von Francken I., Carriers of haemophilia
A - A laboratory study, Acta Med Sean 1959, 165:357). En este
ensayo, la actividad biológica es expresada como unidades/ml plasma
(1 unidad corresponde a la cantidad de FIX presente en el plasma
agrupado normal.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ejemplos siguientes son destinados como
ilustraciones no limitativas de la presente invención.
La enzima, \alpha-xilosidasa,
puede ser preparada a partir de diferentes fuentes, p. ej. de
material vegetal como se describe por Monroe et al. (Plant
Physiology and Biochemistry 41:877-885 (2003)). Por
ejemplo, tejidos de planta de p. ej. Arabidopsis thaliana son
molidos en un mortero y una mano de mortero con arena cuarzosa en
dos volúmenes de tampón A (40 mM Hepes, pH 7,0, 1 M NaCl), y el
extracto filtrado se centrifuga a 15000 x g durante 15 min. El
sulfato de amonio se añade por ejemplo al 80% de saturación. Las
proteínas precipitadas son recogidas por centrifugado a 15000 x g
durante 15 min y son redisueltas en el tampón A. La
\alpha-xilosidasa se purifica por cromatografía,
por ejemplo en una columna de Concanavalina
A-Sefarosa, en una columna de intercambio aniónico
y/o en otras columnas cromatográficas conocidas por el experto en la
materia. Se recogen fracciones durante la elución y las fracciones
conteniendo la enzima \alpha-xilosidasa se
identifican usando el ensayo de
\alpha-xilosidasa.
Genes que codifican
\alpha-xilosidasas, que pueden hidrolizar enlaces
alfa-xilosídicos, han sido clonados y caracterizados
previamente y genes mostrando una homología significante con
\alpha-xilosidasas caracterizadas han sido
anotados en los genomas de varios organismos procarióticos y
eucarióticos. Las secuencias de genes están disponibles en bases de
datos tales como SWISS-PROT o NCBI y pueden ser
amplificadas por PCR de ADN genómico de los organismos respectivos.
Varios candidatos fueron elegidos para la clonación y expresión en
E. coli después de buscar bases de datos de proteínas para la
presencia de proteínas de \alpha-xilosidasa. Los
genes candidatos siguientes fueron seleccionados basándose en la
anotación ya existente en las bases de datos (A),
caracterización(P) precedente publicada o basados en el
análisis de homología a
\alpha-xilosidasas(H) conocidas: gen tm0308
(Thermotoga maritima: A); gen bt3085 (2139 bp) y gen
bt3659(2475 bp) (Bacteroides thetaiotaomicron: A); gen
bf0551 (2238 bp) y gen bf1247 (2538 bp) (Bacteroides
fragilis: A); gen b102681 (2310 bp) (Bacillus
licheniformis: H); gen bh1905 (2328 bp)(Bacillus
halodurans: H), gen xyIS (2196 bp)(Sulfolobus
solfataricus: P); gen yicl (2319 bp) (Escherichia coli:
P).
\newpage
El software SignalP (Bendtsen,J.D.et
al..J. Mol. Biol., 340:783-795, 2004) se usa
para evaluar si un péptido señal está potencialmente presente en el
N-terminal de las enzimas candidatas. BF0551;
BF1247; BT3085; BT3659 son supuestamente segregados como indicado
por una predicción fuerte de un sitio de división de la peptidasa
señal I. Un codón de metionina codificando una metionina de inicio
se incluye delante del primer aminoácido después el sitio de la
división prevista.
ADN genómico purificado de Bacteroides
thetaiotaomicron (ATCC 29148D), Bacteroides fragilis
(ATCC
25285D), Bacillus haludurans (ATCC 21591D&BAA125D), Sulfolobus solfataricus (ATCC 35092D), Thermotoga marítima (ATCC 43589D) se obtiene de American Type Culture Collection. En el caso de E. coli (derivado de la cepa K-12) y Bacillus licheniformis (ATCC 28450), el ADN genómico se prepara a partir de células bacterianas cultivadas durante la noche en un medio LB usando el equipo de tejido DNeasy (Qiagen) según las instrucciones de fabricación.
25285D), Bacillus haludurans (ATCC 21591D&BAA125D), Sulfolobus solfataricus (ATCC 35092D), Thermotoga marítima (ATCC 43589D) se obtiene de American Type Culture Collection. En el caso de E. coli (derivado de la cepa K-12) y Bacillus licheniformis (ATCC 28450), el ADN genómico se prepara a partir de células bacterianas cultivadas durante la noche en un medio LB usando el equipo de tejido DNeasy (Qiagen) según las instrucciones de fabricación.
Cebadores directos e inversos para la
amplificación por PCR se diseñan con una extensión en los extremos
5' comprendiendo los sitios de división de las enzimas de
restricción Ndel (o Xbal) y Xmal, respectivamente. La PCR es
realizada usando la siguiente condición: 1) 95ºC durante 3 min:
desnaturalización, 2) 94ºC durante 30 seg: desnaturalización, 3)
55ºC o 60ºC durante 30 seg: alineamiento, 4) 72ºC durante 2 min:
alargamiento. La fase 2-4 se repite durante 15
ciclos. Productos PCR se separan en geles de agarosa de bromuro de
etidio del 1% y bandas mostrando los tamaños correctos previstos se
cortan de los geles y se purifican usando el equipo de purificación
de ADN GFX (Amersham Pharmacia). Los productos purificados por PCR
se clonan en el vector pCR2.1TOPO según las instrucciones del
fabricante (Invitrogen). Los clones que muestran el perfil de
división de la enzima de restricción correcto se ordenan para
evaluar la secuencia de ADN. El inserto que representa los genes de
\alpha-xilosidasa son liberados del vector
pCR2.1TOPO usando las enzimas de restricción pertinentes. Un vector
de expresión pET11a de E. coli (Novagen) conteniendo un sitio
Ndel (y Xbal) y Xmal se divide con las enzimas de restricción
pertinentes y la parte del vector es purificada como se describe
para los productos de la PCR. Vector e insertos se ligan entre sí
usando el kit Rapid Ligation (Roche) según las instrucciones del
fabricante.
Los productos de la ligadura se transforman en
células TOPIO de E.coli (Invitrogen) mediante la
transformación química o métodos de choque térmico conocidos por las
personas cualificadas. Las células se colocan en placas de cultivo
de medio LB/ampicilina(Amp) durante la noche. Las colonias
individuales se seleccionan de las placas y se dejan crecer durante
la noche en un medio LB/Amp. Los plásmidos pET purificados de cada
colonia se seleccionan para la presencia de insertos correctos
usando enzimas de división de restricción y evaluación de tamaños de
los insertos liberados.
Rosetta DE3 de E. Coli (Novagen) se
transforma con plásmidos pET conteniendo los genes de
\alpha-xilosidasa y se coloca en placas en
cloranfenicol(Cam)/Amp LB. Las células de las placas dejadas
durante la noche se resuspenden en medio líquido Cam/Amp LB y se
diluyen a OD_{600} = 0,1. Las células del medio líquido se
propagan hasta OD_{600} = 0,4-0,8. Las células son
equilibradas entonces a una temperatura de 18ºC durante 30 min. y la
inducción de proteínas se induce con 0,5 mM de IPTG durante la noche
a 18ºC. Las células se recolectan y los granulados se resuspenden en
un tampón (p. ej., 25mM Tris HCl pH 7 o 10 mM tampón de fosfato de
potasio pH 7) a una densidad de la célula correspondiente a
OD_{600} =\sim10. Las células se sonican en hielo durante
3-7 veces 15-30 seg con
interrupciones de 30 seg en hielo. El detrito celular se elimina por
centrifugado y los sobrenadantes se ensayan para actividad.
Los sobrenadantes que resultan de sonicación se
evalúan en p-nitrofenilo \alpha-D
xilopiranosido (Sigma) para la presencia de actividad
\alpha-xilosidasa. Enzima cruda se incuba con 5 mM
p-nitrofenilo \alpha-D xilopiranosida a
37ºC durante 1-2 horas en un tampón (p. ej., 10mM de
tampón de potasio pH 7 o un 25 mM de tampón Tris HCl pH 7). Las
enzimas crudas también se ensayan en un fragmento de FVII humano
comprendiendo la glicosilación
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52
(fragmento peptídico que consiste en los residuos de aminoácidos
39-62 de FVII) para evaluar si la enzima puede
dividir los enlaces alfa 1,3 xilosídicos. La incubación con péptido
se realiza durante 3 horas o durante la noche a 37ºC. Las muestras
de péptidos incubadas con o sin \alpha-xilosidasa
son evaluadas entonces por MALDI MS directamente después de la
incubación para evaluar si la enzima puede eliminar cero, uno o dos
azúcares de xilosa del glicopéptido.
Una purificación parcial de la
\alpha-xilosidasa expresada se realiza antes de la
incubación con rFVII. Los sobrenadantes (de aproximadamente
20-50 ml de cultivo celular) obtenidos después de la
disrupción celular en un tampón adecuado (por ejemplo un tampón
fosfato 10mM pH 7). En el caso de enzimas que provienen de
termófilos (por ejemplo tm0308; BH1905, XylS), los sobrenadantes
también se calientan a 50-70ºC durante 30 min, se
enfrían en hielo durante 10 min y se elimina el precipitado por
centrifugado durante 15 min a 15.000 G para eliminar contaminantes
termolábiles de E. coli..
Los sobrenadantes son estériles filtrados y
aplicados a una columna 1 ml DEAE FF (Amersham Pharmacia). La
purificación se realiza con el sistema FPLC AKTA explorer (Amersham
Pharmacia) con los tampones siguientes: tampón A: 25 mM fosfato de
sodio pH 7, tampón B: 25 mM fosfato de sodio pH 7 y 1 M NaCl.
Después de cargar la aplicación, la muestra no unida se lava con
tampón A durante 5 CV. Un gradiente del 0-100% de
tampón B se usa durante 20 CV durante el cual la proteína objetivo
se eluye en fracciones. Después de la purificación, las fracciones
comprendiendo el valor máximo principal en el cromatograma
resultante se evalúan por incubación en p-nitrofenilo
\alpha-D xilopiranosido o por SDS PAGE. Las
fracciones conteniendo la actividad
\alpha-xilosidasa se diluyen en un tampón 20 mM
Tris HCl pH 7, 2 mM CaCl_{2} y se concentran en 50.000 columnas de
MWCO Vivaspin 20 (Vivascience) por centrifugado a 2900 rpm.
Las O-glicoformas de rFVIIa
exclusivamente con glucosa en serina 52 se obtienen a partir de la
incubación de rFVIIa en un tampón apropiado, p. ej.
glicil-glicina o 20 mM de Tris HCl pH 7,0, 2 mM
CaCl_{2}, con \alpha-xilosidasa purificada
durante un tiempo apropiado, que puede ser determinado
experimentalmente. Espectros de masa visualizando la
desglicosilación se obtienen a partir del análisis de incubaciones
rFVII \alpha-xilosidasa ESI-MS
(Q-STAR).
El resultante rFVIIa remodelado de glicano se
purifica de la enzima \alpha-xilosidasa por
ejemplo por cromatografía de intercambio de aniones o filtración en
gel o combinaciones adecuadas. La pureza de la
O-glicoforma de rFVIIa preparada se verifica por el
mapa de O-glicopéptidos de rFVIIa.
La estrategia arriba mencionada (véase el
ejemplo 2) fue seguida todo el camino hasta una conclusión para
tm0308. El gen putativo de \alpha-xilosidasa de T.
marítima (tm0308) fue amplificado por PCR y clonado en un vector
pET11a de E. coli. tm0308 soluble podría ser obtenido después
de la expresión en una cepa de expresión Rosetta de E. coli
(DE3) y la evaluación de una preparación cruda de TM0308 en un
\alpha-D xilopiranosido
p-nitrofenilo, claramente indicó actividad
\alpha-xilosidasa. La
\alpha-xilosidasa fue parcialmente purificada
usando la cromatografía DEAE FF seguida de la concentración
ascendente por ultrafiltración. La enzima parcialmente purificada
fue incubada con FVII en un tampón 25 mM Tris pH 7, 2 mM CaCl_{2}
a diferentes proporciones de enzima/FVII durante 3 horas a 50ºC o
durante la noche a 37ºC. Controles con composiciones idénticas de
\alpha-xilosidasa y rFVII, a los que fue añadido
sustrato sintético, mostraron que la enzima fue activa en estas
condiciones y fue posible visualizar FVII con y sin tratamiento de
xilosidasa en geles de SDS y por ESI-MS. No
obstante, ninguna eliminación significante de los azúcares de xilosa
ligados a Glc-O- Ser52 se pudo detectar en este
primer experimento. Por el contrario, la eliminación de xilosa de un
péptido FVIIa purificado reducido y alquilado comprendiendo
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52
fue observado.
Los constructos siguientes han sido clonados en
los vectores de expresión pET conforme a la estrategia descrita en
el ejemplo 2: gen bl02681(2310 bp)(Bacillus
licheniformis: H); gen bl1905 (2328 bp)(Bacillus
halodurans: H), gen xyIS (2196 bp)(Sulfolobus
solfataricus: P); gen yicl (2319 bp) (Escherichia coli:
P). Los constructos serán expresados en Rosetta, aislados,
purificados, y evaluados para actividad
\alpha-xilosidasa conforme a la estrategia
descrita anteriormente.
Cada \alpha-xilosidasa será
incubada con rFVIIa en un tampón apropiado, p. ej.
glicil-glicina o 20 mM Tris HCl pH 7.0, 2 mM
CaCl_{2}, para un tiempo apropiado que puede ser determinado
experimentalmente y espectros de MS visualizando la desglicosilación
serán obtenidos mediante el análisis de incubaciones rFVII
\alpha-xilosidasa
ESI-LC-MS
(Q-STAR).
El resultante rFVIIa remodelado glicano será
purificado de la enzima \alpha-xilosidasa por
ejemplo por cromatografía de intercambio de aniones o filtración en
gel o combinaciones adecuadas de étas. La pureza de la
O-glicoforma de rFVIIa preparada se verifica por el
mapa de O-glicopéptidos de rFVIIa.
La estructura cristalina de Yicl se resolvió
recientemente. Así, la clonación de una enzima
\alpha-xilosidasa truncada representando un
dominio activo, catalítico de la proteína yicl (u otras
\alpha-xilosidasas similares) puede ser posible y
está en proyecto, como una enzima más pequeña, si activa, puede
acceder mejor el
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52
presente en rFVIIa nativo. Un dominio comprendiendo el sitio activo
en la enzima está previsto de la estructura. La secuencia de genes
codificando esta parte de la secuencia Yicl está preparada a partir
del plásmido Yicl pET11a ya existente para un ejemplo por
amplificación de PCR de áreas pertinentes del gen Yicl, los
cebadores usados para PCR tendrán extensiones con sitios de enzima
de restricción que pueden ser usadas para ligadura del gen Yicl
truncado en el vector pET11a. La enzima truncada, después de
expresión y purificación, será evaluada para su potencial para la
desglicosilación de rFVIIa como se ha descrito anteriormente.
\global\parskip0.900000\baselineskip
La enzima,
UDP-D-xilosa:
\beta-D-glucósido
\alpha-1,3-D-xilosiltransferasa,
puede ser obtenida a partir de células HepG2 como se describe por
Omichi et al. (1997). En breve, las células HepG2 se dejan
crecer en un medio suplementado con el 10% de suero fetal de
ternera. La fracción microsómica se prepara por homogenización de
las células seguida de centrifugado. La enzima
\alpha-xilosiltransferasa se purifica por
cromatografía, por ejemplo en una columna de intercambio de aniones
y/o en otras columnas cromatográficas conocidas para el experto en
la materia. Las fracciones se recogen durante la elución y las
fracciones conteniendo la enzima
\alpha-xilosiltransferasa se identifican usando el
ensayo de \alpha-xilosiltransferasa.
La enzima,
UDP-D-xilosa:
\alpha-D-xilósido
\alpha1,3-xilosiltransferasa, puede ser preparada
a partir de células HepG2 como se describe por Minamida et
al. (1996). En breve, células HepG2 se crecen en un medio
suplementado el 10% de suero fetal de ternera. La fracción
microsomal se prepara por homogenización de las células seguida de
centrifugado. La enzima \alpha-xilosiltransferasa
se purifica por cromatografía, por ejemplo en una columna del
intercambio de aniones y/o en otras columnas cromatográficas
conocidas para el experto en la materia. Las fracciones se recogen
durante la elución y las fracciones conteniendo la enzima
\alpha-xilosiltransferasa se identifican usando el
ensayo de \alpha-xilosiltransferasa.
Los ensayos de
\alpha-xilosiltransferasa se realizan en un tampón
apropiado, p. ej. 10 mM Hepes, pH 7,2, el 0,1% de Tritón
X-100, 0,5 mM UDP-xilosa (Sigma
U5875), conteniendo un sustrato adecuado, p. ej. los
O-glicopéptidos que pueden ser obtenidos a partir
del mapa de O-glicopéptidos de rFVIIa o los
oligosacáridos piridilaminados preparados como se describe en
Minamida et al. (Minamida et al., Detection of
UDP-D-xylose:
\alpha-D-xyloside
\alpha1-3xylosyltransferase activity in human
hepatoma cell line HepG2. J. Biochem. 120 1002-1006,
1996). La reacción se detiene después de un tiempo apropiado, que
puede ser determinado experimentalmente, p. ej. por la adición de
ácido trifluoroacético, y las mezclas de ensayo son analizadas por
HPLC.
Las O-glicoformas de rFVIIa
exclusivamente con xilosa-glucosa en serina 52 se
obtienen a partir de (1) tratamiento de rFVIIa con xilosidasa como
se ha descrito anteriormente, (2) purificación de rFVIIa tratado con
xilosidasa de la xilosidasa por ejemplo por cromatografía de
intercambio de aniones, y (3) por incubación de rFVIIa tratado con
xilosidasa en un tampón apropiado, p. ej.
glicil-glicina, pH 7,0, 10 mM cloruro de calcio, con
UDP-D-xilosa purificada:
P-D-glucósido
\alpha-1,3-D-xilosiltransferasa
y UDP-D-xilosa durante un tiempo
apropiado, que puede ser determinado experimentalmente. El
resultante rFVIIa glico-remodelado se purifica de
la UDP-D-xilosa: enzima
\alpha-D-glucósido
\alpha-1,3-D-xilosiltransferasa
por ejemplo por cromatografía de intercambio de aniones. La pureza
de la O-glicoforma de rFVIIa preparada se verifica
por el mapa de O-glicopéptidos de rFVIIa.
Las O-glicoformas de rFVIIa con
xilosa-xilosa-glucosa en serina 52
son obtenidas a partir de (1) tratamiento de rFVIIa con xilosidasa
como se ha descrito anteriormente, (2) purificación del rFVIIa
tratado con xilosidasa de la xilosidasa por ejemplo por
cromatografía de intercambio de aniones, (3) otro tratamiento con
UDP-D-xilosa:
\alpha-D-glucósido
\alpha-1,3-D-xilosiltransferasa
y UDP-D-xilosa como se ha descrito
anteriormente, y (4) por incubación del producto en un tampón
apropiado, p. ej. glicil-glicina, pH 7,0, 10 mM
cloruro de calcio, con UDP-D-xilosa
purificada: \alpha-D-xilósido
\alpha1,3-xilosiltransferasa y
UDP-D-xilosa durante un tiempo
apropiado, que puede ser determinado experimentalmente. El
resultante rFVIIa glico-remodelado se purifica de la
UDP-D-xilosa: enzima
\alpha-D-xilósido
\alpha1,3-xilosiltransferasa por ejemplo por
cromatografía de intercambio de aniones. La pureza de la
O-glicoforma de rFVIIa preparada se verifica por el
mapa de O-glicopéptidos de rFVIIa.
El contenido relativo de las
O-glicoformas de rFVIIa se determina por mapeo de
péptidos trípticos de la cadena ligera de rFVIIa. El rFVIIa es
reducido y alquilado y la cadena ligera de rFVIIa se purifica en una
columna RP-HPLC eluida con un gradiente de
acetonitrilo en agua: ácido trifluoroacético. La cadena ligera de
rFVIIa purificada se cambia de tampón al tampón Tris, pH 7,5 y se
digiere con tripsina. El digesto tríptico de la cadena ligera de
rFVIIa se analiza en una columna RP-HPLC (por
ejemplo Nucleosil C18, 5 \mu, 300 A, 4,0 x 250 mM,
Macherey-Nagel 720065) eluida con un gradiente de
acetonitrilo (0%-45% de acetonitrilo en 100 min) en agua: ácido
trifluoroacético (véase la figura 2). El flujo es 1,0 ml/min y la
detección es UV a 215 nm.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los valores máximos conteniendo los
O-glicopéptidos de rFVIIa se eluyen después de
aprox. 60-65 min donde el primer y el tercer valor
máximo contienen O-glicopéptidos con una
xilosa-xilosa-glucosa ligada a
serina 52, y el segundo y cuarto valor máximo contienen
O-glicopéptidos con una glucosa ligada a serina
52.
De forma similar, el primer y el segundo valor
máximo contienen O-glicopéptidos con un
tetrasacárido ligado a serina 60, y el tercer y el cuarto valor
máximo contienen O-glicopéptidos con una fucosa
ligada a serina 60.
El modelo de O-glicoformas puede
ser analizado por mapeo de péptidos trípticos de rFVIIa. El rFVIIa
se cambia de tampón al tampón Tris, pH 7,5, y se digiere con
tripsina. El digesto tríptico del rFVIIa se analiza en una columna
RP-HPLC (por ejemplo Nucleosil C18, 5 \mu, 300
\ring{A}, 4,0 x 250 mM, Macherey-Nagel 720065) se
eluye con un gradiente de acetonitrilo (0%-45% de acetonitrilo en
100 min) en agua: ácido trifluoroacético. El flujo es 1,0 ml/min y
la detección es UV a 215 nm.
Los valores máximos conteniendo los
O-glicopéptidos de rFVIIa se eluyen después de
aprox. 67-70 min donde el segundo valor máximo
contiene O-glicopéptidos con una
xilosa-xilosa-glucosa ligada a
serina 52, y el primer valor máximo contiene
O-glicopéptidos con una glucosa ligada a serina
52.
El modelo de O-glicoformas puede
ser analizado por análisis de la masa total de rFVIIa. El rFVIIa se
desala en una columna Millipore ZipTip C4 equilibrada con el 1% de
ácido fórmico y se eluye con el 3% de ácido fórmico en el 90% de
metanol. La muestra eluida se analiza por la técnica de nanospray en
un espectrómetro de masas Qstar XL.
El valor máximo más importante a aproximadamente
50500 Da representa O-glicoformas de rFVIIa con una
glucosa ligada a serina 52 y el valor máximo más importante a
aproximadamente 50800 Da representa O-glicoformas de
rFVIIa con una xilosa-xilosa-glucosa
ligada a serina 52.
Glc-O-Ser52-FVII
y
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII
fue purificado usando dos ciclos de cromatografía de interacción
hidrofóbica (HIC). La columna (1,0 cm en diámetro interno x 7,0 cm
longitud = 5,5 ml volumen de columna (CV)) embalado con Toso Haas
TSK-Gel fenilo 5 PW, fue equilibrada con 5 CV 10 mM
histidina, 10 mM CaCl_{2}, 2,0 M NH4-acetato, pH
6,0. La columna fue cargada con aproximadamente 2,5 mg de FVII pr.
mi resina. A la solución de carga, 2,0 M
NH4-acetato y 10 mM CaCl_{2} fueron añadidos antes
de la carga. La columna fue lavada con 5 CV 10 mM histidina, 10 mM
CaCl_{2}, 2,0 M NH4-acetato, pH 6,0. La elución
fue realizada usando un gradiente lineal 20 CV de 10 mM histidina,
10 mM CaCl_{2}, 2,0 m NH4-acetato, pH 6,0 a 10 mM
histidina, 10 mM CaCl_{2}, pH 6,0. La purificación fue rea-
lizada a una velocidad de flujo de 6 CV/h y a una temperatura de 5ºC. Fracciones fueron recogidas durante la elución.
lizada a una velocidad de flujo de 6 CV/h y a una temperatura de 5ºC. Fracciones fueron recogidas durante la elución.
El FVII eluido en dos valores máximos más
importantes de superposición (véase la figura 4: cromatograma de
primer ciclo HIC). Fracciones conteniendo el primer valor máximo
fueron agrupadas (fracción "A", figura 4) y nuevamente
purificadas por un segundo ciclo de HIC, usando el mismo
procedimiento cromatográfico en cuanto al primer ciclo HIC (véase la
figura 5: cromatograma obtenido a partir de recargar la fracción
"A" sobre la columna HIC). Las fracciones conteniendo el
segundo valor máximo más importante (fracción "B", figura 4)
fueron agrupadas también y nuevamente purificadas por un segundo
ciclo de HIC, usando el mismo procedimiento cromatográfico en cuanto
al primer ciclo HIC (véase la figura 6: cromatograma obtenido
recargando la fracción "B" sobre la columna HIC).
Glc-O-Ser52-FVII
purificado fue identificado en la fracción del valor máximo,
fracción 10 (figura 5), obtenida recargando la fracción "A"
sobre la segunda fase HIC.
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVII
purificado fue identificado en la fracción del valor máximo,
fracción 15 (figura 6), obtenida recargando la fracción "B"
sobre la segunda fase HIC. La IDENTIFICACIÓN se obtuvo por mapeo de
péptidos trípticos de rFVIIa como se describe en el ejemplo 7
(figuras 7A y 7B) y por análisis de la masa total de rFVIIa como se
describe en el ejemplo 7 (figuras 8A y 8B). Ambos análisis han
mostrado un alto contenido de
Glc-O-Ser52-rFVIIa y
un bajo contenido de
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa
en la fracción del valor máximo, fracción 10, y un contenido bajo de
Glc-O-Ser52-rFVIIa y
un alto contenido de
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa
en la fracción del valor máximo, fracción 15. Una cuantificación del
contenido de las O-glicoformas en las dos fracciones
del valor máximo no pudo ser obtenida debido a un contenido de
rFVIIa relativamente bajo en las fracciones (figuras 7A y 7B: mapeo
de péptidos trípticos: otros fragmentos de péptidos de rFVIIa
coeluidos con o eluidos cerca de los
O-glicopéptidos, y el contenido de
O-glicopéptidos en cantidades bajas por tanto no
pudo ser determinado.) (Las figuras 8A y 8B: análisis de la masa
total: otros O- y/o N-glicoformas de rFVIIa, por
ejemplo N-glicoformas de rFVIIa carentes de un ácido
N-acetilneuramínico, aparecieron en los espectros de
masa, y el contenido de O-glicoformas de rFVIIa en
cantidades bajas por tanto no pudo ser determinado).
Las actividades específicas de las fracciones
del valor máximo obtenidas del HIC (tabla 1) fueron determinadas por
el ensayo de la coagulación de primera generación. Se descubrió que
la
Glc-O-Ser52-rFVIIa
O-glicoforma tuvo una baja actividad específica
mientras la O-glicoforma de
Xyl-Xyl-Glc-OrSer52-rFVIIa
tuvo una alta actividad específica.
Preparaciones de
Glc-O-Ser52-rFVIIa
altamente purificadas y preparaciones de
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa
altamente purificadas pueden ser obtenidas por purificación repetida
en la cromatografía de interacción hidrofóbica como se ha descrito
anteriormente. Preparaciones de
Glc-O-Ser52-rFVIIa y
de
Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa
altamente purificadas con un contenido de rFVIIa más alto pueden ser
obtenidas mediante el aumento de la cantidad de materia prima para
la cromatografía de interacción hidrofóbica realizada como se ha
descrito anteriormente. El contenido de cada
O-glicoforma de rFVIIa en las preparaciones
altamente purificadas con un contenido de rFVIIa más alto puede ser
cuantificado por mapeo de péptidos trípticos de la cadena ligera de
rFVIIa como se describe en el ejemplo 7. Las actividades específicas
de las preparaciones altamente purificadas pueden ser determinadas
por el ensayo de coagulación de primera generación como se ha
mencionado anteriormente.
\vskip1.000000\baselineskip
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Claims (26)
1. Preparación de un polipéptido del factor VII
conteniendo un motivo
Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys
y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente
Glc-O-Ser/Thr, donde la preparación
contiene un modelo de glicosilación ligado a serina/treonina que es
uniforme al menos en un 80%.
2. Preparación según la reivindicación 1, donde
el modelo de glicosilación es uniforme al menos en un 85%,
preferiblemente al menos en un 90%, al menos en un 95%, o al menos
uniforme en un 98%.
3. Preparación según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde el glicano ligado a serina/treonina es
Xyl-Xyl-Glc-.
4. Preparación según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde el glicano ligado a serina/treonina es
Xyl-Glc-.
5. Preparación según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, donde el glicano ligado a serina/treonina es
Glc-.
6. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde la glicoproteína es el
factor VII humano.
7. Preparación según cualquiera de las
reivindicaciones 1-5, donde la glicoproteína es una
variante del factor VII y donde la proporción entre la actividad de
la variante del factor VII y la actividad del factor humano VIIa
nativo (FVIIa de tipo salvaje) es al menos aproximadamente 1,25
cuando se evalúa en el "ensayo de hidrólisis in vitro" o
en el "ensayo de proteólisis in vitro", ambos como se
describe en la presente descripción, preferiblemente al menos
aproximadamente 2,0, o al menos aproximadamente 4,0.
8. Método para producir una preparación como se
describe en las reivindicaciones 1 a 7, donde el glicano ligado a
serina/treonina es -Glc; el método comprendiendo las fases de:
- (a)
- obtención de una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr de una célula en la que está preparada; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o por aislamiento de la glicoproteína de una fuente natural;
- (b)
- contacto de la preparación obtenida en la fase (a) con una \alpha-xilosidasa en condiciones apropiadas para la eliminación de residuos de xilosa de la glicoproteína, produciendo de este modo la glicoproteína con un modelo de glicosilación alterado.
9. Método según la reivindicación 8, incluyendo
además la fase de aislamiento de la glicoproteína preparada en la
fase (b) con una glicosilación de la
glucosa-O-serina/treonina.
10. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 8-9, donde la glicosilación es una
glicosilación de la serina.
11. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 8-10, incluyendo además la fase de
análisis de la estructura de los oligosacáridos ligados a los
polipéptidos para determinar un modelo de la glicoforma, y,
opcionalmente, repetir la fase (b) hasta que el modelo de glicoforma
deseado sea conseguido.
12. Método para producir una preparación como se
describe en las reivindicaciones 1-7, donde el
glicano ligado a serina/treonina es Glc; el método comprendiendo las
fases de:
- (a)
- obtención de una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys, p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o por aislamiento de la glicoproteína de una fuente natural;
- (b)
- contacto de la preparación obtenida en la fase (a) con una O-glucosiltransferasa y un donante de glucosa activado en condiciones apropiadas para transferir un residuo de glucosa de la fracción donante de glucosa a la fracción aceptora de serina/treonina, produciendo de este modo el polipéptido con un modelo de glicosilación alterado.
13. Método según la reivindicación 12,
incluyendo además la fase de aislamiento de la glicoproteína
preparada en la fase (b) con una glicosilación de
glucosa-O-serina/treonina.
14. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12-13, donde la glicosilación es
una glicosilación de la serina.
15. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 12-14, incluyendo además la fase de
análisis de la estructura de los oligosacáridos ligados a los
polipéptidos para determinar un modelo de la glicoforma, y,
opcionalmente, repetir la fase (b) hasta que el modelo de la
glicoforma deseado sea conseguido.
16. Método para producir una preparación como se
describe en las reivindicaciones 1-7, donde el
glicano ligado a serina/treonina es Xyl- Glc-; el método
comprendiendo las fases de:
- (a)
- obtención de una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o por aislamiento de la glicoproteína de una fuente natural;
- (b)
- contacto de la preparación obtenida en la fase (a) con UDP-D-xilosa: \beta-D-glucósido \alpha-1,3-D-xilosiltransferasa y un donante de xilosilo activado en condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa de la fracción donante de xilosa a la fracción aceptora, produciendo de este modo el glicopéptido con un modelo de glicosilación alterado.
17. Método según la reivindicación 16,
incluyendo además la fase de aislamiento de la glicoproteína
preparada en la fase (b) con una glicosilación de
xilosa-glucosa-O-serina/treonina.
18. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 16-17, donde la glicosilación es
una glicosilación de la serina.
19. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 16-18, incluyendo además la fase de
análisis de la estructura de los oligosacáridos ligados a los
polipéptidos para determinar un modelo de glicoforma, y,
opcionalmente, repetición de la fase (b) hasta que el modelo de
glicoforma sea conseguido.
20. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 16-19, incluyendo además la fase de
eliminar residuos de xilosa terminales sometiendo la preparación
obtenida en la fase (a) al método descrito en las reivindicaciones
8-11 antes de la fase (b).
21. Método para hacer una preparación como se
describe en las reivindicaciones 1-7, donde el
glicano ligado a serina/treonina es
Xyl-Xyl-Glc-; el método
comprendiendo las fases de:
- (a)
- obtención de una preparación de un polipéptido del factor VII conteniendo un motivo Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y donde dicha serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr; p. ej., de una célula creada genéticamente (cultivo celular) o por aislamiento de la glicoproteína de una fuente natural;
- (b)
- contacto de la preparación obtenida en la fase (a) con UDP-D-xilosa: \beta-D-glucósido \alpha-1,3-D-xilosiltransferasa y un donante activado de xilosilo en condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa de la fracción de donante de xilosa a la fracción aceptora, produciendo de este modo el glicopéptido con un modelo de glicosilación alterado.
- (c)
- contacto de la preparación obtenida en la fase (b) con UDP-D-xilosa: \beta-D-xilósido \alpha-1,3-xilosiltransferasa y un donante activado de xilosilo en condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa de la fracción donante de xilosa a la fracción aceptora, produciendo de este modo el glicopéptido con un modelo de glicosilación alterado.
22. Método según la reivindicación 21,
incluyendo además la fase de aislamiento de la preparación obtenida
en la fase (b) antes de someter la preparación a la fase (c).
23. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21-22, incluyendo además la fase de
aislamiento de la glicoproteína preparada en la fase (c) con una
glicosilación de
xilosa-xilosa-glucosa-O-serina/treonina.
24. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21-23, donde la glicosilación es
una glicosilación de la serina.
25. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21-24, incluyendo además la fase de
análisis de la estructura de los oligosacáridos ligados a los
polipéptidos para determinar un modelo de glicoforma, y,
opcionalmente, repetición de la fase (b) y/o la fase (c) hasta que
el modelo de glicoforma deseado sea conseguido.
26. Método según cualquiera de las
reivindicaciones 21-25, incluyendo además la fase de
eliminar residuos de xilosa terminales sometiendo la preparación
obtenida en la fase (a) al método descrito en las reivindicaciones
8-11 antes de la fase (b).
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