MXPA06012676A - Glucoformas o-enlazadas de polipeptidos y metodos de fabricacion de los mismos. - Google Patents

Glucoformas o-enlazadas de polipeptidos y metodos de fabricacion de los mismos.

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MXPA06012676A
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Niels Kristian Klausen
Daniel Rasmussen
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Abstract

La presente invencion se refiere a las composiciones que comprenden glucoproteinas que tienen patrones alterados de glucosilacion O-enlazados, en particular el factor VII, factor IX y metodos para la elaboracion de estos.

Description

GLUCOFORMAS O-ENLAZADAS DE POLIPEPTIDOS Y MÉTODOS DE FABRICACIÓN DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las composiciones que comprenden glucoproteínas que tienen patrones alterados de glucosilación O-enlazada, en particular el factor VII, el factor IX y otros factores de la coagulación sanguínea. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La actividad biológica de muchas glucoproteínas es altamente dependiente de la presencia o ausencia de estructuras oligosacáridas particulares enlazadas a la glucoproteína. El patrón de glucosilación de una glucoproteína terapéutica puede afectar numerosos aspectos de la eficacia terapéutica tal como, por ejemplo, la solubilidad, resistencia al ataque proteolítico, inactivación térmica, inmunogenicidad, vida media, bioactividad, biodisponibilidad y estabilidad. La glucosilación es una modificación post-transicional compleja que es dependiente de las células. Después de la traducción, las proteínas son transportadas hacia el retículo endoplásmico (ER) , glucosiladas y enviadas al aparato de Golgi para el procesamiento posterior y la dirección al objetivo y/o secreción subsiguientes. Durante la Ref.: 177231 glucosilación, son formadas ya sea las glucoproteínas N-enlazadas u O-enlazadas. Las proteínas séricas involucradas en la coagulación o en la fibrinólisis, que incluyen, por ejemplo, el factor VII y el factor IX están probando ser agentes terapéuticos útiles para tratar una variedad de condiciones patológicas. En consecuencia, existe una necesidad cada vez mayor para formulaciones que comprenden estas proteínas, que sean farmacéuticamente aceptables y que muestren eficacia uniforme y clínica predeterminada. Debido a muchas de las ventajas del uso del plasma humano, una fuente de productos farmacéuticos, se prefiere producir las proteínas en sistemas recombinantes. Las proteínas de la coagulación, no obstante, están sometidas a una variedad de modificaciones co- y post-traduccionales, incluyendo, por ejemplo, la glucosilación enlazada a la asparagina (N-enlazadas) ; la glucosilación enlazada a la serina o treonina (O-enlazadas) ; y la ?-carboxilación de los residuos de glu. Estas modificaciones pueden ser cualitativas o cuantitativamente diferentes cuando son utilizadas células heterólogas como hospederos para la producción a gran escala de las proteínas. En particular, la producción en las células heterólogas a menudo da como resultado un arreglo diferente de glucoformas, cuyos polipéptidos idénticos están teniendo diferentes estructuras oligosacáridas covalentemente enlazadas, diferentes. En diferentes sistemas, las variaciones en la estructura oligosacárida de las proteínas terapéuticas ha sido vinculada a, entre otras cosas, a los cambios en la inmunogenicidad y en el despejo in vivo. De este modo, existe una necesidad en la técnica para composiciones y métodos que proporcionan preparaciones de glucoproteína, particularmente preparaciones que comprenden el factor IX recombinante o el factor VII humano recombinante, o el factor VII modificado, o polipéptidos relacionados al factor VII, que contienen patrones de glucoformas predeterminados. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las preparaciones que comprenden los polipéptidos que muestran patrones predeterminados de glucoformas enlazadas a la serina o a la treonina. Las preparaciones son al menos aproximadamente 80% homogéneas, con respecto a los glicanos enlazados o a las cadenas oligosacáridas, al menos aproximadamente 90%, o al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% homologas. Como se utiliza en la presente, un patrón de glucoformas se refiere a la distribución dentro de la preparación, de las cadenas oligosacáridas que tienen estructuras variantes que son covalentemente enlazadas a un residuo de serina o treonina localizado en un dominio similar a EGF en la cadena principal de aminoácidos del polipéptido. En una aspecto, la invención proporciona una preparación de una glucoproteína que contiene una porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y en donde las formas de serina/treonina forman parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr, conteniendo dicha preparación un patrón sustancialmente uniforme de glucosilación enlazada a la serina/treonina. En una modalidad de la invención, el patrón de glucosilación es de al menos 80% uniforme, preferentemente al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 98% uniforme. En una modalidad, los glicanos enlazados a la serina/treonina son Xyl-Xyl-Glc- ; en otra modalidad más, los glicanos son Xyl-Glc,• en otra modalidad más, los glicanos son Glc-. En diversas modalidades, las glucoproteínas son seleccionadas del grupo de polipéptidos del factor VII, polipéptidos relacionados al factor VII, polipéptidos del factor IX, polipéptidos del factor X, polipéptidos del factor XII, y polipéptidos de la proteína Z. En una modalidad preferida, la glucoproteína se selecciona del grupo de: factor humano VII, variantes de la secuencia del factor VII, el factor IX humano y variantes de la secuencia del factor IX. En una modalidad, la glucoproteína es una variante del factor VII, en donde la proporción entre la actividad de la variante del factor VII y la actividad del factor humano nativo VII (FVIIa del tipo silvestre) es al menos de aproximadamente 1.25, cuando se prueba, en el "Ensayo de hidrólisis in vitro" como se describe en la presente descripción, preferentemente al menos aproximadamente 2.0, o al menos aproximadamente 4.0. En otro aspecto más, la invención proporciona los métodos para elaborar las preparaciones de glucoproteínas que contienen porciones Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y en donde la serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr, contiendo dichas preparaciones un patrón de glucosilación enlazado a serina/treonina, sustancialmente uniforme. Los métodos son útiles para remodelar o alterar el patrón de glucosilación presente sobre una glucoproteína después de su expresión inicial. Más particularmente, la presente invención proporciona una metodología enzimática general para la modificación de los glicanos (en particular glicanos 0-enlazados) de la glucoproteínas, con el fin de mejorar o aumentar sus propiedades farmacéuticas . Un método involucra el tratamiento de glucoproteína con xilosidasas, con el fin de eliminar cualesquiera residuos de xilosas terminales; otros métodos incluyen el enlace de los residuos de xilosa a los residuos expuestos de glucosa o xilosa sobre la glucoproteína, mediante el tratamiento con xilosiltransferasas; un tercer método incluye el enlace de los residuos de glucosa a los residuos de aminoácidos serina y/o treonina, en la cadena principal polipeptídica, con lo cual se crea un polipéptido glucosilado. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la glucosilación de la serina 52 del factor VII de tipo silvestre (wt-factor VII) . La figura 2 muestra un mapeo de la O-glucosilación del factor VII. La figura 3 muestra un esquema de reacción para elaboración de una preparación de glucoproteínas que muestran una glucosilación predeterminada enlazada a la serina/treonina . La figura 4 muestra un cromatograma a partir del primer ciclo HIC que muestra las fracciones "A" y "B" . La figura 5 muestra un cromatograma obtenido mediante la recarga de la fracción "A" sobre la columna HIC; Glc-0-Ser52-FVII fue identificada en la fracción pico, fracción 10. La figura 6 muestra un cromatograma obtenido mediante la recarga de la fracción "B" sobre la columna HIC; Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52-FVII fue identificada en la fracción pico, fracción 15. La figura 7A muestra un mapa de péptido tríptico de la fracción pico, fracción 10; la flecha indica el 0-glucopéptido Glc-0-Ser52. La figura 7B muestra un mapa de péptido tríptico de la fracción pico, fracción 15; la flecha indica el 0-glucopéptido Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52. La figura 8A muestra un análisis de masa total de la fracción pico, fracción 10; la flecha indica el 0-glucofor a Glc-0-Ser52-rFVIIa. La figura 8B muestra un análisis de masa total de la fracción pico, fracción 15; la flecha indica el 0-glucoforma Xyl-Xyl-Glc-O-rFVIIa. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se utilizan en la presente las siguientes abreviaturas : Glc = glucosilo Xyl = xilosilo Ser = serina (código de una letra: S) Thr = treonina (código de una letra: T) Pro = prolina (código de una letra: P) Cys = cisteína (código de una letra: C) FVII = Factor VII FVIIa = activado (dos cadenas) Factor VII FIX = Factor IX FlXa = activado (dos cadenas) Factor IX Como se utiliza en la presente, un "patrón de glucoforma" (o "patrón de glucosilación") se refiere a la distribución dentro de la preparación de las cadenas de oligosacárido que tienen estructuras variantes que están covalentemente enlazadas a un residuo de serina o de treonina, localizado en la cadena principal de aminoácidos del polipéptido. La "homogeneidad" se refiere a la consistencia estructural a través de una población de polipéptidos con glicanos conjugados. De este modo, se dice que una preparación de glucoproteína es de aproximadamente 100% homologa si todas las moléculas de glucoproteína contenidas contienen glicanos idénticos enlazados en el ciclo de glucosilación relevante. Por ejemplo, una preparación de los polipéptidos del factor VII se dice que es al menos 90% homologa hacia al menos 90% de las moléculas polipeptídicas, del factor VII contienen el glicano de interés enlazado a la serina 52 (por ejemplo, Xyl-Xyl-Glc-O- Ser52). "Glucoformas sustancialmente uniformes" o "glucosilación sustancialmente uniforme" o "patrón de glucosilación sustancialmente uniforme" cuando se hace referencia a una especie de glucopéptido, se refiere al porcentaje de porciones aceptores, por ejemplo, los residuos de serina o treonina, que son glucosilación por el glicano que interés. Por ejemplo, en el caso del factor VII, los patrones de glucosilación sustancialmente uniformes existen si sustancialmente todos (como se define más adelante) los residuos de serina en la posición 52 están glucosilados con los glicanos de interés. Es comprendido por una persona de experiencia en la técnica que el material inicial puede contener residuos glucosilados de serina y/o treonina que están glucosilados con una especie que tiene la misma estructura que el glicano de interés. De este modo, la glucosilación porcentual calculada incluye los residuos de serina/treonina que está glucosilado con el glicano de interés de acuerdo a la invención, así como aquellos residuos de serina/treonina ya glucosilados con el glicano de interés en el material inicial. El término "sustancial" se pretende que signifique que al menos aproximadamente 80%, tal como al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 98% de los residuos de serina/treonina de la glucoproteína estén glucosilados con un glicano específico predeterminado, o con el glicano de interés. El patrón de glucosilación es típicamente determinado por uno o más métodos conocidos por aquellos expertos en la materia, tales como, por ejemplo, la digestión tríptica seguida por la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) , cromatografía liquida-espectrometría de masa (LC-MS, por sus siglas en inglés) , espectrometría de tiempo de vuelo de masa de deserción por láser, asistida por matriz (MALDITOF, por sus siglas en inglés) , electroforesis capilar, y similares. El término "porción aceptora" está destinado a abarcar el grupo o porción al cual es transferido un grupo oligo-monosacárido deseado tal, sin limitación el residuo de serina/treonina localizado dentro de la porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys, un residuo Glc covalentemente enlazado a un residuo de serina/treonina, o un residuo Xyl covalentemente enlazado a un residuo Glc o un residuo Xyl en una porción Glc-O-Ser/Thr o Xyl-Glc-O-Ser/Thr, respectivamente . El término "porción donadora de sacáridos" está destinado a abarcar una molécula donadora de sacárido, activada (por ejemplo, una estructura oligo- o mono-sacárida adecuada tal, por ejemplo, un xilosil-xilosil-donador, xilosil-donador, o glucosil-donador) que tiene un grupo saliente (por ejemplo, xilosa-UDP o glucosa-UDP) adecuado para la porción donadora que actúa como un sustrato para la enzima catalizadora relevante (por ejemplo, glucosiltransferasa, xilosidasa o xilosil-transferasa) . Los oligosacáridos son considerados como poseedores de un extremo reductor y uno no reductor, ya sea que el sacárido en el extremo reductor sea o no de hecho un azúcar reductor. De acuerdo con la nomenclatura aceptada, los oligosacáridos son descritos en la presente con el extremo no reductor a la izquierda y el extremo reductor a la derecha (por ejemplo, Xyl-Xyl-Glc-O-Ser) . Polipéptidos que contienen el dominio EGF El término "polipéptidos que contienen el dominio EGF" está destinado a abarcar los péptidos, oligopéptidos y polipéptidos que contienen uno o más dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF, por sus siglas en inglés) . Los dominios de EGF o repeticiones de EGF son porciones pequeñas de aproximadamente 40 aminoácidos, definidos por 6 cisteínas conservadas que forman tres enlaces disulfuro. Los polipéptidos que contienen el dominio EGF contienen todos una secuencia de consenso para la modificación de la O-glucosa: Cysl-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys2 (por ejemplo, una secuencia de consenso Cysl-Xl-Ser-X2-Pro-Cys2 o una Cysl-Xl-Thr-X2-Pro-Cys2 ) donde Cysl y Cys2 son la primera y segunda cisteínas conservadas de la repetición de EGF y Xl y X2 independientemente es cualquier aminoácido. El término "glucoproteína" está destinado a abarcar los polipéptidos que contienen el dominio EGF que contienen uno o más glicanos enlazados a uno o más residuos de aminoácidos de serina/treonina del dominio EGF localizado en la secuencia de aminoácidos de cadena principal del polipéptido. Como se utiliza en la presente el termino "glicano" o intercambiable, "cadena de azúcar" "cadena de oligosacárido" o "porción oligosacárida" se refiere a la estructura oligosacárida completa que está covalentemente enlazada a un residuo simple de serina/treonina. El glicano puede comprender una o más unidades sacáridas; los ejemplos de glicanos incluyen, por ejemplo Glc-, Xyl-Glc-, y Xyl-Xyl-Glc- . El términOo "sitio de O-glucosilación" está destinado a indicar el sitio de glucosilación en la serina/treonina (por ejemplo, Ser o Thr) localizado dentro de la porción Cysl-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys2 donde Cysl y Cys2 son la primera y segunda cisternas conservadas de la repetición EGF, y Xl y X2 relacionadas independientemente son cualquier aminoácidos. Estos incluyen el sitio de glucosilación en la posición Ser-52 (S52) o wt-FVII humano y los residuos correspondientes en los polipéptidos homólogos, tales como, sin limitación, las variantes de la secuencia de FVII y los polipéptidos de FIX. El término "residuos correspondientes" está destinado a indicar el residuo de aminoácidos Ser o Thr correspondiente al residuo Ser52 del factor VII de tipo silvestre (ver figura 1) cuando las secuencias están alineadas. La homología/identidad de la secuencia de aminoácidos es convenientemente determinada a partir de las secuencias alineadas, utilizando un programa de computadora adecuado para el alineamiento de la secuencia, tal como por ejemplo, un programa ClustalW, versión 1.8, 1999 (Thompson et al., 1994, Nucleic Acid Research, 22: 4673-4680). Por ejemplo, el residuo Ser52 del factor VII de tipo silvestre corresponde al residuo Ser53 de factor IX de tipo silvestre. Se entiende además que las variantes del polipéptido pueden ser creadas conteniendo las porciones Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys de origen no natural, y con esto contener sitios de 0-glucosilación de origen no natural que pueden ser glucosilados de acuerdo con la presente invención. En una modalidad de la invención, el sitio de O-glucosilación es un sitio de glucosilación de serina y la porción es Cysl-Xl-Ser-X2-Pro-Cys2. En otra modalidad más, el sitio de 0-glucosilación es un sitio de glucosilación de treonina y la porción es Cysl-Xl-Thr-X2-Pro-Cys2. El término "glucosa terminal" está destinado a abarcar los residuos de glucosa enlazados a los residuos de azúcar terminal en un glicano, y la cadena de oligosacárido, por ejemplo, el azúcar terminal de cada antena es glucosa. El término "xilosa terminal" está destinado a abarcar los residuos de xilosa enlazados con el residuo de azúcar terminal en un glicano, o cadenas de oligosacárido. Enzimas La O-glucosiltransferasa proteica puede ser preparada como se describe por ejemplo en Shao et al. (Glycobiology 12 (11) : 763-770 (2002)). Las enzimas alfa-xilosidasas pueden ser preparadas, por ejemplo, como se describe por Monroe et al. (Plant Physiology and Biochemistry 41 : 877-885 (2003)). La enzima, UDP-D-xilosa: ß-D-glucósido-a-1, 3-D-xilosiltransferasa puede ser preparada a partir de células HepG2 como se describe en Omichi et al. (Eur. J. Biochem. 245: 143-146 (1997) ) . La enzima, UDP-D-xilosa :a-D-xilósido-al, 3-xilosiltransferasa puede ser preparada a partir de las células HepG2 descritas por Minamida et al. ((J. Biochem. (Tokyo) 120: 1002-1006 (1996)). La UDP-beta-D-glucosa comercialmente disponible, por ejemplo de Sigma (Sigma U4625) . La UDP-D-xilosa es comercialmente disponible, por ejemplo de Sigma (Sigma U5875) . Glucoproteínas La porción: Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys parece ser principalmente encontrada en dominios del factor de crecimiento epidérmico (EGF) de proteína multimodulares tales como los factores de la coagulación y fibrinolíticos . La porción es una secuencia de consenso de la modificación de 0-glucosa, con lo cual se forma un enlace de serina-glucosa (Glc-O-Ser) o treonina-glucosa (Glc-O-Thr) . Los factores de la coagulación VII, IX, X y XII así como la proteína plasmática Z, la fibrilina y la trombospondina han mostrado que contienen la secuencia de consenso Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys. De estos, los factores VII y IX y la proteína Z han sido descritos para contener la secuencia de consenso Cys-Xl-Ser-X2-Pro-Cys. Las trombospondinas son una familia de proteínas extracelulares que participan en la comunicación de célula a célula y de célula a matriz. Las proteínas son secretadas a partir de las plaquetas. Estas' regulan el fenotipo celular durante la génesis y reparación del tejido. La proteína Z es una proteína plasmática dependiente de la vitamina K, cuya estructura es similar a aquella de los factores VII, IX y X. En contraste a estas proteínas, no obstante, la proteína Z no es el zimógeno de una proteasa de serina, debido a que ésta carece de los residuos de His y Ser de la triada catalítica. Ya que las proteínas C y S, la proteína Z participa en la limitación de la respuesta de la coagulación, al parecer al ayudar a la inhibición del factor X activado (FXa) . El factor X (Factor de Stuart Prower) es una proteasa de serina dependiente de la vitamina K que participa en el proceso de coagulación sanguínea al participar en la activación de la protrombina en trombina. El factor XII (factor de Hageman) es un factor de la coagulación sanguínea activado por el contacto con la superficie sub-endotelial de un vaso dañado. Junto con la prekalikreina, éste sirve como factor de contacto que inicia la vía intrínseca de la coagulación sanguínea. La kalikreina activa el factor XII a Xlla. El factor IX (factor de Christmas) es una proteasa de serina dependiente de la vitamina K, que participa en el proceso de coagulación sanguínea al participar en la activación de FX a Fxa. El factor VII (proconvertina) es una proteasa de serina dependiente de la vitamina K que participa en el proceso de coagulación sanguínea, al participar en la activación de la protrombina en trombina. FVII es activado en FVIla por contacto con el factor tisular expuesto (TF) en los sitios de daño de la pared del vaso. Polipéptidos del factor VII y polipéptído relacionados al factor VII Como se utiliza en la presente, los términos polipéptidos del factor VII o "polipéptido de FVII" significa cualquier proteína que comprenda la secuencia de aminoácidos 1-406 del factor Vlla humano de tipo silvestre (por ejemplo, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos descrita en la patente de los Estados Unidos No. 4,784,950), variantes de la misma, así como los polipéptidos relacionados al factor VII, derivados del factor VII y conjugados del factor VII. Este incluye variantes de FVII, polipéptidos relacionados al factor VII, derivados del factor VII y conjugados del factor VII que muestran sustancialmente la misma o una actividad biológica mejorada con relación al factor Vlla humano de tipo silvestre. El término "factor VII" está destinado a abarcar los polipéptidos del factor VII en su forma no escindida (zimógeno), así como aquellos que han sido proteolíticamente procesados para producir sus respectivas formas bioactivas, que pueden ser designadas al factor Vlla. Típicamente, el factor VII es escindido entre los residuos 152 y 153 para producir el factor Vlla. Tales variantes del factor VII pueden mostrar diferentes propiedades con relación al factor VII, incluyendo la estabilidad, enlace del fosfolípido, actividad específica alterada, y similares. Como se utiliza en la presente, "FVIIa humano de tipo silvestre" es un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos descrita en la patente de los Estados Unidos No. 4,784,950. Como se utiliza en la presente, "los polipéptidos relacionados al factor VII" abarcan los polipéptidos, incluyendo variantes, en las cuales, la actividad biológica del factor Vlla ha sido sustancialmente modificada, tal como reducida con relación a la actividad del factor Vlla de tipo silvestre. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el factor Vil o el factor Vlla dentro de los cuales han sido introducidas alteraciones específicas en la secuencia de aminoácidos, que modifican o perturban la bioactividad del polipéptido. El término "derivado del factor VII" como se utiliza en la presente, está destinado a designar un polipéptido de FVII que muestra sustancialmente la misma o mejorada actividad biológica con relación al factor VII de tipo silvestre, en el cual uno o más de los aminoácidos del péptido progenitor han sido genética y/o química y/o enzimáticamente modificados, por ejemplo, mediante alquilación, glucosilación, PEGilación, acilación, formación de éster o formación de amida o similares. Este incluye pero no está limitado al factor Vlla humano PEGilado, el factor Vlla humano cisteína-PEGilado y variantes del mismo. Los ejemplos no limitantes de los derivados del factor VII incluyen los derivados de FVII gluco-PEGilados como se describe en el documento WO 03/31464 y en las solicitudes de patentes de los Estados Unidos Nos. 20040043446, 20040063911, 20040142856, 20040137557, y 20040132640 (Neose Technologies, Inc.); los conjugados de FVII como se describen en los documentos WO 01/04287, solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS) y WO 02/02764, solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030211094 (University of Minnesota). El término "actividad biológica mejorada" se refiere a los polipéptidos de FVII con i) sustancialmente la misma o actividad proteolítica incrementada en comparación al factor Vlla humano de tipo silvestre, recombinante, o ii) a los polipéptidos de FVII sustancialmente con la misma o actividad de enlace al TF incrementada en comparación al factor Vlla humano de tipo silvestre, recombinante, o iii) a los polipéptidos de FVII sustancialmente con la misma o una vida media incrementada en plasma sanguíneo, en comparación al factor Vlla humano de tipo silvestre, recombinante. El término "factor Vlla humano PEGilado" significa el factor Vlla humano, que tiene una molécula de PEG conjugada a un polipéptido del factor Vlla humano. Se entiende que la molécula de PEG puede ser enlazada a cualquier parte del polipéptido del factor Vlla incluyendo cualquier residuo de aminoácido o porción de carbohidrato del polipéptido del factor Vlla. El término "factor Vlla humano cisteína-PEGilado" significa el factor Vlla que tiene una molécula de PEG conjugada a un grupo sulfhidrilo de una cisteína producida en el factor VITa humano. Los ejemplos no limitantes de las variantes del factor VII que tienen sustancialmente la misma o una actividad proteolítica incrementada, en comparación al factor Vlla humano de tipo silvestre, recombinante, incluyen S52A-FVIla, S60A-FVlla (Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); las variantes de FVIIa que muestran estabilidad proteolítica incrementada como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,580,560; el factor Vlla ha sido proteolíticamente escindido entre residuos 290 y 291 o entre los residuos 315 y 316 (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501- 505, 1995); las formas oxidadas del factor Vlla (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); las variantes de FVII como se describe en PCT/DK02/00189 (correspondientes WO 02/077218), y las variantes FVII que muestran estabilidad proteolítica incrementada como se describe en WO 02/38162 (Scripps Research Institute) ; las variantes de FVII que tienen un dominio de Gla modificado que muestran un enlace membranal mejorado como se describe en WO 99/20767, las patentes de los Estados Unidos Nos. 6017882 y 6747003, solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030100506 (University of Minnesota) y WO 00/66753, solicitudes de patentes de los Estados Unidos Nos. 20010018414, 2004220106, y 200131005, patentes de los Estados Unidos Nos. 6762286 y US 6693075 (University of Minnesota) ; y las variantes FVII como se describen en WO 01/58935, la patente de los Estados Unidos Nos. 6806063, la solicitud de patente de los Estados Unidos No. 20030096338 (Maxygen ApS), WO 03/93465 (Maxygen ApS), WO 04/029091 (Maxygen ApS), WO 04/083361 (Maxygen ApS), y WO 04/111242 (Maxygen ApS) , así como en WO 04/108763 (Canadian Blood Services) . Los ejemplos no limitantes de variantes de FVII que tienen actividad biológica incrementada en comparación a FVII de tipo silvestre, incluyen variantes FVII como se describe en los documentos WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (correspondiente a WO 03/027147), solicitud de patente Danesa PA 2002 01423 (correspondiente a WO 04/029090), solicitud de patente Danesa PA 2001 01627 (correspondiente a WO 03/027147); WO 02/38162 (Scripps Research Institute) ; y las variantes de FVIIa con actividad mejorada como se describe en JP 2001061479 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.). Ejemplos de variantes del factor VII incluyen, sin limitación, L305V-FVII, L305V/M306D/D309S-FVII, L305I-FVII, L305T-FVII, F374P-FVII, V158T/M298Q-FVII, V158D/E296V/M298Q-FVII , K337A-FVII, M298Q-FVII, V158D/M298Q-FVII, L305V/K337A-FVII , V158D/E296V/M298Q/L305V-FVII, V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII , V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A-FVII, K157A-FVII, E296V-FVII, E296V/M298Q-FVII, V158D/E296V-FVII , V158D/M298K-FVII , y S336G-FVII, L305V/K337A-FVII, L305V/V158D-FVII , L305V/E296V-FVII, L305V/M298Q-FVII, L305V/V158T-FVII , L305V/K337A/V158T-FVII, L305V/K337A/M298Q-FVII, L305V/K337A/E296V-FVII , L305V/K337A/V158D-FVII, L305V/V158D/M298Q-FVII , L305V/V158D/E296V-FVII, L305V/V158T/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V-FVII, L305V/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/K316H-FVII, S314E/K316Q-FVII, S314E/L305V-FVII, S314E/K337A-FVII, S314E/V158D-FVII, S314E/E296V-FVII, S314E/M298Q-FVII, S314E/V158T-FVII, K316H/L305V-FVII, K316H/K337A-FVII , K316H/V158D-FVII, K316H/E296V-FVII, K316H/M298Q-FVII, K316H/V158T-FVII, K316Q/L305V-FVII, K316Q/K337A-FVII, K316Q/V158D-FVII, K316Q/E296V-FVII, K316Q/M298Q-FVII, K316Q/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A-FVII , S314E/L305V/V158D-FVII, S314E/L305V/E296V-FVII, S314E/L305V/M298Q-FVII , S314E/L305V/V158T-FVII, S314E/L305V/K337A/V158T-FVII , S314E/L305V/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/K337A/E296V-FVII , S314E/L305V/K337A/V158D-FVII, S314E/L305V/V158D/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V-FVII, S314E/L305V/V158T/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V-FVII, S314E/L305V/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/K337A- FVII, K316H/L305V/V158D-FVII, K316H/L305V/E296V-FVII , K316H/L305V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T-FVII , K316H/L305V/K337A/V158T-FVII, K316H/L305V/K337A/M298Q-FVII , K316H/L305V/K337A/E296V-FVII, K316H/L305V/K337A/V158D-FVII , K316H/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V-FVII , K316H/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V-FVII , K316H/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/K337A -FVII, K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D-FVII, K316Q/L305V/E296V-FVII , K316Q/L305V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T-FVII , K316Q/L305V/K337A/V158T-FVII, K316Q/L305V/K337A/M298Q-FVII , K316Q/L305V/K337A/E296V-FVII, K316Q/L305V/K337A/V158D-FVII, K316Q/L305V/V158D/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V-FVII, K316Q/L305V/V158T/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V-FVII, K316Q/L305V/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q- FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, K316Q/L305V/V158T/E 96V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/K337A-FVII , F374Y/V158D-FVII, F374Y/E296V-FVII , F374Y/M298Q-FVII , F374Y/V158T-FVII, F374Y/S314E-FVII , F374Y/L305V-FVII , F374Y/L305V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D-FVII, F374Y/L305V/E296V-FVII, F374Y/L305V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T-FVII, F374Y/L305V/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E-FVII, F374Y/K337A/V158T-FVII, F374Y/K337A/M298Q-FVII, F374Y/K337A/E296V-FVII, F374Y/K337A/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q-FVII, F374Y/V158D/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q-FVII, F374Y/V158T/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E-FVII, F374Y/S314E/M298Q-FVII, F374Y/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158D-FVII, F374Y/L305V/K337A/E296V-FVII, F374Y/L305V/K337A/M298Q-FVII, F374Y/L305V/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/E296V/V158T-FVII , F374Y/L305V/E296V/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/V158T-FVII, F374Y/L305V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/S314E-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158T-FVII, F374Y/K337A/S314E/M298Q-FVII, F374Y/K337A/S314E/E296V-FVII, F374Y/K337A/S314E/V158D-FVII, F374Y/K337A/V158T/M298Q-FVII, F374Y/K337A/V158T/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/E296V-FVII, F374Y/K337A/M298Q/V158D-FVII, F374Y/K337A/E296V/V158D-FVII, F374Y/V158D/S314E/M298Q-FVII, F374Y/V158D/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158D/M298Q/E296V-FVII , F374Y/V158T/S314E/E296V-FVII, F374Y/V158T/S314E/M298Q-FVII , F374Y/V158T/M298Q/E296V-FVII, F374Y/E296V/S314E/M298Q-FVII , F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E-FVII, F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T-FVII, F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E-FVII, F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E-FVII, F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E-FVII, S52A-Factor VII, S60A-Fact?r VII; Rl52E-Factor VII, S344A-Factor VII, T106N-FVII, K143N/N145T-FVII, V253N-FVII, R290N/A292T-FVII , G291N-FVII, R315N/V317T-FVII , K143N/N145T/R315N/V317T-FVII ; y FVII que tiene sustituciones, adiciones, o supresiones en la secuencia de aminoácidos a partir de 233Thr hasta 240Asn; FVII que tiene sustitución, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos 304Arg a 329Cys; y FVII que tiene sustituciones, adiciones o supresiones en la secuencia de aminoácidos de 153lle a 223Arg. Las variantes del factor VII que tienen sustancialmente la misma o una actividad biológica mejorada con relación al factor Vlla de tipo silvestre, abarcan aquellas que muestran las mismas aproximadamente 25%, tal como, por ejemplo, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 120, al menos aproximadamente 130, o al menos aproximadamente 150% de la actividad específica del factor Vlla de tipo silvestre, que ha sido producido en el mismo tipo celular, cuando se prueba en uno o más de un ensayo de coagulación, un ensayo de proteólisis, o un ensayo de enlace a TF, como se describió anteriormente. Las variantes del factor VII que tienen actividad biológica sustancialmente reducida con relación al factor Vlla de tipo silvestre, son aquellas que muestran menos de aproximadamente 25%, preferentemente menos de aproximadamente 10%, más preferentemente menos de aproximadamente 5% y lo más preferentemente menos de aproximadamente 1% de la actividad específica del factor Vlla de tipo silvestre que ha sido producido en el mismo tipo celular, cuando se prueba en uno o más de un ensayo de coagulación, ensayo de proteólisis, o ensayo de enlace a TF, como se describe más adelante. Las variantes del factor VII que tienen una actividad biológica sustancialmente modificada con relación al factor VII de tipo silvestre incluyen, sin limitación, las variantes del factor VII que muestran actividad proteolítica del factor X y dependiente de TF, y aquellas que se enlazan a TF pero no rompen el factor X. La actividad biológica del factor Vlla en la coagulación sanguínea, se deriva de su habilidad para (i) enlazarse al factor tisular TF y ii) catalizar la escisión proteolítica del factor IX o del factor X para producir el factor IX o X activado (factor IXa o Xa, respectivamente) . Para los fines de la invención, la actividad biológica del factor Vlla puede ser cuantificada mediante la medición de la habilidad de una preparación para promover la coagulación sanguínea utilizando plasma deficiente en el factor VII, y tromboplastina, como se describe por ejemplo en la patente de los Estados Unidos No. 5,997,864. En este ensayo, la actividad biológica es expresada como la reducción en el tiempo de coagulación con relación a una muestra control, y es convertida a "unidades del factor Vil" por comparación con un estándar de suero humano combinado, que contiene una unidad/ml de actividad del factor Vil. Alternativamente, la actividad biológica del Vlla puede ser cuantificada mediante (i) la medición de la habilidad del factor Vlla para producir el factor Xa en un sistema que comprende TF incrustado en una membrana lipídica y el factor X (Persson et al., J. Biol. Chem. 272: 19919-19924, 1997); (ii) la medición de la hidrólisis del factor X en un sistema acuoso (ver "Métodos generales" más adelante) ; (iii) la medición de su enlace físico a TF utilizando un instrumento basado en la resonancia de plasmón superficial (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997) (iv) la medición de la hidrólisis de un sustrato sintético (ver "Métodos generales" más adelante) ; y (v) la medición de la generación de trombina en un sistema in vitro independiente de TF (ver más adelante "Métodos generales"). Polipéptidos del factor IX y polipéptidos relacionados al factor IX La presente invención abarca los polipéptidos del factor IX tales como, por ejemplo, aquellos que tienen la secuencia de aminoácidos descrita por ejemplo en Jaye et al., Nucleic Acids Res. 11: 2325-2335, 1983. (factor IX humano de tipo silvestre) . En la práctica de la presente invención, cualquier polipéptido del factor IX puede ser utilizado, el cual sea efectivo en prevenir o tratar la hemorragia. Este incluye los polipéptidos del factor IX derivados de sangre o plasma, o producidos por medios recombinantes . Como se utiliza en la presente, "EL polipéptido del factor IX" abarca, sin limitación, el factor IX, así como los polipéptidos relacionados al factor IX. El término "factor IX" está destinado a abarcar, sin limitación, los polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos como se describe en Jaye et al., Nucleic Acids Res. 1983 (ver arriba) (factor IX humano de tipo silvestre), así como el factor IX de tipo silvestre derivado de otra especie, tal como, por ejemplo, bovino, porcino, canino, murino, y el factor IX de salmón. Este abarca además las variantes alélicas naturales del factor IX que pueden existir y que aparecen de un individuo a otro. También, el grado y localización de la glucosilación u otras modificaciones post-traducción pueden variar dependiendo de las células hospederas elegidas y de la naturaleza del ambiente celular del hospedero. El término "factor IX" está también destinado a abarcar los polipéptidos del factor IX en su forma no escindida (zimógeno) así como aquellos que han sido proteolíticamente procesados para producir formas bioactivas respectivas, que pueden ser designadas al factor Xla. "Los polipéptidos relacionados al factor IX" incluyen, sin limitación, los polipéptidos del factor IX que han sido ya sea químicamente modificados al factor IX humano y/o que contienen una o más alteraciones en la secuencia de aminoácidos con relación al factor IX humano (por ejemplo, variantes del factor IX) y/o que contienen secuencias truncadas de aminoácidos con relación al factor IX (por ejemplo, fragmentos del factor IX) . Tales polipéptidos relacionados al factor IX pueden mostrar diferentes propiedades con relación al factor IX humano, incluyendo la estabilidad, enlace al fosfolípido, actividad específica alterada, y similares.
El término "polipéptidos relacionados al factor IX" está destinado a abarcar tales polipéptidos en su forma no escindida (zimógeno) , así como aquellos que han sido proteolíticamente procesados para producir sus formas bioactivas respectivas, que pueden ser designados "polipéptidos relacionados al factor IXa" o "polipéptidos proporcionados al factor IX activado" . Como se utiliza en la presente, "los polipéptidos relacionados al factor IX" abarca, sin limitación, los polipéptidos que muestran sustancialmente la misma actividad biológica o una actividad biológica mejorada con relación al factor IX humano de tipo silvestre, así como los polipéptidos, en los cuales la actividad biológica del factor IX ha sido sustancialmente modificada o reducida con relación a la actividad del factor IX humano de tipo silvestre. Estos polipéptidos incluyen, sin limitación, el factor IX o el factor IXa que ha sido químicamente modificado, y las variantes del factor IX dentro de las cuales, han sido introducidas alteraciones específicas en la secuencia de aminoácidos que modifican o perturban la bioactividad del polipéptido. Este abarca además los polipéptidos con una secuencia de aminoácidos ligeramente modificada, por ejemplo, los polipéptidos que tienen un extremo N-terminal modificado, incluyendo las supresiones o adiciones de aminoácidos de N- terminales, y/o los polipéptidos que han sido químicamente modificados con relación al factor IX humano. Los polipéptidos relacionados al factor IX incluyendo las variantes del factor IX que muestran ya sea sustancialmente la misma o una mejor bioactividad que el factor IX de tipo silvestre, o alternativamente, que muestran bioactividad sustancialmente modificada o reducida con relación al factor IX de tipo silvestre, incluyen, sin limitación, los polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que difiere de la secuencia del factor IX de tipo silvestre mediante inserción, supresión o sustitución de uno o más aminoácidos . Los polipéptidos relacionados al factor IX, incluyendo las variantes, abarcan aquellas que muestran aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30%, al menos aproximadamente 40%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 100%, al menos aproximadamente 110%, al menos aproximadamente 120% y al menos aproximadamente 130% de la actividad específica del factor IX de tipo silvestre que ha sido producido en el mismo tipo celular, cuando se prueba en el ensayo de actividad del factor IX, como se describe en la presente especificación. Los polipéptidos relacionados al factor IX, incluyendo las variantes, que tienen sustancialmente la misma o una actividad biológica mejorada, con relación al factor IX de tipo silvestre, abarcan aquellos que muestran al menos aproximadamente 25%, preferentemente al menos aproximadamente 50%, más preferentemente al menos aproximadamente 75%, más preferentemente al menos aproximadamente 100%, más preferentemente al menos aproximadamente 110%, más preferentemente al menos aproximadamente 120% y lo más preferentemente al menos aproximadamente 130% de la actividad biológica específica del factor IX de tipo silvestre, que ha sido producido en el mismo tipo celular, cuando se prueba en uno o más ensayos de actividad del factor IX específico, como se describe. Para los fines de la invención, la actividad biológica del factor IX puede ser cuantificada como se describe posteriormente en la presente descripción (ver "Métodos generales"). Los polipéptidos relacionados al factor IX incluyendo las variantes, que tienen actividad biológica sustancialmente reducida con relación al factor IX de tipo silvestre, son aquellas que muestran menos de aproximadamente 25%, preferentemente menos de aproximadamente 10%, más preferentemente menos de aproximadamente 5% y más preferentemente menos de aproximadamente 1% de la actividad específica del factor IX de tipo silvestre que ha sido producido en el mismo tipo celular, cuando se prueba en uno o más de los ensayos específicos de actividad del factor IX como se describe anteriormente. Los ejemplos no limitantes de polipéptidos del factor IX incluyen el factor IX humano derivado de plasma, como se describe por ejemplo en Chandra et al., Biochem.
Biophys. Acta 1973, 328:456; Andersson et al., Thromb. Res. 1975, 7:451; Suomela et al., Eur. J. Biochem. 1976, 71:145. Los ensayos adecuados para probar la actividad del factor IX, y con esto proporcionar los medios para seleccionar las variantes adecuadas del factor IX para el uso en la presente invención, pueden ser realizados como pruebas in vitro simples como se describe, por ejemplo, en Wagenvoord et al., Haemostasis 1990; 20 (5) : 276-88. La actividad biológica del factor IX puede ser también cuantificada mediante la medición de la habilidad de una preparación para corregir el tiempo de coagulación del plasma deficiente en el factor IX, por ejemplo, como se describe en Nilsson et al., 1959. (Nilsson IM, Biombaeck M, Thilen A, von Francken I., Carriers of haemophilia A - A laboratory study, Acta Med Sean 1959; 165:357). En este ensayo, la actividad biológica es expresada como unidades/ml de plasma (1 unidad corresponde a la cantidad de FIX presente en el plasma combinado normal) . En algunas modalidades de la invención, el factor IX son los polipéptidos relacionados al factor IX, en donde la proporción entre la actividad del polipéptido del factor IX y la actividad del factor IX humano nativo (factor IX de tipo silvestre) es al menos de 1.25 cuando se prueba en el "ensayo cromogénico" (ver más adelante) ; en otras modalidades, la proporción es al menos de aproximadamente 2.0; en modalidades adicionales, la proporción es al menos de aproximadamente 4.0. Glucosilación O-enlazada En la práctica de la presente invención, el patrón de oligosacáridos puede ser determinado utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo sin limitación: cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ; electroforesis capilar (CE, por sus siglas en inglés) ; resonancia magnética nuclear (RMN) ; espectrometría de masa (MS, por sus siglas en inglés) , utilizando técnicas de ionización tales como bombardeo atómico rápido, electrorrocío, o desorción de láser asistida por matriz (MALDI, por sus siglas en inglés); cromatografía de gases (GC, por sus siglas en inglés); y tratamiento con exoglucosidasas en conjunto con HPLC de intercambio aniónico (AIE) , cromatografía de exclusión de tamaño (SEC, por sus siglas en inglés), o MS . Ver, por ejemplo, Weber et al., Anal. Biochem. 225: 135 (1995); Klausen et al., J. Chromatog. 718: 195 (1995); Morris et al., in Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker, (1990), pp 137-167; Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990); Sutton et al., Anal. Biohcem. 318:34 (1994); Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994). El contenido relativo de las O-glucoformas puede ser determinado por ejemplo, mediante mapeo del péptido tríptico. En resumen, la glucoproteína es digerida con tripsina y los polipéptidos que contienen el sitio de 0-glucosilación son separados de acuerdo a la estructura del glicano mediante cromatografía de HPLC, espectrometría de masa y otra técnica de separación analítica adecuada. Si es necesario, con el fin de obtener una separación adecuada, antes de la digestión con la tripsina, la glucoproteína puede ser reducida y alquilada, y la cadena polipeptídica que contiene el sitio de O-glucosilación es purificada mediante, por ejemplo, cromatografía de HPLC. Luego, el polipéptido purificado es sometido a digestión tríptica seguido por análisis como se describe anteriormente. Métodos para producir preparaciones de glucoproteína giß tienen un patrón predeterminado de oligosacáridos O-enlazados El origen de la glucoproteína aceptora no es un aspecto crítico de la invención. Típicamente, la glucoproteína será expresada en una célula procariótica o célula eucariótica cultivada, tal como una célula de mamífero, de levadura, de insecto, de hongo o de planta. La proteína, no obstante, puede ser también aislada de una fuente natural tal como plasma, suero o sangre. La glucoproteína puede ser ya sea una proteína de longitud completa o un fragmento de la misma. La invención proporciona las composiciones que incluyen especies de glucoproteínas que tienen un patrón de glucosilación sustancialmente uniforme. Los métodos son útiles para la remodelación o alteración del patrón de glucosilación presente sobre una glucoproteína después de su expresión inicial. De este modo, los métodos de la invención proporcionan un medio práctico para la preparación a gran escala de las glucoformas que tienen patrones de derivatización uniformes preseleccionados o predeterminados. Los métodos son particularmente muy adecuados para la modificación de los péptidos terapéuticos, incluyendo pero no limitados a, glucoproteínas que son incompletamente glucosiladas durante la producción en cultivos celulares o en animales transgénicos. No obstante, las preparaciones y composiciones de la invención pueden ser también preparadas mediante purificación de fuentes naturales, tales como plasma, suero y sangre, o fluidos de cultivo celular, y el aislamiento de las glucoformas deseadas a partir de éstos. Los polipéptidos que van a ser remodelados de acuerdo con la invención son típicamente preparados mediante procesos de cultivo celular. Las células hospederas elevadas incluyen, sin limitación, células humanas que expresan un gen endógeno tal como, por ejemplo, un gen del factor VII ó IX ó X ó XII o un gen de la proteína Z. En estas células, el gen endógeno puede ser intacto, o puede haber sido modificado in situ, o una secuencia fuera del gen endógeno puede haber sido modificada in situ para alterar la expresión del gen de la glucoproteína endógeno. Cualquier célula humana capaz de expresar un gen de glucoproteína endógeno, puede ser utilizado. Otras células hospederas incluidas son las células hospederas heterólogas programadas para expresar una glucoproteína tal como por ejemplo, el factor VII ó IX ó X ó XII humano a partir de un gen recombinante. Las células hospederas pueden ser células de vertebrados, de insectos o de hongos. Preferentemente, las células son células de mamífero, capaces de realizar el espectro completo de glucosilación N-enlazada de mamífero; la glucosilación O-enlazada; y la ?-carboxilación. Ver por ejemplo, la patente de los Estados Unidos No. 4,784,950. Las líneas celulares de mamífero preferidas incluyen las líneas celulares CHO (ATCC CCL 61), COS-I (ATCC CRL 1650), líneas celulares de riñon de hámster bebé (BHK) y HEK293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977). Línea celular de BHK preferida es la línea celular BHK tk" tsl3 (Waechter y Baserga, Proc.Nati.Acad. Sci. EUA 79: 1106-1110, 1982), de aquí en adelante denominada como células BHK 570. Las células BHK 570 son disponibles de la American Type Culture Collection, 12301 Park-lawn Dr., Rockville, MD 20852, bajo el número de acceso del ATCC CRL 10314. Una línea celular tk" tsl3 BHK es también disponible de la ATTC bajo el número de acceso CRL 1632. Además, puede ser utilizado un número de otras líneas celulares, incluyendo Hep I de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1600) , Hep II de rata (hepatoma de rata; ATCC CRL 1548) , TCMK (ATCC CCL 139), células de pulmón humano (ATCC HB 8065), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) y células DUKX (líneas celulares CHO) (Ur-laub and Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 77:4216-4220, 1980) . (Las células DUKX también denominadas como células CXBI1), y las células DG44 (línea celular CHO) (Cell, 33:405, 1983, and Somatic Cell and Molecular Genetics 12:555, 1986). También útiles son las células 3T3, las células Namalwa, mielomas y fusiones de mielomas, con otras células. Las células hospederas tratadas incluyen células BHK 21 que han sido adaptadas para desarrollarse en ausencia de suero, y han sido programadas para expresar el factor Vil. Las células pueden ser mutantes o células recombinantes que expresan un espectro cualitativa o cuantitativamente diferente de las enzimas de glucosilación (tales como por ejemplo, las glucosil-transferasas y/o glucosidasas) , que el tipo celular del cual éstas se derivan. Las células pueden ser también programadas para expresar otros péptidos o proteínas heterólogas, incluyendo, por ejemplo, formas truncadas del factor VII. Las células hospederas pueden también ser células CHO que han sido programadas para coexpresar el polipéptido del factor VII de interés (por ejemplo, el factor VII o un polipéptido relacionado al factor VII) y otro péptido heterólogo o polipéptido tal como, por ejemplo, una enzima de modificación o un fragmento del factor VII. Métodos : La presente invención abarca los métodos para producir una preparación que comprende un patrón de glucoforma enlazada a serina/treonina predeterminado, como se describe anteriormente y, en modalidades adicionales, los métodos para optimizar la distribución de la glucoforma de una glucoproteína (ver figura 3) . Los pasos individuales del proceso descritos pueden ser aplicados en diferentes combinaciones, con el fin de obtener el patrón de glucoforma deseado. Los ejemplos no limitantes se dan en seguida. En un aspecto, estos métodos son llevados a cabo por los pasos de: (a) obtener una preparación de una glucoproteína que contiene la porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y en donde la serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr proveniente de una célula en la cual ésta es preparada, por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o aislamiento de la glucoproteína de una fuente natural ; (b) poner en contacto la preparación de glucoproteína con un donador activado de la porción mono- u oligosacárida deseada y una enzima adecuada para transferir el grupo mono- u oligosacárido deseado bajo condiciones apropiadas para transformar el grupo mono- u oligosacárido a partir de la porción donadora a la porción aceptora, con lo cual se produce el glucopéptido que tiene patrón de glucosilación alterado. En otro aspecto más, estos métodos son llevados a cabo, por los pasos de: (aa) la obtención de una preparación de una glucoproteína que contiene una porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y en donde la serina/treonina forma parte del enlace covalente Glc-O-Ser/Thr, a partir de una célula en la cual es preparado; por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (bb) poner en contacto la preparación de glucoproteína con una enzima adecuada para eliminar el grupo mono- u oligosacárido terminal bajo condiciones apropiadas para remover el grupo mono- u oligosacárido, con lo cual se produce el glucopéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación. En una modalidad, el método comprende una combinación de los pasos (b) y (bb) . En una modalidad, los métodos comprenden además un paso de aislamiento de la glucoproteína que tiene un patrón alterado de glucosilación. En una modalidad, los métodos comprenden un paso adicional de: analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos para determinar un patrón de glucoforma, y opcionalmente, repetir los pasos (b) y/o (bb) hasta que es logrado un patrón de glucoforma deseado. Estos métodos pueden comprender además el paso de someter las preparaciones que tienen los patrones de glucoformas predeterminados al menos a una prueba de bioactividad (incluyendo, por ejemplo, la coagulación, la proteólisis del factor X, o el enlace de TF) u otra funcionalidad (tal como, por ejemplo, el perfil farmacocinético o la estabilidad) y correlacionando los patrones de glucoformas particulares con la bioactividad particular o los perfiles de funcionalidad con el fin de identificar un patrón de glucoforma deseado. En una modalidad, el patrón de glucoforma deseado es una glucosilación de glucosa o serina/treonina sustancialmente uniforme: en esta modalidad, en donde la glucoproteína inicialmente obtenida contiene la xilosa terminal (MÉTODO B) comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de una glucoproteína que contiene una porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y en donde la serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr a partir de una célula en la cual es preparado; por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (b) poner en contacto la preparación obtenida en el paso (a) con una xilosidasa bajo condiciones apropiadas para remover los residuos de xilosa de la glucoproteína, con lo cual se produce la glucoproteína que tiene un patrón alterado de glucosilación. En una modalidad, el método incluye además el paso de aislar la glucoproteína preparada en el paso b que tiene una glucosilación Glc-O-Ser/Thr . En una modalidad, el método incluye además el paso de analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos para determinar un patrón de glucoforma y opcionalmente, repetir el paso b hasta que es logrado el patrón de glucoforma deseado. En otra modalidad más, para elaborar un patrón de glucoformas deseado en la forma de una glucosilación de glucosa-O-serina/treonina sustancialmente uniforme, el método (MÉTODO C) comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de un polipéptido que contiene la porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys, por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (b) poner en contacto la preparación obtenida del paso (a) con una O-glucosil-transferasa y un donador de glucosa activado, bajo condiciones apropiadas para transferir un residuo de glucosa desde la porción donadora de glucosa a la porción aceptora de serina/treonina, con lo cual se produce el polipéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación. En una modalidad, el método incluye además el paso de aislar la glucoproteína preparada en el paso b que tiene una glucosilación Glc-O-Ser/Thr . En una modalidad, el método incluye además el paso de analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos, para determinar un patrón de glucoforma, y opcionalmente, repetir el paso (b) hasta que se logra el patrón de glucoforma deseado. En una modalidad, el patrón de glucoforma deseado es una glucosilación de xilosa glucosa o serina/treonina sustancialmente uniforme. En esta modalidad, el método (MÉTODO Al) comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de una glucoproteína que contiene una porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2- Pro-Cys, y en donde la serina/treonina forma parte del enlace covalente Glc-O-Ser/Thr; por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (b) poner en contacto la preparación obtenida en el paso (a) con un UDP-D-xilosa: ß-D-glucósido- -1 , 3-D-xilosiltransferasa y un donador de xilosil activado, bajo condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa desde la porción donadora de xilosa a la porción aceptora, con lo cual se produce el glucopéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación alterado. En una modalidad, el método incluye además el paso de aislar la glucoproteína preparada en el paso b que tiene una glucosilación Xyl-Glc-O-Ser/Thr . En una modalidad, el método incluye además el paso de analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos para determinar un patrón de glucoforma, y opcionalmente, repetir el paso (b) hasta que se logre el patrón de glucoforma deseado En una modalidad, el método incluye además el paso de eliminar los residuos de xilosa terminales al someter la preparación obtenida en el paso (a) al MÉTODO B antes del paso (b) . En una modalidad, el patrón de glucoforma deseado es una glucosilación de xilosa, xilosa-glucosa o serina/treonina sustancialmente uniforme: En esta modalidad, el método (MÉTODO A2 ) comprende los pasos de : (a) obtener una preparación de una glucoproteína que contiene una porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2- Pro-Cys, y en donde la serina/treonina forma parte del enlace covalente Glc-O-Ser/Thr; por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (b) poner en contacto la preparación obtenida en el paso (a) con un UDP-D-xilosa: ß-D-glucósido-a-1, 3-D-xilosiltransferasa y un donador de xilosil activado, bajo condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa desde la porción donadora de xilosa a la porción aceptora, con lo cual se produce el glucopéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación alterado. (c) poner en contacto la preparación obtenida en el paso (b) con UDP-D-xilosa :a-D-xilósido-a-l, 3-xilosiltransferasa y un donador de xilosilo activado, bajo condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa desde la porción donadora de xilosa hasta la porción aceptora, con lo cual se produce el glucopéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación. En una modalidad, el método incluye además el paso de aislar la preparación obtenida en el paso (b) antes de someter la preparación al paso (c) . En una modalidad, el método incluye además el paso de aislar la glucoproteína preparada en el paso (c) que tiene la glucosilación Xyl-Xyl-Glc-O-Ser/Thr .
En una modalidad, el método incluye además el paso de analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos, para determinar un patrón de glucoforma, y opcionalmente, repetir el paso (b) y/o el paso (c) hasta que el patrón de glucoforma deseado es alcanzado. En una modalidad, el método incluye además el paso de eliminar los residuos de xilosa terminales al someter la preparación obtenida en el paso (a) al MÉTODO B antes del paso (b) . En diferentes modalidades, la glucoproteína muestra glucosilación de Xyl-Xyl-Glc-O-Ser sustancialmente uniforme, glucosilación de Xyl-Glc-O-Ser y glucosilación de Glc-0-Ser; Ser es la serina de la porción Cys-Xl-Ser-X2-Pro-Cys contenida (Xl y X2 independientemente son cualquier residuo de aminoácidos). En otras modalidades diferentes, la glucoproteína muestra sustancialmente glucosilación de Xyl-Xyl-Glc-O-Thr sustancialmente uniforme, glucosilación de Xyl-Glc-0-Thr y glucosilación de Glc-O-Thr; siendo Thr la treonina de la porción Cys-Xl-Thr-X2-Pro-Cys contenida (Xl y X2 independientemente son cualquier residuo de aminoácidos) . En diferentes modalidades, los polipéptidos son seleccionados de la lista de: polipéptidos del factor vil, polipéptidos relacionados al factor VII, polipéptidos del factor IX, polipéptidos relacionados al factor IX, polipéptidos del factor X, y polipéptidos relacionados al factor X. En modalidades preferidas, la preparación de glucoproteína se selecciona de la lista de: Polipéptidos del Factor VII que muestran glucosilación Xyl-Xyl-Glc-O-Ser sustancialmente uniforme, Polipéptidos del factor VII que muestran glucosilación Xyl- Glc-0-Ser52 sustancialmente uniforme, Polipéptidos del factor VII que muestran glucosilación Glc-O- Ser52 sustancialmente uniforme, Polipéptidos del factor VII que muestran glucosilación Xyl- Xyl-Glc-0-Ser52 sustancialmente uniforme, Polipéptidos del factor VII que muestran glucosilación Xyl- Glc-0-Ser52 sustancialmente uniforme Polipéptidos del factor VII que muestran glucosilación Glc-0-Ser52 sustancialmente uniforme Variantes del factor Vil que muestran Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52 sustancialmente uniforme Variantes del factor VII que muestran Xyl-Glc-0-Ser52 sustancialmente uniforme Variantes del factor VII que muestran Glc-0-Ser52 sustancialmente uniforme Polipéptidos del factor IX que muestran glucosilación Xyl- Xyl-Glc-0-Ser53 sustancialmente uniforme Polipéptidos del factor IX que muestran glucosilación Xyl-Glc-0-Ser53 sustancialmente uniforme Polipéptidos del factor IX que muestran glucosilación Glc-O-Ser53 sustancialmente uniforme Polipéptidos relacionados al factor IX que muestran glucosilación Xyl-Xyl-Glc-0-Ser53 sustancialmente uniforme Polipéptidos relacionados al factor IX que muestran glucosilación Xyl-Glc-0-Ser53 sustancialmente uniforme Polipéptidos relacionados al factor IX que muestran glucosilación' Glc-0-Ser53 sustancialmente uniforme Variantes del factor IX que muestran glucosilación Xyl-Xyl-Glc-0-Ser53 sustancialmente uniforme Variantes del factor IX que muestran glucosilación Xyl-Glc-O-Ser53 sustancialmente uniforme Variantes del factor IX que muestran glucosilación Glc-O-Ser53 sustancialmente uniforme Se debe entender que los oligonucleótidos tales como Xyl-Xyl- pueden también ser transferidos a la porción aceptora Glc-O-Ser/Thr mediante el uso de una enzima de transferencia adecuada y un donador activado de Xyl-Xyl-. Método croma tográfico : La presente invención también abarca los métodos cromatográficos de interacción hidrofóbica para producir una preparación que comprende un patrón de glucoforma predeterminada enlazado a serina/treonina, como se describe anteriormente, y para purificar un polipéptido O-glucosilado que tiene un patrón de glucoforma deseado a partir de una composición que comprende el polipéptido y los polipéptidos que tienen patrones de glucoformas no deseados . En un aspecto, el método comprende los siguientes pasos : (a) obtener una preparación de una glucoproteína que contiene la porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y en donde la serina/treonina forman parte del enlace covalente Glc-O-Ser/Thr a partir de una célula en la cual ésta es preparada, por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (b) el enlace de la glucoproteína a un material de interacción hidrofóbica utilizando una solución que comprende agua, opcionalmente un componente salino, y opcionalmente un amortiguador; (c) lavar opcionalmente el material de interacción hidrofóbica utilizando una solución que comprende agua, opcionalmente un componente salino, y opcionalmente un amortiguador para eluir los contaminantes provenientes del material de interacción hidrofóbica; (d) lavar el material de interacción hidrofóbica utilizando una solución que comprende un modificador orgánico, agua, opcionalmente un componente salino, y opcionalmente un amortiguador, a un gradiente lineal o gradual o isocráticamente en el componente salino para separar así las glucoproteínas que tienen un patrón de glucoforma deseada a partir de las glucoproteínas que no tienen la glucoforma deseada a partir del material de interacción hidrofóbica; (e) recolectar la fracción que contiene las glucoproteínas que tienen el patrón de glucoformas deseadas . En una modalidad, los métodos anteriormente descritos incluyen además el paso de repetir los pasos (a) al e) al someter la preparación obtenida en el paso (e) a los pasos (a) al (e) . Este paso adicional puede estar repetido más de una vez si se considera necesario. Se debe entender que las preparaciones de acuerdo a la invención pueden también ser preparadas mediante un proceso que comprende una combinación de pasos de purificación mediante los cuales las especies de glucoproteína que tienen la glucosilación deseada son capturadas del líquido de cultivo celular o la fuente natural de origen, y los métodos enzimáticos descritos anteriormente. Los métodos anteriormente descritos pueden comprender además el paso de someter las preparaciones que tienen los patrones de glucoforma predeterminados al menos a una prueba de bioactividad (incluyendo, por ejemplo, coagulación, proteólisis del Factor X, o enlace de TF) u otra funcionalidad (tales como, por ejemplo, el perfil farmacocinético o estabilidad) , y la correlación de los patrones de glucoforma particulares con bioactividad particular o perfiles de funcionalidad, con el fin de identificar un patrón de glucoforma deseado. Pueden ser tratados tratamientos enzimáticos adicionales en conexión con los métodos anteriores para modificar el patrón del oligosacárido de los glicanos N- u 0-enlazado de una preparación; tales tratamientos incluyen, sin limitación, el tratamiento con uno o más de sialidasa (neuraminidasa) , galactosidasa, fucosidasa; galactosil-transferasa, fucosil-transferasa, y/o sialiltransferasa, en una secuencia y bajo condiciones que logran una modificación deseada en la distribución de las cadenas oligosacáridas que tienen estructuras terminales particulares. Las glucosiltransferasas son comercialmente disponibles de Calbiochem (La Jolla, California) y las glucosidasas son comercialmente disponible de Glyko, Inc., (Novato, California). Preparaciones de glucoproteína Como se utiliza en la presente, una "preparación de glucoproteína" se refiere a una pluralidad de glucoformas que han sido separadas de la célula en la cual éstas fueron sintetizadas. La preparación de glucoproteína incluye formas inactivadas, formas activadas, polipéptidos relacionados a la funcionalidad tales como, por ejemplo, variantes y formas químicamente modificadas, que han sido separadas de la célula en la cual éstas fueron sintetizadas.
Por ejemplo, como se utiliza en la presente, una "preparación del Factor VII" se refiere a una pluralidad de polipéptidos del Factor VII, polipéptidos del Factor Vlla, o polipéptidos relacionados al Factor VII, incluyendo variantes y formas químicamente modificadas, que han sido separadas de la célula en la cual éstas fueron sintetizadas o aisladas de una fuente natural. De igual modo, una "preparación del Factor IX" se refiere a una pluralidad de polipéptidos del Factor IX, polipéptidos del Factor IXa, o polipéptidos relacionados al Factor IX, incluyendo variantes o formas químicamente modificadas, que han sido separadas de la célula en la cual éstas fueron sintetizadas o aisladas de una fuente natural (por ejemplo, plasma, suero, sangre) . La separación de los polipéptidos a partir de su célula de origen puede ser lograda mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, la eliminación del medio de cultivo celular que contiene el producto deseado a partir de un cultivo de células adherentes; la centrifugación o filtración para eliminar las células no adherentes; y similares. Opcionalmente, los polipéptidos pueden ser además purificados. La purificación puede ser lograda utilizando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, sin limitación, cromatografía de afinidad, tal como, por ejemplo, sobre una columna de anticuerpo anti-Factor VII o anti-Factor IX (ver, por ejemplo, Wakabayashi et al., J. Biol . Chem . 261: 11097; y Thim et al., Biochem 27: 7785, 1988); cromatografía de interacción hidrofóbica; cromatografía de intercambio iónico; cromatografía de exclusión de tamaño; procedimientos electroforéticos (por ejemplo, enfoque isoeléctrico preparativo (IEF) , solubilidad diferencial (por ejemplo, precipitación con sulfato de amonio) , o extracción y similares. Ver, en general, Scopes, Proteina Puri fica tion, Springer-Verlag, New York, 1982; y Protein Purifica tion, J.-C. Janson y Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989. Después de la purificación, la preparación contiene preferentemente menos de aproximadamente 10% en peso, más preferentemente menos de aproximadamente 5% y lo más preferentemente menos de aproximadamente 1%, de las proteínas no relacionadas, derivadas de la célula hospedera. El Factor VII y los polipéptidos relacionados al Factor VII, el Factor IX y los polipéptidos relacionados al Factor IX, o el Factor X y los polipéptidos relacionados al Factor X, respectivamente, pueden ser activados mediante escisión proteolítica, utilizando el Factor Xlla u otras proteasas que tienen especificidad similar a la tripsina, tales como, por ejemplo, el Factor iXa, kalikreina, Factor Xa, y trombina. Ver, por ejemplo, Osterud et al., Biochem. 11: 2853 (1972); Thomas, Patente de los Estados Unidos No. 4,456,591; y Hedner et al., J. Clin . Invest . 71: 1836 (1983).
Alternativamente, el Factor VII, IX o X, respectivamente, pueden ser activados mediante el paso de éstos a través de una columna de cromatografía de intercambio iónico, tal como Mono Q® (Pharmacia) o similar. El polipéptido activado resultante, el Factor VII, puede ser formulado y administrado como se describe más adelante. Propiedades funcionales de las preparaciones de glucoproteína Las preparaciones de la glucoproteína que tienen patrones de oligosacáridos predeterminados de acuerdo a la invención (incluyendo polipéptidos del Factor VII, polipéptidos relacionados al Factor VII, polipéptidos del Factor IX y polipéptidos relacionados al Factor IX) muestran propiedades funcionales mejoradas con relación a las preparaciones de referencia. Las propiedades funcionales mejoradas pueden incluir, sin limitación, a) propiedades físicas tales como, por ejemplo, estabilidad al almacenamiento; b) propiedades farmacocinéticas tales como, por ejemplo, la biodisponibilidad y la vida media; c) la inmunogenicidad en humanos, y d) la actividad biológica, tales como, por ejemplo, la actividad de coagulación. Una preparación de referencia se refiere a una preparación que comprende un polipéptido que es idéntico a aquel contenido en la preparación de la invención a la cual ésta está siendo comparada (tal como, por ejemplo, Factor VII de tipo silvestre o Factor IX de tipo silvestre o una variante particular o forma químicamente modificada) excepto por que muestra un patrón diferente de glucosilación enlazado a la serina/treonina. La estabilidad al almacenamiento de una preparación de la glucoproteína (por ejemplo, al Factor VII) puede ser evaluada mediante la medición de (a) el tiempo requerido para que 20% de la bioactividad de una preparación decaiga cuando se almacena como un polvo seco a 25°C y/o (b) el tiempo requerido para una duplicación en la proporción de (por ejemplo, el Factor Vlla) los agregados de la glucoproteína en la preparación. En algunas modalidades, las preparaciones de la invención muestran un incremento de al menos aproximadamente 30%, preferentemente al menos aproximadamente 60% y más preferentemente al menos aproximadamente 100%, en el tiempo requerido para que 20% de la bioactividad decaiga con relación al tiempo requerido para el mismo fenómeno en una preparación de referencia, cuando ambas preparaciones son almacenadas como polvo seco a 25°C. Las mediciones de bioactividad pueden ser realizadas utilizando cualquiera de un ensayo de coagulación, ensayo de proteólisis, ensayo de enlace a TF, o ensayo de generación de trombina independiente de TF. En algunas modalidades, las preparaciones de la invención muestran un incremento de al menos aproximadamente 30%, preferentemente al menos aproximadamente 60%, y más preferentemente al menos aproximadamente 100%, en el tiempo requerido para la duplicación de los agregados con relación a una preparación de referencia, cuando ambas preparaciones son almacenadas como polvos secos a 25°C. Los contenidos de los agregados pueden ser determinados de acuerdo a los métodos conocidos para una persona experta en la materia, tales como, por ejemplo, métodos de HPLC de permeación en gel. Por ejemplo, el contenido de los agregados del Factor VII es determinado mediante HPLC de permeación en gel sobre una columna Protein Pak 300 SW (7.5 x 300 mm) (Waters, 80013) como sigue. La columna es equilibrada con el Eluyente A (sulfato de amonio 0.2 M, 5% de isopropanol, pH ajustado a 2.5 con ácido fosfórico, y después de esto el pH es ajustado a 7.0 con trietilamina) después de lo cual es aplicada a la columna 25 µg de la muestra. La elución es con el Eluyente A, a una velocidad de flujo de 0.5 ml/minuto por 30 minutos, y la detección es lograda mediante la medición de la absorbancia a 215 nm. El contenido de los agregados es calculado como el área pico de los agregados del Factor VII/área total de los picos de Factor VII (monómero y agregados ) . "Biodisponibilidad" se refiere a la proporción de una dosis administrada de una preparación de glucoproteína (por ejemplo, Factor VII o relacionada al Factor VII) que puede ser detectada en plasma a tiempos predeterminados después de la administración. Típicamente, la biodisponibilidad es medida en los animales de prueba mediante la administración de una dosis de entre aproximadamente 25-250 µg/kg de la preparación; obteniendo muestras plasmáticas a tiempos predeterminados después de la administración; y determinando el contenido de los polipéptidos glucosilados (por ejemplo, Factor VII o relacionados al Factor VII) en las muestras utilizando uno o más de un ensayo de coagulación (o cualquier bioensayo) , un inmunoensayo o un equivalente. Los datos son típicamente visualizados gráficamente como polipéptido [por ejemplo el Factor Vil] versus el tiempo y la biodisponibilidad es expresada como el área bajo la curva (AUC) . La biodisponibilidad relativa de una preparación de prueba se refiere a la proporción entre la AUC de la preparación de prueba y aquella de la preparación de referencia. En algunas modalidades, las preparaciones de la presente invención muestran una biodisponibilidad relativa de al menos aproximadamente 110%, preferentemente al menos aproximadamente 120%, más preferentemente al menos aproximadamente 130% y lo más preferentemente al menos aproximadamente 140% de la biodisponibilidad de una preparación de referencia. La biodisponibilidad puede ser medida en cualquier especie de mamífero, preferentemente perros, y los tiempos predeterminados son utilizados para calcular la AUC que puede abarcar diferentes incrementos desde 10 minutos hasta 8 horas. "Vida media" se refiere al tiempo requerido para que la concentración plasmática de (por ejemplo, polipéptidos del Factor VII o polipéptidos relacionados al Factor VII) la glucoproteína decaigan desde un valor particular hasta la mitad de ese valor. La vida media puede ser determinada utilizando el mismo procedimiento que para la biodisponibilidad. En algunas modalidades, las preparaciones de la presente invención muestran un incremento en la vida media de al menos aproximadamente 0.25 horas, preferentemente al menos aproximadamente 0.5 horas, más preferentemente al menos aproximadamente 1 hora, y lo más preferentemente al menos aproximadamente 2 horas, con relación a la vida media de una preparación de referencia. "Inmunogenicidad" de una preparación se refiere a la habilidad de la preparación, cuando se administra a un humano, para promover una respuesta inmune dañina, ya sea humoral, celular o ambas. Los polipéptidos del Factor Vlla y los polipéptidos relacionados al Factor Vlla no son conocidos como promotores de las respuestas inmunes detectables en humanos. No obstante, en cualquier subpoblación de humanos, pueden existir individuos quienes muestren sensibilidad a las proteínas particulares administradas. La inmunogenicidad puede ser medida mediante la cuantificación de la presencia de los anticuerpos anti-Factor VII y/o las células T que responden al Factor VII en un individuo sensible, utilizando métodos convencionales conocidos en la técnica. En algunas modalidades, las preparaciones de la presente invención muestran una disminución en la inmunogenicidad en un individuo sensible de al menos aproximadamente 10%, preferentemente de al menos aproximadamente 25%, más preferentemente al menos aproximadamente 40% y lo más preferentemente al menos aproximadamente 50%, con relación a la inmunogenicidad para ese individuo de una preparación de referencia. Composiciones farmacéuticas y Métodos de Uso Las preparaciones de la presente invención pueden ser utilizadas para tratar cualquier síndrome que responda a la glucoproteína relevante. Los síndromes que responden al Factor VII, FIX y VX, respectivamente, incluyen los síndromes tales como, por ejemplo, trastornos del sangrado, incluyendo, sin limitación, aquellos provocados por las deficiencias en el factor de la coagulación (por ejemplo, hemofilia A y B o deficiencia de los factores de la coagulación XI o VII) ; por trombocitopenia o enfermedad de von Willebrand, o por inhibidores de los factores de coagulación, o sangrado excesivo de cualquier causa. Las preparaciones pueden también ser administradas a pacientes en asociación con cirugía u otros traumas, o a pacientes que reciben terapia con anticoagulante. Las preparaciones que comprenden los polipéptidos relacionados al Factor VII de acuerdo a la invención, que tienen bioactividad sustancialmente reducida con relación al Factor Vil de tipo silvestre, pueden ser utilizadas como anticoagulantes, tales como, por ejemplo, en pacientes que sufren angioplastia u otros procedimientos quirúrgicos que pueden incrementar el riesgo de trombosis u oclusión de los vasos sanguíneos como ocurre, por ejemplo, en la restenosis. Otras indicaciones médicas para las cuales son prescritos los anticoagulantes incluyen, sin limitación, trombosis de venas profundas, embolismo pulmonar, apoplejía, coagulación intravascular diseminada (DIC) , deposición de fibrina en pulmones y riñones asociada con endotoxemia por gram-negativos, infarto del miocardio; Síndrome de Insuficiencia Respiratoria Aguda (ARDS) , Síndrome de Respuesta Inflamatoria Sistémica (SIRS) , Síndrome Urémico Hemolítico (HUS) , MOF y TP. Las composiciones farmacéuticas que comprenden el Factor VII y las preparaciones relacionadas al Factor VII de acuerdo a la presente invención están principalmente destinadas para la administración parenteral, para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico. Preferentemente, las composiciones farmacéuticas son administradas parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, o intramuscularmente. Éstas pueden ser administradas mediante infusión continua o pulsátil. Las composiciones o formulaciones farmacéuticas comprenden una preparación de acuerdo a la invención en combinación con, preferentemente disuelta en, un portador farmacéuticamente aceptable, preferentemente un portador o diluyente acuoso. Una variedad de diluyentes acuosos puede ser utilizada, tal como agua, agua amortiguada, 0.4% de solución salina, 0.3% de glicina y similares. Las preparaciones de la invención pueden también ser formuladas en preparaciones liposomales para la distribución o dirección al objetivo a los sitios de daño. Las preparaciones liposomales son en general descritas por ejemplo en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,837,028, 4,501,728 y 4,975,282. Las composiciones pueden ser esterilizadas mediante técnicas convencionales de esterilización bien conocidas. Las soluciones acuosas resultantes pueden ser envasadas para el uso o filtradas bajo condiciones asépticas y liofilizadas, la preparación liofilizada que se combina con una solución acuosa estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables o adyuvantes, incluyendo, sin limitación, agentes amortiguadores y ajustadores del pH y/o agentes ajustadores de la tonicidad, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. La concentración de los polipéptidos del Factor VII o relacionados al Factor VII en estas formulaciones pueden variar ampliamente, por ejemplo, de menos de aproximadamente 0.5% en peso, usualmente en o al menos aproximadamente 1% en peso hasta tanto como 15 o 20% en peso, y serán seleccionadas principalmente por los volúmenes de fluido, las viscosidades, etc., de acuerdo con el modo particular de administración seleccionado. De este modo, una composición farmacéutica típica para la infusión intravenosa podría ser constituida para contener 250 ml de solución estéril de Ringer y 10 mg de la preparación. Los métodos efectivos para preparar las composiciones parenteralmente administrables serán conocidos o aparentes para aquellos expertos en la técnica y se describen con más detalle en, por ejemplo, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 18a ed. , Mack Publishing Company, Easton, PA (1990) . Las composiciones que contienen las preparaciones de la presente invención pueden ser administradas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En aplicaciones terapéuticas, las composiciones son administradas a un sujeto que sufre ya de una enfermedad, como se describe anteriormente, en una cantidad suficiente para curar, aliviar o detener parcialmente la enfermedad y sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr esto es definida como la "cantidad terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para cada propósito dependerán de la severidad de la enfermedad o del daño, así como del peso y del estado general del sujeto. En general, no obstante, la cantidad efectiva estará en el intervalo de aproximadamente 0.05 mg hasta aproximadamente 500 mg de la preparación por día, para un sujeto de 70 kg, con dosis de aproximadamente 1.00 mg hasta aproximadamente 200 mg de la preparación por día que son más comúnmente utilizadas. Se entenderá que la determinación de una dosis apropiada puede ser lograda utilizando la experimentación rutinaria, mediante la construcción de una matriz de valores y probando diferentes puntos en la matriz. La distribución local de las preparaciones de la presente invención, tal como, por ejemplo, la aplicación tópica, puede ser llevada a cabo, por ejemplo, por medio de una aspersión, perfusión, catéteres de doble globo, stents, incorporados dentro de injertos vasculares o stents, hidrogeles utilizados para catéteres de globo de recubrimiento, u otros métodos bien establecidos. En cualquier caso, las composiciones farmacéuticas podrían proporcionar una cantidad de la preparación suficiente para tratar de manera efectiva al sujeto.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender además otros agentes bioactivos, tales como, por ejemplo, coagulantes o anticoagulantes no relacionados al Factor vil. EXPERIMENTOS Métodos generales Ensayo de a-xilosidasa Los ensayos de a-xilosidasa son conducidos en un amortiguador apropiado, por ejemplo, acetato de sodio 50 mM, pH 4.5, que contienen un sustrato adecuado, por ejemplo, los O-glucopéptidos que pueden ser obtenidos a partir del mapa del O-glucopéptido de la glucoproteína relevante (por ejemplo, rFVIIa) . La reacción es detenida después de un tiempo apropiado que puede ser determinado experimentalmente, por ejemplo, mediante la adición de ácido trifluoroacético, y las mezclas de ensayo son analizadas mediante HPLC. Ensayo de a-xilosiltransf erasa Los ensayos de a-xilosiltransferasa son conducidos en un amortiguador apropiado, por ejemplo Hepes 10 mM, pH 7.2, 0.1% de Tritón X-100, UDP-xilosa 0.5 mM (Sigma U5875), que contiene un sustrato adecuado, por ejemplo los 0-glucopéptidos que pueden ser obtenidos del mapa de 0-glucopéptidos de la glucoproteína relevante (por ejemplo, rFVIIa) o los oligosacáridos piridil-aminados preparados como se describe en Minamida et al. (Minamida et al., Detection of UDP-D-xylose: a-D-xyloside al-3xyloxyultransferase activity in human hepatoma cell line HepG2. j. Biochem. 120 1002-1006, 1996) . La reacción es detenida después de un tiempo apropiado, que puede ser determinado experimentalmente, por ejemplo mediante la adición de ácido trifluoroacético y las mezclas de ensayo son analizadas mediante HPLC. Los ensayos de a-xilosidasa y a-xilosiltransferasa son optimizados para el tiempo y, opcionalmente para la temperatura y el pH. Ensayo de O-glucosil transf erasa Los ensayos de O-glucosiltransferasa son conducidos, por ejemplo, como se describe por Shao et al. ( Glycobiology 12(11) 763-770 2002). Ensayos del Factor Vil Un ensayo adecuado para probar la actividad del factor Vlla y con esto seleccionar las variantes adecuadas del factor Vlla puede ser realizado como una prueba in vi tro preliminar simple. El ensayo es también adecuado para seleccionar variantes adecuadas del factor Vlla.
Ensayo de hidrólisis In vitro La variante del factor Vlla nativo (tipo silvestre) y el factor Vlla (ambos de aquí en adelante denominados como "factor Vlla") pueden ser evaluados para las actividades específicas. Éstos pueden también ser evaluados en paralelo a comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo es llevado a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp. Nunc. Dinamarca). El sustrato cromogénico D-Ile- Pro-Arg-p-nitroanilida (S-2288, Chromogenix, Suecia) , concentración final 1 mM, es agregado al factor Vlla (concentración final 100 nM) en Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene cloruro de sodio 0.1 M, cloruro de calcio 5 mM y 1 mg/ml de albúmina sérica bovina. La absorbancia a 405 nm es medida continuamente en un lector de placa ExpectraMax™ 340 (Molecular Devices, EUA). La absorbancia desarrollada durante una incubación de 20 minutos, después de la sustracción de la absorbancia en un pozo blanco que no contiene enzima, se utiliza para calcular la proporción entre las actividades del factor Vlla variante y de tipo silvestre: Proporción = (A05 nm factor Vlla variante) / (A05 nm factor Vlla tipo silvestre) . Con base en esto, las variantes del factor Vlla con una actividad comparable a o mayor que el factor Vlla nativo, pueden ser identificadas tales como, por ejemplo, las variantes donde la proporción entre la actividad de la variante y la actividad del factor nativo VII (FVII de tipo silvestre) es alrededor de 1 versus aproximadamente 1.0. La actividad del factor VTIa o las variantes del factor VTla pueden también ser medidas utilizando un sustrato fisiológico tal como el factor X, adecuadamente a una concentración de 100-1000 nM, donde el factor Xa generado es medido después de la adición de un sustrato cromogénico adecuado (por ejemplo S-2765) . Además, el ensayo de actividad puede ser corrido a temperatura fisiológica. Ensayo de Proteólisis In Vitro El Factor VIA nativo (tipo silvestre) y la variante del Factor Vlla (ambos denominados de aquí en adelante como "Factor Vlla") son evaluados en paralelo para comparar directamente sus actividades específicas. El ensayo es llevado a cabo en una placa de microtitulación (MaxiSorp. Nunc, Dinamarca). El Factor Vlla (10 nM) y el Factor X (0.8 microM) en 100 microl de Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene cloruro de sodio 0.1 M, cloruro de calcio 5 mM y 1 mg/ml de albúmina sérica bovina, se incuban por 15 minutos. La escisión del Factor X es luego detenida por la adición de 50 microlitros de Hepes 50 mM, pH 7.4, que contiene cloruro de sodio 0.1 M, EDTA 20 mM y 1 mg/ml de albúmina sérica bovina. La cantidad del Factor Xa generado es medida por la adición del sustrato cromogénico Z-D-Arg-Gly-Arg-p-nitroanilida (S-2765, Chromogenix, Suecia), concentración final 0.5 M. La absorbancia a 405 nm es medida continuamente en un lector de placa SpectraMax*1 340 (Molecular Devices, USA) . La absorbancia desarrollada durante 10 minutos, después de la sustracción de la absorbancia en un pozo blanco que no contiene FVIIa, se utiliza para calcular la proporción entre las actividades proteolíticas del Factor Vlla variante y de tipo silvestre: Proporción = (A405 nm factor Vlla variante) / (A405 nm factor Vlla de tipo silvestre) . Con base en lo anterior, las variantes del factor Vlla con una actividad comparable a o mayor que el factor Vlla nativo, pueden ser identificadas tales como, por ejemplo, las variantes donde la proporción entre la actividad de la variante y la actividad del factor VII nativo (FVII de tipo silvestre) es alrededor de 1, versus por arriba de 1.0. Ensayo de generación de trombina : La habilidad del factor VII o polipéptidos relacionados al factor VII (por ejemplo, variantes) para generar trombina puede ser medida en un ensayo que comprende todos los factores de la coagulación relevantes y los inhibidores a concentraciones fisiológicas y plaquetas activadas (como se describe en la página 543 en Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol . 99, 542-547 que es incorporada por referencia en la presente) . Ensayos de coagulación Ensayo de la generación La actividad de los polipéptidos del Factor VII puede ser también medida utilizando un ensayo de coagulación de una sola etapa, esencialmente como se escribe en los documentos W092/15686 o Patente de los Estados Unidos No. 5,997,864. En resumen, la muestra que va a ser probada es diluida en Tris 50 mM (pH 7.5), 0.1% de BSA y 100 µl se incuban con 100 µl de plasma deficiente del Factor VII y 200 µl de tromboplastina C que contiene 10 mm de Ca2+. Los tiempos de coagulación son medidos y comparados a una curva estándar utilizando un estándar de referencia o un combinado de plasma humano normal citratado en dilución en serie. Ensayo de 2a generación Esencialmente el mismo, excepto que es utilizado el factor tisular humano recombinante en vez de la tromboplastina C. Ensayo del Factor IX Prueba para la actividad del factor IX: Los ensayos adecuados para probar la actividad del factor IX, y con esto proporcionar medios para seleccionar variantes adecuadas del factor IX, para el uso en la presente invención, pueden ser realizados como pruebas in vi tro simples como se describe, por ejemplo, en Wagenvoord et al., Haemostasis 1990; 20(5): 276-88. La actividad biológica del factor IX puede ser también cuantificada mediante la medición de la habilidad de una preparación para corregir el tiempo de coagulación del plasma deficiente en el factor IX, por ejemplo, como se describe en Nilsson et al., 1959 (Nilsson IM, Blombaeck M, Thilen A, von Francken I., Carriers of haemophilia A - A laboratory study, Acta Med Sean 1959; 165: 357). En este ensayo, la actividad biológica es expresada como unidades/ml de plasma (1 unidad corresponde a la cantidad de FIX presente en el plasma combinado normal . .Ejemplos Los siguientes ejemplos están destinados a ser ilustraciones no limitantes de la presente invención. Ejemplo 1 Preparación de la a-xilosidasa por extracción y purificación La enzima a-xilosidasa puede ser preparada a partir de varias fuentes, por ejemplo a partir de material vegetal como se describe por Monroe et al. ( Plant Physiology and Biochemistry 41: 877-885 (2003)). Por ejemplo, los tejidos vegetales provenientes por ejemplo de Arabidopsis thaliana son triturados en un mortero y pistilo con arena de cuarzo en dos volúmenes de Amortiguador A (Hepes 40 mM, pH 7.0, cloruro de sodio ÍM) , y el extracto filtrado se centrífuga a 15,000 por g por 15 minutos. Se agrega sulfato de amonio por ejemplo hasta una saturación del 80%. Las proteínas precipitadas se recolectan mediante centrifugación a 15000 x g por 15 minutos y se vuelven a disolver en /Amortiguador A. La a-xilosidasa es purificada mediante cromatografía, por ejemplo sobre una columna de concanavalina A-Sepharose, sobre una columna de intercambio aniónico y/o sobre otras columnas cromatográficas conocidas por las personas expertas en la técnica. Las fracciones son recolectadas mediante la elución y las fracciones que contienen la enzima a-xilosidasa son identificadas mediante el uso del ensayo de a-xilosidasa. Ejemplo 2 Preparación de la a-xilosidasa por clonación y expresión en E. coli y purificación Los genes que codifican para las a-xilosidasas, que pueden hidrolizar los enlaces alfa-xilosídicos, han sido clonados y caracterizados previamente, y los genes que muestran homología significativa a las a-xilosidasas caracterizadas, han sido anotados en los genomas provenientes de varios organismos procarióticos y eucarióticos. Las secuencias génicas son disponibles en las bases de datos tales como SWISS-PROT o NCBI y pueden ser amplificadas por PCR a partir de ADN genómico a partir de los organismos respectivos. Fueron elegidos varios candidatos para la clonación y expresión en E. coli después de la búsqueda en las bases de datos de proteínas para la presencia de las proteínas a-xilosidasas. Los siguientes genes candidatos fueron seleccionados con base en la anotación ya existente en las bases de datos (A) , caracterización previamente publicada (P) o con base en el análisis de la homología a la a-xilosidasa (H) conocida: el gen tm0308 (Thermotoga marítima: A); gen bt3085 (2139 pb) y gen bt3659 (2475 pb) (Bacteroides thetaiotaomicron: A); gen bf0551 (2238 pb) y gen bfl247 (2538 pb) (Bacteroides fragilis: A); gen bl02681 (2310 pb) (Bacillus licheniformis: H) ; gen bhl905 (2328 pb) (Bacillus halodurans : H) , gen xylS (2196 pb) (Sulfolobus solfataricus : P) ; gen yicl (2319 pb) (Escherichia coli: P) . Estrategia para la clonación y expresión de las a-xilosidasas en E. coli El software SignalP (Bendtsen, J. D. et al., J. Mol. Biol., 340: 783-795, 2004) es utilizado para evaluar si un péptido de señal está potencialmente presente en el extremo N de las enzimas candidatas. BF0551, BF1247, BT3085, BT3659 son presumiblemente secretados como se indica por una fuerte predicción de un sitio de escisión del péptido de señal I. Un codón de metionina que codifica para una metionina inicial es incluido en el frente del primer aminoácido después del sitio de escisión predicho. El ácido desoxirribonucleico (DNA por sus siglas en ingles) genómico purificado proveniente de Bacteroides thetaiotaomi cron (ATCC 29148D) , Bacteroides fragilis (ATCC 25285D) , Bacillus haludurans (ATCC 21591D&BAA-125D) , Sulfolobus solfataricus (ATCC 35092D) , Thermotoga marítima (ATCC 43589D) es obtenido de American Type Culture Collection. En el caso de E. coli (derivado de la cepa K-12) y Bacillus licheniformis (ATCC 28450) , el DNA genómico es preparado a partir de las células bacterianas cultivadas toda la noche en el medio LB utilizando el equipo de tejidos de DNeasy (Qiagen) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los cebadores delantero e inverso para la amplificación por PCR son diseñados con una extensión en los extremos 5' , que comprende los sitios de escisión de enzima de restricción Ndel (o Xbal) y Xmal, respectivamente. La PCR es realizada utilizando las siguientes condiciones: 1) 95°C por 3 minutos: desnaturalización, 2) 94°C por 30 segundos: desnaturalización, 3) 55°C o 60°C por 30 segundos: recocido, 4) 72 °C por 2 minutos: alargamiento. Los pasos 2-4 son repetidos por 15 ciclos. Los productos de PCR son separados sobre geles de agarosa con 1% de bromuro de etidio y las bandas que muestran los tamaños predichos correctos son extirpadas de los geles y purificadas utilizando el equipo de purificación de DNA GFX (Amersham Pharmacia) . Los productos de PCR purificados son clonados dentro del vector pCR2.1TOPO de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Los clones que muestran el perfil de escisión con enzima de restricción correcto, son secuenciados para evaluar la secuencia de DNA. El inserto que representa los genes de la a-xilosidasa es liberado del vector pCR2.1TOPO utilizando las enzimas de restricción relevantes. Un vector de expresión de E. coli pETlla (Novagen) que contiene un sitio Ndel (y Xbal) y un sitio Xmal es escindido con enzimas de restricción relevantes y la parte del vector es purificada como se describe para los productos de PCR. El vector y los insertos son ligados entre sí utilizando el Equipo Rapid Ligation (Roche) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los productos de ligadura son transformados dentro de E. coli TOP10 (Invitrogen) por medio de transformación química o métodos de choque por calor conocidos por las personas expertas en la técnica. Las células son sembradas sobre placas de cultivo con medio LB/ampicilina (Amp) , toda la noche. Las colonias simples son seleccionadas de las placas y desarrolladas toda la noche en medio LB/Amp. Los plásmidos pET purificados provenientes de cada colonia son seleccionados para la presencia de los insertos correctos utilizando enzimas de escisión por restricción y evaluación de los tamaños de los insertos liberados. E. coli Roseta DE# (Novagen) es transformada con los plásmidos pET que contienen los genes a-xilosidasa y sembrados sobre placas LB con cloranfenicol (Cam) /Amp. Las células provenientes de las placas de toda la noche son resuspendidas en el medio líquido Cam/Amp LB y diluida a una OD6oo = 0.1. Las células en el medio líquido son propagadas hasta la OD6oo = 0.4-0.8. Las células son luego equilibradas a una temperatura de 18°C por 30 minutos y la inducción de proteínas es inducida con IPTG 0.5 mM o/n a 18°C. Las células son cosechadas y los botones son resuspendidos en un amortiguador (por ejemplo, Tris HCL 25 mM pH 7 o amortiguador de fosfato de potasio 10 mM pH 7) hasta una densidad celular correspondiente a OD6oo = aproximadamente 10. Las células son sonicadas sobre hielo por 3 a 7 veces 15 a 30 segundo con interrupciones de 30 segundos sobre hielo. Los desechos celulares son eliminados mediante centrifugación y los sobrenadantes son evaluados para la actividad. Ensayo para la actividad de a-xilosidasa Los sobrenadantes resultantes de la sonicación son evaluados sobre p-nitrofenil-a-D-xilopiranósido (Sigma) para la presencia de la actividad de a-xilosidasa. La enzima cruda es incubada con p-nitrofenil-a-D-xilopiranósido 5 mM a 37°C por 1-2 horas en un amortiguador (por ejemplo, amortiguador de potasio 10 mM pH 7 o un amortiguador de Tris HCl 25 M pH 7) . Las enzimas crudas son también evaluadas sobre un fragmento de FVII humano que comprende la glucosilación Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52 (fragmento peptídico que consiste de los residuos de aminoácidos 39-62 de FVII) para evaluar si la enzima puede o no escindir los enlaces 1,3-xilosídicos. La incubación con el péptido es realizada por 3 horas o toda la noche a 37°C. Las muestras del péptido incubadas con o sin a-xilosidasa son luego evaluadas por MALDI MS directamente después de la incubación, para evaluar si la enzima puede eliminar cero, uno o dos azúcares xilosa del glucopéptido. Purificación de las a-xilosidasas Es realizada una purificación parcial de la a-xilosidasa expresada antes de la incubación con rFVII. Los sobrenadantes (de aproximadamente 20 a 50 ml de cultivo celular) obtenidos después de la desintegración celular en un amortiguador adecuado (por ejemplo un amortiguador de fosfato 10 mM pH 7) . En el caso de las enzimas que vienen de los ter ófilos (por ejemplo tm0308, BH1905, XylS) , los sobrenadantes son también calentados a 50-70°C por 30 minutos, enfriados sobre hielo por 10 minutos y el precipitado es eliminado mediante centrifugación por 15 minutos a 15,000 G con el fin de eliminar los contaminantes de E. coli termolábiles . Los sobrenadantes son esterilizados por filtración y aplicados a una columna de DEAE FF de 1 ml (Amersham Pharmacia) . La purificación es realizada con el explorador AKTA (Amersham Pharmacia) FPLC con los siguientes amortiguadores: Amortiguador A: fosfato de sodio 25 mM pH 7, Amortiguador B: fosfato de sodio 25 mM pH 7 y cloruro de sodio 1 M. Después de que se carga la aplicación, la muestra no enlazada es lavada con el amortiguador A por 5 CV. Se utiliza un gradiente de 0-100% de amortiguador B por 20 CV durante el cual la proteína objetivo es eluida en fracciones. Después de la purificación, las fracciones que comprenden el pico principal en el cromatograma resultante son evaluadas mediante incubación sobre p-nitrofenil-a-D-xilopiranósido o mediante SDS-PAGE. Las fracciones que contienen la actividad de a-xilosidasa son diluidas en un amortiguador de Tris HCl 20 mM pH 7 , cloruro de calcio 2 mM y concentrado sobre columnas Vivaspin 20 de 50 , 000 MWCO (Vivascience) mediante centrifugación a 2900 rpm . O-glucoformas de rFVlla con glucosa exclusivamente en la serina 52 Las O-glucoformas de rFVlla exclusivamente con glucosa en la serina 52 son obtenidas mediante incubación de rFVlla en un amortiguador apropiado, por ejepplo glicilglicina o Tris HCl 20 rriM pH 7.0, cloruro de calcio 2 mM, con a-xilosidasa purificada por un tieppo apropiado, que puede ser determinado experimentalmente. Los espectros de masa que visualizan la desglucosilación son obtenidos mediante el análisis de las incubaciones ESI-MS de a-xilosidasa de rFVll (Q-STAR) . El rFVlla remodelado con glicano resultante es purificado a partir de la enzima a-xilosidasa por ej emplo mediante cromatografía de intercambio aniónico o filtración en gel o combinaciones adecuadas . La pureza de la 0-glicoforma preparada o rFVlla es verificada mediante el mapa de O-glucopéptido de rFVlla . Ejemplo 3 Preparación de la a-xilosidasa mediante clonación y expresión del gen de a-xilosidasa putativo de T. Marítima (tm0308) en E. coli y purificación La estrategia anterior (ver Ejemplo 2) fue seguida por toda la vía hasta una conclusión para tm0308. El gen de a-xilosidasa putativo de T. Marítima ( tm0308 ) fue ampli ficado por PCR y clonado dentro de un vector pETlla de E. coli . tm0308 soluble podría ser obtenido después de la expresión en una cepa de expresión de E. coli Roseta (DE3 ) y evaluación de una preparación cruda de TM0308 sobre un p-nitrof enil-a-D-xilopiranósido , indicó claramente la actividad de a-xilosidasa . La a-xilosidasa fue parcialmente purif icada utilizando cromatografía DEAE FF seguido por la concentración mediante ultrafiltración . La enzima parcialmente purificada fue incubada con FVII en un Tris 25 mM de pH 7 , amortiguador de cloruro de calcio 2 mM a diferentes proporciones de enzima/FVll por 3 horas a 50 °C o toda la noche a 37 °C . Los controles con composiciones idénticas de a-xilosidasa y rFVII a los cuales se agregó el sustrato sintético, mostraron que la enzima fue activa bajo estas condiciones y fue posible visualizar FVII con y sin tratamiento con xilosidasa sobre los geles de SDS y mediante ESI-MS . No obstante, no pudo ser detectada ninguna eliminación significativa de los azúcares de xilosa enlazados a Glc-0-ser52 en este primer experimento. En contraste, la eliminación de la xilosa a partir de un péptido FVIIa reducido y alquilado, que copprende Xyl-Xyl-Glc-O-SEr52 fue observada. Ejemplo 4 Preparación de la a-xilosidasa mediante clonación y expresión en E. coli Las siguientes construcciones han sido clonadas dentro de vectores de expresión pET de acuerdo con la estrategia descrita en el Ejemplo 2 : Gen bl02681 (2310 ' pb) (Bacillus licheniformis : H) ; gen bll905 (2328 pb) (Bacillus halodurans : H) , gen xylS (2196 pb) (Sulfolobus solfataricus : P) ; gen yicl (2319 pb) (Escherichia coli : P) . Las construcciones serán expresadas en Roseta, aislados , purificaos y evaluadas para la actividad de a-xilosidasa de acuerdo con la estrategia anteriormente descrita. Cada a-xilosidasa será incubada con rFVII en un amortiguador apropiado, por ejepplo, glicilglicina o Tris HCl 20 mM pH 7.0, cloruro de calcio 2 mM, por un tiempo apropiado que puede ser determinado experimentalmente y los Espectros de MS que visualizan la desglucos i lación serán obtenidos mediante análisis de las incubaciones ESI-LC-MS de la a-xilosidasa de rFVll (Q-STAR) . El rFVlla remodelado con glicano resultante será purificado a partir de la enzima a-xilosidasa por ej emplo mediante cromatograf ía de intercambio aniónico o f iltración en gel o combinaciones adecuadas de los mismos . La pureza de la O-glucoforma preparada de la rFVlla es veri f icada por el mapa de O-glucopéptido de rFVlla . Ejemplo 5 Preparación de la a-xilosidasa truncada mediante clonación y expresión en E. coli La estructura cristalina de Yicl fue recientemente resuelta . De este modo , la clonación de una enzima a-xilosidasa truncada que representa un dominio catalítico activo de la proteína Yicl (u otras a-xilosidasas similares) puede ser posible y está siendo planeada, ya que una enzima más pequeña, si es activa, puede tener mejor acceso al Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52 presente en el rFVlla nativo. Un dominio que comprende el sitio activo en la enzima es predicho a partir de la estructura. La secuencia de genes que codifica para esta parte de la secuencia de Yicl es preparada a partir del plásmido Yicl pETlla ya existente, por ejemplo mediante amplificación por PCR de las áreas relevantes del gen Yicl. Los cebadores utilizados para la PCR tendrán extensiones con los sitios de enzima de restricción que pueden ser utilizados para la ligadura el gen Yicl truncado dentro del vector pETlla. La enzima truncada, después de la expresión y purificación, será evaluada por su potencial para la desglucosilación de rFVlla como se describió anteriormente. Ejemplo 6 Preparación de rFVlla exclusivamente con la xilosa- (glucosa en la serina 52, o exclusivamente xilosa-xilosa-glucosa en la serina 52 por tratamiento con la a-xílosiltransf erasa Preparación de la a-xilosil transf erasa La enzima, UDP-D-xilosa: ß-D-glucósido-a-1, 3-D-xilosiltransferasa, puede ser preparada a partir de las células HepG2 como se describe por Omichi et al. (1997). En resumen, las células HepG2 son desarrolladas en un medio suplementado con 10% de suero fetal de ternera. La fracción microsomal es preparada mediante homogeneización de las células seguida por centrifugación. La enzima a-xilosiltransferasa es purificada mediante cromatografía, por ejemplo sobre una columna de intercambio aniónico y/o sobre otras columnas cromatográficas conocidas por la persona experta. Las fracciones son recolectadas durante la elución y las fracciones que contienen la enzima a-xilosiltransferasa son identificadas mediante el uso del ensayo de a-xilosiltransferasa. La enzima, UDP-D-xilosa: a-D-xilósido-a.1 , 3-xilosiltransferasa, puede ser preparada a partir de las células HepG2 como se describe por Minamida et al. (1996). En resumen, las células HepG2 son desarrolladas en un medio suplementado con 10% de suero fetal de ternera. La fracción microsomal es preparada mediante homogeneización de las células seguida por centrifugación. La enzima a-xilosiltransferasa es purificada mediante cromatografía, por ejemplo sobre una columna de intercambio aniónico y/o sobre otras columnas cromatográficas, conocidas por el experto en la materia. Las fracciones son recolectadas durante la elución y las fracciones que contienen la enzima a-xilosiltransferasa son identificadas mediante el uso del ensayo de a-xilosiltransferasa. Ensayo de a-xilosil transferasa Los ensayos de la a-xilosiltransferasa son conducidos en un amortiguador apropiado, por ejemplo Hepes 10 mM, pH 7.2, 0.1% de Tritón X-100, UDP-xilosa 0.5 mM (Sigma U5875) , que contiene un sustrato adecuado, por ejemplo los 0-glucopéptidos que pueden ser obtenidos a partir del mapa de O-glucopéptido de rFVlla o los oligosacáridos piridilaminados preparados como se describe en Minamida et al. (Minamida et al., Detection of UDP-D-xylose: a-D-xyloside al-3xylosyltransferase activity in human hepatoma cell line HepG2. J. Biochem. 120 1002-1006, 1996). La reacción es detenida después de un tiempo apropiado, que puede ser determinado experimentalmente, por ejemplo mediante la adición de ácido trifluoroacético, y las mezclas de ensayo son analizadas mediante HPLC. O-glucoformas de rFVlla exclusivamente con xilosa-glucosa en la serina 52 Las O-glucoformas de rFVlla exclusivamente con xilosa-glucosa en la serina 52, son obtenidas mediante (1) el tratamiento de rFVlla con la xilosidasa como se describe anteriormente, (2) la purificación del rFVlla tratado con xilosidasa, a partir de la xilosidasa por ejemplo mediante cromatografí de intercambio aniónico, y (3) mediante incubación del rFVlla tratado con xilosidasa, en un amortiguador apropiado, por ejemplo, glicilglicina, pH 7.0, cloruro de calcio 10 mM, con UDP-D-xilosa purificada: ß-D-glucósido-a-1, 3-D-xilosiltransferasa purificada, y la UDP-D-xilosa por un tiempo apropiado, que puede ser determinado experimentalmente. El rFVlla gluco-remodelado resultante es purificado a partir de la enzima UDP-D-xilosa: ß-D-glucósido-a-1, 3-D-xilosiltransferasa, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio aniónico. La pureza de la 0-glucoforma preparada de rFVlla es verificada mediante el mapa del O-glucopéptido de rFVlla. O-glucoformas de rFVlla exclusivamente con xilosa-xilosa-glucosa en la serina 52 Las O-glucoformas con xilosa-xilosa-glucosa en la serina 52 son obtenidas mediante (1) el tratamiento de rFVlla con xilosidasa como se describe anteriormente, (2) la purificación del rFVlla tratado con xiloxidasa, a partir de la xilosidasa por ejemplo mediante cromatografía de intercambio aniónico, (3) el tratamiento adicional con la enzima UDP-D-xilosa :ß-D-glucósido-a-l, 3-D-xilosiltransferasa y UDP-D-xilosa como se describe anteriormente, y (4) mediante incubación del producto en un amortiguador apropiado, por ejemplo glicilglicina, pH 7.0, cloruro de calcio 10 mM, con la enzima UDP-D-xilosa: ß-D-xilosido-a-1, 3-D-xilosiltransferasa y UDP-D-xilosa por un tiempo apropiado, que puede ser determinado experimentalmente. El rFVlla gluco-remodelado resultante es purificado a partir de la enzima UDP-D-xilosa: a-D-xilósido-a-1 , 3-xilosiltransferasa por ejemplo mediante cromatografía de intercambio aniónico. La pureza de la O-glucoforma preparada de rFVlla es verificada mediante el mapa de O-glucopéptido 'de rFVlla. Ejemplo 7 Análisis del patrón de la O-glucoforma de rFVlla Mapeo del péptido tríptico de la cadena ligera de rFVlla El contenido relativo de las O-glucoformas de rFVlla es determinado mediante el mapeo de péptido tríptico de la cadena ligera de rFVlla. El rFVlla es reducido y alquilado y la cadena ligera de rFVlla es purificada sobre una columna de RP-HPLC eludía con un gradiente de acetonitrilo en agua: ácido trifluoroacético. La cadena ligera de rFVIIA purificada es intercambiada con amortiguador a amortiguador Tris, pH 7.5 y digerida con tripsina. El digerido tríptico de la cadena ligera de rFVlla es analizado sobre una columna de RP-HPLC (por ejemplo Nucleosil C18, 5 µ, 300 A, 4.0 x 250 mm, Macherey-Nagel 720065) eluida con un gradiente de acetonitrilo (0% a 45% de acetonitrilo en 100 minutos) en agua: ácido trifluoroacético (ver Figura 2). El flujo es de 1.0 ml/minuto y la detección es UV a 215 nm. Los picos que contienen los O-glucopéptidos de rFVlla son eluidos después de aproximadamente 60 a 65 minutos, donde el lo y el 3er picos contienen los 0-glucopéptidos con una xilosa-xilosa-glucosa enlazada a la serina 52, y el 2o y 4o picos contienen los O-glucopéptidos con una glucosa enlazada a la serina 52. Similarmente, el lo y el 2o picos contienen 0-glucopéptidos con un tetrasacárido enlazado a la serina 60, y el 3er y 4o picos contienen O-glucopéptidos con una fucosa enlazada a la serina 60. Mapeo del péptido tríptico de rFVlla El patrón de la 0-glucoforma puede ser analizado mediante el mapeo del péptido tríptico de rFVlla. El rFVlla es intercambiado con amortiguador a amortiguador Tris, pH 7.5, y digerido con tripsina. La digestión tríptica de rFVlla es analizada sobre una columna de RP-HPLC (por ejemplo Nucleosil C18, 5 µ, 300 Á, 4.0 x 250 mm, Macherey-Nagel 720065) eluida con un gradiente de acetonitrilo (0% a 45% de acetonitrilo en 10 minutos) en agua.-ácido trifluoroacético. El flujo es de 1.0 ml/minuto y la detección es UV a 215. Los picos que contienen los O-glucopéptidos de rFVlla son eluidos después de aproximadamente 67 a 70 minutos donde el 1er pico contiene los O-glucopéptidos con una xilosa-xilosa-glucosa enlazada a la serina 52, y el 2o pico contiene los O-glucopéptidos con una glucosa enlazada a la serina 52. Análisis de masa total de rFVlla El patrón de la O-glucoforma puede ser analizado mediante análisis de masa total de rFVlla. El rFVlla es desalado sobre una columna Millipore ZipTip C4 equilibrada con 1% de ácido fórmico y eluida con 3% de ácido fórmico en 90% de metanol. La muestra eluida es analizada mediante la técnica de nanorrocío sobre un espectrómetro de masa Qstar XL . El pico mayor a aproximadamente 50500 Da representa las O-glucoformas de rFVlla con una glucosa enlazada a la serina 52 y el pico mayor a aproximadamente 50800 Da representa las O-glucoformas de rFVIIia con la xilosa-xilosa-glucosa enlazada a la serina 52. Ej empl o 8 Purificación de Glc-OSer52-FVII y Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52-FVII Glc-0-ser52-FVII y Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52-FVII fueron purificados utilizando dos ciclos de cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). La columna (1.0 cm de diámetro interno x 7.0 cm de longitud = 5.5 ml de volumen de columna (CV) ) empaquetada con Toso Haas TSK-Gel fenil 5 PW, fue equilibrada con 5 CV de histidina 10 mM, cloruro de calcio 10 mM, acetato de amonio 2.0 M, pH 6.0. La columna fue cargada aproximadamente con 2.5 mg de FVII por. ml de resina. A la solución de carga se agregaron acetato de amonio 2.0 M y cloruro de calcio 10 mM antes de la carga. La columna fue lavada con 5 CV de histidina 10 mM, cloruro de calcio 10 mM, acetato de amonio 2.0 M, pH 6.0. La elución fue realizada utilizando un gradiente lineal de 20 CV a partir de histidina 10 mM, cloruro de calcio 10 mM, acetato de amonio 2.0 M, pH 6.0 hasta histidina 10 mM, cloruro de calcio 10 mM, pH 6.0. La purificación fue realizada a una velocidad de flujo de 6 CV/hora y una temperatura de 5°C. Las fracciones fueron recolectadas durante la elución. El FVII eluyó en dos picos mayores traslapados (ver Figura 4: el cromatograma a partir de este primer ciclo de HIC) . Las fracciones que contenían el primer pico fueron combinadas (fracción "A", Figura 4) y posteriormente purificadas por un segundo ciclo de HIC, utilizando el mismo procedimiento cromatográfico que para el primer ciclo HIC (ver Figura 5 : el cromatograma obtenido mediante la recarga de la fracción "A" sobre la columna HIC) . Las fracciones que contenían el segundo pico mayor (fracción "B", Figura 4) se combinaron también y se purificaron adicionalmente por un segundo ciclo de HIC, utilizando el mismo procedimiento cromatográfico que para el primer ciclo de HIC (ver Figura 6 : el cromatograma obtenido mediante recarga de la fracción "B" sobre la columna HIC) . Glc-0-Ser52-FVII purificado fue identificado en la fracción pico, fracción 10 (Figura 5) , obtenida mediante la recarga de la fracción "A" sobre el segundo paso de HIC. El Xyl-Xyl-glc-0-Ser52-FVII purificado fue identificado en la fracción pico, fracción 15 (Figura 6) obtenido mediante recarga de la fracción "B" sobre el segundo paso de HIC. La identificación fue obtenida mediante mapeo de péptido tríptico de rFVlla como se describe en el Ejemplo 7 (Figura 7A y 7B) y por análisis de masa total de rFVlla como se describe en el Ejemplo 7 (Figura 8A y 8B) . Ambos análisis mostraron un alto contenido de Glc-0-Ser52-rFVIIa y un bajo contenido de Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52-rFVIIa en la fracción pico, fracción 10 y un bajo contenido de Glc-0-Ser52-rFVIIa y un alto contenido de Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52-rFVIIa en la fracción pico, fracción 15. No pudo ser obtenida una cuantificación del contenido de las O-glucoformas en las dos fracciones pico, debido al contenido de rFVlla relativamente bajo en las fracciones (Figura 7A y 7B: mapeo de polipéptido tríptico: Otros fragmentos peptídicos de rFVlla co-eluyeron con o eluyeron cercanos a los O-glucopéptidos, y el contenido de 0-glucopéptidos en bajas cantidades no pudo por lo tanto ser determinado) . (Figura 8A y 8B: análisis de masa total: otras O- y/o N-glucoformas de rFVlla, por ejemplo N-glucoformas de rFVlla que carecen de un ácido N-acetilneuramínico, aparecieron en los espectros de masa, y por lo tanto no pudo ser determinado el contenido de las 0-glucoformas de rFVlla en bajas cantidades. Las actividades específicas de las fracciones pico obtenidas del HIC (Tabla 1) fueron determinadas por el ensayo de coagulación de primera generación. Se encontró que la O-glucoforma Glc-0-Ser52-rFVIIa tuvo una baja actividad específica mientras que la O-glucoforma Xyl-Xyl-Glc-OSer52-rFVIIa tuvo una alta actividad específica. Tabla 1. Actividad específica determinada utilizando el ensayo de coagulación de primera generación para las fracciones pico obtenidas del HIC. El contenido de rFVlla fue determinado mediante HPLC.
Ejemplo 9 Purificación por cromatografía de interacción hidrofóbica Preparaciones de Glc-0-Ser52-rFVlla altamente purificadas y preparaciones de Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52-rFVIIa altamente purificadas pueden ser obtenidas mediante la purificación repetida sobre la cromatografía de interacción hidrofóbica como se describe anteriormente. Las preparaciones altamente purificadas de Glc-0-Ser52-rFVIla y Xyl-Xyl-Glc-0-Ser52-rFVIIa con contenido de rFVlla alto, pueden ser obtenidas mediante el incremento de la cantidad del material inicial para la cromatografía de interacción hidrofóbica utilizada como se describe anteriormente. El contenido de cada O-glucoforma de rFVlla en las preparaciones altamente purificadas con mayor contenido de rFVlla puede ser cuantificado por mapeo de péptido tríptico de la cadena ligera de rFVlla como se describe en el Ejemplo 7. Las actividades específicas de las preparaciones altamente purificadas pueden ser determinadas mediante el ensayo de coagulación de primera generación como se define anteriormente . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (28)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una preparación de una glucoproteína que contiene la porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y en donde la serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr, caracterizada porque contiene un patrón de glucosilación enlazado a serina/treonina, sustancialmente uniforme.
  2. 2. Una preparación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el patrón de glucosilación es al menos 80% uniforme, preferentemente al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% uniforme.
  3. 3. Una preparación de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque el glicano enlazado a la serina/treonina es Xyl-Xyl-Glc- .
  4. 4. Una preparación de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque el glicano enlazado a la serina/treonina es Xyl-Glc-.
  5. 5. Una preparación de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizada porque el glicano enlazado a la serina/treonina es Glc-.
  6. 6. Una preparación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque la glucoproteína es seleccionada del grupo de: polipéptidos del factor VII, polipéptidos relacionados al factor VII, polipéptido del factor IX, polipéptidos del factor X, polipéptidos del factor XII y polipéptidos de la proteína Z.
  7. 7. Una preparación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la glucoproteína es el factor VII humano.
  8. 8. Una preparación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la glucoproteína es una variación del factor VII y en donde la proporción entre la actividad de la variante del factor VII y la actividad del factor Vlla humano nativo (FVIIa de tipo silvestre) es al menos de aproximadamente 1.25 cuando se prueba en el "Ensayo de Hidrólisis in vitro", o en "Ensayo de Proteólisis in vitro", ambos como se describen en la presente descripción, preferentemente al menos de aproximadamente 2.0, o al menos aproximadamente 4.0.
  9. 9. Una preparación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la glucoproteína se selecciona del grupo de: factor IX humano, variantes de la secuencia del factor XI.
  10. 10. Un método para la elaboración de una preparación de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, en donde el glicano enlazado a la serina/treonina es -Glc; el método está caracterizado porque comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de una glucoproteína que contiene la porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys y en donde la serina/treonina forma parte de un enlace covalente Glc-O-Ser/Thr proveniente de una célula en la cual ésta es preparada, por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o aislamiento de la glucoproteína de una fuente natural; (b) poner en contacto la preparación obtenida en el paso (a) con una alfa-xilosidasa, bajo condiciones apropiadas para remover los residuos de xilosa de la glucoproteína, con lo cual se produce la glucoproteína que tiene un patrón alterado de glucosilación.
  11. 11. Un método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque incluye además el paso de aislar la glucoproteína preparada en el paso b que tiene una glucosilación de glucosa O-serina/treonina.
  12. 12. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10-11, caracterizado porque la glucosilación es una glucosilación de serina.
  13. 13. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque incluye además el paso de analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos, para determinar un patrón de glucoforma y, opcionalmente, repetir el paso b hasta que se obtiene el patrón de glucoforma deseado.
  14. 14. Un método para elaborar una preparación de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9 , en donde el glicano enlazado a la serina/treonina es Glc; el método está caracterizado porque comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de un polipéptido que contiene la porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2-Pro-Cys, por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (b) poner en contacto la preparación obtenida del paso (a) con una O-glucosil-transferasa y un donador de glucosa activado, bajo condiciones apropiadas para transferir un residuo de glucosa desde la porción donadora de glucosa a la porción aceptora de serina/treonina, con lo cual se produce el polipéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación.
  15. 15. Un método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque incluye además el paso de aislar la glucoproteína preparada en el paso b que tiene una glucosilación de glucosa O-serina/treonina.
  16. 16. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14-15, caracterizado porque la glucosilación es una glucosilación de serina.
  17. 17. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, caracterizado porque incluye además el paso de analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos, para determinar un patrón de glucoforma y, opcionalmente, repetir el paso b hasta que se obtiene el patrón de glucoforma deseado.
  18. 18. Un método para la elaboración de una preparación de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9 , en donde el glicano enlazado a la serina/treonina es Xyl-Glc-; el método está caracterizado porque comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de una glucoproteína que contiene una porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2- Pro-Cys, y en donde la serina/treonina forma parte del enlace covalente Glc-O-Ser/Thr; por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (b) poner en contacto la preparación obtenida en el paso (a) con un UDP-D-xilosa: ß-D-glucósido- -1 , 3-D-xilosiltransferasa y un donador de xilosil activado, bajo condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa desde la porción donadora de xilosa a la porción aceptora, con lo cual se produce el glucopéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación alterado.
  19. 19. Un método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque incluye además el paso de aislar la glucoproteína preparada en el paso b que tiene la glucosilación xilosa-glucosa-O-serina/treonina .
  20. 20. Un método de conformidad . con cualquiera de las reivindicaciones 18-19, caracterizado porque la glucosilación es una glucosilación de serina.
  21. 21. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque incluye además el paso de analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos, para determinar un patrón de glucoforma y, opcionalmente, repetir el paso b hasta que se obtiene el patrón de glucoforma deseado.
  22. 22. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque incluye el paso de retirar los residuos de xilosa terminales al someter la preparación obtenida en el paso (a) al método de conformidad con la reivindicaciones 10 a 13, antes del paso (b) .
  23. 23. Un método para la elaboración de una preparación de conformidad con las reivindicaciones 1 a 9, en donde el glicano enlazado a la serina/treonina es Xyl-Xyl-Glc-; caracterizado porque comprende los pasos de: (a) obtener una preparación de una glucoproteína que contiene una porción Cys-Xl-Ser/Thr-X2- Pro-Cys, y en donde la serina/treonina forma parte del enlace covalente Glc-O-Ser/Thr; por ejemplo, a partir de una célula manipulada por ingeniería genética (cultivo celular) o por aislamiento de la glucoproteína a partir de una fuente natural; (b) poner en contacto la preparación obtenida en el paso (a) con un UDP-D-xilosa: ß-D-glucósido-a-1 , 3-D-xilosiltransferasa y un donador de xilosil activado, bajo condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa desde la porción donadora de xilosa a la porción aceptora, con lo cual se produce el glucopéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación alterado, (c) poner en contacto la preparación obtenida en el paso (b) con UDP-D-xilosa :o¡-D-xilósido-a-l, 3-xilosiltransferasa y un donador de xilosilo activado, bajo condiciones apropiadas para transferir un residuo de xilosa desde la porción donadora de xilosa hasta la porción aceptora, con lo cual se produce el glucopéptido que tiene un patrón alterado de glucosilación.
  24. 24. Un método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque incluye el paso de aislar la preparación obtenida en el paso (b) antes de someter la preparación al paso (c) .
  25. 25. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 24, caracterizado porque incluye además el paso de aislar la glucoproteína preparada en el paso (c) que tiene la glucosilación xilosa-xilosa-glucosa-O-serina/treonina .
  26. 26. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23-25, caracterizado porque la glucosilación es una glucosilación de serina.
  27. 27. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, caracterizado porque incluye además el paso de analizar la estructura de los oligosacáridos enlazados a los polipéptidos para determinar un patrón de glucoforma y, opcionalmente, repetir el paso (b) y/o paso (c) hasta que se obtiene el patrón de glucoforma deseado.
  28. 28. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 23 a 27, caracterizado porque incluye además el paso de retirar los residuos de xilosa terminales al someter la preparación obtenida en el paso (a) al método descrito de conformidad con las reivindicaciones 10-13, antes del paso (b) .
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