JP2014088391A - O結合型糖鎖形成のポリペプチドおよび該ペプチドの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフを含む糖タンパク質の製剤を作成する方法であって、前記方法が、(a)培養細胞、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、前記セリン/ステオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、(b)糖タンパク質からキシロース残基を除去するのに適切な条件下で、工程(a)で得られた製剤をα-キシロシダーゼと接触させ、その結果、変更された糖鎖形成パターンを有する糖タンパク質を精製する工程と、を含む方法。
【選択図】図1
Description
Glc =グルコシル
Xyl =キシロシル
Ser =セリン(一文字表記: S)
Thr =スレオニン(一文字表記: T)
Pro =プロリン(一文字表記: P)
Cys =システイン(一文字表記: C)
FVII =因子VII
FVIIa =活性化された(二本鎖)因子VII
FIX =因子IX
FIXa =活性化された(二本鎖)因子IX
用語「EGFドメイン含有ポリペプチド」は、一以上の上皮成長因子(EGF)様ドメインを含むペプチド、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含むことを意味する。EGFドメインまたはリピートは、3つのジスルフィド結合を形成する6つの保存されたシステインによって定義された約40のアミノ酸を含む小さいモチーフである。EGFドメイン含有ポリペプチドは全て、O-グルコース修飾のための以下の共通配列を含む:Cys1-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys2(すなわち、Cys1-X1-Ser-X2-Pro-Cys2またはCys1-X1-Thr-X2-Pro-Cys2共通配列)(ここで、Cys1およびCys2はEGFリピートの第1および第2の保存されたシステインであり、X1およびX2はそれぞれ独立した任意のアミノ酸である)。
例えば、Shao et al. (Glycobiology 12(11): 763-770 (2002))に記載されたように、タンパク質O-糖転移酵素が調製されてもよい。
モチーフ:Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysは、主にマルチモジュラーなタンパク質(例えば血液凝固および線維素溶解性の因子)の上皮成長因子(EGF)ドメインにおいて主として見出されるであろう。該モチーフは、セリン-グルコース(Glc-O-Ser)またはスレオニン-グルコース(Glc-O-Thr)の結合が形成される、O-グルコース修飾のための共通配列である。凝固因子VII、IX、XおよびXII、ならびに血漿タンパク質Z、フィブリンおよびトロンボスポンジンは全て、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cys共通配列を含む。これらのうち、因子VIIおよびIXおよびタンパク質Zは、共通配列Cys-X1-Ser-X2-Pro-Cysを含む。
明細書中に使用されたとき、用語「因子VIIポリペプチド」または「FVIIポリペプチド」は、野生型ヒト因子VIIa(すなわち、米国特許第4,784,950号に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチド)のアミノ酸配列1〜406を含む任意のタンパク質およびその変異体、ならびに因子VII関連ポリペプチド、因子VII誘導体および因子VII接合体を意味する。この中には、野生型ヒト因子VIIaと比較して実質的に同一または向上した生物学的活性を示す、FVII変異体、因子VII関連ポリペプチド、因子VII誘導体および因子VII接合体が含まれる。
本発明には、因子IXポリペプチド、例えばJaye et al., Nucleic Acids Res. 11: 2325-2335, 1983.において開示されたアミノ酸配列を有するもの(野生型ヒト因子IX)が含まれる。
本発明のいくつかの実施態様において、因子IXは、「色素産生試験」(下記参照)で試験されたとき、前記因子IXポリペプチドの活性と天然のヒト因子IX(野生型因子IX)の活性との間の比が少なくとも約1.25である因子IX関連のポリペプチドである; 他の実施態様において、前記比は少なくとも約2.0である; さらなる実施態様において、前記比は少なくとも約4.0である。
本発明を行うにあたり、オリゴ糖のパターンは、当業者に知られた任意の方法を使用して決定され得る。当業者に知られた任意の方法には、これらに制限されないが、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC); キャピラリー電気泳動(CE); 核磁気共鳴(NMR); イオン化技術、例えば第一原子照射、エレクトロスプレー、またはマトリックス補助レーザー脱離(MALDI)を使用する質量分析(MS); ガスクロマトグラフィー(GC); 陰イオン交換(AIE)-HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、またはMSと組み合わせたエキソグリコシダーゼでの治療が含まれる。例えば、Weber et al., Anal. Biochem. 225:135 (1995); Klausen et al., J. Chromatog. 718:195 (1995); Morris et al., in Mass Spectrometry of Biological Materials, McEwen et al., eds., Marcel Dekker, (1990), pp 137-167; Conboy et al., Biol. Mass Spectrom. 21:397, 1992; Hellerqvist, Meth. Enzymol. 193:554 (1990); Sutton et al., Anal. Biohcem. 318:34 (1994); Harvey et al., Organic Mass Spectrometry 29:752 (1994)を参照されたい。
受容体糖タンパク質の起源は、本発明の重要な側面ではない。典型的には、糖タンパク質を、培養された原核生物細胞または真核生物細胞(例えば哺乳類、酵母、昆虫、菌類または植物細胞)において発現させることができる。しかしながら、該タンパク質はまた、天然源、例えば血漿、血清または血液から単離されてもよい。糖タンパク質は、全長タンパク質またはその断片であってもよい。
方法: 本発明には、上述したような所定のセリン/スレオニン結合型の糖鎖形成パターンを含む製剤を生成するための方法が含まれ、かつ、さらなる実施態様において、糖タンパク質の糖鎖形成の分布を最適化するための方法が含まれる(図3を参照)。記載された個々のプロセス工程は、所望の糖形成パターンを得るために、異なる組合せにおいて適用され得る。制限のない例は、以下に与えられる。
(a) 調製された細胞、例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(b) 供与基から受容基に所望の単糖またはオリゴ糖基を移行させるのに適した条件下で、前記糖タンパク質製剤を、「前記所望の単糖またはオリゴ糖基の活性化された供与体」および「前記所望の単糖またはオリゴ糖基を移行させるために適した酵素」と接触させ、その結果、変化した糖鎖形成パターンを有する糖ペプチドを生成する工程。
(aa) 調製された細胞、例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(bb) 単糖またはオリゴ糖基を除去するために適した条件下で、前記糖タンパク質製剤を、末端の単糖またはオリゴ糖基を除去するために適した酵素と接触させ、その結果、変化した糖鎖形成パターンを有する糖ペプチドを生成する工程。
(a) 調製された細胞、例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(b) キシロース残基を糖タンパク質から除去するために適した条件下で、工程(a)において得られた製剤を、キシロシダーゼと接触させる工程。
(b) グルコース供与基からセリン/スレオニン受容基にグルコース残基を移行させるために適した条件のもと、工程(a)において得られた製剤を、O-グルコシルトランスフェラーゼおよび活性化されたグルコース供与体と接触させる工程。
(a) 調製された細胞、例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(b) キシロース供与基から受容基にキシロース残基を移行させるために適した条件下で、工程(a)において得られた製剤を、UDP-D-キシロース: β-D-グルコシド α-1,3-D-キシロシル転移酵素および活性化されたキシロシル供与体と接触させ、その結果、変更された糖鎖形成パターンを有する糖ペプチドを生成する工程。
(a) 例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(b) キシロース供与基から受容基にキシロース残基を移行させるのに適した条件下で、工程(a)において得られた製剤を、UDP-D-キシロース: β-D-グルコシド α-1,3-D-キシロシル転移酵素および活性化されたキシロシル供与基と接触させる工程と、
(c) キシロース残基をキシロース供与基から受容基に移行させるのに適切な条件のもと、工程(b)において得られた製剤を、UDP-D-キシロース: α-D-キシロシドα-1,3-キシロシル転移酵素および活性化されたキシロシル供与基と接触させる工程。
実質的に均一なXyl-Glc-O-Ser52糖鎖形成を示す因子VIIポリペプチド
実質的に均一なGlc-O-Ser52糖鎖形成を示す因子VIIポリペプチド
実質的に均一なXyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖鎖形成を示す因子VII-関連ポリペプチド
実質的に均一なXyl-Glc-O-Ser52糖鎖形成を示す因子VII-関連ポリペプチド
実質的に均一なGlc-O-Ser52糖鎖形成を示す因子VII-関連ポリペプチド
実質的に均一なXyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖鎖形成を示す因子VII-関連ポリペプチド
実質的に均一なXyl-Glc-O-Ser52糖鎖形成を示す因子VII変異体
実質的に均一なGlc-O-Ser52糖鎖形成を示す因子VII変異体
実質的に均一なXyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IXポリペプチド
実質的に均一なXyl-Glc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IXポリペプチド
実質的に均一なGlc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IXポリペプチド
実質的に均一なXyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IX-関連ポリペプチド
実質的に均一なXyl-Glc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IX-関連ポリペプチド
実質的に均一なGlc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IX-関連ポリペプチド
実質的に均一なXyl-Xyl-Glc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IX変異体
実質的に均一なXyl-Glc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IX変異体
実質的に均一なGlc-O-Ser53糖鎖形成を示す因子IX変異体
(b) 水、任意的には塩成分、および任意的にはバッファーを含む溶液を使用して、糖タンパク質を親水性相互作用物質に結合させる工程、
(c) 水、任意的には塩成分、および任意的にはバッファーを含む溶液を使用して、疎水性相互作用物質を洗浄し、該疎水性相互作用物質から汚染物質を除去する工程、
(d) 直線的または段階的勾配または定組成的塩成分において、有機修飾体、水、任意的には塩成分、および任意的にはバッファーを含む溶液を使用して、疎水性相互作用物質を洗浄し、所望の糖鎖形成パターンを有する糖タンパク質を、所望の糖鎖形成を持たない糖タンパク質および疎水性相互作用物質から分離する工程、および
(e) 所望の糖鎖形成パターンを有する糖タンパク質を含む画分を収集する工程。
本明細書で使用されるとき、「糖タンパク質製剤」は、それらが合成される細胞から分離された多数の糖鎖形成を意味する。糖タンパク質製剤には、それらが合成される細胞から分離された不活性化された形態、活性化された形態、機能的に関連したポリペプチド、例えば、変異体および化学的に修飾された形態が含まれる。
任意的には、該ポリペプチドはさらに精製されてもよい。精製は、当該技術において周知の任意の方法を使用して達成され得る。例えば、これらに限定されないが、抗因子VIIまたは抗因子IX抗体などのカラムで構成されたアフィニティークロマトグラフィー(例えば Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; およびThim et al., Biochem. 27:7785, 1988を参照); 疎水性相互作用クロマトグラフィー; イオン交換クロマトグラフィー; サイズ排除クロマトグラフィー; 電気泳動的な手順(例えば、調製用の等電点電気泳動(IEF))、溶解度差に基づく分離(例えば硫安塩析)、または抽出などが含まれる。一般的には、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; and Protein Purification, J.-C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989を参照されたい。精製後、該製剤は、宿主細胞に由来した関連性の無いタンパク質を、好ましくは約10重量%未満、より好ましくは約5%、および最も好ましくは約1%未満含む。
本発明による所定のオリゴ糖類パターンを有する糖タンパク質の製剤は、(因子VIIポリペプチド、因子VII関連ポリペプチド、因子IXポリペプチドおよび因子IX関連ポリペプチドを含む)参照的製剤と比較して向上した機能的性質を示す。向上した機能的性質には、これらに限定されないが、a) 物理的性質(例えば貯蔵安定性); b) 薬物動態学的性質(例えば生物学的利用能および半減期); c) ヒトにおける免疫原性、およびd) 生物学的活性(例えば凝固活性)が含まれ得る。
本発明の製剤は、関連した糖タンパク質に反応するあらゆる病的症状を治療するのに使用され得る。例えば、因子VII、FIXおよびFX反応性症候群は、例えば出血障害のような症候群を含む。該出血障害には、これらに限定されないが、凝固因子欠乏(例えば、血友病AおよびB、または凝固因子XIまたはVIIの欠乏)によって引き起こされるもの、血小板減少またはフォン−ウィルブランド病によって引き起こされるもの、または凝固因子阻害物質によって引き起こされるもの、または原因を問わず過剰な出血によって引き起こされるものが含まれる。本発明の製剤はまた、手術または他の外傷に付随して患者に投与され得、または抗凝固療法を受けている患者に投与され得る。
一般的方法
α-キシロシダーゼ試験
α-キシロシダーゼ分析は、適切な基質{例えば、関連した糖タンパク質(例えばrFVIIa)のO-糖ペプチド地図から得られ得るO-糖ペプチド}を含む、適切なバッファ(例えば50mMの酢酸ソーダ、pH 4.5)中において行われる。例えば、トリフルオロ酢酸の追加によって実験的に決定され得る適切な時間後に反応を停止し、試験混合物をHPLCによって分析した。
α-キシロシル転移酵素試験は、適切な基質{例えば、関連した糖タンパク質(例えばrFVIIa)のO-糖ペプチド地図から得られ得るO-糖ペプチド、または、Minamida et al. (Minamida et.al., Detection of UDP-D-xylose: α-D-xyloside α1-3xylosyltransferase activity in human hepatoma cell line HepG2. J. Biochem. 120 1002-1006, 1996) に記載されたように調製されたピリジル-アミン化オリゴ糖}を含む、適切なバッファー(例えば10mMのHepes、pH 7.2、0.1%のTriton X-100、0.5mMのUDP-キシロース(Sigma U5875)中において行われる。該反応は、適切な時間が経過した後停止させ、実験的に決定することができる(例えば、トリフルオロ酢酸の追加によって)。そして、試験混合物をHPLCによって分析した。
O-グルコシル転移酵素試験は、例えばShao et al. (Glycobiology 12(11) 763-770 2002) によって記載されたように行われる。
因子VIIa活性化についての試験に適した試験法、および適切な因子VIIa変異体を選択するのに適した試験法は、単純な予備的インビトロ試験として行われ得る。試験法はまた、適切な因子VIIa変異体を選択するために適している。
天然(野生型)因子VIIaおよび因子VIIa変異体(以下、ともに「因子VIIa」として表記)は、比活性について試験され得る。これらはまた、その比活性を直接比較するために、並行して試験され得る。分析は、マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)で行われる。色素産生基質 D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド(S-2288, Chromogenix, Sweden)(最終濃度1mM)が、0.1M NaCl、5mM CaCl2および1mg/ml ウシ血清アルブミンを含む50mM Hepes(pH7.4)中の因子VIIa(最終濃度100nM)に加えられる。405ナノメートルの吸光度は、SpectraMax 340プレートリーダー(Molecular Devices, USA)において連続的に測定される。酵素を十分に含まないブランク中の吸光度の減算の後、20分間のインキュベーションにわたって呈される吸光度は、変異体の活性と野生型因子VIIaの活性との間の比を算出するために使用される:
比=(A405 nm 因子VIIa変異体)/(A405 nm 因子VIIa野生型)。
天然(野生型)因子VIIaおよび因子VIIa変異体(以下、ともに「因子VIIa」として表記)は、それらの比活性を直接比較するために並行して試験に供される。該分析は、マイクロタイタープレート(MaxiSorp, Nunc, Denmark)において行われる。0.1M NaCl、5mM CaCl2および1mg/ml ウシ血清アルブミンを含む100microL 50mM Hepes(pH7.4)中の因子VIIa(10nM)および因子X(0.8のmicroM)が、15分間にわたってインキュベートされる。その後、因子Xの切断が、0.1M NaCl、20mM EDTAおよび1mg/ml ウシ血清アルブミンを含む50microL 50mM Hepes(pH7.4)の追加によって停止される。精製された因子Xaの量は、色素産生基質Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド(S-2765、Chromogenix、Sweden)(終濃度0.5mM)の追加によって測定される。405ナノメートルの吸光度は、SpectraMax340プレートリーダー(Molecular Devices, USA)において連続的に測定される。10分間にわたって呈される吸光度は、FVIIaを含まないブランクウェル中の吸光度の減算の後、変異体のタンパク質分解活性と野生型因子VIIaのタンパク分解活性との比を算出するために使用される:
比=(A405 nm 因子VIIa変異体)/(A405 nm 因子VIIa野生型)。
トロンビンを生成する因子VIIまたは因子VII関連のポリペプチド(例えば変異体)の能力は、生理学的濃度での全ての関連する凝固因子および阻害物質ならびに活性化血小板を含んでなる試験において測定され得る(p.543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547上に記載 参照によって本明細書中に組み込まれる)。
第一生成試験
因子VIIポリペプチドの活性はまた、WO 92/15686またはUS 5,997,864に記載されたように、一段階凝固試験を使用して測定され得る。簡単に言うと、試験対象のサンプルが、50mM Tris (pH7.5)、0.1% BSA中に希釈され、100μLが、100μLの因子VII欠乏性血漿および10mM Ca2+を含む200μLのトロンボプラスチンCでインキュベートされる。血液凝固時間が測定され、段階的に希釈されたリファレンス基準またはクエン酸正常ヒト血奨の貯留液を使用して標準曲線と比較される。
トロンボプラスチンCの代わりに組み換え体人組織因子が使用されることを除いて、ほぼ同じある。
因子IX活性についての試験:
因子IX活性についての適切な試験法(その結果、本発明において使用に適した因子IX変異体を選択するための手段を提供する)は、例えば、Wagenvoord et al., Haemostasis 1990;20(5):276-88に記載されたような単純なインビトロ試験として行われうる。
以下の例は、本発明の非限定的な具体例として表わされる。
抽出および精製によるα-キシロシダーゼの調製
酵素α-キシロシダーゼは、多様供給源(例えば植物材料)から調製され得る。Monroe et al. (Plant Physiology and Biochemistry 41:877-885 (2003))を参照されたい。例えば、シロイヌナズナ由来の植物組織が、2容積のバッファーA(40mMのHepes、pH 7.0、1M NaCl)中において珪砂とともに乳鉢および乳棒ですりつぶされ、濾過された抽出物は、硫酸塩が加えられる15分間にわたって15000×gで遠心処理される。硫酸アンモニウムが、例えば80%飽和まで加えられる。沈殿したタンパク質は15分間にわたる15000×gの遠心処理によって集められ、バッファーAで再溶解される。キシロシダーゼは、例えばコンカナバリンA-セファロースカラム、陰イオン交換カラムおよび/または当業者に知られた他のクロマトグラフィーのカラム上で、クロマトグラフィーによって精製される。画分は溶出中に集められ、α-キシロシダーゼ酵素を含む画分が、α-キシロシダーゼ試験の使用によって同定される。
クローニングによるα-キシロシダーゼの調製および大腸菌における発現およびその精製
α-キシロシダーゼ(αキシロシド結合を加水分解し得る)をコードする遺伝子が、事前にクローン化されて特徴づけられ、特徴づけられたα-キシロシダーゼに強い相同性を示す遺伝子に、幾つかの原核生物および真核生物由来のゲノムにおいて注釈をつけた。遺伝子配列は、SWISS-PROTまたはNCBIのようなデータベースが利用可能であり、かつそれぞれの生物由来のゲノムDNAからPCRによって増幅され得る。α-キシロシダーゼのタンパク質の存在についてタンパク質データベースを検索した後、幾つかの候補遺伝子を、クローニングのために選択し、大腸菌内で発現させた。以下の候補遺伝子は、データベースにおいて既に存在する注釈(A)、事前に公開された特性(P)または既知のα-キシロシダーゼに対するホモロジー分析(H)に基づいて選択された: 遺伝子tm0308 (Thermotoga maritima: A); 遺伝子bt3085 (2139 bp) および 遺伝子bt3659(2475 bp) (Bacteroides thetaiotaomicron: A); 遺伝子bf0551 (2238 bp) および 遺伝子bf1247 (2538 bp) (Bacteroides fragilis: A); 遺伝子bl02681(2310 bp)(Bacillus licheniformis: H); 遺伝子bh1905 (2328 bp)(Bacillus halodurans: H), 遺伝子xylS (2196 bp)(Sulfolobus solfataricus: P); 遺伝子yicI (2319 bp) (Escherichia coli: P)。
SignalPソフトウェア(Bendtsen,J.D.et al. .J. Mol. Biol., 340:783-795, 2004)は、シグナルペプチドが候補となる酵素のN-末端中に存在する可能性があるか否かを評価するために使用される。BF0551, BF1247, BT3085, BT3659 は、シグナルペプチダーゼI切断部位の強力な予測によって示されるように分泌される可能性がある。開始メチオニンをコードするメチオニンコドンは、予測された切断部位の後ろの第一のアミノ酸の前に含まれる。
超音波処理で得られた上澄みは、α-キシロシダーゼ活性の存在についてp-ニトロフェニル α-D キシロピラノシド(Sigma)上で評価される。粗製の酵素は、バッファー(例えば、10mM カリウムバッファーpH 7または25mM トリスHCl pH 7バッファー)中で37℃で1〜2時間にわたって5mM p-ニトロフェニル α-D キシロピラノシドとともにインキュベートされる。粗製の酵素はまた、酵素がα-1,3キシロシド結合を切断し得るかどうかを評価するために、Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52糖鎖形成(FVIIのアミノ酸残基39〜62からなるペプチド断片)を含むヒトFVIIの断片上で試験される。ペプチドとのインキュベーションは、37℃で3時間または終夜にわたって行われる。キシロシダーゼとともに、またはキシロシダーゼなしでインキュベートされたペプチドのサンプルは、インキュベーション後にMALDI MSによって、酵素が0個、一つまたは二つのキシロース糖を糖ペプチドから除去し得るか否かについて直接的に評価される。
発現したα-キシロシダーゼの部分的精製は、rFVIIでインキュベーションする前に行われる。上清(約20〜50ml 細胞培養液由来)が、適切なバッファー(例えば、10mMのリン酸塩バッファー pH7)において細胞分裂後に得られた。好熱菌(例えば、tm0308、BH1905、XylS)由来の酵素の場合において、上清はまた、30分間にわたって50〜70℃で加熱され、10分間にわたって氷上で冷却され、および沈殿物が15分間にわたって15.000Gで遠心分離によって除去され、不耐熱性の大腸菌汚染を取り除く。
セリン52での排他的グルコースでのrFVIIaのO-糖形成は、適切なバッファー、例えばグリシルグリシンまたは20mM Tris HCl pH7.0、2mM CaCl2中におけるrFVIIaの、適切な時間(実験的に決定され得る)にわたる精製されたα-キシロシダーゼとのインキュベーションによって得られる。脱糖鎖形成を視覚化する質量スペクトルは、rFVII α-キシロシダーゼ・インキュベーションESI-MS(Q-STAR)を分析することによって得られる。
T. maritimaの推定上のα-キシロシダーゼ遺伝子(tm0308)の大腸菌内におけるクローニングおよびその発現、ならびにその精製による、α-キシロシダーゼの調製
上述した戦略(例2を参照)は、tm0308についての結論に完全に従う。T. maritimaの推定上のα-キシロシダーゼ遺伝子(tm0308)は、PCRによって増幅され、大腸菌pET11aベクターにクローン化された。可溶性tm0308は、大腸菌Rosetta(DE3)発現株における発現、およびp-ニトロフェニル α-D キシロピラノシド、明示的に示されたα-キシロシダーゼ活性についての粗TM0308製剤の評価の後に得られ得る。α-キシロシダーゼは、DEAE FFクロマトグラフィーを使用して部分的に精製され、その後に限外濾過によって上限濃度まで精製された。部分的に精製された酵素は、異なる酵素/FVII比で3時間50℃または終夜37℃で、25mM Tris pH7, 2mM CaCl2バッファーでインキュベートされた。α-キシロシダーゼおよびrFVIIの同一の組成物を含む対照群に合成基質が加えられると、酵素はこれらの条件のもとで活性を示し、SDS-ゲル上およびESI-MSによるキシロシダーゼ処理の有無でFVIIを視覚化することを可能にした。しかしながら、Glc-O-Ser52に結合したキシロース糖類の顕著な除去は、この第一の実験において検出され得なかった。対照的に、Xyl-Xyl-Glc-O-Ser52を含む還元およびアルキル化された精製FVIIaペプチドからのキシロースの除去は、観察された。
クローニングによるα-キシロシダーゼの調製および大腸菌内における発現
以下の構成物が、例2に記載された戦略に基づいてpET発現ベクター内にクローン化された:遺伝子bl02681(2310 bp)(Bacillus licheniformis: H); 遺伝子bl1905 (2328 bp)(Bacillus halodurans: H), 遺伝子xylS (2196 bp)(Sulfolobus solfataricus: P); 遺伝子yicI (2319 bp) (Escherichia coli: P)。
クローニングによる切断されたα-キシロシダーゼの調製および大腸菌内における発現
YicIの結晶構造は、最近解明された。YicIタンパク質(または他の類似のα-キシロシダーゼ)の活性な触媒性ドメインを表す切断されたα-キシロシダーゼ酵素のクローニングは可能である。より小さい酵素は、活性であるならば、天然rFVIIa中に存在するXyl-Xyl-Glc-O-Ser52によりよくアクセスし得る。酵素中の活性部位を含むドメインは構造から予測される。この部分のYicI配列をコードする遺伝子情報は、YicI遺伝子の関連した領域のPCR増幅による例についての既存のYicI pET11aプラスミドから調製される。PCRについて使用されたプライマーは、切断されたYicI遺伝子のpET11aベクターへのライゲーションのために使用され得る制限酵素部位で伸長する。切断された酵素は、発現および精製後に、上述したようなrFVIIaの脱グリコシル化についての潜在力について評価される。
キシロシル転移酵素処理による、セリン52での排他的キシロース-グルコースでのrFVIIaの調製またはセリン52での排他的キシロース-キシロース-グルコースでのrFVIIaの調製
酵素、UDP-D-キシロース: β-D-グルコシド α-1,3-D-キシロシル転移酵素は、Omichi et al. (1997)によって記載されたようなHepG2細胞から調製され得る。簡単に言えば、HepG2細胞を、10%ウシ胎児血清が補充された培地中で増殖させる。ミクロソーム画分は、細胞の均質化後の遠心分離によって調製される。α-キシロシル転移酵素は、クロマトグラフィー(例えば、陰イオン交換カラムおよび/または当業者に知られた他のクロマトグラフィーカラム)上で、クロマトグラフィーによって精製される。画分は溶出中に集められ、α-キシロシル転移酵素を含む画分は、α-キシロシル転移酵素の使用によって同定される。
α-キシロシル転移酵素試験は、適切な基質、例えば、Minamidaらに記載されたように調製されたrFVIIaまたはピリジルアミン化されたオリゴ糖類のO−糖鎖ペプチド地図から得られうるO-糖鎖ペプチドを含む、適切なバッファ(例えば、10mM Hepes、pH 7.2、0.1% Triton X-100、0.5mM UDP-キシロース(Sigma U5875))において行われる( Minamida et.al., UDP-D-キシロースの検出: ヒト肝腫細胞系統 HepG2におけるα-D-キシロシド α1-3キシロシル転移酵素活性 J. Biochem. 120 1002-1006, 1996)。該反応は、例えばトリフルオロ酢酸の追加によって実験的に決定されうる適切な時間後に停止され、該試験混合物がHPLCによって分析される。
セリン52での排他的キシロース-グルコースでのrFVIIaのO-糖鎖形成は、(1)上述したようなキシロシダーゼでのrFVIIaの処理、(2)例えば陰イオン交換クロマトグラフィーによるキシロシダーゼからのキシロシダーゼ処理されたrFVIIaの精製、(3)実験的に決定され得る適切な時間中、精製されたUDP-D-キシロース:β-D-グルコシド α-1,3-D-キシロシル転移酵素およびUDP-D-キシロースを含む適切なバッファ(例えばグリシルグリシン、pH7.0, 10mM塩化カルシウム)中におけるキシロシダーゼで処理されたrFVIIaのインキュベーションによって得られる。得られた糖鎖再構成型rFVIIaは、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーによって、UDP-D-キシロース:β-D-グルコシド α-1,3-D-キシロシル転移酵素から精製される。rFVIIaの調製されたO-糖鎖形成の純度は、rFVIIaのO-糖鎖ペプチド地図によって検証される。
セリン52でのキシロース-キシロース-グルコースでのrFVIIaのO-糖鎖形成は、(1)上述したようなキシロシダーゼでのrFVIIaの処理、(2)例えば陰イオン交換クロマトグラフィーによるキシロシダーゼからのキシロシダーゼ処理されたrFVIIaの精製、(3)UDP-D-キシロースでのさらなる処理:上述したようなβ-D-グルコシド α-1,3-D-キシロシル転移酵素およびUDP-D-キシロース、および(4) 実験的に決定しうる適切な時間中、精製されたUDP-D-キシロース:α-D-キシロシド α1,3-キシロシル転移酵素およびUDP-D-キシロースを含む適切なバッファー(例えばグリシルグリシン、pH7.0, 10mM塩化カルシウム)中における生成物のインキュベーション、によって得られる。得られた糖鎖再構成型rFVIIaは、例えば陰イオン交換クロマトグラフィーによって、UDP-D-キシロース:α-D-キシロシド α1,3-キシロシル転移酵素から精製される。rFVIIaの調製されたO-糖鎖形成の純度は、rFVIIaのO-糖鎖ペプチド地図によって検証される。
rFVIIaのO-糖鎖形成パターンの分析
rFVIIa軽鎖のトリプシン処理ペプチドマッピング
rFVIIaのO-糖鎖形成の相対的含量は、rFVIIa軽鎖のトリプシン処理ペプチドマッピングによって決定される。rFVIIaは還元およびアルキル化され、rFVIIa軽鎖は水:トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配で溶出されたRP-HPLCカラム上で精製される。精製されたrFVIIa軽鎖は、Trisバッファー、pH7.5にバッファー交換され、トリプシンで消化された。rFVIIa軽鎖のトリプシン消化は、水:トリフルオロ酢酸におけるアセトニトリル勾配(0%〜45%アセトニトリル 100min中)で溶出されたRP-HPLCカラム(例えば、Nucleosil C18, 5 μ, 300Å, 4.0×250 mm, Macherey-Nagel 720065)上で分析される(図2を参照)。流速は1.0ml/分であり、検出は215nmのUVである。
O-糖鎖形成パターンは、rFVIIaのトリプシン処理ペプチドマッピングによって分析され得る。rFVIIaは、TrisバッファーpH7.5にバッファー交換され、トリプシンで消化される。rFVIIaのトリプシン消化は、水:トリフルオロ酢酸中のアセトリトリル勾配(0%〜45%アセトリトリル 100min中)で溶出されたRP-HPLCカラム上(例えば、Nucleosil C18, 5μ, 300Å, 4.0×250 mm, Macherey-Nagel 720065)で分析される。流速は1.0 ml/分であり、検出は215nmのUVである。
O-糖鎖形成パターンは、rFVIIaの総質量分析によって分析され得る。rFVIIaは、1%ギ酸で平衡化されたMillipore ZipTip C4カラム上で脱塩化され、90%メタノール中の3%ギ酸で溶出される。溶出されたサンプルは、Qstar XL質量分光計でのナノスプレー技術によって分析される。
Glc-O-Ser52-FVIIおよびXyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVIIの精製
Glc-O-ser52-FVIIおよびXyl-Xyl-Glc-O-Ser52-FVIIは、2サイクルの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)を使用して精製された。Toso Haas TSK-Gelフェニル5 PWで充填されたカラム(内計1.0 cm×7.0 cm長 = 5.5 mlカラム容積 (CV))は、5 CV 10 mM ヒスチジン、10 mM CaCl2、2.0 M NH4-酢酸塩、pH 6.0で平衡化された。カラムには、約2.5 mgのFVII pr. Ml樹脂が搭載された。搭載する前に、搭載溶液に2.0 M NH4-酢酸塩および10 mM CaCl2が添加された。カラムを5 CV 10 mMヒスチジン、10 mM CaCl2、2.0M NH4-酢酸塩(pH 6.0)で洗浄した。溶出を行う際、10 mM ヒスチジン、10 mM CaCl2、2.0M NH4-酢酸塩(pH 6.0)から、10 mM ヒスチジン、10 mM CaCl2(pH 6.0)までの20CV直線的勾配を使用した。6CV/hの流速および5℃の温度で精製を行った。画分を溶出の間に集めた。
疎水性相互作用クロマトグラフィーによる精製
高度に精製されたGlc-O-Ser52-rFVIIa製剤および高度に精製されたXyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIa製剤は、上述したような疎水性相互作用クロマトグラフィー上で精製を繰り返すことによって得られうる。より高いrFVIIa含量を含む高度に精製されたGlc-O-Ser52-rFVIIaおよびXyl-Xyl-Glc-O-Ser52-rFVIIaが、上述したように行われた疎水性相互作用クロマトグラフィーについての開始物質の量を増加させることによって得られうる。より高いrFVIIa含量を含む高度に精製された製剤中におけるrFVIIaの各O-糖鎖形成の含量は、例7に記載されたようなrFVIIa軽鎖のトリプシン処理ペプチドマッピングによって定量化され得る。高度に精製された製剤の特異的活性は、上述したような第一生成凝固試験によって決定され得る。
Claims (28)
- Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフを含む糖タンパク質の製剤であって、前記セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成し、かつ前記製剤が実質的に均一なセリン/スレオニン結合型糖鎖形成パターンを含む製剤。
- 前記糖鎖形成パターンが、少なくとも80%均一、好ましくは少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%均一である請求項1に記載の製剤。
- 前記セリン/スレオニン結合型グリカンが、Xyl-Xyl-Glc-である請求項1または2に記載の製剤。
- 前記セリン/スレオニン結合型グリカンが、Xyl-Glc-である請求項1または2に記載の製剤。
- 前記セリン/スレオニン結合型グリカンが、Glc-である請求項1または2に記載の製剤。
- 前記糖タンパク質が、因子VIIポリペプチド、因子VII関連ポリペプチド、因子IXポリペプチド、因子Xポリペプチド、因子XIIポリペプチド、およびタンパク質Zポリペプチドからなる群から選択される請求項1〜5のいずれか一項に記載の製剤。
- 前記糖タンパク質が、ヒト因子VIIである請求項6に記載の製剤。
- 前記糖タンパク質が、因子VIIの変異体であり、因子VII変異体の活性と天然のヒト因子VIIa(野生型FVIIa)の活性との間の比が、「インビトロ加水分解試験」または「インビトロタンパク質分解試験」(ともに本明細書中に記載)において試験されたとき、少なくとも約1.25、好ましくは少なくとも約2.0、または少なくとも約4.0である請求項6に記載の製剤。
- 前記糖タンパク質が、ヒト因子IX、因子IX配列変異体の群から選択される請求項6に記載の製剤。
- 前記セリン/スレオニン結合型グリカンが-Glcである請求項1〜9のいずれか一項に記載の製剤を作製する方法であって、前記方法が、
(a) 調製された細胞、例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、前記セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(b) 糖タンパク質からキシロース残基を除去するのに適切な条件下で、工程(a)において得られた製剤をα-キシロシダーゼと接触させ、その結果、変更された糖鎖形成パターンを有する糖タンパク質を生成する工程と
を含む方法。 - グルコース-O-セリン/スレオニン糖鎖形成を有する、工程bにおいて調製された糖タンパク質を単離する工程をさらに含む請求項10に記載の方法。
- 前記糖鎖形成が、セリンのグリコシル化である請求項10または11に記載の方法。
- 糖鎖形成パターンを決定するためにポリペプチドに結合したオリゴ糖類の構造を分析する工程と、任意的には、所望の糖鎖形成パターンが達成されるまで工程(b)を繰り返す工程とをさらに含む請求項10〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セリン/スレオニン結合型グリカンがGlcである請求項1〜9のいずれか一項に記載の製剤を作製する方法であって、前記方法が、
(a) 例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(b) グルコース供与基からセリン/スレオニン受容基にグルコース残基を移行するのに適した条件下で、工程(a)において得られた製剤を、O-グルコシル転移酵素および活性化されたグルコース供与体に接触させ、その結果、変更された糖鎖形成パターンを有するポリペプチドを生成する工程と
を含む方法。 - グルコース-O-セリン/スレオニン糖鎖形成を有する工程bにおいて調製された糖タンパク質を単離する工程をさらに含む請求項14に記載の方法。
- 前記糖鎖形成が、セリンのグリコシル化である請求項14または15に記載の方法。
- 糖鎖形成パターンを決定するためにポリペプチドに結合したオリゴ糖類の構造を分析する工程と、任意的には、所望の糖鎖形成パターンが達成されるまで工程(b)を繰り返す工程とをさらに含む請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 前記セリン/スレオニン結合型グリカンがXyl-Glc-である請求項1〜9のいずれか一項に記載の製剤を作製する方法であって、前記方法が、
(a) 例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、前記セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(b) キシロース供与基から受容基へキシロース残基を移行するのに適切な条件下で、工程(a)において得られた製剤を、UDP-D-キシロース:β-D-グルコシド α-1,3-D-キシロシル転移酵素および活性化されたキシロシル供与体と接触させ、その結果、変更された糖鎖形成パターンを有するポリペプチドを生成する工程と
を含む方法。 - キシロース-グルコース-O-セリン/スレオニン糖鎖形成を有する工程bにおいて調製された糖タンパク質を単離する工程をさらに含む請求項18に記載の方法。
- 前記糖鎖形成が、セリンのグリコシル化である請求項18または19に記載の方法。
- 糖鎖形成パターンを決定するためにポリペプチドに結合したオリゴ糖類の構造を分析する工程と、任意的には、所望の糖鎖形成パターンが達成されるまで工程(b)を繰り返す工程とをさらに含む請求項18〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程(a)において得られた製剤を、工程(b)の前に請求項10〜13に記載された方法に供することによって末端キシロース残基を再移動させる工程をさらに含む請求項18〜21のいずれか一項に記載の方法。
- セリン/スレオニン結合型グリカンがXyl-Xyl-Glc-である請求項1〜9のいずれか一項に記載された製剤を作製する方法であって、前記方法が、
(a) 例えば、加工された細胞(細胞培養)から、または天然源から糖タンパク質を単離することによって、Cys-X1-Ser/Thr-X2-Pro-Cysモチーフであって、前記セリン/スレオニンがGlc-O-Ser/Thr共有結合の部位を形成するモチーフを含む糖タンパク質の製剤を得る工程と、
(b) キシロース供与基から受容基へキシロース残基を移行するのに適切な条件下で、工程(a)において得られた製剤を、UDP-D-キシロース:β-D-グルコシド α-1,3-D-キシロシル転移酵素および活性化されたキシロシル供与体と接触させ、その結果、変更された糖鎖形成パターンを有する糖ペプチドを生成する工程と、
(c) キシロース供与基から受容基へキシロース残基を移行するのに適切な条件下で、工程(b)において得られた製剤を、UDP-D-キシロース:α-D-キシロシド α-1,3-キシロシル転移酵素および活性化されたキシロシル供与体と接触させ、その結果、変更された糖鎖形成パターンを有する糖ペプチドを生成する工程と
を含む方法。 - 前記工程(c)に製剤を供する前に、前記工程(b)において得られた製剤を単離する工程をさらに含む請求項23に記載の方法。
- キシロース-キシロース-グルコース-O-セリン/スレオニン糖鎖形成を有する工程(c)において調製された糖タンパク質を単離する工程をさらに含む請求項23または24に記載の方法。
- 前記糖鎖形成が、セリンのグリコシル化である請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
- 糖鎖形成パターンを決定するためにポリペプチドに結合したオリゴ糖類の構造を分析する工程と、任意的には、所望の糖鎖形成パターンが得られるまで工程(b)および/または工程(c)を繰り返す工程とをさらに含む請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(a)において得られた製剤を、工程(b)の前に請求項10〜13のいずれか一項に記載の方法に供することによって末端キシロース残基を再移動させる工程をさらに含む請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
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