ES2316163T3 - Ensayo de union magneticamente asistida utilizando un reactivo con respuesta magnetica. - Google Patents
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Abstract
Un método para determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método comprendiendo las etapas de: (1) poner en contacto dicha muestra de ensayo con un reactivo de partículas en fase sólida móvil y con un reactivo magnéticamente sensible para formar una mezcla de reacción, dicho analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil y a dicho reactivo magnéticamente sensible para formar un complejo constando de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil, una pluralidad de dichos reactivos magnéticamente sensibles y dicho analito; (2) someter dicha mezcla de reacción a un campo magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dicho complejo si dicho complejo está presente en dicha mezcla de reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando manifestada por el movimiento o captura de dicho complejo a una velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil solo; y (3) medir directa o indirectamente el grado de dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza que actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la captura magnética de dicho complejo utilizando un dispositivo visual o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida móvil son separados del complejo por movimiento en un canal capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi) ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente, (ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de ensayo.
Description
Ensayo de unión magnéticamente asistida
utilizando un reactivo con respuesta mágnetica.
Esta invención se refiere a un método para
determinar la presencia o cantidad de analito en una muestra de
ensayo, utilizando materiales magnéticamente reactivos. Más
concretamente, la invención tiene que ver con el empleo de
materiales magnéticamente reactivos para cambiar las propiedades de
componentes en ensayos de unión.
Las ensayos diagnósticos han llegado a ser un
medio indispensable para detectar analitos en muestras de ensayo,
utilizando la reacción mutua entre el analito y un miembro de unión
específica para el analito, tal como la inmunorreacción entre un
antígeno y un anticuerpo que se une a ese antígeno. Típicamente, en
tales ensayos diagnósticos se emplean etiquetas o marcadores
detectables unidos a anticuerpos, los cuales, a su vez, se unen al
analito de interés, en donde la detección del complejo
analito-anticuerpo marcado resultante, o la
detección del anticuerpo marcado que no se une al analito para
formar un complejo, es utilizada para indicar la presencia o
cantidad de analito en la muestra de ensayo.
Dos técnicas de ensayo diagnóstico comúnmente
utilizadas, que emplean miembros de unión específica, son el
radioinmunoensayo (RIA) y el inmunoensayo enzimático (EIA), ambos
cuales emplean un miembro de unión específica marcado. El RIA
utiliza un isótopo radioactivo como etiqueta o marcador detectable
unido a un miembro de unión específica. Debido a que el isótopo
radiactivo puede ser detectado en cantidades muy pequeñas, puede
ser utilizado para detectar o cuantificar cantidades pequeñas de
analito. Sin embargo, las desventajas sustanciales asociadas con el
RIA incluyen las instalaciones especiales y la extrema cautela que
se requieren al manipular materiales radioactivos, el alto coste de
tales reactivos, y sus especiales requerimientos de evacuación.
El EIA utiliza una enzima como etiqueta o
marcador detectable unido a un miembro de unión específica, en
donde se utiliza la actividad enzimática de la enzima para detectar
la inmunorreacción. Mientras que el EIA no tiene alguna de las
mismas desventajas del RIA, las técnicas EIA necesitan típicamente
la adición de materiales sustrato para provocar la reacción
enzimática detectable. Además, los sustratos enzimáticos son
frecuentemente inestables y tienen que ser preparados justo antes de
su uso, o ser almacenados bajo refrigeración. Además, los
marcadores enzimáticos pueden ser difíciles de purificar y conjugar
con miembros de unión, y pueden ser inestables durante el
almacenamiento a temperatura ambiente o incluso bajo condiciones
refrigeradas. Los inmunoensayos enzimáticos son también
insatisfactorios porque los métodos requieren típicamente
incubaciones complejas, múltiples adiciones de líquidos, y múltiples
etapas de lavado.
Más recientemente, se han desarrollado técnicas
de ensayo que utilizan partículas de sol metálicas como marcadores
visuales. En estas técnicas, se utiliza un metal (por ejemplo, oro,
plata, platino), un compuesto metálico o una sustancia no metálica
recubierta con un metal o compuesto metálico, para formar una
dispersión acuosa de partículas. Generalmente, el miembro de unión
específica a marcar es absorbido sobre las partículas de sol
metálicas, y las partículas son capturadas o agregadas en presencia
de analito. Aunque las partículas de sol metálicas tienen la
ventaja de producir una señal que es visualmente detectable así como
medible por un instrumento, son difíciles de medir
cuantitativamente. Las partículas de sol metálicas tienen también
una intensidad de color limitada, y por consiguiente, una limitada
sensibilidad en algunos ensayos. Además, las superficies de las
partículas de sol metálicas inorgánicas, tales como oro, pueden no
aceptar fácilmente la unión covalente de miembros de unión
específica. De este modo, durante su uso en un ensayo de unión, se
tiene que tener cuidado para que los miembros de unión específica
adsorbidos no sean extraídos de las partículas inorgánicas mediante
la combinación del desplazamiento por otras proteínas o agentes
tensoactivos y de las fuerzas de corte que acompañan a las etapas
de lavado empleadas para eliminar el material unido no
específicamente. Las partículas de sol metálicas pueden ser
difíciles de recubrir sin inducir agregación; pueden agregarse en
el almacenamiento o pueden agregarse con la adición de tampones o
sales. Además, tales marcadores particulados son difíciles de
concentrar y pueden ser difíciles de dispersar.
Otros materiales para marcadores incluyen
sustancias quimioluminiscentes y fluorescentes. Sin embargo, estas
sustancias pueden ser inestables, y los materiales fluorescentes
pueden experimentar atenuación. Como marcadores visuales, también
se han utilizado partículas no metálicas, tales como partículas de
látex teñidas o coloreadas.
Los dispositivos para inmunoensayos
autoejecutables han demostrado ser de gran beneficio en el campo de
la diagnóstica. Un dispositivo para inmunoensayos autoejecutables es
un kit conteniendo inmunorreactivos al que se puede añadir
primeramente una muestra biológica por el paciente o el técnico de
laboratorio, después se realiza el ensayo diagnóstico sin la
necesidad de complejos instrumentos de laboratorio. Los dispositivos
para inmunoensayos autoejecutables disponibles comercialmente,
tales como el dispositivo de ensayo por tiras teniendo la marca
registrada "TESTPACK PLUS", distribuido por Abbott
Laboratories, permite que los inmunoensayos sean realizados rápida y
fiablemente.
Típicamente, los dispositivos para inmunoensayos
autoejecutables implican tiras de ensayo cromatográficas. Por
ejemplo, la Patente U.S. Nº 4.960.691 revela una tira de ensayo para
análisis, de un analito en una muestra, por medio de una serie
secuencial de reacciones. La tira de ensayo consta de un tramo de
material cromatográfico teniendo capilaridad y de la capacidad de
transporte, mediante un disolvente cromatográfico, de reactivos no
inmovilizados y componentes reactivos de una muestra por medio de un
disolvente cromatográfico seleccionado. La tira de ensayo incluye
(1) un primer extremo en el que empieza el transporte mediante un
disolvente cromatográfico, (2) un segundo extremo en el que termina
el transporte median un disolvente cromatográfico, y (3) una
pluralidad de zonas dispuestas entre el primer y segundo extremos.
Estas zonas incluyen (1) una primera zona impregnada con un primer
reactivo que es móvil en el disolvente y capaz de una reacción de
unión específica con el analito, (2) una segunda zona para recibir
la muestra, y (3) una tercera zona, corriente abajo de la segunda
zona, impregnada con un segundo reactivo que está inmovilizado
frente el transporte mediante un disolvente, y es capaz de una
reacción de unión específica con el analito, para inmovilizar el
analito en la tercera zona. La tira de ensayo está diseñada para
que el primer reactivo pueda ser detectado en la tercera zona como
medida del analito.
Una característica común de las tiras de ensayo
cromatográficas implica el flujo de fluido o de una mezcla de
fluido y partículas a través de una matriz porosa. La tira de ensayo
incluye típicamente una zona de reacción donde pueden ocurrir
reacciones de unión. Para que en las tiras de ensayo cromatográficas
sucedan reacciones de unión adecuadas, el fluido o mezcla tiene que
fluir sustancial y uniformemente a través de la zona de
reacción.
Un problema con los dispositivos de ensayo de
este tipo es la inherente variabilidad en el material de que está
formada la matriz porosa. Esta variabilidad (por ejemplo, en
porosidad) afecta directamente al flujo de fluido a través de la
matriz, y puede afectar adversamente a la precisión del dispositivo
de ensayo. Además, la matriz a menudo se unirá no específicamente a
las partículas o reactivos en sitios en la zona de reacción
pretendida o en otra parte, necesitando de ese modo el uso de
procedimientos de pasivación complicados después de que se haya
aplicado el reactivo inmovilizado. Por consiguiente, existe el deseo
de desarrollar un rápido y sencillo dispositivo para ensayos
autoejecutables, que no requiera que un fluido fluya a través de una
matriz porosa.
Otro problema con los dispositivos para
inmunoensayos autoejecutables es la necesidad de inmovilizar un
reactivo de unión específica sobre la tira de ensayo, a fin de que
los reactivos involucrados en el ensayo puedan ser capturados en la
zona de reacción. El proceso para inmovilizar los reactivos de unión
específica sobre la tira de ensayo puede ser difícil de controlar,
conduciendo a variaciones lote a lote en la capacidad de unión de
la zona de reacción. Además, los reactivos de unión inmovilizados
pueden ser inestables, originando que la capacidad de unión de la
zona de reacción cambie después del transporte o almacenamiento.
Debido a que el reactivo de unión específica inmovilizado es
específico para el ensayo de un analito concreto, las tiras de
ensayo tienen que ser dedicadas a un ensayo concreto. Un problema
adicional con los dispositivos para inmunoensayos autoejecutables
es la variación lote a lote resultante de los procesos de
fabricación, especialmente la variación de la actividad de los
reactivos biológicos, tales como las moléculas de unión. Por
ejemplo, las variaciones lote a lote en la capacidad de unión del
reactivo de unión, en la zona de captura de una tira de ensayo,
pueden afectar a los resultados. Aunque los ajustes en las
actividades o concentraciones de los otros reactivos pueden
compensar, el hacer tales ajustes supone el introducir una
complejidad excesiva a los procesos de fabricación, y se necesita
casar cada lote de tiras de ensayo con lotes concretos de reactivos.
La capacidad de utilizar una tira de ensayo uniforme, completamente
estable, en ensayos para varios analitos diferentes simplificaría
sumamente la producción y control de ensayos autoejecutables basados
en tiras. Alternativamente, sería ventajosa la capacidad de adaptar
fácilmente una tira de ensayo durante su fabricación, para
satisfacer los requerimientos de un conjunto de reactivos.
En varias aplicaciones es conveniente utilizar
un ensayo autoejecutable que dé un resultado positivo por encima de
una cierta concentración de analito y un resultado negativo por
debajo de esa concentración, con un intervalo muy estrecho de
concentraciones de transición. Con tiras de ensayo convencionales,
ha sido difícil lograr este resultado.
Las micropartículas superparamagnéticas también
son utilizadas ampliamente en la realización de inmunoensayos. Las
micropartículas superparamagnéticas son magnéticamente reactivas
porque un campo magnético aplicado originará una fuerza que actúe
sobre ellas en la dirección del generador del campo magnético. Sin
embargo, no retendrán ningún magnetismo residual después de que se
quite el campo magnético aplicado. Típicamente, las partículas se
unen a un miembro de unión específica para formar un conjugado,
siendo capaz el miembro de unión específica de unirse al analito de
interés. El conjugado de miembro de unión
específica-partículas es dispersado en un líquido,
el cual se mezcla después con la muestra para formar una mezcla de
ensayo, permitiendo de ese modo que el conjugado de miembro de
unión específica-partículas se una al analito, si el
analito estuviese presente. El complejo de
conjugado-analito es atraído después hacia una
superficie sólida mediante la aplicación de un campo magnético, y
se elimina el material no unido al conjugado (comúnmente conocido
como separación unido/libre), como se describió en los N^{os} de
Patente U.S. 4.745.077, 4.070.246 y 3.985.649. Por regla general, se
necesitan etapas de lavado, adiciones de reactivos y separaciones
unido/libre adicionales antes de que se produzca una señal medible.
Los métodos analíticos de este tipo emplean típicamente emisión de
luz (quimioluminiscencia o fluorescencia), absorción de luz después
de la producción enzimática de un cromóforo, o emisión radioactiva
como señal indicadora de la cantidad de analito de interés.
Típicamente, la reactividad magnética de las partículas
superparamagnéticas se utiliza únicamente como una ayuda en las
etapas de separación unido/libre, con el resto del procedimiento de
ensayo implicando reactivos y protocolos convencionales. Por
consiguiente, los análisis convencionales que utilizan partículas
superparamagnéticas están limitados a cualquier instrumentación
automatizada compleja (por ejemplo, el ACS 180 de Ciba Corning
Diagnostics) o a una serie prolongada de etapas de ensayo
manuales.
El tamaño y composición de las partículas
superparamagnéticas y la intensidad y gradiente del campo magnético
aplicado determinarán la magnitud de la fuerza magnética ejercida
sobre ellas. Cuando se aplica un campo magnético a una suspensión
líquida de tales partículas, la magnitud de la fuerza ejercida en
cada partícula, y la resistencia hidrodinámica de cada partícula,
determinarán su velocidad de movimiento a través del líquido hacia
el generador del campo magnético. Para partículas magnéticamente
reactivas de composición similar, la fuerza ejercida sobre una
partícula individual mediante un campo magnético aplicado, y por lo
tanto su velocidad de movimiento a través del líquido, depende de su
volumen, mientras que la resistencia está determinada por su área
transversal. Las partículas magnéticamente reactivas más pequeñas se
moverán más lentamente en un campo magnético aplicado debido a la
fuerza más débil ejercida en cada partícula con respecto a su área
transversal, y las partículas superparamagnéticas muy pequeñas,
tales como ferrofluidos, se moverán muy lentamente debido a que la
fuerza ejercida sobre ellas es comparable a la de las fuerzas
aleatorias de las moléculas que las rodean. Estas fuerzas
aleatorias proceden del movimiento térmico (browniano). A medida
que las partículas aumentan de tamaño, su volumen aumenta más
rápidamente de lo que lo hace su área transversal, con el resultado
de que la fuerza magnética aumenta más rápidamente de lo que lo hace
la resistencia. La reunión de varias partículas pequeñas de
movimiento lento en agregados producirá que la suma de las fuerzas
que actúan sobre las partículas individuales sea ejercida sobre los
agregados, con el resultado de que los agregados se moverán más
rápidamente a través del líquido, hacia la fuente del campo
magnético, que las partículas individuales. También se pueden
seleccionar la intensidad y gradiente del campo magnético aplicado
para favorecer el movimiento o captura de tipos o formas concretas
de reactivos magnéticamente sensibles.
La Patente U.S. Nº 5.108.933 revela un método
por el que se pueden utilizar partículas coloidales magnéticamente
reactivas para la separación de alguna de las diversas sustancias
diana, a partir de un medio de ensayo sospechoso de contener la
sustancia de interés, mediante la transformación de partículas en
microaglomerados que incluyen la sustancia diana, vía manipulación
de su o sus propiedades coloidales. Los aglomerados resultantes
pueden ser posteriormente extraídos del medio utilizando imanes de
laboratorio corrientes, ya que las partículas están compuestas de
suficiente material magnético, por encima de un umbral empírico,
para efectuar tal extracción. El método se lleva a cabo añadiendo
al medio de ensayo partículas coloidales aglomerables y
resuspendibles, las cuales son capaces de una suspensión estable en
el medio de ensayo, formando un aglomerado magnético comprendiendo
las partículas coloidales y cualquier sustancia diana presente en el
medio de ensayo, y separando del medio los aglomerados magnéticos
resultantes. Este método de análisis, sin embargo, utiliza solamente
un único tipo de partícula, presentando de ese modo dificultades en
la detección. La presencia o ausencia de partículas magnéticas
agregadas en la proximidad del imán no está ni fácilmente ni
precisamente determinada por medios visuales. Sería conveniente
utilizar partículas de indicador que se pudiesen detectar fácilmente
y exactamente por medios visuales.
El empleo de partículas de indicador no
magnéticas está descrito por la Patente U.S. Nº 5.374.531, la cual
revela el empleo simultáneo de partículas magnéticas y partículas
fluorescentes no magnéticas en la cuantificación de fenotipos
leucocitarios u otros analitos particulados. Las partículas
magnéticas y las partículas fluorescentes no magnéticas contienen
sustancias de unión que ocasionan la formación de rosetas constando
de partículas magnéticas, partículas fluorescentes no magnéticas, y
las células deseadas. Las rosetas son separadas de los componentes
no magnéticos de la muestra de ensayo mediante la aplicación de un
campo magnético, después de lo cual se puede medir el número de
células por la cantidad de fluorescencia emitida los las partículas
fluorescentes no magnéticas. La formación de rosetas es aplicable
solamente a la detección de analitos particulados (tales como
células), ya que esto acarrea unir partículas magnéticas y
partículas de indicador alrededor de las células diana, las cuales
células tienen que ser de un tamaño similar o mayor que las
partículas magnéticas y las partículas de indicador. Las rosetas
descritas en esta patente no se pueden formar con analitos de escala
molecular, ya que tales analitos son mucho más pequeños que las
partículas magnéticas y las partículas de indicador.
En la Patente U.S. Nº 5.145.784 se describe la
agregación de partículas de indicador magnéticas y no magnéticas,
en función de la presencia de analitos de escala molecular. En esta
patente, las partículas magnéticas y las partículas detectables no
magnéticas que tengan antígeno y/o anticuerpo pegado a sus
superficies son combinadas con la muestra a analizar, anticuerpo
libre si se requiere, y cualquier tampón, sal y otros reactivos
necesarios. Después de la incubación durante un tiempo específico y
bajo condiciones apropiadas para que se unan el antígeno y el
anticuerpo específico, las partículas magnéticas se extraen mediante
atracción hacia un imán. Posteriormente, se determina la presencia
o ausencia y/o cantidad de partículas detectables no magnéticas, y
se determina la presencia o ausencia y/o cantidad de antígeno o
anticuerpo de interés en la muestra. En este proceso, la presencia
de analito no es detectada observando directamente los complejos de
partículas magnéticas/no magnéticas separados cerca de la ubicación
del imán.
Los N^{os} de Patente U.S. 5.445.970 y
5.445.917, WO 93/19370 y WO 93/19371 describen el empleo de un
material magnéticamente atraíble, como marcador detectable en
ensayos de unión. El marcador magnético es sometido a un campo
magnético, y el marcador, a su vez, muestra una fuerza o movimiento
resultante a consecuencia de la aplicación del campo magnético. El
alcance de la fuerza o movimiento es modulado por un analito que
pueda estar presente en una muestra de ensayo. Debido a que la
presencia o cantidad de analito en una muestra de ensayo es
responsable de la magnitud de la fuerza ejercida o de la cantidad de
movimiento mostrada por el material magnéticamente atraíble, el
efecto del campo magnético sobre el marcador magnéticamente atraíble
se puede utilizar como medida de la presencia o cantidad de analito
en una muestra de ensayo. Este enfoque requiere que la presencia de
un analito origine un cambio en el grado de unión del material
magnéticamente atraíble a una fase sólida, de manera que el
material magnéticamente atraíble unido esté impedido para moverse
en el campo magnético aplicado. La aplicación de un campo magnético
origina después un fraccionamiento del material magnéticamente
atraíble libre y del material magnéticamente atraíble unido a la
fase sólida. La medición de la fuerza ejercida sobre el material
magnéticamente atraíble unido a la fase sólida, o sobre el material
magnéticamente atraíble libre, refleja entonces la cantidad de
analito presente en la mezcla de ensayo. Aunque los formatos de
ensayo autoejecutables sean posibles utilizando este enfoque, se
necesita la captura específica en algún formato de fase sólida no
móvil.
La Patente U.S. Nº 5.236.824 describe un método
de inmunoensayo magnético por láser, que utiliza un aparato de
magnetoforesis.
Para algunas aplicaciones, un formato de ensayo
que utilice únicamente fases sólidas móviles, tal como
micropartículas, tendría diferentes ventajas, como las tendrían los
formatos que no requieran la medición de la fuerza magnética para
determinar la concentración de analito. También sería provechoso
utilizar reactivos que no decanten de la suspensión. Se pueden
producir partículas de látex que formen suspensiones estables, pero
las partículas superparamagnéticas lo suficientemente pequeñas para
formar suspensiones estables, llamadas ferrofluidos, son solamente
atraídas débilmente hacia la fuente de un campo magnético y, por lo
tanto, no pueden ser fácilmente capturadas magnéticamente. Los
ferrofluidos son también no compatibles, en general, con las
soluciones acuosas. Sería ventajoso desarrollar formatos de
inmunoensayos autoejecutables que no necesiten un material
cromatográfico. Sería también ventajoso desarrollar un medio para un
inmunoensayo autoejecutable que pudiese ser utilizado para una
multiplicidad de inmunoensayos y fácilmente adaptado a las
variaciones de reactivos resultantes de los procesos de
fabricación.
La presente invención implica un método para
determinar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de
ensayo. En una forma de realización, el método comprende las etapas
de:
(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo
con un reactivo de partículas en fase sólida móvil y con un
reactivo magnéticamente sensible para formar una mezcla de reacción,
dicho analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho
reactivo de partículas en fase sólida móvil y a dicho reactivo
magnéticamente sensible para formar un complejo constando de dicho
reactivo de partículas en fase sólida móvil, una pluralidad de
dichos reactivos magnéticamente sensibles y dicho analito;
(2) someter dicha mezcla de reacción a un campo
magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dicho
complejo si dicho complejo está presente en dicha mezcla de
reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando
manifestada por el movimiento o captura de dicho complejo a una
velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente
sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase
sólida móvil solo; y
(3) medir directa o indirectamente el grado de
dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza
que actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no
unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la
captura magnética de dicho complejo utilizando un dispositivo visual
o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente
sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida
móvil son separados del complejo por movimiento en un canal capilar,
(iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la variación en
la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi) ópticamente, el
cambio en la reflexividad de una superficie ópticamente reflectante
sobre la que dichos complejos han sido capturados magnéticamente,
(viii) un cambio en el peso aparente, (ix) un cambio en la masa
aparente, (x) un movimiento, o (xi) un cambio en la cantidad de
esfuerzo, para proporcionar una medida de la presencia o cantidad de
dicho analito en dicha muestra de ensayo.
En una segunda forma de realización, el método
comprende las etapas de:
(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo
con un reactivo magnéticamente sensible y un reactivo de partículas
en fase sólida móvil para formar una mezcla de reacción, dicho
analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo
magnéticamente sensible para formar un primer complejo constando de
dicho analito y de dicho reactivo magnéticamente sensible, y dicho
reactivo magnéticamente sensible siendo capaz de unirse
específicamente a dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil
para formar un segundo complejo constando de una pluralidad de
dichos reactivos magnéticamente sensibles y de dicho reactivo de
partículas en fase sólida móvil;
(2) someter dicha mezcla de reacción a un campo
magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dichos
complejos si cualquiera de dichos complejos está presente en dicha
mezcla de reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando
manifestada por el movimiento o captura de dicho segundo complejo a
una velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente
sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase
sólida móvil solo o dicho primer complejo; y
(3) medir directa o indirectamente el grado de
dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza
que actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no
unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la
captura magnética de dicho segundo complejo utilizando un
dispositivo visual o un dispositivo óptico, en donde el reactivo
magnéticamente sensible no unido y/o el reactivo de partículas en
fase sólida móvil son separados del complejo por movimiento en un
canal capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v)
la variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi)
ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie
ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido
capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente,
(ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un
cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de
la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de
ensayo.
En una alternativa de la segunda forma de
realización, el método comprende las etapas de:
(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo
con un reactivo magnéticamente sensible y un reactivo de partículas
en fase sólida móvil para formar una mezcla de reacción, dicho
analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de
partículas en fase sólida móvil para formar un primer complejo
constando de dicho analito y de dicho reactivo de partículas en
fase sólida móvil, y dicho reactivo magnéticamente sensible siendo
capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de partículas en
fase sólida móvil para formar un segundo complejo constando de una
pluralidad de dichos reactivos magnéticamente sensibles y de dicho
reactivo de partículas en fase sólida móvil;
(2) someter dicha mezcla de reacción a un campo
magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dichos
complejos si cualquiera de dichos complejos está presente en dicha
mezcla de reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando
manifestada por el movimiento o captura de dicho segundo complejo a
una velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente
sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase
sólida móvil solo o dicho primer complejo; y
(3) medir directa o indirectamente el grado de
dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza
que actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no
unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la
captura magnética de dicho complejo utilizando un dispositivo visual
o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente
sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida
móvil son separados del segundo complejo por movimiento en un canal
capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la
variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi)
ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie
ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido
capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente,
(ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un
cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de
la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de
ensayo.
El reactivo magnéticamente sensible consta de un
miembro de unión específica unido a un material magnéticamente
reactivo. El reactivo magnéticamente sensible consta,
preferentemente, de un primer miembro de unión específica unido a
una micropartícula superparamagnética o a un ferrofluido.
El reactivo de partículas en fase sólida móvil
consta de un segundo miembro de unión específica unido a una
partícula en fase sólida, tal como una micropartícula polimérica o
látex.
En la primera forma de realización, comúnmente
conocida como formato sándwich, el primer miembro de unión
específica es seleccionado para que se una específicamente al
analito, y el segundo miembro de unión específica es seleccionado
para que también se una específicamente al analito, de manera que
ambos miembros de unión específica se puedan unir simultáneamente
al analito. En presencia del analito, o cuando la concentración de
analito sea superior a un umbral especificado, el primer y segundo
miembros de unión específica se unen específicamente al analito
para formar una cantidad detectable de complejo comprendiendo el
analito, el primer y segundo miembros de unión específica, y el
reactivo magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil
a los que están unidos, respectivamente, el primer y segundo
miembros de unión específica. En ausencia de analito, o cuando la
concentración de analito sea inferior a un umbral especificado, la
cantidad de complejo formado conteniendo ambos miembros de unión
específica estará por debajo del umbral del ensayo.
En una variación de esta primera forma de
realización, el reactivo en fase sólida móvil puede ser reemplazado
por un reactivo magnéticamente sensible. En esta variación, en
presencia de analito, o cuando la concentración de analito sea
superior a un umbral especificado, el primer y segundo miembros de
unión específica se unen específicamente al analito para formar una
cantidad detectable de complejo comprendiendo el analito, el primer
y segundo miembros de unión específica, y los reactivos
magnéticamente sensibles a los que están unidos, respectivamente,
el primer y segundo miembros de unión específica. En ausencia de
analito, o cuando la concentración de analito sea inferior a un
umbral especificado, la cantidad de complejo formado conteniendo
ambos miembros de unión específica estará por debajo del umbral del
ensayo.
En la segunda forma de realización, comúnmente
conocida como formato competitivo, uno de los miembros de unión
específica exhibe un epítopo manifestado por el analito. Uno de los
miembros de unión específica es seleccionado para unirse a ese
epítopo, el cual epítopo está también manifestado por el otro
miembro de unión específica. En ausencia de analito, o cuando la
concentración de analito sea inferior a un umbral especificado, los
miembros de unión específica se unen entre sí para formar un
complejo comprendiendo los miembros de unión específica y el
reactivo magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil
a los que los miembros de unión específica están unidos. En
presencia de analito, o cuando la concentración de analito sea
superior a un umbral especificado, uno de los miembros de unión
específica se une al analito, inhibiendo de ese modo la unión del
mismo al otro miembro de unión específica, y evitando la formación
del complejo conteniendo el reactivo magnéticamente sensible y el
reactivo en fase sólida móvil.
El método de la presente invención utiliza
ventajosamente la presencia de analito para modular la unión de las
partículas de reactivo magnéticamente sensible a las partículas de
reactivo en fase sólida móvil para formar complejos. En un campo
magnético aplicado, los complejos mostrarán respuestas magnéticas
que son diferentes de las respuestas magnéticas de las partículas
individuales del reactivo magnéticamente sensible y de aquellas
respuestas magnéticas de las partículas individuales del reactivo en
fase sólida móvil. Tal formación de complejos modulada por el
analito puede tener lugar entre partículas que exhiban grados muy
diferentes de reactividad magnética, por ejemplo, entre partículas
superparamagnéticas y diamagnéticas. Los complejos resultantes,
debido a la presencia de partículas superparamagnéticas, serán
atraídos hacia la fuente de un campo magnético. Las respuestas de
los complejos que contengan una pluralidad de partículas
paramagnéticas, superparamagnéticas, o de ferrofluidos, u otros,
resultantes de la formación de complejos, pueden servir como una
medida de la presencia o cantidad de un analito presente en una
muestra de ensayo. El cambio en la respuesta magnética de las
partículas de reactivo magnéticamente sensible y las partículas de
reactivo en fase sólida móvil resultante de la formación de
complejos conteniendo estas partículas se puede manifestar como una
velocidad alterada del movimiento de cualquier tipo de partícula en
el campo aplicado, o como una velocidad alterada de acumulación de
cualquier tipo de partícula en una ubicación cerca de la fuente de
un campo magnético aplicado, o como una acumulación detectable de
complejos conteniendo partículas en una ubicación cerca de la fuente
de un campo magnético aplicado.
El método de la presente invención emplea
dispositivos para determinar la presencia o cantidad de un analito
en una muestra de ensayo. Uno de tales dispositivos consta de (i) un
recipiente de reacción donde el reactivo magnéticamente sensible no
unido y el reactivo magnéticamente sensible unido a un reactivo en
fase sólida móvil en forma de complejo son producidos en relación a
la cantidad de analito en la muestra de ensayo; (ii) un generador
del campo magnético para la aplicación de un campo magnético a la
mezcla de ensayo; y (iii) un medio de medición para valorar la
reactividad alterada del reactivo magnéticamente sensible o del
reactivo en fase sólida móvil, o de ambos, como medida de la
presencia o cantidad de analito en la muestra de ensayo. Los
generadores de campo magnético apropiados para esta invención
incluyen imanes permanentes y electroimanes. Los medios de medición
preferidos para los dispositivos constan de uno o más de los
elementos siguientes:
(1) un dispositivo balanza para medir el alcance
de la formación de complejos, midiendo la variación en la fuerza
ejercida sobre los reactivos por un campo magnético aplicado, o la
variación en la fuerza ejercida sobre la fuente del campo magnético
por los reactivos durante o después de la separación magnética de
los complejos;
(2) un dispositivo visual para medir el alcance
de la formación de complejos mediante la separación magnética de los
reactivos no unidos de los reactivos en los complejos;
(3) un dispositivo visual, o un dispositivo
óptico, para medir (a) el alcance de la formación de complejos
mediante la captura magnética del reactivo magnéticamente sensible
unido a un reactivo en fase sólida móvil y la separación de
reactivo magnéticamente sensible no unido o de reactivo en fase
sólida móvil, o (b) ambos reactivos por movimiento en un canal
capilar;
(4) un transductor de efecto Hall, u otro
dispositivo, para medir el alcance de la formación de complejos,
midiendo la perturbación de un campo magnético causada por cambios
en la distribución de los complejos durante o después de la
separación magnética de los complejos;
(5) un dispositivo óptico para medir el alcance
de la formación de complejos, midiendo la variación en la densidad
óptica de la mezcla de reacción durante o después de la separación
magnética de los complejos;
(6) un dispositivo óptico para medir el alcance
de la formación de complejos, midiendo el cambio en la reflexividad
de una superficie ópticamente reflexiva debido a la fuerza ejercida
sobre ella por los complejos capturados magnéticamente durante o
después de la separación magnética de los complejos.
En una forma de realización de un dispositivo
para inmunoensayos autoejecutables que se puede utilizar para
reemplazar un dispositivo de tira convencional para realizar
inmunoensayos, los miembros de unión específica similares a
aquellos fijados en la matriz porosa de un dispositivo convencional
para inmunoensayos autoejecutables están fijados a partículas de
material magnéticamente reactivo, por ejemplo partículas
superparamagnéticas, y el reactivo magnéticamente sensible
resultante está incluido en una mezcla de reactivos. Se deja que la
muestra de ensayo contacte con la mezcla de reactivos para formar
una mezcla de ensayo, la cual se deja que fluya a través de un
canal antes que a través de una matriz porosa. La unión que
normalmente ocurriría entre las partículas visibles de indicador y
los miembros de unión específica unidos no difusivamente a la matriz
porosa en la zona de reacción de un dispositivo convencional puede
ocurrir, en lugar de eso, entre el reactivo magnéticamente sensible
y el reactivo indicador diamagnético visible. La colocación de un
imán en una ubicación especificada a lo largo del canal atrae al
reactivo magnéticamente sensible unido al reactivo indicador
diamagnético. La presencia de reactivo indicador diamagnético
unido, atraído hacia el imán, puede ser detectada visualmente o
mediante un dispositivo óptico, e indica la presencia o cantidad de
analito en la muestra. Se debería observar que los ensayos que
utilizan los principios de esta invención también pueden ser
convenientemente realizados en recipientes de reacción
convencionales, por ejemplo cubetas, pocillos, tubos y otros. Se
debería observar además que el reactivo magnéticamente sensible
puede ser visible y el reactivo diamagnético puede ser transparente,
esto es, no visible, por lo que la presencia o cantidad de analito
puede ser detectada visualmente o mediante un dispositivo óptico
viendo solamente el reactivo magnéticamente sensible acumulado.
Además, el reactivo magnéticamente sensible puede ser visible y el
reactivo diamagnético puede ser visible, por lo que la presencia o
cantidad de analito puede ser detectada visualmente o mediante un
dispositivo óptico viendo el reactivo magnéticamente sensible y el
reactivo diamagnético acumulados.
Una ventaja concreta de esta invención es la
facilidad con la que se puede realizar un inmunoensayo por medio de
un dispositivo portátil autónomo. El campo magnético de una cinta
grabadora magnética o bandas magnéticas de las tarjetas de crédito
normales es suficiente para originar la separación de complejos,
conteniendo reactivo magnéticamente sensible, del reactivo en fase
sólida móvil diamagnético. La presencia de estos complejos puede
ser fácil y fidedignamente observada visualmente debido a la
presencia del material en fase sólida diamagnético dentro de los
complejos. Otra ventaja concreta de esta invención es la capacidad
de crear una zona de captura magnética que hará juego con los
reactivos magnéticamente sensibles y los reactivos en fase sólida
móvil empleados. Se pueden definir el campo magnético y su
gradiente para que proporcionen una atracción óptima del reactivo
magnéticamente sensible. En ensayos autoejecutables, el
sitio(s) de captura magnética se puede utilizar para
proporcionar lecturas semicuantitativas por medios visuales. Se
puede controlar el sitio(s) de captura magnética para
proporcionar medios para compensar las variaciones lote a lote en
los reactivos de ensayo. Como se dijo previamente, los reactivos
utilizados en ensayos de unión convencionales son generalmente
mezclas biológicas complejas, y tienden a variar de un lote a otro
lote debido a los procesos de fabricación. Para formatos de ensayo
sándwich, donde las partículas del reactivo magnéticamente sensible
pueden ser muy pequeñas con respecto a las partículas del reactivo
en fase sólida móvil, es posible controlar el comportamiento
magnético del reactivo magnéticamente sensible, controlando la
intensidad y el gradiente del campo magnético. También es posible
controlar la captura de las partículas de reactivo en fase sólida
móvil que pueden ser grandes con respecto a las partículas del
reactivo magnéticamente sensible. Para capturar muy eficazmente los
complejos que consten de partículas de reactivo en fase sólida
móvil y de partículas de reactivo magnéticamente sensible sin
capturar las partículas no unidas de reactivo magnéticamente
sensible, es posible proporcionar un gradiente de campo que cambie
con la distancia comparable a la dimensión de las partículas de
reactivo en fase sólida móvil. Tal campo puede ser codificado,
durante la fabricación, en un material magnéticamente
susceptible.
La Fig 1 es una vista esquemática de una
reacción de unión específica que se utiliza en esta invención.
La Fig 2 es una vista esquemática de un aparato
que utiliza una balanza para la detección, asistida magnéticamente,
de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.
La Fig 3 es una vista esquemática del aparato de
la Fig 2 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de
complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.
La Fig 4 es una vista esquemática de un aparato
que utiliza una balanza para la detección, asistida magnéticamente,
de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.
La Fig 5 es una vista esquemática del aparato de
la Fig 4 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de
complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.
La Fig 6 es vista esquemática de un aparato que
utiliza un transductor de efecto Hall para la detección, asistida
magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente
sensible.
La Fig 7 es una vista esquemática del aparato de
la Fig 6 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de
complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.
La Fig 8 es una vista esquemática de un aparato
que utiliza un sensor óptico para la detección, asistida
magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente
sensible.
La Fig 9 es una vista esquemática del aparato de
la Fig 8 en operación para la detección, asistida magnéticamente, de
complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.
La Fig 10 es una vista esquemática de un aparato
que utiliza una balanza para la detección, asistida magnéticamente,
de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.
La Fig 11 es una vista esquemática del
dispositivo de la Fig 10 en operación para la detección, asistida
magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente
sensible.
La Fig 12 es una vista esquemática de un aparato
que utiliza una microbalanza para la detección, asistida
magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente
sensible.
La Fig 13 es una vista esquemática de una parte
del aparato de la Fig 12 en operación para la detección, asistida
magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente
sensible.
La Fig 14A es una vista esquemática de un tipo
de dispositivo para inmunoensayos autoejecutables, en operación para
la detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un
reactivo magnéticamente sensible. La figura representa el
inmunoensayo antes de que el complejo sea capturado.
La Fig 14B es una vista esquemática del
dispositivo para inmunoensayos autoejecutables de la Fig 14A, en
operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos
conteniendo un reactivo magnéticamente sensible. La figura
representa el inmunoensayo después de que el complejo es
capturado.
La Fig 15A es una vista esquemática de otro tipo
de dispositivo para inmunoensayos autoejecutables para la detección,
asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo
magnéticamente sensible. La figura representa el inmunoensayo antes
de que el complejo sea capturado.
La Fig 15B es una vista esquemática del
dispositivo para inmunoensayos autoejecutables de la Fig 15A, en
operación para la detección, asistida magnéticamente, de complejos
conteniendo un reactivo magnéticamente sensible. La figura
representa el inmunoensayo después de que el complejo es
capturado.
La Fig 16A es una vista esquemática de un
dispositivo de detección de la densidad óptica, en operación para la
detección, asistida magnéticamente, de complejos conteniendo un
reactivo magnéticamente sensible, antes de que se hayan acumulado un
gran número de complejos en el fondo del recipiente de reacción.
La Fig 16B es una vista esquemática del
dispositivo de la Fig 16A en operación para la detección, asistida
magnéticamente, de complejos conteniendo un reactivo magnéticamente
sensible, después de que se hayan acumulado un gran número de
complejos en el fondo del recipiente de reacción.
La Fig 17 es una vista esquemática de un aparato
que utiliza una microbalanza y un dispositivo de colocación de la
mezcla de ensayo, para la detección magnéticamente asistida de
complejos conteniendo un reactivo magnéticamente sensible.
La Fig 18 es un gráfico que ilustra la señal
generada por el dispositivo ilustrado en la Fig 17, durante el
análisis de tres muestras de micropartículas
superparamagnéticas.
La Fig 19 es un gráfico que ilustra la medición
de la fuerza de atracción de partículas magnéticamente reactivas,
sin unir o libres, en función del tiempo.
La Fig 20A es un gráfico que ilustra la
separación de ferrofluido en una columna de medio para filtración en
gel "SEPHACRYL® S-500".
La Fig 20B es un gráfico que ilustra la
separación de ferrofluido en una columna de medio para filtración en
gel "SEPHACRYL® S-1000".
La Fig 21 es un gráfico que ilustra los
resultados de la separación magnética, detectada en el aparato
mostrado en las Figs 4, 5 y 17, después de la incubación de
polipirrol recubierto con anti-biotina con
diferentes cantidades de ferrofluido recubierto con
biotina-albúmina de suero bovino.
Las Figs 22A, 22B, 22C y 22D son vistas
esquemáticas que ilustran los aspectos observables de ferrofluido
uniéndose a partículas de látex en un campo magnético.
La Fig 23 es un gráfico que ilustra la velocidad
y alcance del cambio de peso aparente de un imán, resultante de la
operación del aparato de la Fig 17, para medir el efecto de variar
la concentración de soluciones diluidas de ferrofluido recubierto
con BSA biotinilada.
La Fig 24 es un gráfico que ilustra el cambio de
peso aparente de un imán, resultante de la captura de complejos de
polipirrol y reactivo magnéticamente sensible, durante un ensayo
para albúmina de suero bovino biotinilada libre.
La Fig 25A es una vista en perspectiva de un
dispositivo para inmunoensayos autoejecutables para la detección,
magnéticamente asistida, de complejos conteniendo un reactivo
magnéticamente sensible.
La Fig 25B es una vista en perspectiva
despiezada del dispositivo para inmunoensayos autoejecutables de la
Fig 25A.
La Fig 25C es una vista lateral en elevación del
dispositivo para inmunoensayos autoejecutables de la Fig 25A.
La Fig 26 es un gráfico que ilustra los
resultados obtenidos al utilizar un dispositivo del tipo mostrado en
las Figs 25A, 25B y 25C, por medio de un lector de reflectancia.
La Fig 27 es un gráfico que ilustra los
resultados obtenidos al utilizar un dispositivo para inmunoensayos
autoejecutables para fibrina soluble, por medio de un lector de
densidad óptica.
Las definiciones siguientes son aplicables a la
invención:
La expresión "muestra de ensayo", como se
utiliza aquí, se refiere a una materia sospechosa de contener el
analito. La muestra de ensayo se puede utilizar directamente como se
obtiene de la fuente, o siguiendo un pretratamiento para modificar
el carácter de la muestra. La muestra de ensayo puede ser obtenida a
partir de cualquier fuente biológica, tal como un fluido
fisiológico incluyendo, pero no se pretende que esté limitado a,
sangre, saliva, fluido de los cristalinos oculares, fluido
cerebroespinal, sudor, orina, leche, líquido ascítico, mucosidad,
líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido amniótico y otros;
caldos de fermentación; cultivos celulares; mezclas de reacciones
químicas y otros. La muestra de ensayo se puede pretratar antes de
su uso, tal como preparar plasma de la sangre, diluir fluidos
viscosos, y otros. Los métodos de tratamiento pueden implicar
filtración, destilación, concentración, inactivación de componentes
interferentes, y la adición de reactivos. Además de los fluidos
biológicos o fisiológicos, se pueden utilizar otras muestras
líquidas tales como agua, productos alimentarios y otros para la
realización de ensayos medioambientales o de producción de
alimentos. Además, como muestra de ensayo se puede utilizar una
materia sólida sospechosa de contener el analito. En algunos casos,
puede ser beneficioso modificar una muestra de ensayo sólida para
formar un medio líquido o para liberar el analito.
La expresión "miembro de unión específica",
como se utiliza aquí, se refiere a un miembro de un par de unión,
esto es, dos moléculas diferentes en donde una de las moléculas se
une específicamente a la segunda molécula por medios químicos o
físicos. Además de los bien conocidos miembros de pares de unión de
antígeno y anticuerpo, otros pares de unión abarcan, pero no se
pretende que estén limitados a, biotina y avidina, carbohidratos y
lectinas, secuencias nucleotídicas complementarias, secuencias
peptídicas complementarias, moléculas efectoras y receptoras,
cofactores enzimáticos y enzimas, inhibidores enzimáticos y enzimas,
una secuencia peptídica y un anticuerpo específico para la
secuencia o la proteína entera, ácidos y bases poliméricos,
colorantes y aglutinantes proteicos, péptidos y aglutinantes
proteicos específicos (por ejemplo, ribonucleasa, péptido S y
ribonucleasa proteína S), azúcar y ácido borónico, y moléculas
similares teniendo una afinidad que permita su asociación en un
ensayo de unión. Además, Los pares de unión pueden incluir miembros
que sean análogos del miembro de unión original, por ejemplo un
análogo de analito o un miembro de unión fabricado mediante
técnicas recombinantes o ingeniería molecular. Si el miembro de
unión es un inmunorreactante, puede ser, por ejemplo, un
anticuerpo, antígeno, hapteno, o complejo de los mismos, y si se
utiliza un anticuerpo, puede ser un anticuerpo monoclonal o
policlonal, una proteína o anticuerpo recombinantes, un anticuerpo
quimérico, una mezcla(s) o fragmento(s) de los
mismos, así como una mezcla de un anticuerpo y otros miembros de
unión. Los detalles de la preparación de tales anticuerpos,
péptidos y nucleótidos y su idoneidad para uso como miembros de
unión en un ensayo de unión son bien conocidos por aquellos
especializados en la técnica.
El término "analito" o "analito de
interés", como se utiliza aquí, se refiere al compuesto o
composición a detectar o medir, y que tiene al menos un epítopo o
sitio de unión. El analito puede ser cualquier sustancia para la
que existe un miembro de unión de origen natural, o para la que se
puede preparar un miembro de unión. Los analitos incluyen, pero no
se pretende que estén limitados a, toxinas, compuestos orgánicos,
proteínas, péptidos, microorganismos, aminoácidos, carbohidratos,
ácidos nucleicos, hormonas, esteroides, vitaminas, fármacos
(incluyendo aquellos administrados con fines terapéuticos así como
aquellos administrados con fines ilícitos), partículas de virus y
metabolitos de o anticuerpos para cualquiera de las sustancias
anteriores. Por ejemplo, tales analitos incluye, pero no se
pretende que estén limitados a, ferritina; creatinina quinasa MIB
(CK-MB); digoxina; fenitoína; fenobarbitol;
carbamazepina; vancomicina; gentamicina; teofilina; ácido
valproico; quinidina; hormona luteinizante (LH); hormona
foliculoestimulante (FSH); estradiol; progesterona; anticuerpos
IgE; vitamina B2-microglobulina; hemoglobina
glucosilada (GHb); cortisol; digitoxina;
N-acetilprocainamida (NAPA); procainamida;
anticuerpos para rubéola, tales como rubéola-IgG y
rubéola-IgM; anticuerpos para toxoplasmosis, tales
como toxoplasmosis IgG (Toxo IgG) y toxoplasmosis IgM (Toxo IgM);
testosterona, salicilatos; paracetamol; antígenos de superficie del
virus de la hepatitis B (HBsAg); anticuerpos para el antígeno del
núcleo de la hepatitis B, tales como IgG e IgM
anti-antígeno del núcleo de la hepatitis B
(Anti-HBC); virus 1 y 2 de la inmunodeficiencia
humana (VIH), antígeno e de la hepatitis B (HBeAg); anticuerpos para
el antígeno e de la hepatitis B (Anti-HBe); hormona
estimulante del tiroides (TSH); tiroxina (T4); triyodotironina total
(T3 total); triyodotironina libre (T3 libre); antígeno
carcinoembriónico (CEA); y alfa fetoproteína (AFP); y drogas
ilícitas y sustancias controladas, incluyendo, pero no se pretende
que estén limitadas a, anfetamina, metanfetamina; barbituratos
tales como amobarbital, secobarbital, pentobarbital, fenobarbital, y
barbital; benzodiazepinas tales como librium y valium;
cannabinoides tales como hachís y marihuana; cocaína; fentanilo;
LSD; metacualona; opiatos tales como heroína, morfina, codeína,
hidromorfona, hidrocodona, metadona, oxicodona, oximorfona y opio;
fenciclidina; y propoxifeno. El término "analito" también
incluye cualquier sustancias antigénicas, haptenos, anticuerpos,
macromoléculas y combinaciones de los mismos.
El término "análogo de analito", como se
utiliza aquí, se refiere a una sustancia que reaccione cruzadamente
con un miembro de unión específico para el analito, aunque lo puede
hacer hasta un grado mayor o menor del que lo hace el analito
mismo. El análogo de analito puede incluir un analito modificado así
como una porción fragmentada o sintética de la molécula de analito,
siempre que el análogo de analito tenga al menos un sitio epitópico
en común con el analito de interés. Un ejemplo de un análogo de
analito es una secuencia peptídica sintética que duplique al menos
un epítopo del analito molécula entera, a fin de que el análogo de
analito pueda unirse a un miembro de unión específica para el
analito.
El término "magnético", como se utiliza
aquí, tiene que ver con una sustancia que tenga la capacidad de
llegar a ser magnetizada cuando está en un campo magnético.
El término "paramagnético", como se utiliza
aquí, tiene que ver con una sustancia en la que un campo magnético
inducido está en la misma dirección al campo magnetizante, pero
mucho más débil que en materiales ferromagnéticos. Los materiales
ferromagnéticos, tales como hierro, níquel, o cobalto, exhiben una
alta permeabilidad magnética, la capacidad de adquirir una alta
magnetización en campos magnéticos relativamente débiles, un punto
de saturación característico, e histéresis magnética. El término
"paramagnético" tiene que ver con una sustancia para la que la
susceptibilidad magnética es positiva.
El término "diamagnético", como se utiliza
aquí, tiene que ver con una sustancia en la que un campo magnético
inducido está en la dirección opuesta al campo magnetizante. El
término "diamagnético" tiene que ver con una sustancia para la
que la susceptibilidad magnética es negativa.
El magnetismo en una material proviene de los
espines intrínsecos de los electrones de los átomos que lo
componen. Los espines de electrones desapareados en elementos tales
como el hierro comunican un espín al átomo completo. Cuando se
aplica un campo magnético a tal material, los espines de los átomos
individuales tenderán a alinearse con el campo para minimizar su
energía, creando un momento magnético neto. Si los átomos reactivos
están compactos entre sí, como en los materiales ferromagnéticos,
influyen entre sí para formar un orden magnético de largo alcance.
A medida que aumenta la intensidad del campo aplicado, la
magnetización de un material ferromagnético aumentará hasta que
prácticamente todos los átomos reactivos estén alineados, después
de lo cual no se observará aumento adicional en la magnetización y
se dice que el material está saturado. Durante una disminución
posterior en la intensidad del campo aplicado, los materiales
ferromagnéticos mostrarán una notable histéresis, y después de la
eliminación total del campo aplicado el material conservará algo de
su orden magnético de largo alcance y estará magnetizado
permanentemente.
En algunos materiales, los cuales son
mencionados como paramagnéticos, los átomos individuales que
manifiestan una alta sensibilidad magnética están rodeados por
átomos de otros elementos que manifiestan baja sensibilidad
magnética. Cuando son sometidos a un campo magnético aplicado, los
átomos que exhiban una alta sensibilidad magnética se alinearán con
el campo, pero no se influirán entre sí y serán capaces de formar
un orden magnético de largo alcance. No se observará una saturación
pronunciada, y cuando se elimine el campo magnético, no se mostrará
histéresis ya que los espines de los átomos individuales revierten a
orientaciones aleatorias y se pierde todo el campo magnético
residual.
Los materiales superparamagnéticos manifiestan
características de paramagnetismo y ferromagnetismo. Si las
pequeñas partículas de material ferromagnético están dispersadas en
una matriz que exhiba baja reactividad magnética, los átomos dentro
de una partícula individual se alinean e influyen entre sí cuando
están en un campo. Sin embargo, no influyen en los átomos de una
partícula vecina, con el resultado de que no se forma un orden
magnético de largo alcance. Aunque los materiales
superparamagnéticos son capaces de llegar a estar más sumamente
magnetizados que los materiales paramagnéticos cuando son sometidos
a un campo magnético, las partículas superparamagnéticas también
muestran un pequeño magnetismo residual después de que se elimine
el campo magnético.
En Jiles, Introduction to Magnetism and Magnetic
Materials, Chapman & Hall (Londres, 1991), incorporada aquí como
referencia, se pueden encontrar detalles adicionales acerca del
magnetismo, ferromagnetismo, paramagnetismo, superparamagnetismo y
diamagnetismo.
La expresión "reactivo magnéticamente
sensible", como se utiliza aquí, se refiere a una sustancia que
implica un material magnéticamente reactivo unido a un miembro de
unión específica. La unión se puede llevar a cabo por medios de
unión covalentes o no covalentes, brazos conectores, y otros. Sin
embargo, para la presente invención no es crítico el método de
unión. Como se utiliza aquí, un "material magnéticamente
reactivo" es una sustancia que, en la aplicación de un campo
magnético, permite que el reactivo magnéticamente sensible produzca
una respuesta detectable que estará directa o indirectamente
relacionada con la cantidad de analito en la muestra de ensayo. El
componente miembro de unión específica del reactivo puede ser
seleccionado para que se una directamente al analito, o se una
indirectamente al analito por medio de un miembro de unión
específica auxiliar, lo cual se describe en mayor detalle a
continuación. Los reactivos magnéticamente sensibles se pueden unir
a miembros de unión específica auxiliares antes, durante o después
de poner en contacto el reactivo magnéticamente sensible con la
muestra de ensayo y/u otros reactivos de ensayo. Las expresiones
"miembro de unión específica unido a una partícula magnéticamente
reactiva", "miembro de unión específica unido a un material
magnéticamente reactivo", "miembro de unión específica unido a
un reactivo magnéticamente sensible" y términos similares son
utilizadas para referirse a la característica principal de los
reactivos magnéticamente sensibles de la presente invención, esto
es, el reactivo produce una respuesta detectable cuando es sometido
a un campo magnético.
La expresión "fase sólida", como se utiliza
aquí, se refiere a cualquier material al que se llegan a unir el
analito, complejos de analito, o reactivos de ensayo, y del que se
pueden separar los reactivos de ensayo sin reaccionar, muestra de
ensayo, o soluciones de ensayo. La fase sólida tiene generalmente un
miembro de unión específica unido a su superficie para formar un
"reactivo en fase sólida", que permite la unión del analito,
el reactivo magnéticamente sensible, u otro reactivo de ensayo. Los
miembros de unión específica que están unidos a la fase sólida se
pueden seleccionar para que se unan directamente al analito o se
unan indirectamente al analito por medio de un miembro de unión
específica auxiliar, el cual se puede unir al reactivo en fase
sólida antes, durante, o después de poner en contacto el reactivo en
fase sólida con la muestra de ensayo y/u otros reactivos de ensayo.
La expresión "reactivo en fase sólida móvil", como se utiliza
aquí, se refiere a un reactivo en el que la fase sólida es una
partícula.
El término "complejo", como se utiliza
aquí, se refiere a la sustancia formada mediante la unión de uno o
más materiales a otro material mediante una o más reacciones de
unión específica. Los ejemplos representativos de complejos
abarcan, pero no se limitan a, (a) complejos formados mediante la
reacción de unión específica de un reactivo magnéticamente sensible
con un reactivo en fase sólida móvil, (b) complejos formados
mediante la reacción de unión específica de un analito con un
reactivo magnéticamente sensible y un reactivo en fase sólida
móvil, (c) complejos formados mediante la reacción de unión
específica de un analito con un reactivo magnéticamente sensible, y
(d) complejos formados mediante la reacción de unión específica de
un analito con un reactivo en fase sólida móvil.
La expresión "miembro de unión auxiliar",
como se utiliza aquí, se refiere a cualquier miembro de un par de
unión que se utilice en el ensayo además de los miembros de unión
específica del reactivo magnéticamente sensible o reactivo en fase
sólida móvil. Por ejemplo, en ejemplos donde el analito mismo no se
puede unir directamente al reactivo magnéticamente sensible, un
miembro de unión auxiliar puede ser capaz de unir el reactivo
magnéticamente sensible al analito de interés. Como se comprenderá,
por supuesto, en un ensayo se puede utilizar uno o más miembros de
unión auxiliares, y tal miembro(s) de unión auxiliar se puede
unir al reactivo magnéticamente sensible o reactivo en fase sólida
móvil antes, durante, o después de que el reactivo magnéticamente
sensible o reactivo en fase sólida móvil sea puesto en contacto con
una muestra de ensayo u otro reactivo de ensayo. El miembro de
unión auxiliar puede ser incor-
porado en el dispositivo de ensaño o puede ser añadido al dispositivo como una solución de reactivo independiente.
porado en el dispositivo de ensaño o puede ser añadido al dispositivo como una solución de reactivo independiente.
El campo de aplicación de la invención es como
se define en el sumario anterior de la invención y la
reivindicaciones adjuntadas.
Cuando un material es puesto bajo la influencia
de un campo magnético, actuará una fuerza sobre él, la cual fuerza
está dirigida hacia o lejos de la fuente del campo magnético. Por
ejemplo, la fuerza que actúa sobre un material ferromagnético
fuertemente sensible magnéticamente, tal como la magnetita, estará
dirigida hacia la fuente del campo magnético. En el mismo campo,
cuanto mucho más débil sea la fuerza que actúa sobre un material
diamagnético, tal como el poliestireno, estará dirigida lejos de la
fuente del campo magnético. El alcance de la respuesta de los
materiales magnéticamente sensibles se puede utilizar como medida de
la cantidad de material magnéticamente sensible presente. La
presente invención resulta del inesperado y sorprendente
descubrimiento de que, cuando se utiliza un material magnéticamente
reactivo como componente de un reactivo magnéticamente sensible en
un ensayo de unión, es posible detectar la presencia o cantidad de
cualquiera o ambos del material magnéticamente reactivo libre o
material magnéticamente reactivo incorporados en un complejo,
midiendo el alcance de la respuesta resultante de la interacción del
reactivo magnéticamente sensible con un campo magnético aplicado.
La respuesta del reactivo magnéticamente sensible a un campo
magnético puede manifestarse ella misma de maneras tales como, por
ejemplo, un movimiento detectable del material magnéticamente
reactivo o una fuerza resultante detectable ejercida por o sobre el
material magnéticamente reactivo. Además, la intensidad de la
fuerza o el alcance del movimiento producen una relación clara para
la cantidad de material magnéticamente reactivo unido a un material
en fase sólida, permitiendo de ese modo la determinación de la
presencia o cantidad de un analito en una muestra de ensayo. Por
ejemplo, la fuerza ejercida por un campo magnético sobre partículas
individuales de un material ferromagnético suspendido en un fluido
(por ejemplo, un ferrofluido) es relativamente pequeña y, por
consiguiente, difícil de detectar. Sin embargo, cuando una
pluralidad o multiplicidad de estas partículas ferromagnéticas
individuales se llegan a unir a un material en fase sólida
diamagnético, por ejemplo, mediante la unión específica directamente
vía miembros de unión específica o indirectamente mediante la unión
simultánea y específica a un analito vía miembros de unión
específica, la fuerza ejercida por un campo magnético sobre los
complejos individuales suspendidos en el fluido es relativamente
alta y, por consiguiente, mucho más fácilmente detectable. La
separación de las partículas individuales de los complejos y el
movimiento de los complejos en un campo magnético forman la base
para el método y aparato de esta invención.
La selección de una composición concreta de
material magnéticamente reactivo no es crítica para la presente
invención. Preferentemente, el material magnéticamente reactivo
puede ser unido a, o puede ser modificado, para que sea capaz de
ser unido a un miembro de unión específica que, a su vez, se unirá a
otro reactivo de ensayo o a un componente presente en una muestra
de ensayo. También se prefiere que el material magnéticamente
reactivo sea magnéticamente sensible hasta el punto de que permita
el fraccionamiento del reactivo magnéticamente sensible unido y el
reactivo magnéticamente sensible no unido, y la producción de una
respuesta detectable al ser sometido a un campo magnético. Con el
propósito de la presente invención, un material es magnéticamente
reactivo si está influenciado por la aplicación de un campo
magnético tal como, por ejemplo, si es atraído hacia la fuente del
campo magnético o tiene una susceptibilidad magnética detectable. Se
pueden formar diversos reactivos magnéticamente sensibles
diferentes variando el componente magnéticamente reactivo o el
componente miembro de unión específica del reactivo. Se
comprenderá, por supuesto que la elección implica la consideración
del analito a detectar y la optimización deseada de la técnica de
ensayo.
Está disponible comercialmente una amplia
variedad de materiales magnéticamente reactivos que son apropiados
para su uso en reactivos magnéticamente sensibles, o en la técnica
se conocen bien las técnicas de producción para ello. Las
características preferidas de los materiales magnéticamente
reactivos se pueden conseguir mediante una amplia variedad de
materiales magnéticos. Los materiales magnéticamente reactivos
apropiados para su uso en esta invención abarcan, pero no se
limitan a, materiales ferromagnéticos, ferrimagnéticos,
paramagnéticos, superparamagnéticos, y otros. El término
"ferromagnético" se utiliza generalmente para describir
materiales que son atraídos hacia un imán y que típicamente llegan a
ser magnetizados permanentemente en su exposición a un campo
magnético. Los materiales ferromagnéticos también se pueden reducir
en tamaño de partícula, de manera que cada una de las partículas
sea un dominio magnético individual. Estas partículas se pueden
dispersar en una matriz para crear una micropartícula o una
partícula de ferrofluido. En este estado de subdivisión, el
material puede ser llamado como "superparamagnético", y se
caracteriza por la ausencia de cualquier magnetización permanente
medible importante. Los materiales apropiados para su uso como
matriz en esta invención incluyen, pero no se limitan a, materiales
tales como, por ejemplo, polímeros orgánicos incluyendo el
poliestireno y otros.
Los materiales ferromagnéticos, ferrimagnéticos,
paramagnéticos, y superparamagnéticos apropiados abarcan, pero no
se limitan a, metales tales como hierro, níquel, cobalto, cromo,
manganeso, y otros; elementos de la serie de los lantánidos tales
como neodimio, erbio, y otros; aleaciones tales como aleaciones
magnéticas de aluminio, níquel, cobalto, cobre, y otras; óxidos
tales como óxido férrico (Fe_{3}O_{4}), óxido ferroso férrico,
óxido de cromo (CrO_{2}), óxido de cobalto (CoO), óxido de níquel
(NiO_{2}), óxido de manganeso (Mn_{2}O_{3}),y otros;
materiales compuestos tales como ferritas y otros; y soluciones
sólidas tales como magnetita con óxido férrico y otras. Los
materiales magnéticamente reactivos preferidos para su uso en esta
invención son la magnetita, el óxido férrico (Fe_{3}O_{4}), y el
óxido ferroso (Fe_{2}O_{3}).
Las partículas sólidas se pueden fabricar de
hierro, óxido de hierro, un núcleo de material magnéticamente
reactivo recubierto con un óxido metálico, o una partícula magnética
coloidal conteniendo magnetita o hematita. Las partículas sólidas
tienen típicamente un peso específico de hasta 8 y un tamaño medio,
por ejemplo diámetro, de hasta 800 nanómetros.
Las partículas estratificadas pueden constar de
un núcleo de material magnéticamente reactivo teniendo un
recubrimiento magnéticamente no reactivo. Por ejemplo, una partícula
estratificada puede constar de un núcleo de óxido metálico
magnético que está generalmente rodeado por un recubrimiento
polimérico de silano; una partícula estratificada puede constar de
un sustrato metálico insoluble en agua recubierto con un producto
de condensación de un ácido aminobenzoico con un aldehído, apropiado
para acoplarse a un compuesto que tenga afinidad biológica. Una
partícula estratificada puede constar de un núcleo formado de una
partícula individual de un material magnéticamente reactivo
teniendo un recubrimiento de material polímero reticulado insoluble
en agua que tiene grupos reactivos en la superficie del mismo. Una
partícula estratificada puede constar de un núcleo de un material
no magnético teniendo un recubrimiento de un material magnéticamente
reactivo. Una partícula estratificada puede constar de una
partícula polimérica orgánica teniendo un recubrimiento de ferrita;
una partícula estratificada puede constar de un núcleo de material
termoplástico teniendo un recubrimiento de material magnéticamente
reactivo (en al menos una porción de la superficie del núcleo); una
partícula estratificada puede constar de una microesfera de
polialdehído recubierta con un metal; una partícula estratificada
puede constar de un núcleo de una partícula polimérica (por
ejemplo, poliestireno) teniendo un recubrimiento polimérico/óxido
metálico magnéticamente reactivo cubriendo uniformemente el núcleo.
Una partícula estratificada puede constar de un núcleo de material
magnéticamente no reactivo teniendo una capa de un material
magnéticamente reactivo y un recubrimiento magnéticamente no
reactivo. Por ejemplo, una partícula estratificada puede constar de
una microesfera de polialdehído recubierta con metal encapsulado
con agarosa, una cuenta de resina termoplástica (por ejemplo,
poliestireno, cloruro de polivinilo, poliacrilato, nylon, etc.)
teniendo desde el 1-25% en peso de un polvo
magnéticamente reactivo unido a la superficie de la cuenta, y un
polímero recubierto en eso, el polímero recubierto teniendo grupos
funcionales para unirse a un componente biológicamente activo.
Las partículas de material compuesto pueden
constar de un material magnéticamente reactivo incrustado dentro de
un material magnéticamente no reactivo. Los ejemplos representativos
de partículas de material compuesto incluyen: (a) cristales
magnéticos conteniendo hierro (<1.000 \ring{A}) incorporados
dentro de una estructura de vidrio y/o cristal; (b) una matriz de
copolímero formada a partir de al menos un monómero monoetilénico
(30-99% en peso) que no se coordine con un complejo
metálico, al menos un monómero polietilénico reticulable
(0'5-50% en peso) que no se coordine con un complejo
metálico, y al menos un monómero nucleófilo (0'5-30%
en peso) que se pueda coordinar con un complejo metálico, con
cristalitas encapsuladas de un metal; (c) partículas magnetizables
teniendo un tamaño medio (por ejemplo, diámetro) menor de 300
\ring{A}, encapsuladas en una matriz de organopolisiloxano; (d)
un producto de reacción particulado de una forma hidrosoluble de
hierro y un polímero hidrosoluble teniendo sitios de coordinación
disponibles (par de electrones libres para un enlace de
coordinación con un átomo de metal de transición); (e) una matriz
polimérica orgánica, inorgánica o sintética conteniendo un material
magnéticamente reactivo; (f) una fase continua de una matriz
polimérica insoluble en agua teniendo dispersada (embebida) allí
dentro: un material magnéticamente reactivo y un material absorbente
particulado (seleccionado de carbón vegetal, talco, resinas de
intercambio iónico, tierra de Fuller, dióxido de silicio, óxidos de
zirconio o aluminio o titanio, vidrio poroso, zeolitas, polímeros
naturales o sintéticos, primer o segundo anticuerpos polimerizados
o enzimas polimerizadas, antígenos o receptores de la superficie
celular en forma particulada, partículas subcelulares y células
bacterianas); (g) partículas fabricadas polimerizando uno o más
monómeros, en presencia de sólidos magnéticamente reactivos, para
formar directamente una matriz polimérica sintética insoluble en
agua teniendo los sólidos uniformemente incrustados allí dentro; (h)
partículas de proteína o polipéptido reticulados y un material
magnéticamente reactivo fabricado combinando: una solución en
disolvente orgánico de un polímero de alto peso molecular (por
ejemplo poliestireno), un material magnéticamente reactivo
particulado, y un agente reticulante polifuncional (por ejemplo,
polialdehído); (i) partículas poliméricas vinílicas aromáticas
hidrófobas teniendo un diámetro medio de 0'03 a 5 micrómetros y un
material magnéticamente reactivo en una cantidad del 0'5 al 50% en
peso con respecto a la porción polimérica de las partículas, el
material magnéticamente reactivo estando dispersado dentro de las
partículas poliméricas; (j) un rellenante seleccionado del grupo
que se compone de un metal, aleación de metal, óxido de metal, sal
de metal, sulfuro de metal, pigmento y compuesto quelato metálico,
y una capa superficial oleófila sobre el rellenante, y una capa de
material polímero sobre la superficie oleófila que cubre el
rellenante.
Los reactivos magnéticamente sensibles formados
como matriz o partículas de material compuesto pueden incluir,
opcionalmente, recubrimientos o capas adicionales de materiales
magnéticamente reactivos o materiales magnéticamente no reactivos,
o mezclas de los mismos. Las composiciones para matrices se pueden
fabricar mediante cualquier método, abarcando, pero no se limitan
a, (1) polimerización del material magnéticamente reactivo con el
monómero seleccionado, (2) hinchamiento del material de la matriz
con la introducción de material magnéticamente reactivo dentro de
los poros de la matriz, y otros. La matriz puede incluir materiales
orgánicos e inorgánicos tales como, por ejemplo, vidrio, celulosa,
materiales poliméricos sintéticos, agarosa, y otros. Los materiales
poliméricos apropiados para esta invención abarcan, pero no se
limitan a, polímeros de estireno; poliestirenos sustituidos;
derivados de polinaftaleno; ácidos poliacrílicos y polimetacrílicos;
poliacrilamida y polimetacrilamida; policarbonato; poliésteres;
poliamidas; polipirrol; poliaminoácidos aromáticos; polialdehídos;
materiales proteínicos tales como gelatina, albúmina y otros;
polisacáridos tales como el almidón, dextrano y otros; y
copolímeros de materiales poliméricos. El polímero puede ser también
utilizado en una mezcla con un rellenante inerte o puede incluir un
material absorbente.
Preferentemente, las partículas de material
magnéticamente reactivo apropiadas para su uso en la presente
invención son sustancialmente de forma esférica, aunque son
adecuadas otras formas y pueden ser ventajosas en algunas
circunstancias. Otras posibles formas incluyen, pero no se limitan
a, placas, varillas, barras, y formas irregulares. El diámetro de
las partículas de material magnéticamente reactivo oscilan,
preferentemente, desde aproximadamente 0'01 micrones (\mum) hasta
aproximadamente 1.000 \mum, más preferentemente desde unos 0'01
\mum hasta unos 100 \mum, y muy preferentemente desde unos 0'01
\mum hasta unos 10 \mum. Como se apreciará por aquellos
especializados en la técnica, la composición, forma, tamaño y
densidad del material magnéticamente reactivo pueden variar
ampliamente, y un material magnéticamente reactivo se puede
seleccionar basado en factores tales como el analito de interés y el
protocolo de ensayo deseado.
Conforme a una forma de realización de la
presente invención, las partículas de material magnéticamente
reactivo se pueden seleccionar para que tengan un peso específico a
fin de que se mantengan suspendidas dentro de la mezcla de
reacción, intensificando de ese modo la reactividad del miembro de
unión específica. Generalmente, las partículas pequeñas
magnéticamente reactivas que tengan un diámetro medio de menos de
unos 0'03 \mum (300 \ring{A}) pueden permanecer suspendidas en
solución mediante agitación térmica, sin decantación espontánea. En
formas de realización alternativas, las partículas de material
magnéticamente reactivo se pueden seleccionar para que tengan un
peso específico a fin de que no decanten en la mezcla de reacción,
intensificando de ese modo la reactividad del miembro de unión
específica con un reactivo inmovilizado en una fase sólida.
Generalmente, las partículas grandes de material magnéticamente
reactivo, por ejemplo aquellas que tengan un diámetro medio mayor
de unos 10 \mum, pueden responder a campos magnéticos débiles.
Aunque se pueden utilizar partículas grandes o densas de material
magnéticamente reactivo, tales partículas pueden necesitar que la
mezcla de reacción sea agitada durante las etapas de incubación,
para impedir la decantación de las partículas. En otra forma de
realización, las partículas de material magnéticamente reactivo se
pueden seleccionar para que permanezcan dispersas en la mezcla de
reacción durante un tiempo suficiente para permitir las reacciones
de unión requeridas, sin la necesidad de agitar o mezclar.
Al formar el reactivo magnéticamente sensible,
la unión del miembro de unión al material magnéticamente reactivo
puede ser lograda mediante cualquier mecanismo de unión o
acoplamiento apropiado, incluyendo, pero no se limitan a,
adsorción, enlace covalente, reticulación (químicamente o mediante
miembros de unión), una combinación de tales mecanismos de unión, y
otros. Típicamente, los grupos de acoplamiento y los agentes de
acoplamiento o conectores son seleccionados para que la actividad de
la unión del miembro de unión específica no sea sustancialmente
modificada o destruida en la unión al material magnéticamente
reactivo. La cantidad de miembro de unión que se puede unir al
material magnéticamente reactivo depende en gran parte de su
concentración, de las condiciones utilizadas, y de la cantidad y
naturaleza de los grupos funcionales disponibles en el material
magnéticamente reactivo o agente de acoplamiento.
Preferentemente, el miembro de unión específica
se une covalentemente al material magnéticamente reactivo, y el
enlace covalente se puede formar entre un componente y una forma
químicamente activa del otro componente. Por ejemplo, un éster
activo tal como N-hidroxisuccinimida puede ser
introducido en un componente y dejar que reaccione con una amina
libre en el otro componente, para formar un acoplamiento covalente
de los dos. Otros ejemplos abarcan, pero no se limitan a, la
introducción de maleimida en un componente, al cual se deja que
reaccione con porciones sulfhidrilo endógenas o introducidas en el
otro componente; la oxidación de grupos carbohidrato endógenos o
introducidos en un componente para formar aldehídos, los cuales
pueden reaccionar con aminas libres o hidrazidas en el otro
componente. Donde el marcador atraíble magnéticamente incluya un
recubrimiento o matriz poliméricos, el polímero se puede seleccionar
para que lo contenga, o se puede proporcionar con grupos reactivos
adecuados tales como, por ejemplo, azida, bromoacetilo, amino,
hidroxilo, sulfhidrilo, epóxido, carboxílico u otros grupos, para
facilitar la unión del miembro de unión específica. Los reactivos
apropiados, así como las técnicas de conjugación para sintetizar el
reactivo magnéticamente sensible, son bien conocidos por aquellos
de habilidad normal en la técnica. Se comprenderá, por supuesto, que
los métodos para sintetizar un reactivo magnéticamente sensible no
pretenden limitar la invención.
Los reactivos de partículas en fase sólida móvil
pueden constar generalmente de materiales que abarcan, pero no se
limitan a, polímeros tales como, por ejemplo, polímeros de estireno;
poliestireno sustituido; derivados de polinaftaleno; ácidos
poliacrílicos y polimetacrílicos; poliacrilamida y
polimetacrilamida; policarbonato; poliésteres; poliamidas;
polipirrol; polipropileno; látex; politetrafluoroetileno;
poliacrilonitrilo; vidrio u otros materiales vítreos;
poliaminoácidos aromáticos; polialdehídos; materiales proteínicos
tales como gelatina, albúmina y otros; polisacáridos tales como el
almidón, dextrano y otros; y copolímeros de materiales
poliméricos.
El método para unir un miembro de unión
específica a una fase sólida para, de ese modo, formar un reactivo
en fase sólida móvil, abarca la unión covalente y la unión no
covalente, las cuales han sido perfiladas anteriormente con
respecto a sintetizar un reactivo magnéticamente sensible.
Generalmente, se prefiere que el miembro de unión específica sea
unido a la fase sólida mediante unión covalente.
Los métodos y dispositivos revelados aquí se
pueden aplicar a cualquier formato de ensayo apropiado que implique
miembros de un par de unión específica, incluyendo, pero no se
limitan a, aquellos miembros de un par de unión previamente
descritos. Los métodos de ensayo de la presente invención utilizan
la respuesta de un reactivo magnéticamente sensible, a la
influencia de un campo magnético, para medir cuantitativa o
cuantitativamente la unión entre miembros de un par de unión
específica. Conforme a la presente invención, la presencia de un
analito media la extensión a la que el reactivo magnéticamente
sensible se une a un reactivo en fase sólida móvil. La extensión de
la unión modulará la respuesta del reactivo magnéticamente sensible
o la del reactivo en fase sólida móvil, o la de ambos, a la
influencia de un campo magnético. Por lo tanto, midiendo la
respuesta del reactivo magnéticamente sensible, o la del reactivo
en fase sólida móvil, o la de ambos, hacia el campo magnético, se
puede determinar exactamente la presencia o cantidad de analito
contenido en una muestra de ensayo.
Los reactivos magnéticamente sensibles y
dispositivos de la presente invención se pueden utilizar en
diversos formatos de inmunoensayo. Sin embargo, la presente
invención no se limita a inmunoensayos. En general, se puede
realizar cualquier configuración de ensayo, conforme a las
reivindicaciones adjuntadas, que utilice miembros de un par de
unión específica y un reactivo magnéticamente sensible tal como, por
ejemplo, las micropartículas superparamagnéticas utilizadas en la
presente invención. Los formatos de inmunoensayo son bien conocidos
por aquellos de habilidad normal en la técnica y están descritos,
por ejemplo, en la Patente U.S. Nº 5.252.459.
Los formatos de inmunoensayo están
particularmente bien descritos en la columna 5, línea 55, hasta la
columna 9, línea 62, de la Patente U.S. Nº 5.252.459.
La presente invención es aplicable a diversos
formatos de ensayo competitivo y formatos de ensayo sándwich que
son bien conocidos en la técnica. Se han descrito numerosos formatos
de ensayo competitivo, de inhibición, y sándwich, por los que se
reparte un reactivo marcado entre una fase líquida y una fase sólida
respecto a la presencia del analito en la muestra de ensayo.
Según un formato de ensayo competitivo, un
reactivo magnéticamente sensible puede constar de un primer miembro
de unión (por ejemplo, un análogo de analito) unido a un material
magnéticamente reactivo para, de ese modo, formar un reactivo
magnéticamente sensible. Un reactivo en fase sólida móvil puede
constar de un material en fase sólida móvil, tal como látex o
micropartícula poliméricos, al que se une un segundo miembro de
unión, el cual segundo miembro de unión se une específicamente al
analito y al primer miembro de unión, el cual está unido al
reactivo magnéticamente sensible. Durante el transcurso del ensayo,
un analito en la muestra de ensayo y el reactivo magnéticamente
sensible compiten por los sitios de unión en el reactivo en fase
sólida móvil. Alternativamente, el miembro de unión específica unido
a la fase sólida puede ser un análogo de analito seleccionado para
competir con el analito por unirse a un miembro de un par de unión
específica unido a un material magnéticamente reactivo. Por lo
tanto, la cantidad de reactivo magnéticamente sensible que se llega
a unir a la fase sólida es inversamente proporcional a la cantidad
de analito en la muestra de ensayo.
Según un formato de ensayo sándwich, un primer
miembro de unión específica se une a un material magnéticamente
reactivo para formar un reactivo magnéticamente sensible, y un
segundo miembro de unión específica se une a una fase sólida móvil
para formar un reactivo en fase sólida móvil. Los miembros de unión
específica son seleccionados para unirse directa o indirectamente
al analito de interés. Durante el transcurso del ensayo, el
reactivo magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil
se unen al analito para formar un complejo. De este modo, la
cantidad de reactivo magnéticamente sensible que forme un complejo
con el reactivo en fase sólida móvil para unirse al analito es
proporcional a la cantidad de analito en la muestra de ensayo.
Según la presente invención, lo protocolos de
ensayo pueden comprender opcionalmente el empleo de miembros de
unión auxiliares para unir indirectamente al analito o análogo de
analito al reactivo magnéticamente sensible o al reactivo en fase
sólida móvil. El miembro de unión auxiliar puede ser unido a un
reactivo en fase sólida móvil o a un reactivo magnéticamente
sensible antes, durante, o después de poner en contacto el reactivo
en fase sólida móvil o el reactivo magnéticamente sensible con la
muestra de ensayo u otros reactivos de ensayo.
Además, los protocolos de ensayo pueden
comprender, por ejemplo, el poner en contacto simultáneamente los
reactivos de ensayo y la muestra de ensayo para formar una mezcla de
reacción, o los reactivos de ensayo y la muestra de ensayo pueden
ser puestos secuencialmente en contacto, y durante un periodo de
tiempo apropiado para la unión, para formar múltiples mezclas de
reacción. Según tales protocolos de ensayo, después de un periodo
apropiado para la unión para formar complejos, el reactivo
magnéticamente sensible que no haya experimentado una reacción de
unión específica para formar un complejo (esto es, el reactivo
magnéticamente sensible no unido) puede ser separado del reactivo
magnéticamente sensible que haya experimentado una reacción de unión
específica para formar un complejo (esto es, el reactivo
magnéticamente sensible unido), debido a su diferente
comportamiento en un campo magnético aplicado. Se comprenderá, por
supuesto, que la separación del reactivo magnéticamente sensible
unido y el reactivo magnéticamente sensible no unido pueda implicar
la completa eliminación del reactivo magnéticamente sensible no
unido de la mezcla de reacción y/o del reactivo magnéticamente
sensible unido.
La separación del reactivo magnéticamente
sensible unido y el reactivo magnéticamente sensible no unido
también puede implicar la segregación del reactivo magnéticamente
sensible no unido del reactivo magnéticamente sensible unido, de
manera que el reactivo magnéticamente sensible no unido permanezca
en la mezcla de reacción pero no afecte adversamente la respuesta
detectable cuando el material magnéticamente reactivo unido sea
puesto en la proximidad de un campo magnético. Alternativamente, el
reactivo magnéticamente sensible no unido, el reactivo
magnéticamente sensible unido, o el reactivo en fase sólida móvil
pueden ser observados por una respuesta a un campo magnético.
Además, el reactivo magnéticamente sensible no unido, el reactivo
magnéticamente sensible unido, o el reactivo en fase sólida móvil
pueden ser observados por una respuesta a un campo magnético, por lo
que se puede observar una proporción del reparto.
Generalmente, los dispositivos comprenden
componentes para ejecutar ensayos de unión asistidos magnéticamente
como se pensó aquí. Por consiguiente, tales dispositivos constan
preferentemente de (i) un recipiente de reacción; (ii) un generador
de campo magnético para la aplicación de un campo magnético al
reactivo magnéticamente sensible; y (iii) un medio de medición para
valorar el efecto del campo magnético generado por el generador del
campo magnético sobre el reactivo magnéticamente sensible o el
reactivo en fase sólida móvil, o ambos, como medida de la presencia
o cantidad de analito en la muestra de ensayo.
El recipiente de reacción puede ser cualquier
dispositivo capaz de contener los reactivos de ensayo revelados
aquí, y donde se puedan producir el reactivo magnéticamente sensible
no unido y el reactivo magnéticamente sensible unido en relación a
la cantidad de analito en una muestra de ensayo.
El separar el reactivo magnéticamente sensible
unido del reactivo magnéticamente sensible no unido se puede llevar
a cabo mediante cualquier método apropiado para fraccionar el
reactivo magnéticamente sensible no unido y el reactivo
magnéticamente sensible unido, tal como, por ejemplo, la aplicación
de un campo magnético.
El generador del campo magnético puede ser
cualquier medio para generar un campo magnético que provoque una
respuesta del reactivo magnéticamente sensible. Los generadores de
campo magnético preferidos para esta invención incluyen imanes
permanentes y electroimanes. También se comprenderá, por supuesto,
que el generador de campo magnético también se puede utilizar para
separar el reactivo magnéticamente sensible no unido del libre, o
del reactivo magnéticamente sensible unido o acomplejado.
La respuesta de un reactivo magnéticamente
sensible a un campo magnético se puede manifestar de muchas formas
medibles, incluyendo la fuerza o movimiento resultante del reactivo
tal como, por ejemplo, un cambio aparente en la fuerza que actúa
sobre el reactivo en el recipiente de reacción, un desplazamiento
del reactivo, y otras. Se comprenderá, por supuesto, que estas
manifestaciones pueden ser medidas directamente detectando y
midiendo las manifestaciones del reactivo magnéticamente sensible, o
las manifestaciones pueden ser medidas indirectamente detectando y
midiendo el efecto del reactivo magnéticamente sensible sobre, por
ejemplo, el reactivo en fase sólida móvil o el generador del campo
magnético. La influencia del campo magnético sobre un reactivo
magnéticamente sensible puede ser observada o detectada y medida
mediante cualquier medio apropiado para medir, directa o
indirectamente, la respuesta del reactivo magnéticamente sensible al
campo magnético. Por ejemplo, (a) se puede detectar y medir un
cambio en el peso aparente mediante una balanza; (b) se puede
detectar y medir un cambio en la masa aparente mediante una balanza,
o un cambio resultante en la frecuencia de un oscilador, tal como
un cristal de cuarzo; (c) se puede detectar y medir un
desplazamiento, mediante un sensor óptico, para valorar la magnitud
de un cambio desde la posición inicial hasta una posición posterior
adoptada por el reactivo magnéticamente sensible, el reactivo en
fase sólida móvil, o el complejo constando de un reactivo en fase
sólida móvil y un reactivo magnéticamente sensible; (d) se puede
detectar y medir un movimiento mediante un detector de movimiento
para valorar el movimiento, tal como, por ejemplo, una película
piezoeléctrica, o una bobina tal como, por ejemplo, un susceptómetro
que puedan crear un campo que sea interrumpido mediblemente por la
presencia y/o movimiento de material magnético; y (e) se puede
detectar un cambio en la cantidad de esfuerzo incorporando
materiales, sensibles al esfuerzo, dentro de un recipiente o
material en fase sólida de manera que, en la aplicación de un campo
magnético, sea detectable el cambio en el esfuerzo. Se comprenderá,
por supuesto, que dependiendo del ensayo concreto, puede ser
preferible detectar, directa o indirectamente, la respuesta del
reactivo magnéticamente sensible no unido, la respuesta del reactivo
magnéticamente sensible unido, o ambas respuestas del reactivo
magnéticamente sensible unido y del reactivo magnéticamente
sensible no unido hacia el campo magnético. También se comprenderá,
por supuesto, que se puede utilizar una amplia variedad de
instrumentos para detectar cambios de masa, cambios de posición,
movimientos, cambios de peso, cambios de fuerzas, susceptibilidad
magnética, inducción, cambios ópticos y otros, todos los cuales
resultan de la interacción entre un campo magnético y el reactivo
magnéticamente sensible.
La presente invención resuelve los problemas de
los ensayos heterogéneos y de aglutinación convencionales,
permitiendo que el reactivo magnéticamente sensible se asocie con
reactivos semejantes o con otras partículas no reactivas
magnéticamente, aplicando después un campo magnético, y midiendo las
consecuencias de la fuerza magnética ejercida sobre el reactivo
magnéticamente sensible para proporcionar resultados cualitativos o
cuantitativos del ensayo. Los niveles pequeños de fuerza se pueden
determinar fácilmente utilizando detectores los cuales abarcan,
pero no se limitan a, balanzas electrónicas; sensores ópticos,
dispositivos sensores de presión piezoeléctricos tales como, por
ejemplo, dispositivos micromecánicos de silicio o chips
electrónicos; dispositivos vibradores de fibra; bobinas que
produzcan un campo que sea interrumpido por la presencia de un
reactivo magnéticamente sensible, tales como, por ejemplo, bobinas
de inducción y otras; y dispositivos de viga en voladizo que
incluyen, pero no se limitan a, aquellos utilizados para percibir
los cambios en las fuerzas en un microscopio de fuerza atómica; y
otros. Estos detectores permiten la ejecución de ensayos muy
sensibles y obvian la necesidad de amplificación del marcador, como
se requiere en muchos ensayos convencionales.
Los ensayos de unión heterogéneos convencionales
requieren un lavado vigoroso de la fase sólida para separar el
reactivo marcado unido y el reactivo marcado no unido, y para
suprimir la unión no específica de materiales a la fase sólida.
Tales etapas de lavado complican el protocolo de ensayo y restringen
el ensayo para el uso de miembros de un par de unión específica
teniendo alta afinidad, esto es, una fuerza de unión que resistirá
tal manipulación física. En ensayos convencionales de aglutinación
de partículas, se pueden utilizar miembros de unión baja afinidad
debido a que los diversos sitios de unión en cada miembro pueden
cooperar para dar altas avideces, y la ausencia de etapas de lavado
permite mantener asociaciones débiles, simplificando mientras el
formato de ensayo. Los resultados de amplificación de señales
debidos a la interacción de unos pocos sitios de unión pueden
originar la agregación de complejos varios órdenes de magnitud
mayores en tamaño y masa que los miembros de unión originales, y de
ese modo, proporcionar un cambio macroscópico que puede ser
interpretado visualmente. Sin embargo, los ensayos de aglutinación
de partículas son a menudo difíciles de interpretar, no producen
resultados cuantitativos, y no son fácilmente flexibles para su
automatización.
Conforme a la presente invención, se puede
manipular exactamente la intensidad del campo magnético, por
ejemplo, por medio de un electroimán, un imán permanente móvil, o
codificando campos magnéticos de intensidades o gradientes
específicos, o ambos, sobre materiales magnéticamente reactivos. Se
puede elegir una intensidad o gradiente del campo, o ambos, que
sean óptimos para un ensayo concreto y reactivos de ensayo
concretos, permitiendo de ese modo la corrección de la variabilidad
lote a lote en otros reactivos, o en la unión selectiva de ciertos
subconjuntos de reactivos o complejos a fin de obtener resultados de
ensayo más precisos. Se comprenderá que las ventajas mencionadas
permiten que los ensayos sean más fácilmente adaptados para
controlar mediante ordenador.
Los protocolos siguientes representan ejemplos
de un formato de ensayo sándwich y un formato de ensayo competitivo
indirecto utilizando la detección asistida magnéticamente de un
reactivo magnéticamente sensible. Con respecto a esto, los
protocolos siguientes, y los protocolos contemplados por la presente
invención, pueden ser ejecutados en cualquier orden de etapas o,
alternativamente, de una manera simultánea.
Protocolo
A
(1) Un primer miembro de unión específica, que
tiene un sitio de unión capaz de unirse a un primer sitio de unión
en el analito de interés, es unido a un material magnéticamente
reactivo para formar un reactivo magnéticamente sensible;
(2) un segundo miembro de unión específica, que
tiene un sitio de unión capaz de unirse a un segundo sitio de unión
en el analito de interés, es unido a una fase sólida móvil para
formar un reactivo en fase sólida móvil;
(3) se pone una muestra de ensayo en contacto
con el reactivo en fase sólida móvil para formar una primera mezcla
de reacción, por lo que el analito de interés se llega a unir al
reactivo en fase sólida móvil;
(4) se pone la primera mezcla de reacción en
contacto con el reactivo magnéticamente sensible para formar una
segunda mezcla de reacción, por lo que el reactivo magnéticamente
sensible forma un complejo con el reactivo en fase sólida móvil y el
analito, uniéndose al analito unido (la proporción de reactivo
magnéticamente sensible que forma un complejo con el reactivo en
fase sólida móvil y el analito está directamente relacionada con la
cantidad de analito en la muestra de ensayo);
(5) la segunda mezcla de reacción es sometida a
un detector;
(6) la segunda mezcla de reacción es expuesta a
un campo magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética
sobre el complejo de reactivo magnéticamente sensible, reactivo en
fase sólida móvil y analito, la influencia de esta fuerza estado
manifestada por el movimiento o captura de los complejos de reactivo
magnéticamente
sensible-analito-reactivo en fase
sólida móvil a una velocidad diferente de la del reactivo
magnéticamente sensible sin acomplejar o la del reactivo en fase
sólida móvil sin acomplejar, y se determina el grado de
manifestación mediante el detector; y
(7) el grado medible de la manifestación
proporciona una medida de la cantidad de reactivo magnéticamente
sensible que se ha incorporado en los complejos.
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Protocolo
B
(1) Un primer miembro de unión específica, que
tiene un sitio de unión (primer sitio de unión) capaz de unirse a un
sitio de unión en el analito de interés (segundo sitio de unión), es
unido a un material magnéticamente reactivo para formar un reactivo
magnéticamente sensible;
(2) un segundo miembro de unión específica, que
tiene un sitio de unión (tercer sitio de unión) capaz de unirse al
primer sitio de unión, es unido a un material en fase sólida móvil
para formar un reactivo en fase sólida móvil;
(3) se pone una muestra de ensayo en contacto
con el reactivo magnéticamente sensible para formar una primera
mezcla de reacción, por lo que el analito de interés se llega a unir
al reactivo magnéticamente sensible;
(4) se pone la primera mezcla de reacción en
contacto con el reactivo en fase sólida móvil para formar una
segunda mezcla de reacción, por lo que el reactivo magnéticamente
sensible se llega a unir al reactivo en fase sólida móvil uniéndose
al segundo miembro de unión específica (la proporción de reactivo
magnéticamente sensible que se llega a unir al reactivo en fase
sólida móvil está inversamente relacionada con la cantidad de
analito en la muestra de ensayo);
(5) la segunda mezcla de reacción es sometida a
un detector;
(6) la segunda mezcla de reacción es expuesta a
un campo magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética
sobre el complejo de reactivo magnéticamente sensible unido a la
fase sólida, la influencia de esta fuerza estado manifestada por el
movimiento o captura de los complejos, conteniendo el reactivo
magnéticamente sensible y el reactivo en fase sólida móvil, a una
velocidad diferente de la del reactivo magnéticamente sensible sin
acomplejar o la del reactivo en fase sólida móvil sin acomplejar, y
se determina el grado de manifestación mediante el detector; y
(7) el grado de la manifestación proporciona una
medida de la cantidad de reactivo magnéticamente sensible que se ha
incorporado en los complejos.
La Fig 1 ilustra las reacciones de unión del
Protocolo B. La Fig 1 ilustra esquemáticamente la unión de un
reactivo magnéticamente sensible 2 (por ejemplo, ferrofluido) a un
reactivo en fase sólida móvil 4 (por ejemplo,
látex-polipirrol) para producir un complejo 6 con
propiedades magnéticas alteradas. Una partícula de ferrofluido, que
no sea un complejo, no respondería tan rápidamente a un campo
magnético aplicado como lo haría un complejo conteniendo una
multiplicidad de partículas de ferrofluido.
En el Protocolo A o el Protocolo B, se puede
invertir el orden de las etapas 5 y 6.
Las siguientes formas de realización
ejemplifican cómo se debe utilizar el método de la presente
invención para realizar inmunoensayos.
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Forma de Realización
1
Las Figs 2 y 3 ilustran esquemáticamente la
medición magnéticamente asistida de la unión de un reactivo
magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por
medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después
de que la reacción haya sido sometida a un detector (etapa 6 del
Protocolo A).
Como se muestra en la Fig 2, el recipiente de
reacción 10 contiene una mezcla de reacción 12, la cual comprende
el analito 14, una suspensión de partículas de reactivo en fase
sólida móvil 16, y partículas de reactivo magnéticamente sensible
18. La mezcla de reacción 12 es sometida al detector 20, poniendo el
recipiente de reacción 10 sobre, o fijando el recipiente de
reacción 10 a, un soporte 22. El soporte 22 descansa sobre el
detector 20. El detector 20 puede ser una típica microbalanza de
carga superior, teniendo una cazoleta 26 que recibirá el soporte
22. Una vez que la cazoleta 26 reciba el soporte 22, y el soporte 22
reciba el recipiente de reacción 10, se puede tarar el detector 20
o ajustar al equilibrio (puesto a cero).
Como se muestra en la Fig 3, está puesto un imán
28 cerca del fondo del recipiente de reacción 10, por lo que el
campo magnético ejerce una fuerza sobre el reactivo magnéticamente
sensible en la mezcla de reacción 12. Generalmente, el imán 28 está
fijado a un brazo 30, lo que permite ajustes precisos del movimiento
del imán 28 hacia y lejos del recipiente de reacción 10. El campo
magnético puede ser suministrado mediante un imán permanente o un
electroimán, y puede ser aplicado intermitente o continuamente. Se
puede utilizar un electroimán a fin de que se pueda cambiar el
campo magnético, siendo desconectado y encendido antes de mover el
imán 28 o el recipiente de reacción 10. También se puede controlar
el electroimán mediante un ordenador, proporcionando de ese modo
los ajustes finos de la intensidad del campo magnético. Además, se
puede utilizar un electroimán para generar un campo magnético
alterno, el cual puede proporcionar la ventaja adicional de provocar
la mezcla del reactivo magnéticamente sensible en la mezcla de
reacción 12, si se desea tal mezcla.
La fuerza ejercida sobre el reactivo
magnéticamente sensible en el recipiente de reacción 10 se
manifiesta como un cambio aparente en el peso del recipiente de
reacción, el cual es registrado en la pantalla 32 del detector 20.
La fuerza magnética que se ejerce sobre una partícula del reactivo
en fase sólida móvil, que tiene más de una partícula de reactivo
magnéticamente sensible unido a ella (por medio del analito), es
mayor que la fuerza ejercida sobre una partícula de reactivo en
fase sólida móvil solo o sobre una partícula de reactivo
magnéticamente sensible solo. Por consiguiente, los complejos 34
comprendiendo el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el
reactivo magnéticamente sensible se mueven más rápidamente en el
campo que lo hacen las partículas individuales de reactivo
magnéticamente sensible. La fuerza de atracción entre los complejos
34 y el imán 28 origina una fuerza a ejercer sobre el recipiente de
reacción 10 y, de este modo, sobre el soporte 22 en la misma
dirección debido a la gravedad, la cual es registrada en la pantalla
32 del detector 20 como un aumento del peso aparente. A medida que
los complejos 34 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y
reactivo magnéticamente sensible migran hacia el fondo del
recipiente de reacción 10, y por lo tanto se mueven más cerca del
imán 28, aumenta la fuerza entre los complejos 34 y el imán 28,
acelerando además el movimiento de los complejos 34. A medida que
los complejos 34 alcanzan el fondo del recipiente de reacción 10 y
se acumulan allí, ejercen su máxima fuerza sobre el recipiente de
reacción 10 y su soporte 22 debido a su proximidad al imán. Este
fenómeno aumenta además el peso aparente del recipiente de reacción
10, como es indicado por la lectura de la pantalla. La velocidad a
la que los complejos 34 llegan al fondo del recipiente de reacción
10, y por lo tanto la velocidad de cambio del peso aparente
registrada por el detector 20, es una medida del grado de unión
entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo
magnéticamente sensible, y por lo tanto, de la cantidad de analito
presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser
registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo,
en un dispositivo registrador convencional. El cambio de peso
aparente es una medida de la cantidad de analito en la mezcla de
ensayo.
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Forma de Realización
2
Las Figs 4 y 5 son vistas esquemáticas de un
método alternativo para la medición de la unión de un reactivo
magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por
medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después
de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector
(etapa 6 del Protocolo A).
Como se muestra en la Fig 4, el recipiente de
reacción 100 contiene una mezcla de reacción 102, la cual consta
del analito 104, una suspensión de partículas de un reactivo en fase
sólida móvil 106, y partículas de un reactivo magnéticamente
sensible 108. En la Fig 4, la mezcla de reacción es sometida a un
detector 110, poniendo el recipiente de reacción 100 sobre, o
fijando el recipiente de reacción 100 a, un soporte 112. El soporte
112 posiciona el recipiente de reacción 100 encima del detector 110.
Como detector 110 se puede utilizar una típica microbalanza de
carga superior, con una cazoleta sensible al peso 116. En la
cazoleta 116 está situado el imán 118, por debajo de la posición
del recipiente de reacción 100. Antes de que el recipiente de
reacción 100 sea colocado en el soporte 112, o antes o justo después
de que se coloque la mezcla de reacción en el recipiente de reacción
100, se puede tarar el detector 110 o ajustar al equilibrio (puesto
a cero).
La Fig 4 muestra el procedimiento justo después
de que el recipiente de reacción 100 haya sido colocado sobre en el
soporte 112. El campo magnético producido por el imán 118 ejerce una
fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible en la mezcla de
reacción 102, en la dirección del imán, y una fuerza correspondiente
es ejercida sobre el imán en la dirección del reactivo
magnéticamente sensible. La fuerza ejercida sobre el imán tiende a
contrarrestar la fuerza ejercida sobre él debido a la gravedad,
produciendo un cambio en la respuesta del detector 110. Esta
respuesta inicial del detector es debida a la fuerza entre el imán y
el reactivo magnéticamente sensible en sus posiciones iniciales. Si
en este momento la balanza está puesta a cero, esta respuesta
inicial se convertirá en parte del peso de la tara de la balanza, y
el detector 110 mostrará la lectura cero. En la pantalla 120 se
puede observar la respuesta del detector 110.
El campo magnético producido por el imán 118
ejerce una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible en la
mezcla de reacción 102. La fuerza magnética que se ejerce sobre una
partícula del reactivo en fase sólida móvil, que tiene más de una
partícula del reactivo magnéticamente sensible unido a ella (por
medio del analito), es mayor que la fuerza ejercida sobre una
partícula de reactivo en fase sólida móvil solo o sobre una
partícula de reactivo magnéticamente sensible solo. Por
consiguiente, los complejos 122 de reactivo en fase sólida móvil,
analito, y reactivo magnéticamente sensible se mueven más
rápidamente en el campo magnético que lo hacen las partículas
individuales de reactivo magnéticamente sensible. A medida que los
complejos 122 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo
magnéticamente sensible migran hacia el fondo del recipiente de
reacción 100, y por lo tanto se mueven más cerca del imán 118,
aumenta la fuerza entre los complejos 122 y el imán 118, acelerando
además el movimiento de los complejos. Como se muestra en la Fig 5,
a medida que los complejos 122 alcanzan el fondo del recipiente de
reacción 100 y se acumulan allí, ejercen su máxima fuerza sobre el
imán 118, disminuyendo además el peso aparente del imán 118, como se
indica por un cambio en la lectura del detector. La velocidad a la
que los complejos 122 llegan al fondo del recipiente de reacción
100, y por lo tanto la velocidad de cambio del peso aparente
registrada por el detector 110, es una medida del grado de unión
entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo
magnéticamente sensible, y por lo tanto, de la cantidad de analito
presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser
registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo,
en un dispositivo registrador convencional. Cualquier cambio final
en la respuesta del detector después de que todos los complejos
hayan migrado hacia el fondo del recipiente de reacción 100, o la
velocidad de cambio de la respuesta del detector durante la
migración de los complejos, puede ser utilizado para medir la
cantidad de analito presente en la mezcla de reacción y, de este
modo, en la mezcla de ensayo original. En la Fig 5, las flechas
dentro de la figura representan la fuerza entre los complejos y el
imán.
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Forma de Realización
3
La Fig 6 y Fig 7 son vistas esquemáticas de un
método alternativo para la medición de la unión de un reactivo
magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por
medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después
de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector
(etapa 6 del Protocolo A).
Como se muestra en la Fig 6, el recipiente de
reacción 200 contiene una mezcla de reacción 202, la cual consta
del analito 204, una suspensión de partículas de un reactivo en fase
sólida móvil 206, y partículas de un reactivo magnéticamente
sensible 208. La mezcla de reacción es sometida a un detector 210,
poniendo el recipiente de reacción 200 sobre, o fijando el
recipiente de reacción 200 a, un soporte 212. El soporte 112
posiciona el recipiente de reacción 200 encima de un sensor 214, el
cual consta de un diafragma de material flexible 216 que tiene un
imán 218 unido en él. El diafragma de material flexible 216 está
apoyado sobre una base 220. El detector 210 consta de un
transductor de efecto Hall 222, que está colocado debajo del
diafragma de material flexible 216. La detección se lleva a cabo
monitorizando la salida de un circuito electrónico conectado al
transductor de efecto Hall 222. Los cambios en la fuerza sobres el
imán 218 producen cambios en su posición con respecto al
transductor de efecto Hall 222, debido a la flexión del diafragma
216. Este, a su vez, produce un cambio en el campo magnético
percibido por el transductor de efecto Hall 222, el cual se
manifiesta por un cambio en la salida del circuito electrónico. La
Fig 6 muestra el procedimiento justo después de que el recipiente de
reacción 200 haya sido colocado sobre el soporte 212 y puesto a cero
el detector.
El imán 218, unido al diafragma 216, está
situado cerca del recipiente de reacción 200, por lo que el campo
magnético ejerce allí dentro una fuerza sobre el reactivo
magnéticamente sensible. Por consiguiente, los complejos 224 de
reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente
sensible se mueven más rápidamente en el campo magnético que lo
hacen las partículas individuales de reactivo magnéticamente
sensible. A medida que los complejos 224 de reactivo en fase sólida
móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible migran hacia el
fondo del recipiente de reacción 200, y por lo tanto se mueven más
cerca del imán 218, aumenta la fuerza entre los complejos 224 y el
imán 218, acelerando además el movimiento de los complejos 224.
Como se muestra en la Fig 7, a medida que los complejos 224 alcanzan
el fondo del recipiente de reacción 200 y se acumulan allí, ejercen
su máxima fuerza de atracción sobre el imán 218. Esta fuerza es, a
su vez, ejercida sobre el diafragma 216, causando que se flexione y
desplace el imán 218 lejos del transductor 222. El grado de
desplazamiento desde la posición original del imán 218 depende de la
cantidad de reactivo magnéticamente sensible unido al reactivo en
fase sólida móvil (por medio del analito), y se manifestará como una
alteración en la señal producida por el circuito electrónico. La
velocidad a la que los complejos 224 llegan al fondo del recipiente
200, y por lo tanto la velocidad de cambio de la señal registrada
por el circuito del transductor, es una medida del grado de unión
entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo
magnéticamente sensible, y por lo tanto de la cantidad de analito
presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser
registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo,
en un dispositivo registrador. En la pantalla 226 se puede ver la
velocidad de cambio de la señal. Cualquier cambio final en la
respuesta del detector después de que todos los complejos hayan
migrado hacia el fondo del recipiente de reacción 200, o la
velocidad de cambio de la respuesta del detector durante la
migración de los complejos, puede ser utilizado para medir la
cantidad de analito presente en la mezcla de reacción y, de este
modo, en la mezcla de ensayo original. E dispositivo de esta forma
de realización se puede fabricar para que funcione en cualquier
orientación espacial.
Además del transductor de efecto Hall 222, se
pueden utilizar otros dispositivos de medición por proximidad. Los
ejemplos representativos de tales dispositivos abarcan dispositivos
ópticos donde un haz de luz es reflejado desde el fondo del
diafragma 216 sobre un detector, un desplazamiento del diafragma
causando una alteración en la intensidad de la luz que choca contra
el detector. También se pueden utilizar dispositivos ópticos que
midan el cambio en modelos de interferencia de luz reflejada a
partir del diafragma, en función de la distancia o distorsión de la
posición. También se pueden utilizar métodos no ópticos para
determinar los cambios en la posición o forma del diafragma, tales
como los sensores capacitivos comúnmente empleados como detectores
de proximidad. En lugar del diafragma, se pueden utilizar otros
elementos flexibles tales como bandas, muelles, brazos en voladizo,
y otros. En la Fig 7, las flechas dentro de la figura representan la
fuerza entre los complejos y el imán.
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Forma de Realización
4
La Fig 8 y Fig 9 son vistas esquemáticas de un
método alternativo para la medición de la unión de un reactivo
magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por
medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después
de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector
(etapa 6 del Protocolo A).
Como se muestra en la Fig 8, el recipiente de
reacción 300 contiene una mezcla de reacción 302, la cual consta
del analito 304, una suspensión de partículas de un reactivo en fase
sólida móvil 306, y partículas de un reactivo magnéticamente
sensible 308. En la Fig 8, la mezcla de reacción es sometida a un
detector 310, poniendo el recipiente de reacción 300 sobre, o
fijando el recipiente de reacción 300 a, un sensor 312. El sensor
312 consta de un diafragma de material flexible 314. El diafragma de
material flexible 314 está apoyado sobre una base 316. La detección
se lleva a cabo por medio de una fuente de luz 318 y un sensor
óptico 320. La luz procedente de la fuente de luz 318 es reflejada,
desde un sitio reflexivo 321 en el diafragma 314, sobre el sensor
óptico 320. Cualquier derivación en la posición del diafragma 314
produce un desplazamiento de posición o deflexión de la luz
reflejada que choca contra el sensor óptico 320, de ese modo
causando un cambio en la salida del sensor óptico 320. Se comprende
que el diafragma mismo 314 puede servir como medio para percibir la
posición, siendo reflejada la luz directamente fuera de la
superficie inferior del diafragma 314.
Como se muestra en la Fig 9, está puesto un imán
322 cerca del diafragma 314, por lo que el campo magnético ejerce
una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible en la mezcla de
reacción. Por consiguiente, los complejos 326 de reactivo en fase
sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente sensible se mueven
más rápidamente en el campo magnético que lo hacen las partículas
individuales de reactivo magnéticamente sensible. A medida que los
complejos 326 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo
magnéticamente sensible migran hacia el fondo del recipiente de
reacción 300, y por lo tanto se mueven más cerca del imán 322,
aumenta la fuerza entre los complejos 326 y el imán 322, acelerando
además el movimiento de los complejos 326. A medida que los
complejos 326 alcanzan el fondo del recipiente de reacción 300 y se
acumulan allí, ejercen su máxima fuerza de atracción sobre el imán
322. Esta fuerza es, a su vez, ejercida sobre el diafragma 314,
causando que se flexione. El grado de desplazamiento o distorsión
desde la posición original del diafragma 314 depende, en gran
parte, del grado de unión entre el reactivo magnéticamente sensible,
el analito, y el reactivo en fase sólida móvil, y por lo tanto de
la cantidad de analito presente en la mezcla de reacción. El grado
de unión se puede medir por el detector 310. Se comprenderá que el
recipiente de reacción 300 puede estar permanentemente fijado al
diafragma flexible 314, y reutilizado sacando y reemplazando la
mezcla de reacción 302. También se comprenderá que el recipiente de
reacción 300 o el diafragma flexible 314 puedan se desechables.
También se comprenderá que el soporte flexible necesite estar en
forma de diafragma. Se puede utilizar cualquier soporte flexible o
desplazable tal como, por ejemplo, brazos en voladizo, tirantes
elásticos, muelles o dispositivos que floten.
Se comprenderá que el mismo material flexible
pueda servir como recipiente de reacción, siendo la mezcla de
reacción colocada directamente en él. Se comprenderá adicionalmente
que el material flexible pueda ser de una configuración tal que
forme sitios en los que se pudiese contener la mezcla de reacción.
También se comprenderá que el material flexible puede ser una red
que se pueda mover a lo largo del sensor. En la Fig 9, las flechas
dentro de la figura representan la fuerza entre los complejos y el
imán.
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Forma de Realización
5
La Fig 10 y Fig 11 son vistas esquemáticas de
otros métodos para la medición de la unión de un reactivo
magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por
medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después
de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector
(etapa 6 del Protocolo A).
Como se muestra en la Fig 10, el recipiente de
reacción 400 consta de un pocillo 402 que tiene una tapa 404. El
pocillo 402 contiene una mezcla de reacción 406. Si está presente el
analito 408, una porción del reactivo magnéticamente sensible 410
se une al reactivo en fase sólida móvil 412 para formar complejos
414 (por medio del analito). El pocillo 402 está colocado sobre o
fijado a un dispositivo sensor de fuerzas, tal como una balanza 416
que tiene una cazoleta 418, el cual recibe el pocillo 402. Una vez
que la balanza 416 recibe el pocillo 402, la balanza 416 puede ser
puesta a cero.
Como se muestra en la Fig 11, está puesto un
imán 420 cerca de la tapa 404, por lo que el campo magnético ejerce
una fuerza sobre el reactivo magnéticamente sensible dentro del
pocillo 402. Bajo la influencia de esta fuerza, los complejos 414
de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo magnéticamente
sensible migran hacia la cara inferior de la tapa 404, donde la
fuerza magnética es más intensa debido a la más cercana proximidad
al imán 420. El reactivo magnéticamente sensible no unido 410 se
mueve más lentamente bajo este nivel de intensidad del campo
magnético que lo hacen los complejos 414, y tarda más tiempo en
alcanzar la cara inferior de la tapa 404. A medida que los
complejos 414 de reactivo en fase sólida móvil, analito, y reactivo
magnéticamente sensible se acumulan en la cara inferior de la tapa
404, producen una fuerza hacia arriba contra ella, contrarrestando
la fuerza de gravedad y causando una disminución en el peso aparente
del pocillo 402, el cual es registrado en la pantalla 422 de la
balanza 416. La velocidad a la que los complejos 414 llegan a la
cara inferior de la tapa 404, y por lo tanto la velocidad del cambio
de peso aparente registrado por la balanza 416, es también una
medida del grado de unión entre el reactivo en fase sólida móvil, el
analito, y el reactivo magnéticamente sensible, y por lo tanto
también es una medida de la cantidad de analito presente en la
mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser registrada, como un
cambio del peso aparente en función del tiempo, en un medio
registrador. Este método también se puede aplicar utilizando
recipientes de reacción con la parte superior abierta, la tensión
superficial de la mezcla de reacción sirviendo para el mismo
propósito que la tapa. La velocidad aparente de cambio del peso del
pocillo 402 será rápida a lo primero, pero diminuirá a medida que
sean capturados todos los complejos. El cambio total en el peso en
este momento puede ser utilizado para medir la cantidad de analito
en la mezcla de reacción. En la Fig 11, las flechas dentro de la
figura representan la fuerza entre los complejos y el imán.
Alternativamente, se podría sujetar el imán 420 a una balanza de
manera que se podrían medir los cambios en la fuerza ejercida por
los complejos sobre el imán.
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Forma de Realización
6
Las Figs 12 y 13 ilustran un detector
alternativo para la medición de la unión de un reactivo
magnéticamente sensible a un reactivo en fase sólida móvil (por
medio del analito), y sigue sustancialmente el Protocolo A después
de que la mezcla de reacción haya sido colocada sobre un detector
(etapa 6 del Protocolo A).
Como se muestra en la Fig 12, y más
detalladamente en la Fig 13, el recipiente de reacción 500 consta
de un pocillo 502 que contiene una mezcla de reacción 503 constando
de partículas de un reactivo magnéticamente sensible 504, de un
reactivo en fase sólida móvil 506 y, si estuviese presente, de un
analito 508. Como mínimo, una porción del reactivo magnéticamente
sensible 504 se une a las partículas del reactivo en fase sólida
móvil 506 (por medio del analito 508). La mezcla de reacción 503 es
sometida a un detector 510, poniendo el recipiente de reacción 500
dentro de, o fijando el recipiente de reacción 500 a, un primer
soporte 512. El soporte 512 sirve para colocar el recipiente de
reacción 500 cerca de un imán 514, el cual está sujeto a un segundo
soporte 516. El segundo soporte 516 tiene un filo de cuchilla 518
que descansa sobre una superficie sólida 520, y un brazo lateral
522 que sobrevuela la cazoleta 524 de una balanza 526. El segundo
soporte 516 está situado de tal forma que está libre para pivotar
sobre el filo de cuchilla 518, y está mantenido únicamente en su
posición vertical por el apoyo del brazo lateral 522, sobre la
cazoleta 524 de la balanza 526 mediante un tornillo de ajuste 527.
Una vez que los soportes 512 y 516 están colocados, la balanza 526
se puede tarar o ajustar a equilibrio (puesta a cero).
Después, se coloca el pocillo 512 dentro de, o
se fija al, soporte 512, de ese modo poniéndolo cerca del imán 514,
por lo que el campo magnético ejerce una fuerza sobre el reactivo
magnéticamente sensible dentro del pocillo 502. Bajo la influencia
de esta fuerza, los complejos 528 de reactivo en fase sólida móvil,
analito, y reactivo magnéticamente sensible migran hacia el lateral
del pocillo 502 donde la atracción magnética es más intensa, debido
a la más cercana proximidad al imán 514. El reactivo magnéticamente
sensible 504 no unido se mueve más lentamente bajo este nivel de
intensidad del campo magnético, y tarda más tiempo en alcanzar el
lateral del pocillo 502.
Los complejos 528 de reactivo magnéticamente
sensible, analito, y reactivo en fase sólida móvil producen una
fuerza sobre el imán 514 dirigida lateralmente hacia el pocillo 502.
Esta fuerza contrarresta la fuerza del brazo lateral 522 del apoyo
del segundo soporte 516 sobre la cazoleta 524 de la balanza 526,
produciendo una disminución en el peso aparente del brazo lateral
522 reportada por la balanza 526. La fuerza ejercida sobre el imán
no es suficiente para mover sustancialmente el segundo soporte 516,
pero suficiente solamente para disminuir su apoyo sobre la cazoleta
524 de la balanza. Están también disponibles dispositivos balanza
que mantienen la posición de la cazoleta sin hacer caso del apoyo
sobre ella. También se comprenderá que el concepto de esta forma de
realización no está restringido al empleo de balanzas. Se puede
utilizar cualquier dispositivo medidor de fuerzas, incluyendo
aquellos descritos anteriormente, esto es, aquellos que utilizan
soportes flexibles y sensores ópticos y otros de posicionamiento. La
velocidad a la que los complejos 528 llegan al lateral del pocillo
502, y por lo tanto la velocidad de cambio del peso aparente
registrado por la balanza 526, es una medida del grado de unión
entre el reactivo en fase sólida móvil, el analito, y el reactivo
magnéticamente sensible, y por lo tanto de la cantidad de analito
presente en la mezcla de reacción. Esta velocidad puede ser
registrada, como un cambio del peso aparente en función del tiempo,
en un medio registrador.
\vskip1.000000\baselineskip
Forma de Realización
7
Como forma de realización adicional de la
presente invención, las Figs 14A y 14B ilustran un dispositivo de
inmunoensayo autoejecutable para realizar ensayos analíticos. El
dispositivo 600 consta de un canal capilar 602 que tiene uno o más
sitios magnéticos 604. La mezcla de reacción 606 es atraída por el
canal 602 mediante capilaridad. La mezcla de reacción contiene un
reactivo magnéticamente sensible 610, el analito 612, y un reactivo
en fase sólida móvil 614. A medida que la mezcla de reacción 606
fluye por el canal 602, pasa sobre el sitio o sitios magnéticos
604, en las cuales posiciones el complejo 616 de reactivo en fase
sólida móvil 614, analito 612, y reactivo magnéticamente sensible
610 se acumulan preferentemente contra la pared del canal 602. En
algunas aplicaciones, puede ser ventajoso elegir la intensidad o
gradiente del campo magnético en el sitio(s) magnético, o el
tamaño y composición del reactivo magnéticamente sensible, a fin de
que el reactivo magnéticamente sensible se acumule si no está unido
o forme un complejo con el reactivo en fase sólida móvil. La
presencia o amplitud de esta acumulación de reactivo en fase sólida
móvil se puede medir de diversas formas.
En una forma de realización preferida de esta
invención, se fabrican partículas de reactivo en fase sólida móvil
614 o partículas de reactivo magnéticamente sensible 610 para que la
acumulación de los complejos 616 de reactivo en fase sólida móvil
614, analito 612, y reactivo magnéticamente sensible 610, en el
sitio o sitios magnéticos 604, origine que se establezcan
resultados visibles. Sin embargo, se comprenderá que la acumulación
de los complejos 616 se pueda detectar o medir por emisión de la
fluorescencia, reflexividad, densitometría, actividad enzimática o
cualquiera de los otros métodos de las otras formas de realización
descritas aquí, o por otros medios.
En una forma de realización particularmente
preferida, el sitio magnético 604 puede ser una cinta grabadora
magnética o una banda magnética similar a la encontrada en una
tarjeta de crédito convencional. El sitio magnético 604 también
sirve como superficie interior del canal capilar 602.
sitio(s) magnético 604 puede ser individual o múltiple, de
formas diversas, y de intensidades o gradientes de campo que
difieran para que los complejos de reactivo en fase sólida móvil,
analito, y reactivo magnéticamente sensible, que tengan diferentes
proporciones de reactivo en fase sólida móvil y reactivo
magnéticamente sensible, sean capturados en un sitio(s) 604
diferente, como indicación de la concentración de analito en la
muestra de ensayo.
Se pueden elegir las intensidades, gradientes,
tamaños y formas del campo del sitio(s) magnético, así como
el tamaño, forma y composición del reactivo magnéticamente sensible
para optimizar los resultados cualitativos, por ejemplo
positivo/negativo, o los resultados más cuantitativos, por ejemplo
semicuantitativos. Por ejemplo, a lo largo del fondo del canal
capilar ilustrado en las Figs 14A y 14B se podrían codificar una
serie de sitios de captura magnéticos idénticos. Cada sitio podría
ser codificado a fin de que tuviese una capacidad limitada para
unirse a los complejos constando de reactivo magnéticamente sensible
y de reactivo en fase sólida móvil. A medida que la mezcla de
reacción progrese corriente abajo a través del canal, los complejos
encontrarían primeramente, corriente arriba, la mayor parte de los
sitios de captura magnéticos de la serie y se acumularían allí. En
una mezcla de reacción conteniendo pocos complejos, únicamente la
mayor parte de los sitios de captura magnéticos corriente arriba
mostraría acumulación de complejos. Sin embargo, si hubiese
suficientes complejos para saturar la mayor parte de los sitios de
captura magnéticos corriente arriba, los complejos adicionales
fluirían mas allá del sitio, para ser acumulados en la siguiente
mayor parte corriente arriba de los sitios de captura magnéticos, y
así sucesivamente. Entonces, el número de sitios de captura
magnéticos que muestren acumulación de complejos serviría como
medida del alcance de la formación de complejos en la mezcla de
reacción, y por lo tanto de la concentración de analito en la
muestra de ensayo.
Alternativamente, en ciertos formatos de ensayo,
la concentración de analito en la mezcla de reacción se puede
manifestar por el número de partículas de reactivo magnéticamente
sensible unidas a cada partícula de reactivo en fase sólida móvil,
antes que por el alcance de la formación de complejos. En estos
casos, en el fondo del canal capilar se pueden codificar múltiples
sitios de captura magnéticos que difieran en la intensidad o
gradiente del campo magnético, o en ambos. Cada combinación de
intensidad/gradiente del campo mostraría una preferencia para
atraer complejos con una proporción concreta de reactivo
magnéticamente sensible a reactivo en fase sólida móvil. Por
ejemplo, a medida que progresase la mezcla de reacción corriente
abajo a lo largo del canal, los complejos podrían encontrar en
primer lugar el sitio de captura magnético que tuviese la intensidad
de campo más débil. Este sitio capturaría solamente aquellos
complejos que tuvieran una alta proporción de reactivo
magnéticamente sensible a reactivo en fase sólida móvil. Los sitios
de captura magnéticos posteriores incrementarían progresivamente en
intensidad del campo, de ese modo siendo capaces de capturar
complejos que tuviesen menores y menores proporciones de reactivo
magnéticamente sensible a reactivo en fase sólida móvil. En este
caso, qué sitios de captura magnéticos de la serie muestren
acumulación de complejos será una indicación de cómo de extensa ha
sido la acumulación de reactivo magnéticamente sensible, y por
consiguiente, cuanto analito estaba presente en la muestra de
ensayo. Se comprenderá que la acumulación de los complejos se puede
detectar o medir visualmente o por emisión de la fluorescencia,
reflexividad, densitometría, actividad enzimática, o cualquiera de
los métodos de las otras formas de realización descritas aquí, o por
otros medios. Esta forma de realización proporciona un pequeño
dispositivo analítico portátil, potencialmente desechable, que no
necesita energía eléctrica.
En otra forma de realización de la presente
invención, la cual emplea un dispositivo como el ilustrado en las
Figs 14A y 14B, el piso del canal capilar está fabricado de material
ópticamente absorbente. El reactivo en fase sólida móvil muestra
propiedades ópticas (reflectancia, color, fluorescencia,
quimioluminiscencia, u otras) que proporcionan contraste al canal
capilar ópticamente absorbente en proporción al alcance de la
acumulación del reactivo en fase sólida móvil. De esta manera, se
pueden enmascaran las propiedades ópticas del reactivo en fase
sólida móvil, lo cual es una propiedad especialmente útil en
formatos donde el reactivo magnéticamente sensible sea siempre
capturado en el sitio de captura magnético.
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Forma de Realización
8
En otra forma de realización de la presente
invención, las Figs 15A y 15B ilustran un dispositivo para
inmunoensayos autoejecutables para realizar ensayos analíticos. El
dispositivo 700 consta de un elemento 702 que tiene una superficie
plana 704 conteniendo uno o más sitios magnéticos 706. Se pone una
mezcla de reacción 708 en contacto con la superficie 704 o con una
capa de material cubriendo la superficie 704. La mezcla de reacción
708 contiene un reactivo magnéticamente sensible 710, el analito
712, y un reactivo en fase sólida móvil 714. Los complejos 716 de
reactivo en fase sólida móvil 714, analito 712 y reactivo
magnéticamente sensible 710 migran de manera preferente y se
acumulan en los sitios magnéticos 706. En algunas aplicaciones,
puede ser ventajoso elegir la intensidad o gradiente del campo
magnético en el sitio(s) de captura magnético, o el tamaño y
composición del reactivo magnéticamente sensible, a fin de que el
reactivo magnéticamente sensible se acumule si no está unido o
formado en un complejo el reactivo en fase sólida móvil. La
presencia o alcance de esta acumulación de reactivo en fase sólida
móvil se puede medir de diversas formas.
En una forma de realización preferida de esta
invención, se fabrican partículas de reactivo en fase sólida móvil
714 o partículas de reactivo magnéticamente sensible 710 para que,
cuando los complejos 716 de reactivo en fase sólida móvil 714,
analito 712 y reactivo magnéticamente sensible 710 se acumulen en el
sitio magnético 706, se forme un resultado visible. La forma,
color, densidad, alcance, posición, etc., sirven como medida de la
presencia o cantidad de analito en la mezcla de ensayo. Los sitios
magnéticos 706 pueden ser individuales o múltiples, de formas
diversas, y de intensidades o gradientes de campo diferentes, a fin
de que los complejos de reactivo en fase sólida móvil, analito y
reactivo magnéticamente sensible, que tengan diferentes
proporciones de reactivo en fase sólida móvil y reactivo
magnéticamente sensible, sean capturadas en sitios 706 diferentes
como indicación de la concentración de analito en la muestra de
ensayo. Se comprenderá que la acumulación de complejos se pueda
detectar o medir por emisión de la fluorescencia, reflexividad,
densitometría, actividad enzimática o cualquiera de los otros
métodos de las otras formas de realización descritas aquí, o por
otros medios.
En una forma de realización particularmente
preferida, el sitio magnético 706 puede ser una cinta grabadora
magnética o una banda magnética similar a la encontrada en una
tarjeta de crédito convencional. Esta forma de realización
proporciona un pequeño dispositivo analítico portátil,
potencialmente desechable, que no necesita energía eléctrica.
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Forma de Realización
9
En otra forma de realización de esta invención,
los procedimientos descritos aquí se pueden utilizar para
determinar las propiedades de materiales magnéticamente reactivos.
El tamaño, forma, contenido de magnetita, estado de agregación, y
otros factores influirán en la velocidad a la que las partículas de
reactivo magnéticamente sensible se moverán en un fluido en
respuesta a un campo magnético aplicado. La aplicación de las
técnicas de esta invención a muestras de materiales magnéticamente
reactivos puede servir como medio para controlar la calidad de
estos materiales, así como determinar la cantidad de estos
materiales en una muestra desconocida o una muestra de concentración
desconocida.
\newpage
Forma de Realización
10
En otra forma de realización de la presente
invención, las Figs 16A y 16B ilustran un dispositivo para
inmunoensayos autoejecutables para realizar ensayos analíticos. El
dispositivo 800 consta de un recipiente de reacción 802 soportado
encima de un imán 804. El recipiente de reacción 802 contiene una
mezcla de reacción 808, la cual consta de partículas de un reactivo
magnéticamente sensible 810, un analito 812, si hubiese, y
partículas de un reactivo en fase sólida móvil 814. Si está presente
el analito, una porción del reactivo magnéticamente sensible 810 se
une al reactivo en fase sólida móvil 814 (por medio del analito)
para formar complejos 816. Debido a que la fuerza magnética que es
ejercida sobre una partícula de reactivo en fase sólida móvil, que
tiene más de una partícula de reactivo magnéticamente sensible
unidas a ella (por medio del analito), es mayor que la fuerza
ejercida sobre una partícula de reactivo magnéticamente sensible
solo, los complejos 816 de reactivo en fase sólida móvil 814,
analito 812 y reactivo magnéticamente sensible 810 se moverán más
rápidamente en el campo magnético que lo hagan las partículas de un
reactivo magnéticamente sensible solo, y son desalojadas de la
suspensión.
En una forma de realización preferida de esta
invención, se fabrican partículas de reactivo en fase sólida móvil
o partículas de reactivo magnéticamente sensible, o ambas, a fin de
que cualquiera, o ambas, puedan ser detectadas cuando estén en
suspensión. La eliminación de los complejos de la suspensión puede
ser detectada visualmente o medida utilizando un dispositivo óptico
tal como el mostrado en la Fig 16. A partir de una fuente de luz
820, un haz de luz pasa a través del recipiente de reacción 802 y la
mezcla de reacción 808, para alcanzar un detector óptico 822. En la
pantalla 824, se pueden ver los resultados de las mediciones de
densidad óptica. La cantidad de reactivo en fase sólida móvil 814 o
de reactivo magnéticamente sensible 819, o ambos, se determina
observando cambios en la densidad óptica, emisión de la
fluorescencia, dispersión de luz o cualquier otro método de las
otras formas de realización descritas aquí, o por otros medios.
Se comprenderá que, puesto que la presente
invención implica la valoración de la fuerza, movimiento, o
acumulación manifestados por los complejos de reactivo en fase
sólida móvil y reactivo magnéticamente sensible, los diversos
métodos de detección y reactivos descritos aquí sean fácilmente
adaptados a una operación o sistema automatizado. Sin embargo, tal
operación o sistema automatizado no significa excluir la posibilidad
de que algunas operaciones del ensayo, en un sistema automatizado,
puedan ser realizadas manualmente.
La presente invención será ilustrada ahora
mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
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Se diseñó y construyó un dispositivo para medir
y registrar automáticamente las fuerzas ejercidas sobre un material
magnéticamente reactivo por los campos magnéticos aplicados. Se
obtuvo una microbalanza electrónica 900, modelo
UMT-2, de Mettler-Toledo Inc.,
Hightstown, N. J. Refiriéndonos ahora a la Fig 17, esta balanza 900
fue modificada en la fábrica para admitir pesos superiores a su
intervalo normal. Se produjo un pie de aluminio 902 para reemplazar
la cazoleta corriente de la balanza. Se trabajó a máquina un rebaje
circular 904 en la parte superior del pie 902, para recibir un imán
cilíndrico 906 de
neodimio-hierro-boro de 0'25
pulgadas (6'35 mm) de diámetro, obtenido de Cookston Magnets. Se
redondeó un extremo del imán cilíndrico de 0'25 pulgadas (6'35 mm)
de largo, para darle una ligera forma de bóveda y modificar la forma
del campo magnético producido, a fin de que la región de máxima
fuerza sobre las partículas magnéticamente reactivas estuviese en
el centro de la cara del imán. Se fabricó una tapa de aluminio 908
para la cámara de pesada de la microbalanza, para reemplazar la
tapa de vidrio normalmente suministrada. La tapa 908 constaba de un
anillo exterior de aluminio 910 teniendo un gran agujero central,
el cual soportaba un disco de aluminio 912 que tenía un diámetro
más pequeño que el diámetro de la cámara de pesada. El disco 912
estaba penetrado por dos agujeros no roscados 914 y 916, cerca del
extremo, y un agujero roscado 920 más grande en el centro. El disco
912 estaba situado en el anillo de fijación 910, de manera que los
tornillos de fijación 924 y 926 pasaban a través de cada agujero no
roscado 914 y 916, y atornillados sobre los agujeros roscados 928 y
929 en el anillo de fijación 910. El agujero roscado central 920 en
el disco 912 acogía una pieza intercalada cilíndrica roscada 930 de
aluminio en la que se había taladrado un agujero central 932 de
fondo plano, desde la parte superior hacia dentro, a 0'01 pulgadas
de la base dejando una delgada "ventana" de aluminio para
formar el piso 934 del agujero 932. El agujero central 932 de la
pieza intercalada 930 acogía adaptadores cilíndricos de aluminio
936 con agujeros taladrados a través de sus centros 937, para alojar
recipientes de ensayo 938 de formas y tamaños diversos. El
dispositivo de medición de las fuerzas se ensambló quitando la
cazoleta de la balanza y reemplazándola con el pie de aluminio 902.
El imán moldeado 906 fue colocado en el rebajo 904 de la parte
superior del pie 902, con el extremo redondeado más alto. La tapa de
vidrio de la cámara de pesada de la microbalanza fue reemplazada
con el anillo exterior de aluminio 910, con el disco de aluminio 912
centrado sobre él. La pieza intercalada roscada de aluminio 930 fue
atornillada en el agujero central roscado 920 en el disco 912, y en
ella se insertó un adaptador 936 para recipientes de ensayo. La
balanza misma, y todas las piezas añadidas estaban conectadas a
tierra para evitar cualquier aumento de carga estática.
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El dispositivo microbalanza modificada fue
conectado con el programa de captación de datos LabVIEIN® de
National Instruments Inc., Austin TX, residiendo en un ordenador
Macintosh por medio de un cable suministrado por
Mettler-Toledo Inc. El programa fue instalado para
captar, registrar y mostrar continuamente las lecturas de peso
enviadas desde la microbalanza a una velocidad de una lectura cada
0'3 segundos.
El aparato microbalanza 900 fue puesto a cero y
se empezó la recogida de datos en el ordenador acoplado. Mediante
una pipeta, se transfirió una alícuota de 20 \mul de una
suspensión diluida de micropartículas superparamagnéticas,
obtenidas de Nippon Paint, a un microtubo de polipropileno, el cual
fue colocado después en el soporte de aluminio para recipientes de
ensayo sobre la microbalanza, a fin de que la parte inferior del
tubo descansase sobre el fondo plano de la pieza intercalada roscada
de aluminio 930. Después, la pieza intercalada 930 fue girada en
sentido de las agujas del reloj para que provocase que la parte
inferior de la pieza intercalada 930 se aproximase a la parte
superior del imán 906. Se monitorizó el peso aparente del imán 906
reportado por la balanza 900, y se descubrió que disminuía a medida
que la pieza intercalada 930 se aproximaba al imán. Este cambio
aparente de peso resultó de la fuerza ejercida por el imán 906 sobre
las micropartículas superparamagnéticas en el microtubo, las cuales
contrarrestaban la fuerza gravitacional sobre el imán 906. A medida
que se continuaba girando la pieza intercalada 930, se alcanzó una
posición en la que la parte inferior de la pieza intercalada 930
hizo contacto con la parte superior del imán 906. En este momento,
el peso aparente del imán 906 aumentó drásticamente ya que la pieza
intercalada 930 ejercía una fuerza descendente sobre él. Después,
se invirtió el sentido de rotación de la pieza intercalada 930 hasta
que se restituyese el peso aparente del imán 906 observado justo
antes de que se hiciese contacto. Luego, la pieza intercalada 930
fue girada diez grados adicionales en el sentido contrario a las
agujas del reloj, dejando una separación muy pequeña entre la parte
inferior de la pieza intercalada 930 y la parte superior del imán
906. Se aflojaron los tornillos de fijación 924 y 926 que retienen
el disco de aluminio 912 conteniendo la pieza intercalada roscada
930 contra el anillo de aluminio 910, y se ajustó horizontalmente el
disco 912 hasta que se reportó el mínimo peso aparente por la
balanza 900; después, se volvieron a apretar los tornillos de
fijación 924 y 926. Después, se repitió el ajuste vertical de la
pieza intercalada roscada 930 descrito anteriormente, y se fijó su
posición mediante la aplicación de una gota de cemento de goma a las
roscas. El resultado de estos ajustes fue posicionar las
micropartículas superparamagnéticas en la región de máxima fuerza de
atracción vertical a partir del imán 906 siendo pesado por la
balanza 900.
Se comprobó la sensibilidad y reproducibilidad
del dispositivo balanza utilizando una suspensión al 0'01%
(peso/volumen) de micropartículas superparamagnéticas teniendo un
diámetro de 0'8 \mum y conteniendo un 30% de magnetita en peso de
partícula. Se transfirieron alícuotas, de 20 \mul cada una, a
tubos de polipropileno de microcentrífuga de 0'5 cm x 3 cm (Robbins
Scientific). El dispositivo balanza fue puesto a cero y se empezó
la recogida de datos. Después de 10 segundos, se insertó el primer
tubo en el dispositivo. Inmediatamente después de la introducción
del tubo, el peso aparente reportado del imán empezó a caer
rápidamente (ver Fig 18). Unos 10 segundos después de la
introducción, empezó a disminuir la velocidad de cambio de peso
hasta que el cambio estuvo casi parado después de unos 30 segundos,
siendo el cambio final de peso de 2'4 mg. Al sacar el tubo de
microcentrífuga, el peso aparente se restituyó rápidamente a cero.
Repitiendo el proceso con dos muestras adicionales, dio resultados
sustancialmente idénticos (ver Fig 18).
De Xerox Specialty Materials, Pittsford, NY, se
obtuvo un ferrofluido capaz de formar dispersiones acuosas
estables. Este material está descrito en los N^{os} de Patente
U.S. 5.322.756 y 5.358.659, incorporadas aquí como referencia. El
ferrofluido fue suministrado como suspensión acuosa al 60%
(peso/volumen). Las partículas de ferrofluido eran
superparamagnéticas y comprendían una matriz polimérica en la que
estaban incrustados nanocristales monodominio de Fe_{2}O_{3},
los cuales constituían el 27% del peso de la partícula. El tamaño
de partícula variaba de partícula a partícula. El diámetro medio de
las partículas era de aproximadamente 20 nm. Se reportó que la
magnetización de las partículas era de 12'2 emu/g a 6 kilogauss.
El ferrofluido concentrado fue diluido 100 veces
con agua, produciendo una suspensión marrón transparente. Se
transfirió una alícuota de 5 \mul de ferrofluido diluido a un
microtubo de polipropileno, y fue puesto en el dispositivo balanza
descrito en el Ejemplo 1. Se observó un cambio rápido de peso de 5'2
mg, equivalente a 104 mg/\mul de ferrofluido no diluido. El
ferrofluido diluido fue diluido 16 veces adicionales (1.600 veces
en total) en agua, y se analizó una alícuota de 100 \mul en el
dispositivo balanza como se describió anteriormente en el Ejemplo
1. Se observó un cambio inmediato de peso de 0'5 mg, seguido por un
cambio de peso muy lento hasta un cambio de peso total de 8 mg
durante un periodo de 20 horas (ver Fig 19). Este resultado indicó
la fuerza muy débil ejercida sobre cada partícula individual de
ferrofluido por el campo aplicado. Aunque la fuerza de atracción de
los agregados de todas las partículas en el campo es percibida
inmediatamente por la balanza, la migración de las partículas a la
región de campo y gradiente máximos fue muy lenta, como se indica
por el cambio posterior muy lento en peso.
El ferrofluido concentrado fue diluido 100 veces
con salino tamponado con fosfato (PBS) conteniendo 0'1% albúmina de
suero bovino (BSA), y se aplicó a una columna cromatográfica de 1 cm
x 40 cm rellena con medio para filtración en gel "SEPHAROSE®
S-300" (Pharmacia Bioteck, límite de exclusión de
1x10^{6} daltons), equilibrada previamente con BSA al 0'1% en
PBS, y eluida con el mismo tampón. El ferrofluido eluyó como banda
marrón en el volumen excluido de la columna. La separación en una
columna de medio para filtración en gel "SEPHACRYL®
S-500" (límite de exclusión de 2x10^{7}
daltons) produjo que estuviese parcialmente incluido el ferrofluido
(ver Fig 20A), mientras que la separación en una columna de medio
para filtración en gel "SEPHACRYL® S-1000"
(límite de exclusión >10^{8} daltons) produjo que estuviesen
incluidas la mayor parte de las partículas, eluyendo como banda
ancha más tarde que las micropartículas de 30 \mum de referencia
(ver Fig 20B). En la Fig 20B, la curva A representa el reactivo
magnéticamente sensible y la curva B representa el reactivo en fase
sólida móvil. De esta manera, se pudo subfraccionar el ferrofluido
partiendo de la base del tamaño de partícula.
Para evaluar la utilidad del ferrofluido en
ensayos de unión, el ferrofluido fue recubierto con BSA biotinilada
(albúmina bovina marcada con biotinamidocaproílo, Sigma Chemicals
Co., St. Louis, MO). Se mezcló una alícuota de 100 \mul, de una
solución de 10 mg/ml de BSA biotinilada en PBS, con 850 \mul de
tampón de bicarbonato al 1% (pH 9'0) y 50 \mul del ferrofluido
concentrado. La mezcla fue incubada a una temperatura de 37ºC
durante una hora, después se añadió 200 \mul de BSA al 1% en PBS,
y se continuó la incubación durante 45 minutos adicionales.
Después, se aplicó la mezcla a una columna cromatográfica de 1 cm x
40 cm rellena con medio para filtración en gel "SEPHAROSE®
S-300", equilibrada previamente con BSA al 0'1%
en PBS, y se eluyó con el mismo medio. Las fracciones conteniendo
el ferrofluido, como se notó por su color marrón, eluyeron en el
volumen vacío. Una alícuota de 5 \mul de las fracciones combinadas
dio una lectura de 5 mg en el dispositivo balanza. El material
combinado fue diluido 50 veces con PBS para su uso en ensayos de
unión (ver Ejemplos 3, 4, 5, 6, 7, y 8 a continuación).
De Abbott Laboratories se obtuvo un anticuerpo
con actividad de unión frente a la gonadotropina coriónica humana
subunidad beta, y se marcó con tritio mediante oxidación con
peryodato, seguido por reducción con NaCNBH_{3}(^{3}H).
Después de la aplicación a una columna de 1 cm x 40 cm de medio para
filtración en gel "SEPHAROSE® S-300"
(Pharmacia Bioteck), el marcador eluyó en tres picos en el volumen
excluido, el volumen parcialmente incluido, y el volumen incluido
totalmente, representando agregados de anticuerpo marcado,
anticuerpo marcado libre y marcador libre, respectivamente. Se
mezcló una alícuota de 10 \mul del anticuerpo marcado no separado
(340.000 dpm) con una alícuota de 20 \mul de ferrofluido en 220
\mul de tampón de carbonato sódico al 1%, pH 9'0. Después de la
incubación durante dos horas a una temperatura de 37ºC, se añadió
800 \mul de BSA al 0'1% en PBS y se continuó la incubación
durante 45 minutos a una temperatura de 37ºC. Después, la mezcla
fue aplicada a la columna de medio para filtración en gel
"SEPHAROSE® S-300" como se describió antes. El
marcador eluyó como dos picos, uno eluyendo con el ferrofluido en
el volumen excluido y el otro en el volumen incluido totalmente. Se
repitió el procedimiento de recubrimiento con anticuerpo
anti-hCG no marcado. Se recogió el material que
eluía en el volumen excluido, y se diluyó cincuenta veces con PBS
para su uso en inmunoensayos.
Se preparó una muestra de partículas de
látex-polipirrol recubiertas con un anticuerpo con
afinidad de unión para biotina, como se describe en la Patente U.S.
Nº 5.252.459, incorporada aquí como referencia. Estas partículas
eran de 0'3 a 0'7 \mum de diámetro, y las suspensiones de ellas
son de color negro intenso.
A viales de vidrio teniendo una capacidad de 4
ml se transfirieron cinco alícuotas (un ml cada una) del
ferrofluido diluido cincuenta veces, recubierto con BSA biotinilada,
de la columna conteniendo medio para filtración en gel
"SEPHAROSE® S-300" (ver Ejemplo 2). A cada vial
conteniendo el ferrofluido recubierto con BSA biotinilada se
transfirieron alícuotas de 0, 2, 5, 10 y 20 \mul de una suspensión
al 0'1% del látex-polipirrol recubierto con
anti-biotina, y el contenido de cada vial se incubó
a una temperatura de 37ºC durante 30 minutos. Luego, de cada vial
se transfirió una alícuota (100 \mul) a un microtubo de
polipropileno, se puso el microtubo en el aparato microbalanza
descrito en el Ejemplo 1, y se registró el peso aparente del imán en
función del tiempo.
La velocidad y el alcance de la respuesta del
aparato reflejaron la cantidad de látex-polipirrol
recubierto con anti-biotina presente (ver Fig 21).
Se puso la balanza a cero y la recogida de datos empezó a los 0
segundos (ver Fig 21). El microtubo de polipropileno conteniendo la
alícuota de la mezcla incubada sin látex-polipirrol
recubierto con anti-biotina añadido (la muestra de
cero microlitros) fue insertado en el aparato después de 45
segundos. El peso reportado del imán disminuyó rápidamente desde 0
mg hasta -0'06 mg, después disminuyó además, a una velocidad
estable, a -0'10 mg por encima de un periodo de tres minutos,
reflejando la velocidad de migración del ferrofluido hacia el fondo
del microtubo (ver segmento A de la curva, Fig 21). Luego, el se
extrajo el microtubo del aparato y el peso reportado del imán volvió
rápidamente a cero.
El microtubo de polipropileno conteniendo la
alícuota de mezcla incubada, que tiene dos microlitros añadidos de
látex-polipirrol recubierto con
anti-biotina, fue insertado en el aparato después de
30 segundos adicionales. El peso reportado del imán cayó
rápidamente desde 0 a -0'06 mg, después disminuyó además hasta
-0'12 mg por encima de un periodo de tres minutos (ver segmento B de
la curva, Fig 21), después de lo cual fue extraído. Los análisis de
los microtubos conteniendo alícuotas de las mezclas incubadas, que
tenían 5, 10 y 20 microlitros añadidos de
látex-polipirrol recubierto con
anti-biotina (ver segmentos C, D y E de la curva,
Fig 21), mostraron velocidades de disminución en el peso reportado
del imán cada vez más grandes, reflejando la mayor velocidad de
migración del ferrofluido en complejos de
látex-polipirrol-ferrofluido que la
del ferrofluido solo (ver Tabla 1).
La velocidad lineal de los cambios de peso por
encima de los periodos de tres minutos de observación indicó que la
captura de los complejos no fue completada en ese tiempo. Por encima
de periodos de observación más largos, el cambio de peso más rápido
de las muestras conteniendo concentraciones mayores de
látex-polipirrol retardó el de la muestra cero,
indicando que todos los complejos habían migrado hacia el fondo del
microtubo. La lenta velocidad de cambio de peso vista con la
muestra cero fue debida a la agregación de las partículas de
ferrofluido durante el procedimiento de recubrimiento con la
albúmina de suero bovino biotinilada, y se puede reducir mediante
sonicación previa.
El efecto fue también observable visualmente,
advirtiendo la velocidad y alcance de la eliminación del
látex-polipirrol de la muestra de ensayo (ver Figs
22A, 22B, 22C y 22D). En todas las muestras conteniendo
látex-polipirrol, todas las de látex fueron
eliminadas de la muestra de ensayo, indicando la presencia de un
exceso de ferrofluido en todas las muestras. En la serie de Figs
22A, 22B, 22C y 22D, la Fig 22A precede a la Fig 22B, la Fig 22B
precede a la Fig 22C, y la Fig 22C precede a la Fig 22D.
Para determinar la concentración óptima de
ferrofluido necesaria para otorgar reactividad magnética al
látex-polipirrol, el ferrofluido recubierto con BSA
biotinilada de la columna conteniendo medio para filtración en gel
"SEPHAROSE® S-300" fue diluido 50 veces, 100
veces, 200 veces, 400 veces y 800 veces con PBS. Todas las
soluciones diluidas eran transparentes, siendo la dilución de 50
veces de color pajizo, siendo la dilución de 100 veces de color
amarillo claro, siendo la solución diluida 200 veces de color
amarillo muy claro, y siendo incoloras las soluciones diluidas 400
veces y 800 veces. Para cada solución diluida, se transfirió una
alícuota (1 ml) a un vial de 4 ml, y después se añadieron 20 \mul
de la suspensión de polipirrol recubierto con
anti-biotina a cada vial. Después de la incubación
durante 30 minutos a una temperatura de 37ºC, se transfirió una
alícuota de 100 \mul de cada mezcla de ensayo a un microtubo, y se
insertó el microtubo en el aparato microbalanza descrito en el
Ejemplo 1. En todas las muestras de ensayo conteniendo ferrofluido,
todas las de látex-polipirrol migraron con el
tiempo hacia el fondo del microtubo, como se determinó visualmente.
La velocidad y alcance del cambio de peso aparente del imán
reportados por el aparato variaron con la concentración de
ferrofluido (ver Fig 23). Estos resultados indican que, aunque las
suspensiones de ferrofluido más sumamente diluidas fueron capaces
de unir un número suficiente de partículas de ferrofluido a
partículas de látex-polipirrol para permitir que
los complejos fuesen capturados magnéticamente, el empleo de
suspensiones de ferrofluido más concentradas produjo una superior
carga de ferrofluido en el látex-polipirrol.
Se fabricaron soluciones diluidas de BSA
biotinilada libre con un diluyente de ensayo obtenido de Abbott
Laboratories, para dar concentraciones de 0 \mug/ml, 2 \mug/ml,
10 \mug/ml y 40 \mug/ml. Para cada solución diluida, se puso
una alícuota (20 \mul) en un microtubo y se mezcló con 20 \mul
del látex-polipirrol recubierto con
anti-biotina. Después de que cada solución fuese
incubada durante una hora a una temperatura de 37ºC, a cada
solución se añadió 40 \mul del ferrofluido recubierto con BSA
biotinilada, se continuó la incubación durante 30 minutos
adicionales, luego se puso cada tubo en el aparato microbalanza
descrito en el Ejemplo 1 para su análisis. Se advirtió el cambio de
peso aparente observado del imán con los tubos en el sitio con
respecto al peso aparente del imán cuando estaba en el sitio un
microtubo conteniendo 40 \mul de diluyente en lugar del
ferrofluido. Como se muestra en la Fig 24, concentraciones
crecientes de albúmina de suero bovino biotinilada libre inhiben la
captura del ferrofluido por el látex-polipirrol, con
el resultado de que se forman menos complejos y se acumula menos
ferrofluido en el fondo del microtubo, donde puede ejercer su
máxima fuerza de atracción sobre el imán. La muestra de 40 \mug/ml
(10 \mug/ml en la mezcla incubada) mostró un cambio de peso de
0'2 mg, indicando que la máxima inhibición bajo estas condiciones
fue obtenida a concentraciones de albúmina de suero bovino
biotinilada de 4-5 \mug/ml en la mezcla
incubada.
Estos resultados demuestran que el ferrofluido y
el látex-polipirrol se unen entre sí debido a los
miembros de unión específica con los que están recubiertos. El
alcance de la unión origina un cambio predecible en el efecto de un
campo magnético aplicado sobre la muestra de ensayo.
Refiriéndonos ahora a las Figs 25A, 25B y 25C,
se laminaron conjuntamente tres láminas 1000, 1002 y 1004 de
película polimérica para crear un material laminar 1006 para canales
capilares. Uno o más agujeros de apertura 1008 en la lámina
superior 1000 sirvieron como sitio(s) de aplicación para la
muestra de ensayo, permitiendo el acceso al extremo(s)
terminal 1010 del canal(s) 1012 cortado en la lámina del
medio 1002. La parte inferior 1014 de la lámina del fondo 1004
estaba recubierta con adhesivo para que se adhiriese a una placa
base magnética 1016, la cual se describe a continuación. La muestra
de ensayo fue atraída hacia abajo del canal 1012, por capilaridad,
hasta que alcanzó el extremo(s) 1018 del canal(s)
1012, en el cual punto cesaría el movimiento del líquido hacia
abajo del canal. A veces, se puso un material capilar (no mostrado)
situado en el extremo(s) 1018 del canal(s) 1012, para
continuar atrayendo la muestra de ensayo hacia abajo del canal
después de que se haya alcanzado el extremo del canal.
Aunque el dispositivo en este ejemplo está
fabricado adhiriendo tres capas de material polímero conjuntamente,
está dentro del campo de aplicación de esta invención fabricar
dispositivos que tengan canales capilares con una única capa, dos
capas, o cuatro o más capas de material polímero o equivalente tal
como, por ejemplo, vidrio o láminas de metal. En la técnica son
bien conocidos, por los de habilidad normal, métodos para adherir
dos o más capas de material polímero o equivalente, tales como, por
ejemplo, adhesivos, termoselladores, fijadores y otros.
Se trabajó a máquina una placa base de 20 cm x
20 cm a partir de una placa de aluminio 1016 de ½ pulgada (12'7
mm). Se trabajó a máquina un canal 1020 [½ pulgada (12'7 mm) de
ancho y ¼ de pulgada (6'35 mm) de profundidad] a lo largo de la
cara de la placa, el cual canal fue rellenado con una pieza
intercalada 1022 "DELRIN". Se cortó longitudinalmente un canal
de 1/8 de pulgada (3'18 mm) de profundidad por 1/32 de pulgada (0'79
mm) de ancho, a lo largo del centro de la pieza intercalada 1022, y
se rellenó con una tira 1024 de 1/8 de pulgada (3'18 mm) x 1/32 de
pulgada (0'79 mm) x 6 pulgadas (15'24 mm) de material magnético
flexible.
Para determinar la concentración óptima de
ferrofluido necesaria para otorgar reactividad magnética sobre
látex-polipirrol, para su uso en un formato de
ensayo que emplee un dispositivo que tenga canales capilares, el
ferrofluido recubierto con BSA biotinilada de la columna conteniendo
medio para filtración en gel "SEPHAROSE®
S-300" fue diluido 50 veces, 100 veces, 200
veces, 400 veces y 800 veces con PBS. Para cada solución diluida,
se transfirió una alícuota (1 ml) a un vial de 4 ml, y a cada vial
se añadió 20 \mul de la suspensión de polipirrol recubierto con
anti-biotina. Después de la incubación durante 30
minutos a una temperatura de 37ºC, se aplicó después una alícuota
de 7 \mul de cada vial al sitio de aplicación del material laminar
de los canales capilares, el cual había sido unido a la placa base
magnética de manera que el eje longitudinal de la tira magnética
estuviese orientado 90º desde el eje longitudinal de los canales, y
fue colocado debajo de los canales 0'5 cm distal a la abertura
proximal de los canales (ver Figs 25A y 25B). Todos los canales
correspondientes a las muestras de ensayo que contenían las
soluciones diluidas de ferrofluido mostraron una banda negra de
látex-polipirrol capturado en la posición de la tira
magnética, la intensidad de la banda aumentando a medida que
aumentaba la concentración de ferrofluido en la muestra de ensayo.
Las muestras de ensayo que no contenían ferrofluido no mostraron
ninguna banda de látex-polipirrol.
Se prepararon cuatro soluciones independientes
conteniendo 0 \mug, 5 \mug, 20 \mug y 80 \mug de BSA
biotinilada, descrita en el Ejemplo 4, en 1 ml de PBS. A cada mezcla
se añadió una alícuota (20 \mul) del
látex-polipirrol recubierto con
anti-biotina descrito en el Ejemplo 2, seguido por
incubación a una temperatura de 37ºC durante una hora, después de
lo cual se añadió una alícuota de 20 \mul del ferrofluido
recubierto con BSA biotinilada del Ejemplo 2. Después de incubación
a una temperatura de 37ºC durante 5 minutos o 25 minutos, se
aplicaron alícuotas al dispositivo de canales capilares descrito en
el Ejemplo 5. La presencia de BSA biotinilada libre, a una
concentración de 5 \mug/ml o más, inhibió la captura del
látex-polipirrol en el sitio magnético de los
canales.
Se fabricaron soluciones diluidas, en diluyente
de ensayo, de BSA biotinilada descrita en el Ejemplo 4, a
concentraciones de 0 \mug/ml, 5 \mug/ml, 10 \mug/ml, 20
\mug/ml y 80 \mug/ml. Una alícuota de 20 \mul de cada
solución de BSA biotinilada diluida fue mezcla adicionalmente con 60
\mul de diluyente y 10 \mul del
látex-polipirrol recubierto con
anti-biotina descrito en el Ejemplo 2. Después de
que dejase estar la mezcla durante 15 minutos a temperatura
ambiente, a eso se añadió una alícuota de 10 \mul del ferrofluido
recubierto con BSA biotinilada del Ejemplo 2. Después de incubación
adicional a una temperatura de 20ºC durante 15 minutos, se
aplicaron alícuotas (7 \mul) de la mezcla resultante al
dispositivo de canales capilares descrito en el Ejemplo 5. La
presencia de BSA biotinilada libre, a una concentración de 5
\mug/ml o más, inhibió la captura del
látex-polipirrol en el sitio magnético de los
canales.
Para este tipo de ensayo, se pudieron obtener
resultados cuantitativos midiendo el cambio en reflectancia del
sitio de captura magnético debido a la presencia de
látex-polipirrol capturado. Se repitió el ensayo
como antes, excepto que se utilizaron concentraciones de BSA
biotinilada de 0'125 \mug/ml, 1'0 \mug/ml, 5'0 \mug/ml y 80
\mug/ml. Después de las aplicaciones de alícuotas (7 \mul) de
las mezclas de reacción a los canales capilares, se escanearon los
canales utilizando un lector de reflectancia de barrido fabricado
por Abbott Laboratories. La reflectancia en el sitio de captura
magnético fue comparada con la reflectancia de los sitios, en
cualquier lado del sitio de captura magnético, y se calculó la
reflectancia neta como la diferencia entre la reflectancia en el
sitio de captura magnético y la media de los dos sitios vecinos. La
diferencia entre la reflectancia en el sitio de captura magnético y
en los sitios vecinos no magnéticos disminuyó a medida que
aumentaba la concentración de BSA biotinilada libre, debido a que la
BSA biotinilada libre inhibía la unión entre el
látex-polipirrol y el ferrofluido (ver Fig 26). La
respuesta del ensayo muestra el estrecho margen deseable para un
formato de ensayo positivo/negativo.
Se diluyó el ferrofluido en ácido
3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 20 mM,
el cual había sido ajustado a pH 7'0 con ClH, hasta una
concentración de 1% en sólidos. Todas las etapas posteriores con el
ferrofluido hasta el ensayo final fueron realizadas en este tampón.
De la preparación de ferrofluido se eliminaron el material soluble
y las partículas sin hierro unido, aplicando una capa de 3'3 ml de
la suspensión al 1% en 10 ml de sacarosa al 20%, en un tubo de
centrífuga de 15 ml. Se centrifugó la preparación durante dos horas
en un rotor de cubetas giratorias a 170.000xg, a una temperatura de
4ºC. El gránulo resultante de ahí fue lavado dos veces en 10 ml de
tampón, después de lo cual, se centrifugó el gránulo a 170.000xg
durante una hora. El gránulo final fue suspendido en tampón MOPS
para proporcionar una concentración del 1% en sólidos, y almacenado
luego a una temperatura de 4ºC.
Se ajustó un anticuerpo monoclonal murino, que
estaba unido a la subunidad alfa de \beta-hCG, a
una concentración de 4 mg/ml; cinco ml de esta solución se añadieron
a un volumen igual de la suspensión de partículas
superparamagnéticas lavadas. Esta suspensión se agitó, a temperatura
ambiente, en un agitador de plataforma a 160 rpm durante una hora.
Las partículas recubiertas fueron lavadas dos veces mediante
centrifugación a 170.000xg durante 30 minutos, a una temperatura de
4ºC, suspendidas para formar una suspensión conteniendo 1% en
sólidos, y sonicada en un baño de hielo/agua durante 15 segundos. Se
añadió azida sódica para proporcionar una concentración final del
0'01%; las partículas fueron almacenadas a una temperatura de 4ºC.
Para su uso como control en algunos experimentos, las partículas
superparamagnéticas fueron recubiertas, de manera similar, con
albúmina de suero bovino (BSA).
De Polysciences Inc., Warrington, PA, se
obtuvieron partículas de látex azul de 3 \mum de diámetro. Las
partículas fueron diluidas, hasta el 0'1% en sólidos, en tampón MOPS
20mM conteniendo ClNa 0'1M (MOPS-ClNa). Se lavaron
las partículas una vez por centrifugación a 17.000xg durante 30
minutos, a una temperatura de 4ºC, y se suspendieron en tampón
hasta una concentración del 0'4% en sólidos. Se ajustó IgG de cabra
purificado por afinidad, reactivo con la subunidad beta de hCG, a
una concentración de 250 \mug/ml en tampón
MOPS-ClNa. Se mezclaron volúmenes iguales de
partículas de látex y solución de anticuerpo, y se agitaron en un
agitador de plataforma a 160 rpm durante una hora, a temperatura
ambiente. Las partículas de látex recubiertas fueron lavadas dos
veces y suspendidas en tampón hasta una concentración del 0'4% en
sólidos, en tampón MOPS-ClNa conteniendo azida
sódica. Para su uso como control, las partículas de látex fueron
recubiertas con BSA mediante el mismo procedimiento. Todas las
partículas recubiertas se almacenaron a 4ºC.
Se aplicó un ensayo con 10 muestras de orina de
mujeres embarazadas, y con 10 muestras de mujeres que no estaban
embarazadas. Las muestras codificadas fueron aplicadas en un
experimento ciego. Junto con las muestras clínicas, se ensayaron
controles positivos conteniendo \beta-hCG a una
concentración de 64 ng/ml y controles negativos.
Independientemente, todas las muestras se evaluaron en el ensayo
Abbott Test-Pack Plus para confirmar la presencia o
ausencia de b-hCG en cantidades coherentes con el
embarazo.
Se realizó el ensayo mezclando: (a) 30 \mul de
partículas de látex azul de 3 \mum recubiertas con IgG, las
cuales habían sido diluidas al 0'2% en sólidos en tampón
MOPS-ClNa conteniendo 1'0 mg de albúmina de suero
bovino por ml (MOPS-ClNa-BSA); (b)
10 \mul de partículas magnéticas recubiertas con anticuerpo
monoclonal al 0'0066% en sólidos en
MOPS-ClNa-BSA; y (c) 40 \mul de
muestra de orina no diluida. Se dejó que la mezcla permaneciese a
temperatura ambiente durante 15 minutos, después del cual periodo se
salpicaron 15 \mul sobre cinta de Teflón cubriendo la tira
magnética de la placa base magnética descrita en el Ejemplo 5 y
representada en la Fig 25. Se puso un cubreobjetos de vidrio sobre
dos soportes de 0'5 mm de espesor en cualquiera de los lados de la
cinta de Teflón® para crear una cámara de reacción teniendo una
superficie de inspección ópticamente plana (ver Fig 15A y 15B). Se
registraron los resultados después de 5 minutos y 10 minutos.
Cuando se realizó el ensayo con las 10 muestras positivas y el
control positivo, se observó una colección de partículas azules
ajustándose en forma al campo magnético. Por contraste, las
partículas azules permanecieron dispersadas homogéneamente cuando
se ensayaron las muestras negativas y el control negativo. Los
resultados obtenidos con el ensayo Test-Pack Plus
eran conformes con los del ensayo de la invención.
Se desarrolló un ensayo autoejecutable para
fibrina soluble en plasma humano. El ensayo estaba basado en la
velocidad de cambio de la densidad óptica de una suspensión de
látex-polipirrol recubierto con un miembro de unión
específica y ferrofluido recubierto con un miembro de unión
específica, bajo la influencia de un campo magnético aplicado. En
Abbott Laboratories se produjo látex-polipirrol (0'2
\mum de diámetro, 2% en sólidos) (ver Ejemplo 2). De American
Biogenetic Sciences (Boston, MA) se obtuvieron un primer anticuerpo
teniendo afinidad de unión para un epítopo en fibrina soluble
humana, y un segundo anticuerpo teniendo afinidad de unión por un
epítopo diferente en fibrina soluble humana. Se mezcló una alícuota
del primer anticuerpo (125 \mul, 5'58 mg/ml) con tampón borato
0'1M (187 \mul, pH 10'0), surfactante "BRIJ® 35" al 1% (375
\mul), látex-polipirrol (1'87 ml) y agua (1'2
ml). Después de que la mezcla hubiese sido incubada con balanceo
durante dos horas a temperatura ambiente, se añadieron 1'25 ml de
albúmina de suero bovino al 4% en tampón Bis-Tris
0'25M (pH 7'0) y 555 \mul de ácido periódico 0'3M en
trietanolamina 0'5M, y la mezcla resultante se incubó durante dos
horas adicionales a temperatura ambiente. Después, la mezcla circuló
a través de un aparato de diafiltración "MICROGON®" para
intercambiar la porción líquida de la muestra con tampón
MOPS-etanolamina 25mM (pH 7'2) conteniendo 0'5% de
albúmina de suero bovino y 0'1% de surfactante "BRIJ® 35". El
látex-polipirrol recubierto con anticuerpo se
almacenó en esta solución. Para diluir el estándar de fibrina
soluble y la solución madre de polipirrol se utilizó una solución
diluyente conteniendo 0'5% de albúmina de suero bovino, 5% de
sacarosa, 0'1% de surfactante "Tween 20®" y 0'05% de
conservante "PROCLIN" en salino tampo-
nado con fosfato. Para su uso en el ensayo, la suspensión madre de polipirrol fue diluida veinte veces con diluyente.
nado con fosfato. Para su uso en el ensayo, la suspensión madre de polipirrol fue diluida veinte veces con diluyente.
Se diluyó una alícuota (250 \mul) del
ferrofluido, descrito en el Ejemplo 2, hasta una concentración del
3% en sólidos en carbonato sódico 0'05M (pH 9'1), y se mezcló con
una solución del segundo anticuerpo (2 \mul, 14'7 \mug/ml).
Después de que la mezcla se incubase a 37ºC durante una hora, se
añadió 1% de albúmina de suero bovino (110 \mul), y se incubó la
mezcla resultante durante 45 minutos adicionales a 37ºC. Luego, se
aplicó la mezcla a una columna de 1 cm x 40 cm, rellena con medio de
permeación en gel "SEPHACRYL® S-300", y
equilibrada con salino tamponado con fosfato conteniendo 0'1% de
albúmina de suero bovino. La columna fue eluida con el mismo tampón,
y se recuperó el material excluido en 3 ml.
Se preparó la mezcla de reactivo de ensayo
mezclando 1 ml de la suspensión diluida de polipirrol recubierto con
anticuerpo con 100 \mul de la suspensión de ferrofluido recubierto
con anticuerpo.
Se prepararon estándares de ensayo a partir de
fibrina soluble humana (obtenida de American Biogenetic Sciences)
diluida a diferentes concentraciones con la solución diluyente.
Para determinar la densidad óptica de la mezcla
de ensayo, se utilizó un espectrofotómetro Cary 3. De Wilmad Glass
Inc., se obtuvo una cubeta para fluorómetro de 5 mm de diámetro
interior x 30 mm. Dentro del agujero roscado en el fondo del
soporte para cubetas del espectrofotómetro se atornilló un tornillo
de cabeza hexagonal y, en la parte superior de él, se puso un imán
de neodimio-hierro-boro de 0'25
pulgadas (6'35 mm) x 0'25 (6'35 mm). Después, se ajustó la posición
del imán en el soporte para cubetas, girando la cabeza del tornillo
hasta que el imán empezase a bloquear la porción inferior del haz de
luz a través del soporte para cubetas (como se juzgó por una
disminución en la densidad óptica aparente reportada por el
instrumento). La porción superior e inferior del haz de luz fue
bloqueada por tiras horizontales de cinta eléctrica hasta que quedó
una abertura vertical de 3 mm, la parte inferior de la cual se
alineó con el piso interior de la celda del fluorómetro cuando se
insertó en el soporte para cubetas hasta que descansase sobre la
parte superior del imán. El soporte para cubetas de referencia fue
bloqueado de manera similar. Se puso el instrumento a cero antes de
que empezase el ensayo.
El ensayo se realizó mezclando en primer lugar
50 \mul de la mezcla de reactivo de ensayo con 50 \mul de la
mezcla de ensayo, y transfiriendo después la mezcla resultante a la
cubeta. Después, se insertó la cubeta dentro del soporte para
cubetas hasta que su parte inferior descansase sobre el imán, y
empezó inmediatamente la recogida continua de datos de densidad
óptica por el espectrofotómetro. La velocidad de eliminación del
látex-polipirrol de la solución mediante captura
magnética se reflejó en la velocidad de cambio de la densidad
óptica de la suspensión. El diagrama de la velocidad de cambio de la
densidad óptica en la mezcla de ensayo, en función de la
concentración de fibrina soluble en la muestra de ensayo, muestra
una relación lineal (ver Fig 27).
Claims (7)
1. Un método para determinar la presencia o
cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método
comprendiendo las etapas de:
(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo
con un reactivo de partículas en fase sólida móvil y con un reactivo
magnéticamente sensible para formar una mezcla de reacción, dicho
analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de
partículas en fase sólida móvil y a dicho reactivo magnéticamente
sensible para formar un complejo constando de dicho reactivo de
partículas en fase sólida móvil, una pluralidad de dichos reactivos
magnéticamente sensibles y dicho analito;
(2) someter dicha mezcla de reacción a un campo
magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dicho
complejo si dicho complejo está presente en dicha mezcla de
reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando
manifestada por el movimiento o captura de dicho complejo a una
velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente
sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase
sólida móvil solo; y
(3) medir directa o indirectamente el grado de
dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza que
actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no
unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la
captura magnética de dicho complejo utilizando un dispositivo visual
o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente
sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida móvil
son separados del complejo por movimiento en un canal capilar, (iv)
las perturbaciones de un campo magnético, (v) la variación en la
densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi) ópticamente, el
cambio en la reflexividad de una superficie ópticamente reflectante
sobre la que dichos complejos han sido capturados magnéticamente,
(viii) un cambio en el peso aparente, (ix) un cambio en la masa
aparente, (x) un movimiento, o (xi) un cambio en la cantidad de
esfuerzo, para proporcionar una medida de la presencia o cantidad de
dicho analito en dicha muestra de ensayo.
2. Un método para determinar la presencia o
cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método
comprendiendo las etapas de:
(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo
con un reactivo magnéticamente sensible y un reactivo de partículas
en fase sólida móvil para formar una mezcla de reacción, dicho
analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo
magnéticamente sensible para formar un primer complejo constando de
dicho analito y de dicho reactivo magnéticamente sensible, y dicho
reactivo magnéticamente sensible siendo capaz de unirse
específicamente a dicho reactivo de partículas en fase sólida móvil
para formar un segundo complejo constando de una pluralidad de
dichos reactivos magnéticamente sensibles y de dicho reactivo de
partículas en fase sólida móvil;
(2) someter dicha mezcla de reacción a un campo
magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dichos
complejos si cualquiera de dichos complejos está presente en dicha
mezcla de reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando
manifestada por el movimiento o captura de dicho segundo complejo a
una velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente
sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase
sólida móvil solo o dicho primer complejo; y
(3) medir directa o indirectamente el grado de
dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza que
actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no
unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la
captura magnética de dicho segundo complejo utilizando un
dispositivo visual o un dispositivo óptico, en donde el reactivo
magnéticamente sensible no unido y/o el reactivo de partículas en
fase sólida móvil son separados del complejo por movimiento en un
canal capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la
variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi)
ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie
ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido
capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente,
(ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un
cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de
la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de
ensayo.
3. Un método para determinar la presencia o
cantidad de un analito en una muestra de ensayo, dicho método
comprendiendo las etapas de:
(1) poner en contacto dicha muestra de ensayo
con un reactivo magnéticamente sensible y un reactivo de partículas
en fase sólida móvil para formar una mezcla de reacción, dicho
analito siendo capaz de unirse específicamente a dicho reactivo de
partículas en fase sólida móvil para formar un primer complejo
constando de dicho analito y de dicho reactivo de partículas en fase
sólida móvil, y dicho reactivo magnéticamente sensible siendo capaz
de unirse específicamente a dicho reactivo de partículas en fase
sólida móvil para formar un segundo complejo constando de una
pluralidad de dichos reactivos magnéticamente sensibles y de dicho
reactivo de partículas en fase sólida móvil;
(2) someter dicha mezcla de reacción a un campo
magnético de manera que se ejerza una fuerza magnética sobre dichos
complejos si cualquiera de dichos complejos está presente en dicha
mezcla de reacción, la influencia de dicha fuerza magnética estando
manifestada por el movimiento o captura de dicho segundo complejo a
una velocidad más rápida que la de dicho reactivo magnéticamente
sensible solo, o que la de dicho reactivo de partículas en fase
sólida móvil solo o dicho primer complejo; y
(3) medir directa o indirectamente el grado de
dicha manifestación midiendo (i) un cambio aparente en la fuerza que
actúa sobre dichos reactivos, (ii) la separación de reactivos no
unidos de los complejos utilizando un dispositivo visual, (iii) la
captura magnética de dicho complejo utilizando un dispositivo visual
o un dispositivo óptico, en donde el reactivo magnéticamente
sensible no unido y/o el reactivo de partículas en fase sólida móvil
son separados del segundo complejo por movimiento en un canal
capilar, (iv) las perturbaciones de un campo magnético, (v) la
variación en la densidad óptica de la mezcla de reacción, (vi)
ópticamente, el cambio en la reflexividad de una superficie
ópticamente reflectante sobre la que dichos complejos han sido
capturados magnéticamente, (viii) un cambio en el peso aparente,
(ix) un cambio en la masa aparente, (x) un movimiento, o (xi) un
cambio en la cantidad de esfuerzo, para proporcionar una medida de
la presencia o cantidad de dicho analito en dicha muestra de
ensayo.
4. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en donde dicha muestra de
ensayo es puesta secuencialmente en contacto con dicha partícula en
fase sólida móvil y dicho reactivo magnéticamente sensible.
5. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en donde dicha muestra de
ensayo es puesta simultáneamente en contacto con dicha partícula en
fase sólida móvil y dicho reactivo magnéticamente sensible.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la
partícula en fase sólida móvil es un reactivo magnéticamente
sensible.
7. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en donde se utiliza una
balanza para detectar dicho cambio de peso aparente.
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