JPH08304399A

JPH08304399A - 磁性体粒子の分離方法およびそれを用いた免疫分析方法

Info

Publication number: JPH08304399A
Application number: JP12974895A
Authority: JP
Inventors: Takaaki Munebayashi; 孝明宗林; Masanobu Sawai; 政信澤井
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1995-04-28
Filing date: 1995-04-28
Publication date: 1996-11-22

Abstract

(57)【要約】【目的】ＦＩＡ，ＥＩＡ，ＬＩＡ，ＲＩＡ等の免疫分
析の分野においてＢ／Ｆ分離を容易にするために、迅速
かつ簡便な磁性体粒子の分離方法を提供する。【構成】試料液中の免疫学的に活性な第１物質を、該
第１物質に対して免疫学的に活性な第２物質を固定化し
た磁性体粒子と反応させた後、少なくとも一部が磁化さ
れているかまたは磁化可能な物質で構成され、かつ少な
くとも一方向に対して連続した空隙を有する分離体と接
触させ、該分離体表面にて第１物質及び第２物質からな
る反応物を含有する磁性体粒子を捕集する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、磁性体粒子の分離方法
およびそれを用いた免疫分析方法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
抗原抗体反応を利用した免疫測定方法が種々の疾病の早
期検出法や、極微量の物質の検出法として知られてい
る。高感度な免疫測定法には種々の方法があり、放射性
同位体（ＲＩ）、酵素、蛍光物質、発光物質などを各々
標識物質として結合させた抗体または抗原を用いるラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（Ｅ
ＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、発光イムノア
ッセイ（ＬＩＡ）などに分類される。また、ラテックス
等の不溶性担体粒子に担持された抗体または抗原と、そ
れに対応する抗原または抗体とを反応させ、その反応に
伴う反応混合物の透過光の変化から抗原抗体反応の速度
を測定する方法（ＬＰＩＡ）が知られている。

【０００３】しかし、かかる従来技術においては種々の
問題がある。たとえば、ＲＩＡはＲＩの取扱いおよび廃
棄に対する制約がある。ＬＰＩＡは簡便性、操作性など
に優れた方法であるが、検出速度の改良が望まれてい
る。

【０００４】ＥＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡなどは取扱いの安
全性については有利であるが、検出感度はＲＩＡに若干
劣る。また、ＥＩＡは酵素反応を伴うため取扱いもＦＩ
Ａほど簡便ではない。

【０００５】また、ＥＩＡ，ＦＩＡ，ＬＩＡなどの方法
は、通常、反応結合物と未反応物を分離、洗浄する操作
（Ｂ／Ｆ分離）を必要とする。Ｂ／Ｆ分離は、通常、チ
ューブ、マイクロタイターウェルなどの反応容器から、
未反応物を含む反応液を廃棄した後、洗浄液の供給、イ
ンキュベーション、洗浄液の廃棄という洗浄操作を数回
繰り返すことにより行われるが、このために測定操作を
煩雑にし、測定に要する時間が長くなる等の問題があ
る。

【０００６】Ｂ／Ｆ分離を比較的迅速、簡便に行うため
にメンブレン、グラスファイバーなどのフィルターを利
用した方法がある。これらは、液の流れる方向が一方向
であるため、廃棄時に液を反応容器から吸い出す必要が
なく、洗浄工程に必要とする時間も短くてすみ、また、
自動化など装置化しやすい特徴がある。しかしながら、
これらの方法にも、種々の問題点がある。

【０００７】フィルターに一次抗体または抗原を直接結
合させたものでは、フィルターと測定したい項目と対応
している必要があり、フィルターの保管、供給などを考
えると自動化装置を考える場合に問題がある。

【０００８】また、ラテックス等の微粒子に一次抗体ま
たは抗原を結合し、反応後、微粒子をフィルターに捕集
するタイプのものでは、フィルター上に孔径より大きい
粒子を捕集するものと、フィルターへの粒子の吸着を利
用するものがある。前者では、フィルターが目詰まりす
ることにより二次抗体などの標識物が完全に洗浄しきれ
なくて、バックグラウンドの上昇を生じる可能性があ
る。また、後者では、フィルターへの吸着の原因が解明
されていないため、粒子を完全に捕集しているかどうか
の判断、また、吸着しやすい素材を用いることによるバ
ックグランドの上昇などの問題が残る。また、粒子のフ
ィルター内部への捕集を利用するため、ＥＩＡには応用
できるが、ＦＩＡの場合、励起光がフィルター内部に達
せず、蛍光もフィルター外部にとどかない可能性もあ
り、応用は難しい。同様に、ＬＩＡでも発光した光が有
効に観測されない可能性がある。

【０００９】Ｂ／Ｆ分離の改良法として、磁性粒子を用
いたものも種々報告されている。一次抗体または抗原を
磁性粒子に結合したものを用いるもので、磁石を利用す
ることにより、磁性粒子を集める操作を迅速にできる特
徴がある。しかしながら、現在実用化されているもの
は、反応容器の横または底に磁石を用いて磁性粒子を集
め、上澄み液を廃棄するタイプであり、分離の時間短縮
にはなっても、洗浄工程には従来のものに比べて特に進
歩は認められない。また、「BiO Techniques, 156-160
(1985)」の図１には磁性フィルターの概念が示されてい
るが、いまだ、実用化されたものはなく、さらに、本文
献の方法では、フィルター内部への捕集の問題が解決で
きていないため、前述したようにやはりＦＩＡ，ＬＩＡ
への応用は困難である。

【００１０】本発明は、上記観点からなされたものであ
り、ＦＩＡ，ＥＩＡ，ＬＩＡ，ＲＩＡ等の免疫分析の分
野においてＢ／Ｆ分離を容易にするために、迅速かつ簡
便な磁性体粒子の分離方法を提供することを課題とす
る。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決すべく鋭意検討した結果、磁性体粒子およびそ
れを捕集することが可能な特定の材料を用いることによ
り、迅速、簡便にＢ／Ｆ分離を行うことができ、かつ、
ＦＩＡ，ＬＩＡへの適用も可能な分離・分析手段を見出
し、本発明を完成するに至った。

【００１２】即ち本発明の要旨は、特許請求の範囲に記
載の通り、 (1) 磁性体粒子を含有してなる試料液を、少なくとも一
部が磁化されているかまたは磁化可能な物質で構成さ
れ、かつ少なくとも一方向に対して連続した空隙を有す
る分離体と接触させ、当該分離体表面にて前記試料液中
の磁性体粒子を捕集することを特徴とする、磁性体粒子
の分離方法に関する第１の発明、

【００１３】(2) 試料液中の免疫学的に活性な第１物質
を、該第１物質に対して免疫学的に活性な第２物質を固
定化した磁性体粒子と反応させ、前記反応物を、少なく
とも一部が磁化されているかまたは磁化可能な物質で構
成され、かつ少なくとも一方向に対して連続した空隙を
有する分離体と接触させ、該分離体表面にて第１物質及
び第２物質からなる反応物を含有する磁性体粒子を捕集
することを含む免疫分析方法関する第２の発明、

【００１４】(3) 試料液中の免疫学的に活性な第１物質
を、該第１物質に対して免疫学的に活性な第２物質を固
定化した磁性体粒子と反応させ、前記反応物を、少なく
とも一部が磁化されているかまたは磁化可能な物質で構
成され、かつ少なくとも一方向に対して連続した空隙を
有する分離体と接触させ、該分離体表面にて第１物質及
び第２物質からなる反応物を含有する磁性体粒子を捕集
し、試料液中の未反応の第１物質、または分離体に捕集
された第１物質を定性的または定量的に測定することを
含む免疫分析方法に関する第３の発明、および

【００１５】(4) 試料液中の免疫学的に活性な第１物質
と、該第１物質に対して免疫学的に活性な第２物質を固
定化した磁性体粒子と、該第１物質に対して免疫学的に
活性な第３物質を担持した標識性物質とを反応させ、前
記反応物を、少なくとも一部が磁化されているかまたは
磁化可能な物質で構成され、かつ少なくとも一方向に対
して連続した空隙を有する分離体と接触させ、該分離体
表面にて第１物質、第２物質及び標識性物質に担持され
た第３物質からなる反応物を含有する磁性体粒子を捕集
し、分離体に捕集された標識性物質の標識強度を測定す
ることを含む免疫分析方法に関する第４の発明を含む。

【００１６】以下、本発明につき詳細に説明する。

【００１７】＜１＞磁性体粒子本発明に使用される磁性体粒子は、例えば、抗原あるい
は抗体のような免疫学的に活性な物質同士の結合物を試
料液から分離（Ｂ／Ｆ分離）するための担体となるもの
である。この磁性体粒子は、磁性体のみからなる粒子で
あってもよいが、磁性体を内部に含んだポリスチレン、
ジビニルベンゼンなどからなるラテックス粒子ゼラチン
粒子あるいはリポソーム、または、磁性体をラテックス
粒子、ゼラチン粒子、リポソームなどの表面に固定化し
たものなどが特に好ましい形態として用いられる。

【００１８】磁性体としては、磁気誘導により容易に磁
化され得るものであれば特に制限はされず、例えば、
鉄、マンガン、ニッケル、コバルト及びクロムなどの金
属またはこれらの合金、四三酸化鉄（Fe₃O₄）、三二酸
化鉄（γ−Fe₂O₃）等の金属酸化物、各種フェライト等
の金属塩、フェライト型あるいはマルテンサイト型ステ
ンレス、アモルファス合金、シリコン鉄軟磁性結晶等が
挙げられる。

【００１９】かかる磁性体粒子は、好ましくは、粒径
０．０５〜１０μｍであることが望ましく、より好まし
くは粒径０．１〜２μｍであることが望ましい。

【００２０】＜２＞分離体は、磁気により磁性体粒子を
捕集するためのものであり、フェライト磁石や、サマリ
ウム−コバルト、ネオジムなどの希土磁石などの永久磁
石、さらには上記の磁性体粒子に用いられるのと同様の
磁性体により形成される。本願においては、分離体はか
かる素材を含んでさえいれば良く、分離体全体にわたっ
て当該素材で構成されていても、あるいは当該素材を部
分的に含有する合成樹脂等で構成されていても構わな
い。分離体が、磁気を帯びていない磁性体によって形成
される場合には、外部磁場を与えることにより帯磁さ
せ、それによって磁性体粒子を捕集することができる。

【００２１】分離体は、磁性体粒子を含有する試料液か
ら磁性体粒子を分離するという目的上、試料液を分離体
表面に接触、好ましくは分離体を通過させながら磁性体
粒子の捕集を行わせるために、少くとも一方向に対して
連続した空隙を有していることが必要である。分離体に
より磁性体粒子を捕集させる際に、分離体の内部よりも
表面に捕集できるようにすることは、後述の免疫反応の
標識物質を蛍光色素または発光色素にした場合、重要で
ある。本発明では、この要件を満足させるために、分離
体の表面に磁極が生じるような分離体の形状や、外部磁
場の与え方について鋭意検討した。その結果、分離体の
形状としては、液が通過できるように穴をあけた金属
板、棒状の金属、ワイヤーを束ねたもの（図２）、コイ
ル状に巻いたテープ（図４及び図５）、金属繊維の束
（図８）、金属ファイバーを織ったものや不織布状に固
めたものが、また、外部磁場の与え方としては、２つの
磁石を分離体の周囲に、分離体の空隙の方向と平行、か
つ、磁極の向きを一致させて、分離体を挟むようにして
配置する方法が好ましいものとして挙げられる（図
３）。分離体の端部で磁性体粒子を多く捕集するよう
に、端部の磁束密度を高くするためには、端部にエッジ
を多く含むような形状が分離体には好適であり、上記し
た中では、ワイヤーを束ねたもの、コイル状に巻いたテ
ープなどが特に好適な形状である。また、円筒状の磁性
フィルターの下部に、ドーナツ状の磁石を配置すると、
磁性フィルターと外部磁場を与える磁石を一体化するこ
とがで、自動化装置に組み込む際により有利な形状とな
り、さらに分離体表面に磁極を生じさせることができ
る。

【００２２】また、磁石からなる分離体の場合には、例
えば、４本の棒磁石を束ね、対向する２つの磁石の磁極
が同一方向を向き、他の２つの磁石が前記方向に対して
逆方向となるように束ねたもの（図１１）が、好ましい
ものとして挙げられる。しかしながら、分離体の表面で
効果的に磁性体粒子を捕集することができれば、分離体
の形状や外部磁場の与え方は上記のものに限定されな
い。

【００２３】分離体を試料液に浸漬し、あるいは試料液
を分離体に染み込ませることによって、試料液中の磁性
体粒子を分離体表面で捕集することもできるが、分離体
を例えば円筒状の保持容器（図１）に詰め、この保持容
器に試料液を通液することにより、簡便かつ効果的に分
離体と試料液を接触させることができる。このような保
持容器の材料としては、合成樹脂など、強磁性体でなけ
ればいずれのものでも使用できるが、より好ましくは分
離・分析する磁性体粒子およびその反応物を吸着しない
素材を選ぶのが望ましい。以下、本明細書において、保
持容器に詰めた分離体を「磁性フィルター」ということ
がある。

【００２４】試料液を、適度な速度で分離体に接触、通
過させ、さらに、分離体上に磁性体粒子を捕集した後、
必要に応じて洗浄することが望まれるため、分離体内に
適度な間隙を保つことが必要となる。上記のワイヤーを
束ねたものやコイル状に巻いたテープの場合は、ワイヤ
ーの直径、テープの巻数などで調節できる。さらに、吸
着の少ない、磁化しない他のスペーサー材を共存させる
ことによる、試料液と分離体との接触、通過速度の調節
も可能である。

【００２５】さらに、試料液あるいは洗浄液を分離体を
通過させるために、吸引または加圧してもよいが、分離
体の下部、即ち、液が流出する側の分離体面に吸収材を
置き、これに吸水させることによっても試料液あるいは
洗浄液を分離体を通過させることができる。このような
吸水材を用いることで、吸引、加圧などの操作、廃液ボ
トルの設置等が不要となり、自動化された磁性体分離装
置を設計しやすくなる。なお、吸水材としては、アセテ
ート繊維（ダイセル化学工業社製）、無灰パルプ（アド
バンテック社製）などが挙げられる。

【００２６】＜３＞本発明の磁性体粒子の分離方法。上記の分離体に、磁性体粒子を含有してなる試料液を接
触させ、分離体表面にて前記試料液中の磁性体粒子を捕
集することにより、磁性体粒子を分離することができ
る。

【００２７】免疫学的に活性な第１物質を含む試料液
と、この第１物質に対して免疫学的に活性な第２物質を
固定化した磁性体粒子とを反応させ、この磁性体粒子を
上記の方法によって分離することにより、免疫反応によ
る第１物質と第２物質との結合を介して、第２物質を分
離することができる。ここで、試料液に残存する未反応
の第１物質または分離体に捕集された第１物質を定性的
または定量的に測定することにより、試料中の第１物質
を測定することができる。

【００２８】前記第１物質を含む試料液と、前記第２物
質を固定化した磁性体粒子とを反応させた後、さらにこ
の反応物と、前記第１物質に対して免疫学的に活性な第
３物質を担持させた標識性物質とを反応させ、磁性体粒
子を前記方法により分離し、免疫反応による第１物質と
第２物質との結合及び第２物質と第３物質との結合を介
して分離体に捕集された標識性物質物の標識強度を測定
することにより、第１物質を測定することができる。

【００２９】「免疫学的に活性な物質」とは、ヒトを含
む動物の生体内において、免疫反応を惹起するいかなる
物質をも意味する。好ましくは、抗体および抗原が挙げ
られる。抗体としては、通常ＩｇＧが用いられるが、Ｉ
ｇＧを、ペプシン、パパインなどのタンパク消化酵素あ
るいはジチオスレイトール、メルカプトエタノールなど
の還元剤を用いて、Ｆ（ａｂ’）₂ 、Ｆａｂ、Ｆａｂ’
などに低分子化して得られるフラグメントを用いても良
い。また、ＩｇＧだけでなくＩｇＭ、ＩｇＡあるいはこ
れらをＩｇＧと同様の処理により低分子化したフラグメ
ントを用いても良い。

【００３０】また、抗体としては、ポリクローナル抗
体、モノクローナル抗体のいずれも適用できる。モノク
ローナル抗体の適用において、免疫反応としてサンドイ
ッチ法を用いる場合には、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の
ように、繰り返し構造を持つタンパク質や、ＣＡ１９−
９抗原のように、分子内に同じエピトープを複数持つ抗
原に対しては、モノクローナル抗体は１種又はそれ以上
で使用できる。また、同じエピトープを複数持たない抗
原に対しても、異なるエピトープを２つ以上有する場合
には、各々のエピトープを認識する２種以上のモノクロ
ーナル抗体、又はモノクローナル抗体とポリクローナル
抗体を組み合わせて使用すれば適用できる。

【００３１】一方、抗原としては、たとえばタンパク
質、ポリペプチド、ステロイド、多糖類、脂質、花粉、
遺伝子工学的に産出された組換えタンパク質、薬物など
種々のものが挙げられる。

【００３２】磁性体粒子に免疫学的に活性な物質を固定
化する方法は、既に多くの方法が提案されている。たと
えば、磁性体粒子に対し固定化したい物質を物理的に吸
着させる方法、カルボジイミドなどのカップリング剤に
よって化学的に変性させた後に化学結合させる方法、ま
た、スペーサー分子をはさんで結合させることもよく知
られている。抗体を固定化した上に抗原を結合させて抗
原固定化磁性体粒子とすることもできる。また、アルブ
ミンなどの他のタンパク質に化学結合法を用いて結合さ
せた後、そのタンパク質を磁性体粒子に物理的、化学的
に固定化する方法などがある。

【００３３】本発明の免疫分析方法としては、試料液中
の免疫学的に活性な第１物質を、当該第１物質に対して
免疫学的に活性な第２物質を固定化した磁性体粒子と反
応させる場合に加え、試料液中に第１物質に対して免疫
学的に活性な第３物質を共存させ、当該第３物質，第１
物質および磁性体粒子上の第２物質を反応させる場合も
含まれる。

【００３４】前者の場合を、例えば、磁性体粒子を一次
抗体（モノクローナル抗体）を固定化して試料液中の抗
原を検出する方法を挙げて説明する。即ち、試料液中の
抗原を、一次抗体を固定化した磁性体粒子と反応させた
後上記分離体と接触させ、該分離体上に磁性体粒子−一
次抗体−抗原から成る反応物及び未反応の磁性体粒子を
捕集する。次いで、例えば特開平１−１９３６４７号公
報に記載の方法で未反応の試料液中の抗原を、また、例
えば特開昭６０−１７７２６５号公報に記載の方法で分
離体上に捕集された磁性体粒子−一次抗体−抗原を定性
的または定量的に測定する。

【００３５】後者の場合は、例えば、磁性体粒子に一次
抗体（モノクローナル抗体）を固定化して試料液中の抗
原を検出する際に、さらに二次抗体として蛍光性物質、
化学発光性物質、酵素等で標識した別のエピトープを認
識するモノクローナル抗体を用い、磁性体粒子−抗原−
二次抗体のサンドイッチ型の反応結合物を形成し、上記
分離体を用いて磁力により分離体上に反応結合物を捕集
し、未反応の標識二次抗体を洗浄除去した後、分離体上
の蛍光強度、化学発光強度あるいは酵素活性を計測する
方法がある。また、このとき、二次抗体をたとえばウサ
ギポリクローナル抗体にしておき、三次抗体として標識
抗ウサギＩｇＧ（モノクローナル抗体、ポリクローナル
抗体共に使用可）を使用する系とすることもできる。標
識抗体としてビオチン標識化抗体を用い、これに蛍光性
物質、化学発光性物質、酵素等を結合したストレプトア
ビジンを結合させた後、蛍光強度、発光強度あるいは酵
素活性を計測してもよい。さらに、標識抗体のかわり
に、標識した微粒子（ラテックス、ゼラチン、リボソー
ムなど）に二次抗体を固定化しておき、磁性体粒子と抗
原に対しサンドイッチ型の反応をさせることも可能であ
る。酵素活性は、酵素反応により発色する色素基質を用
いると容易に測定することができる。

【００３６】同様にして、抗原を磁性体粒子に固定化し
たり、蛍光性物質や化学発光性物質で標識することによ
り抗体を検出する反応系をつくることができる。さらに
ハプテンなどの低分子抗原に対しては、阻害法を用いる
ことによって測定することができる。たとえば、一定量
の薬物などを固定化した磁性体粒子と、一定量の標識し
た薬物とを、該薬物に対する一定量の抗体と反応させる
場合に、試料液中の該薬物濃度が高いほど、磁性体粒子
−抗体−標識薬物の反応結合物を形成する反応が阻害さ
れるために、捕集された磁性体粒子に結合する標識物質
の量は減少することになる。この減少量から試料液中の
薬物濃度が求められる。

【００３７】あるいは、抗原固定化磁性体粒子と標識抗
体との反応を、試料液中の抗原や抗体で阻害することに
よって測定するも可能である。免疫学的に活性な物質
に、標識性物質、好ましくは蛍光色素、化学発光性物質
または酵素を標識する方法としては種々の方法が知られ
ている。好ましくは、抗体または抗原分子と標識性物質
を直接に、あるいは適当なスペーサー分子を介して化学
的に結合する方法がとられる。

【００３８】本発明において、免疫学的に活性な物質を
直接標識する代わりに、ラテックス等の第２の粒子に免
疫学的に活性な物質および標識物質を各々結合させたも
のも使用することもできる。このとき、蛍光性物質、化
学発光性物質、酵素等の標識性物質で前記粒子を標識す
る方法には、化学的に結合させる方法、粒子を重合によ
り作成する際に標識性物質を加えて粒子内部に閉じ込め
る方法、あらかじめ、タンパク質、ペプチド等の免疫学
的に活性な物質と標識性物質を結合させておいてからそ
のタンパク質、ペプチド等を粒子に担持させる方法があ
る。たとえば、特開昭５４−１０１４３９号公報には、
希土類キレートをＴＯＰＯ（トリ−ｎ−オクチルホスフ
ィンオキシド）との協同抽出法を利用して有機高分子の
ラテックスの内部に閉じ込める方法が述べられている。
これに従って作成した蛍光標識粒子は標識強度、安定性
共に良好なものが得られる。

【００３９】上記の第２の粒子の標識に用いられる蛍光
性物質としては、ユーロピウム、サマリウム、テルビウ
ムなどの希土類キレートや、フィコシアニン、フィコエ
リスリンなどのフィコビリプロテイン、フルオレセイ
ン、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、７−ア
ミノ−４−メチルクマリンなどが挙げられ、化学発光性
物質としては、アクリジニウム誘導体、イソルミノール
などが挙げることができる。

【００４０】標識物質として酵素を用いた場合は、酵素
にアルカリホスファターゼを用い、４−メチルウンベリ
フェリルリン酸の脱リン酸化により生じる蛍光、または
ＡＭＰＰＤ（3-(2'-spiroadawantane)-4-methoxy-4-(3"
-phosphoryloxy)phenyl-1.2-dioxetane）の脱リン酸化
により生じる化学発光を測定する方法や、酵素にペルオ
キシターゼを用い、ルミノールの酸化により生じる化学
発光を測定する方法などが挙げられる。

【００４１】第１物質と第２物質を固定化した磁性体粒
子の反応、第１物質と磁性体粒子との結合物と第３物質
との反応、あるいは結合物の洗浄等は、通常の免疫測定
法と同様にして行うことができる。例えば、結合反応に
用いる緩衝液にはトリス緩衝液、リン酸緩衝液等が挙げ
られ、洗浄液としては、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００などの界面活性剤を含んだトリス緩衝液、リ
ン酸緩衝液などが挙げられる。

【００４２】

【実施例】以下、実施例に基づいて、本発明をより具体
的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り、実
施例に限定されるものではない。

【００４３】

【実施例１】スチールワイヤーの束からなる分離体１
を、円筒形のジュラコン（ポリアセタール）製の保持容
器２（外径６．５ｍｍ、内径２．５ｍｍ、高さ５ｍｍ）
の内部に、ワイヤーの束の方向と保持容器の筒の方向と
が一致するように挿入して、磁性フィルター３を作製し
た（図１及び２）。この磁性フィルター外部に、図３に
示すように、磁性フィルターの芯方向に平行に、かつ、
磁極が同方向となるように一対のネオジム磁石４を配置
し、分離体表面に磁極が生じるように外部磁場を与え
た。

【００４４】一方、磁性粒子は次のようにして調製し
た。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）をウサギに免疫し
て、抗ＨＢｓＡｇ抗血清を得た。この抗血清をペプシン
処理し、ゲルろ過クロマトグラフィーにより精製し、抗
ＨＢｓＡｇＦ（ａｂ’）₂を得た。平均粒径１．０９
μｍの磁性体含有ポリスチレンラテックス粒子（ローヌ
・プーラン社製。以下、「Ｍｇラテックス粒子」と略
す）に、前記の抗ＨＢｓＡｇＦ（ａｂ’）₂ を吸着さ
せ、その後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で粒子表面を
コートし、粒子を安定化させた。

【００４５】上記磁性フィルターを、Ｔｗｅｅｎ２０及
び食塩を含むトリス緩衝液（ＴＴＢＳ）で洗浄した後、
抗体固定化Ｍｇラテックス粒子をＢＳＡ含有トリス緩衝
液で０．００５％に希釈したものをエッペンピペット
（エッペンドルフ社製）で３００μｌ添加して、Ｍｇラ
テックス粒子の捕集を行った。

【００４６】磁性フィルターをＴＴＢＳで洗浄後、走査
型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（Ｓ−２３００日立製作所
（株）製）により、分離体表面像を観察した。結果を図
１４に、またその拡大図を図１５に示した。スチールワ
イヤーのエッジ部に強く粒子が捕集されていることがわ
かる。

【００４７】

【実施例２】コイル状に巻いたアモルファス金属テープ
（新日本製鐵（株）製）からなる分離体１（図４）を、
円筒形のジュラコン（ポリアセタール）製の保持容器２
（外径６．５ｍｍ、内径２．５ｍｍ、高さ５ｍｍ）の内
部に、コイルの芯の方向と筒の方向とが一致するように
挿入して、磁性フィルター３を作製した（図５）。この
磁性フィルター外部に、図３に示すように、磁性フィル
ターの芯方向に平行に、かつ、磁極が同方向となるよう
に一対のネオジム磁石４を配置し、分離体表面に磁極が
生じるように外部磁場を与えた。

【００４８】上記磁性フィルターをＴｗｅｅｎ２０及び
食塩を含むトリス緩衝液（ＴＴＢＳ）で洗浄した後、実
施例１で作製した抗体固定化Ｍｇラテックス粒子をＢＳ
Ａ含有トリス緩衝液で０．００５％に希釈したものをエ
ッペンピペット（エッペンドルフ社製）で３００μｌ添
加して、Ｍｇラテックス粒子の捕集を行った。

【００４９】磁性フィルターをＴＴＢＳで洗浄後、ＳＥ
Ｍ（Ｓ−２３００日立製作所（株）製）により、分離
体表面像を観察した。結果を図１６に、またその拡大図
を図１７に示した。アモルファス金属テープのエッジ部
に強く粒子が捕集されていることがわかる。

【００５０】

【実施例３】スチールウールの束からなる分離体１を、
円筒形のアクリル製の保持容器２（外径６．５ｍｍ、内
径２．５ｍｍ、高さ５ｍｍ）の内部に、束の方向と筒の
方向とが一致するように充填して、磁性フィルター３を
作製した（図６）。この磁性フィルター外部に、図３に
示すように、磁性フィルターの芯方向に平行に、かつ、
磁極が同方向となるように一対のサマリウム−コバルト
Ｓｍ−Ｃｏ磁石４を配置し、分離体表面に磁極が生じる
ように外部磁場を与えた。

【００５１】実施例１と同じＭｇラテックス粒子に、免
疫学的に活性な第１物質として甲状腺刺激ホルモン（Ｔ
ＳＨ）のβ−サブユニットに対するモノクローナル抗体
（マウスＩｇＧ，錦商事から購入）を吸着させた後、牛
血清アルブミン（ＢＳＡ）で粒子をコートすることによ
り粒子を安定化させ、磁性体粒子を得た。

【００５２】希土類キレート化合物であるＥｕ−ＴＴＡ
（ユーロピウム−テノイルトリフルオロアセトン）化合
物１×１０^-4モルと、ＴＯＰＯ（トリ−ｎ−オクチルホ
スフィンオキシド）２×１０^-4モルをアセトン４０ｇに
溶解した後、これを、粒径０．２２μｍのポリスチレン
ラテックス粒子（Ｄｏｗ社）３ｇを水４０ｍｌに懸濁さ
せたものと混合し、エバポレーターによりアセトンを除
去することにより、ラテックス粒子にＥｕキレート化合
物をＴＯＰＯと協同抽出し、Ｅｕ標識ラテックス粒子
（以下、「Ｅｕラテックス粒子」という。）を作製し
た。

【００５３】上記Ｅｕラテックス粒子にＴＳＨのα−サ
ブユニットに対するモノクローナル抗体（マウスＩｇ
Ｇ，錦商事）を吸着させた後、ＢＳＡでコートすること
により粒子を安定化させた。

【００５４】モノクローナル抗体を固定化したＭｇラテ
ックス粒子０．０２５％懸濁液とＥｕラテックス粒子
０．００５％懸濁液を等量混合してラテックス粒子混合
試薬とした。

【００５５】ＴＳＨ（ＺＹＭＥＤ社）をトリス緩衝液で
希釈して、０、１、３、９、２７μＩＵ／ｍｌの標準液
をそれぞれ作製した。標準液１００μｌ、ＢＳＡ含有ト
リス緩衝液１００μｌ、上記ラテックス粒子混合試薬４
０μｌを加えた後撹はんし、３０分間免疫反応を行わせ
た。

【００５６】次に上記磁性フィルターを用い、上記反応
液２２０μｌをエッペンピペット（エッペンドルフ社
製）でフィルター上に加えることによりＭｇラテックス
粒子の捕集、分離を行った。

【００５７】磁性体粒子を分離した後、磁性フィルター
をＴｗｅｅｎ２０を含んだトリス緩衝液で洗浄し、Ｅｕ
キレートの６１５ｎｍの蛍光強度をＣｙｂｅｒＦｌｕｏ
ｒ６１５（ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ社）により測定し
た。結果を図７に示す。

【００５８】標準液のＴＳＨ濃度が高くなるに従って、
磁性フィルター上に捕集されたＭｇラテックス粒子と抗
原抗体反応により結合したＥｕラテックス粒子が増加し
ていることが、蛍光強度の増加からわかる。

【００５９】

【実施例４】実施例１で使用したＭｇラテックス粒子
に、抗ＡＦＰ（αフェトプロテイン）抗体（ウサギＦ
（ａｂ’）₂ 、ヤトロン社）を吸着させた後、ＢＳＡで
コートすることにより粒子を安定化させた。さらに、実
施例３で使用したＥｕラテックス粒子にも同様に、抗Ａ
ＦＰ抗体（ウサギＦ（ａｂ’）₂ ）を固定化し、ＢＳＡ
で処理した。

【００６０】抗ＡＦＰ抗体を固定化したＭｇラテックス
粒子０．０２５％懸濁液をＥｕラテックス粒子０．００
５％懸濁液を等量混合してラテックス粒子混合試薬とし
た。ＡＦＰ標準液（ダイアヤトロン社）をトリス緩衝液
で希釈して、０、０．３３、１．０、３．０、９．０、
２７．０、８１．１、２４３ｎｇ／ｍｌ標準液をそれぞ
れ作製した。

【００６１】標準液３０μｌ、ＢＳＡ含有トリス緩衝液
２００μｌ、上記ラテックス粒子混合試薬４０μｌを加
えた後撹はんし、３０分間免疫反応を行わせた。この反
応液２４０μｌを、実施例１と同様の磁性フィルターに
エッペンピペット（エッペンドルフ社製）で添加し、磁
性粒子を捕集した後、Ｔｗｅｅｎ２０を含んだトリス緩
衝液で洗浄し、Ｅｕキレートの６１５ｎｍの蛍光強度を
ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１５（ＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ
社）により測定した。結果を図８に示す。

【００６２】標準液のＡＦＰ濃度が高くなるに従って、
磁性フィルター上に捕集されたＭｇラテックス粒子と抗
原抗体反応により結合したＥｕラテックス粒子が増加し
ていることが、蛍光強度の増加からわかる。

【００６３】

【実施例５】スチールワイヤーの束からなる分離体１
を、円筒形のポリ塩化ビニル製の保持容器２（外径６．
５ｍｍ、内径２．５ｍｍ、高さ５ｍｍ）の内部に、束の
方向と筒の方向とが一致するように充填して、磁性フィ
ルター３を作製した（図９）。この磁性フィルター外部
に、図９に示すように、磁性フィルターの下部に、ドー
ナツ状のＳｍ−Ｃｏ磁石を置いた。このような配置によ
り、磁性フィルターと外部磁場を与える磁石を一体化
し、自動化装置に組み込む際により有利な形状とし、さ
らに分離体表面に磁極が生じさせることができる。

【００６４】実施例３で作製した抗ＴＳＨ抗体を固定化
したＭｇラテックス粒子と、Ｅｕラテックス粒子をそれ
ぞれ、０．０２５％、０．００５％懸濁液を等量混合し
てラテックス粒子混合試薬とした。

【００６５】ＴＳＨ（ＺＹＭＥＤ社）をトリス緩衝液で
希釈して、０、３．０、９．０、０、２７μＩＵ／ｍｌ
標準液をそれぞれ作製した。標準液１００μｌ、ＢＳＡ
含有トリス緩衝液１００μｌ、上記ラテックス粒子試薬
４０μｌを加えた後撹はんし、３０分間免疫反応を行わ
せた。

【００６６】この反応液２２０μｌを、エッペンピペッ
ト（エッペンドルフ社製）で上記磁性フィルターに添加
し、Ｍｇラテックス粒子を分離し、Ｔｗｅｅｎ２０を含
んだトリス緩衝液で洗浄した後、Ｅｕキレートの６１５
ｎｍの蛍光強度をＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１５（ｃｙｂ
ｅｒＦｌｕｏｒ社）により測定した。結果を図１０に
示す。

【００６７】標準液のＴＳＨ濃度が高くなるに従って、
磁性フィルター上に捕集されたＭｇラテックス粒子と抗
原抗体反応により結合したＥｕラテックス粒子が増加し
ていることが、蛍光強度の増加からわかる。

【００６８】

【実施例６】直径１ｍｍ、長さ５ｍｍの円柱形の４本の
ネオジム磁石を束ね、対向する２つの磁石の磁極が同一
方向を向き、他の２つの磁石が前記方向に対して逆方向
となるように束ねたものを分離体１とし、これを、塩ビ
製の保持容器２（外径６．５ｍｍ、内径２．５ｍｍ、高
さ５ｍｍ）の中に詰めて磁性フィルターを作製した（図
１１）。永久磁石で分離体を形成することにより外部磁
場を不要とし、分離器具の形状をより簡便なものとし
た。さらにネオジム磁石の磁極を分離体表面にそろえる
ことにより、表面での分離、捕集を可能とした。

【００６９】実施例３で作製した抗ＴＳＨ抗体を固定化
したＭｇラテックス粒子０．０２５％懸濁液とＥｕラテ
ックス粒子０．００５％懸濁液を等量混合してラテック
ス粒子混合試薬とした。

【００７０】ＴＳＨ（ＺＹＭＥＤ社）をトリス緩衝液で
希釈して、０、３．０、９．０、０、２７μＩＵ／ｍｌ
の標準液を作製した。標準液１００μｌ、ＢＳＡ含有ト
リル緩衝液１００μｌ、上記ラテックス粒子試薬４０μ
ｌを加えた後撹はんし、３０分間免疫反応を行わせた。

【００７１】この反応液２２０μｌを、エッペンピペッ
ト（エッペンドルフ社製）で上記磁性フィルターに添加
し、磁性粒子を捕集した後、Ｔｗｅｅｎ２０を含んだト
リス緩衝液で洗浄し、Ｅｕキレートの６１５ｎｍの蛍光
強度をＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１５（ＣｙｂｅｒＦｌ
ｕｏｒ社）により測定した。結果を図１２に示す。

【００７２】標準液のＴＳＨ濃度が高くなるに従って、
磁性フィルター上に捕集されたＭｇラテックス粒子と抗
原抗体反応により結合したＥｕラテックス粒子が増加し
ていることが蛍光強度の増加からわかる。

【００７３】

【実施例７】実施例３で作製した抗ＴＳＨ抗体を固定化
したＭｇラテックス粒子と、Ｅｕラテックス粒子をそれ
ぞれ、０．０２５％、０．００５％を等量混合してラテ
ックス粒子混合試薬とした。

【００７４】ＴＳＨ（ＺＹＭＥＤ社）をトリス緩衝液で
希釈して、０、３．０、９．０、２７μＩＵ／ｍｌの標
準液を作製した。標準液１００μｌ、ＢＳＡ含有トリス
緩衝液１００μｌ、上記ラテックス粒子試薬４０μｌを
加えた後撹はんし、３０分間免疫反応を行わせた。

【００７５】この反応液２２０μｌを、実施例２と同様
の磁性フィルターにエッペンピペット（エッペンドルフ
社製）で添加し、磁性粒子を捕集した後、Ｔｗｅｅｎ２
０を含んだトリス緩衝液で洗浄し、Ｅｕキレートの６１
５ｎｍの蛍光強度をＣｙｂｅｒＦｌｕｏｒ６１５（Ｃｙ
ｂｅｒＦｌｕｏｒ社）により測定した。結果を図１３
に示す。

【００７６】標準液のＴＳＨ濃度が高くなるに従って、
磁性フィルター上に捕集されたＭｇラテックス粒子と抗
原抗体反応により結合したＥｕラテックス粒子が増加し
ていることが、蛍光強度の増加からわかる。

【００７７】

【発明の効果】本発明の磁性体の分離方法は、洗浄の迅
速、簡便性を兼ね備えた方法であり、特にＦＩＡ，ＥＩ
Ａ，ＬＩＡ，ＲＩＡ等の免疫分析の分野においてＢ／Ｆ
分離の迅速性をはかることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１〜４、６、７で使用した磁性フィル
ターの保持容器の形状を示す斜視図である。

【図２】実施例で使用した磁性フィルターの断面図で
ある。

【図３】分離体に外部磁場を与える場合の、分離体
（保持容器）と磁石との配置を模式的に表した図面であ
る。

【図４】実施例２および７で使用した分離体の形状を
示す斜視図である。

【図５】実施例２および７で使用した磁性フィルター
の断面図である。

【図６】実施例３で使用した磁性フィルターの断面図
である。

【図７】実施例３において測定した、ＴＳＨ濃度と蛍
光強度との関係を表す図面である。

【図８】実施例４において測定した、ＡＦＰ濃度と蛍
光強度との関係を表す図面である。

【図９】実施例５で使用した磁性フィルターと、これ
に外部磁場を与える磁石との配置を含めた全体像を表す
斜視面である。

【図１０】実施例５において測定した、ＴＳＨ濃度と
蛍光強度との関係を表す図面である。

【図１１】実施例６で使用した磁性フィルターの断面
図である。

【図１２】実施例６において測定した、ＴＳＨ濃度と
蛍光強度との関係を表す図面である。

【図１３】実施例７において測定した、ＴＳＨ濃度と
蛍光強度との関係を表す図面である。

【図１４】実施例１において、分離体表面に捕集され
た粒子構造を表す図面に代わる写真である。

【図１５】実施例１において、分離体表面に捕集され
た粒子構造を表す図面に代わる写真である。

【図１６】実施例２において、分離体表面に捕集され
た粒子構造を表す図面に代わる写真である。

【図１７】実施例２において、分離体表面に捕集され
た粒子構造を表す図面に代わる写真である。

【符号の説明】

１分離体２保持容器３磁性フィルター４磁石

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】磁性体粒子を含有してなる試料液を、少
なくとも一部が磁化されている素材又は磁性体で構成さ
れ、かつ少なくとも一方向に対して連続した空隙を有す
る分離体と接触させ、該分離体表面にて前記試料液中の
磁性体粒子を捕集することを特徴とする、磁性体粒子の
分離方法。
【請求項２】試料液中の免疫学的に活性な第１物質
を、該第１物質に対して免疫学的に活性な第２物質を固
定化した磁性体粒子と反応させ、前記反応物を、少なくとも一部が磁化されているかまた
は磁化可能な物質で構成され、かつ少なくとも一方向に
対して連続した空隙を有する分離体と接触させ、該分離体表面にて第１物質及び第２物質からなる反応物
を含有する磁性体粒子を捕集することを含む免疫分析方
法。
【請求項３】試料液中に、第１物質に対して免疫学的
に活性な第３物質をさらに共存させ、当該第３物質、第
１物質および磁性体粒子上の第２物質を反応させること
を特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】第３物質が標識物質で標識されているこ
とを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】第３物質に標識性物質が化学結合してい
ることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】第３物質および標識性物質が同一粒子上
に結合していることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項７】試料液中の免疫学的に活性な第１物質
を、該第１物質に対して免疫学的に活性な第２物質を固
定化した磁性体粒子と反応させ、前記反応物を、少なくとも一部が磁化されているかまた
は磁化可能な物質で構成され、かつ少なくとも一方向に
対して連続した空隙を有する分離体と接触させ、該分離体表面にて第１物質及び第２物質からなる反応物
を含有する磁性体粒子を捕集し、試料液中の未反応の第１物質、または分離体に捕集され
た第１物質を定性的または定量的に測定することを含む
免疫分析方法。
【請求項８】試料液中の免疫学的に活性な第１物質
と、該第１物質に対して免疫学的に活性な第２物質を固
定化した磁性体粒子と、該第１物質に対して免疫学的に
活性な第３物質を担持した標識性物質とを反応させ、前記反応物を、少なくとも一部が磁化されているかまた
は磁化可能な物質で構成され、かつ少なくとも一方向に
対して連続した空隙を有する分離体と接触させ、該分離体表面にて第１物質、第２物質及び標識性物質に
担持された第３物質からなる反応物を含有する磁性体粒
子を捕集し、分離体に捕集された標識性物質の標識強度を測定するこ
とを含む免疫分析方法。
【請求項９】試料液を分離体に通液することを特徴と
する請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】試料液を、吸引または加圧により分離
体に通液させることを特徴とする請求項９に記載の方
法。
【請求項１１】試料液が流出する側の分離体面に吸水
材を設けることを特徴とする請求項９または１０に記載
の方法。
【請求項１２】磁性体粒子が粒径０．０５〜１０μｍ
の粒子であることを特徴とする請求項１〜１１のいずれ
かに記載の方法。
【請求項１３】免疫学的に活性な物質が抗原または抗
体であることを特徴とする請求項２〜１２のいずれかに
記載の方法。
【請求項１４】分離体上に磁性体粒子を捕集した後、
分離体を洗浄することを特徴とする請求項１〜１３のい
ずれかに記載の方法。
【請求項１５】分離体が、フェライト磁石、サマリウ
ム−コバルト磁石、希土磁石、鉄、マンガン、ニッケ
ル、コバルト、クロム、四三酸化鉄、三二酸化鉄、フェ
ライト型もくしはマルテンサイト型ステンレス、アモル
ファス合金、シリコン鉄軟磁性結晶およびこれらを含有
する合成樹脂から選ばれる素材で構成されることを特徴
とする請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。