PT812422E - Processo e compostos para a deteccao de analitos por medicao de magnetismo remanescente e sua utilizacao - Google Patents

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“PROCESSO E COMPOSTOS PARA A DETECÇÃO DE ANALITOS POR MEDIÇÃO DE MA GNETISMO REMANESCENTE E SUA UTILIZA ÇÃO ” A invenção refere-se ao objecto caracterizado nas reivindicações da patente, isto é, processo para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de analitos em fases líquidas e sólidas por medição do magnetismo remanescente (residual), a utilização de compostos adequados para esse efeito e sua utilização na analítica. É conhecido que imunoensaios quantitativos assim como ensaios de ligação (por exemplo, ensaios de ligação do receptor) possibilitam a determinação de um grande número de substâncias, que também podem ser de relevância biológica, para determinar em amostras de diferentes composições. Em geral, neste caso, contudo, por amostra é determinado um parâmetro num ensaio no presente caso. Uma panorâmica actual dos diferentes processos é fornecida por T. Chard [An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques : Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 4a. ed., Elsevier Science Publishers, Amesterdão (1990)]. O fundamento de todos os ensaios de ligação é a elevada sensibilidade de detecção de compostos de isótopos ou marcados de outra fonma em combinação com a grande especificidade de reacções de ligandos-receptores.

No processo divulgado na publicação JP3-220442A concretiza-se a determinação de um título de antigénios através da medição da extensão da agregação (aglutinação) mediada por anticorpos com o auxílio de um processo divulgado na publicação para a medição do tamanho das partículas de partículas magnéticas aglomeradas. O processo da determinação do tamanho das partículas consiste assim em originar um campo magnético, o qual atravessa a amostra sedimentada num sítio estável, e na medição da intensidade do fluxo magnético residual das partículas magnéticas aglomeradas. A partir da publicação US-4 661 408 são conhecidos fluidos ferrosos, que contêm partículas superparamagnéticas de dióxido de crómio com anticorpos acoplados. Assim, é reivindicado que estas partículas apresentem tempos de relaxação intrinsecamente muito pequenos, não correspondendo por isso aos requisitos para a utilização de medições de magnetismo remanescente.

Os processos de ensaio conhecidos possuem, contudo, as seguintes desvantagens: -2-

f • Os processos para a determinação simultânea de analitos diferentes dentro da mesma amostra baseiam-se na ligação de diferentes sondas marcadas radiológica, fluorescente ou enzimologicamente aos analitos. Assim, como regra geral, para a determinação do analito é medida a actividade ligada ou não ligada da sonda depois da separação e lavagem subsequente. A quantidade utilizável do rótulo diferente das sondas é, por conseguinte, limitada. Assim, no caso por exemplo, de rádio-isotópos diferentes como marcação de sondas aparecem fenómenos de sobreposição que conduzem a uma perda rápida da exactidão quantitativa dos sinais individuais. A combinação de diferentes enzimas como rótulo das sondas origina problemas comparáveis em que a condutibilidade no presente caso é ainda dificultada através da procura necessária das condições de reacção que permitam a determinação simultânea das reacções de enzimas num sistema. • A sensibilidade do processo é limitada, por exemplo, por acções de permuta não específicas entre matriz e sonda ou, mas também, por possibilidade limitada de marcação da sonda (pequena actividade específica). • A concretização do processo com êxito ffequentemente prevê um processamento do material de amostras obtido (por exemplo, preparação de soro ou plasma a partir de sangue puro, extracção de amostras com dissolventes orgânicos, enriquecimento de analitos por meio de processo cromatográfico, etc.). • Para a concretização do processo com êxito, são indispensáveis os passos de separação e lavagem que servem a separação entre receptores ou ligandos não ligados e ligados. • Para a concretização de ensaios rádio-imunos, é necessária a utilização no processamento de nuclídeos radioactivos mais caros. • A armazenagem dos marcadores utilizados até à data causa frequentemente na prática problemas, uma vez que ou não são estáveis (ensaios rádio-imunos) e, por conseguinte, devem ser sempre produzidas recentemente ou devem reagir de forma sensível sobre as influências de ambiente. O objectivo da presente invenção foi, portanto, encontrar um processo de novo tipo e substâncias, que ultrapassam o estado da técnica, acima mencionado.

Este objectivo é atingido por meio da presente invenção.

Descobriu-se que a detecção qualitativa e/ou quantitativa de analitos em fases líquidas e/ou sólidas se realiza com êxito quando substâncias estáveis ou quase estáveis, ferromagnéticas ou ferrimagnéticas coloidais heterogéneas são utilizadas como marcação magnética a detectar em imunoensaios ou ensaios de ligação e a magnetização remanescente da amostra é determinada como grandeza de medição.

Subsequentemente, são em primeiro lugar descritos processos que vencem as desvantagens dos processos conhecidos.

Os processos de acordo com a invenção baseiam-se na utilização de substâncias coloidais, ferromagnéticas ou ferrimagnéticas, de seguida também designadas como marcação magnética que são combinadas com substâncias a detectar - de seguida também denominadas analitos - ou substâncias de estrutura específica que se ligam especificamente aos analitos a detectar.

As combinações deste tipo de marcações magnéticas com analitos ou substâncias de estrutura específica são designadas de seguida também como marcadores magnéticos. Através da utilização da expressão "substâncias coloidais", designam-se tanto a zona das dimensões da ordem de grandeza das partículas ou das substâncias na zona das dimensões das partículas ou substâncias coloidais, isto é, zona de 1 nma cerca de 1000 nm, assim como a sua utilização como fase dispersa num agente de dispersão adequado que é principalmente aquoso. Substâncias coloidais que de seguida são também designadas como partículas, estão presentes para fins de melhor capacidade de posicionamento e transporte em forma seca ou liofilizada, enquanto na concretização de medidas estão contudo presentes, de uma forma geral, num estado disperso em fase líquida.

Um fundamento essencial da invenção consiste em que a dependência temporal de magnetização das substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas coloidais, após desligação de um campo magnetizado exterior é muito sensível em termos de material e forma (constante de anisotropia do material de partículas utilizado), volumes e da temperatura das partículas utilizadas. Isto é originado por uma rotação do vector de magnetização interno dentro das partículas. Este mecanismo é denominado de relaxação -de Néel. Quando a magnetização das partículas é relaxada dentro do tempo de medição, isto é denominado superparamagnetismo intrínseco. As partículas, cujo tempos de relaxação de Néel são essencialmente maiores do que o intervalo de tempo de observação são denominadas partículas de

magnetismo remanescente ou também como partículas estáveis. As particulasj/cujo tempos de relaxação de Néel são da ordem de grandeza do intervalo de tempo de observação, são denominadas partículas quase estáveis.

Um outro fundamento essencial da invenção consiste em que a magnetização relaxa uma globalidade de partículas coloidais que se movem livremente, estáveis ou quase estáveis ferromagnéticas ou ferrimagnéticas após desligação de um campo magnetizante exterior dentro de um tempo de medição através de um segundo mecanismo. Por conseguinte, atinge-se uma rotação da partícula coloidal global dentro do líquido circundante, em que a constante do tempo depende do diâmetro hidrodinâmico das partículas incluindo o invólucro, da viscosidade do líquido de suporte e da temperatura. Estes parâmetros são essencialmente determinados pela vizinhança das partículas. O mecanismo é designado como relaxação de Brown ou superparamagnetismo extrínseco.

Efectua-se o processo de acordo com a invenção para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de analitos em fases líquidas e sólidas, no qual (i) são primeiro marcadas substâncias de estrutura específica, as quais se ligam especificamente aos analitos a detectar com substâncias ferrimagnéticas ou ferromagnéticas e subsequentemente (ii) estas substâncias magnéticas de estrutura específica são fornecidas às amostras a serem medidas, (iii) as amostras a serem medidas são magnetizadas por meio de um campo magnético colocado exteriormente de intensidade adequada e (iv) após a desligação do campo exterior, é medido o magnetismo remanescente da magnetização das partículas coloidais (marcação magnética) por meio de sensores de campo magnético, em que o magnetismo remanescente ocorrente através da ligação específica e a respectiva extensão são usados para análise. A discriminação possível apenas excepcionalmente nos processos do estado da técnica, entre marcadores ligados e não ligados é possibilitada no processo de acordo com a invenção através da utilização do magnetismo remanescente desaparecido (isto é, o superparamagnetismo extrínseco) do marcador magnético não ligado na fase líquida. A globalidade do marcador magnético ligado mostra, por outro lado, em função do material das partículas - um magnetismo remanescente mensurável. Na detecção do magnetismo remanescente das amostras a determinar é, portanto, detectada apenas a porção do marcador magnético ligado. O processo é, por conseguinte, também designado como medição do magnetismo -5- -5- !

remanescente de ligação ou da medição do magnetismo baseia-se no marcador específico da estrutura ligado na detecção quantitativa.

Por outras palavras, a determinação do analito pode realizar-se sem procedimentos de separação e lavagem dispendiosos, uma vez que apenas as substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas estáveis ou quase estáveis, ligadas especificamente aos analitos (que são combinadas para fins de fornecimento de uma especificidade com substâncias de estrutura específica) procuram o magnetismo remanescente, contrariam ente ao magnetismo das substâncias que simultaneamente ferromagnéticas ou ferrimagnéticas estáveis ou quase estáveis, não ligadas, presentes em excesso na amostra (que, de qualquer forma, são combinadas com substâncias de estrutura específica) antes do início da medição por superparamagnetismo extrínseco são dissipadas.

Numa forma de concretização adicional da invenção, o processo é modificado na sua forma, uma vez que em lugar das substâncias de estrutura específica, a própria análise é combinada com as substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas, estáveis ou quase estáveis, tal como esta é utilizada tão frequentemente e de forma análoga, por exemplo, à concretização de experiências radio-imuno competitivas. As amostras devem então ser adicionalmente acrescentadas à substância de estrutura específica, as quais se devem ligar especificamente aos analitos a detectar. O processo pode ser concretizado também como ensaio de múltiplos analitos, que possibilita uma determinação directa, simultânea de vários analitos diferentes em líquidos ou substâncias sólidas. Para isso, é necessário, primeiramente marcar os analitos com diferentes substâncias coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas e com suficiente intensidade de campo coerciva discreta. Durante a ligação do marcador magnético, é colocado um campo magnetizante (campo de magnetização primário), o qual conduz a uma orientação de todos os marcadores magnéticos contidos na amostra ao longo do seu eixo simples. Subsequentemente, o magnetismo remanescente da amostra é determinado. Em procedimentos adicionais, a amostra é magnetizada com campos externos contrários (de sentido contrário ao campo de magnetização primário), que são determinados na sua intensidade com a intensidade de campo coerciva das marcações magnéticas. Por conseguinte, é possível orientar sempre de forma selectiva apenas as marcações, cujas intensidades de campo coercivas são mais reduzidas do que a do campo magnetizante colocado. Entre os procedimentos individuais da remagnetização é, de cada vez, determinado novamente o magnetismo remanescente da amostra. 1(

A partir do magnetismo remanescente medido da amostra em cada procedimento individual da magnetização pode ser quantificada, por conseguinte, a porção do marcador magnético ligado diferente.

Através deste processo é possível determinar simultaneamente vários analitos por amostra. O processo de acordo com a invenção, assim como as variantes do processo, podem ser utilizados na fertilidade, histocompatibilidade, alergologia, infectologia, higiene, genética, virulogia, bacteriologia, toxicologia, patologia, análise do meio ambiente e diagnóstico médico. A detecção do magnetismo remanescente da ligação efectua-se com dispositivos de medição conhecidos, no presente caso adequados como, por exemplo, Dispositivos de Interferência Quântica Supercondutora [“Superconducting Quantum Interference Devices” (SQUIDs)], nos quais é imediatamente efectuada uma magnetização por meio de um campo magnético adequado e subsequentemente, após separação do campo, concretizada a medição do magnetismo remanescente da substância de estrutura específica magnética ou dos sinais dependentes da mesma através de sensores do campo magnético.

Durante a medição, vantajosamente a amostra pode mover-se. Especialmente vantajosa é uma modulação do sinal através de vibração ou rotação da amostra. Por conseguinte, uma transformação do sinal de medição dc é realizada numa zona de elevada frequência.

Para a medição podem também ser utilizados - juntamente com os referidos SQUIDs - como gradiómetros bobinas de indução rectificadas, sonda electromagnética, sensores de resistência gigante-magnética ou um transformador de resistência magnética.

Na utilização de sensores que podem medir o campo dc (por exemplo, SQUIDs, sonda electromagnética, sensores de resistência gigante-magnética ou transformador de resistência magnética) é também possível uma medição do magnetismo remanescente após a magnetização prévia da amostra, sem que esta se mova. ------

Um dispositivo de medição adequado é, por exemplo, representado na Figura 1. Um dispositivo deste tipo é utilizado nos exemplos que se seguem. -7-

Um outro aspecta da invenção refere-se à utilização de compostos para mediçãoçao magnetismo remanescente da ligação. Os compostos adequados consistem em suspensões coloidais de substâncias ferri magnética ou ferromagnéticas e substâncias ou analitos de estrutura específica.

Como substâncias de estrutura específica entendem-se, como estando no âmbito da presente invenção, todas as substâncias que se ligam de forma específica à estrutura desejada como, por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpos, biotina ou substâncias ligados de forma específica à biotina como a avidina ou estreptavidina, agonistas ligadas de forma específica em receptores como citoquina, linfoquina, endotelina ou respectivos antagonistas, péptidos e proteínas específicas, receptores, enzimas, substratos de enzimas, nucleótidos, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos, hidratos de carbono, lipoproteínas, etc.

Por conseguinte, são preferidas substâncias cuja constante de ligação se situa na gama de 105 - 1015 (mol/1)'1, especialmente substâncias cuja constante de ligação se situa na zona dos ΙΟ7- 1015 (mol/1)'1.

Como substâncias coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas podem ser utilizadas todas as substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas, cujo tempo de relaxação de Néel intrínseco é superior ou igual ao tempo de medição e que, por conseguinte, são estáveis ou quase estáveis. São especialmente adequadas todas as substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas, cujo tempo de relaxação a 20°C é superior a IO-4 segundos. Especialmente adequadas são todas as substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas, cujo tempo de relaxação é superior a 1 segundo.

As substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas podem ser vantajosamente estabilizadas com um invólucro de hidratos de carbono oligoméricos ou poliméricos, proteínas, péptidos, nucleótidos, tensioactivos, polímeros sintéticos e/ou lípidos. O tamanho das partículas das substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas situa-se vantajosamente entre 1 nm e 1000 nm. Especialmente preferido é o tamanho das partículas entre 2 e 500 nnr. (Os dados numéricos respeitantes ao tamanho das partículas refere-se ao diâmetro hidrodinâmico).

Como substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas são especialmente adequadas partículas coloidais estáveis ou quase estáveis de óxidos de ferro (Fe3C>4, y-Fe203), ferrito de bário, ferrito de estrôncio, ferro puro, dióxido de crómio, níquel, cobalto assim como óxidos de ferro com adições de manganésio, cobre, níquel ou cobalto (como descrito, em DE 30 27 012 e em DE 41 16 093). A preparação de compostos utilizáveis de acordo com a invenção, que consistem em substâncias estáveis ou quase estáveis ferromagnéticas ou ferrimagnéticas ligadas com substâncias ou analitos de estrutura específica, realiza-se com o auxílio dos processos correntes na área da imunoquímica, na química peptídica e proteica. Nesse caso, é acoplada a substância ou analito de estrutura específica através de ligações covalentes com as substâncias formadoras de substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas do invólucro estabilizador. Como invólucro estabilizador são importantes, por exemplo, hidratos de carbono, péptidos, nucleótidos, proteínas, lípidos, tensioactivos ou polímeros. Os métodos de acoplamento especialmente adequados são, por exemplo, a activação e acoplamento por meio de carbodi-imidas [Jakoby and Wilchek, eds., (1974) Methods Enzymol 34], a ligação de bases de Schiff por acção de periodatos sobre compostos que contêm hidratos de carbono (Wichek and Bayer, eds., Methods Enzym 184:177) que eventualmente são a posteriori para uma suplementar estabilização, o acoplamento por meio de dialdeídoglutárico [Heitzmann and Richards, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71 (1974) 3537], a reticulação de partículas bromoacetiladas com substâncias tiolizadas [Angerer et al., Cell 9 (1976) 81], assim como a alquilação redutiva [Bayer et al., J. Histochem. Cytochem. 24 (1976) 933].

Podem também ser preparadas partículas coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com um invólucro estabilizador a partir da substância de estrutura específica ou dos próprios analitos, em que as partículas são inseridas após preparação ou directamente numa solução da substância ou analito de estrutura específica, eventualmente na presença de adicionais materiais auxiliares como, por exemplo, proteínas, hidratos de carbono assim como, substâncias superficialmente activas, naturais, sintéticas ou parcialmente sintéticas, etc., ou são preparadas directamente na presença de substâncias de estrutura específica ou analitos.

Para concretização de ensaios de analitos múltiplos, podem também ser utilizadas as misturas de compostos constituídos por vários marcadores magnéticos diferentes, em que os marcadores magnéticos diferentes são constituídos por combinações de substâncias de estrutura específica diferente ou analitos -9- detectáveis com diferentes substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas.* A base desta utilização de acordo com a invenção de combinações de marcador magnético diferente, consiste em que seja utilizada como marcação magnética para as respectivas substâncias de estrutura específica ou analitos detectáveis de substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com intensidades de campo coercivas diferentes (Hc), em que a intensidade de campo coercivo (Hc) dos parâmetros e a magnetização remanescente (Mr) podem ser determinadas, separadamente, de forma conhecida para as marcações magnéticas diferentes e, por conseguinte, são conhecidas.

As substâncias de estrutura específica marcadas com substâncias coloidais ferromagnéticas e ferrimagnéticas podem também estar presentes sob forma seca (por exemplo, como liofilizados), eventualmente em combinação com outros materiais auxiliares, que possibilitam a secagem ou aumentam a estabilidade do produto seco. A preparação do agente pronto a utilizar a partir de liofilizados desta natureza realiza-se, assim, imediatamente antes da aplicação por ressuspensão directa num agente de suspensão adequado.

Um outro aspecto da invenção refere-se, por conseguinte, aos meios para medição de magnetismo remanescente de ligação que contém substâncias coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas num agente de suspensão adequado.

Como agentes de suspensão adequados são importantes todos os líquidos nos quais as partículas coloidais se podem mover livremente. No caso de as medições poderem ser efectuadas sem procedimentos de separação ou de lavagem, a viscosidade do agente de suspensão utilizado deve ser coordenada com o tempo de relaxação de Néel das substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas e o tempo de medição, uma vez que o agente de suspensão determina essencialmente a constante de tempo de relaxação de Brown. Por outro lado, a relaxação de Brown (superparamagnetismo extrínseco) pode, desta forma, ser prolongada, por exemplo, com a utilização de partículas com um curto tempo de relaxação (por exemplo, 0,01 segundos) em agentes de suspensão de elevada viscosidade (por exemplo, glicerol a 80%) e um curto tempo de medição (por exemplo, 0,0001 segundos após desligação do campo exterior), uma vez que já não se pode diferenciar entre marcadores de estrutura específica ligados e não ligados. É, contudo, vantajoso utilizar agentes de suspensão-com uma viscosidade menor do que 100 mPas.

Como agentes de suspensão são adequados água, soluções aquosas de materiais auxiliares de superfície activa, como por exemplo tensioactivos ou hidratos de carbono oligoméricos ou poliméricos, assim como misturas de água com álcoois como, por exemplo, glicerol e polietilenoglicol em que é especialmente adequada a água para fins de injecção. Os agentes de suspensão podem adicionalmente conter materiais auxiliares modificadores da pressão osmótica como, por exemplo, sal de cozinha. Adicionalmente, podem estar contidas substâncias tampão determinadoras do valor de pH, por exemplo, fosfatos.

Um outro objectivo da invenção é a utilização dos compostos no processo de acordo com a invenção para medição do magnetismo remanescente de ligação.

Devido à detecção de ligação baseada em mecanismos físicos podem ser incluídos consideravelmente sinais de medição não específicos. A especificidade do processo depende, por conseguinte, apenas da “verdadeira” especificidade da substância de estrutura específica (reactividade cruzada de anticorpos, ligação não específica de ligandos).

Devido à elevada sensibilidade do processo de acordo com a invenção são assim facilmente atingidos valores inferiores aos limites de detecção comuns de ensaios de ligação.

Em oposição a métodos conhecidos (JP-235774 e WO 91/15243) não é medida, no processo de acordo com a invenção, a magnetização estática na presença de um campo magnético exterior, mas sim o magnetismo remanescente de ligação ou sinais dependentes do mesmo na presença de um campo magnético. Por conseguinte, são disponibilizadas primeiro informações sobre o estado de ligação do marcador.

Adicionalmente, é assim evitada também uma influência do sinal de medição por meio dos componentes diamagnéticos ou paramagnéticos relativamente a impurezas, o que contribui para um outro aumento da sensibilidade de medição.

Os processos de acordo com a invenção para medição de magnetismo remanescente de ligação podem também ser utilizados para detectar in vivo o local de paragem de substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas. No presente caso, consiste numa especial.....vantagem que para determinação do magnetismo remanescente de ligação possam ser utilizadas substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas e, por conseguinte, sejam evitados isótopos radioactivos de aplicação humana especialmente crítica, em que a sensibilidade do processo de

- Π - a acordo com a invenção do processo de medicina nuclear utilizável atingi cintilografía da gama ou tomografia de positrões-emissão. Além disso, é desnecessária uma separação prévia de marcadores não ligados a circular no sangue, uma vez que este (por oposição a métodos radiodiagnósticos) não procura qualquer “sinal de perturbação” e, por conseguinte, não influencia a detecção do marcador ligado específico.

De acordo com a invenção é ministrada ao paciente uma suspensão estável ou quase estável de substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas. Como método de aplicação são adequadas as aplicações locais, a aplicação perorai e todas as formas de aplicação parentérica. Especialmente adequadas são as formas de aplicação intravasais.

As substâncias coloidais são distribuídas no organismo, em que o modelo de distribuição é influenciado no corpo pelo método de aplicação, assim como por outros diferentes parâmetros farmocinéticos. A determinação solucionada localmente do magnetismo remanescente de ligação em tempos distintos após aplicação estável ou quase estável de substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas pode servir para fixar estados patológicos do organismo que são, assim, caracterizados por um enriquecimento invulgar ou aparecimento com erro de enriquecimentos.

Especialmente vantajoso pode, para representação de estruturas patológicas, estar contida em corpos humanos a utilização de acordo com a invenção de substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas (marcadores magnéticos) estáveis ou quase estáveis combinadas com substâncias de estrutura específica. No presente caso, a ligação específica do marcador magnético na estrutura patológica conduz a um sinal específico que pode ser determinado in vivo, de acordo com a invenção, com o processo de magnetismo remanescente de ligação descrito para concretização de experiências de ligação.

Como exemplo para uma aplicação, de acordo com a invenção, de substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas estáveis ou quase estáveis em combinação com o processo da medição de magnetismo remanescente, é conhecida a detecção de tumores no corpo através de utilização de marcadores magnéticos de tumor específico. Os marcadores-de tumores específicos podem, por exemplo, ser combinações de substâncias estáveis ou quase estáveis ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com substâncias de tumor específico como, por exemplo, anticorpos, fragmentos de anticorpos, péptidos, receptores, proteínas, ácidos -12- nucleicos, oligonucleicos, hidratos de carbono monoméricos, oligoméricos o poliméricos.

Outros exemplos para possíveis aplicações são a representação de trombos, placas arteroescleróticas, reacções inflamatórias, modificações reumáticas ou reumatoides, em que cada combinação vantajosa, de acordo com a invenção, de substâncias estáveis ou quase estáveis ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com as respectivas substâncias patológicas de estrutura específica pode ser utilizada como marcador magnético. A medição In vivo da divisão espacial de um marcador magnético de aplicação humana estável ou quase estável realiza-se de acordo com a invenção segundo duas variantes: 1. Produção de um campo magnético o mais homogéneo possível na região do corpo que interessa, supressão do campo e medição da distribuição espacial de ligação por meio de um sensor de canal múltiplo SQUID como, por exemplo, tal como é utilizado para investigações biomagnéticas [comp. D Drung, IEEE Trans. Appl. Supercond., 5 (1995) 2112-2117], Estes devem abranger o objecto de medição o mais globalmente possível. Para obtenção de suficientes informações de medição são vantajosas múltiplas concretizações da medição com um sequencial repouso do objecto de medição. 2. Produção sequencial de um campo local limitado espacialmente, supressão do campo e medição do magnetismo remanescente de ligação por meio de um sensor de canal único. A utilização de um sensor de canal múltiplo é, de qualquer forma, possível.

Segundo ambos os métodos, para obtenção da máxima informação, são preferidas nos três sentidos espaciais tanto a magnetização do objecto de medição como também a medição do campo magnético resultante. A avaliação dos dados de medição pode realizar-se por meio de um processo de aproximação adequado. Assim, pode estabelecer-se fundamentalmente o modelo do dipolo, multipolo ou- multidipolo magnético. Os parâmetros especiais do modelo, especialmente, os locais do dipolo ou multipolo são determinados por meio do processo de aproximação uma vez que se minimizam as irregularidades entre dados de medição e parâmetros do modelo. A partir destes parâmetro!· é averiguada a distribuição espacial das partículas magnéticas de forma conhecida.

Um procedimento análogo é conhecido e comprovado na análise do campo magnético das correntes bioeléctricas.

Para a medição do magnetismo remanescente de ligação in vivo adequam-se fundamentalmente as mesmas substâncias -ou agentes desta forma preparados -tal como são importantes nas investigações in-vitro.

Especialmente adequados para a aplicação In vivo são os marcadores magnéticos que são biologicamente degradáveis e compatíveis. Isto ocorre especialmente para marcadores magnéticos que consistem em óxidos de ferro ou em combinações de óxidos de ferro com manganésio ou cobalto. As partículas magnéticas, nas quais as substâncias de estrutura específica dos processos referidos podem ser acopladas, encontram utilização na tomografia nuclear e são, sobretudo, descritas na WO 92/12735, WO 92/22586 assim como na ÈP 0 186 616. Um outro aspecto da invenção refere-se, por conseguinte, a marcadores magnéticos num processo In-vivo para medição do magnetismo remanescente.

Como substâncias de estrutura específica entendem-se, em ligação com a utilização In vivo da medição de magnetismo remanescente, especialmente todas as substâncias que se ligam de forma específica em estruturas detectáveis do corpo humano. Especialmente adequados são anticorpos, fragmentos de anticorpos, agonistas ou respectivos antagonistas que ligam especificamente a receptores, péptidos específicos e proteínas, receptores, enzimas, substratos de enzimas, nucleóticos, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos, hidratos de carbono ou lipoproteínas. Dos agonistas que se ligam a receptores são especialmente adequados citoquinas, linfoquinas ou endotelinas. São especialmente adequadas substâncias de estrutura específica que apresentam uma constante de ligação na gama dos 105 - 1015 (mol/1)'1. São especialmente adequadas todas as substâncias de estrutura específica que apresentam uma constante de ligação na gama dos 107 — 1015 (mol/1)'1.

Os exemplos que se seguem-servem para o esclarecimento mais pormenorizado do objecto da invenção, sem o limitar. - 14- - 14-

Exemplo 1 100 μ% de um anticorpo monoclonal contra colagénio III, de seguida referido como anti-colagénio III, são dissolvidos em 500 μ\ de solução de hidrogenocarbonato de sódio 0,1 Μ. 1 ml de suspensão de magnetite revestida com dextrano (Meito Sangyo) é retamponizada com 1 mol de Fe/1 e uma dimensão de partículas de cerca de 40 nm (diâmetro hidrodinâmico) através de uma coluna Sephadex (farmácia PD 10) com hidrogenocarbonato de sódio 0,1 Μ. A suspensão são adicionados 0,5 ml de solução de periodato de sódio 10 mmol. Deixa-se repousar a solução no escuro durante 2 horas. Subsequentemente, é eluída através de uma PD 10 com solução 0,1 M de hidrogenocarbonato de sódio. A suspensão é adicionada solução de anti-colagénio III. Deixa-se repousar no escuro a mistura durante 3 horas a 4°C. Subsequentemente, são adicionados 5 mg de NaBRt como substância sólida e agitada durante um curto intervalo de tempo. Deixa-se repousar a mistura no escuro durante 8 horas a 4°C. Subsequentemente é eluído o anti-colagénio III marcado com magnetite (de seguida referido como Mag-anti-colagénio III) através de uma coluna PD 10 com solução de sal de cozinha tamponizada com fosfato (PBS, pH 7,4).

Uma solução de 5 μ% de colagénio III em 200 μ\ de tampão [solução de sal de cozinha tamponizada de fosfato (PBS)] é incubada num recipiente de análise de poliestireno. (O recipiente de análise serve, como fase sólida, na qual uma parte do colagénio é fixado). Subsequentemente, é rejeitada a fase líquida. O recipiente de análise é lavado três vezes com solução de sal de cozinha revestido de fosfato contendo 0,1% de Tween® 20 (designado de seguida como PBST) de forma a lavar colagénio não fixo. No recipiente de análise são adicionados, então, 5 μ\ de Mag-anti-colagénio III dissolvidos em 200 μ\ de PBST. É incubado 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, a amostra é magnetizada numa câmara magneticamente blindada num campo de intensidade igual a 2 mT, 4 cm por baixo do detector Squid (ver Figura 1). Após se desligar o campo magnético a amostra é medida. Para isso, a amostra é retirada da bobina de magnetização durante a medição. A partir da diferença da densidade de fluxo averiguada - depois da desligação do campo magnético -antes e depois do afastamento da amostra do campo de medição obtém-se o magnetismo remanescente. No caso do presente exemplo, foi determinado um magnetismo remanescente.

Exemplo 2

Uma solução de 5 /zg de colagénio V em 200 μ\ de tampão de PBS de pH 7,4 é -15- -15-

incubada num recipiente de análise de poliestireno. Subsequentemente, aifase líquida é rejeitada. O recipiente de análise é lavado três vezes com tampão de lavagem de PBST de pH 7,4. São adicionados à amostra 5 μ\ de Mag-anti-colagénio ΠΙ em 200 μ\ de PBST, preparados segundo o exemplo 1. São incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente, a amostra é magnetizada numa câmara blindada magneticamente num campo de intensidade igual a 2 mT, 4 cm por baixo do detector SQU1D (ver Figura 1). Após se desligar o campo magnético a amostra é medida. Para isso, a amostra é retirada da bobina de magnetização durante a medição. Na amostra resultante do colagénio V não é possível determinar nenhum magnetismo remanescente.

Exemplo 3 A partir de 10 ml de uma solução de 1,9 mg/ml de colagénio III em PBS (pH 7,4) são preparados respectivamente 5 ml das seguintes diluições: 1000 ng/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml A partir de cada diluição é pipetado respectivamente 1 ml para respectivamente um tubo de poliestireno (capacidade 2,5 ml). Os três tubos de ensaio são inibidos durante 1 hora a 37°C. De seguida, o conteúdo dos tubos é rejeitado. Os tubos são lavados 3 vezes respectivamente com 1 ml de PBST.

Em cada tubo é colocado 1 ml de uma diluição 1:100 do anticorpo marcado com magnetite, preparado de acordo com o exemplo 1. Deixam-se repousar os tubos durante 1 hora à temperatura ambiente. De seguida, as amostras são magnetizadas (2 mT) com o dispositivo de medição esboçado na Figura 1 e após se desligar o campo magnetizante as amostras são medidas. Para isso, as amostras são retiradas durante a medição da bobina de magnetização. A avaliação dos sinais medidos é uma medida para o magnetismo remanescente de ligação e obtém-se a representação gráfica da Figura 2.

Ufa* 2 8 DEZ. 2000

Dra. Maria Silvina Fferreira

Agente Oficial de Propriedade Industfiol R. Castilho, 201-3.° E- 1070-051 LISBOA Telefs. 213 851339 - 213 854 613

Claims (22)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de analitos, caracterizado pelo facto de serem utilizadas substâncias coloidais ferromagnéticas ou ferrimagnéticas estáveis ou quase estáveis, como marcação magnética a detectar em imunoensaios heterogéneos e ser determinada a magnetização remanescente da amostra como grandeza de medição.
2. 2. Processo para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de analitos em imunoensaios heterogéneos, caracterizado pelo facto de o marcador magnético ligado no momento da medição na sua globalidade provocar uma magnetização remanescente da amostra, enquanto da mesma forma a magnetização no marcador magnético não ligado presente na amostra é desvanecida num instante de tempo da medição na sua globalidade através de superparamagnetismo extrínseco.
3. 3. Processo para a detecção qualitativa e/ou quantitativa de analitos em imunoensaios heterogéneos, caracterizado pelo facto de (i) primeiramente substâncias de estrutura específica, as quais ligam especificamente os analitos a detectar, serem marcadas com substâncias coloidais ferrimagnéticas ou ferromagnéticas e subsequentemente (ii) estas substâncias de estrutura específica marcadas magneticamente serem adicionadas à amostra a medir, (iii) a amostra a medir ser magnetizada por meio de um campo magnético de intensidade apropriada colocado no exterior e (iv) após a desligação do campo exterior ser medido o magnetismo remanescente da magnetização das partículas coloidais por meio de sensores de campo magnético, em que o magnetismo remanescente ocorrente por meio de ligação específica e respectiva medida são para análise.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de, em vez de substâncias de estrutura específica, os analitos detectados serem marcados com substâncias ferrimagnéticas ou ferromagnéticas e serem adicionados às amostras a medir as substâncias de estrutura específica, as quais se ligam de forma específica aos analitos a detectar. 2
5. 5. Processo de acordo com as reivindicações 3 ou 4, caracterizado pele facto de as substâncias de estrutura específica serem anticorpos, fragmentos de anticorpos, biotina ou substâncias especificamente ligantes da biotina, avidina ou estreptavidina, agonistas ou respectivos antagonistas que especificamente se ligam a receptores, péptidos e proteínas específicas, receptores, enzimas, substratos de enzimas, nucleótido, ácidos ribonucleicos, ácidos desoximbonucleicos, hidratos de carbono ou lipoproteínas.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de os agonistas ou antagonistas que ligam especificamente receptores serem citoquina, linfoquina, endotelina ou respectivos antagonistas.
7. 7. Processo de acordo com as reivindicações 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo facto de as substâncias de estrutura específica possuírem uma constante de ligação na gama de 105 - 1015 (mol/l)"1.
8. 8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de a amostra se mover durante a medição e, por conseguinte, modular o sinal da amostra.
9. 9. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de, como sensores do campo magnético, serem utilizados gradiómetros de bobinas de indução em circuito, sonda electromagnética, sensores gigantes de resistência magnética ou um transformador de resistência magnética.
10. 10. Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de como sensores do campo magnético serem utilizados SQUTDs.
11. 11. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de, por magnetização gradual da amostra a medir, se realizar uma determinação simultânea de vários analitos diferentes.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de, para uma determinação quantitativa simultânea de analitos, serem utilizadas substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas diferentes com intensidades de campo coercivo discretas. 3
13. 13. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado pek facto de o tempo de relaxação de Néel intrínseco das substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas utilizadas ser maior do que o tempo de medição.
14. 14. Processo de acordo com reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o tempo de relaxação de Néel intrínseco das substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas utilizadas a 20°C ser maior do que IO-4 segundos.
15. 15. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo facto de as substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas possuírem um tamanho de partículas na gama dos 1 a 1000 nm.
16. 16. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo facto de as substâncias ferromagnéticas e ferrimagnéticas serem estabilizadas com um invólucro de hidratos de carbono oligoméricos ou poliméricos, proteínas, péptidos, nucleótidos, tensioactivos, polímeros e/ou lípidos sintéticos.
17. 17. Utilização de compostos no processo de acordo com as reivindicações 1-16, caracterizada pelo facto de os compostos consistirem em combinações de substâncias estáveis ou quase estáveis ferrimagnéticas ou ferromagnéticas com substâncias de estrutura específica.
18. 18. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo facto de as partículas ferrimagnéticas ou ferromagnéticas apresentarem um tempo de relaxação de Néel maior do que 10"4 segundos.
19. 19. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo facto de as substâncias de estrutura específica serem anticorpos, fragmentos de anticorpos, agonistas que ligam especificamente receptores, citoquinas, linfoquinas, endotelinas ou os seus antagonistas, outros péptidos e proteínas específicos, receptores, enzimas, substratos de enzimas, nucleótidos, ácidos ribonucleicos, ácidos desoxirribonucleicos, hidratos de carbono ou lipoproteinas.
20. 20. Utilização de compostos de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo facto de as substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas serem partículas coloidais estáveis ou quase estáveis de óxidos de ferro, ferrito de 4 4

    bário, ferrito de estrôncio, ferro puro, dióxido de crómio, níquel,i cobalto assim como óxidos de ferro com adições de manganésio, cobre, níquel ou cobalto.
21. 21. Utilização de agentes no processo de acordo com as reivindicações 11 ou 12, caracterizada pelo facto de conter múltiplas substâncias ferromagnéticas ou ferrimagnéticas com diferentes intensidades de campo coercivas.
22. 22. Utilização do processo de acordo com as reivindicações 1 - 16 em fertilidade, histocompatibilidade, alergologia, infectologia, higiene, genética, virologia, bacteriologia, toxicologia, patologia, análise, analítica do ambiente e diagnóstico médico. Lisboa, 2 8 DEZ. 2000

    Dra. Maria Silvina Fferreira Agente Ofieiol de Propriedade IndusHiol R. Castilho, 201-3.° E - 1070-051 LISBOA Teteh. 213 851339 - 213 854 613