KR100416186B1 - 잔류자기측정을사용하는분석물질의검출방법및검출용화합물,및이들의용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 결합 잔류자기 측정의 도움으로 액체 및 고체 상 중의 분석물질의 정성적 검출 방법, 이러한 목적에 적합한 화합물, 및 이들의 분석 화학에서의 용도에 관한 것이다.

Description

잔류자기 측정을 사용하는 분석물질의 검출 방법 및 검출용 화합물, 및 이들의 용도 {Process and Compounds for Use in Detecting Analystes by Measurement of Residual Magnetism, and the Use of the Said Compounds}
본 발명은 특허 청구의 범위에서 특성화된 주제, 즉 잔류자기 측정을 사용하여 액체 및 고체 상 중에서 분석물질을 정성적 및(또는) 정량적으로 검출하는 방법, 이러한 목적에 적합한 화합물, 및 분석 화학에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
정량적 면역분석, 및 다른 결합 분석(예를 들면, 수용체 결합 분석)은 조성을 달리하는 시료들 중에서 생물학적 관련성을 가질 수 있는 매우 많은 물질들을 측정할 수 있음이 공지되어 있다. 그러나, 일반적으로, 이러한 방식으로는 하나의 분석에서 샘플 당 단지 1개의 파라미터만이 측정된다. 각종 방법들에 대한 기존의 개괄은 챠드(T. Chard)[An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 제4판, Elsevier Science Publishers, 암스테르담(1990)]이다. 모든 결합 분석법의 기초는 고특이성의 리간드-수용체 반응과 함께 동위원소로 또는 다른 몇몇 수단에 의해 표지된 화합물의 높은 검출 감응성이다.
일본 특허출원 3-220442A에 개시된 방법에서는, 문헌에 공지된 집괴된 자기성 입자의 입자크기를 측정하는 방법을 사용하여 항체 매개 응집 반응 정도를 측정함으로써 항원의 적정 농도를 결정한다. 이러한 입자 크기의 측정 방법은 침착된 정지상 샘플에 자기장을 통과시키고, 집괴된 자기성 입자의 잔류 자기 플럭스 밀도를 측정하는 것으로 이루어진다.
미국 특허 US-4,661,408호에는 항체가 결합된 이산화크롬으로 만들어진 초상자성 입자를 함유하는 자성 유체가 공지되어 있다. 이러한 입자는 매우 짧은 고유 완화 시간을 가지므로, 잔류자기 측정에 사용하기 위한 필요를 충족시키지 못한다.
그러나, 공지된 분석 방법들은 다음과 같은 결점들을 갖는다:
- 동일 샘플 내에서 각종 분석물질들의 동시 측정 방법들은 각종의 방사성-, 형광- 또는 효소학적으로 표지된 프로브의 분석물질과의 결합에 기초한다. 이 경우, 분석물질의 정량적 측정을 위해 프로브의 결합되지 않은 또는 결합된 활성을 일반적으로 후속되는 분리 및 세척 후에 측정한다. 이 경우, 사용가능한 상이한 프로브 표지의 양은 매우 한정된다. 따라서, 예를 들면 프로브 표지화로서 상이한 방사성동위원소의 경우, 소위 중첩(overlapping) 현상이 일어나고, 이것은 개별 신호의 정량적 정확도의 급속한 손실을 야기시킨다. 프로브 표지로서 각종 효소의 조합은 필적할 만한 문제점을 야기시키고, 이에 의해 실행이 시스템 중에서 효소 반응들의 동시 측정을 가능하게 하는 반응 조건에 대한 연구 필요성에 의해 추가로 방해된다.
- 방법의 감응성은 예를 들면, 매트릭스와 프로브 사이의 비특이적 상호작용에 의해 또는 다르게는 프로브의 제한된 표지화능(저특이적 활성)에 의해 한정된다.
- 방법의 성공적인 실행은 종종 얻은 샘플 물질을 처리(예를 들면, 전혈로부터 혈청 또는 혈장의 제조, 유기 용제를 이용한 샘플의 추출, 크로마토그래피 방법을 사용하는 분석물질의 농축, 등)해야 할 필요가 있다.
- 방법들의 성공적인 실행을 위해서는, 결합된 및 결합되지 않은 수용체 또는 리간드의 분리를 보장하는 분리 및 세척 단계가 필수적이다.
- 방사성 면역분석법의 실행을 위해서는, 비용이 많이 들고 취급하기 힘든 방사 핵종의 사용이 필수적이다.
- 실제로, 사용된 마커는 (방사성면역분석법의 경우에서와 같이) 안정하지 않아서 항상 바로 제조되어야 하거나 또는 민감한 방식으로 환경적 영향과 반응하기 때문에 이들을 저장하는 것은 종종 문제를 야기한다.
그러므로 본 발명의 목적은 상기한 선행 기술보다 우수한 신규의 방법 및 물질을 발견하는 것이다.
이 목적은 본 발명에 의해 달성된다.
안정한 또는 준안정한 준강자성(ferrimagnetic) 또는 강자성(ferromagentic) 물질을 면역분석 또는 결합 분석에서 동정되는 자성 표지로서 사용하고, 샘플의 잔류 자기화를 측정 변수로서 측정하는 경우, 액체 및(또는) 고체 상 중에서의 분석물질의 정성적 및(또는) 정량적 검출이 가능함을 발견하였다.
이하, 공지된 방법들의 결점을 극복하는 방법을 먼저 설명한다.
본 발명에 따른 방법은 동정되어야 하는 물질(이하에서 분석물질이라고도함) 또는 구조 특이적 물질과 조합되는 콜로이드 준강자성 또는 강자성 물질(이하에서 자성 표지라고도 함)의 사용에 기초한다. 이러한 자성 표지와 분석물질 또는 구조 특이적 물질의 조합물은 이하에서 자성 마커라고도 한다. 콜로이드 물질이라는 용어는 콜로이드 크기 범위(즉, 1 nm 내지 최대 약 1000 nm) 내에 있는 물질 또는 입자의 크기 범위 및 대부분의 경우 수성인 적합한 분산 매질 중에서의 분산된 상으로서의 이들의 사용을 모두 설명하기 위한 것이다. 콜로이드 물질(이하에서 입자라고도 함)은 개선된 저장 수명 및 운반성을 위하여 건조된 형태나 동결된 형태로 존재할 수 있으나, 측정의 실시 동안에 이들은 일반적으로 액체 상의 분산 상태로 존재한다.
본 발명의 중요한 원리는 외부 자기장이 차단된 후 준강자성 또는 강자성 콜로이드 물질의 자기화의 시간 의존성이 물질 및 형태(사용된 입자 물질의 비등방성 상수), 사용된 입자의 부피 및 온도에 매우 민감한 방식으로 의존한다는 것이다. 이것은 입자 내에서의 내부 자기화 벡터의 회전에 의해 야기된다. 이러한 메카니즘은 니일리안 완화(Neelian relaxation)라 한다. 입자들의 자기화가 측정 시간 내에서 완화되는 경우, 그 초상자성은 내재적인 것이라 한다. 니일리안 완화 시간이 관찰 기간보다 상당히 긴 입자는 잔류자기 입자 또는 안정한 입자라 한다. 니일리안 완화 시간이 관찰 기간과 유사한 입자는 준안정한 입자라 한다.
본 발명의 다른 필수적인 원리는 자유로이 이동할 수 있는 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 콜로이드 입자 전체의 자기화가 외부 자기장이 끊어진 후에 제 2 메카니즘 때문에 측정 시간 내에서 완화된다는 것이다. 이 경우, 전체콜로이드 입자의 회전은 주변의 액체 내에서 일어나고, 이에 의해 시간 상수는 외피를 포함하는 입자의 유체 역학적 직경, 담체 액체의 점도 및 온도에 의존한다. 이들 파라미터는 주로 입자들의 환경에 의해 결정된다. 상기 메카니즘은 브라우니안(Brownian) 완화 또는 외성 초상자성이라 한다.
액체 및 고체 상 중에서의 분석물질을 정성적 및(또는) 정량적으로 검출하기 위한 본 발명의 방법은
i) 먼저 구조 특이적 물질을 준강자성 또는 강자성 물질로 표지시킨 다음,
ii) 이들 자기적으로 표지된 구조 특이적 물질을 측정하고자 하는 샘플 중에 사용하고,
iii) 외부로부터 인가되는 적합한 세기의 자기장의 도움으로 측정하고자 하는 샘플을 자기화시키고,
iv) 외부 자기장을 끊은 후 콜로이드 입자(자기 표지)의 자기화의 잔류자기를 자기장 센서의 도움으로 측정하고, 이에 의해 특이적 결합 및 그의 정도에 의해 발생하는 잔류자기를 분석에 사용함으로써 수행한다.
선행 기술의 방법에서는, 결합된 마커와 결합되지 않은 마커 사이의 판별은 예외적인 경우에서만 가능했으나, 본 발명의 방법에서는 액체 상 중에서의 결합되지 않은 자성 마커의 감퇴하는 잔류자기(즉, 외성 초상자성)를 사용함으로써 가능하다. 그러나, 결합된 자성 마커 전체는 입자 물질에 의존하는 측정가능한 잔류자기를 나타낸다. 따라서 측정하고자 하는 샘플의 잔류자기를 측정하는데 있어서, 결합된 자성 마커 부분만이 검출된다. 그러므로, 이 방법은 아래에서 결합 잔류자기 측정하기 또는 결합 잔류자기 측정이라 언급하고, 이는 결합된 구조 특이적 마커의 정량적 검출에 기초한다.
달리 말하면, (특이성을 부여하기 위한 목적으로 구조 특이적 물질과 조합되는)분석물질과 특이적으로 결합하는 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질만이 잔류자기를 야기시키는 반면, 샘플 중에 동시에 존재하는(또한 구조 특이적 물질과 조합되는) 과량의 결합되지 않은 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질의 자기화는 외성 초상자성에 의한 측정을 시작하기조차 전에 감퇴하기 때문에 분석물질의 측정을 비용이 많이 드는 분리 및 세척 단계 없이 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시태양에서, 상기 방법은 구조 특이적 물질 대신에, 예를 들면 경쟁적 방사성면역분석의 실행에서 종종 유사하게 사용되는 바와 같이, 분석물질 그 자체를 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질과 조합시키는 바와 같은 방식으로 변형된다. 이어서 구조 특이적 물질을 추가로 샘플에 첨가해야 한다.
그러나 방법은 또한 다중분석물질 분석법으로서 실행될 수 있고, 이것은 액체 또는 고체 중에서 몇가지 상이한 분석물질의 직접적인 동시 측정을 가능하게 한다. 이를 위하여, 먼저 충분히 분리된 보자력장 세기를 갖는 상이한 준강자성 또는 강자성 콜로이드 물질들로 분석물질을 표지시키는 것이 필요하다. 자성 마커의 결합 동안에, 자기화장(제1 자기화장)을 인가하고, 이것은 샘플 중에 함유된 모든 자성 마커가 그들의 단일 축을 따라 배향되도록 한다.
이어서, 샘플의 잔류자기를 측정한다. 추가의 단계에서는, 샘플을 자기 표지의 보자력장 세기에 맞춘 세기를 갖는 외부의 반대 장(제1 자기장과 반대로 흐름)으로 자기소거시킨다. 그 결과, 보자력장 세기가 인가된 자기화 장의 세기보다 작은 표지만을 특별히 재배향시키는 것이 항상 가능하다. 자기 소거의 각각의 단계 사이에서 샘플의 잔류자기를 다시 측정한다.
따라서 상이한 결합된 자성 마커 부분은 각 개별 자기소거 단계에서 샘플의 측정된 잔류자기에 기초하여 정량화할 수 있다.
이 방법은 샘플 당 수 개의 분석물질을 동시에 측정할 수 있도록 한다.
본 발명에 따른 방법 및 이들의 변형법은 수정률, 조직적합성, 알레르기학, 감염학, 위생학, 유전학, 바이러스학, 세균학, 독성학, 병리학, 환경 분석, 및 의학적 진단에 사용될 수 있다.
결합 잔류자기의 검출은 이러한 목적에 적합한 공지된 측정 장치, 예를 들면 초전도 양자 간섭 장치(Superconducting Quantum Interference Devices: SQUIDs)로 수행하고, 이에 의해 적합한 자기장의 도움으로 제1 자기화를 행하고, 이어서 자기장을 끊은 후 민감한 자기장 센서를 이용하여 자기화된 구조 특이적 물질의 잔류 자기 또는 이 잔류 자기에 의존하는 신호를 측정한다.
측정 동안에, 샘플은 유리하게 이동될 수 있다. 특히 유리한 것은 샘플의 진동 또는 회전에 의한 신호의 변조이다. 이것은 dc 측정 신호의 보다 높은 주파수 범위로의 변환을 가능하게 해 준다.
측정을 위해, 상기한 SQUIDs 외에 그라디오미터, 자속 자력계, 거대한 자기성 전기저항 센서 또는 자기성 전기저항 변환기로서 접속된 유도 코일도 사용할 수 있다.
dc 장을 측정할 수 있는 센서(예를 들면, SQUIDs, 자속자력계, 거대한 자기성 전기저항 센서 또는 자기성 전기저항 변환기)를 사용하면, 샘플을 자기화한 후 샘플을 움직이지 않고도 잔류자기를 측정할 수 있다.
적합한 측정 장치를 도 1에 예로서 도시한다. 상기 장치는 또한 하기 실시예에서도 사용하였다.
본 발명의 다른 면은 결합 잔류자기를 측정하기 위한 화합물에 관한 것이다. 적합한 화합물은 콜로이드성 현탁액, 준강자성 또는 강자성 물질 및 구조 특이적 물질 또는 분석물질로 이루어진다.
본 발명의 골격 이내에서, 구조 특이적 물질은 소정의 구조와 특이적으로 결합하는 모든 물질(예를 들면, 항체, 항체 단편, 비오틴), 또는 아비딘 또는 스트렙타비딘과 같은 비오틴과 특이적으로 결합하는 물질, 수용체와 특이적으로 결합하는 아고니스트(예를 들면 시토킨, 임포킨, 엔도텔린 또는 그들의 길항질), 특이적 펩티드 및 단백질, 수용체, 효소, 효소 기질, 뉴클레오티드, 리보핵산, 데옥시리보핵산, 탄수화물, 지단백질 등으로서 정의된다. 이들 중에서, 결합 상수가 105내지 1015(mol/l)-1의 범위인 물질, 특히 결합 상수가 107내지 1015(mol/l)-1의 범위인 물질이 바람직하다.
준강자성 또는 강자성 콜로이드성 물질로서는, 고유 니일리안 완화 시간이측정 시간보다 크거나 또는 동일하고, 따라서 안정하거나 또는 준안정한 모든 준강자성 또는 강자성 물질을 사용할 수 있다.
특히 적합한 것은, 완화 시간이 20 ℃에서 10-4초보다 긴 모든 준강자성 및 강자성 물질이다. 특히 적합한 것은 완화 시간이 1초보다 긴 모든 준강자성 및 강자성 물질이다.
준강자성 및 강자성 물질은 유리하게는 올리고머 또는 중합체 탄수화물, 단백질, 펩티드, 뉴클레오티드, 계면활성제, 합성 중합체 및(또는) 지질로 제조된 외피에 의해 안정화될 수 있다.
준강자성 및 강자성 물질의 입자 크기는 유리하게는 1 nm 내지 1000 nm이다. 특히 바람직한 것은 2 nm 내지 500 nm의 입자 크기이다.(입자 크기에 대한 값은 유체 역학적 직경에 관한 것이다).
준강자성 또는 강자성 물질로서는, 산화철(Fe3O4, γ-Fe2O3), 아철산바륨, 아철산스트론튬, 순수한 철, 이산화크롬, 니켈, 코발트, 및 망간, 구리, 니켈 또는 코발트 첨가제를 갖는 산화철로 이루어진 안정한 또는 준안정한 콜로이드 입자(예를 들면, DE 30 27 012 및 DE 41 16 093에 기재되어 있는 바와 같음)가 특히 적합하다.
안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질(이들은 구조 특이적 물질 또는 분석물질에 결합된다)로 이루어진, 본 발명에 사용될 수 있는 화합물의 제조는 면역화학, 펩티드 화학, 및 단백질 화학의 영역에서 친숙한 방법들에 의해 수행된다. 이 경우, 구조 특이적 물질 또는 분석물질은 공유 결합을 통해 준강자성 또는 강자성 물질의 안정화 외피를 형성하는 물질과 연결된다. 안정화 외피로서는, 예를 들면 탄수화물, 펩티드, 뉴클레오티드, 단백질, 지질, 계면활성제, 또는 중합체가 적합하다. 특히 적합한 연결 방법은 예를 들면 카르보디이미드를 사용하는 활성화 및 커플링[쟈코비(Jakoby) 및 윌첵(Wilchek) 편집, (1974) Methods Enzymol 34], 페리오데이트가 탄수화물을 함유하는 화합물 상에 작용한 후의 쉬프 염기의 형성(이후 좀 더 안정화시키기 위해 다시 환원할 수도 있다)[윌첵 및 바이엘(Bayer) 편집, Methods Enzym 184:177], 글루타릭 디알데히드를 사용하는 커플링[하이쯔만(Heitzmann) 및 리차드(Richards), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 71 (1974) 3537], 브로모아세틸화 입자의 티오릴화 물질과의 가교결합[앵거러(Angerer) 등, Cell 9 (1976) 81], 및 환원성 알킬화[바이엘 등, J. Histochem. Cytochem. (1976) 933]이다.
또한 준강자성 또는 강자성 콜로이드 입자는 입자 제조 후 입자를 임의적으로 다른 보조제, 예를 들면 단백질, 탄수화물 및 천연, 합성 또는 부분적으로 합성된 계면활성제의 존재 하에 구조 특이적 물질 또는 분석물질의 용액에 직접 투입하거나 또는 구조 특이적 물질 또는 분석물질의 존재 하에 직접 제조함으로써 구조 특이적 물질 또는 분석물질 그 자체로 이루어진 안정화 외피를 갖도록 제조할 수 있다.
다중분석물질 분석의 수행을 위하여, 몇가지 상이한 자성 마커들로 이루어진 화합물의 혼합물도 또한 사용할 수 있고, 이에 의해 상이한 자성 마커는 상이한 준강자성 또는 강자성 물질로 동정되어야 하는 상이한 구조 특이적 물질 또는 분석물질의 조합물로 이루어진다. 본 발명에 따른 상이한 자성 마커의 조합물의 이러한 사용 원리는 다양한 보자력장 세기(Hc)를 갖는 준강자성 또는 강자성 물질이 동정되어야 하는 각각의 구조 특이적 물질 또는 분석물질에 대한 자성 표지로서 사용된다는 것이고, 이에 의해 상이한 자성 표지에 대한 보자력장 세기(Hc) 및 잔류자기 자기화(MR)의 파라미터를 공지된 방식으로 미리 각각 측정할 수 있고, 따라서 이러한 파라미터들은 알려져 있다.
준강자성 또는 강자성 콜로이드 물질로 표지된 구조 특이적 물질은 건조된 형태(예를 들면 동결건조)로 존재할 수 있으며, 임의적으로 건조를 용이하게 하거나 또는 건조된 생성물(예를 들면, 동결건조물)의 안정성을 증가시키는 다른 보조제와 조합된 형태로 존재할 수 있다. 그러한 동결 전조물로부터 즉시 사용할 수 있는 제제의 제조는 사용하기 직전에 적절한 현탁액 매질 중에 재현탁함으로써 수행한다.
따라서 본 발명의 다른 면은 적합한 현탁액 매질 중에서의 결합 잔류자기 측정을 위한 제제를 함유하는 준강자성 또는 강자성 콜로이드 물질에 관한 것이다.
현탁액 매질로서는, 콜로이드 입자가 자유로이 이동할 수 있는 모든 액체가 적합하다. 분리 또는 세척 단계없이 측정을 수행할 경우, 사용되는 현탁액 매질의 점도는 현탁액 매질이 기본적으로 브라우니안 완화의 시간 상수를 결정하기 때문에, 준강자성 및 강자성 물질의 니일리안 완화 시간 및 측정 시간에 맞게 조절되어야 한다. 그렇지 않으면, 예를 들면 짧은 측정 시간(예를 들면, 외부 장이 끊어진 후 0.0001초)에서 매우 점성의 현탁액 매질(예를 들면, 80% 글리세롤) 중에서 짧은 완화 시간(예를 들면 0.01초)을 갖는 입자를 사용할 때, 브라우니안 완화(외성 초상자성)는 결합된 구조 특이적 마커와 결합되지 않은 구조 특이적 마커 사이에 더이상의 구별이 행해질 수 없을 정도로 느려질 수 있다. 100 mPas 미만의 점도를 갖는 현탁액 매질을 사용하는 것이 일반적으로 유리하다.
현탁액 매질로서는, 물, 계면활성 보조제(예를 들면 계면활성제 또는 올리고머 또는 중합체 탄수화물 및 단백질)의 수용액, 및 물과 알콜(예를 들면 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜)의 혼합물이 적합하고, 이에 의해 주사용으로 적합한 물이 바람직하다. 또한, 현탁액 매질은 삼투압을 변화시키는 보조제, 예를 들면 식염을 함유할 수 있다. 또한, pH를 결정하는 완충제 물질, 예를 들면 포스페이트를 함유할 수 있다.
본 발명의 다른 목적은 결합 잔류자기를 측정하기 위한 본 발명의 방법에서의 화합물의 용도이다.
물리적 메카니즘에 기초한 결합 동정화 때문에, 비특이적 측정 신호(매트릭스 현상)는 대부분 제외될 수 있다. 따라서 본 방법의 특이성은 단지 구조 특이적 물질의 "진정한" 특이성(항체의 교차 반응성, 리간드의 비특이적 결합)에만 의존한다.
본 발명의 방법의 높은 감응성 때문에, 다른 방법으로는 흔히 만나게 되는 결합 분석의 검출 한계 이하를 유지하기가 쉽다.
공지된 방법(JP-235774 및 WO 91/15243)과는 대조적으로, 본 발명의 방법에서는, 외부 자기화 장의 존재 하에 정자기화를 측정하는 것이 아니라, 오히려 자기화 장의 부재하에 결합 잔류자기 또는 이에 의존하는 신호를 측정한다. 마커의 결합 상태에 관한 데이터는 오직 이러한 방식만으로 얻을 수 있다.
또한, 이것은 측정 신호가 반자성 또는 상자성 성분 또는 오염물에 의해 영향받지 않도록 하고, 이것은 측정 감응성을 더욱 증가시키는 것을 돕는다.
추가적으로, 본 발명의 결합 잔류자기 측정 방법은 준강자성 또는 강자성 물질의 보유 부위를 생체내에서 확인하는데 사용할 수 있다. 이 경우, 준강자성 또는 강자성 물질을 사용하여 결합 잔류자기를 측정할 수 있고 따라서 특히 인체 내에 방사능 동위원소의 위험한 사용을 피할 수 있다는 것이 특히 유리하고, 이에 의해 본 발명의 방법의 감응성은 흔히 사용되는 감마 신티그래피 또는 양전자 방출 토모그래피의 핵-의약 방법의 감응성에 도달한다. 게다가, 결합되지 않은 마커는(방사진단 방법과는 대조적으로) 임의의 "간섭 신호"를 야기시키지 않고, 따라서 특이적으로 결합된 마커의 검출이 영향을 받지 않기 때문에, 혈액 중에 순환하는 결합되지 않은 마커의 선행 분리가 필요하지 않다.
본 발명에 따라, 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질의 현탁액을 환자에 투여한다. 국소 투여, 경구 투여 및 모든 형태의 비경구 투여가 투여 방법으로서 적합하다. 특히 적합한 것은 혈관내 투여 형태이다.
콜로이드 물질은 유기체 중에서 분산되고, 이에 의해 체내에서의 분산 패턴은 투여 방법 및 각종의 다른 약물운동학적 파라미터에 의해 영향을 받는다. 체내의 병리학적 상태를 측정하기 위하여 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질의 투여 후, 상이한 시간에 결합 잔류자기의 부위 분할된 측정을 사용할 수 있고, 체내의 병리학적 상태는 비정상적인 농도 또는 농도의 결핍에 의해 특징지어진다.
인체 내의 병리학적 구조를 가시화하기 위해서는, 구조 특이적 물질과 결합된 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질(자성 마커)의 사용이 특히 유리할 수 있다. 여기서, 병리학적 구조에 대한 자성 마커의 특이적 결합은 특별한 신호를 야기시키고, 이것은 결합 분석법을 실행하기 위해 설명된 결합 잔류자기 방법으로 본 발명에 따라 생체내에서 측정될 수 있다.
본 발명에 따른 결합 잔류자기 측정 방법과 함께 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질의 사용의 예로서, 종양 특이적 자성 마커를 사용하여 체내의 종양을 검출하는 것을 언급할 수 있다. 종양 특이적 마커는 예를 들면 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질과 종양 특이적 물질, 예를 들면 항체, 항체 단편, 펩티드, 수용체, 단백질, 핵산, 올리고뉴클레오티드 및 단량체, 올리고머, 또는 중합체 탄수화물의 조합물일 수 있다.
가능한 응용분야의 다른 예는 혈병, 동맥경화 플라크, 종양성 반응 및 류머티스성 또는 류머티스 변형의 가시화이고, 이에 의해 각 경우 각각의 병리학적 구조에 특이적인 물질과 본 발명에 따른 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질의 조합물을 자성 마커로서 사용하는 것이 유리하다.
인체에 투여한 안정한 또는 준안정한 자성 마커의 공간적 분포의 생체내 측정을 2가지 변형법에 따른 본 발명에 따라 수행한다:
1. 유리한 신체 영역 중에서 가능한 한 균질한 자기장을 생성시키고, 자기장을 끊고, 예를 들면 생체자성 시험[드렁(D. Drung), IEEE Trans. Appl. Supercond., 5 (1995) 2112-2117]에 사용된 바와 같이, SQUID-다중채널 센서를 사용하여 결합 잔류자기의 공간적 분포를 측정한다. 이 센서는 가능한 한 완전히 측정 물체를 감싸야 한다. 충분한 측정 정보를 제공하기 위하여, 측정 물체의 연속적인 재스터링으로 재측정하는 것이 유리하다.
2. 공간적으로 한정된 국소 장을 연속적으로 생성시키고, 장을 끊고, 단일 채널 센서를 사용하여 공간적인 결합 잔류자기를 측정한다. 다중채널 센서의 사용도 또한 가능하다.
2가지 방법의 경우에 있어서, 최대의 정보가 수집될 수 있도록 측정 물체의 자기화 및 생성된 자기장의 측정 모두를 3개의 모든 공간상의 방향에서 행하는 것이 바람직하다.
측정 데이타의 평가는 적절한 근사법을 사용하여 수행할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 자성 이중극자, 다중극자 또는 다중-이중극자의 모델을 출발지점으로서 취할 수 있다. 이어서 모델의 특별한 파라미터, 특히 이중극자 또는 다중극자의 위치를 근사법을 사용하여 찾아내는데, 이것은 측정 데이타와 모델 파라미터 사이의 편차를 최소화시킨다. 자기화된 입자의 공간적인 분포는 당업계에 공지된 방식으로 이들 파라미터로부터 결정할 수 있다.
유사한 방법이 공지되어 있고, 생체전기 전류의 자기장을 분석하는데 있어서그 자체로서 증명되었다.
생체내에서 결합 잔류자기를 측정하기 위하여, 기본적으로 시험관내 시험에서 사용한 것과 동일한 물질 또는 이들로부터 제조된 제제가 적합하다.
생체내 적용에 특히 적합한 것은 생분해성이고 생체 적합성인 자성 표지이다. 이것은 망간 또는 코발트와 산화철의 조합물 또는 산화철로 이루어진 자성 표지의 경우 특히 그러하다. 공지된 방법에 따라 구조 특이적 물질이 결합할 수 있는 자성 입자들은, 예를 들면 핵 회전 토모그래피에서 사용하고 이 입자들은 WO 92/12735, WO 92/22586 및 EP 0 186 616에 기술되어 있다. 따라서 본 발명의 다른 면은 결합 잔류자기를 측정하기 위하여 생체내 방법에 자성 표지를 사용하는 것에 관한 것이다.
결합 잔류자기 측정의 생체내 적용과 관련하여, 구조 특이적 물질은 특히 확인되어야 하는 인체 구조에 특이적으로 결합하는 모든 물질로서 정의된다. 특히 적합한 것은 항체, 항체 단편, 수용체와 특이적으로 결합하는 작동질, 또는 그들의 길항질, 특이적 펩티드 및 단백질, 수용체, 효소, 효소 기질, 뉴클레오티드, 리보핵산, 데옥시리보핵산, 탄수화물, 또는 지단백질이다. 수용체와 결합하는 작동질 중에서는, 특히 시토킨, 임포킨 또는 엔도텔린이 적합하다.
결합 상수가 105내지 1015(mol/l)-1의 범위인 모든 구조 특이적 물질이 매우 적합하다. 결합 상수가 107내지 1015(mol/l)-1의 범위인 모든 구조 특이적 물질이 특히 바람직하다.
하기의 실시예를 사용하여 본 발명의 목적을 보다 상세히 설명하고자 하나 본 발명은 이 실시예들로 한정되지 않는다.
실시예 1
이하에서 안티콜라겐 III으로 언급되는 콜라겐 III에 대한 단일클론 항체 100 ㎍을 0.1M 중탄산나트륨 용액 500 ㎕ 중에 용해시켰다. 1 mol Fe/ℓ 및 약 40 nm의 입자 크기(유체 역학적 직경)를 갖는 덱스트란 코팅된 마그네타이트 현탁액[메이토 산교(Meito Sangyo)] 1 ㎖를 세파덱스(Sephadex) 컬럼[파르마시아(Pharmacia) PD 10] 상에서 0.1 M 중탄산나트륨으로 완충시켰다. 10 mmol 소듐 페리오데이트 용액 0.5 ㎖를 현탁액에 첨가하였다. 용액을 어둠 속에서 2시간 동안 정치시켰다. 이어서, PD 10 상에서 0.1 M 중탄산나트륨 용액으로 용출시켰다. 안티콜라겐 III 용액을 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 어둠 속에서 4 ℃에서 3시간 동안 정치시켰다. 이어서, NaBH45 mg을 고상물로서 첨가하고, 간략하게 소용돌이시켰다. 혼합물을 어둠 속에서 4 ℃에서 8시간 동안 정치시켰다. 이어서, 마그네타이트 표지화된 안티콜라겐 III(이하에서 mag-안티콜라겐 III으로 언급함)을 PD 10 컬럼을 통해 포스페이트 완충된 식염 용액(PBS, pH 7.4)으로 용출시켰다.
완충제[포스페이트 완충된 식염 용액(PBS)] 200 ㎕ 중의 콜라겐 III 5 μg의 용액을 폴리스티렌 샘플링 용기 중에서 배양시켰다.(이 경우에 샘플링 용기는 고체상으로서 제공되고, 여기에 콜라겐 일부분이 부착된다). 이어서 액체 상을 버렸다. 샘플링 용기를 0.1% 트윈(Tween)(등록상표) 20을 함유하는 포스페이트 완충된 식염 용액(이하, PBST로서 언급함)으로 3회 플러슁시키고, 부착되지 않은 콜라겐을 세척해냈다. 샘플링 용기 중에서, PBST 200 ㎕ 중에 용해시킨 mag-안티콜라겐 III 5 ㎕를 이어서 첨가하였다. 이것을 상온에서 약 1시간 동안 배양하였다. 이어서, 샘플을 자기적으로 차폐된 방에서 SQUID 검출기 아래 4 cm에서 2 mT의 세기를 갖는 장으로 자기화시켰다. 자기장을 끊은 후, 샘플을 측정하였다. 이를 위하여, 샘플을 측정 동안에 자기화 코일로부터 제거하였다. 측정하는 장으로부터 샘플을 제거하기 전 및 후에, 자기장을 끊은 후의 측정된 자기 플럭스 밀도의 차이로부터 잔류자기가 생성되었다. 본 실시예의 경우, 잔류자기를 발견하였다.
실시예 2
pH 7.4의 PBS 완충제 200 ㎕ 중의 콜라겐 V 5 ㎍의 용액을 폴리스티렌으로 만들어진 샘플링 용기 중에서 배양시켰다. 이어서 액체 상을 버렸다. 샘플링 용기를 pH 7.4의 PBST 세척 완충제로 3회 플러슁시켰다. PBST 200 ㎕ 중의, 실시예 1에 따라 제조된 mag-안티콜라겐 III 5 ㎕를 샘플에 첨가하였다. 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 이어서, 샘플을 자기적으로 차폐된 방에서 SQUID 검출기 아래 4 cm에서 2 mT의 세기를 갖는 장으로 자기화시켰다(도 1 참조). 자기장을 끊은 후, 샘플을 측정하였다. 이를 위하여, 샘플을 측정 동안에 자기화 코일로부터 제거하였다. 콜라겐 V를 함유하는 샘플에서는 잔류자기가 검출될 수 없었다.
실시예 3
PBS(pH 7.4) 중의 1.9 mg/㎖ 콜라겐 III 용액 10 ㎖로부터, 하기하는 각각의 희석액 5 ㎖를 제조하였다:
1,000 ng/㎖, 100 ng/㎖, 10 ng/㎖
각 경우, 각 희석액으로부터 1 ㎖를 폴리스티렌 튜브(2.5 ㎖ 용량)로 피펫팅하였다. 3개의 샘플 튜브를 37 ℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 이어서, 튜브의 내용물을 버렸다. 튜브를 각각 PBST 1 ㎖로 3회 세척하였다.
실시예 1에 따라 제조된 마그네타이트 표지시킨 항체의 1:100 희석액 1 ㎖를 각 튜브에 첨가하였다. 튜브를 실온에서 1시간 동안 정치시켰다. 이어서, 샘플을 도 1에 개략화한 측정 배치로 자기화시키고(2 mT), 자기장을 끊은 후, 샘플을 측정하였다. 이를 위하여, 샘플을 측정 동안에 자기화 코일로부터 제거하였다. 측정된 신호의 평가는 결합 잔류자기의 척도이고, 도 2에 나타낸 관계를 생성시킨다.

Claims (35)

  1. 고유 니일리안 완화 시간이 측정 시간보다 큰 안정한 또는 준안정한 준강자성(ferrimagnetic) 또는 강자성(ferromagnetic) 물질을 면역분석 또는 다른 결합분석에서 확인되어야 하는 자성 표지로서 사용하고, 샘플의 잔류자기화를 측정 변수로서 측정하는 것을 특징으로 하는, 액체 또는 고체상 중의 분석물질의 정성적 또는 정량적 검출 방법.
  2. 측정 시간에 결합된 자성 마커 전체가 샘플의 잔류 자기화를 생성시키는 반면, 측정 시간에 샘플 중에 존재하는 결합되지 않은 자성 마커의 자기화가 전체적으로 외성 초상자성 때문에 감퇴하는, 면역분석 또는 다른 결합분석에서의 분석물질의 정성적 또는 정량적 검출 방법.
  3. (i) 먼저 구조 특이적 물질을 준강자성 또는 강자성 물질로 표지시킨 다음,
    (ii) 이들 자기적으로 표지된 구조 특이적 물질을 측정하고자 하는 샘플 중에 사용하고,
    (iii) 외부로부터 인가되는 적합한 세기의 자기장의 도움으로 측정하고자 하는 샘플을 자기화시키고,
    (iv) 외부 자기장을 끊은 후, 콜로이드 입자의 자기화의 잔류자기를 자기장 센서의 도움으로 측정하고, 이에 의해 특이적 결합 및 그의 정도에 의해 발생하는잔류자기를 분석에 사용하는, 액체 또는 고체상 중의 분석물질의 정성적 또는 정량적 검출 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 구조 특이적 물질 대신에, 확인되어야 하는 분석물질을 준강자성 또는 강자성 물질로 표지시키고, 구조 특이적 물질을 측정하고자 하는 샘플에 첨가하는 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 구조 특이적 물질이 항체, 항체 단편, 비오틴, 또는 비오틴과 특이적으로 결합하는 물질, 수용체와 특이적으로 결합하는 작동질, 또는 그들의 길항질, 특이적 펩티드 및 단백질, 수용체, 효소, 효소 기질, 뉴클레오티드, 리보핵산, 데옥시리보핵산, 탄수화물, 또는 지단백질인 방법.
  6. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 구조 특이적 물질이 105내지 1015(mol/l)-1의 범위의 결합 상수를 갖는 방법.
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 구조 특이적 물질이 107내지 1015(mol/l)-1의 범위의 결합 상수를 갖는 방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 측정 동안에 이동하여 샘플 신호가 변조되는 방법.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 그라디오미터, 자속 자력계, 거대한 자기성 전기저항 센서 또는 자기성 전기저항 변환기로서 접속된 유도 코일을 자기장 센서로서 사용하는 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, SQUIDs(Superconducting Quantum Interference Devices: 초전도 양자 간섭장치)를 자기장 센서로서 사용하는 방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 측정하고자 하는 샘플의 단계별 자기화로 액체 또는 고체 물질 중의 몇가지 상이한 분석물질의 동시 측정을 수행하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 분석물질의 동시 정량적 측정을 위하여, 별도의 보자력장 세기를 갖는 상이한 준강자성 또는 강자성 물질을 사용하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 사용된 준강자성 및 강자성 물질의 니일리안 완화 시간이 20 ℃에서 10-4초보다 긴 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 사용된 준강자성 및 강자성 물질의 니일리안 완화 시간이 20 ℃에서 1초보다 긴 방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 준강자성 및 강자성 물질이 1 내지 1000 nm 범위의 입자 크기를 갖는 방법.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 준강자성 및 강자성 물질이 2 내지 500 nm 범위의 입자 크기를 갖는 방법.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 준강자성 및 강자성 물질이 올리고머 또는 중합체 탄수화물, 단백질, 펩티드, 뉴클레오티드, 계면활성제, 합성 중합체 및 지질로부터 선택되는 일종 이상의 화합물들로 만들어진 외피로 안정화된 방법.
  18. 구조 특이적 물질과 안정한 또는 준안정한 준강자성 또는 강자성 물질의 조합물로 이루어진, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 준강자성 및 강자성 입자가 10-4초보다 긴 니일리안 완화 시간을 갖는 화합물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 준강자성 및 강자성 입자가 1초보다 긴 니일리안 완화 시간을 갖는 화합물.
  21. 제18항에 있어서, 상기 구조 특이적 물질이 항체, 항체 단편, 수용체와 특이적으로 결합하는 작동질, 시토킨, 임포킨, 엔도텔린 또는 그들의 길항질, 다른 특이적 펩티드 및 단백질, 수용체, 효소, 효소 기질, 뉴클레오티드, 리보핵산, 데옥시리보핵산, 탄수화물, 또는 지단백질인 화합물.
  22. 제18항에 있어서, 상기 준강자성 또는 강자성 물질이 산화철, 아철산바륨, 아철산스트론튬, 순수한 철, 이산화크롬, 니켈, 코발트, 및 망간, 구리, 니켈 또는 코발트 첨가제를 갖는 산화철로 이루어진 안정한 또는 준안정한 콜로이드 입자인 화합물.
  23. 각종의 보자력장 세기를 갖는 상이한 준강자성 또는 강자성 물질을 함유하는, 제11항 또는 제12항에 따른 방법에 사용하기 위한 제제.
  24. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 수정률, 조직적합성, 알레르기학, 감염학, 위생학, 유전학, 바이러스학, 세균학, 독성학, 병리학 또는 환경 분석에 사용되는 것인 방법.
  25. 자기장이 끊어진 후에 준강자성 또는 강자성 물질의 자기화의 잔류자기를 측정하는, 인체를 제외한 유기체내로 도입되거나 또는 인체를 제외한 유기체 상에 가해진 준강자성 또는 강자성 물질의 검출 방법.
  26. (i) 먼저 구조 특이적 물질을 준강자성 또는 강자성 물질로 표지시킨 다음,
    (ii) 이들 자성 표지된 구조 특이적 물질을 살아있는 유기체 내로 도입시키거나 또는 유기체에 가하고,
    (iii) 외부로부터 인가되는 자기장의 도움으로 유리한 부피의 유기체를 자기화시키고,
    (iv) 외부 자기장을 끊은 후, 자기장 센서의 도움으로 자성 마커의 자기화의 잔류자기를 측정하는 것을 특징으로 하는, 인체를 제외한 유기체내로 도입되거나 또는 인체를 제외한 유기체 상에 가해진 준강자성 또는 강자성 물질의 검출 방법.
  27. 제26항에 있어서, 항체, 항체 단편, 수용체와 특이적으로 결합하는 작동질, 또는 그들의 길항질, 특이적 펩티드 및 단백질, 수용체, 효소, 효소 기질, 뉴클레오티드, 리보핵산, 데옥시리보핵산, 탄수화물, 또는 지단백질을 구조 특이적 물질로서 사용한 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 수용체와 특이적으로 결합하는 작동질 또는 길항질이 시토킨, 임포킨, 엔도텔린 또는 그들의 길항질인 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 구조 특이적 물질이 105내지 1015(mol/l)-1의 범위의 결합 상수를 갖는 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 구조 특이적 물질이 107내지 1015(mol/l)-1의 범위의 결합 상수를 갖는 방법.
  31. 제25항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 초전도 양자 간섭 장치(SQUIDs), 유도 코일, 자속 자력계, 거대한 자기성 전기저항 센서 또는 자기성 전기저항 변환기를 자기장 센서로서 사용하는 방법.
  32. 구조 특이적 물질과 상이한 준강자성 또는 강자성 물질의 혼합물을 함유하는, 제26항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 제제.
  33. 준강자성 또는 강자성 물질의 니일리안 완화 시간이 37 ℃에서 10-4초보다긴, 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 화합물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 준강자성 또는 강자성 물질의 니일리안 완화 시간이 37 ℃에서 1초보다 긴 화합물.
  35. 제33항 또는 제34항에 있어서, 상기 준강자성 및 강자성 물질이 산화철, 또는 망간, 구리, 니켈 또는 코발트 첨가제를 포함하는 산화철인 화합물.
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