JP5059730B2 - 超高感度磁力減少測定システムおよびこれを用いた超高感度、洗浄不要の測定方法 - Google Patents
超高感度磁力減少測定システムおよびこれを用いた超高感度、洗浄不要の測定方法 Download PDFInfo
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Description
MRAにおいては、親水性界面活性剤と生体レセプターとで被覆し、均一に分散した磁性ナノ粒子を有する溶液である磁気試薬をまず用意する。当該試薬の調製は、磁性ナノ粒子の表面を界面活性剤で被覆するために、主に磁性ナノ粒子を界面活性剤溶液中で混合することを備える。次いで、生体レセプターを当該溶液に添加し、磁性ナノ粒子の表面上で界面活性剤と結合させる。当該生体レセプターとしては、例えば抗体または抗原が挙げられ、これはモノクローナルまたはポリクローナルとすることができる。外部多重交流磁界下で、磁性ナノ粒子が磁気相互作用を介して振動する。外部多重交流界下の磁気試薬は、多周波数交流磁化率χacとして既知の磁気特性を明示する。
試料の交流磁気信号をMRAで検出するので、超高感度のセンサーを用いて交流磁気信号を探査するか、又は検出すべき交流磁気信号を強化することによって生体分子を検出する際の感度を助成することができる。超電導量子干渉デバイス(SQUID)がMRAシステムにおけるセンサーとして期待の候補であることを示す。
次の開示は、種々のタイプの生体標的の測定に対する本発明の磁束移送を有する高TcSQUID系MRAシステムの適用例である。本発明の一態様によれば、ヒトC反応性タンパク質(CRP、分子量=116.67KDa)やヒト凝固因子IX(F9、分子量=36.56KDa)のような「大きな」生体標的に対する本発明のSQUID系MRAシステムの典型的測定仕様を検討する。CRPを磁気的に標識するために、ポリクローナル抗ヤギCRPを磁性ナノ粒子上に被覆する一方、F9を磁気的に標識するために、モノクローナル抗マウスF9を磁性ナノ粒子上に被覆する。従って、検出すべきCRPは多重活性エピトープとして機能し、一方F9は単一活性エピトープとして機能する。本発明の別の態様によれば、例えばロイコマラカイトグリーン(LMG、分子量=26.3Da)のような「小さな」生体標的に対する本発明のSQUID系MRAシステムの典型的測定仕様も検討する。小さなサイズのため、小分子が会合後抗体によってほぼ完全に覆われる。すなわち、各小分子が一旦抗体に抱合されると、他の抗体と結合するために得ることができる小分子上の他のエピトープがない。従って、小分子はその構造により効果的な単一活性エピトープ分子である。本発明の高TcSQUID系MRAシステムを用いた多重活性エピトープ分子、単一活性エピトープ分子および小分子に対する当該発明の洗浄不要磁力減少測定を介した超高感度免疫の特徴をより良好に示すため、MRA結果をELISAから得たデータと比較する。
リン酸緩衝食塩水(PBS)溶液中に分散させた磁性ナノ粒子を、デキストラン(GABC社製)のような親水性界面活性剤で被覆する。親水性界面活性剤の他の種類、例えばプロテインG、プロテインA,リポソームまたは有機酸を適用してもよい。当該界面活性剤はPBS溶液中での磁性ナノ粒子の分散を助けるか、或いはまた生体レセプターのナノ粒子表面への結合を改善する。磁性ナノ粒子のコアの材料としては、例えばFe3O4が挙げられる。しかしながら、MnFe2O4、Fe2O3、NiFe2O4、またはCoFe2O4を含む他の材料も磁性ナノ粒子の物質として適用可能で、本発明の範囲内に包含されると言及すべきである。磁力顕微鏡(MFM)を用いることによって、磁性ナノ粒子の形態を詳細に調べる。MFMによって撮影した磁性ナノ粒子の代表的な画像を図4(a)に示す。濃い点が個々の磁性ナノ粒子に対応する。大量、例えば200以上の磁性ナノ粒子の分析を介して、図4(b)に描くような磁性ナノ粒子の直径分布を得る。図4(b)のガイドラインはガウス分布に従う。図4(b)の結果によれば、磁性ナノ粒子の直径における平均値および標準偏差は、それぞれ29.3nmおよび1.4nmである。以下の測定に用いた磁性ナノ粒子の平均直径は約5nmから約700nmの範囲である。
種々の磁気試薬(それぞれポリクローナル抗ヤギCRP被覆の磁性ナノ粒子の溶液、モノクローナル抗マウスF9被覆の磁性ナノ粒子の溶液、抗ウサギLMG被覆の磁性ナノ粒子の溶液)の100μLの交流磁化率χacスペクトルを、SQUID系MRAシステムを用いて測定する。次いで、各磁気試薬を、それぞれ種々の量のヒトCRP(シグマ、C4063)またはF9(アブノヴァ)若しくはLMG(グリコネックス社製)の20μL溶液と混合して混合物溶液を形成する。CRP抗ヤギCRP(またはF9モノクローナル抗マウスF9若しくはLMG抗ウサギLMG)の免疫錯体の種々の濃度を培養後に混合物溶液で発現する。その後、免疫錯体を有する各混合物溶液のχacスペクトルを、SQUID系MRAシステムを用いることにより分析する。所定周波数でのχacの減少を種々の濃度のCRP(またはF9若しくはLMG)で混合した各試薬溶液について観察する。従って、χacの減少とCRP(またはF9若しくはLMG)の濃度との間の関係が成り立つ。
市販のサンドイッチELISA測定キット(アノゲン、EL 10022)を、ヒトCRPのような巨大分子の定量的検出に用いる。測定手順をここに簡潔に述べる。100μLのヒトCRPを、抗体で予備被覆したプレートを底面に設けたELISAプレートに添加する。ウェルをプラスチックカバーで覆い、CRP抗体免疫錯体を30分間培養する。ウェルを洗浄緩衝液で満たし、溶液を該ウェルから注出することにより、当該溶液を除去する。洗浄処理を4回以上繰り返す。最終洗浄後、プレートを反転させ、明白な湿分がなくなるまで吸収紙上でたたくことにより該プレートをさらに乾燥する。しかる後、100μLのHRP(西洋ワサビパーオキシド)抱合標識化溶液をウェルに分注し、次いで抗体CRP標識免疫錯体を30分間培養する。次いで、蛍光発生基質溶液100μLをウェルに添加して15分間蛍光を活性化させ、続いて停止液100μLをウェルに添加する。最後に、蛍光の光学密度をELISA読み取り装置(シナジー HT)で測定する。
超高感度のSQUID系MRAシステムと、従来のELISAとにより測定したCRPに対する結果を以下に要約する。CRPは人体が損傷もしくは感染したときに発現する。従って、血清中のCRP濃度は、診療所における感染疾患を診断するための代表的な指標である。交流(ac)磁化率減少に基づく磁気検出の詳細なメカニズムは、先行米国特許出願第11/164,275号明細書に議論されており、ここに参照して援用する。
100b:センサーユニット
101、102:励起コイル
103、104:関数発生器
105:試料
106:ピックアップコイル
107:結合コイル
108:スポンジ
109:高遷移温度(高Tc)rf(無線周波数)SQUID磁力計
110:デュワー
111:液体窒素
112:磁気シールドボックス
113:rfシールド室
114:スポンジ
115:SQUID電子機器
116:読み出し電子機器
Claims (19)
- 検体中の生体標的の濃度を測定することができる超高感度磁力減少測定システムであって、当該生体標的が多重活性エピトープ生体分子または単一活性エピトープ生体分子からなり、
異なる周波数を有する2つの交流励起磁界を与えるように、2つの独立した関数発生器により駆動する、少なくとも2つの励磁コイルと、少なくとも生体レセプターで被覆された磁性ナノ粒子を含む試料を収容し、かつ該試料から誘導された磁束を感知するピックアップコイルとからなる試料ユニットと、
磁気センサーと、前記ピックアップコイルに接続した結合コイルとからなるセンサーユニットとを備え、
前記試料ユニットのピックアップコイルによって感知した試料の誘導磁束を前記結合コイルを介して前記センサーユニットの磁気センサーに移送し、
前記試料が前記生体標的を含む検体からなる場合にも、当該生体標的が生体レセプターで抱合され、
前記試料の交流磁化率(χ ac,φ )を測定し、かつ前記試料の交流磁化率減少(Δχ ac,φ )を決定し、当該試料の交流磁化率減少をΔχ ac,φ ≡(χ ac,0 −χ ac,φ )として定義し、ここでχ ac,0 が遊離した非抱合磁性ナノ粒子の交流磁化率であり、Δχ ac,φ が生体標的の濃度に比例することを特徴とする超高感度磁力減少測定システム。 - 前記磁性ナノ粒子を親水性界面活性剤で被覆し、前記生体レセプターを当該親水性界面活性剤に結合する請求項1に記載のシステム。
- 前記生体レセプターが抗体または抗原からなる請求項1に記載のシステム。
- 前記単一活性エピトープ生体分子が小生体分子も含み、当該小生体分子を前記生体レセプターで抱合する際、小生体分子のそれぞれが一つの生体レセプターのみによって実質的に覆われる請求項1に記載のシステム。
- パラメータΔχac,φ/χac,0を前記生体標的の濃度に関する指標として定義し、当該パラメータΔχac,φ/χac,0をΔχac,φ/χac,0≡(χac,0−χac,φ)/χac,0として定義する請求項1に記載のシステム。
- 前記試料の交流磁化率減少Δχac,φと、調節された溶液中における前記生体標的の種々の既知濃度との間の特性曲線を確立し、検体中の生体標的の濃度を該特性曲線に従って決定する請求項5に記載のシステム。
- 前記磁気センサーが超電導量子干渉素子(SQUID)磁力計または磁場勾配計を備える請求項1に記載のシステム。
- 試料溶液における生体分子の濃度を定量的に決定するための超高感度方法であって、
磁性ナノ粒子を含む試薬を用意し;
当該試薬の交流磁化率(χac,0)を測定し;
当該試薬を多重活性エピトープ生体分子または単一活性エピトープ生体分子からなる生体分子を含む試料溶液と混合し、ここで前記磁性ナノ粒子を前記生体分子で会合し;
前記生体分子での会合後の前記試薬の交流磁化率(χac,φ)を測定し;
前記生体分子での会合前後での前記試薬の交流磁化率における差異(Δχac,φ)を計算し、ここでΔχac,φ≡(χac,0−χac,φ)とすることを備える生体分子濃度の決定方法。 - 前記磁性ナノ粒子を緩衝溶液中で懸濁することによって前記試薬を形成し、当該磁性ナノ粒子を親水性界面活性剤で被覆し、かつ生体レセプターを当該親水性界面活性剤に結合する請求項8に記載の方法。
- 前記生体分子を前記生体レセプターで抱合する請求項9に記載の方法。
- 前記単一活性エピトープ生体分子が小生体分子も含み、当該小生体分子を前記生体レセプターで抱合する際、小生体分子のそれぞれが一つ生体レセプターのみによって実質的に覆われる請求項9に記載の方法。
- 前記磁性ナノ粒子をFe2O3、Fe3O4、MnFe2O4、NiFe2O4およびCoFe2O4からなる群より選択する請求項9に記載の方法。
- 前記親水性界面活性剤をデキストラン、プロテインG、プロテインA、リポソームおよび有機酸からなる群より選択する請求項9に記載の方法。
- 前記生体レセプターが抗体または抗原からなる請求項8に記載の方法。
- 前記試薬の交流磁化率における差異(Δχac,φ)と、調節された試料中における生体分子の種々の既知濃度との間の標準化特性曲線を確立し;
当該標準化特性曲線に従って試料溶液中の生体分子の濃度を決定すること
をさらに備える請求項8に記載の方法。 - パラメータΔχac,φ/χac,0を前記生体分子の濃度に関する指標として用い、当該パラメータΔχac,φ/χac,0をΔχac,φ/χac,0≡(χac,0−χac,φ)/χac,0として
定義する請求項8に記載の方法。 - Δχac,φ/χac,0と、調節された溶液中における生体分子の種々の既知濃度との間の標準化特性曲線を確立し;
試料溶液中の生体分子の濃度を当該標準化特性曲線に従って決定することをさらに備える請求項16に記載の方法。 - 前記生体分子との会合後の前記磁気試薬の交流磁化率(χac,φ)を、遊離した非抱合生体分子を除去することなく測定する請求項8に記載の方法。
- 前記試薬の交流磁化率を磁力減少測定システムによって測定し、
当該システムが前記試薬を試料溶液とともにまたは試料溶液なしに収容し、可変磁束を当該試薬に供給し、該試薬から誘導された磁束を検出するための磁束供給ユニット;
前記磁束供給ユニットからのある部位に位置し、少なくとも誘導磁束を感知するための
SQUIDを備える磁束読み取りユニット;および
前記部位で前記試薬の誘導磁束を前記SQUIDに移送するための磁界移送ユニットを備える請求項8に記載の方法。
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