JPH03220442A - 磁気微粒子の粒度測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野〕 本発明は、磁気微粒子の粒度測定方法及びそれを利用す
る抗原又は抗体の濃度測定方法に関する。

〔従来の技術〕

従来、懸濁液中の微粒子の粒度測定は、ミクロンサイズ
を超える微粒子の場合には沈降法、慣性法等が用いられ
ているが、サブミクロンサイズの微粒子の場合には光散
乱法が用いられており、レーザー光等を照射したときの
光散乱の角度及び散乱光の強度を光学的に測定する方法
等が知られている。

また、従来、液体試料中の抗原又は抗体の濃度を測定す
る代表的な方法としては、レーザーネフェロメトリー、
ラテックス比濁法、エンザイムイムノアッセイ、ラジオ
イムノアッセイ等が知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし、前記の微粒子の濃度測定方法は、試料液中に他
の共存物質が存在して光の吸収、散乱が起こる場合には
正確な測定を行うことができず、測定の感度、精度とも
大幅に低下するという問題がある。そのため、測定用の
試料の調製には、そのような共存物質を予め除去する必
要があった。

また、微粒子表面の凹凸によって光散乱の状態が変わる
ため測定結果が影響を受けるという欠点もあった。

また、前記の抗原又は抗体の濃度測定方法には、光学的
測定では前記同様に共存物質の影響を受けること、エン
ザイムイムノアッセイでは酵素活性の安定性という困難
な要求があること、そしてラジオイムノアッセイでは放
射性物質を用いる危険性が伴うという問題があった。

そこで、本発明の課題は、共存物質が試料液中に共存し
ていても何らそれらに影響されず、しかも粒子表面の凹
凸などの表面状態による測定誤差が少ない、高感度、高
精度の測定を行うことができる磁気微粒子の粒度測定方
法を提供することにある。

本発明の別の課題は、前記の従来の抗原又は抗体の濃度
測定方法の問題を解決し、特に従来の免疫測定において
は分離する必要があった血球等の共存物質を分離せずに
、その存在のままで抗原又は抗体の濃度を測定すること
ができる方法を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、磁気微粒子の粒度測定において、試料に
磁場を印加後その印加を停止した際の残留磁場の測定か
ら、前記の課題を解決できることを見出した。

本発明は、第一に、前記の従来の微粒子の粒度測定法が
有する問題点を解決するものとして、磁気微粒子の懸濁
液に磁場を印加して一定方向に配向処理し、次に磁場の
印加を停止し、次に磁気微粒子の残留磁束密度を測定す
ることからなる磁気微粒子の粒度測定方法を提供するも
のである。

本発明の方法に供される磁気微粒子を含む懸濁液におい
ては、一般に、当初、個々の磁気微粒子は無秩序に分散
しているため、懸濁液全体が有する磁束密度はほとんど
零である。磁場の印加による一定方向に配向処理される
と磁束密度は最大になるが、磁場の印加を停止すると磁
気微粒子の配向は次第にくずれ、無秩序化の方向に向か
う。この配向の無秩序化に伴って懸濁液が有する残留磁
束密度が減衰する。また、配向の無秩序化は磁気微粒子
の熱運動やゆらぎのために起こるので、その速度は磁気
微粒子の粒度が小さいほど速く、粒度が大きいほど遅い
。即ち、磁気微粒子の粒度と懸濁液の残留磁束密度と間
には相関関係が存在するのであり、本発明の粒度測定法
はこれを利用して磁気微粒子の粒度を測定するものであ
る。

本発明の方法において残留磁束密度の測定は、例えば、
フラックスゲート型磁束計、５ＱＵＩＤ等の磁束計によ
って測定される。

本発明の方法により測定できる磁気微粒子は、磁性を有
する微粒子であれば特に限定されないが、単磁区構造で
ないものは一旦着磁処理を施して磁性を一定方向に配向
させる必要がある。本発明の方法を適用することができ
る磁気微粒子としては、例えば、ＦｅｘＯａ＋　　ｒ　
　Ｆｅ、Ｏｉ、　Ｃｏ　　Ｔ　　ＦｅｚＯ＋＋（ＮｉＣ
ｕＺｎ）Ｏ・Ｆｅｚｅ！、　（ＣｕＺｎ）Ｏ・ＦｅｚＯ
ｚ、　（Ｍｎ−Ｚｎ）Ｏ・Ｆｅ！Ｏｉ、　　（ＮｉＺｎ
）Ｏ−Ｆｅａｒｓ、　Ｓｒ０　・６ＦｅｚＯ＊＋　Ｂａ
Ｏ・６Ｆｅ２０３１　ｓｔｏｗで被覆したＦｅ、Ｏ，（
粒径約２００人）（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔ
ｅｃｈｎｏｌ、、　　ｖｏｌ、２＋　　ｐ、２〜１０（
１９８０）参照〕、各種の高分子材料（ナイロン、ポリ
アクリルアミド、タンパク質等）とフェライトとの複合
微粒子、磁性金属微粒子等を挙げることができる。

懸濁液の液体媒体は特に限定されず、例えば、水、アル
コール類、ヘンゼン、トルエン等の有機溶媒、これらの
混合溶媒があげられる。

本発明の方法は、特に粒径５０人〜５０００人の磁気微
粒子の粒度測定に適する。

本発明の粒度測定方法においては、まず、磁気微粒子が
分散された懸濁液に一定方向の磁場を印加して、磁気微
粒子のスピンを一定方向に配向させる。印加される磁場
の強度は、通常、１００ガウス程度でよく、磁場の印加
時間は、通常、１〜１０分間程分間上い。配向させる方
向は特に限定されないが、一般には磁束計のコイルから
生しる磁束の方向でよい。この配向処理は、例えばＳＱ
［ＩＩＤを用いる場合には、磁束計（ピックアップコイ
ル）の周囲に設けられているソレノイドコイルで行うこ
とができる。

配向処理を所定の時間行ったのち磁場の印加を停止する
。これにより懸濁液の残留磁束密度は初め象、速に減衰
し、次いで緩やかに減衰するというパターンを示す。懸
濁液の残留密度は、一般に、磁場を印加する前に懸濁液
が有していた磁束密度を基準とし、それとの差として定
義される。この残留密度の評価方法としては、種々可能
であり、例えば、次の方法を採用することができる。

（Ａ）磁場の印加停止後から一定時間経過後の残留磁束
密度を測定する。この場合、一般に、印加停止直後又は
停止後１０分以内の時間経過後が適当である。

（Ｂ）　［場の印加停止後の一定時間内の残留磁束密度
を測定し、時間に対する積分値を求める。

こうして求められる、種々の既知の粒度に対する残留磁
束密度の関係を、例えば、検量線で表して両者の相関関
係を知ることにより、未知の試料に含まれる磁気微粒子
の粒度を測定することができる。

本発明は、上記の磁気微粒子の粒度測定方法を利用する
、前記従来の抗原又は抗体の濃度測定方法の問題点を解
決した方法をも提供する。

即ち、本発明は、抗原又は抗体を含有する液体試料に、
前記抗原又は抗体と特異的に結合する抗体又は抗原を固
定化した磁気微粒子を懸濁して抗原抗体反応を起こさせ
て磁気微粒子を凝集させ、生じた凝集体を含む懸濁液に
磁場を印加して配向処理し、次に磁場の印加を停止し、
次に前記凝集体の残留磁束密度を測定することにより前
記凝集体の粒度を測定する工程を有する液体試料中の抗
原又は抗体の濃度測定方法を提供するものである。

この方法において、抗原又は抗体の固定化に用いる磁気
微粒子の材料は、特に限定されず、前述したものを例示
することができる。この方法の場合、磁気微粒子の粒径
は、一般に、５０〜５００人の範囲が好ましく、１００
〜３００人の範囲がより好ましい。

上記の材料及び粒径を有するものの中でも特に好ましい
ものとして、ＳｉＯ□で被覆した粒径約２００人のＦｅ
３Ｏ４粒子、及び粒径２００〜３００人の７−Ｆｅ２０
３粒子を挙げることができる。さらに、このような好ま
しい磁気微粒子として、走磁性細菌から得られる磁鉄鉱
（ｐｅ＋ｏ４）からなる微粒子（粒径約５００人）が挙
げられる。前記走磁性細菌は、例えば特開昭６２−６１
５９９号に開示された方法および採取器により淡水又は
海水から容易に採取することができる。

この濃度測定方法に用いられる抗原又は抗体を固定化し
た磁気微粒子は、上記の磁気微粒子に所要の抗原又は抗
体を固定化することにより製造することができる。抗原
又は抗体の磁気微粒子への固定化は、抗原又は抗体の固
定化技術として公知の方法により行うことができ、例え
ば、シランカップリング剤、ブドウ状球菌より得られる
プロティンＡを磁気微粒子に被膜させ、そして抗体を結
合させる方法等を用いて行う。

磁気微粒子に固定される抗体又は抗原の種類は、被測定
対象である特定の抗原又は抗体に対して抗体又は抗原の
関係にあるものであり、試料液中の抗原又は抗体に応じ
て選択される。かかる抗原又は抗体の例としては次のも
のを挙げることができる。

抗原類：　ＩｇＧ、　ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、アルブ
ミン、ＨＣＧＳＡＦＰ、カルジオライビン抗原、血液型
物質、コンカナバリンＡ、　ＤＮＴ、プロスタグランジ
ン、ＣＲＰ、　ＨＢｓ、ヒト成長ホルモン、ステロイド
ホルモン、ＣＥＡ、　ＩｇＤ等。

抗体類：抗アルブミン抗体、抗ＣＲ抗体、抗１ｇＧ抗体
、抗ｒｇＡ抗体、抗ｒｇＭ抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗Ｉｇ
Ｄ抗体、抗ＣＲＰ抗体、抗ＤＮＴ抗体、抗プロスタグラ
ンジン抗体、抗ヒト凝固ファクター抗体、抗ＣＲＰ抗体
、抗ＨＢｓ抗体、抗ヒト成長ホルモン抗体、抗ステロイ
ドホルモン抗体、およびこれらを含む血清、並びにモノ
クローナル抗体。

懸濁液に用いられる分散媒は、例えば、水性媒体が一般
的である。

本発明の測定法を実施する際には抗原又は抗体を固定化
した磁気微粒子を、例えば、特開昭６３−９０７６６号
公報に開示の懸濁液、即ち、抗原又は抗体が固定化され
ている粒径５０〜５００人の磁気微粒子が、該磁気微粒
子１ｓ＋ｇ当り５ｍ１以上の、界面活性剤濃度０．５重
量％以上の等張塩水溶液中に分散してなる懸濁液として
予め調整しておき、試料液に添加することもできる。か
かる懸濁液は、安定性が高く保存性が良好であるので便
利である。等張塩水溶液としては、例えば、０．９χＮ
ａＣＬ水溶液、０．０２５ＭＬよ糖水溶液を使用するこ
とができ、また、これに添加する界面活性剤としては、
Ｔｗｅｅｎ　８０、−ＣＯＯＨ，ＣＯＯ−などの基を有
する界面活性剤等が挙げられる０等張塩水溶液中の界面
活性剤濃度は、０．５重量％以上であることが必要で、
好ましくは、１．０〜５．０重量％である。

この方法において、試料液に磁気微粒子を分散させるに
は、例えば超音波を利用することができる。試料の懸濁
液中への分散処理により試料液中に存在した抗体又は抗
原壁磁気微粒子上に固定化されている抗原又は抗体に結
合し、抗原−抗体−磁気微粒子からなる三元結合体を生
成する。これらの結合体は、抗原−抗体反応の進行によ
り隣接する結合体同士で凝集し、凝集体を生成する。こ
のとき、特開昭６３−９０７６６号公報に記載のように
試料液に磁界を通用してもよく、これにより凝集体の生
成を促進することができる。

得られる凝集体の粒度は、試料液中の抗原又は抗体の濃
度と相関関係があるので、前述の粒度測定法の応用によ
り抗原又は抗体の濃度を知ることができる。具体的には
、既知の抗原又は抗体の濃度に対する残留磁束密度の関
係を、例えば、検量線として求め、これに基づいて未知
濃度の抗原又は抗体の試料を測定することができる。

〔実施例〕

実施例１ 粒径１５０人の酸化鉄からなる磁気微粒子の懸濁液（１
ｍｇ／ｍｌ）を３３ｋＯｅで着磁後放置することで凝集
させ、それぞれ平均粒径０．１５．２．１．１５．５．
８５．０゜１２０．２μｍの５種の磁気微粒子懸濁液を
用意した。

これら磁気微粒子懸濁液に電磁石を用いて２００Ｇ程度
の磁場を２分間印加し、磁気微粒子がフラットゲート磁
束計の検出コイルに直交するように配向させた後、磁場
の印加を停止した。この間の磁気微粒子の磁束密度を測
定したところ、図１に示す結果が得られた。この結果か
ら、残留磁束密度を、磁場印加前の磁束密度を基準とし
、磁場印加停止から１０秒後の磁束密度との差として評
価した。

各粒径に対する残留磁束密度をプロットしたところ、図
２に示す検量線が得られた。

実施例２ 抗ヒト■ｇＧを固定化した粒径１５０人の磁気微粒子を
、Ｔｗｅｅｎ　８０を０．６χで含む生理食塩水に１ｍ
ｇ／ａｌｌの濃度で懸濁し、３０ｋＯｅで着磁後ヒトＩ
ｇＧをそれぞれ１．１０．１００．１０００μｍｇ／ａ
ｔの濃度となるように加え超音波分散し、４種の懸濁液
を調製した。

その後２００ガウス、パルス幅０．５秒の交番磁場を５
分間印加しながら抗原抗体反応を行い、磁気微粒子の凝
集体を得た。そして交番磁場を停止後、フラットゲート
磁束計での磁束密度の測定に供した。

磁気微粒子懸濁液の初期磁束密度を測定した後、電磁石
を用いて２００ガウスの磁場を２分間印加し、磁気微粒
子が磁束計検出コイルに直交するように配向゛させた。

磁場の印加をを停止した後、磁束密度を測定し、実施例
１と同様にして残留磁束密度を評価した。実施例１で得
た、図２の検量線を利用して、ヒ）ＩｇＧの各農度に対
する残留磁束密度を求めたところ、図３に示す結果が得
られた。この結果は、光学的に凝集体の粒度を測定した
場合に得られた結果と良好な一致を示した。

〔発明の効果〕

従来、懸濁液中の磁気微粒子の粒度の測定は光学的に行
われていたが、本発明の磁気微粒子の粒度測定方法によ
れば、光学的には測定ができない高濃度領域や他の共存
物質の存在下においても何ら影響されずに磁気微粒子の
粒度を短時間で測定できる。この方法は、種々の測定に
応用可能である。特に、本発明により提供される抗原又
は抗体の濃度測定方法は、血球等の共存物質の存在下に
おいても何ら影響されずに抗原抗体反応による磁気微粒
子の粒度を短時間で測定できる、酵素を使用しないため
その安定性が問題とならず、また放耐性物質を使用しな
いので安全性が高い等の点で有利である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例工で測定された磁束密度の変化を表し
、図２は、同じく磁気微粒子の粒度と残留磁束密度の関
係を示し、図３は、実施例にで得られた抗原濃度と残留
磁束密度の関係を示す。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）磁気微粒子の懸濁液に磁場を印加して一定方向に
   配向処理し、次に磁場の印加を停止し、次に磁気微粒子
   の残留磁束密度を測定する工程を有する磁気微粒子の粒
   度測定方法。
2. （２）抗原又は抗体を含有する液体試料に、前記抗原又
   は抗体と特異的に結合する抗体又は抗原を固定化した磁
   気微粒子を懸濁して抗原抗体反応を起こさせて磁気微粒
   子を凝集させ、生じた凝集体を含む懸濁液に磁場を印加
   して配向処理し、次に磁場の印加を停止し、次に前記凝
   集体の残留磁束密度を測定することにより前記凝集体の
   粒度を測定する工程を有する液体試料中の抗原又は抗体
   の濃度測定方法。