ES2310545T3 - Gen runx3 con actividad antitumoral y la utilizacion del mismo. - Google Patents
Gen runx3 con actividad antitumoral y la utilizacion del mismo. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2310545T3 ES2310545T3 ES01902862T ES01902862T ES2310545T3 ES 2310545 T3 ES2310545 T3 ES 2310545T3 ES 01902862 T ES01902862 T ES 01902862T ES 01902862 T ES01902862 T ES 01902862T ES 2310545 T3 ES2310545 T3 ES 2310545T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- runx3
- gene
- baselineskip
- dna
- cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4747—Apoptosis related proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Un plásmido de expresión, que posee un gen RUNX3 insertado en sentido directo del mismo y permite la expresión del gen RUNX3 para su uso como agente anticancerígeno.
Description
Gen RUNX3 con actividad antitumoral y la
utilización del mismo.
La presente invención está relacionada con el
gen RUNX3 y la utilización del mismo como un agente anticancerígeno.
Más específicamente, la presente invención está relacionada con la
caracterización del gen RUNX3, su expresión y actividad supresora
de tumores, y su uso en el desarrollo de métodos de diagnóstico del
cáncer y de agentes anticancerígenos.
Los tumores son una agregación de células que
muestran una proliferación autónoma excesiva, y se clasifican en
tumores malignos, que pueden ser mortales, y tumores benignos; no
obstante, puede ser difícil discriminar entre estos tipos. Los
cánceres son enfermedades genéticas que se atribuyen a la mutación
de genes, como los oncogenes y los genes supresores de tumores, y
sus causas pueden encontrarse a nivel celular. Los productos de los
oncogenes constituyen una red de señalización dentro de las células,
y están involucrados en la regulación de los sistemas de
transducción de señales para la división y para la diferenciación
celular. Cuando esta regulación pasa a ser anormal, las células no
se diferencian más, sino que se dividen infinitamente; es decir, se
convierten en tumorigénicas. Si pudiera encontrarse una vía que
lograra que esta ruta anormal de transducción de señales se
convirtiera en una ruta normal, podrían desarrollarse agentes
anticancerígenos de los que podrían obtenerse excelentes efectos
terapéuticos sin efectos secundarios.
En la actualidad, los cánceres se tratan en la
mayoría de casos de tres formas: con terapia quirúrgica,
quimioterapia y radioterapia. En la práctica, prevalecen las
combinaciones de estas terapias además de la combinación con
terapia láser. No obstante, es preferible la quimioterapia a otras
terapias cuando se tiene en cuenta el dolor que acompaña a la
terapia y los estados de metástasis. Se han desarrollado numerosos
agentes anticancerígenos, la mayoría de los cuales se basa en la
eliminación selectiva de las células que se dividen de forma activa.
No obstante, estos agentes anticancerígenos presentan una
desventaja y es que eliminan también algunas células normales, como
las células del sistema inmune y las células de las raíces
capilares, con efectos secundarios concomitantes significativos; no
son, por lo tanto, adecuadas para ser utilizadas durante largos
periodos de tiempo. Así, existe una necesidad de encontrar nuevos
agentes anticancerígenos. Es esperable que un agente terapéutico
basado en las causas del cáncer sea altamente efectivo y posea pocos
o ningún efecto secundario relacionado.
La activación anormal de oncogenes induce la
proliferación celular y es una de las causas del cáncer. Por el
contrario, la función de los genes supresores de tumores es prevenir
la proliferación celular anormal o activar la muerte celular
programada (apoptosis). A menudo, los genes supresores de tumores
activan la apoptosis para eliminar las células con oncogenes
activados anormalmente, previniendo así la formación de células
cancerosas. Cuando los genes supresores de tumores muestran una
actividad normal, las células con oncogenes anormalmente activados
no pueden progresar a un cáncer, sino que son destruidas. Por lo
tanto, para convertirse en células cancerosas, las células deben
tener tanto genes supresores de tumores inactivados como oncogenes
activados.
Uno de los mecanismos mediante los que los genes
supresores de tumores se inactivan es mediante la
hiper-metilación de las islas CpG (Jones y Laird,
Nature Genet. Vol. 21, 163-167, 1999). La metilación
de las islas CpG se realiza mediante la metiltransferasa de DNA.
Tras una metilación significativa, las proteínas de unión al DNA
como la proteína de unión a la metilcitosina 2 (MECP2) se unen a la
citosina metilada del DNA, que recluta la desacetilasa de histonas
(HDAC) para reprimir la expresión génica. En detalle, la HDAC
elimina los grupos acetilo asociados con las histonas y el DNA
cromosómico cercano a las histonas desacetiladas pasa a ser denso,
lo cual lleva a la represión de la transcripción génica. Si la
expresión génica se reprime mediante metilación de DNA, los
inhibidores de la metiltransferasa de DNA o los inhibidores de la
HDAC pueden ser útiles para inducir la expresión génica. Ejemplos
de genes supresores de tumores cuya expresión está reprimida
mediante metilación de DNA son RB1, TP53, VHL, CDKN2A, CDKN2B, MLH1
y APC (Jones y Laird, Nature Genet. Vol. 21,
163-167, 1999).
Tal como se ha mencionado anteriormente, se sabe
que la acetilación y desacetilación de histonas juega un importante
papel en la regulación de la transcripción del DNA en las células
eucariotas (Grunstein M., Nature, 389, 349-352,
1997). Se ha encontrado que algunos compuestos que aparecen de forma
natural previenen la progresión de la células a un cáncer mediante
la inhibición de la HDAC. Los inhibidores de la HDAC, por ejemplo la
trapoxina, tricostatina A y depudecina, han sido estudiados por su
capacidad de revertir la transformación de células cancerosas. De
los inhibidores de la HDAC, la depudecina es la mejor caracterizada
debido a su actividad anti-angiogénica in
vivo e in vitro. Además, los inhibidores de la HDAC han
sido estudiados en relación a las respuestas celulares, incluyendo
la interrupción del ciclo celular, la alteración de los patrones de
expresión génica y la inducción de la apoptosis.
Los sistemas de transducción de señales de
TGF-\beta son bien conocidos por su actividad
supresora de tumores. La unión de TGF-\beta a los
receptores de TGF-\beta provoca la activación de
los receptores, que a su vez activan las proteínas Smad mediante
fosforilación. Una vez activadas, las proteínas Smad se mueven hacia
el interior del núcleo y regulan la expresión génica en cooperación
con otros factores de transcripción, suprimiendo de esta manera la
división celular o induciendo la apoptosis (Massague et al.,
Cell, 103 (2):295-309, 2000). Runx3 es uno de los
factores de transcripción que interaccionan físicamente con las
proteínas Smad (Hanai et al., J. Biol. Chem. 274;
31577-31582, 1999). En las células de varios tipos
de tumores se observan la deleción o mutación de los genes de los
receptores de TGF-\beta o Smad. La actividad
supresora de tumores de los receptores de
TGF-\beta también se ha demostrado mediante un
experimento en una cepa celular que carece del receptor
TGF-\beta. En un ensayo con ratones desnudos,
cuando la célula se transforma para expresar el receptor
TGF-\beta, la proliferación celular se reduce y la
tumorigénesis disminuye (Chang et al., Cancer Res., 57
(14):2856-2859, 1997). El sistema de transducción de
señales de TGF-\beta está bien caracterizado en
relación a la represión de la proliferación celular, que se alcanza
mediante la promoción de la expresión de la proteína p21 inhibidora
de CDK. No obstante, el mecanismo mediante el que el
TGF-\beta induce la apoptosis sigue sin estar
claramente dilucidado.
La PEBP2 (proteína de unión al potenciador del
virus del polioma 2) está compuesta de dos subunidades, \alpha y
\beta. Existen tres genes que codifican la subunidad \alpha:
RUNX1/PEBP2\alphaB/CBFA2/AML1,
RUNX2/PEBP2\alphaA/CBFA2/
AML2 y RUNX3/PEBP2\alphaC/CBFA3/AML2 (Bae y Ito, Histol. Histopathol, 14(4):1213-1221, 1999). Los genes
RUNX1, RUNX2 y RUNX3 muestran una homología entre ellos de alrededor del 60-70% en la secuencia de aminoácidos. Están altamente conservados durante la evolución, con una homología de alrededor del 95% entre ratones y humanos.
AML2 y RUNX3/PEBP2\alphaC/CBFA3/AML2 (Bae y Ito, Histol. Histopathol, 14(4):1213-1221, 1999). Los genes
RUNX1, RUNX2 y RUNX3 muestran una homología entre ellos de alrededor del 60-70% en la secuencia de aminoácidos. Están altamente conservados durante la evolución, con una homología de alrededor del 95% entre ratones y humanos.
Debido a que es un importante gen causal en las
leucemias, el gen RUNX1 se asocia con otros genes mediante la
translocación cromosómica para provocar la leucemia mieloide aguda o
leucemia linfoide aguda en humanos (Miyoshi et al., EMBO J.,
12:2715-2721, 1993; Romana et al., Blood,
85:3662-3670, 1995; Okuda et al., Blood,
91:3134-3143, 1998; Okuda et al., Cell,
84:321-330, 1996). El gen RUNX2 juega un papel
crucial en la osteogénesis y su disrupción está implicada en la
provocación de displasia cleidocraneal (Komori et al., Cell,
89:755-764, 1997; Lee et al., Nat. Genet.,
15:307-310, 1997; Mundlos et al., Cell,
89:773-779, 1997; Otto et al., Cell,
89:756-771, 1997). También se ha visto que el gen
RUNX2 muestra una actividad oncogénica en la formación de linfomas
de células T (Stewart et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A., 94(16):8646-8651, 1997).
Los presentes inventores identificaron el gen
RUNX3 hace varios años como miembro de la familia PEBP2 (Bae et
al., Gene, 159(2):245-248, 1995; Levanon
et al., Genomics, 23(2):425-532,
1994). No obstante, no se han descrito enfermedades asociadas con
la activación o inactivación del gen RUNX3, diferentes a las que se
describen en esta invención.
La amplia e intensiva búsqueda de enfermedades
asociadas con la activación del gen RUNX3, realizada por los
presentes inventores, resultó en el hallazgo de que los productos
génicos de RUNX3 poseen una actividad supresora de tumores, lo que
dio lugar a la presente invención. RUNX3 es indispensable para la
apoptosis inducida por TGF-\beta, y la
inactivación del gen RUNX3 mediante la metilación de DNA en los loci
cercanos al exón 1 de RUNX3 está muy correlacionada con el
desarrollo del cáncer. En la presente invención, se caracteriza la
expresión y actividad supresora de tumores del gen RUNX3, ofreciendo
la posibilidad de desarrollar a partir del mismo métodos de
diagnóstico del cáncer y agentes anticancerígenos.
Los objetivos de la presente invención son
esclarecer la actividad supresora de tumores del gen RUNX3 y su
mecanismo, y proporcionar un método diagnóstico y un agente
terapéutico para el cáncer basado en la actividad supresora de
tumores de RUNX3.
Para alcanzar los objetivos anteriores, la
presente descripción proporciona una cepa celular que posee un cDNA
en sentido directo de RUNX3, en el que el cDNA de RUNX3 se
sobreexpresa, y se una cepa celular que posee un cDNA en sentido
reverso de RUNX3, en el que la expresión del gen RUNX3 está
inhibida.
También, la presente descripción proporciona un
cDNA de RUNX3 con actividad supresora de tumores y su
correspondiente proteína.
En la presente descripción, se muestra que el
gen RUNX3 juega un papel crucial en la apoptosis dependiente de
TGF-\beta, utilizando cepas celulares que
sobreexpresan el cDNA de RUNX3 o que inhiben selectivamente la
expresión del gen RUNX3.
Además, se muestra que la supresión de la
expresión del gen RUNX3 en varias líneas celulares puede atribuirse
a la metilación de DNA en las proximidades del exón 1 del gen
RUNX3.
Además, la presente descripción proporciona una
composición farmacéutica que incluye el gen RUNX3 o su proteína.
Finalmente, la presente invención proporciona
formas de utilización del gen RUNX3 y sus proteínas en el desarrollo
de agentes anticancerígenos y métodos de diagnóstico.
\newpage
La Fig. 1a es una secuencia de nucleótidos de
cDNA del gen humano RUNX3, con flechas que indican los cebadores
utilizados para el análisis mediante RT-PCR y letras
en negrita que indican el codón de inicio de la traducción (ATG) y
el codón de parada de la traducción (TGA).
La Fig. 1b continúa la secuencia de nucleótidos
de cDNA del gen humano RUNX3 de la Fig. 1a.
La Fig. 1c es una secuencia de aminoácidos
deducida a partir de la secuencia de cDNA del gen humano RUNX3 que
se muestra en la Fig. 1a.
La Fig. 2a es una secuencia de nucleótidos que
muestra las islas CpG presentes en el exón 1 del gen humano RUNX3,
en la que se indica con subrayado el fragmento utilizado como sonda
en el análisis Southern blot de DNA genómico, y resaltado con letras
en negrita el codón de inicio de la traducción (ATG).
La Fig. 2b continúa la secuencia de nucleótidos
de las islas CpG presentes en el exón 1 del gen humano RUNX3 de la
Fig. 2a.
La Fig. 3 es una autoradiografía resultante del
análisis de Northern blot para determinar si
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12,
que poseen ambos un gen RUNX3 en sentido reverso, y
MKN28-Rx3, que posee un gen RUNX3 en sentido
directo, expresan los genes RUNX3 en sentido directo y en sentido
reverso.
La Fig. 4a es una gráfica en la que se
representan los contajes de células viables
SNU16-Rx3-AS-c11
respecto al tiempo, junto con los contajes de las células control
SNU16, tras el tratamiento con 1 ng/ml de
TGF-\beta para analizar la muerte celular inducida
por TGF-\beta.
La Fig. 4b es una fotografía que muestra los
resultados de la electroforesis de los DNA genómicos obtenidos a
partir de SNU16,
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12
tras el tratamiento con 1 ng/ml de TGF-\beta1
durante 6 horas para poder determinar si RUNX3 está involucrado en
la ruta de muerte celular programada inducida por
TGF-\beta.
La Fig. 5a es una gráfica que muestra el tamaño
de los tumores formados en ratones desnudos medidos de forma
periódica durante 98 días tras la inyección subcutánea de
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12,
ambos con una expresión restringida de RUNX3 debido a la
sobreexpresión del gen RUNX3 en sentido reverso del mismo; y
control-SNU16 que expresa el gen RUNX3 de forma
normal.
La Fig. 5b es una gráfica en que se midió el
tamaño de los tumores formados en ratones desnudos de forma
periódica durante 37 días tras la inyección subcutánea de MKN28
control, que no expresa el gen RUNX3, y MKN28-Rx3,
en el que se expresa un cDNA de RUNX3.
La Fig. 5c muestra una comparación de masas
tumorales extraídas de ratones sacrificados en el último día de
experimento.
La Fig. 6a es una vista esquemática que muestra
la estructura del cDNA de RUNX3 con flechas que denotan las
posiciones de los cebadores de RT-PCR, y una caja
rayada que denota el dominio Runt, que juega un papel importante en
la unión de la proteína RUNX3 al DNA.
La Fig. 6b muestra los resultados de la
electroforesis de los productos de RT-PCR obtenidos
a partir del RNA total de 15 líneas celulares de cáncer gástrico
mediante el uso de los pares de cebadores PS-N
(PS-N), cebadores PS-C
(PS-C), los cebadores humanos de cDNA de
PEBP2\beta/CBFB (PEBP2\beta) y cebadores humanos de cDNA de la
\beta-actina (\beta-actina), y
los resultados del Southern blot (PS-C ST). Para el
análisis de Southern blot, los productos de RT-PCR
obtenidos mediante el uso de los cebadores PS-C se
hibridaron con el cDNA de RUNX3 como sonda.
La Fig. 6c muestra los resultados de la
electroforesis de los productos de RT-PCR obtenidos
a partir del RNA total de 17 líneas celulares de cáncer de pulmón
mediante el uso de los pares de cebadores PS-N
(PS-N), cebadores PS-C
(PS-C), y los cebadores humanos de cDNA de la
\beta-actina (\beta-actina),
para analizar la producción de mRNA de RUNX3.
La Fig. 7a es una ilustración esquemática que
muestra dianas de enzimas de restricción en la proximidad del exón 1
de RUNX3 y la frecuencia de CpG dentro de las islas CpG típicas, con
barras gruesas que denotan la posición de un fragmento de DNA
utilizado como sonda en el análisis genómico de Southern blot.
La Fig. 7b es una autoradiografía que resulta
del análisis de Southern blot de la metilación de DNA en las
proximidades del exón 1 de RUNX3 en varias líneas celulares de
cáncer gástrico mediante el uso de sondas de DNA que pueden detectar
partes de las islas CpG. Los DNA genómicos se aislaron a partir de
líneas celulares de cáncer y se trataron con SmaI (superior), que no
puede digerir el DNA metilado, y BamHI (inferior), que puede digerir
el DNA independientemente de la metilación del DNA.
\newpage
La Fig. 8 muestra los resultados de la
electroforesis de los productos de RT-PCR obtenidos
a partir del RNA total de NUGC3, MKN28 y MKN74 tras el tratamiento
con
5-aza-2-desoxicitidina
(AZA, 300 nM) o tricostatina A (TSA, 1 mM), de forma separada o en
combinación. Los resultados indican que el tratamiento con los
inhibidores de la metiltransferasa de DNA o los inhibidores de la
HDAC permiten la expresión del gen RUNX3.
\vskip1.000000\baselineskip
En la presente descripción, se describe el papel
de RUNX3 en las células. Con este propósito, se introduce un cDNA
en sentido directo de RUNX3 o un cDNA en sentido reverso de RUNX3 en
células para establecer cepas que sobreexpresen RNA en sentido
directo o en sentido reverso de RUNX3, respectivamente.
Por lo tanto, en un aspecto de la presente
descripción, se proporcionan líneas celulares que son portadoras de
un cDNA en sentido directo de RUNX3 o un cDNA en sentido reverso de
RUNX3 que expresan en exceso la proteína RUNX3 y que inhiben de
forma selectiva la expresión del gen RUNX3, respectivamente.
El gen humano RUNX3 clonado por los presentes
inventores en 1995 (Bae et al., Gene, 159
(2):245-248, 1995; secuencia de nucleótidos de cDNA
con Nº de registro en GenBank Z35278) se utilizó para construir un
vector plasmídico capaz de expresar RUNX3. El cDNA del gen RUNX3
posee la secuencia de nucleótidos Id. de Sec. Nº:1. Este cDNA posee
un marco abierto de lectura que va desde el codón de inicio de la
traducción hasta el codón de parada de la traducción y codifica un
polipéptido que consiste en 415 aminoácidos cuya presunta secuencia
de aminoácidos es la Id. de Sec. Nº:2 (ver Figs. 1a a 1c). Un
fragmento de DNA que comprende las islas CpG en las proximidades
del exón 1 del gen RUNX3 posee la secuencia de nucleótidos de Id. de
Sec. Nº:3 (ver Fig. 2a y 2b).
Se insertó un fragmento de DNA de 2.244 pb que
comprende una región codificante del gen de cDNA de RUNX3 Id. de
Sec. Nº:1 (ver Fig. 1a) en sentido directo en un vector
pEF-BOS (Mizushima et al., Nucleic Acids
Res., 18(17):5322, 1990) para construir un vector plasmídico
recombinante, denominado
pEF-BOS-Rx3, que expresa un gen
RUNX3 en sentido directo. De forma separada, el cDNA de RUNX3 se
insertó en sentido reverso en un vector pEF-BOS para
construir un vector recombinante, denominado
pEF-BOS-Rx3-AS.
Después de cotransfectar el vector plasmídico
pEF-BOS-Rx3 con otro vector portador
de un marcador de selección de resistencia a neo en varias cepas de
células cancerígenas, se seleccionaron transfectados estables que
sobreexpresaban el RNA en sentido directo de RUNX3. En una
realización preferible de la presente descripción, el plásmido
pEF-BOS-Rx3 y un plásmido con un
marcador de selección para neo se cotransfectaron en la cepa MKN28
(que no expresa un gen RUNX3) utilizando Lipofectamina
(Gibco-BRL), y la selección de los transfectados se
logró por medio de la resistencia de G418. La cepa MKN28 que muestra
sobreexpresión del gen RUNX3 en sentido directo se denominó
MKN28-Rx3 y se depositó en la Korean Collection for
Type Culture del Korea Research Institute of Bioscience and
Biotechnology (KRIBB) bajo el Nº de depósito KCTC 0933BP el 9 de
enero de 2001.
Las cepas que expresan el RNA en sentido reverso
de RUNX3 se establecieron mediante cotransfección del vector
plasmídico
pEF-BOS-Rx3-AS y un
plásmido con un marcador de selección en células de la línea celular
de cáncer gástrico SNU16 (Kim et al., J. Natl. Cancer Inst.,
8(13):938-943, 1991), que posee un gen p53
inactivado y un sistema génico normal de
TGF-\beta (Park et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A., 91 (10):8772-8776, 1994). Se
obtuvieron transfectados estables de la misma forma que la expuesta
anteriormente. Los dos transfectados que expresaron en exceso el
RNA en sentido reverso de RUNX3 se denominaron
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12, y
se depositaron en la Korean Collection for Type Culture del KRIBB
bajo los Nº de depósito KCTC 0934BP y KCTC 0935BP el 9 de enero de
2001.
Para determinar si los transfectados
MKN28-Rx3,
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12
expresan el gen RUNX3 en sentido directo o el gen RUNX3 en sentido
reverso, se utilizó el cDNA de RUNX3 de Id. de Sec. Nº:1 como sonda
de DNA para el análisis de Northern blot. Se detectó un tránscrito
de RUNX3 de la cepa MKN28-Rx3 como una banda única
en una posición casi idéntica a la del RNA 18S, verificando la
expresión del mRNA de RUNX3 en la célula. Por el contrario, se
detectaron varios RNA de RUNX3 en sentido reverso de varios tamaños
en las células
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12. En
la cepa control SUN16, la expresión del gen endógeno RUNX3 fue
difícilmente detectable mediante análisis de Northern blot (ver Fig.
3).
En otro aspecto de la presente descripción, se
proporcionan un gen RUNX3 y su producto, que muestran actividad
supresora de tumores.
En la presente descripción, la función del gen
RUNX3 se esclarece utilizando la cepa MKN28-Rx3, que
expresa el gen RUNX3, y las cepas
SNU16-Rx-AS-11c y
SNU16-Rx-AS-12c,
cuya expresión del gen RUNX3 está inhibida de forma selectiva.
Para analizar el papel de RUNX3 en la muerte
celular programada (apoptosis) inducida por
TGF-\beta, se trataron con
TGF-\beta1 las cepas
SNU16-Rx3-ASc11 y
SNU16-Rx3-AS-c12, en
las que la expresión de RUNX3 está selectivamente inactivada; se
utilizaron las células normales SNU16 como control. Los contajes de
células viables revelaron que el TGF-\beta1
induce la apoptosis en la cepa control, pero no en las cepas
mutantes. En más detalle, el tratamiento con
TGF-\beta1 eliminó todas las células SNU16 en 2
días. No obstante, el tratamiento con TGF-\beta1
no eliminó las células
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12
(ver Fig. 4a). De acuerdo con esto, los resultados muestran que el
gen RUNX3 está involucrado en la muerte celular inducida por
TGF-\beta1 en células SNU16.
En la presente descripción, los inventores
también determinan si el mecanismo de la muerte celular inducida
por TGF-\beta1 dependiente de RUNX3, en células
SNU16 tratadas con TGF-\beta1 ocurre a través de
la ruta de la apoptosis o a través de una ruta de necrosis. La
electroforesis del DNA de las células muertas por apoptosis
proporciona bandas de DNA específicas de apoptosis. Estas bandas son
evidentes en el DNA de las células SNU16 tratadas con
TGF-\beta1 (ver Fig. 4b carriles 1 y 2). No
obstante, no se observaron bandas apoptóticas en el DNA de las
células
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12
(ver Fig. 4b, carriles 3 a 6). Por lo tanto, el estímulo de
TGF-\beta1 elimina las células SNU16 a través de
una ruta apoptótica, y RUNX3 es indispensable para este proceso.
Se sabe que la apoptosis inducida por
TGF-\beta1 es un mecanismo muy importante para
suprimir la progresión de las células normales hacia el cáncer, y
que la mayoría de factores involucrados en la ruta de
TGF-\beta presentan una actividad supresora de
tumores (Chang et al., Cancer Res., 57
(14):2856-2859, 1997). Para examinar la actividad
anticancerígena de RUNX3, se realizó un ensayo de tumorigénesis
utilizando ratones desnudos. Para el ensayo de actividad supresora
de tumores, se introducen las líneas celulares en ratones desnudos
mediante inyección subcutánea, tras lo cual se miden de forma
periódica las masas cancerosas formadas por su tamaño externo. Tras
el sacrificio de los ratones el último día, se escinden las masas
cancerosas para poder compararlas.
Los tumores formados en los ratones desnudos
crecieron a una tasa superior en los ratones inyectados con las
células que expresaban
SNU16-Rx3-AS-c11 o
SNU16-Rx3-AS-c12 que
los que fueron inyectados con las células control SNU16 (ver Fig.
5a). En más detalle, las masas cancerosas se midieron el último día.
Las masas del grupo experimental en el que se habían inyectado
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12
eran de un volumen de 1.600 mm^{3}, mientras que aquellas del
grupo control eran de alrededor de 800 mm^{3}. Las masas
cancerosas se escindieron de los ratones 98 días tras la inyección
y se compararon entre ellas. Las masas cancerosas del grupo
experimental fueron marcadamente mayores que las del grupo control
(ver Fig. 5c).
También se analizó la tumorigenicidad de las
células control MKN28 y las células MKN28-Rx3 en las
que se expresa el RNA en sentido directo de RUNX3, utilizando
ratones desnudos de la manera anteriormente descrita para las
células SNU16. Se observó una tumorigénesis significativamente
reducida en los ratones a los que se ha inyectado células
MKN28-Rx3, en comparación con la de los ratones a
los que se ha inyectado células control MKN28 (ver Fig. 5b). En más
detalle, las masas cancerosas del grupo control eran de un volumen
de 600 mm^{3} el último día, y por el contrario se encontró un
volumen de masa cancerosa del grupo experimental inyectado con
MKN28-Rx3, de tan solo 250 mm^{3}. Esto
representa una reducción del crecimiento tumoral del 58%. Las masas
cancerosas se escindieron de los ratones 30 días después de la
inyección y se compararon entre ellas (Fig. 5c).
Estos resultados demuestran que el gen RUNX3
posee actividad supresora de tumores.
En la presente descripción, se analizó el patrón
de expresión del gen RUNX3 en varias líneas celulares de cáncer.
Los RNA totales se aislaron a partir de 15 líneas celulares de
cáncer gástrico y 17 líneas celulares de cáncer de pulmón, y se
utilizaron para determinar si estas líneas celulares producen mRNA
de RUNX3, mediante el uso de RT-PCR. Las líneas
celulares de cáncer gástrico utilizadas en la RT-PCR
fueron SNU1, SNU5, SNU719, NUGC3, MKN1, MKN7, MKN28, MKN45, MKN74,
AGS, KatoIII, RF1, RF48 y AZ521. Las líneas celulares de cáncer de
pulmón fueron NCI-H522, 86-2, A549,
LK79, LK87, LCSC#1, LCSC#2, NCI-H23,
NCI-H226, NCI-460,
NCI-H322, Sq-19,
NCI-H1915, NCI-H630, Hs 888Lu, Lu65
y LX-1. Estas líneas celulares se obtuvieron del
Korean Research Institute of Bioscience and Biotechnology
(KRIBB).
La RT-PCR se realizó utilizando
dos pares de cebadores, llamados PS-N y
PS-C (Fig. 1a). Entre las líneas celulares de
cáncer gástrico se encontró que SNU5, SNU16, SNU719, MKN1, MKN45,
RF1, RF48, MKN7 y AZ521 producían productos de
RT-PCR con un tamaño esperado (1.080 pb con la
pareja de cebadores PS-N y 870 pb con la pareja de
cebadores PS-C), aunque MKN7 produjo productos de
RT-PCR en muy pequeña cantidad (Fig. 6b). Por el
contrario, no se obtuvieron productos de RT-PCR a
partir de las líneas celulares SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS y
KatoIII cuando se utilizó la pareja de cebadores
PS-N o la pareja de cebadores
PS-C.
En el caso de las líneas celulares de cáncer de
pulmón, la expresión del gen RUNX3 se encontró suprimida de forma
significativa en la línea celular HS888Lu y completamente suprimida
en las líneas celulares NCI-H226,
NCI-460, NCI-H630 y Lu65 (ver Fig.
6c).
El análisis de Southern blot se utilizó para
verificar que los productos de RT-PCR se
amplificaban a partir de cDNA del gen RUNX3 (ver Fig. 6b,
PS-3 ST). De forma adicional, se observó la
amplificación del cDNA de PEBP2\beta (ver Fig. 6b PEBP2\beta) y
del cDNA de la \beta-actina (ver Fig. 6b,
\beta-actina) a partir de primeras cadenas de
cDNA idénticas, indicando que la falta de amplificación del cDNA de
RUNX3 en las líneas celulares de cáncer gástrico SNU1, NUGC3,
MKN28, MKN74, AGS, KatoIII, NCI-H226,
NCI-460, NCI-H630 y Lu65 puede
atribuirse a la falta de expresión del gen RUNX3 en estas líneas
celulares. De forma similar, los niveles reducidos de los productos
de RT-PCR en las líneas celulares MKN7 y Hs888Lu son
resultado de los bajos niveles de expresión del gen RUNX3 en estas
líneas celulares.
Los resultados anteriores muestran que el gen
RUNX3 está notablemente o completamente suprimido en alrededor del
47% de las líneas celulares de cáncer gástrico y en alrededor del
30% de las líneas celulares de cáncer de pulmón. Por lo tanto, la
supresión de la expresión del gen RUNX3 puede ser un índice de
diagnóstico importante en alrededor del 47% de las células de
cáncer gástrico y en alrededor del 30% de células de cáncer de
pulmón (cerca del 37% del total de líneas celulares de cáncer de
pulmón y gástrico que se examinaron).
El análisis de las mutaciones del gen RUNX3 en
las líneas celulares de cáncer se realizó utilizando todos los
exones del gen RUNX3 amplificados a partir de varias líneas
celulares de cáncer. No se encontró ninguna mutación puntual que
afectara a la secuencia de aminoácidos. Estos resultados llevaron a
la conclusión de que las líneas celulares de cáncer en las que la
expresión del gen RUNX3 no se detectó contenían un gen RUNX3
normal, pero no lo expresaban. Para determinar si la supresión de la
expresión del gen RUNX3 puede atribuirse a la metilación del DNA,
se analizó la correlación entre la expresión del gen RUNX3 y la
hipermetilación de las islas CpG en los loci cercanos al exón 1 de
RUNX3 a través de Southern blot de DNA genómico, utilizando enzimas
de restricción sensibles a la metilación de DNA. Los DNA genómicos
aislados de las líneas celulares de cáncer se trataron
separadamente con enzimas de restricción que son incapaces de cortar
el DNA metilado y enzimas que son capaces de cortar el DNA
independientemente de la metilación.
En una realización preferible de la presente
descripción, se utilizó SmaI, que no puede digerir el DNA metilado,
y BamH1, que puede digerir el DNA independientemente de su
metilación. El DNA estaba protegido específicamente frente a la
digestión de SmaI en las líneas celulares de cáncer gástrico cuya
expresión del gen RUNX3 no se había detectado, es decir, las líneas
celulares SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS y KatoIII. La línea celular
MKN7, en la que el nivel de expresión era muy bajo, mostró un
patrón parcialmente metilado (ver Fig. 7b). Estos resultados
sugieren que la expresión del gen RUNX3 está muy correlacionada con
la metilación de DNA en los loci cercanos al exón 1 de RUNX3 en las
líneas celulares de cáncer.
Para examinar además si la metilación del DNA
provoca la silenciación del gen RUNX3, se analizó la influencia de
un inhibidor de la metiltransferasa de DNA y un inhibidor de la
desacetilasa de histonas en la reactivación de la expresión del gen
RUNX3. Se utilizaron
5-aza-3-deoxicitidina
(AZA, 300 nM) y tricostatina A (TSA, 1 mM) como inhibidores de la
metiltransferasa de DNA y desacetilasa de histonas, respectivamente.
Tras el tratamiento con el inhibidor de la metiltransferasa de DNA
o el inhibidor de la desacetilasa de histonas, se indujo la
expresión del gen RUNX3 (ver Fig. 8). Estos resultados demostraron
que la hipermetilación de las islas CpG en los loci cercanos al
exón 1 del gen RUNX3 es responsable de la supresión de la expresión
del gen RUNX3 en alrededor del 37% de las células cancerígenas.
Este resultado también indican que pueden desarrollarse agentes
capaces de promover la reactivación del gen RUNX3 a partir de
inhibidores de la metiltransferasa de DNA o inhibidores de la
desacetilasa de histonas y utilizarse como agentes
anticancerígenos.
De acuerdo con la presente descripción, por lo
tanto, el producto del gen RUNX3 está involucrado en la apoptosis
dependiente de TGF-\beta1 y muestra actividad
supresora de tumores. La expresión del gen RUNX3 está suprimida en
una porción sustancial de las células cancerígenas mediante la
hipermetilación de las islas CpG en los loci cercanos al exón 1 del
gen.
En otro aspecto de la presente descripción, se
proporcionan vectores de expresión que son capaces de expresar el
cDNA de RUNX3, y se proporcionan composiciones farmacéuticas que
comprenden las proteínas de estos genes como ingredientes
farmacéuticamente efectivos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
descripción pueden utilizarse para el diagnóstico, profilaxis y
tratamiento de las enfermedades atribuidas a una apoptosis anormal
dependiente de TGF-\beta, incluyendo los cánceres
gástricos y de pulmón.
Se pueden utilizar, como ingredientes
farmacéuticamente efectivos, el cDNA de RUNX3, el RNA de RUNX3 o las
proteínas producidas a partir de los mismos. Son preferibles los
vectores de expresión capaces de expresar el gen RUNX3, ya que si
se inyectan pueden producir las proteínas RUNX3 de forma continua.
Cuando una composición farmacéutica que comprende dicho vector de
expresión se inyecta en un tejido biológico a través de la vía
parenteral, el tejido biológico puede producir RUNX3. Es decir,
puede utilizarse el gen RUNX3 de la presente descripción o un
vector de expresión portador del gen RUNX3 como un ingrediente
farmacéuticamente efectivo de una composición farmacéutica para
utilizar en la terapia génica.
La administración del cDNA de RUNX3 de la
presente descripción y/o el RNA de RUNX3 o la proteína RUNX3
producida a partir de los mismos puede administrarse por vía oral o
parenteral, prefiriéndose la inyección parenteral.
El vector de expresión que comprende el gen
RUNX3 o la proteína RUNX3 producida a partir del mismo, puede
administrarse en varias formas de dosificación oral o parenteral.
Para la formulación de ingredientes, diluyentes, excipientes y/o
transportadores farmacéuticamente útiles, pueden utilizarse agentes
de relleno, espesantes, enlazantes, agentes humectantes, agentes
desintegrantes, surfactantes, etc. Las formulaciones sólidas para
la administración oral pueden constituirse en forma de píldoras,
comprimidos, polvos, gránulos, cápsulas, etc. Estas formulaciones
sólidas pueden comprender al menos un excipiente, como almidón,
carbonato cálcico, sacarosa, lactosa, gelatina, etc. Además de los
excipientes sencillos, pueden utilizarse lubricantes como el
estearato magnésico y talco. Las formulaciones líquidas para la
administración oral pueden ser, por ejemplo, suspensiones,
soluciones internas, emulsiones, jarabes, etc. Estas formulaciones
líquidas puede comprender varios excipientes, por ejemplo, agentes
humectantes, edulcorantes, aromas, y conservantes, así como
diluyentes sencillos como agua, parafina líquida, etc. Ejemplos de
formulaciones para la administración parenteral incluye soluciones
acuosas estériles, soluciones no acuosas, suspensiones, emulsiones,
agentes liofilizados y supositorios. Para la formación de
soluciones o suspensiones no acuosas, pueden utilizarse aceites
vegetales como polipropilenglicol, polietilenglicol y aceite de
oliva, y un éster inyectable como el oleato de etilo. Como bases de
supositorios, pueden utilizarse witepsol, microgol, Tween 61,
aceite de cacao, lauringe y gelatina de glicerol. Para ayudar a la
absorción del ingrediente farmacéuticamente útil en las células,
pueden utilizarse formas de dosificación en liposomas.
La dosis terapéuticamente efectiva de los
ingredientes farmacéuticamente efectivos está en el rango de 0,002
a 1 mg/kg de peso corporal y preferiblemente en el rango de 0,02 a
0,2 mg/kg de peso corporal para el cDNA de RUNX3, en el rango de
0,001 a 0,5 mg/kg de peso corporal y preferiblemente en el rango de
0,01 a 0,1 mg/kg de peso corporal para el RNA de RUNX3, y en el
rango de 0,04 a 4 mg/kg y preferiblemente en el rango de 0,4 a 1
mg/kg de peso corporal para la proteína de RUNX3.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporcionan utilizaciones del gen RUNX3 y sus
proteínas en el desarrollo de agentes anticancerígenos y en el
diagnóstico del cáncer.
Tal como se ha descrito antes, el gen RUNX3 de
la presente descripción muestra una excelente actividad supresora
de tumores y es indispensable para la apoptosis dependiente de
TGF-\beta. La expresión de RUNX3 está suprimida
en alrededor del 47% de las líneas celulares de cáncer gástrico y
alrededor del 30% de líneas celulares de cáncer de pulmón (cerca
del 37% del número total de líneas celulares de cáncer gástrico y de
pulmón). Además, la supresión de la expresión génica de RUNX3 se
atribuye a la metilación anormal del DNA de las islas CpG
localizadas en los loci cercanos al exón 1 del gen RUNX3. Además, el
tratamiento con un inhibidor de la metilasa de DNA o un inhibidor
de la desacetilasa de histonas puede inducir la expresión del gen
RUNX3. Por lo tanto, puede utilizarse el gen RUNX3 de la presente
descripción y las proteínas producidas a partir de éste, en el
desarrollo no sólo de agentes anticancerígenos, sino también en el
desarrollo de métodos diagnósticos para la detección del cáncer, en
los que se mide la metilación anormal del DNA de las islas CpG en
los loci cercanos al exón 1 del gen RUNX3.
Basándonos en los hechos presentados en la
presente descripción, pueden proporcionarse como ingredientes
farmacéuticamente efectivos las composiciones farmacéuticas que
comprenden materiales capaces de regular la metilación de una
secuencia de nucleótidos que incluye islas CpG cercanas al exón 1 de
RUNX3 para la prevención y tratamiento del cáncer.
Un método para el diagnóstico del cáncer que se
caracteriza por detectar la metilación de la secuencia de
nucleótidos que contiene las islas CpG presentes cerca del exón 1
del gen RUNX3 comprende los pasos de:
aislar el DNA genómico de un tejido tumoral de
un sujeto;
digerir el DNA genómico con un enzima de
restricción sensible a la metilación del DNA;
separar el DNA genómico digerido en un gel de
agarosa mediante electroforesis y transferirlo a una membrana;
hibridar el DNA genómico digerido con una sonda
de DNA radiomarcada para el gen RUNX3; y
exponer la membrana a una película para detectar
la expresión del gen RUNX3.
De acuerdo con otra realización de la presente
descripción, un método para el diagnóstico del cáncer comprende los
pasos de:
Aislar el DNA genómico a partir de sangre o un
tejido tumoral de un sujeto;
digerir el DNA genómico con un enzima de
restricción sensible a la metilación del DNA;
realizar una reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) utilizando las digestiones del DNA genómico como molde y
utilizando como cebadores ciertas partes de la secuencia de
nucleótidos de Id. de Sec. Nº:3;
separar los productos de PCR mediante
electroforesis en un gel de agarosa para detectar la amplificación
de una secuencia de DNA de interés.
El método diagnóstico que utiliza la PCR está
basado en el principio de que los productos de PCR sólo se obtienen
si la región del DNA de interés está metilada; de otro modo no se
obtienen productos.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un microchip biológico para utilizar en
el diagnóstico del cáncer, que comprende una parte del cDNA de RUNX3
Id. de Sec. Nº:1 o las proteínas producidas a partir del mismo.
Generalmente, un microchip biológico para el
diagnóstico de enfermedades, que está basado en los principios de
la biología molecular e ingeniería electrónica, posee de decenas a
decenas de miles de DNA o proteínas integradas en un chip pequeño.
Gracias al alto nivel de integración, el microchip biológico puede
utilizarse para analizar al menos cientos de genes o proteínas en
un corto periodo de tiempo. Por lo tanto, el chip biológico puede
utilizarse para realizar una búsqueda de nuevos genes o para el
diagnóstico de enfermedades muy rápidamente y de forma simple, en
comparación con las técnicas de bioingeniería habituales. Los chips
biológicos pueden clasificarse en chips de oligonucleótidos y chips
de cDNA de acuerdo con los materiales genéticos integrados en el
mismo, y pueden fabricarse de acuerdo con su utilización, por
ejemplo búsqueda de genes, enfermedades a diagnosticar, etc. Pueden
utilizarse microchips que utilizan partes de la secuencia de
nucleótidos del cDNA de RUNX3 o anticuerpos frente a proteínas
producidas a partir de fragmentos del cDNA de RUNX3 para el
diagnóstico de varios cánceres, incluyendo el cáncer gástrico y de
pulmón.
Puede conseguirse un mayor entendimiento de la
presente invención mediante los siguientes ejemplos, que se incluyen
para ilustrar y no pretenden limitar la presente invención.
Para elucidar la función del gen RUNX3 in
vivo, se establecieron cepas celulares capaces de sobreexpresar
el gen RUNX3 en sentido directo y el gen RUNX3 en sentido reverso
como sigue.
El gen RUNX3 humano clonado por los presentes
inventores en 1995 (Bae et al., Gene, 159
(2):245-248, 1995; Nº registro GenBank de la
secuencia de nucleótidos del cDNA Z35278) se utilizó para construir
vectores plasmídicos capaces de expresar RUNX3. El cDNA del gen
RUNX3 tiene la secuencia de nucleótidos Id. de Sec. Nº:1 con un
marco abierto de lectura con una longitud desde el codón de inicio
de traducción al codón de parada de la traducción, que codifica un
polipéptido que consiste en 415 aminoácidos cuya presunta secuencia
aminoacídica es el Id. de Sec. Nº:2 (Fig. 1a a 1c). Un fragmento de
DNA que comprende islas CpG presentes en las cercanías del exón 1
del gen RUNX3 tiene la secuencia de nucleótidos de Id. de Sec. Nº:3
(Fig. 2a y 2b).
Un fragmento de DNA cortado con BamHI de 2.244
pb (Fig. 1a) que comprende una región codificante del cDNA del gen
RUNX3 de Id. de Sec. Nº:1, se insertó en sentido directo en un
vector pEF-BOS (Mizushima et al., Nucleic
Acids Res., 18 (17):5322, 1990) en una diana XbaI para construir un
vector plasmídico recombinante, denominado
pEF-BOS-Rx3, que expresa un gen
RUNX3 en sentido directo.
Por otro lado, el cDNA de RUNX3 se insertó en
sentido reverso en un vector pEF-BOS en una diana
XbaI para construir un vector recombinante, denominado
pEF-BOS-Rx3-AS.
El vector plasmídico
pEF-BOS-Rx3, establecido en el
Ejemplo 1-1 y pcDNA3.1, que contiene un marcador de
selección neo, se cotransfectaron en la cepa MKN28 mediante el
método de Lipofectamina (Gibco BRL) como especifican los
fabricantes. MKN28 no expresa de forma endógena el RUNX3. Los
transfectados estables que contienen el
pEF-BOS-Rx3 (RNA de RUNX3 en sentido
directo) se seleccionaron en presencia de G418. La cepa MKN28 que
sobreexpresa el RNA de RUNX3 en sentido directo se denominó
MKN28-Rx3 y se depositó en la Korean Collection for
Type Culture del Korea Research Institute of Bioscience and
Biotechnology (KRIBB) con el Nº de depósito KCTC 0933BP el 9 de
enero de 2001.
Las cepas capaces de expresar el gen RUNX3 en
sentido reverso se establecieron mediante cotransfección del vector
plasmídico
pEF-BOS-Rx3-AS junto
con pcDNA3.1, que contiene un marcador de selección, en la cepa
SNU16, una línea celular de cáncer gástrico (Kim et al., J.
Natl. Cancer Inst., 8 (13):938-943, 1991), que tiene
el gen p53 inactivado y un sistema de señalización de
TGF-\beta normal (Park et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A., 91 (10):8772-8776, 1994). Los
transfectados estables se obtuvieron de la misma forma que en el
caso anterior. Dos transfectados que expresaban de forma excesiva
el gen RUNX3 en sentido reverso para inhibir selectivamente la
expresión del gen RUNX3 se denominaron
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12, y
se depositaron en la Korean Collection for Type Culture del KRIBB
con los Nº de depósito KCTC 0934BP y KCTC 0935BP el 9 de enero de
2001.
Como comparativa, se transfectó solo pcDNA3.1 en
SUN16 y MKN28, que se cultivaron en presencia de G418. Los clones se
utilizaron como controles, denominados control-SNU16
y control-MKN28.
Para determinar si los transfectados
MKN28-Rx3,
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12,
establecidos en el Ejemplo 1-2, expresan el gen
RUNX3 en sentido directo o el gen RUNX3 en sentido reverso en
grandes cantidades, se realizó un análisis de Northern blot.
El RNA total celular se obtuvo de cada cepa
celular de acuerdo con un método estándar (Sambrook et al.,
Molecular Cloning, a laboratory manual, 2ª Ed., 1988, Cold Spring
Harbor Laboratory). Se separaron mediante electroforesis 5
microgramos de cada preparación de RNA en un gel de
agarosa/formaldehído al 1,2% y se transfirieron a una membrana de
nylon Hybond-N+ (Amersham). El cDNA de RUNX3 de Id.
de Sec. Nº:1 (Bae et al., Gene, 159
(2):245-248, 1995) se marcó con
[\alpha^{-32}P]dCTP para su utilización como sonda para
el análisis de hibridación. La hibridación se realizó mediante la
incubación de la membrana de nylon Hybond-N+ y la
sonda de DNA de RUNX3 radiomarcada a 65ºC durante 16 horas en
solución de Denhardt 5x, que comprende SSPE 5x, SDS al 0,5% y 100
mg/ml de esperma de salmón. Después, la membrana de nylon se lavó
dos veces con una solución de SSPE 2x/SDS al 0,1% a temperatura
ambiente durante 15 min. y dos veces con una solución de SSPE
0,1x/SDS al 0,1% a 65ºC durante 15 min. La membrana se expuso a una
película Kodak XAR-5 durante 16 horas a -70ºC para
generar una autoradiografía.
En la autoradiografía obtenida a partir de la
cepa MKN28-Rx3, se observó una única banda en una
posición cercana a la del RNA 18S, lo que verifica la expresión del
cDNA de RUNX3 en la cepa. Por el contrario, se encontró que las
células
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12,
que son portadoras del cDNA de RUNX3 en sentido reverso, generaban
tránscritos del gen RUNX3 en sentido reverso de varios tamaños,
según indicaban las múltiples bandas de la autoradiografía. En la
cepa control-SUN16, la expresión del gen RUNX3
endógeno no se detectó mediante el análisis de Northern blot (véase
la Fig. 3).
Las células SNU16, que normalmente expresan el
gen RUNX3, y las células
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12 en
las que se sobreexpresa un cDNA RUNX3 en sentido reverso para
inhibir de forma selectiva la expresión del gen RUNX3 normal, se
trataron de individualmente con TGF-\beta1 (1
ng/ml), tras lo que se contaron las células viables a lo largo de
un periodo de tiempo. Los resultados se muestran en la Fig. 4a.
Como se muestra en la Fig. 4a, el tratamiento
con TGF-\beta1 indujo la muerte celular en las
células SNU16. Casi todas las células SNU16 murieron en los 2 días
siguientes al tratamiento con TGF-\beta1 a una
concentración de 1 ng/ml. No obstante, las células
SNU16-Rx3-AS-c11, en
las que el gen RUNX3 en sentido reverso se expresaba en exceso para
inhibir de forma selectiva la expresión del gen RUNX3, no murieron
tras el tratamiento con TGF-\beta1. Estos
resultados sugieren que el gen RUNX3 está involucrado en la muerte
celular inducida por TGF-\beta1 en las células
SNU16.
Las células que mueren mediante la vía de la
muerte celular programada muestran un patrón distinto de bandas de
DNA cuando se realiza una electroforesis en un gel de agarosa. Tras
el tratamiento con 1 ng/ml de TGF-\beta1 durante
6 horas, las cepas control-SNU16,
SNU16-Rx3-ASc11 y
SNU16-Rx3-AS-c12 se
lisaron para aislar los DNA genómicos de acuerdo con un método
estándar (Sambrook et al., 1988, Molecular Cloning: a
laboratory manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, USA). Se realizó una electroforesis de 0,2 \mug
de cada uno de las preparaciones de DNA genómico en un gel de
agarosa al 1,5% y se visualizó con bromuro de etidio bajo luz UV.
Los resultados se proporcionan en la Fig. 4b.
Como se observa en esta figura, se formaron
bandas de DNA apoptótico visibles específicas de la muerte celular
programada a partir de las células SNU16 tratadas con
TGF-\beta1 (Fig. 4b, carriles 1 y 2). No se
observaron bandas apoptóticas en el DNA de las células
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12,
ambas con sobreexpresión del gen RNX3 en sentido reverso, y por lo
tanto tienen una reducción selectiva de la expresión de RUNX3 (Fig.
4b, carriles 3 a 6).
Se concluye a partir de estos resultados que las
células SNU16 mueren a causa de los estímulos del
TGF-\beta1 de una vía apoptótica y que RUNX3 es
necesario para el proceso.
Es conocido que la apoptosis inducida por
TGF-\beta1 es un mecanismo muy importante para la
supresión de la progresión de células normales a cancerosas y que
la mayoría de los factores de la vía de TGF-\beta1
tienen actividad supresora de tumores. Se ha analizado la actividad
supresora de tumores del gen RUNX3 utilizando ratones desnudos, con
expectativas de que se observará un efecto antitumoral.
Con esta finalidad, se resuspendieron las cepas
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12, en
las que la expresión del gen RUNX3 está selectivamente inhibida, y
la cepa control-SUN16 en salina tamponada con
fosfato (PBS) al 0,85% a una densidad de 3 x 10^{7} células/ml, y
se inyectaron 0,3 ml de cada suspensión por vía subcutánea en
grupos de ratones desnudos. Por otro lado, se resuspendieron la cepa
MKN28-Rx3 que muestra sobreexpresión del RNA de
RUNX3 en sentido directo y la cepa control-MKN28 en
PBS al 0,85% a una densidad de 5 x 10^{7} células/ml, y se
inyectaron 0,3 ml de cada suspensión por vía subcutánea en otros
grupos de ratones desnudos. Cada clon de las cepas se administró a
9 ratones desnudos, que constituyeron un grupo. La tumorigenicidad
de las cepas MKN28-Rx3 y control
MKN-28 se observó durante 37 días tras la inyección.
La tumorigenicidad de las células
SNU16-Rx3-AS-c11,
SNU16-Rx3-AS-c12 y
control-SNU16 se monitorizó durante 98 días. Durante
estos periodos de tiempo, se midió periódicamente el tamaño externo
de las masas cancerosas que se formaron. En los últimos días, los
ratones se sacrificaron para escindir las masas cancerosas para su
comparación.
Se observó que los tumores se desarrollaron a
tasas mayores en los ratones en los que se inyectaron las células
SNU16-Rx3-AS-c11 o
SNU16-Rx3-AS-c12 que
en los ratones en los que se inyectaron las células control SNU16,
como se muestra en la Fig. 5a. Más detalladamente, se midió que el
volumen de las masas cancerosas formadas en el grupo inyectado con
las células control SNU16 era de 800 mm^{3} al último día. En
cambio, las masas cancerosas de los grupos inyectados con las
células
SNU16-Rx3-AS-c11 y
SNU16-Rx3-AS-c12
midieron 1.600 mm^{3} de volumen, dos veces mayores que las del
grupo control. Las masas cancerosas se escindieron de los ratones
noventa y nueve días tras la inyección, y se compararon entre ellas.
Las masas cancerosas del grupo experimental fueron marcadamente
mayores que las del grupo control, como se observa en la Fig.
5c.
En las células MKN28-Rx3, en las
que se expresa el gen RUNX3 en sentido directo, y las células
control MKN28 también se analizó la actividad supresora de tumores
utilizando ratones desnudos del mismo modo que se utilizó con las
células SNU16. Los ratones a los que se inyectaron células
MKN28-Rx3 mostraron una tumorigénesis
significativamente reducida comparado con los ratones a los que se
inyectaron células control MKN28, como se muestra en la Fig. 5b. En
detalle, las masas cancerosas del grupo control midieron 600
mm^{3} de volumen el último día. En cambio, las masas cancerosas
del grupo experimental inyectado con MKN28-Rx3 eran
pequeñas, de 250 mm^{3}, lo que demuestra que el crecimiento
tumoral se redujo en un 58%. Las masas cancerosas se escindieron de
los ratones treinta días tras la inyección y se compararon entre
ellas. Las masas cancerosas extraídas del grupo experimental
inyectado con MKN28-Rx3 eran macroscópicamente
menores que las escindidas del grupo control (Fig. 5c).
En conjunto, estos resultados demuestran que el
gen RUNX3 tiene actividad supresora de tumores.
El patrón de expresión del gen RUNX3 se analizó
en varias líneas celulares tumorales mediante
RT-PCR. Los RNA totales se aislaron a partir de 15
líneas celulares de cáncer gástrico y 17 líneas celulares de cáncer
de pulmón, y se utilizaron para determinar si estas líneas celulares
producían mRNA de RUNX3. Las células de cáncer gástrico utilizadas
en este análisis fueron SNU1, SNU5, SNU719, NUGC3, MKN1, MKN7,
MKN28, MKN45, MKN74, AGS, KatoIII, RF1, RF48 y AZ521. Las líneas
celulares de cáncer de pulmón fueron NCIH522, 86-2,
A549, LK79, LK87, LCSC#1, LCSC#2, NCI-H23,
NCI-H226, NCI-460,
NCI-H322, Sq-19,
NCI-H1915, NCIH630, Hs 888L u, Lu65 y
LX-1. Todas se obtuvieron de la Korean Collection
for Type Culture del Korea Research Institute of Bioscience and
Biotechnology (KRIBB).
El RNA total se aisló de cada línea celular
tumoral de acuerdo con el método de guanidino estandarizado en un
sólo paso (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory
manual, 2ª Ed., 1988, Cold Spring Harbor Laboratory). Utilizando el
equipo Superscript (Gibco BRL) de acuerdo con el protocolo del
fabricante, se realizó una transcripción reversa para preparar cDNA
a partir del RNA total aislado con oligo-dT como
cebadores. En base al cDNA, el gen RUNX3 se amplificó mediante
RT-PCR para determinar la producción de mRNA de
RUNX3. Para esta RT-PCR, se sintetizaron dos pares
de cebadores de PCR, PS-N y PSC, que se componen de
un conjunto de cebador en sentido directo PS-NA
(Id. de Sec. Nº:4) y cebador en sentido reverso
PS-NB (Id. de Sec. Nº:5) y un conjunto de cebador
en sentido directo PS-CA (Id. de Sec. Nº:6) y
cebador en sentido reverso PS-CB (Id. de Sec. Nº:7).
Las secuencias nucleotídicas de estos dos pares de cebadores de PCR
se diseñaron en base a la secuencia de nucleótidos del cDNA del gen
RUNX3 Id. de Sec. Nº:1 (Fig. 5a).
Como comparativa, se utilizó el cDNA de
PEBP2\beta/CBFB y el cDNA de la \beta-actina
como controles en la RT-PCR. Para amplificar los
controles, se sintetizaron un par de cebadores para
PEBP2\beta/CBFB, que consisten en el cebador en sentido directo
h-\beta5 (Id. de Sec. Nº:8) y el cebador en
sentido reverso h-\beta3 (Id. de Sec. Nº:9), y un
par de cebadores para la \beta-actina, que
consiste en el cebador en sentido directo h-actina
5 (Id. de Sec. Nº:10) y el cebador en sentido reverso
h-actina 3 (Id. de Sec. Nº:11). Las secuencias
nucleotídicas de estos pares de cebadores se diseñaron en base a las
secuencias nucleotídicas del cDNA de la PEBP2\beta humana y el
cDNA de la \beta-actina.
En un termociclador, como el "modelo 9600"
fabricado por Perkin-Elmer Cetus, la
RT-PCR se inició con una predesnaturalización a
95ºC de los 50 \mul de cada solución de PCR durante 2 min., y
luego se realizaron 30 ciclos de desnaturalización a 95ºC durante
15 s., hibridación a 50ºC durante 1 min. y extensión a 72ºC durante
1 min. Tras completarse la RT-PCR, se sometieron a
electroforesis 5 \mul del producto de RT-PCR en un
gel de agarosa al 1,2% y se tiñó con de bromuro de etidio para su
observación bajo luz UV.
\newpage
Entre las líneas celulares de cáncer gástrico,
se detectó que SNU5, SNU16, SNU719, MKN1, MKN45, RF1, RF48, MKN7 y
AZ521 producen productos de RT-PCR con los tamaños
esperados (1.080 pb con el par de cebadores PS-N y
870 pb con el par de cebadores PS-C). Sin embargo,
MKN7 produjo productos de RT-PCR en muy baja
cantidad, como se muestra en la Fig. 6b. No se obtuvieron productos
de RT-PCR a partir de las líneas celulares SNU1,
NUGC3, MKN28, MKN74, AGS y KatoIII cuando se utiliza el par de
cebadores PS-N o el par de cebadores
PS-C.
Entre las 17 líneas celulares de cáncer de
pulmón, la expresión del gen RUNX3 se suprimió significativamente
en la línea celular HS888Lu y completamente en las líneas celulares
NCI-H226, NCI-460,
NCI-H630 y Lu65, como se muestra en la Fig. 6c.
Se realizó el análisis de Southern blot para
verificar la amplificación de los productos de
RT-PCR a partir del cDNA del gen RUNX3. Los
productos de RT-PCR se analizaron en un gel de
agarosa al 1,5% bajo un campo eléctrico y los fragmentos de DNA
separados se transfirieron a una membrana de nylon
Hybond-N+.
Utilizando el fragmento BamHI de 2.244 pb del
cDNA de RUNX3 como sonda, se realizó una hibridación de la misma
forma que en el análisis de Northern blot del Ejemplo
1-3, seguido de una autoradiografía en películas
XAR-5. Los resultados se proporcionan en la Fig.
6b.
Como se puede observar en la autoradiografía,
los productos de RT-PCR se amplificaron a partir del
cDNA de RUNX3 (PS-3 ST).
Además, se observó una amplificación de los cDNA
de PEP2\beta y la \beta-actina a partir de
primeras cadenas idénticas de cDNA, lo que indica una falta de
amplificación de los cDNA de RUNX3 en las líneas celulares de
cáncer gástrico SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS, KatoIII,
NCI-H226 y las líneas celulares de cáncer de pulmón
NCI-460, NCI-H630 y Lu65 puede
atribuirse a una falta de expresión del gen RUNX3 en estas líneas
celulares. Asimismo, los bajos niveles de los productos de
RT-PCR en las líneas celulares MKN7 y Hs888Lu
resulta de niveles reducidos de expresión del gen RUNX3 en estas
líneas celulares.
De los resultados anteriores, se hace patente
que el gen RUNX3 está marcadamente o completamente suprimido en
alrededor del 47% de las líneas celulares de cáncer gástrico y
alrededor del 30% de las líneas celulares de cáncer de pulmón. Como
en las células tumorales la apoptosis inducida por
TGF-\beta no ocurre y su tumorigenicidad aumenta
en presencia de una reducción considerable de RUNX3, la supresión de
la expresión del gen RUNX3 puede ser un índice diagnóstico
importante en alrededor del 47% de las células de cáncer gástrico y
alrededor del 30% de las células de cáncer de pulmón (en alrededor
del 37% del total de células tumorales examinadas).
Para determinar si la supresión de la expresión
del gen RUNX3 era causada por la metilación del DNA, se analizó la
correlación entre la expresión del gen RUNX3 y la hipermetilación de
las islas CpG en los loci cercanos al exón 1 de RUNX3 mediante un
Southern blot en DNA genómico utilizando enzimas de restricción
sensibles a la metilación del DNA.
Los DNA genómicos se aislaron a partir de las
líneas celulares tumorales de acuerdo con el método estandarizado
de SDS/proteasa K (Sambrook et al., 1989). Los DNA genómicos
aislados se trataron con un enzima de restricción que no puede
escindir el DNA metilado (SmaI), y por otro lado, con otro que puede
escindir el DNA independientemente de su metilación (BamHI). Las
digestiones con los enzimas de restricción se sometieron a
electroforesis en un gel de agarosa al 1,5% y luego se
transfirieron a una membrana Hybond-N+. Un fragmento
Nhe1/MluI de DNA genómico que comprende islas CpG del gen RUNX3 se
utilizó como sonda de DNA (Fig. 7a), y se realizó una hibridación
del mismo modo que en el análisis de Northern blot del Ejemplo
1-3, seguido de una autoradiografía en películas
XAR-5. El DNA genómico se aisló a partir de
bibliotecas de DNA del genoma humano utilizando como sonda el cDNA
de RUNX3 de Id. de Sec. Nº:1.
Se observó que la digestión SmaI se reducía en
gran medida específicamente en aquellas líneas celulares de cáncer
gástrico en los que no se detectó expresión del gen RUNX3, es decir,
en las líneas celulares SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS y KatoIII,
como se muestra en la Fig. 7b. La línea celular MKN7, en la que el
nivel de expresión era significativamente bajo mostró un patrón de
metilación parcial (Fig. 7b). Estos resultados indican que la
expresión del gen RUNX3 está altamente correlacionada con el nivel
de metilación del DNA en los loci cercanos al exón 1 de RUNX3 en
las líneas celulares tumorales. Como se detectan bandas específicas
del gen RUNX3 en todas las líneas celulares a pesar de las
diferencias en la metilación, puede concluirse que algunas líneas
celulares tumorales en las que la expresión del gen RUNX3 no se
detecta bajo condiciones normales poseen el gen RUNX3 normal, pero
no lo expresan debido a una metilación anormal.
Para determinar si la metilación de DNA
observada en el Ejemplo 5-1 es la causa directa de
la inactivación del gen RUNX3, se analizó la influencia de un
inhibidor de la metiltransferasa de DNA y un inhibidor de la
desacetilasa de histonas sobre la reactivación de la expresión del
gen RUNX3.
Las líneas celulares NUGC3, MKN28 y MKN74
(seleccionadas al azar a partir de las líneas celulares que no
muestran expresión del gen RUNX3 mediante un análisis de
RT-PCR) se trataron con
5-aza-3-desoxicitidina
(AZA, 300 nM), que inhibe la metiltransferasa de DNA, y
tricostatina A (TSA, 1 mM), que inhibe la desacetilasa de histonas,
por separado o en combinación. Tras 3 días de tratamiento, el RNA
total se aisló a partir de cada línea celular de acuerdo con el
mismo método de guanidino en un paso estandarizado utilizado en el
Ejemplo 4-1, y luego se analizó la expresión del
gen RUNX3 mediante RT-PCR utilizando el par de
cebadores PS-N de Id. de Sec. Nº:4 y 5.
Tras el tratamiento con el inhibidor de la
metiltransferasa de DNA o el inhibidor de la desacetilasa de
histonas, se observó la expresión del gen RUNX3, como se muestra en
la Fig. 8. Estos resultados revelan que la hipermetilación suprime
la expresión del gen RUNX3 en alrededor del 37% de las células de
cáncer gástrico y de pulmón debido a la hipermetilación de las islas
CpG en los loci cercanos al exón 1 del gen RUNX3.
Se analizó la toxicidad aguda del plásmido de
expresión que expresa el gen RUNX3 en sentido directo, construido en
el Ejemplo 1-1, como sigue.
Se realizó una prueba de toxicidad aguda
utilizando ratas de un linaje SD específico libre de patógenos de 6
semanas de edad. Se resuspendió pEFBOS-Rx3
(preparado como se describe en el Ejemplo 1-1) en 1
ml de una solución salina fisiológica y se administró en el tibial
anterior de dos ratas con una dosis de 1 mg/kg mediante inyección
intramuscular. Tras la inyección, se monitorizó la aparición en las
ratas de cambios de peso corporal, síntomas clínicos o la muerte,
se les realizaron análisis serológicos y serobioquímicos. Luego, las
ratas se sacrificaron para poder observar sus órganos abdominal y
torácicos. En ningún animal se encontraron síntomas clínicos
específicos a resaltar. Ningún animal murió tras la administración
del material de prueba y no se observaron cambios en el peso
corporal. Los ensayos serológicos, serobioquímicos y las pruebas de
autopsia fueron todos normales. De acuerdo con esto, se concluyó
que el pEF-BOS-Rx3 es seguro, con
una DL_{50} de al menos 1 mg/kg tras la inyección parenteral.
Como se ha descrito aquí previamente, el gen
RUNX3 de la presente invención muestra una excelente actividad
supresora de tumores y está involucrado de forma indispensable en la
muerte celular programada (apoptosis) dependiente de
TGF-\beta. Además, la supresión de la expresión
del gen RUNX3 se atribuye a una metilación anormal del DNA en las
islas CpG situadas cerca del exón 1 del gen RUNX3. De acuerdo con
esto, el gen RUNX3 y sus productos (RNA y proteínas) pueden
utilizarse para el desarrollo de terapias génicas para tumores. El
análisis de la metilación anormal del DNA en las cercanías del exón
1 del gen RUNX3 es útil para el diagnóstico del cáncer. Además, los
agente químicos capaces de regular la metilación anormal del DNA y
sus consecuencias (por ejemplo los inhibidores de la
metiltransferasa de DNA y los inhibidores de la HDAC) pueden
utilizarse como agentes antitumorales gracias a su capacidad de
promover la expresión del gen RUNX3.
<110> BAE, Seok-Cheol
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Gen RUNX3 con actividad antitumoral
y la utilización del mismo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Ofpo 12-21
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KopatentIn 1.55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4213
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> cDNA del gen SNUX3 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 415
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> proteína SNUX3 humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> isla CpG en el EXÓN 1 del gen RUNX3
humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo de la pareja de
cebadores Ps-N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador reverso de la pareja de
cebadores Ps-N
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo de la pareja de
cebadores Ps-C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador reverso de la pareja de
cebadores Ps-C
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo de la pareja de
cebadores de cDNA de PEBP2 beta/CBFB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador reverso de la pareja de
cebadores de cDNA de PEBP2 beta/CBFB
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo de la pareja de
cebadores de beta-actina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador reverso de la pareja de
cebadores de beta-actina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
Claims (7)
1. Un plásmido de expresión, que posee un gen
RUNX3 insertado en sentido directo del mismo y permite la expresión
del gen RUNX3 para su uso como agente anticancerígeno.
2. Un gen RUNX3 para utilizar como agente
anticancerígeno.
3. Un cDNA de RUNX3 que posee la secuencia de
nucleótidos Id. de Sec. Nº:1 para su uso como agente
anticancerígeno.
4. Un RNA de RUNX3 transcrito a partir del gen
RUN3 para su uso como agente anticancerígeno.
5. Una proteína de RUNX3 para su uso como agente
anticancerígeno.
6. El uso de un cebador que consta de partes de
la secuencia de nucleótidos de Id. de Sec. Nº:3 en la elaboración de
un agente diagnóstico para el diagnóstico del cáncer, en el que el
cebador es capaz de amplificar la secuencia de nucleótidos que
contiene islas CpG cercanas al exón 1 del gen RUNX3 y utilizarlo
para la detección de la metilación de la secuencia de
nucleótidos.
7. Un microchip biológico para el diagnóstico
del cáncer, que comprende un oligonucleótido que consiste en parte
del cDNA de RUNX3 de Id. de Sec. Nº:1 o un anticuerpo dirigido
contra una proteína de RUNX3 producida a partir del cDNA.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR10-2001-0004018A KR100475649B1 (ko) | 2001-01-29 | 2001-01-29 | 항암활성을 나타내는 ｒｕｎｘ３ 유전자 및 그의 용도 |
| KR10-2001-0004018 | 2001-01-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2310545T3 true ES2310545T3 (es) | 2009-01-16 |
Family
ID=19705043
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES01902862T Expired - Lifetime ES2310545T3 (es) | 2001-01-29 | 2001-01-30 | Gen runx3 con actividad antitumoral y la utilizacion del mismo. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7368255B2 (es) |
| EP (1) | EP1356030B1 (es) |
| JP (1) | JP4018542B2 (es) |
| KR (1) | KR100475649B1 (es) |
| AT (1) | ATE402256T1 (es) |
| DE (1) | DE60135022D1 (es) |
| DK (1) | DK1356030T3 (es) |
| ES (1) | ES2310545T3 (es) |
| PT (1) | PT1356030E (es) |
| WO (1) | WO2002061069A1 (es) |
Families Citing this family (56)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB0307428D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Compartmentalised combinatorial chemistry |
| US20060078893A1 (en) | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Medical Research Council | Compartmentalised combinatorial chemistry by microfluidic control |
| GB0307403D0 (en) | 2003-03-31 | 2003-05-07 | Medical Res Council | Selection by compartmentalised screening |
| WO2005040814A1 (en) * | 2003-10-14 | 2005-05-06 | Cancer Research Technology Limited | Methods and means of cancer detection by histone modification |
| US20050221339A1 (en) | 2004-03-31 | 2005-10-06 | Medical Research Council Harvard University | Compartmentalised screening by microfluidic control |
| US7968287B2 (en) | 2004-10-08 | 2011-06-28 | Medical Research Council Harvard University | In vitro evolution in microfluidic systems |
| WO2006057623A1 (en) * | 2004-11-29 | 2006-06-01 | National University Of Singapore | Runx3 antibodies and method of obtaining the antibodies |
| KR100748185B1 (ko) * | 2005-01-31 | 2007-08-10 | 한국생명공학연구원 | Ｌｒｒｃ3ｂ 유전자를 포함하는 항암용 조성물 및 상기유전자를 이용한 진단방법 |
| WO2006096498A2 (en) * | 2005-03-04 | 2006-09-14 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Regulation of runx1 for treatment of pain |
| US7611847B2 (en) | 2005-06-01 | 2009-11-03 | Agency For Science, Technology And Research | Method for identifying an intestinal phenotype |
| WO2006132248A1 (ja) * | 2005-06-07 | 2006-12-14 | Daiichi Pharmaceutical Co., Ltd. | Ｒｕｎｘのユビキチン化方法 |
| JP2009536313A (ja) | 2006-01-11 | 2009-10-08 | レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド | ナノリアクターの形成および制御において使用するマイクロ流体デバイスおよび方法 |
| JP2009531065A (ja) * | 2006-03-29 | 2009-09-03 | ジョン ウェイン キャンサー インスティチュート | エストロゲン受容体アルファのメチル化、およびその使用 |
| US20080014589A1 (en) | 2006-05-11 | 2008-01-17 | Link Darren R | Microfluidic devices and methods of use thereof |
| US9562837B2 (en) | 2006-05-11 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Systems for handling microfludic droplets |
| US9012390B2 (en) | 2006-08-07 | 2015-04-21 | Raindance Technologies, Inc. | Fluorocarbon emulsion stabilizing surfactants |
| US8772046B2 (en) | 2007-02-06 | 2014-07-08 | Brandeis University | Manipulation of fluids and reactions in microfluidic systems |
| US8592221B2 (en) | 2007-04-19 | 2013-11-26 | Brandeis University | Manipulation of fluids, fluid components and reactions in microfluidic systems |
| JP5697448B2 (ja) | 2007-09-17 | 2015-04-08 | エムディーエックスヘルス エスエー | 膀胱癌の検出のための新規なマーカー |
| KR20100093523A (ko) * | 2007-11-06 | 2010-08-25 | 주식회사 프로셀제약 | 세포투과성 ｒｕｎｘ３ 재조합 단백질, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항암 조성물 |
| WO2010009365A1 (en) | 2008-07-18 | 2010-01-21 | Raindance Technologies, Inc. | Droplet libraries |
| US12038438B2 (en) | 2008-07-18 | 2024-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Enzyme quantification |
| WO2010014043A1 (en) * | 2008-07-29 | 2010-02-04 | Agency For Science, Technology And Research | Methods of preventing, arresting or reversing tumourigenesis and of identifying compounds capable of the same |
| SG10201901089TA (en) | 2008-11-10 | 2019-03-28 | Arbutus Biopharma Corp | Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
| US8528589B2 (en) | 2009-03-23 | 2013-09-10 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulation of microfluidic droplets |
| WO2011042564A1 (en) | 2009-10-09 | 2011-04-14 | Universite De Strasbourg | Labelled silica-based nanomaterial with enhanced properties and uses thereof |
| US10837883B2 (en) | 2009-12-23 | 2020-11-17 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Microfluidic systems and methods for reducing the exchange of molecules between droplets |
| US9399797B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-07-26 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| US10351905B2 (en) | 2010-02-12 | 2019-07-16 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
| US9366632B2 (en) | 2010-02-12 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| WO2011100604A2 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Raindance Technologies, Inc. | Digital analyte analysis |
| US9562897B2 (en) | 2010-09-30 | 2017-02-07 | Raindance Technologies, Inc. | Sandwich assays in droplets |
| US9364803B2 (en) | 2011-02-11 | 2016-06-14 | Raindance Technologies, Inc. | Methods for forming mixed droplets |
| EP3736281A1 (en) | 2011-02-18 | 2020-11-11 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Compositions and methods for molecular labeling |
| EP2714970B1 (en) | 2011-06-02 | 2017-04-19 | Raindance Technologies, Inc. | Enzyme quantification |
| US8841071B2 (en) | 2011-06-02 | 2014-09-23 | Raindance Technologies, Inc. | Sample multiplexing |
| US8658430B2 (en) | 2011-07-20 | 2014-02-25 | Raindance Technologies, Inc. | Manipulating droplet size |
| KR101878451B1 (ko) * | 2011-09-06 | 2018-07-16 | 벤텍스 주식회사 | 약물전달기능을 갖는 언더웨어 |
| EP2823303A4 (en) | 2012-02-10 | 2015-09-30 | Raindance Technologies Inc | MOLECULAR DIAGNOSTIC SCREEN TYPE ASSAY |
| WO2013165748A1 (en) | 2012-04-30 | 2013-11-07 | Raindance Technologies, Inc | Digital analyte analysis |
| US9845471B2 (en) | 2013-01-15 | 2017-12-19 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Compositions and methods for treating pancreatic cancer |
| EP2986762B1 (en) | 2013-04-19 | 2019-11-06 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analyte analysis |
| US11901041B2 (en) | 2013-10-04 | 2024-02-13 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Digital analysis of nucleic acid modification |
| US9944977B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-04-17 | Raindance Technologies, Inc. | Distinguishing rare variations in a nucleic acid sequence from a sample |
| US11193176B2 (en) | 2013-12-31 | 2021-12-07 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Method for detecting and quantifying latent retroviral RNA species |
| US10647981B1 (en) | 2015-09-08 | 2020-05-12 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Nucleic acid library generation methods and compositions |
| CN106011263B (zh) * | 2016-06-28 | 2020-01-07 | 宁波大学 | 用于检测与胃癌相关的ndrg4基因甲基化程度的试剂盒及其应用 |
| WO2018021200A1 (ja) * | 2016-07-29 | 2018-02-01 | 国立大学法人京都大学 | Ｒｕｎｘ阻害剤 |
| US10998178B2 (en) | 2017-08-28 | 2021-05-04 | Purdue Research Foundation | Systems and methods for sample analysis using swabs |
| KR101994957B1 (ko) | 2017-11-30 | 2019-07-01 | 고려대학교 산학협력단 | Runx3 단백질 또는 이를 코딩하는 runx3 유전자를 포함하는 trail의 항암 효과 증진용 약학 조성물 |
| WO2019210863A1 (zh) * | 2018-05-03 | 2019-11-07 | 科济生物医药（上海）有限公司 | 免疫效应细胞及其应用 |
| JP7144037B2 (ja) * | 2018-07-25 | 2022-09-29 | 国立大学法人山口大学 | がんの診断用バイオマーカー |
| US20220088126A1 (en) * | 2019-01-08 | 2022-03-24 | Biorunx | Pharmaceutical composition comprising runx3 gene or protein as active ingredient for prevention or treatment of k-ras mutant lung cancer |
| CN112662764A (zh) * | 2020-03-17 | 2021-04-16 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 一种检测11种癌症的探针组合物 |
| KR20210131855A (ko) * | 2020-04-23 | 2021-11-03 | 런엑스 주식회사 | R-point 조절 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 폐암 치료용 약학적 조성물, 상기 복합체의 형성 여부를 이용한 폐암 치료제 스크리닝 방법 및 폐암 진단 방법 |
| US11767541B1 (en) * | 2023-03-27 | 2023-09-26 | Genecraft, Inc. | Adeno-associated virus complex with improved expression of RUNX3 gene and uses for preventing or treating KRAS mutated lung cancer |
-
2001
- 2001-01-29 KR KR10-2001-0004018A patent/KR100475649B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2001-01-30 AT AT01902862T patent/ATE402256T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-01-30 ES ES01902862T patent/ES2310545T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-30 JP JP2002561626A patent/JP4018542B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-30 PT PT01902862T patent/PT1356030E/pt unknown
- 2001-01-30 WO PCT/KR2001/000121 patent/WO2002061069A1/en active Application Filing
- 2001-01-30 US US10/466,938 patent/US7368255B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2001-01-30 DE DE60135022T patent/DE60135022D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-30 EP EP01902862A patent/EP1356030B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-30 DK DK01902862T patent/DK1356030T3/da active
-
2008
- 2008-03-19 US US12/051,649 patent/US20080261883A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20040146986A1 (en) | 2004-07-29 |
| EP1356030A1 (en) | 2003-10-29 |
| JP2004529619A (ja) | 2004-09-30 |
| ATE402256T1 (de) | 2008-08-15 |
| WO2002061069A1 (en) | 2002-08-08 |
| US7368255B2 (en) | 2008-05-06 |
| KR100475649B1 (ko) | 2005-03-10 |
| PT1356030E (pt) | 2008-10-30 |
| DK1356030T3 (da) | 2008-11-03 |
| EP1356030B1 (en) | 2008-07-23 |
| US20080261883A1 (en) | 2008-10-23 |
| DE60135022D1 (de) | 2008-09-04 |
| EP1356030A4 (en) | 2005-02-02 |
| JP4018542B2 (ja) | 2007-12-05 |
| KR20020063387A (ko) | 2002-08-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2310545T3 (es) | Gen runx3 con actividad antitumoral y la utilizacion del mismo. | |
| Antignac et al. | Alport syndrome and diffuse leiomyomatosis: deletions in the 5′ end of the COL4A5 collagen gene | |
| ES2340662T3 (es) | Factor de crecimiento de fibroblastos (fgf23) nuevo procedimiento para el uso. | |
| Setoguchi et al. | Aberrations of the p53 tumor suppressor gene in various tumors in dogs | |
| ES2190466T5 (es) | Gen brca2 de susceptibilidad al cancer de mama ligado al cromosoma 13. | |
| ES2154712T5 (es) | Metodo para diagnosticar la predisposicion al cancer de mama y de ovarios. | |
| Parry et al. | Temperature-sensitive mutants of p16 CDKN2 associated with familial melanoma | |
| ES2296829T3 (es) | Imaginologia, diagnostico y tratamiento de la enfermedad. | |
| ES2815498T3 (es) | Señalización Wnt desregulada dirigida en cáncer utilizando alfa-hélices de BCL-9 estabilizadas | |
| ES2217328T3 (es) | Materiales y procedimientos relacionados con la identificacion y secuenciacion del gen de susceptibilidad al cancer brca2 y utilizaciones del mismo. | |
| Chen et al. | Dysregulated expression of bcl‐2 and bax in oral carcinomas: evidence of post‐transcriptional control | |
| PT954330E (pt) | Proteínas trevo intestinais | |
| US20030172388A1 (en) | Methods and compositions relating to fortilin, an anti-apoptotic molecule, and modulators of fortilin | |
| JP2001502538A (ja) | ミニｅ１ａ遺伝子及び遺伝子産物 | |
| CZ293399A3 (cs) | Kombinovaná terapie tumor-supresorovým gelem a chemoterapie při léčbě nádorových onemocnění | |
| Kent et al. | The reticulocalbin gene maps to the WAGR region in human and to the Small eye Harwell deletion in mouse | |
| JP2002511749A (ja) | ９ｑ３２−３３での腫瘍サプレッサー遺伝子ＤＢＣＣＲ１ | |
| ES2245790T3 (es) | Uso de proteina inhibidora de la apoptosis neuronal (naip). | |
| US20030053995A1 (en) | Methods and compositions for inhibiting EGF receptor activity | |
| ES2288318T3 (es) | Uso de dna-pk. | |
| WO1998022584A1 (en) | C1q RECEPTOR, ENCODING GENE AND APPLICATION IN HOST DEFENSE ENHANCEMENT | |
| EP0960123A1 (en) | Sprouty protein and coding sequence | |
| ES2409338T3 (es) | El polipéptido de MACC1 y su utilización para el diagnóstico de tumores y la terapia tumoral | |
| US7176179B1 (en) | Selective induction of cell death by delivery of amino-terminal interleukin-1-α pro-piece polypeptide | |
| US20050123977A1 (en) | Assay and treatment |