ES2190466T5 - Gen brca2 de susceptibilidad al cancer de mama ligado al cromosoma 13. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE GENERALMENTE AL CAMPO DE LA GENETICA HUMANA. ESPECIFICAMENTE, LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A METODOS Y MATERIALES UTILIZADOS PARA AISLAR Y DETECTAR UN GEN DE PREDISPOSICION AL CANCER DE MAMA HUMANO (BRCA2), ALGUNOS ALELOS MUTANTES QUE CAUSAN SUSCEPTIBILIDAD AL CANCER, EN CONCRETO CANCER DE MAMA. EN CONCRETO, LA INVENCION SE REFIERE A MUTACIONES DE LINEA GERMINAL EN EL GEN BRCA2 Y A SU USO EN EL DIAGNOSTICO DE PREDISPOSICION AL CANCER DE MAMA. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE ADEMAS A MUTACIONES SOMATICAS EN EL GEN BRCA2 EN CANCER DE MAMA HUMANO Y A SU USO EN EL DIAGNOSTICO Y PROGNOSIS DE CANCER DE MAMA HUMANO. ADICIONALMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A MUTACIONES SOMATICAS EN EL GEN BRCA2 EN OTROS CANCERES HUMANOS Y A SU USO EN EL DIAGNOSTICO Y PROGNOSIS DE CANCERES HUMANOS. LA INVENCION TAMBIEN SE REFIERE A LA TERAPIA DE CANCERES HUMANOS QUE TIENEN UNA MUTACION EN EL GEN BRCA2, INCLUYENDO TERAPIA GENICA, TERAPIA DE SUSTITUCION DE PROTEINA Y MIMETICA DE PROTEINA. LA INVENCION SE REFIERE ADEMAS A LA INVESTIGACION DE FARMACOS PARA TERAPIA DE CANCER. FINALMENTE, LA INVENCION SE REFIERE A LA INVESTIGACION DE LAS MUTACIONES DEL GEN BRCA2, LO CUAL ES UTIL PARA DIAGNOSTICAR LA PREDISPOSICION AL CANCER DE MAMA.

Description

Gen BRCA2 susceptibilidad al cáncer de mama ligado al cromosoma 13.

Campo de la invención

La presente invención se refiere de forma general al campo de la genética humana. Específicamente, la presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia codificadora establecida en SEQ ID NO:1 desde la posición nucleotídica 229 a la posición nucleotídica 10482 y que comprende además la mutación asociada con una predisposición al cáncer de mama, en el que T, en la posición nucleotídica 6174, está delecionado, para diagnosticar una predisposición al cáncer de mama en mujeres judías Ashkenazi in vitro. La descripción proporciona métodos y materiales usados para aislar y detectar un gen (BRCA2) que predispone al cáncer humano, algunos de cuyos alelos mutantes causan susceptibilidad al cáncer, en particular, al cáncer de mama en mujeres y hombres. La presente divulgación se refiere además a mutaciones somáticas del gen BRCA2 en el cáncer de mama humano. Finalmente, la divulgación se refiere al cribado del gen BRCA2 en cuanto a mutaciones, que son útiles para diagnosticar la predisposición al cáncer de mama.

Las publicaciones y otros materiales usados aquí para aclarar los antecedentes de la invención, y en particular, los casos que proporcionan detalles adicionales con respecto a la práctica, se referencian por comodidad, por autor y fecha en el siguiente texto y se agrupan del mismo modo en la Lista de referencias bibliográficas adjunta.

Antecedentes de la invención

La genética del cáncer es complicada, implicando a múltiples reguladores positivos del estado transformado (oncogenes), dominantes, así como a múltiples reguladores negativos (genes supresores de tumores), recesivos. Se han caracterizado más de cien oncogenes. Se han identificado menos de una docena de genes supresores de tumores, pero se espera que el número aumente por encima de cincuenta (Knudson, 1993).

La participación de tantos genes destaca la complejidad de los mecanismos de control del crecimiento que operan en las células para mantener la integridad del tejido normal. Esta complejidad se manifiesta de otro modo. Hasta ahora, no se ha demostrado que un único gen participe en el desarrollo de todos, o ni siquiera de la mayoría de los cánceres humanos. Las mutaciones oncogénicas más comunes están en el gen H-ras, encontrado en el 10-15% de todos los tumores sólidos (Anderson et al., 1992). Los genes supresores de tumores más frecuentemente mutados son el gen TP53, delecionado homozigóticamente en aproximadamente el 50% de todos los tumores y el CDKN2, que estaba delecionado homozigóticamente en el 46% de las líneas celulares tumorales examinadas (Kamb et al., 1994a). Sin una diana que sea común a todas las células transformadas, el sueño de una "bala mágica" que pueda destruir o revertir las células cancerosas a la vez que deje sin danos el tejido normal es improbable. La esperanza de una nueva generación de fármacos antitumorales con objetivos específicos se basa en la capacidad para identificar los genes supresores de tumores o los oncogenes que desempeñan un papel general en el control de la división celular.

Los genes supresores de tumores que han sido donados y caracterizados influyen en la susceptibilidad a: 1) retinoblastoma (RB1); 2) tumor de Wilm (WT1); 3) Li-Fraumeni (TP53); 4) poliposis adenomatosa familiar (APC); 5) neurofibromatosis tipo 1 (NF1); 6) neurofibromatosis tipo 2 (NF2); 7) síndrome de von Hippel-Lindau (VHL); neoplasia endocrina múltiple tipo 2A (MEN2A); y 9) melanoma (CDKN2).

Los locus supresores de tumores que han sido cartografiados genéticamente pero que no han sido aislados todavía, incluyen los genes de: neoplasia endocrina múltiple tipo 1 (MEN1); síndrome de cáncer familiar de Lynch 2 (LCFS2); neuroblastoma (NB); síndrome de nevus de las células basales (BCNS); síndrome de Beckwith-Wiedemann (BWS); carcinoma de células renales (RCC); esclerosis tuberosa 1 (TSC1); y esclerosis tuberosa 2 (TSC2). Los genes supresores de tumores que han sido caracterizados hasta la fecha codifican productos con similitudes con una variedad de tipos de proteínas, incluyendo las proteínas que se unen al DNA (WT1), los reguladores auxiliares de la transcripción (RB1), las proteínas activadoras de la GTP-asa o GAP (NF1), los componentes citoesqueléticos (NF2), las quinasas de los receptores unidos a las membranas (MEN2A), los reguladores del ciclo celular (CDKN2) y otros sin ninguna similitud evidente con las proteínas conocidas (APC y VHL).

En muchos casos, se ha demostrado que el gen supresor de tumores identificado originalmente a través de estudios genéticos se ha perdido o se ha mutado en algunos tumores esporádicos. Este resultado sugiere que las regiones de aberración cromosómica pueden significar la posición de importantes genes supresores de tumores implicados tanto en la predisposición genética al cáncer como en el cáncer esporádico.

Una de las características diferenciadoras de varios de los genes supresores de tumores caracterizados hasta la fecha es que, con gran frecuencia, dichos genes están delecionados en ciertos tipos de tumores. Las delaciones implican a menudo la pérdida de un único alelo, la llamada pérdida de heterozigosidad (LOH), pero pueden implicar también la deleción homozigótica de ambos alelos. En la LOH, se supone que el alelo restante no es funcional, ya sea a causa de una mutación heredada preexistente, o ya sea a causa de una mutación esporádica secundaria.

El cáncer de mama es una de las enfermedades más importantes que afectan a las mujeres. Con los índices actuales, las mujeres americanas tienen un riesgo de 1 en 8 de desarrollar cáncer de mama antes de los 95 años (American Cancer Society, 1992). El tratamiento del cáncer de mama en las últimas etapas es a menudo inútil y deformante, lo que hace que la detección precoz tenga una alta prioridad en el tratamiento médico de la enfermedad. El cáncer de ovario, aunque menos frecuente que el cáncer de mama, a menudo es rápidamente fatal y es la cuarta causa más común de mortalidad por cáncer en las mujeres americanas. Los factores genéticos contribuyen a una proporción mal definida de la incidencia del cáncer de mama, estimada en aproximadamente el 5% de todos los casos pero aproximadamente el 25 de los casos diagnosticados antes de los 40 años (Claus et al., 1991). El cáncer de mama ha sido subdividido en dos tipos, los de aparición a una edad temprana y los de aparición a una edad tardía, basándose en un punto de inflexión de la curva de la incidencia específica de la edad de alrededor de los 50 años. Se cree que la mutación de un gen, BRCA1, explica aproximadamente el 45% del cáncer de mama familiar, pero al menos el 80% de las familias con ambos, cáncer de mama y cáncer de ovario (Easton et al., 1993).

El gen BRCA1 ha sido aislado (Futreal et al., 1994; Miki et al., 1994) con un gran esfuerzo después de su cartografía en 1990 (Hall et al., 1990; Narod et al., 1991). Recientemente ha sido cartografiado un segundo locus, BRCA2, en el cromosoma 13 (Wooster et al, 1994) y parece que explica una proporción de cáncer de mama de aparición precoz aproximadamente igual al BRCA1, pero confiere un menor riesgo de cáncer de ovario. El resto de la susceptibilidad al cáncer de mama de aparición precoz se divide entre los genes todavía no cartografiados, para el cáncer familiar y las mutaciones más raras en la línea germinal de genes tales como TP53 (Malkin et al., 1990). Se ha sugerido también que los portadores heterozigotos de formas defectuosas del gen de la ataxia-telangiectasia tienen un riesgo más alto de cáncer de mama (Swift et al., 1976; Swift et al., 1991). El cáncer de mama de aparición a una edad tardía también es a menudo familiar aunque los riesgos en los parientes no son tan altos como los del cáncer de mama de aparición precoz (Cannon-Albright et al., 1994; Mettlin et al., 1990). Sin embargo, no se conoce el porcentaje de tales casos que es debido a susceptibilidad genética.

Ha sido reconocido desde hace tiempo que el cáncer de mama es, en parte, una enfermedad familiar (Anderson, 1972). Numerosos investigadores han examinado los signos de una herencia genética y han llegado a la conclusión de que los datos son muy coherentes con una herencia dominante de uno o varios locus principales de susceptibilidad (Bishop and Gardner, 1980; Go et al., 1983; Williams and Anderson, 1984; Bishop et al., 1988; Newman et al., 1988; Claus et al., 1991). Resultados recientes demuestran que existen al menos tres locus que transmiten la susceptibilidad al cáncer de mama así como a otros cánceres. Estos locus son el locus TP53 sobre el cromosoma 17p (Malkin et al., 1990), un locus de susceptibilidad ligado a 17q conocido como BRCA1 (Hall et al, 1990), y uno o más locus responsables del resto no cartografiado. Hall et al., (1990) indicaron que la susceptibilidad heredada al cáncer de mama en familias con aparición a una edad temprana está ligada al cromosoma 17q21; sin embargo, estudios posteriores realizados por este grupo usando un modelo genético más apropiado refutaron parcialmente la limitación al cáncer de mama de aparición precoz (Margaritte et al., 1992).

La mayor parte de las estrategias para donar el gen (BRCA2) que predispone al cáncer de mama ligado al cromosoma 13 requieren estudios precisos de localización genética. El modelo más sencillo para el papel funcional de BRCA2 considera que los alelos de BRCA2 que predisponen al cáncer son recesivos frente a los alelos naturales; esto es, las células que contienen al menos un alelo de BRCA2 natural no son cancerosas. Sin embargo, las células que contienen un alelo de BRCA2 natural y un alelo que predispone al cáncer pueden sufrir ocasionalmente la pérdida del alelo natural ya sea por mutación aleatoria o por pérdida de cromosomas durante la división celular (sin disgregación). Toda la progenie de una célula mutante semejante carece de la función natural de BRCA2 y puede desarrollar tumores. Según este modelo, los alelos de BRCA2 predisponentes son recesivos, pero la susceptibilidad al cáncer se hereda de forma dominante; las mujeres que tienen un alelo predisponente (y un alelo natural) tienen riesgo de desarrollar cáncer, porque sus células epiteliales mamarias pueden perder espontáneamente el alelo de BRCA2 natural. Este modelo se aplica a un grupo de locus de susceptibilidad al cáncer conocidos como supresores de tumores o antioncogenes, una clase de genes que incluye el gen del retinoblastoma y el gen de la neurofibromatosis. Por inferencia, este modelo puede explicar la función del BRCA1, como ha sido sugerido recientemente (Smith et al.,
1992).

Una segunda posibilidad es que los alelos de BRCA2 predisponentes sean ver-daderamente dominantes; esto es, un alelo de BRCA2 natural no puede superar el papel formador de tumores del alelo predisponente. Por tanto, una célula que porta ambos alelos, el natural y el mutante, no perderá necesariamente la copia natural de BRCA2 antes de dar origen a las células malignas. Por el contrario, las células mamarias de los individuos predispuestos deberían experimentar algunos otros cambios aleatorios que llevan al cáncer.

Si los alelos de BRCA2 predisponentes son recesivos, es de esperar que el gen BRCA2 sea expresado en el tejido mamario normal pero que no sea expresado funcionalmente en los tumores mamarios. Por contraste, si los alelos de BRCA2 predisponentes son dominantes, el gen BRCA2 natural puede ser o no expresado en el tejido mamario normal. Sin embargo, el alelo predisponente probablemente será expresado en las células del tumor mamario.

La unión de BRCA2 al cromosoma 13 fue confirmada independientemente estudiando quince familias que tenían múltiples casos de cáncer de mama de aparición precoz que no estaban ligados a BRCA1 (Wooster et al., 1994). Estos estudios afirman que el gen se localiza dentro de una región grande, de 6 centimorgan (cM) o aproximadamente 6 millones de pares de bases, entre los marcadores D13S289 y D13S267, situando al BRCA2 en una región física definida por 13g12-13. El tamaño de estas regiones y la incertidumbre asociada con ellas ha hecho difícil diseñar e implantar la cartografía física y/o las estrategias de clonación para aislar el gen BRCA2. Como el BRCA1, parece que el BRCA2 confiere un alto riesgo de cáncer de mama de aparición precoz en las mujeres. Sin embargo, no parece que el BRCA2 confiera un riesgo sustancialmente elevado de cáncer de ovario, aunque parece que confiere un elevado riesgo de cáncer de mama en varones (Wooster, et al., 1994).

El documento WO 97/19110 se refiere también a la identificación del gen BRCA2 humano, pero solamente se puede considerar como un documento de la técnica anterior según el Artículo 54(3) de la EPC, con referencia a sus dos primeros documentos de prioridad.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia codificadora establecida en SEQ ID NO:1 desde la posición nucleotídica 229 a la posición nucleotídica 10482 y que comprende además la mutación asociada con una predisposición al cáncer de mama, en el que T, en la posición nucleotídica 6174, está delecionado, para diagnosticar una predisposición al cáncer de mama en mujeres judías Ashkenazi in vitro. La descripción proporciona métodos y materiales usados para aislar y detectar el gen (BRCA2) que predispone al cáncer de mama humano, algunos de cuyos alelos causan susceptibilidad al cáncer, en particular al cáncer de mama en mujeres y hombres. La divulgación se refiere también a mutaciones somáticas del gen BRCA2 en el cáncer de mama humano para uso en el diagnóstico y pronóstico del cáncer de mama humano. Además, la divulgación se refiere al cribado del gen BRCA2 en cuanto a mutaciones, que son útiles para diagnosticar la predisposición al cáncer de mama.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra un mapa esquemático de los STS, P1, BAC y YAC en la región BRCA2.

La Figura 2 muestra la relación secuencia-espacio entre los clones de cDNA, clones híbridos seleccionados, productos de la PCR de cDNA y secuencias genómicas usadas para ensamblar la secuencia transcrita de BRCA2. El 2-Br-C:RACE es un producto de RACE con captura de biotina obtenido a partir del cDNA tanto de la mama humana como del timo humano. El clon de cDNA 1 sC713.1 fue identificado por cribado de un conjunto de testículos humanos y genotecas de cDNA de HepG2 con un clon híbrido seleccionado GT 713. La secuencia 1-BR:CG026® de 5 kb se generó a partir de un producto de la PCR empezando en la unión de los exones 7/8 (dentro de 1 sC713.1) y terminando dentro de un clon híbrido seleccionado que es parte del exón 11. La secuencia del exón 11 se corrigió por comparación con los clones híbridos seleccionados, con la secuencia genómica del dominio público y con los geles de secuenciación de DNA radiactivo. Los clones híbridos seleccionados localizados dentro de dicho exón (los nombres de los clones que empiezan con nH o GT) están situados debajo del mismo. Los clones de cDNA 1 wCBF1B8.1, 1 wCBF1A5.1, 1 wCBF1A5.12, 1 wCBF1B6.2 y 1 wCBF1B6.3 se identificaron cribando un conjunto de glándulas mamarias, placenta, y testículos humanos y las genotecas de cDNA de HepG2 con los clones wXBF1B8, wXPF1A5 y wXBFIB6 atrapados en el exón. El clon 1 wCBF1 B6.3 es quimérico (se indica por la línea cortada), pero su extremo 5' contenía un importante solapamiento con wCBF11A5.1.

1

Las figuras 3A-3D muestran la secuencia de DNA del gen BRCA2 (que se indica también en la SEQ ID NO:1).

La Figura 4 muestra la organización genómica del gen BRCA2. Los exones (casillas y/o líneas verticales) se resuelven a lo largo de las secuencias genómicas (ftp://genome.wustl.edu/pub/gscl/brca;) (líneas horizontales) de tal modo que sus tamaños y espacios son proporcionales. El nombre de cada secuencia genómica se da en el lado izquierdo de la figura. Las secuencias 92M18.00541 y 92M18.01289 realmente se solapan. Las distancias entre las otras secuencias genómicas no se conocen. Ni las bases de datos públicas ni la base de datos de las secuencias de esta invención contenían secuencias genómicas de solapamiento con el exón 21. Los exones 1, 11 y 21 están numerados. El símbolo "*" indica dos exones adyacentes con una separación lo bastante estrecha para que no se resuelvan a esta escala.

Las figuras 5A-5D muestran un análisis de la pérdida de heterozigosidad (LOH) de los tumores de mama primarios. Los alelos de los marcadores STR están indicados por debajo del cromatograma. Se muestra un ejemplo de un tumor heterozigótico en BRCA2 (figuras 5A y 5B) y un ejemplo de un tumor con LOH en BRCA2 (figuras 5C y 5D). Las unidades de fluorescencia están en el eje de ordenadas; el tamaño en pares de bases está sobre el eje de abscisas. N es para el estado normal (figuras 5A y 5C) y T es para el tumor (figuras 5B y 5D).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere al uso de un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia codificadora establecida en SEQ ID NO:1 desde la posición nucleotídica 229 a la posición nucleotídica 10482 y que comprende además la mutación asociada con una predisposición al cáncer de mama, en el que T, en la posición nucleotídica 6174, está delecionado, para diagnosticar una predisposición al cáncer de mama en mujeres judías Ashkenazi in vitro.

En un aspecto, la presente divulgación proporciona un DNA aislado que comprende un cDNA que codifica un polipéptido BRCA2 definido por la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID No:2 o un RNA correspondiente. Un ácido nucleico aislado semejante puede comprender la secuencia codificadora indicada en la SEQ ID No:1 desde la posición nucleotídica 229 a la posición nucleotídica 10482 o un RNA correspondiente.

En un aspecto adicional se divulga un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia codificadora indicada en la SEQ ID No:1 desde la posición nucleotídica 229 a la posición nucleotídica 10482 o un RNA correspondiente, comprendiendo además dicho ácido nucleico una mutación asociada con la predisposición al cáncer de mama, siendo seleccionada dicha mutación entre:

(a)

AC delecionados en las posiciones nucleotídicas 277 y 278; o

(b)

cuatro nucleótidos delecionados en las posiciones 982-985; o

(c)

tener cuatro nucleótidos delecionados en las posiciones 4706-4709; o

(d)

C delecionado en la posición nucleotídica 8525; o

(e)

cinco nucleótidos delecionados en las posiciones 9254-9258; o

(f)

GT delecionados en las posiciones nucleotídicas 4075 y 4076; o

(g)

cinco nucleótidos delecionados en las posiciones 999-1003; o

(h)

T delecionado en la posición nucleotídica 6174; o

(i)

tres nucleótidos delecionados en las posiciones 4132-4134; o

(j)

A delecionado en la posición 1493; o

(k)

una C en lugar de una A en la posición 2411.

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En otro aspecto más, se divulga un ácido nucleico seleccionado del grupo constituido por:

(a) un DNA que comprende la secuencia codificadora indicada en la SEQ ID No:1 desde la posición nucleotídica 229 a la posición nucleotídica 10482 o un RNA correspondiente y

(b) un DNA que se híbrida con un DNA completo que codifica un polipéptido BRCA2 como en (a) anterior y que es al menos 95% complementario comparado con el mismo, o un RNA correspondiente, donde dicho ácido nucleico comprende además una mutación asociada con la predisposición al cáncer de mama, siendo seleccionada dicha mutación entre:

(i)

AC delecionados en las posiciones nucleotídicas 277 y 278; o

(ii)

cuatro nucleótidos delecionados en las posiciones 982-985; o

(iii)

tener cuatro nucleótidos delecionados en las posiciones 4706-4709; o

(iv)

C delecionado en la posición nucleotídica 8525; o

(v)

cinco nucleótidos delecionados en las posiciones 9254-9258; o

(vi)

GT delecionados en las posiciones nucleotídicas 4075 y 4076; o

(vii)

cinco nucleótidos delecionados en las posiciones 999-1003; o

(viii)

tres nucleótidos delecionados en las posiciones 4132-4134; o

(ix)

A delecionado en la posición 1493; o

(x)

una C en lugar de una A en la posición 2411.

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Tales polinucleótidos pueden ser polinucleótidos antisentido. La presente divulgación proporciona también una construcción recombinante que comprende dicho polinucleótido aislado, por ejemplo, una construcción recombinante adecuada para expresión en una célula hospedante transformada.

La presente divulgación proporciona también un ácido nucleico aislado que tiene al menos 15 nucleótidos contiguos de un ácido nucleico de acuerdo con el punto (a) inmediatamente anterior, incluyendo los al menos 15 nucleótidos contiguos dichos, una de dichas mutaciones asociadas con la predisposición al cáncer de mama.

La presente divulgación proporciona además métodos para determinar la variación de la secuencia nucleotídica de un alelo de BRCA2 presuntamente mutante asociado con la predisposición al cáncer de mama a partir de una conocida secuencia nucleotídica que codifica BRCA2 natural no mutante, que comprende los nucleótidos 229-10482 de la SEQ ID NO:1, comprendiendo dicho método, preparar una muestra biológica que contiene dicho alelo de BRCA2 presuntamente mutante y comparar la secuencia nucleotídica del alelo de BRCA2 presuntamente mutante con dicha secuencia no mutante e identificar las diferencias entre las secuencias.

Tales métodos pueden contener además la etapa de amplificar una porción del locus BRCA2, y pueden incluir también una etapa de proporcionar un conjunto de polinucleótidos que son cebadores de la amplificación de dicha porción del locos BRCA2. El método es útil para identificar mutaciones para uso o bien en el diagnóstico de la predisposición al cáncer o bien en el diagnóstico o pronóstico del cáncer.

Comenzando desde una región sobre el cromosoma 13 humano del genoma humano, que tiene un tamaño estimado de aproximadamente 6 millones de pares de bases, se ha identificado una región más pequeña de 1 a 1,5 millones de bases que contiene un locus genético, BRCA2, que causa susceptibilidad al cáncer, incluyendo el cáncer de mama.

La región que contiene el locus BRCA2 fue identificada usando una variedad de técnicas genéticas. Las técnicas de cartografía genética definieron inicialmente la región BRCA2 en términos de recombinación con marcadores genéticos. Basándose en estudios de familias muy extensas ("los kindred") con múltiples casos de cáncer de mama, se ha localizado una región cromosómica que contiene el gen BRCA2. Una región que contiene el locus BRCA2 está físicamente delimitada por los marcadores D13S289 y D13S267.

El uso de los marcadores genéticos proporcionados por esta divulgación permitió la identificación de clones que cubren la región a partir de una genoteca de cromosomas humanos artificiales de levaduras (YAC) o de cromosomas humanos artificiales de bacterias (BAC). Dicho uso permitió también la identificación y preparación de los clones P1 y BAC manipulados más fácilmente a partir de esta región y la construcción de un contig a partir de un subconjunto de los clones. Estos P1, YAC y BAC proporcionan la base para donar el locus BRCA2 y proporcionan la base para desarrollar reactivos eficaces, por ejemplo, para el diagnóstico y tratamiento del cáncer de mama y/o de ovario. Se han aislado de esta región el gen BRCA2 y otros genes de susceptibilidad potencial. El aislamiento se hizo usando un software de atrapamiento (un método de ordenador para identificar las secuencias que probablemente contienen exones codificadores, procedentes de las secuencias de DNA genómico contiguas o discontinuas), técnicas de selección de híbridos y cribado directo, con insertos de cDNA completos o parciales procedentes de los P1 y BAC, en la región para cribar las genotecas de cDNA. Se usaron estos métodos para obtener las secuencias de los locus expresados en la mama y otros tejidos. Estos locus candidatos se analizaron para identificar las secuencias que confieren la susceptibilidad al cáncer. Se ha descubierto en esta invención que hay mutaciones en la secuencia codificadora del locus BRCA2 en las familias, las cuales son responsables de la susceptibilidad al cáncer ligada con el cromosoma 13, conocidas como BRCA2. La presente invención no sólo facilita la detección precoz de ciertos cánceres, tan vital para la supervivencia del paciente, sino que permite también la detección de los individuos susceptibles antes de que desarrollen el cáncer.

Recursos de población

Las familias de Utah, grandes, bien documentadas, son especialmente importantes para proporcionar buenos recursos para estudios genéticos humanos. Cada familia larga proporciona independientemente la capacidad de detectar si el alelo de BRCA2 de susceptibilidad es segregado en dicha familia. Sólo se pueden obtener recombinantes informativos de la localización y aislamiento del locos BRCA2 de aquellas familias suficientemente grandes para poder confirmar la presencia de un alelo de susceptibilidad. Los árboles genealógicos grandes son especialmente importantes para estudiar el cáncer de mama, ya que la penetrancia del alelo de BRCA2 de susceptibilidad se reduce tanto por la edad como por el sexo, haciendo difíciles de encontrar árboles genealógicos informativos. Además, los árboles genealógicos grandes son esenciales para construir los haplotipos de los individuos fallecidos mediante inferencia de los haplotipos de sus parientes próximos.

Aunque también otras poblaciones pueden proporcionar información beneficiosa, tales estudios requieren generalmente un esfuerzo mucho mayor, y las familias son usualmente mucho más pequeñas y por tanto menos informativas. La incidencia del cáncer de mama ajustado según la edad es en Utah 20% más baja que la tasa media de Estados Unidos. Probablemente la incidencia más baja en Utah se debe en gran medida a una edad temprana para el primer embarazo, aumentando la probabilidad de que los casos encontrados en las familias de Utah porten una predisposición genética.

Cartografía genética

Dado un conjunto de familias informativas, los marcadores genéticos son esenciales para ligar una enfermedad con una región de un cromosoma. Tales marcadores incluyen polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP) (Botstein et al., 1980), marcadores con un número variable de repeticiones en tándem (VNTR) (Jeffreys et al., 1985; Nakamura et al., 1987), y una abundante clase de polimorfismos de DNA basados en repeticiones en tándem cortas (STR), especialmente repeticiones de CpA (Weber and May, 1989; Litt et al., 1989). Para generar un mapa genético, se seleccionan marcadores genéticos potenciales y se analizan estos usando DNA extraido de miembros de las familias que están siendo estudiadas.

Los marcadores genéticos útiles en la investigación de un locus genético asociado con una enfermedad se pueden seleccionar sobre una base ad hoc, cubriendo densamente un cromosoma específico, o por análisis detallado de una región específica de un cromosoma. Un método preferido para seleccionar los marcadores genéticos ligados con una enfermedad incluye evaluar el grado de información proporcionado por las familias para determinar la distancia ideal entre los marcadores genéticos de un grado dado de polimorfismo, seleccionar después los marcadores a partir de mapas genéticos conocidos que están idealmente espaciados para la máxima eficacia. La información proporcionada por las familias se mide por la probabilidad de que los marcadores sean heterozigóticos en individuos no relacionados. Es también muy eficaz usar marcadores STR que se detectan por amplificación de la secuencia de ácido nucleico objetivo usando la PCR; tales marcadores son altamente informativos, fáciles de ensayar (Weber and May, 1989), y se pueden ensayar simultáneamente usando estrategias multiplicadoras (Skolnick and Wallace, 1988), lo que reduce grandemente el número de experimentos requeridos.

Una vez que se ha establecido la relación genética, se necesita encontrar marcadores que flanqueen el locus de la enfermedad, esto es, uno o más marcadores proximales al locos de la enfermedad, y uno o más marcadores distales del locus de la enfermedad. Cuando sea posible, se pueden seleccionar los marcadores candidatos a partir de un mapa genético conocido. Cuando no hay ninguno conocido, se pueden identificar nuevos marcadores por la técnica de STR, como se muestra en los ejemplos.

La cartografía genética es usualmente un procedimiento iterativo. En la presente divulgación, este procedimiento empezó definiendo los marcadores genéticos que flanquean el locus BRCA2, reemplazando después estos marcadores flanqueadores con otros marcadores que iban acercándose de forma sucesiva al locus BRCA2. Como una etapa inicial, los sucesos de recombinación, definidos por las familias muy extensas, ayudaron específicamente a localizar el locus BRCA2 como distal o proximal a un específico marcador genético (Wooster et al., 1994).

La región que rodea al BRCA2, hasta la presente divulgación, no había sido bien cartografiada y había pocos marcadores. Por tanto, se desarrollaron secuencias repetitivas cortas a partir de los cósmidos, P1, BAC y YAC, que físicamente formaban el mapa de la región y se analizaron para desarrollar nuevos marcadores genéticos. Se encontraron nuevos STR que eran ambos polimórficos y que estaban en el mapa de la región BRCA2.

Cartografía física

Se emplearon tres métodos distintos para cartografiar físicamente la región. El primero fue el uso de cromosomas artificiales de levaduras (los YAC) para clonar la región BRCA2. El segundo fue la creación de un conjunto de P1, BAC y clones cósmidos que cubren la región que contiene el locus BRCA2.

Cromosomas artificiales de levaduras (YAC). Una vez que se hubo identificado una región suficientemente pequeña que contiene el locus BRCA2, se llevó a cabo el aislamiento físico del DNA de la región mediante la identificación de un conjunto de YAC con solapamiento que cubre la región. Se pueden aislar Yac útiles de genotecas conocidas, tales como las genotecas de YAC de St. Louis y CEPH, que están ampliamente distribuidas y contienen aproximadamente 50.000 YAC cada una. Se aislaron los YAC de estas genotecas públicamente accesibles y se pueden obtener de una serie de fuentes incluyendo el Michigan Genome Center. Claramente, otras personas que hubieran tenido acceso a estos YAC, sin la presente divulgación, no habrían conocido el valor de los YAC específicos que se han seleccionado aquí, porque no hubieran podido conocer cuáles de los YAC estaban dentro y cuáles estaban fuera de la región más pequeña que contiene el locus BRCA2.

Clones P1 y BAC. En la presente divulgación, es ventajoso proceder obteniendo los clones P1 y BAC para cubrir esta región. El tamaño más pequeño de estos insertos en comparación con los insertos YAC, hace que sean más útiles como sondas específicas de hibridación. Además, con el DNA clonado en células bacterianas mejor que en células de levaduras, aumenta grandemente la facilidad con la que se puede manipular el DNA de interés, y mejora la relación señal a ruido de los ensayos de hibridación.

Los clones P1 y BAC se obtienen cribando las genotecas construidas a partir del genoma humano total con sitios específicos de la secuencia marcados (STS) derivados de los YAC, P1, y BAC, aislados como se describe aquí.

Estos clones P1 y BAC se pueden comparar por la PCR de secuencias repetitivas interpuestas (IRS) y/o por digestiones con enzimas de restricción seguido por electroforesis en gel y comparación de los fragmentos de DNA resultantes ("huellas genéticas") (Maniatis et al., 1982). Los clones se pueden caracterizar también por la presencia de los STS. Las huellas genéticas se usan para definir un conjunto de clones contiguos de solapamiento que cubre la región pero que no es excesivamente redundante, denominado aquí un "mínimo camino enlosado". Un mínimo camino enlosado semejante forma la base de los experimentos posteriores para identificar los cDNA que se pueden originar desde el locus BRCA2.

Los clones P1 (Stenberg, 1990); Stenberg et al., 1990; Shizuya et al., 1992) fueron aislados por Genome Sciences usando para el cribado los cebadores de PCR proporcionados por los autores. Los BAC fueron proporcionados por técnicas de hibridación en el laboratorio del Dr. Mel Simon y por análisis de los grupos de PCR en nuestro laboratorio. La estrategia de usar los clones P1 y BAC permitió también cubrir la región genómica con un conjunto independiente de clones no derivados de los YAC. Esto protege frente a la posibilidad de deleciones de los YAC. Estas nuevas secuencias derivadas de los clones P1 y BAC proporcionan el material para posteriores cribados de genes candidatos, como se describe más adelante.

Aislamiento de genes

Hay muchas técnicas para analizar los clones genómicos en cuanto a la presencia de secuencias con probabilidad de ser candidatas como secuencia codificadora de un locus que se pretende aislar, que incluyen, pero sin limitarse a ellas: (a) zoo blots, (b) identificación de islas HTF, (c) atrapamiento de exones, (d) hibridación de cDNA a los P1, BAC o YAC y (e) cribado de genotecas de cDNA.

(a) Zoo blocs. La primera técnica es hibridar los cósmidos a transferencias Southern para identificar las secuencias de DNA que se han conservado evolutivamente, y que por tanto dan señales positivas de hibridación con el DNA de especies con distintos grados de relación con los seres humanos (tales como monos, vacas, pollos, cerdos, ratones y ratas). Las transferencias Southern que contienen dicho DNA procedente de una variedad de especies están comercialmente disponibles (Clonetech, Cat. 7753-1).

(b) Identificación de las islas HTF. La segunda técnica incluye la búsqueda de regiones ricas en los nucleótidos C y G, que a menudo aparecen cerca o dentro de las secuencias codificadoras. Tales secuencias se llaman HTF (fragmento HpaI diminuto) o islas CpG, ya que las enzimas de restricción específicas para los sitios que contienen dímeros CpG cortan frecuentemente estas regiones (Lindsay et al., 1987).

(c) Atrapamiento de exones. La tercera técnica es el atrapamiento de exones, un método que identifica las secuencias del DNA genómico que contienen uniones por empalme y por tanto que probablemente comprenden secuencias codificadoras de genes. La amplificación de exones (Buckler et al., 1991) se usa para seleccionar y amplificar exones a partir de los clones de DNA descritos antes. La amplificación de exones se basa en la selección de secuencias de RNA que están flanqueadas por sitios funcionales de corte y empalme en 5' y/o 3'. Los productos de la amplificación de exones se usan para cribar las genotecas de cDNA de mama para identificar un número manejable de genes candidatos para el estudio posterior. El atrapamiento de exones se puede realizar también sobre pequeños segmentos de DNA secuenciado usando programas de ordenador o por un software de atrapamiento,

(d) Hibridación de cDNA a los P1, BAC o YAC. La cuarta técnica es una modificación de la técnica de enriquecimiento selectivo que utiliza la hibridación de cDNA a los cósmidos, P1, BAC o YAC y permite que las secuencias transcritas sean identificadas y recuperadas del DNA genómico donado (Kandpal et al., 1990). La técnica de enriquecimiento selectivo, modificada para el presente propósito, incluye la unión del DNA de la región de BRCA2 presente en un YAC a una columna matriz y la selección de los cDNA de las genotecas relevantes que se hibridan con el DNA unido, seguido por amplificación y purificación del DNA unido, dando como resultado un gran enriquecimiento de los cDNA en la región representada por el DNA genómico clonado.

(e) Identificación de los cDNA. La quinta técnica es identificar los cDNA que corresponden al locus BRCA2. Las sondas de hibridación que contienen secuencias codificadoras putativas, seleccionadas usando cualquiera de las técnicas anteriores, se usan para cribar diferentes genotecas, incluyendo las genotocas de cDNA del tejido de la mama y cualquier otra genoteca necesaria.

Para encontrar los genes candidatos a BRCA2 se puede usar otra variación sobre el tema de la selección directa de cDNA (Lovett et al., 1991; Futreal, 1993). Este método usa como sonda el DNA de los cósmidos, P1 o BAC. El DNA sonda se digiere con una enzima de restricción de corte romo tal como HaeIII. Los adaptadores de doble cadena se ligan entonces sobre el DNA y sirven como sitios de unión para los cebadores en las reacciones posteriores de amplificación por PCR que usan cebadores biotinilados. El cDNA objetivo se genera a partir de mRNA derivado de muestras de tejido, por ejemplo, tejido de la mama, por la síntesis de una primera cadena ya sea con cebadores aleatorios o con cebadores oligo (dT) seguida por la síntesis de la segunda cadena. Los extremos de cDNA se hacen romos y se ligan a los adaptadores de doble cadena. Estos adaptadores sirven como sitios de amplificación para la PCR. Las secuencias del objetivo y de la sonda se desnaturalizan y se mezclan con DNA C_{o}t-1 humano para bloquear las secuencias repetitivas. La hibridación de la solución se lleva a cabo a valores altos de C_{o}t-1/2 para asegurar la hibridación de las moléculas raras del cDNA objetivo. El material alineado se captura entonces sobre perlas de avidina, se lava con gran rigor y los cDNA retenidos se eluyen y amplifican por PCR. El cDNA seleccionado se somete a posteriores rondas de enriquecimiento antes de la donación en un plásmido vector para análisis.

Análisis de los cDNA para candidatos

La prueba de que el cDNA es el locus BRCA2 se obtiene encontrando las secuencias del DNA extraído procedente de miembros de las familias afectadas que crean productos génicos BRCA2 anormales o niveles anormales del producto génico BRCA2. Tales alelos de BRCA2 de susceptibilidad serán segregados conjuntamente con la enfermedad en las familias grandes. Ellos estarán presentes también con mucha mayor frecuencia en los individuos no familiares con cáncer de mama, que en los individuos de la población general. Finalmente, puesto que los tumores a menudo tienen mutaciones somáticas en los locus que en otros casos tienen mutaciones en la línea germinal, se espera ver alelos de BRCA2 normales en la línea germinal mutados en secuencias que son idénticas o similares a los alelos de BRCA2 de susceptibilidad en el DNA extraído del tejido tumoral. Cuando se comparan las secuencias de BRCA2 de los tejidos tumorales con los alelos de BRCA2 de la línea germinal de los mismos individuos, o se comparan los alelos de BRCA2 de la línea germinal de los casos de cáncer con los de individuos no afectados, la clave es encontrar mutaciones que sean suficientemente graves como para causar la interrupción clara de la función normal del producto génico. Estas mutaciones pueden tomar una serie de formas. Las formas más graves podrían ser mutaciones con desplazamiento del marco de lectura o deleciones grandes que podrían hacer que el gen codificara una proteína anormal o alguna que pudiera alterar significativamente la expresión proteínica. Las mutaciones disruptivas menos graves podrían incluir pequeñas deleciones en el marco de lectura y sustituciones de pares de bases no conservativos que podrían tener un efecto importante sobre las proteínas producidas, tales como cambios hasta un residuo de cisteína o desde un residuo de cisteína, desde un aminoácido básico a uno ácido o viceversa, desde un aminoácido hidrófobo a uno hidrófilo o viceversa, u otras mutaciones que podrían afectar la estructura proteínica secundaria, terciaria o cuaternaria, En general no se debe esperar que las mutaciones silenciosas o las que dan como resultado sustituciones de aminoácidos conservativos interrumpan la función proteínica.

Según la presente divulgación, se detecta una alteración del locus BRCA2 natural. Además, el método se puede llevar a cabo detectando el locus BRCA2 natural y confirmando la falta de una predisposición al cáncer en el locus BRCA2. La "alteración de un gen natural" abarca todas las formas de mutaciones incluyendo deleciones, inserciones y mutaciones puntuales en las regiones codificadoras y no codificadoras. Las deleciones pueden ser del gen completo o solamente de una porción del gen. Las mutaciones puntuales pueden dar como resultado codones de terminación, mutaciones con desplazamiento del marco de lectura o sustituciones de aminoácidos. Las mutaciones somáticas son aquellas que sólo aparecen en ciertos tejidos, por ejemplo, en el tejido tumoral y no se heredan en la línea germinal. Las mutaciones en la línea germinal se pueden encontrar en cualquiera de los tejidos corporales y se heredan. Si sólo está mutado somáticamente un único alelo, hay indicios de un estado neoplásico precoz. Sin embargo, si están mutados somáticamente ambos alelos, entonces hay indicios de un estado neoplásico tardío. Así, el hallazgo de las mutaciones de BRCA2 proporciona información tanto para el diagnóstico como para el pronóstico. Un alelo de BRCA2 que no está delecionado (por ejemplo que se encuentra en el cromosoma hermano de un cromosoma que lleva una deleción de BRCA2) se puede cribar para otras mutaciones tales como inserciones, deleciones pequeñas, y mutaciones puntuales. Se cree que muchas mutaciones encontradas en los tejidos tumorales serán las que lleven a la disminución de la expresión del producto génico BRCA2. Sin embargo, las mutaciones que llevan a productos génicos no funcionales podrían llevar también a un estado canceroso. Los sucesos de mutaciones puntuales pueden tener lugar en regiones reguladoras, tales como en el promotor del gen, llevando a la pérdida o disminución de la expresión del mRNA. Las mutaciones puntuales pueden suprimir también el procesamiento apropiado del RNA, llevando a una pérdida de la expresión del producto génico BRCA2, o a una disminución de la estabilidad o de la eficacia de traducción del mRNA.

Las técnicas útiles de diagnóstico incluyen, pero sin limitarse a ellas, la hibridación fluorescente in situ (FISH), la secuenciación directa del DNA, el análisis por PFGE, el análisis por transferencia Southern, el análisis de conformación de cadena simple (SSCA), el ensayo de protección a RNasa, oligonucleótido alelo-específico (ASO), los análisis de transferencia y PCR-SSCP, como se discute con mayor detalle más adelante.

La predisposición al cáncer, tal como al cáncer de mama, y a los otros cánceres identificados aquí, se puede averiguar analizando cualquier tejido de un ser humano en cuanto a mutaciones del gen BRCA2. Por ejemplo, una persona que ha heredado una mutación de BRCA2 en la línea germinal será propensa a desarrollar cáncer. Esto se puede determinar analizando el DNA de cualquier tejido del cuerpo de la persona. Más simplemente, se puede sacar sangre y extraer el DNA de las células sanguíneas. Además, se puede realizar un diagnóstico prenatal analizando las células fetales, las células de la placenta o las células amnióticas en cuanto a mutaciones del gen BRCA2. La alteración de un alelo de BRCA2 natural, ya sea, por ejemplo, por mutación puntual o por deleción, se puede detectar por cualquiera de los medios expuestos aquí.

Hay varios métodos que se pueden usar para detectar variaciones en la secuencia del DNA. La secuenciación directa del DNA, ya sea secuenciación manual o secuenciación fluorescente automática puede detectar las variaciones de la secuencia. Para un gen tan grande como BRCA2, la secuenciación manual es muy laboriosa, pero en condiciones óptimas, raras veces se pasan por alto las mutaciones de la secuencia codificadora de un gen. Otro método es el ensayo de polimorfismo de la conformación de cadena simple (SSCA) (Orita et al., 1989). Este método no detecta todos los cambios de la secuencia, especialmente si el tamaño del fragmento de DNA es mayor que 200 bp, pero se puede optimizar para detectar la mayor parte de las variaciones de la secuencia de DNA. La reducción de la sensibilidad de detección es una desventaja, pero el aumento del rendimiento posible con SSCA hace de este método una alternativa viable y atractiva a la secuenciación directa para la detección de mutaciones como una base de investigación. Los fragmentos que tienen la movilidad desplazada sobre los geles de SSCA se secuencian después para determinar la naturaleza exacta de la variación de la secuencia del DNA. Otros métodos basados en la detección de apareamientos incorrectos entre las dos cadenas complementarias del DNA incluyen la electroforesis en gel con concentración constante de desnaturalizante (CDGE) (Sheffield et al., 1991), el análisis de heterodúplex (HA) (White et al., 1992) y la digestión química de cadenas con apareamiento incorrecto (CMC) (Grompe et al., 1989). Ninguno de los métodos descritos antes detectará deleciones, duplicaciones o inserciones grandes, ni tampoco detectará una mutación reguladora que afecte a la transcripción o traducción de la proteína. Otros métodos que pudieran detectar estas clases de mutaciones tales como un ensayo de truncación de una proteína o el ensayo asimétrico, detectan solamente tipos específicos de mutaciones y no podrían detectar mutaciones con sentido alterado. Una revisión de los métodos actualmente disponibles para detectar la variación de la secuencia de DNA se puede encontrar en una reciente revisión de Grompe (1993). Una vez que se conoce una mutación, se puede utilizar un método de detección específica del alelo tal como la hibridación de un oligonucleótido alelo-específico (ASO) para cribar rápidamente grandes cantidades de otras muestras para la misma mutación.

Para detectar la alteración del gen BRCA2 natural en un tejido, es útil aislar el tejido libre de los tejidos normales que le rodean. Los medios para enriquecer la preparación del tejido en células tumorales son conocidos en la técnica. Por ejemplo, el tejido puede ser aislado de cortes en parafina o en criostato. Las células cancerosas se pueden separar también de los células normales por citometría de flujo. Estos métodos, así como otros métodos para separar las células tumorales de las células normales, son bien conocidos en la técnica. Si el tejido tumoral está altamente contaminado con células normales, la detección de las mutaciones es más difícil.

Se puede realizar un análisis preliminar rápido para detectar polimorfismos en las secuencias de DNA observando una serie de transferencias Southern de DNA cortadas con una o más enzimas de restricción, preferiblemente con un gran número de enzimas de restricción. Cada transferencia contiene una serie de individuos normales y una serie de casos de cáncer, de tumores o de ambos. Eras transferencias Southern que presentan fragmentos de hibridación (que difieren en longitud del DNA testigo cuando se exploran con sondas de secuencias próximas o que incluyen el locus BRCA2) indican una posible mutación. Si se usan enzimas de restricción que producen fragmentos de restricción muy grandes, entonces se emplea electroforesis de campo pulsado (PFGE).

La detección de mutaciones puntuales se puede conseguir por donación molecular del alelo o alelos de BRCA2 y secuenciación del alelo o alelos usando métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, las secuencias génicas se pueden amplificar directamente a partir de una preparación de DNA genómico procedente del tejido tumoral, usando técnicas conocidas. Se puede determinar después la secuencia del DNA de las secuencias amplificadas.

Hay seis métodos bien conocidos para un análisis más completo, pero todavía indirecto, para confirmar la presencia de un alelo de susceptibilidad: 1) análisis de conformación de cadena simple (SSCA) (Orita et al., 1989); 2) electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE) (Wartell et al., 1990; Sheffield et al., 1989); 3) ensayos de protección a RNasa (Finkelstein et al., 1990; Kinszler et al., 1991); 4) oligonucleótidos alelo-específicos (ASO) (Conner et al., 1983); 5) el uso de proteínas que reconocen los apareamientos incorrectos de nucleótidos, tales como la proteína mutS de E. coli (Modrich, 1991); y 6) PCR alelo-específica (Rano & Kidd, 1989). Para la PCR alelo-específica, se usan cebadores que se hibridan en sus extremos 3' con una mutación particular de BRCA2. Si la mutación particular de BRCA2 no está presente, no se observa ningún producto de amplificación. Se puede usar también Amplification Refractory Mutation System (ARMS), como se describe en la solicitud de patente europea, publicación nº 0332435 y en Newton et al.,1989. Las inserciones y deleciones de genes se pueden detectar también por clonación, secuenciación y amplificación. Además, se pueden usar las sondas de polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) para el gen o genes marcadores que le rodean para puntuar la alteración de un alelo o una inserción en un fragmento polimórfico. Dicho método es particularmente útil para cribar a los parientes de un individuo afectado en cuanto a la presencia de la mutación de BRCA2 encontrada en dicho individuo. Se pueden usar otros métodos para detectar inserciones y deleciones que son conocidos en la técnica.

En los tres primeros métodos (SSCA, DGGE y ensayo de protección a RNasa), aparece una nueva banda electroforética. El SSCA detecta una banda que migra diferencialmente porque el cambio de la secuencia causa una diferencia en el apareamiento de las bases intramoleculares de la cadena simple. La protección a RNasa implica la escisión del polinucleótido mutante en dos o más fragmentos más pequeños. La DGGE detecta diferencias en las tasas de migración de las secuencias mutantes comparadas con las secuencias naturales, usando un gel con gradiente desnaturalizante. En un ensayo de oligonucleótido alelo-específico, se diseña un oligonucleótido que detecta una secuencia específica, y se realiza el ensayo detectando la presencia o ausencia de una señal de hibridación. En el ensayo con mutS, la proteína se une solamente a las secuencias que contienen un apareamiento incorrecto de nucleótidos en un heterodúplex entre las secuencias mutantes y las secuencias naturales.

Los apareamientos incorrectos, según la presente divulgación, son dúplex de ácido nucleico hibridados en los cuales las dos cadenas no son 100% complementarias. La falta de homología total puede ser debida a deleciones, inserciones, inversiones o sustituciones. La detección del apareamiento incorrecto se puede usar para detectar mutaciones puntuales en el gen o en su producto mRNA. Aunque estas técnicas son menos sensibles que la secuenciación, son más sencillas de realizar en un número grande de muestras tumorales. Un ejemplo de una técnica de escisión de cadenas con apareamiento incorrecto es el método de protección a RNasa. En la práctica de la presente divulgación, el método implica el uso de una ribosonda marcada que es complementaria a la secuencia codificadora del gen BRCA2 natural humano. La ribosonda y cualquiera de los mRNA o DNA aislados del tejido tumoral se alinean (hibridan) juntos y posteriormente se digieren con la enzima RNasa A que es capaz de detectar algunos apareamientos incorrectos en una estructura de RNA dúplex. Si se detecta un apareamiento incorrecto por la RNasa A, ésta escinde en el sitio del apareamiento incorrecto. Por tanto, cuando la preparación de RNA alineado se separa sobre una matriz de gel electroforético, si se ha detectado un apareamiento incorrecto y se ha escindido por la RNasa A, se observará un producto RNA que es más pequeño que la longitud completa del RNA dúplex para la ribosonda y el mRNA o DNA. La ribosonda no necesita tener la longitud completa del mRNA o del gen BCRA2 sino que puede ser un segmento de cualquiera de ellos. Si la ribosonda comprende solamente un segmento del mRNA o del gen BCRA2, será deseable usar una serie de estas sondas para cribar la secuencia completa de mRNA en cuanto a apareamientos incorrectos.

De forma similar, se pueden usar sondas de DNA para detectar apareamientos incorrectos, por medio de la escisión enzimática o química. Véase, por ejemplo, Cotton et al., 1988; Shenk et al., 1975; Novack et al., 1986. Alternativamente, los apareamientos incorrectos se pueden detectar por desplazamientos en la movilidad electroforética de los dúplex con apareamiento incorrecto en relación a los dúplex con apareamiento correcto. Véase, por ejemplo, Cariello, 1988. Utilizando o bien ribosondas o bien sondas de DNA, los mRNA o DNA celulares que pudieran contener una mutación se pueden amplificar usando la PCR (véase más adelante) antes de la hibridación. También se pueden detectar cambios en el DNA del gen BRCA2 usando la hibridación Southern, especialmente si los cambios son reordenamientos groseros, tales como deleciones e inserciones.

Las secuencias de DNA del gen BRCA2 que han sido amplificadas por el uso de la PCR se pueden cribar también usando sondas alelo-específicas. Estas sondas son oligómeros de ácido nucleico, cada uno de los cuales contiene una región de la secuencia del gen BRCA2 que contiene una mutación conocida. Por ejemplo, un oligómero puede tener una longitud de aproximadamente 30 nucleótidos, que corresponden a una porción de la secuencia del gen BRCA2. Usando una batería de tales sondas alelo-específicas, se pueden cribar los productos de la amplificación por PCR para identificar la presencia de una mutación previamente identificada en el gen BRCA2. Se puede realizar la hibridación de sondas alelo-especificas con las secuencias amplificadas de BRCA2, por ejemplo, sobre un filtro de nilón. La hibridación a una sonda particular en condiciones rigurosas de hibridación indica la presencia de la misma mutación en el tejido del tumor que en la sonda alelo-específica.

El ensayo más definitivo de las mutaciones en un locus candidato es comparar directamente las secuencias de BRCA2 genómico de pacientes de cáncer con las de una población testigo. Alternativamente, se podría secuenciar el RNA mensajero después de la amplificación, por ejemplo, por PCR, con lo que se elimina la necesidad de determinar la estructura del exón del gen candidato.

Las mutaciones de los pacientes de cáncer que caen fuera de la región codificadora de BRCA2 se pueden detectar examinando las regiones no codificadoras, tales como los intrones y las secuencias reguladoras próximas o dentro del gen BRCA2. Una indicación precoz de que las mutaciones de las regiones no codificadoras son importantes puede venir de los experimentos de transferencia Northern que revelan moléculas de RNA mensajero de tamaño o abundancia anormal en los pacientes de cáncer cuando se comparan con los individuos testigos.

La alteración de la expresión de mRNA en BRCA2 se puede detectar por cualquier método conocido en la técnica. Estos incluyen el análisis por transferencia Northem, amplificación por PCR y protección a RNasa. La disminución de la expresión de mRNA indica una alteración del gen BRCA2 natural. La alteración de los genes BRCA2 naturales se puede detectar también haciendo un cribado para encontrar la alteración de la proteína BRCA2 natural. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos monocionales inmunorreactivos con BRCA2 para cribar un tejido. La falta de un antígeno cognado debería indicar una mutación de BRCA2. Para detectar el producto génico BRCA2 mutante, se pueden usar también anticuerpos específicos para los productos de alelos mutantes. Tales ensayos inmunológicos se pueden realizar en cualquiera de los formatos convenientes conocidos en la técnica. Estos incluyen transferencias Western, ensayos inmunohistoquímicos y ensayos ELISA. Todos los medios para detectar una proteína BRCA2 alterada se pueden usar para detectar la alteración de los genes BRCA2 naturales. Se pueden usar ensayos funcionales, tales como las determinaciones de unión a proteínas. Además, se pueden usar ensayos que detectan la función bioquímica de BRCA2. El hallazgo de un producto génico BRCA2 mutante indica la alteración de un gen BRCA2 natural.

Los genes o productos génicos BRCA2 mutantes se pueden detectar también en otras muestras del cuerpo humano, tales como suero, heces, orina y esputos. Las mismas técnicas descritas antes para la detección de genes o productos génicos BRCA2 mutantes en tejidos se pueden aplicar a otras muestras del cuerpo. Las células cancerosas se desprenden de los tumores y aparecen en dichas muestras corporales. Además, el propio producto génico BRCA2 se puede secretar en el espacio extracelular y se puede encontrar en estas muestras corporales incluso en ausencia de células cancerosas. Cribando tales muestras corporales, se puede conseguir un simple diagnóstico precoz para muchos tipos de cáncer. Además se puede hacer seguimiento del progreso de la quimioterapia o radioterapia más fácilmente analizando dichas muestras corporales en cuanto a los genes o productos génicos BRCA2 mutantes.

Los pares de cebadores son útiles para la determinación de la secuencia de nucleótidos de un particular alelo de BRCA2 usando la PCR. Los pares de cebadores de DNA de cadena simple pueden ser alineados con las secuencias de dentro o de al-rededor del gen BRCA2 sobre el cromosoma 13 con el fin de cebar la amplificación de la síntesis del DNA del propio gen BRCA2. Un conjunto completo de estos cebadores permite la síntesis de todos los nucleótidos de las secuencias codificadoras del gen BRCA2, esto es, los exones. El conjunto de cebadores permite preferiblemente la síntesis de secuencias tanto de los intrones como de los exones. Se pueden usar también cebadores alelo-específicos. Tales cebadores se alinean solamente a alelos mutantes de BRCA2 particulares, y por tanto sólo amplificarán un producto en presencia del alelo mutante como molde.

Para facilitar la donación subsiguiente de las secuencias amplificadas, los cebadores pueden tener secuencias del sitio de la enzima de restricción añadidas a sus extremos 5'. Por tanto, todos los nucleótidos de los cebadores se derivan de las secuencias de BRCA2 o de las secuencias adyacentes a BRCA2, excepto para los pocos nucleótidos necesarios para formar un sitio de la enzima de restricción. Tales enzimas y sitios son bien conocidos en la técnica. Los propios cebadores se pueden sintetizar usando métodos que son bien conocidos en la técnica. Generalmente, los cebadores se pueden preparar usando máquinas para sintetizar oligonucleótidos que están comercialmente disponibles. Dada la secuencia del marco de lectura abierto de BRCA2 que se muestra en la SEQ ID NO:1 y en la Figura 3, el diseño de cebadores particulares, aparte de los descritos más adelante, está dentro de la experiencia en la técnica.

Las sondas de ácido nucleico se pueden usar en hibridación Southern al DNA genómico y en el método de protección a RNasa para detectar las mutaciones puntuales ya discutidas anteriormente. Las sondas se pueden usar para detectar productos de amplificación por PCR. Ellas se pueden usar también para detectar apareamientos incorrectos con el gen o mRNA de BRCA2 usando otras técnicas.

Se ha descubierto que los individuos con el gen BRCA2 natural no tienen el cáncer que resulta del alelo de BRCA2. Sin embargo, las mutaciones que interfieren con la función de la proteína BRCA2 están implicadas en la patogénesis del cáncer. Por tanto, la presencia de un gen BRCA2 alterado (o un mutante) que produce una proteína con pérdida de función, o con función alterada, está directamente correlacionada con un aumento del riesgo de cáncer. Para detectar una mutación del gen BRCA2, se prepara una muestra biológica y se analiza para buscar una diferencia entre la secuencia del alelo de BRCA2 que está siendo analizado y la secuencia del alelo de BRCA2 natural. Los alelos de BRCA2 mutantes se pueden identificar inicialmente por cualquiera de las técnicas descritas antes. Los alelos mutantes se secuencian después para identificar la mutación específica del particular alelo mutante. Alternativamente, los alelos de BRCA2 mutantes se pueden identificar inicialmente identificando las proteínas BRCA2 mutantes (alteradas), usando técnicas convencionales. Los alelos mutantes se secuencian después para identificar la mutación específica de cada alelo. Las mutaciones, especialmente las que llevan a una función alterada de la proteína BRCA2, se usan después para métodos de diagnóstico y pronóstico.

Definiciones

La presente divulgación emplea las siguientes definiciones:

La "amplificación de polinucleótidos" utiliza métodos tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación por ligación (o reacción en cadena de la ligasa, LCR) y métodos de amplificación basados en el uso de la Q-beta-replicasa. Estos métodos son bien conocidos y ampliamente practicados en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos 4.683.195 y 4.683.202 e Innis et al., 1990 (para PCR); y Wu et al., 1989a (para LCR). Los reactivos y el hardware para realizar la PCR están comercialmente disponibles. Los cebadores útiles para amplificar las secuencias de la región BRCA2 son preferiblemente complementarios y se hibridan específicamente con las secuencias de la región BRCA2 o de las regiones que flanquean una región objetivo dentro de ella. Las secuencias de BRCA2 generadas por la amplificación se pueden secuenciar directamente. Alternativamente, pero menos deseable, las secuencias amplificadas pueden ser donadas previamente al análisis de secuencias. Un método para la zonación directa y el análisis de secuencias de los segmentos genómicos amplificados enzimáticamente ha sido descrito por Scharf, 1986.

"Polinucleótido analito" y "cadena analito" se refieren a un polinucleótido de cadena simple o doble que contiene presuntamente una secuencia objetivo, y que puede estar presente en una variedad de tipos de muestras, incluyendo las muestras biológicas.

"Anticuerpos". El término "anticuerpo" se usa tanto para designar una entidad molecular homogénea, como una mezcla tal como un producto sérico compuesto por una pluralidad de diferentes entidades moleculares. Los polipéptidos BRCA2 se pueden preparar sintéticamente en un sintetizador de péptidos y se pueden acoplar a una molécula portadora (por ejemplo, hemocianina de lapa californiana) e inyectar durante varios meses a conejos. El suero de los conejos se analiza después en cuanto a inmunorreactividad frente al polipéptido o fragmento BRCA2. Los anticuerpos monocionales se pueden preparar inyectando ratones con los polipéptidos proteínicos, proteínas de fusión o sus fragmentos. Los anticuerpos monocionales serán cribados por ELISA y analizados en cuanto a inmunorreactividad específica con el polipéptido BRCA2 o sus fragmentos. Véase, Harlow & Lane, 1988. Estos anticuerpos serán útiles en ensayos así como en compuestos farmacéuticos.

Una vez que se ha obtenido una cantidad suficiente del polipéptido deseado, éste puede ser usado para diferentes propósitos. Un uso típico es la producción de anticuerpos específicos para unión. Estos anticuerpos pueden ser o policlonales o monocionales, y pueden ser producidos in vitro o in vivo por métodos bien conocidos en la técnica. Para la producción de anticuerpos policlonales, se selecciona un apropiado sistema inmunitario objetivo, típicamente ratón o conejo. El antígeno sustancialmente purificado se presenta al sistema inmunitario en una forma determinada por métodos apropiados para el animal y por otros parámetros bien conocidos por los inmunólogos. Los sitios típicos para inyección son las plantas de los pies, intramuscularmente, intraperitonealmente, o intradérmicamente. Naturalmente, el ratón o el conejo pueden ser sustituidos por otras especies. Los anticuerpos policlonales se purifican después usando métodos conocidos en la técnica, ajustados para la especificidad deseada.

Una respuesta inmunológica se valora usualmente con un inmunoensayo. Normalmente, tales inmunoensayos incluyen alguna purificación de una fuente de antígeno, por ejemplo, el producido por las mismas células y de la misma forma que el antígeno. Una variedad de métodos de inmunoensayo son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow & Lane, 1988, o Goding, 1986.

Los anticuerpos monoclonales con afinidades de 10^{-8} M^{-1} o preferiblemente 10^{-9} a 10^{-10} M^{-1} o mayores se prepararán típicamente por procedimientos estándar como se han descrito, por ejemplo, en Harlow & Lane, 1988 o Goding, 1986. Brevemente, se seleccionarán animales apropiados y se seguirá el protocolo de inmunización deseado. Después del apropiado periodo de tiempo, se extirpan los bazos de dichos animales y las células del bazo individual se fusionan, típicamente, con células inmortalizadas de mieloma en condiciones apropiadas de selección. Después, las células se separan clonalmente y los sobrenadantes de cada clon se analizan en cuanto a su producción de un apropiado anticuerpo específico para la región deseada del antígeno.

Otras técnicas adecuadas incluyen la exposición in vitro de los linfocitos a los polipéptidos antigénicos, o alternativamente, a una selección de bancos de anticuerpos en lagos o vectores similares. Véase Huse et al., 1989. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se pueden usar con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcan uniéndolos, ya sea covalentemente o no covalentemente, con una sustancia que proporciona una señal detectable. Se conoce una amplia variedad de marcadores y técnicas de conjugación y están descritos extensamente tanto en la literatura científica como en la de patentes. Los marcadores adecuados incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las patentes que describen el uso de tales marcadores incluyen las patentes de Estados Unidos 3.817.837; 3.850.752; 3.939.350; 3.996,345; 4.277.437; 4.275.149 y 4.366.241. También, se pueden producir inmunoglobulinas recombinantes (véase la patente de Estados Unidos 4.816.567).

"Copartícipe de unión" se refiere a una molécula capaz de unirse a una molécula ligando con alta especificidad, como por ejemplo, un antígeno y un anticuerpo específico del antígeno o una enzima y su inhibidor. En general, los copartícipes específicos de unión se deben unir con suficiente afinidad para inmovilizar el dúplex copia del analito/cadena complementaria (en el caso de hibridación de polinucleótidos) en las condiciones de aislamiento. Los copartícipes específicos de unión son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, biotina y avidina o estreptavidina, IgG y proteína A, los numerosos acoplamientos conocidos de receptor-ligando, y las numerosas cadenas complementarias polinucleotídicas. En el caso de copartícipes complementarios de unión a polinucleótidos, los copartícipes tienen normalmente al menos aproximadamente 15 bases de longitud, y pueden tener al menos 40 bases de longitud. Los polinucleótidos pueden estar compuestos de DNA, RNA, o análogos sintéticos de nucleótidos.

Una "muestra biológica" se refiere a una muestra de tejido o fluido que presuntamente contiene un polinucleótido o polipéptido analito, procedente de un individuo que incluye, pero sin limitarse a ellos, por ejemplo, plasma, suero, liquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, tractos respiratorio, intestinal, y genitourinario, lágrimas, saliva, células sanguíneas, tumores, órganos, tejidos y muestras de los constituyentes de cultivos celulares in vitro.

Tal como se usan aquí, los términos "diagnóstico" o "pronóstico" cuando se emplean en el contexto de las neoplasias, se usan para indicar 1) la clasificación de las lesiones como neoplásicas, 2) la determinación de la gravedad de la neoplasia, o 3) el seguimiento de la progresión de la enfermedad, antes, durante y después del tratamiento.

"Codificar". Se dice que un polinucleótido "codifica" un polipéptido si, en su estado nativo o cuando es manipulado por métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, puede ser transcrito y/o traducido para producir el mRNA de un polipéptido y/o el polipéptido o uno de sus fragmentos. La cadena antisentido es el complemento de un ácido nucleico semejante, y la secuencia codificadora se puede deducir de ella.

"Aislado" o "sustancialmente puro". Un ácido nucleico (por ejemplo, un RNA, DNA o una mezcla de polímeros) "aislado" o "sustancialmente puro" es aquel que está sustancialmente separado de otros componentes celulares que acompañan naturalmente a una secuencia o proteína humana nativa, por ejemplo, ribosomas, polimerasas, muchas otras secuencias y proteínas del genoma humano. El término incluye una secuencia de ácido nucleico o una proteína que ha sido separada de su entorno natural, e incluye aislados de DNA recombinante o donado y análogos sintetizados químicamente o análogos sintetizados biológicamente por sistemas heterólogos.

"Alelo BRCA2" se refiere a los alelos normales del locus BRCA2 así como a los alelos que portan variaciones que predisponen a los individuos a desarrollar cáncer de muchos sitios incluyendo, por ejemplo, cáncer de mama, de ovario y de estómago. Tales alelos predisponentes se llaman también "alelos de BRCA2 de susceptibilidad"

"Locus BRCA2", "Gen BRCA2", "Ácidos nucleicos BRCA2" o "Polinucleótido BRCA2" se refieren cada uno a polinucleótidos, todos los cuales están en la región BRCA2, que probablemente van a ser expresados en el tejido normal, ciertos de cuyos alelos predisponen a un individuo a desarrollar cánceres de mama, ovario y estómago. Las mutaciones en el locus BRCA2 pueden estar implicadas en la iniciación y/o progresión de otros tipos de tumores. El locus se señala en parte por las mutaciones que predisponen a los individuos a desarrollar cáncer. Estas mutaciones caen dentro de la región BRCA2 descrita más adelante. El locus BRCA2 pretende incluir las secuencias codificadoras, las secuencias interpuestas y los elementos reguladores que controlan la transcripción y/o la traducción. El locus BRCA2 pretende incluir todas las variaciones alélicas de la secuencia de DNA.

Estos términos, cuando se aplican a un ácido nucleico, se refieren a un ácido nucleico que codifica un polipéptido, fragmento, homólogo o variante de BRCA2 humano, incluyendo, por ejemplo, fusiones o deleciones de proteínas. Los ácidos nucleicos de la presente divulgación tendrán una secuencia que se derivada de un gen que codifica BRCA2 natural o es sustancialmente similar a él, o una secuencia que es sustancialmente homóloga con un gen que codifica BRCA2 natural o a una de sus porciones. La secuencia codificadora de un polipéptido BRCA2 se muestra en la SEQ ID NO:1 y en la Figura 3, y la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO:2.

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Las composiciones polinucleotídicas de esta divulgación incluyen RNA, cDNA, DNA genómico, formas sintéticas, y mezcla de polímeros, cadenas tanto con sentido como antisentido, y pueden ser modificadas química o bioquímicamente o pueden contener bases nucleotídicas no naturales o derivadas, como será fácilmente apreciado por los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, marcadores, metilación, sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como uniones sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.), uniones con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes, y uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa-anoméricos, etc.). También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a los polinucleótidos en su capacidad para unirse a una secuencia designada por medio de un enlace de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que las uniones peptídicas sustituyen a las uniones de fosfato en la cadena principal de la molécula.

La presente divulgación proporciona ácidos nucleicos recombinantes que comprenden toda o parte de la región BRCA2. La construcción recombinante puede ser capaz de replicarse autónomamente en una célula hospedarte. Alternativamente, la construcción recombinante puede llegar a ser integrada en el DNA cromosómico de la célula hospedarte. Un polinucleótido recombinante tal, comprende un polinucleótido de origen genómico, cDNA, semi-sintético, o sintético, el cual, en virtud de su origen o manipulación, 1) no está asociado con todo ni con una porción de un polinucleótido con el que está asociado en la naturaleza; 2) está ligado a un polinucleótido distinto de aquel al que está ligado en la naturaleza; o 3) no aparece en la naturaleza.

Por tanto, se proporcionan por esta divulgación ácidos nucleicos recombinantes que comprenden secuencias diferentes que no aparecen en la naturaleza. Aunque se puede emplear la secuencia natural, ésta será alterada a menudo, por ejemplo, por deleción, sustitución o inserción.

Las genotecas de cDNA o genotecas genómicas de diferentes tipos pueden ser cribadas como fuentes naturales de los ácidos nucleicos de la presente divulgación, o tales ácidos nucleicos pueden ser proporcionados por amplificación de las secuencias residentes en el DNA genómico o en otras fuentes naturales, por ejemplo, por PCR. La elección de las genotecas de cDNA normalmente corresponde a una fuente de tejido que es abundante en el mRNA de las proteínas deseadas. Normalmente se prefieren las genotecas de fagos pero se pueden usar otros tipos de genotecas. Los clones de una genoteca se extienden sobre placas, se transfieren a un sustrato para cribado, se desnaturalizan y se exploran con sondas para buscar la presencia de las secuencias deseadas.

Las secuencias de DNA usadas en esta divulgación comprenderán usualmente al menos aproximadamente cinco codones (15 nucleótidos), más usualmente al menos aproximadamente 7-15 codones, y lo más preferiblemente, al menos aproximadamente 35 codones. También pueden estar presentes uno o más intrones. Este número de nucleótidos es usualmente aproximadamente la longitud mínima requerida para una sonda satisfactoria que podría hibridarse específicamente con una secuencia que codifica BRCA2.

Los métodos para la manipulación del ácido nucleico están descritos en general, por ejemplo, en Sambrook et at, 1989 o Ausubel et al., 1992. Los reactivos útiles para la aplicación de dichos métodos, tales como las enzimas de restricción y similares, son muy conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles de vendedores tales como New England BioLabs, Boehringer Mannheim, Amersham, Promega Biotec, U. S. Biochemicals, New England Nuclear, y una serie de otras fuentes. Muchas secuencias génicas naturales se pueden obtener de diferentes genotecas de cDNA o de genotecas genómicas utilizando sondas apropiadas. Véase, GenBank, National Institutes of Health.

"Región BRCA2" se refiere a una porción del cromosoma 13 humano delimitada por los marcadores tdj3820 y YS-GB10T. Esta región contiene el locus BRCA2, que incluye el gen BRCA2.

Tal como se usan aquí, los términos "locus BRCA2", "alelo de BRCA2" y "región BRCA2" se refieren todos al DNA bicatenario que comprende el locus, alelo, o región, así como a cualquiera de los DNA monocatenarios que comprenden el locus, alelo, o región.

Tal como se usa aquí, una "porción" del locus o región o alelo de BRCA2 se define como de un tamaño mínimo de al menos aproximadamente ocho nucleótidos, o preferiblemente aproximadamente 15 nucleótidos, o más preferiblemente al menos aproximadamente 25 nucleótidos, y puede tener un tamaño mínimo de al menos aproximadamente 40 nucleótidos.

"Proteína BRCA2" o "polipéptido BRCA2" se refieren a una proteína o polipéptido codificado por el locus BRCA2, variantes o fragmentos del mismo. El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y su equivalente y no se refiere a una longitud específica del producto; por tanto, los péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de un polipéptido. Este término no se refiere tampoco, o excluye las modificaciones del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones, y similares. Dentro de la definición se incluyen, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, los aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con uniones sustituidas así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto las que se presentan naturalmente como las que no se presentan naturalmente. Ordinariamente, tales polipéptidos tendrán al menos aproximadamente un 50% de homología con la secuencia BRCA2 nativa, preferiblemente un exceso de aproximadamente 90%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 95% de homología. También se incluyen las proteínas codificadas por el DNA que se hibridan en condiciones de alto o bajo rigor, a los ácidos nucleicos que codifican BRCA2 y a los polipéptidos o proteínas estrechamente relacionados encontrados por los antisueros frente a la proteína o proteínas BRCA2.

La longitud de las secuencias de los polipéptidos comparada para su homología será generalmente de al menos aproximadamente 16 aminoácidos, usualmente de al menos aproximadamente 20 residuos, más usualmente de al menos aproximadamente 24 residuos, típicamente de al menos aproximadamente 28 residuos, y preferiblemente más de aproximadamente 35 residuos.

"Ligado operacionalmente" se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes así descritos están en una relación que permite que funcionen del modo pretendido. Por ejemplo, un promotor está ligado operacionalmente a una secuencia codificadora si el promotor afecta a su transcripción o expresión.

"Sondas". Los polimorfismos de los polinucleótidos asociados con los alelos de BRCA2 que predisponen a ciertos cánceres o que están asociados con la mayoría de los cánceres se detectan por hibridación con una sonda polinucleotídica que forma un híbrido estable con el de la secuencia objetivo, en condiciones de hibridación y lavado que varían desde rigurosas a moderadamente rigurosas. Si se espera que las sondas sean perfectamente complementarias con la secuencia objetivo, se usarán condiciones rigurosas. El rigor de la hibridación se puede disminuir si se espera algo de apareamiento incorrecto, por ejemplo, si se esperan variantes con el resultado de que la sonda no sea completamente complementaria. Se eligen condiciones que no admiten uniones no específicas/adventicias, esto es, que minimizan el ruido. Puesto que tales indicaciones identifican polimorfismos neutrales de DNA así como mutaciones, estas indicaciones necesitan un análisis adicional para demostrar la detección de un alelo de BRCA2 de susceptibilidad.

Las sondas para los alelos de BRCA2 se pueden derivar de las secuencias de la región BRCA2 o de sus cDNA. Las sondas pueden ser de cualquier longitud adecuada, que atraviesen toda o una porción de la región BRCA2, y que permitan la hibridación específica con la región BRCA2. Si la secuencia objetivo contiene una secuencia idéntica a la de la sonda, las sondas pueden ser cortas, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 8-30 pares de bases, ya que el híbrido será relativamente estable incluso bajo condiciones rigurosas. Si se espera algún grado de apareamiento incorrecto con la sonda, esto es, si se sospecha que la sonda se puede hibridar con una región variante, se puede emplear una sonda más larga que se híbrida con la secuencia objetivo con la especificidad requerida.

Las sondas incluirán un polinucleótido aislado unido a una molécula marcadora o indicadora y se pueden usar para aislar otras secuencias polinucleotídicas, que tienen similitud de secuencias, por métodos estándar. Para las técnicas de preparación y marcaje de sondas véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1992. Se pueden seleccionar otros polinucleótidos similares usando polinucleótidos homólogos. Alternativamente, se pueden sintetizar o seleccionar polinucleótidos que codifican estos o similares polipéptidos, por medio del uso de la redundancia en el código genético. Se pueden introducir diferentes sustituciones de codones, por ejemplo, por cambios silenciosos (con lo que se producen diferentes sitios de restricción) o para optimizar la expresión de un sistema particular. Se pueden introducir mutaciones para modificar las propiedades del polipéptido, quizás para cambiar las afinidades de unión al ligando, las afinidades intercadenas, o la tasa de degradación o de ciclo metabólico del polipéptido.

Las sondas que comprenden oligonucleótidos sintéticos u otros polinucleótidos de la presente divulgación se pueden derivar de polinucleótidos de cadena simple o doble naturales o recombinantes, o se pueden sintetizar químicamente. Las sondas pueden ser marcadas también por traslado de cortes (nick translation), reacción de inserción del fragmento de Klenow, u otros métodos conocidos en la técnica.

Se prefieren como sondas las porciones de la secuencia polinucleotídica que tiene al menos aproximadamente ocho nucleótidos, usualmente al menos aproximadamente 15 nucleótidos, y menos de aproximadamente 6 kb, usualmente menos de aproximadamente 1,0 kb, procedente de una secuencia polinucleotídica que codifica BRCA2. Las sondas se pueden usar también para determinar si el mRNA que codifica BRCA2 está o no presente en una célula o tejido.

"Ácido nucleico recombinante" es un ácido nucleico que no se encuentra en la naturaleza, o que se prepara por la combinación artificial de dos segmentos de la secuencia, de lo contrario separados. Esta combinación artificial se consigue a menudo o por medios de síntesis química, o por la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, por técnicas de ingeniería genética. Esto se hace usualmente para reemplazar un codón con un codón redundante que codifica el mismo aminoácido o un aminoácido conservativo, a la vez que típicamente se introduce o se separa un sitio de reconocimiento en la secuencia. Alternativamente, se realiza para juntar segmentos de ácido nucleico con las funciones deseadas para generar una combinación deseada de funciones.

"Secuencias reguladoras" se refiere a aquellas secuencias normalmente en el espacio de 100 kb de la región codificadora de un locus, pero también pueden estar más distantes de la región codificadora, las cuales afectan a la expresión del gen (incluyendo la transcripción del gen, y traducción, corte y empalme, estabilidad o similares del RNA mensajero).

"Homología o similitud sustancial". Un ácido nucleico o su fragmento es "sustancialmente homólogo" ("o sustancialmente similar") a otro si, cuando se pone en paralelo de forma óptima (con las apropiadas inserciones o deleciones de nucleótidos) con el otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), hay una identidad de secuencia nucleotídica en al menos aproximadamente 60% de las bases nucleotídicas, usualmente en al menos aproximadamente 70%, más usualmente en al menos aproximadamente 80%, preferiblemente en al menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente en al menos aproximadamente 95-98% de las bases nucleotídicas.

Alternativamente, existe un homología o (similitud) sustancial cuando un ácido nucleico o su fragmento se hibridan con otro ácido nucleico (o una de sus cadenas complementarias) en condiciones selectivas de hibridación, o con una cadena, o con su complemento. Existe selectividad de hibridación cuando tiene lugar una hibridación que es sustancialmente más selectiva que la falta total de especificidad. Típicamente, la hibridación selectiva tendrá lugar cuando hay al menos aproximadamente 55% de homología sobre una extensión de al menos aproximadamente 14 nucleótidos, preferiblemente al menos aproximadamente 65%, más preferiblemente al menos aproximadamente 75%, y lo más preferiblemente al menos aproximadamente 90%. Véase, Kanehisa, 1984. La comparación de la longitud de la homología, como se describe, se puede hacer sobre extensiones más largas, y en ciertas realizaciones se hará a menudo sobre una extensión de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, usualmente de al menos aproximadamente 20 nucleótidos, más usualmente de al menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente de al menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente de al menos aproximadamente 32 nucleótidos, y preferiblemente de al menos aproximadamente 36 nucleótidos o más.

La hibridación del ácido nucleico se verá afectada por condiciones tales como la concentración de sal, temperatura, o disolventes orgánicos, además de la composición de la base, longitud de las cadenas complementarias, y el número de apareamientos incorrectos de bases nucleotídicas entre los ácidos nucleicos que se hibridan, como puede ser fácilmente apreciado por los expertos en la técnica. Las condiciones rigurosas de temperatura incluirán generalmente temperaturas por encima de 30ºC, típicamente por encima de 37ºC, y preferiblemente por encima de 45ºC. Las condiciones rigurosas de sal ordinariamente serán menos de 1000 mM, típicamente menos de 500 mM, y preferiblemente menos de 200 mM. Sin embargo, la combinación de parámetros es mucho más importante que la medida de cualquier parámetro único. Véase, por ejemplo, Wetmur & Davidson, 1968.

Las secuencias de la sonda se pueden hibridar también específicamente con el DNA dúplex bajo ciertas condiciones para formar un tríplex u otros complejos de DNA de mayor orden. La preparación de tales sondas y las condiciones adecuadas de hibridación son bien conocidas en la técnica.

Los términos "homología sustancial" o "identidad sustancial", cuando se refieren a polipéptidos, indican que el polipéptido o proteína en cuestión presenta al menos aproximadamente 30% de identidad con una proteína completa presente en la naturaleza o con una de sus porciones, usualmente al menos aproximadamente 70 de identidad, y preferiblemente al menos aproximadamente 95% de identidad.

"Función sustancialmente similar" se refiere a la función de un ácido nucleico modificado o de una proteína modificada, con relación al ácido nucleico BRCA2 natural o al polipéptido BRCA2 natural. El polipéptido modificado será sustancialmente homólogo con el polipéptido BRCA2 natural y tendrá sustancialmente la misma función. El polipéptido modificado puede tener una secuencia de aminoácidos alterada y/o puede contener aminoácidos modificados. Además de la similitud de función, el polipéptido modificado puede tener otras propiedades útiles, tal como una semivida más larga. La similitud de función (actividad) del polipéptido modificado puede ser sustancialmente la misma que la actividad del polipéptido BRCA2 natural. Alternativamente, la similitud de función (actividad) del polipéptido modificado puede ser más alta que la actividad del polipéptido BRCA2 natural. El polipéptido modificado se sintetiza usando técnicas convencionales, o se codifica por un ácido nucleico modificado y se produce usando técnicas convencionales. El ácido nucleico modificado se prepara por técnicas convencionales. Un ácido nucleico con una función sustancialmente similar a la función del gen BRCA2 natural produce la proteína modificada descrita
antes.

La homología, para los polipéptidos, se mide típicamente usando un software de análisis de secuencias. Véase, por ejemplo, Sequence Analysis Software Package del Genetícs Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wisconsin 53705. El software para análisis de proteínas empareja secuencias similares usando la medida de homología asignada a diferentes sustituciones, deleciones y otras modificaciones. Las sustituciones conservativas incluyen típicamente sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; ácido aspártico, ácido glutámico; asparragina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina.

Un "fragmento", "porción" o "segmento" de polipéptido es una extensión de residuos de aminoácidos de al menos aproximadamente cinco a siete aminoácidos contiguos, a menudo de al menos aproximadamente siete a nueve aminoácidos contiguos, típicamente de al menos aproximadamente nueve a 13 aminoácidos contiguos y, lo más preferiblemente, de al menos aproximadamente 20 a 30 o más aminoácidos contiguos.

"Región objetivo" se refiere a una región del ácido nucleico que se amplifica y/o se detecta. El término "secuencia objetivo" se refiere a una secuencia con la cual una sonda o un cebador formará un híbrido estable en las condiciones deseadas.

La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, DNA recombinante, genética, e inmunología. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1982; Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1992; Glover, 1985; Anand, 1992; Guthrie & Fink, 1991. Una discusión general de las técnicas y materiales para la cartografía de los genes humanos, incluyendo la cartografía del cromosoma 13 humano, está dispuesta, por ejemplo, en White & Lalouel, 1988.

Preparación de ácidos nucleicas recombinantes o sintetizados químicamente; vectores, transformación, células hospedantes

Se pueden producir grandes cantidades de los polinucleótidos de la presente divulgación por replicación en una célula hospedante adecuada. Los fragmentos de polinucleótidos naturales o sintéticos que codifican un fragmento deseado serán incorporados a construcciones de polinucleótidos recombinantes, usualmente construcciones de DNA, capaces de introducirse y replicarse en una célula procariota o eucariota. Usualmente las construcciones de polinucleótidos serán adecuadas para replicación en un hospedante unicelular, tal como levaduras o bacterias, pero se pueden destinar también a la introducción (con y sin integración dentro del genoma) en líneas celulares cultivadas de mamíferos o plantas, u otras líneas celulares eucariotas. La purificación de los ácidos nucleicos producidos por los métodos de la presente invención se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1992.

Los polinucleótidos de la presente divulgación se pueden producir también por síntesis química, por ejemplo, por el método de fosforamidita descrito por Beaucage & Carruthers, 1981 o el método del triéster según Matteucci and Caruthers, 1981, y se puede llevar a cabo en sintetizadores de oligonucleótidos, automáticos, comerciales. Se puede obtener un fragmento de doble cadena a partir del producto de cadena simple de la síntesis química bien sintetizando la cadena complementaria y alineando las cadenas juntas en condiciones apropiadas o bien añadiendo la cadena complementaria usando DNA-polimerasa con la secuencia de un cebador apropiado.

Las construcciones de polinucleótidos preparadas para introducción en un hospedante procariota o eucariota pueden comprender un sistema de replicación reconocido por el hospedante, que incluye el fragmento pretendido de polinucleótido que codifica el polipéptido deseado, y que incluirá también preferiblemente las secuencias reguladoras de iniciación de la transcripción y de la traducción ligadas operacionalmente al segmento que codifica el polipéptido. Los vectores de expresión pueden incluir, por ejemplo, un origen de la replicación o una secuencia que se replica autónomamente (ARS) y las secuencias de control de la expresión, un promotor, un potenciador y los sitios necesarios de información del proceso, tales como los sitios de unión a las ribosomas, los sitios de corte y empalme del RNA, los sitios de poliadenilación, las secuencias del terminador transcripcional, y las secuencias de estabilización del mRNA. También se pueden incluir señales de secreción, cuando sea apropiado, ya sea a partir de una proteína BRCA2 nativa o de otros receptores o de polipéptidos secretados de la misma especie o de especies relacionadas, lo que permite que la proteína se reticule y/o se aloje en las membranas celulares, y de este modo alcance su topología funcional, o que sea secretada desde la célula. Tales vectores se pueden preparar por medio de métodos recombinantes estándar bien conocidos en la técnica y discutidos, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1992.

Se seleccionarán las secuencias de un promotor apropiado y otras secuencias necesarias del vector de forma que sean funcionales en el hospedante, y pueden incluir, cuando sea apropiado, aquellas asociadas naturalmente con los genes BRCA2. Ejemplos de combinaciones manejables de líneas celulares y vectores de expresión están descritos en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1992; véase también, por ejemplo, Metzger et al., 1988. En la técnica se conocen muchos vectores útiles y se pueden obtener de vendedores tales como Stratagene, New England Biolabs, Promega Biotech, y otros. En hospedantes procariotas se pueden usar promotores tales como los promotores trp, lac y fágicos, los promotores de tRNA y los promotores de la enzima glucolítica. Los promotores de levaduras útiles incluyen las regiones promotoras de metalotioneina, 3-fosfoglicerato-quinasa u otras enzimas glucolíticas tales como la enolasa o gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa, enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa, y otros. Los vectores y promotores adecuados para uso en la expresión de levaduras están descritos adicionalmente en Hitzeman et al., EP 73.675A. Los promotores apropiados no nativos de mamíferos pueden incluir promotores precoces y tardíos a partir de SV40 (Fiers et al., 1978) o promotores derivados del virus de la leucemia murina de Moloney, virus del tumor del ratón, virus del sarcoma aviar, adenovirus II, virus del papiloma bovino o polioma. Además, la construcción puede ser unida a un gen amplificable (por ejemplo, DHFR) de tal modo que se pueden hacer múltiples copias del gen. Para potenciadores apropiados y otras secuencias de control de la expresión, véase también Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1983).

Aunque tales vectores de expresión se pueden replicar de forma autónoma, también se pueden replicar al ser insertados en el genoma de la célula hospedarte, por métodos bien conocidos en la técnica.

Los vectores de expresión y donación contendrán probablemente un marcador seleccionable, un gen que codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de una célula hospedante transformada con el vector. La presencia de este gen asegura solamente el crecimiento de aquellas células hospedantes que expresan los insertos. Los genes de una selección típica codifican proteínas que a) confieren resistencia a los antibióticos o a otras sustancias tóxicas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato, etc., b) complementan las deficiencias auxotróficas, o c) suministran nutrientes críticos no disponibles desde medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina-racemasa para Bacilli. La elección del marcador seleccionable apropiado dependerá de la célula hospedante, y los marcadores apropiados para diferentes hospedantes son bien conocidos en la técnica.

Los vectores que contienen los ácidos nucleicos de interés pueden ser transcritos in vitro, y el RNA resultante puede ser introducido en la célula hospedante por métodos bien conocidos, por ejemplo, por inyección (véase, Kubo et al., 1988), o los vectores pueden ser introducidos directamente en las células hospedantes por métodos bien conocidos en la técnica, que varían dependiendo del tipo de hospedante celular, incluyendo la electroporación; transfección empleando cloruro de calcio, cloruro de rubidio, fosfato de calcio, DEAE-dextrano, u otras sustancias; bombardeo con microproyectiles; lipofección; infección (donde el vector es un agente infeccioso, tal como un genoma retroviral); y otros métodos. Véase en general, Sambrook et al., 1989 y Ausubel et al., 1992. La introducción de los polinucleótidos en la célula hospedante por cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, entre otros, los descritos antes, será denominada aquí como "transformación". Las células en las que se han introducido los ácidos nucleicos descritos antes se considera que incluyen también la progenie de tales células.

Se pueden preparar grandes cantidades de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la presente divulgación expresando los ácidos nucleicos de BRCA2 o sus porciones en vectores u otros vehículos de expresión en células hospedantes procariotas o eucariotas compatibles. Los hospedantes procariotas más comúnmente usados son cepas de Escherichia coli, aunque también se pueden usar otras procariotas, tales como Bacillus subtilis o Pseudomonas.

Se seleccionan los clones usando marcadores que dependen del modo de construcción del vector. El marcador puede estar sobre la misma molécula de DNA o una diferente, preferiblemente la misma molécula de DNA. En los hospedantes procariotas, se puede seleccionar el transformante, por ejemplo, por resistencia a la ampicilina, tetraciclina u otros antibióticos. La producción de un producto particular basado en la sensibilidad a la temperatura puede servir también como un marcador apropiado.

Las células procariotas o eucariotas transformadas con los polinucleótidos de la presente divulgación serán útiles no solamente para la producción de los ácidos nucleicos y polipéptidos de la presente divulgación, sino también, por ejemplo, para estudiar las características de los polipéptidos BRCA2.

Las sondas y cebadores basados en las secuencias del gen BRCA2 descritas aquí se usan para identificar secuencias y proteínas homólogas del gen BRCA2 en otras especies. Estas secuencias y proteínas del gen BRCA2 se pueden usar en métodos de diagnóstico/pronóstico, métodos terapéuticos y métodos de cribado de fármacos.

Análisis de un presunto alelo de BRCA2 mutante

Para determinar la variación de la secuencia nucleotídica de un presunto alelo de BRCA2 mutante asociado con la predisposición al cáncer de mama en relación con una conocida secuencia nucleotídica que codifica BRCA2 natural no mutante que comprende los nucleótidos 229-10482 de la SEQ ID NO:1, de acuerdo con la presente divulgación, se prepara una muestra biológica, tal como sangre, que contiene dicho presunto alelo de BRCA2 mutante.

Inicialmente, el método de cribado puede incluir la amplificación de las secuencias relevantes de BRCA2. En otra realización preferida de la invención, el método de cribado incluye un estrategia no basada en la PCR. Tales métodos de cribado incluyen metodologías de amplificación con marcador de dos etapas que son bien conocidas en la técnica. Tanto las estrategias de cribado basadas en la PCR como las no basadas en la PCR pueden detectar las secuencias objetivos con un alto nivel de sensibilidad.

El método más popular usado hoy es la amplificación del objetivo. Aquí, la secuencia de ácido nucleico objetivo se amplifica con polimerasas. Un método particularmente preferido que usa la amplificación con polimerasa es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa y otros ensayos de amplificación con polimerasa pueden alcanzar un aumento de más de un millón de veces en el número de copias por medio del uso de ciclos de la amplificación dirigida por la polimerasa. Una vez amplificado, el ácido nucleico resultante se puede secuenciar o usar como un sustrato para las sondas de DNA.

Cuando se usan las sondas para detectar la presencia de las secuencias objetivos (por ejemplo, en el escrutinio de la susceptibilidad al cáncer), la muestra biológica a ser analizada, tal como sangre o suero, puede ser tratada, si se desea, para extraer los ácidos nucleicos. La muestra de ácido nucleico se puede preparar de diferentes modos para facilitar la detección de la secuencia objetivo; por ejemplo, por desnaturalización, digestión por restricción, electroforesis o transferencia. La región elegida del ácido nucleico analito usualmente debe ser al menos parcialmente de cadena simple para formar híbridos con la secuencia elegida de la sonda. Sí la secuencia es naturalmente de cadena simple, no se necesitará la desnaturalización. Sin embargo, si la secuencia es de cadena doble, probablemente será necesario que la secuencia sea desnaturalizada. La desnaturalización se puede llevar a cabo por diferentes métodos conocidos en la técnica.

El ácido nucleico analito y la sonda se incuban en condiciones que facilitan la formación de un híbrido estable de la secuencia objetivo de la sonda con la secuencia objetivo putativa del analito. La región de las sondas que se usa para unirse al analito puede hacerse completamente complementaria de la región objetivo del cromosoma 13 humano. Por tanto, son deseables condiciones de gran rigor para evitar falsos positivos. Sin embargo, las condiciones de gran rigor se usan solamente si las sondas son complementarias de las regiones del cromosoma que son únicas en el genoma. El rigor de la hibridación se determina por una serie de factores durante la hibridación y durante el procedimiento de lavado, que incluyen la temperatura, fuerza fónica, composición de las bases, longitud de la sonda, y concentración de formamida. Estos factores se describen en, por ejemplo, Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989. Bajo ciertas circunstancias, puede ser deseable la formación de híbridos de mayor orden, tales como tríplex, cuádruplex, etc., para proporcionar los medios de detectar las secuencias objetivos.

La detección, si la hubiera, del híbrido resultante se consigue usualmente por el uso de sondas marcadas. Alternativamente, la sonda puede estar sin marcar, pero puede ser detectable por la unión específica con un ligando que está marcado, ya sea directa o indirectamente. Los marcadores adecuados, y los métodos para marcar sondas y ligandos son conocidos en la técnica, e incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos que se pueden incorporar por métodos conocidos (por traslado de cortes, por el uso de cebadores aleatorios o quinasas), biotina, grupos fluorescentes, grupos quimioluminiscentes (por ejemplo, dioxietanos, particularmente dioxietanos activados), enzimas, anticuerpos y similares. Las variaciones de este esquema básico son conocidas en la técnica, e incluyen aquellas variaciones que facilitan la separación de los híbridos a ser detectados de los materiales extraños y/o que amplifican la señal del residuo marcado. Una serie de estas variaciones se revisa en, por ejemplo, Matthews & Kricka, 1988; Landegren et al., 1988; Mittlin, 1989; patente de Estados Unidos 4.868.105, y en la publicación EPO Nº 225.807.

Como se ha indicado antes, los ensayos de cribado que no se basan en la PCR también se contemplan en esta invención. Un ejemplo de un procedimiento no basado en la PCR se da en el Ejemplo 6. Este procedimiento hibrida una sonda de ácido nucleico (o un análogo tal como un soporte de fosfonato de metilo que sustituye al fosfodiéster normal) con el objetivo del DNA a bajo nivel. Esta sonda puede tener una enzima ligada covalentemente a la sonda, de tal modo que el ligamiento covalente no interfiere con la especificidad de la hibridación. Este complejo de enzima-sonda-conjugado-ácido nucleico objetivo, se puede aislar entonces del conjugado sonda-enzima libre y se añade un sustrato para la detección por la enzima. Se observa la actividad enzimática como un cambio en el desarrollo de color o emisión de luminiscencia que da como resultado un aumento en la sensibilidad de 10^{3}-10^{6}. Para un ejemplo relativo a la preparación de conjugados de oligodesoxinucleótido-fosfatasa alcalina y a su uso como sondas de hibridación, véase Jablonski et al., 1986.

Las metodologías de amplificación con marcador en dos etapas son conocidas en la técnica. Estos ensayos trabajan sobre el principio de que un pequeño ligando (tal como digoxigenina, biotina, o similares) se une a una sonda de ácido nucleico capaz de unirse específicamente a BRCA2. Se pueden desarrollar ejemplos de sondas basándose en la secuencia indicada en la SEQ ID NO:1 y en la Figura 3 de esta solicitud de patente. Las sondas alelo-específicas se contemplan también dentro del alcance de este ejemplo y los ejemplos de sondas alelo-específicas incluyen las sondas que abarcan las mutaciones de predisposición descritas más adelante, incluyendo las descritas en la Tabla 2.

En un ejemplo, el pequeño ligando unido a la sonda de ácido nucleico es reconocido específicamente por un conjugado de anticuerpo-enzima. En una realización de este ejemplo, la digoxigenina se une a la sonda de ácido nucleico. La hibridación se detecta por un conjugado de anticuerpo-fosfatasa alcalina que cambia sobre un sustrato quimioluminiscente. Para métodos de marcaje de las sondas de ácido nucleico según esta realización véase Martin et al, 1990. En un segundo ejemplo, el pequeño ligando es reconocido por un conjugado de un segundo ligando-enzima que es capaz de complejarse específicamente con el primer ligando. Una realización bien conocida de este ejemplo son las interacciones de tipo biotina-avidina. Para métodos de marcaje de las sondas de ácido nucleico y su uso en los ensayos basados en biotina-avidina véase Rigby et al., 1977 y Nguyen et al., 1992.

Se contempla también dentro del alcance de esta invención que los ensayos con las sondas de ácido nucleico de esta invención emplearán una mezcla de sondas de ácido nucleico capaces de detectar BRCA2. De este modo, en un ejemplo para detectar la presencia de BRCA2 en una muestra de células, se emplea más de una sonda complementaria a BRCA2 y en particular el número de sondas diferentes es alternativamente 2, 3, o 5 secuencias diferentes de la sonda de ácido nucleico. En otro ejemplo, para detectar la presencia de mutaciones en la secuencia del gen BRCA2 en un paciente, se emplea más de una sonda complementaria a BRCA2 donde la mezcla incluye sondas capaces de unirse a las mutaciones alelo-específicas identificadas en las poblaciones de pacientes con alteraciones en BRCA2. En esta realización, se puede usar cualquier número de sondas, y preferiblemente se incluirán sondas que corresponden a las principales mutaciones del gen identificadas como que predisponen a un individuo al cáncer de mama. Algunas sondas candidatos contempladas dentro del alcance de la invención incluyen sondas que incluyen las mutaciones alelo-específicas descritas más adelante y las que tienen las regiones BRCA2 que se muestran en la SEQ ID NO:1 y en la Figura 3, en ambos lados 5' y 3' del sitio de mutación.

Se puede detectar el polipéptido BRCA2 codificado por el presunto alelo de BRCA2 mutante. Las alteraciones en un polipéptido semejante se pueden determinar por análisis de secuencias de acuerdo con las técnicas convencionales. Más preferiblemente, se usan anticuerpos (policlonales o monoclonales) para detectar diferencias en los péptidos BRCA2 o la ausencia de estos péptidos. Los anticuerpos se pueden preparar como se ha discutido antes bajo el epígrafe "Anticuerpos" y como se muestra adicionalmente en los ejemplos 9 y 10. Otros métodos para producir y purificar anticuerpos son bien conocidos en técnica y se puede elegir cualquiera de tales métodos. Los anticuerpos se pueden usar para inmunoprecipitar las proteínas BRCA2 de la solución así como para reaccionar con la proteína BRCA2 sobre transferencias Western o inmunotransferencias en geles de poliacrilamida. Los anticuerpos se pueden usar para detectar proteínas BRCA2 en parafina o en secciones de tejido congeladas, usando técnicas inmunocitoquímicas.

Los métodos preferidos para detectar BRCA2 o sus mutaciones incluyen los ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunorradiométricos (IRMA) y ensayos inmunoenzimáticos (TEMA), incluyendo los ensayos sandwich que usan anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Ejemplos de los ensayos sandwich están descritos por David et al., en las patentes de Estados Unidos números 4.376.110 y 4.486.630, y se ilustran en el Ejemplo 9.

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Se hace referencia a los siguientes ejemplos, que se muestran a modo de ilustración y que no se pretende que limiten la invención de ningún modo. Se utilizaron los métodos estándar bien conocidos en la técnica o los métodos específicamente descritos a continuación.

Ejemplo 1 Investigación y estudio de familias con probabilidad de tener un locus de susceptibilidad al cáncer de mama ligado al cromosoma 13

Se investigaron familias extensas propensas al cáncer procedentes de una población definida que proporciona un conjunto grande de familias extensas con múltiples casos de cáncer de mama y muchos parientes disponibles para el estudio. El gran número de meiosis presentes en estas grandes familias proporcionó la capacidad de detectar si se había segregado o no el locus BRCA2, y aumentó la oportunidad de que aparezcan recombinantes informativos dentro de la pequeña región que se estaba investigando. Esto mejoró en gran manera las posibilidades de establecer una conexión con la región BRCA2, y facilitó grandemente la reducción de la región BRCA2 hasta un tamaño manejable que permite la identificación del propio locus BRCA2.

Cada familia se extendió a todos los parientes conectivos disponibles, y a todos los parientes de primer grado, informativos, de cada probando o caso de cáncer. Para estas familias, a través de los archivos relacionados con el registro de tumores, se identificaron casos adicionales de cáncer de mama e individuos con cáncer en otros sitios de interés que también aparecieron en las familias. Se investigaron todos los cánceres de mama registrados en la familia que estaban confirmados en el Utah Cancer Registry. Para confirmación de todos los cánceres se obtuvieron los informes médicos o los certificados de defunción. Cada individuo conectivo clave y todos los individuos informativos fueron invitados a participar proporcionando una muestra de sangre de la cual se extrajo el DNA. Se tomaron también muestras a los cónyuges y parientes de los casos fallecidos de forma que el genotipo de los casos fallecidos pudiera ser inferido de los genotipos de sus parientes.

Para los estudios de relación con los marcadores del cromosoma 13 se seleccionaron las familias que tenían tres o más casos de cáncer con genotipos inferibles. Estas familias incluían las originalmente investigadas a partir de las bases de datos relacionadas, para un estudio de enfermedades de mama proliferativas y de cáncer de mama (Skolnick et al., 1990). El criterio de selección de estas familias fue la presencia de dos hermanas o una madre y su hija con cáncer de mama. Adicionalmente, se incluyeron las familias que habían sido estudiadas desde 1980 como parte de los estudios de relación con el cáncer de mama y las familias investigadas, a partir de las bases de datos relacionadas, para la presencia de grupos de cáncer de mama en hombres y mujeres y las familias autocalificadas con cáncer de mama de iniciación precoz. Estas familias se investigaron y extendieron en las sesiones clínicas del experimento de la forma descrita antes.

Para cada muestra recogida de estas familias, se extrajo el DNA de la sangre o de bloques de tejido fijados en parafina usando protocolos estándar de laboratorio. La determinación del genotipo en este estudio estuvo restringida a los marcadores de repeticiones cortas en tándem (STR), puesto que, en general tienen alta heterozigosidad y los métodos de la PCR ofrecen un rápido proceso a la vez que usan muy pequeñas cantidades de DNA. Para ayudar en este esfuerzo, se desarrollaron marcadores STR sobre el cromosoma 13 cribando una genoteca de cósmidos específicos del cromosoma para buscar clones que contenían repeticiones cortas en tándem de 2, 3, o 4, localizadas en el brazo corto de la región del locus supresor de tumores Rb. Las secuencias de oligonucleótidos de los marcadores no desarrollados en el laboratorio de esta invención se obtuvieron de informes publicados o como parte del Breast Cancer Linkage Consortium o de otros investigadores. A todas las películas de determinación de los genotipos se les dio una puntuación a ciegas con un marcador de pistas estándar usado para mantener una codificación coherente de los alelos. Las muestras claves sufrieron una tipificación duplicada de todos los marcadores relevantes.

Las puntuaciones LOD para cada familia se calcularon para dos valores fraccionarios de recombinación, 0,001 y 0,1. (Para el cálculo de las puntuaciones LOD, véase Ott 1985). Las probabilidades se calcularon según el modelo derivado por Claus et al., 1991, que asume una frecuencia estimada de genes de 0,003, un riesgo durante la vida en las mujeres portadoras de genes de aproximadamente 0,80, y riesgos específicos de la población para el cáncer de mama, basados en la edad, en los no portadores de genes. Las frecuencias de los alelos para los marcadores usados para el cálculo de las puntuaciones LOD, se calcularon a partir de las tipificaciones hechas en el laboratorio de la invención de individuos no relacionados del panel CEPH (White and Lalouel, 1988).

La familia 107 es la familia más grande con cáncer de mama ligado al cromosoma 13 registrada hasta la fecha en todos los grupos. Los indicios de la conexión con el cromosoma 13 para esta familia son abrumadores. En las familias más pequeñas, los cánceres esporádicos confundieron en gran medida el análisis de la conexión y la correcta identificación de los recombinantes clave.

Con el fin de mejorar la caracterización de los recombinantes y definir los marcadores de flanqueamiento más próximos, se necesitó un mapa denso de esta región relativamente pequeña sobre el cromosoma 13. El método de esta invención fue analizar los marcadores STR existentes proporcionados por otros investigadores y cualquier marcador nuevamente desarrollado en el laboratorio de esta invención de las familias ligadas por el cromosoma. La Figura 1 muestra la localización de diez marcadores usados en el análisis genético. La Tabla 1 da las puntuaciones LOD para la conexión de cada una de las 19 familias de este estudio, lo que redujo la región a aproximadamente 1,5 Mb.

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
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La Tabla 1 indica también la probabilidad posterior de una familia que tiene una mutación BRCA2 basada en las puntuaciones LOD y en las probabilidades anteriores. Cuatro de estos marcadores (D13S171, D13S260, D13S310 y D13S267) eran conocidos previamente. Los otros seis marcadores se encontraron como parte de esta investigación sobre BRCA2. En esta invención ha sido posible reducir la región a 1,5 megabases basándose en un recombinante de la familia 107 con marcador tdj3820 en el límite izquierdo, y un segundo recombinante en la familia 2043 con marcador YS-G-B10T en el límite derecho (véase la Figura 1) que está aproximadamente en la misma localización que AC6 y D13S310. Además se encontró una deleción homozigótica en una línea celular de un tumor pancreático en la región BRCA2 que puede haber sido dirigida por la propia BRCA2; esta deleción se denomina deleción de Schutte/Kern en la Figura 1 (Schutte et al., 1995). El contig de Schutte/Kern de la Figura 1 se refiere al mapa físico de estos autores que cubre la deleción.

Ejemplo 2 Desarrollo de recursos genéticos y físicos en la región de interés

Para aumentar el número de locus altamente polimórficos en la región BRCA2, se ha desarrollado una serie de marcadores STR en el laboratorio de esta invención a partir de los P1, BAC y YAC que cartografían físicamente la región. Estos marcadores permitieron refinar adicionalmente la región (véase la Tabla 1 y la discusión anterior).

Los STS de la región deseada se usaron para identificar los YAC que los contienen. Estos YAC se usaron después para identificar subclones en los P1 o BAC. Estos subclones se cribaron después en cuanto a la presencia de repeticiones cortas en tándem. Se seleccionaron con preferencia los clones con una fuerte señal, ya que era más probable que representaran repeticiones que tienen un gran número de repeticiones y/o que son de una fidelidad al molde casi perfecta. Es conocido que estas dos características aumentan la probabilidad de polimorfismo (Weber et al., 1990). Estos clones fueron secuenciados directamente del vector para localizar la repetición. Se obtuvo una única secuencia en un lado de la repetición corta en tándem usando un cebador de un conjunto de posibles cebadores complementarios con el extremo de la repetición. Basándose en esta única secuencia se preparó un cebador para volver a secuenciar a lo largo de la repetición en la otra dirección, obteniéndose una única secuencia para el diseño de un segundo cebador que la flanquea. Después se cribaron los STR en cuanto a polimorfismo en un pequeño grupo de individuos no relacionados y se analizaron frente al panel híbrido para confirmar su localización física. Se tipificaron entonces nuevos marcadores que satisfacían estos criterios en un conjunto de individuos no relacionados de Utah para obtener frecuencias de alelos apropiadas para el estudio de esta población. Muchos de los otros marcadores descritos en este estudio se analizaron también en individuos no relacionados para obtener frecuencias de alelos similarmente apropiadas.

Usando el procedimiento descrito antes, se encontraron nuevos STR a partir de estos YAC que eran polimórficos ambos y estaban localizados en la región BRCA2. La Figura 1 muestra un mapa esquemático de los P1, BAC y YAC en la región BRCA2.

Ejemplo 3 Identificación de los clones de cDNA candidatos para el locus BRCA2 por análisis genómico de la región contig 1. Métodos generales

Cribado completo de la región recomendable. El primer método para identificar los cDNA candidatos, aunque muy laborioso, usó técnicas convencionales. El método comprendió el cribado de los clones P1 y BAC en la región contig para identificar las secuencias codificadoras putativas. Los clones que contienen las secuencias codificadoras putativas se usaron después como sondas sobre filtros de genotecas de cDNA para identificar los clones de cDNA candidatos para futuros análisis. Se cribaron los clones para encontrar las secuencias codificadoras putativas por uno cualquiera de dos métodos.

Los clones de P1 a ser analizados se digirieron con una enzima de restricción para liberar el DNA humano desde el DNA vector. Se separó el DNA sobre un gel de agarosa al 0,5% de 14 cm, haciendo el recorrido durante la noche a 20 voltios durante 16 horas. Las bandas de DNA humano se cortaron del gel y se electroeluyeron del trozo de gel a 100 voltios durante al menos dos horas en 0,5x de solución tampón de tris-acetato (Maniatis et al., 1982). El DNA
(\sim 15 kb a 25 kb) digerido con Not I, eluido, se digirió después con la enzima de restricción EcoRI para dar fragmentos más pequeños (-0,5 kb a 5,0 kb) que se separaron más fácilmente para la siguiente etapa de marcaje del DNA con radionucleótidos. Los fragmentos de DNA se marcaron por medio del método de marcaje con cebador hexámero aleatorio (Boehringer-Mannheim, Cat nº 1004760). El DNA marcado se precipitó con espermina (se añaden 100 \mul de TE, 5 \mul de espermina 0,1 M, y 5 \mul de DNA de esperma de salmón a 10 mg/ml) para separar los radionucleótidos no incorporados. Se volvió a suspender entonces el DNA marcado en 100 \mul de TE, NaCl 0,5 M a 65ºC durante 5 minutos y después se bloqueó con DNA C_{o}t-1 humano durante 2-4 horas, siguiendo las instrucciones del fabricante (Gibco/BRL, Cat nº 5279SA). La sonda bloqueada con C_{o}t-1 se incubó sobre los filtros en la solución de bloqueo durante la noche a 42ºC. Los filtros se lavaron durante 30 minutos a temperatura ambiente en 2 x SSC, SDS al 0,1%, y después en el mismo tampón durante 30 minutos a 55ºC. Se expusieron entonces los filtros durante 1 a 3 días a -70ºC a una película Kodak XAR-5 con un filtro intensificador. De este modo, las transferencias se híbridaron o con el conjunto de fragmentos generados por Eco-RI del inserto, o con cada uno de los fragmentos individualmente.

El DNA humano de los clones de la región se aisló como un inserto completo o como fragmentos generados por Eco-RI y se marcó como se ha descrito antes. Se usó el DNA marcado para cribar los filtros de diferentes genotecas de cDNA en las mismas condiciones descritas anteriormente excepto que los filtros de cDNA sufren un lavado más riguroso de 0,1 x SSC, SDA al 0,1% a 65ºC durante 30 minutos dos veces.

La mayor parte de las genotecas de cDNA usadas hasta la fecha en estos estudios (genotecas de tejido de mama normal, de tejido de mama de una mujer en su octavo mes de embarazo y de un cáncer de mama) se prepararon en Clonetech, Inc. La genoteca de cDNA generada a partir del tejido de la mama de una mujer embarazada de 8 meses está disponible en Clonetech (Cat. Nº HL1037a) en el vector Lambda gt-10, y se cultiva en células hospedantes bacterianas C600Hfl. Las muestras de tejido de mama normal y de tejido de mama maligno se aislaron de una mujer de raza blanca de 37 años y se envió a Clonetech un gramo de cada tejido para la obtención de mRNA y la construcción de la genoteca de cDNA. Las dos últimas genotecas se generaron utilizando tanto cebadores aleatorios como cebadores oligo-dT, con selección del tamaño de los productos finales que fueron donados después en el vector Lambda Zap II, y cultivados en una cepa XL1-blue de bacterias como se describe por el fabricante. Las genotecas adicionales de cDNA específico del tejido incluyen cerebro fetal humano (Stratagene, Cat 936206), testículos humanos (Clonetech Cat HL3024), timo humano (Clonetech Cat HL1127n), cerebro humano (Clonetech Cat HL11810), placenta humana (Clonetech Cat 1075b), y músculo esquelético humano (Clonetech Cat HL1124b).

Las genotecas de cDNA se dispusieron en placas con sus células hospedantes sobre placas NZCYM, y se hicieron transferencias a filtros por duplicado de cada placa según el método de Maniatis et al. (1982). El DNA del inserto (humano) procedente de los clones genómicos candidatos se purificó y se marcó radiactivamente para una actividad específica alta. El DNA radiactivo se hibridó entonces con los filtros de cDNA para identificar los cDNA que corresponden a los genes localizados dentro del clon cósmido candidato. Los cDNA identificados por este método se recogieron, se volvieron a poner en placas, y se cribaron de nuevo con el inserto del clon marcado o su DNA derivado del fragmento por EcoRI para verificar su estado positivo. Los clones que fueron positivos después de esta segunda ronda de cribado se cultivaron a continuación y sus DNA se purificaron por análisis de transferencia Southern y secuenciación. Los clones o bien se purificaron como plásmidos por medio de la escisión in vivo del plásmido desde el vector Lambda como está descrito en los protocolos de los fabricantes, o bien se aislaron del vector Lambda como un fragmento de restricción y se subclonaron en el vector plásmido.

El análisis por transferencia Southern se realizó por duplicado, una de ellas, usando el DNA del inserto genómico original como una sonda para verificar que el inserto de cDNA contiene secuencias de hibridación. La segunda transferencia se hibridó con el DNA del inserto de cDNA del clon más grande de cDNA para identificar qué clones representan el mismo gen. Se secuenciaron todos los cDNA que se hibridan con el clon genómico y son únicos y se analizó el DNA para determinar si las secuencias representan genes conocidos o únicos. Todos los clones de cDNA que aparecían como únicos fueron analizados después como candidatos a los locus BRCA2. Específicamente, los clones se hibridaron a transferencias Northern para buscar la expresión específica en la mama y la expresión diferencial de los RNA normales frente a los RNA de tumores de mama. También se analizaron por la PCR sobre los clones en la región BRCA2 para verificar su localización. Para cartografiar la extensión del locus, se aislaron los cDNA de longitud completa y se usaron sus secuencias como sondas de PCR sobre los YAC y los clones circundantes y que incluyen los clones de identificación originales. Los límites de intrón-exón se definen después adicionalmente por medio del análisis de secuencias.

Se ha hecho un cribado de genotecas de cDNA de mama normal, de mama de 8 meses de embarazo y de cerebro fetal con fragmentos Eco RI a partir de los clones cósmidos BAC y P1 en la región. Se identificaron en las tres genotecas los clones de DNA de BRCA2 potenciales. Se recogieron los clones, se pusieron en placas y se cribaron de nuevo con la sonda original para verificar que eran positivos.

Análisis de cDNA seleccionado por híbridos. Los fragmentos de cDNA obtenidos de la selección directa se comprobaron por hibridación en transferencia Southern frente al DNA sonda para verificar que se hablan originado de la región contig. Los que pasaron esta prueba fueron secuenciados en su totalidad. El conjunto de secuencias de DNA obtenidas de este modo se comprobaron después una frente a otra para encontrar clones independientes que se solapan.

La selección directa del método de cDNA (Lovett et al., 1991; Futreal, 1993) se utiliza con DNA de P1 y BAC como sonda. El DNA sonda se digiere con una enzima de restricción de corte romo tal como HaeIIi. Los adaptadores de cadena doble se ligan entonces sobre el DNA y sirven como sitios de unión de los cebadores en subsiguientes reacciones de amplificación por PCR usando cebadores biotinilados. El DNA objetivo se genera a partir de mRNA derivado de las muestras de tejidos, por ejemplo, tejido de mama, por la síntesis de la primera cadena con cebadores aleatorios o con cebadores oligo(dT), seguida por la síntesis de la segunda cadena. Los extremos de cDNA se hacen romos y se ligan con adaptadores de doble cadena. Estos adaptadores sirven como sitios de amplificación por PCR. Las secuencias del objetivo y de la sonda se desnaturalizan y se mezclan con DNA C_{o}t-1 humano para bloquear las secuencias repetitivas. La hibridación de la solución se realiza a valores altos de C_{o}t-112 para asegurar la hibridación de las moléculas raras del cDNA objetivo. El material alineado se captura entonces sobre perlas de avidina, se lava con gran rigor y los cDNA retenidos se eluyen y se amplifican por PCR. El cDNA seleccionado se somete a posteriores rondas de enriquecimiento antes de su donación en un vector plásmido para análisis.

Análisis de las islas HTF. Un método para identificar cósmidos para usar como sondas en las genotecas de cDNA fue el análisis de las islas HTF. Las islas HTF son segmentos de DNA que contienen un frecuencia muy alta de dinucleótidos CpG no metilados (Tonolio et al., 1990) y se revelan por el agrupamiento de los sitios de restricción de enzimas cuyas secuencias de reconocimiento incluyen los dinucleótidos CpG. Las enzimas conocidas como útiles en el análisis de las islas HTF son AscI, NotI, BssHII, EagI, SacII, NaeI, NarI, SmaI, y MluI (Anand, 1992).

Análisis de clones candidatos. Se secuenciaron uno o más de los genes candidatos generados anteriormente y se usó la información para la identificación y clasificación de cada gen expresado. Las secuencias de DNA se compararon con genes conocidos por comparaciones de las secuencias nucleotídicas y por traducción en todos los marcos de lectura seguido por una comparación con las secuencias de aminoácidos conocidas. Esto se consiguió usando el software Genetic Data Environment (GDE) versión 2.2 y las series Basic Local Alignment Search Tool (Blast) de paquetes de software de cliente/servidor (por ejemplo BLASTIN 1.3.13MP), para comparación de secuencias entre las bases de datos tanto locales como remotas (por ejemplo, GenBank), trabajando en estaciones de trabajo Sun SPARC. Se han generado secuencias reconstruidas de colecciones de clones de cDNA identificadas con los cósmidos y los PI. Todos los genes candidatos que representaban secuencias nuevas se analizaron además para comprobar sus posibilidades como locus BRCA2 putativos.

Cribado de las mutaciones. Para cribar las mutaciones en los parientes afectados, se siguieron dos métodos diferentes. En primer lugar, el DNA genómico aislado de los miembros de la familia que se sabe que son portadores del alelo de BRCA2 de susceptibilidad se usó como un molde para la amplificación de las secuencias del gen candidato por PCR. Si los cebadores de la PCR flanquean o solapan un límite de intrón/exón, el fragmento amplificado será más grande que lo previsto por la secuencia de cDNA o no estará presente en la mezcla amplificada. Por una combinación de tales experimentos de amplificación y secuenciación de los clones P1 o BAC usando el conjunto de cebadores diseñados es posible establecer la estructura intrón/exón y finalmente obtener las secuencias de DNA del DNA genómico de las familias.

Un segundo método que es mucho más rápido si la estructura intrón/exón del gen candidato es compleja incluye secuenciar los fragmentos amplificados desde el cDNA sintetizado a partir del mRNA de los linfocitos extraído de la sangre de familiares que se usó como sustrato para la amplificación por PCR usando el conjunto de cebadores diseñados. Si el gen candidato se expresa hasta una extensión significativa en los linfocitos, tales experimentos producen usualmente fragmentos amplificados que pueden ser secuenciados directamente sin conocimiento de las uniones intrón/exón.

Los productos de tales reacciones de secuenciación se analizaron por electroforesis en gel para determinar las posiciones de la secuencia que contienen o mutaciones tales como deleciones o inserciones, o sustituciones de pares de bases que causan los cambios de aminoácidos u otros efectos perjudiciales.

Cualquier secuencia dentro de la región BRCA2 que se expresa en la mama se considera que es un gen candidato a BRCA2. Los indicios convincentes de que un gen candidato dado corresponde a BRCA2 vienen de la demostración de que las familias emparentadas contienen alelos defectuosos del candidato.

2. Métodos específicos

Selección de híbridos. Se usaron en este trabajo dos métodos distintos de selección de híbridos.

Método 1

Preparación y selección de cDNA

Se preparó cDNA utilizando un cebador aleatorio a partir de RNA-poly (A)^{+} de los tejidos de las glándulas mamarias, ovario, testículos, cerebro fetal y placenta y a partir de RNA total de la línea celular Caco-2 (ATCC HTB 37). A los cDNA se les añadió una cola de homopolímero y después se seleccionaron los híbridos para dos rondas consecutivas de hibridación al DNA inmovilizado de P1 o BAC como se ha descrito previamente. (Parimoo et al., 1991; Rommens et al., 1994). En los experimentos de selección individual, se usaron grupos de dos a cuatro clones P1 y/o BAC de solapamiento. Se recogió el cDNA de hibridación, se pasó a través de una columna Fine Sephadex G50 y se amplificó usando cebadores con cola. Los productos se digirieron entonces con EcoRI, se seleccionaron por tamaño sobre geles de agarosa, y se ligaron a pBluescript (Stratagene) que había sido digerido con EcoRI y se trataron con fosfatasa alcalina de vaca (Boehringer Mannheim). Los productos de ligación se transformaron en células competentes DH5a de E. coli (Life Technologies, Inc.).

Caracterización de los cDNA recuperados. Se recogieron 200 a 300 colonias individuales de cada ligación (de cada una de las 250 kbases del DNA genómico) y se extendieron en cuadrículas en placas de microtitulación para ordenamiento y almacenaje. Los cultivos se transfirieron por duplicado a membranas Hybond N (Amersham) en soporte de agar LB con ampicilina. Se dejó que se propagaran las colonias y a continuación se usaron con procedimientos estándar. El análisis inicial de los clones de cDNA incluyó un precribado de las secuencias ribosómicas y subsiguientes cribados cruzados para la detección de solapamiento y redundancia.

Se eliminaron aproximadamente 10-25% de los clones porque se habían hibridado fuertemente con el cDNA radiomarcado obtenido del RNA total. Se aislaron para análisis posterior los plásmidos de 25 a 50 clones de cada experimento de selección que no se habían hibridado en el precribado. Se comprobó que los fragmentos de cDNA recuperados se originaban de los clones genómicos de partida individuales por hibridación con los digeridos por restricción de los DNA de los clones de partida, de una línea celular híbrida de hámster (GM10898A) que contiene el cromosoma 13 como su único material humano, y con el DNA genómico humano. Los clones se asignaron tentativamente a grupos basándose en los intervalos de solapamiento y no-solapamiento de los clones genómicos. De los clones analizados, aproximadamente el 85% se correspondían en su mapa con los clones de partida.

Método 2 (Lovett et al., 1991)

Preparación de cDNA

Los RNA enriquecidos con Poly(A) procedentes de glándulas mamarias, cerebro, linfocitos y estómago humanos se transcribieron inversamente usando el cebador aleatorio con cola, XN_{12}

[5'-(NH_{2})-GTAGTGCAAGGCTCGAGAACNNNNNNNNNNNN]

(SEQ ID NO:3)

y la transcriptasa inversa Superscript II (Gibco BRL). Después de la síntesis de la segunda cadena y pulido del extremo, el cDNA ds (bicatenario) se purificó en columnas de Sepharose CL-4B (Pharmacia). Los cDNA fueron "anclados" por ligación de un oligo RP de doble cadena

[5'-(NH_{2})-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTGTTC

(SEQ ID NO:4)

alineado con

5'-GAACAATGACGGCCGTTAGAATTCTACTCA-(NH2)

(SEQ ID NO:5)]

a sus extremos 5' (5' con relación a mRNA) usando la DNA-ligasa T4. El cDNA ds anclado se volvió a purificar después sobre columnas de Sepharose CL-4B.

Selección. Los cDNA de los tejidos de glándulas mamarias, cerebro, linfocitos y estómago se amplificaron en primer lugar usando una versión anidada de RP

(RP.A: 5'-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCAT)

(SEQ ID NO:6)

y

XPCR [5'-(PO_{4})-GTAGTGCAAGGCTCGAGAAC

(SEQ ID NO:7)]

y se purificó por fraccionamiento en Sepharose CL-4B. Las sondas de selección se prepararon a partir de los P1, BAC o PAC purificados por digestión con HinfI y exonucleasa III. La sonda de cadena simple fue fotomarcada con fotobiotina (Gibco BRL) según las recomendaciones del fabricante. La sonda, el cDNA y el DNA Cot-1 se hibridaron en TEA-CL 2,4 M, NaPO_{4} 10 mM, EDTA 1 mM. Los cDNA hibridados se capturaron sobre partículas paramagnéticas de estreptavidina (Dynal), se eluyeron, y se reamplificaron con una versión adicional anidada de RP

[RP.B: 5'-(PO_{4})-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTG

(SEQ ID NO:8)]

y XPCR, y se seleccionaron por tamaño sobre Sepharose CL-4B. El cDNA amplificado seleccionado, se hibridó con una alícuota adicional de la sonda y DNA C_{o}t-1. Los productos capturados y eluidos se amplificaron de nuevo con RP.B y XPCR, se seleccionaron por tamaño por electroforesis en gel y se donaron en pUC18 cortado por HincII desfosforilado. Los productos de ligación se transformaron en células ultracompetentes XL2-Blue (Stratagene).

Análisis. Aproximadamente 192 colonias para cada experimento de selección con sonda única se amplificaron por PCR de la colonia usando cebadores vectores y se sometieron por duplicado a una transferencia sobre filtros de nilón Zeta Probe (Bio-Rad). Se hibridaron los filtros usando procedimientos estándar o con DNA C_{o}t-1 con cebador aleatorio o con DNA sonda (P1, BAC o PAC). Los clones C_{o}t-1-negativos y sonda-positivos se secuenciaron en ambas direcciones usando cebadores vectores sobre un secuenciador ABI 377.

Atrapamiento de exones. La amplificación de exones se realizó usando un conjunto con mínimo solapamiento de BAC, P1 y PAC para aislar una serie de secuencias de genes procedentes de la región candidata a BRCA2. Se ensamblaron los grupos de clones genómicos, que contenían de 100-300 kb de DNA en la forma de 1-3 clones genómicos con solapamiento. Los clones genómicos se digirieron con PstI o BamHI + BgIII y se ligaron a los sitios PstI o BamHI del vector de corte y empalme pSPL3. Se realizó la técnica de amplificación de exones (Church et al., 1993) y se clonaron los productos finales en el plásmido pAMP1 a partir del sistema de clonación con uracilo-DNA-glucosilasa (BRL). Se recogieron aproximadamente 6000 clones, se propagaron en placas de 96 pocillos, se estamparon sobre filtros, y se analizaron en cuanto a la presencia del vector y de secuencias de repeticiones, por medio de hibridación. Cada inserto del clon se amplificó por PCR y se analizó en cuanto a la redundancia, localización y especificidad humana por hibridación a las cuadrículas de exones y trasferencias del DNA genómico original. Los exones candidatos únicos se secuenciaron, se investigaron frente a las bases de datos, y se usaron para hibridación a genotecas de cDNA.

5' RACE. El extremo 5' de BRCA2 fue identificado por un protocolo RACE

modificado llamado RACE con captura de biotina. El RNA enriquecido con Poly(A) procedente de la glándula mamaria y del timo se transcribió inversamente usando el cebador aleatorio con cola, XN_{12}

[5'-(NH_{2})-GTAGTGCAAGGCTCGAGAACNNNNNNNNNNNN

(SEQ ID NO:3)]

y la transcriptasa inversa Superscript II (Gibco BRL). La cadena de RNA se hidrolizó en NaOH y la primera cadena de cDNA se purificó por fraccionamiento sobre Sepharose CL-4B (Pharmacia). Las primeras cadenas de los cDNA se "anclaron" por ligación de un oligo de cadena doble con un colgante en 5' aleatorio de 7 bp [ds UCA: 5'-CCTTCACACGCGTATCGATTAGTCACNNNNNNN.(NH_{2}) (SEQ ID NO:9) alineada a 5'-(PO_{4})-GTGACTAATCGATACGCGTGTGAAGGTGC (SEQ ID NO:10)] a sus extremos 3' usando la DNA-ligasa T4. Después de la ligación, el cDNA anclado se volvió a purificar por fraccionamiento sobre Sepharose CL-4B. Se amplificó el extremo 5' de BRCA2 usando un cebador inverso biotinilado

[5'-(B)-TTGAAGAACAACAGGACTTTCACTA] (SEQ ID NO: 11) y una versión anidada de UCA [UCP.A: 5'-CACCTTCACACGCGTATCG (SEQ ID NO:12)]. Los productos de la PCR se fraccionaron sobre un gel de agarosa, se purificaron en el gel, y se capturaron sobre partículas paramagnéticas de estreptavidina (Dynal). El cDNA capturado se reamplificó usando un cebador inverso anidado [5'-GTTCGTAATTGTTGTTTTTATGTTCAG] (SEQ ID NO:13) y una versión adicional anidada de UCA [UCP.B: 5'-CCTTCACACGCGTATCGATTAG] (SEQ ID NO:14)]. Esta reacción POR dio una única banda muy marcada sobre el gel de agarosa; el DNA se purificó en el gel y se secuenció en ambas direcciones sobre un secuenciador ABI 377.

Clones de cDNA. Las genotecas de cDNA humano se cribaron con clones seleccionados de híbridos marcados con ^{32}P o con clones atrapados en exones. Los fagos eluidos de las placas terciarias se amplificaron por la PCR con cebadores específicos de vectores y después se secuenciaron en un secuenciador ABI 377. Transferencias Northern. Se compraron de Clonetech filtros Multiple Tissue Northem (MTN) que están cargados con 2 \mug por pista de poly(A) + RNA derivado de una serie de tejidos humanos. Se usaron para explorar los filtros, sondas marcadas con cebador aleatorio con ^{32}P que corresponden a los cDNA recuperados GT 713 (exones 3-7 de BRCA2), \lambda wCPF1B8.11 (extremo 3' del exón 11 en el exón 20), y gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (GAPDH). Las prehibridaciones se hicieron a 42ºC en formamida al 50%, 5X SSPE, SDS al 1%, 5X de mezcla de Denhardt, DNA de testículos de salmón desnaturalizado a 0,2 mg/ml y 2\mug/ml de poly(A). Las hibridaciones se realizaron en la misma solución con la adición de sulfato de dextrano hasta 4% y la sonda. Se realizaron lavados rigurosos en 0,1X SSC/SDS al 0,1% a 50ºC.

Análisis RT-PCR. Diez \mug de RNA total extraído de cinco líneas celulares de cáncer de mama humano (ZR-75-1, T-47D, MDA-MB-231, MDA-MB468 y BT-20) y tres líneas celulares de cáncer de próstata humano (LNCaP, DU145 y PC-3) (los RNA fueron proporcionados por el Dr. Claude Labrie CHUL Research Center) fueron transcritos inversamente usando el cebador mH2O-1 D05#RA

[5'-TTTGGATCATTTTCACACTGTC]

(SEQ ID NO:15)

y la transcriptasa inversa Superscript II (Gibco BRL). Después, se amplificaron los cDNA de cadena simple usando los cebadores CG026#FB:

[5'-GTGCTCATAGTCAGAAATGAAG]

(SEQ ID NO:16)

y mH2O-1 D05#RA (éste es el par cebador que se usó para saltar desde la unión de los exones 718 al exón 11; el producto de la PCR tiene aproximadamente 1,55 kb). Los productos de la PCR se fraccionaron sobre un gel de agarosa al 1,2%.

Amplificación por PCR y cribado de las mutaciones. Los 26 exones codificadores de BRCA2 y sus sitios de corte y empalme asociados se amplificaron desde el DNA genómico como se ha descrito (Kamb et al., 1994b). Las secuencias de DNA de los cebadores, alguna de las cuales cae en la secuencia del intrón flanqueador, usadas para la amplificación y secuenciación, aparecen en la Tabla 2. Alguno de los exones (de 2 a 10, 11-5, 11-6, 11-7 y 23 a 27) se amplificaron por un simple método de una etapa. Las condiciones de la PCR para estos exones fueron: etapa única de desnaturalización a 95ºC (1 min); 40 ciclos a 96ºC (6 segundos), Temperatura de alineamiento (T_{ann}) = 55ºC (15 segundos), 72ºC (1 min). Otros exones (11-22) requirieron reamplificación anidada después de la reacción primaria de la PCR. En estos casos, se realizó la amplificación inicial con los cebadores de las dos primeras columnas de la Tabla 2 durante 19 ciclos como se ha descrito antes. La reamplificación anidada para estos exones se realizó durante 28 o 32 ciclos en las mismas condiciones con los cebadores que aparecen en la tercera columna de la Tabla 2. Las condiciones tampón fueron como se ha descrito (Kamb et al., 1994b). Se purificaron los productos en geles de agarosa al 0,8% usando perlas Qiaex (Qiagen).

Los productos purificados se analizaron por secuenciación en ciclos con \alpha-P^{32}dATP con el kit de secuenciación Ampli-Cycle^{TM} (Perkin Elmer, Branchburg, NJ). Los productos de la reacción se fraccionaron sobre geles de poliacrilamida al 6%. Todas las reacciones (A) se cargaron de forma adyacente una de otra, seguido por las reacciones (C), etc. La detección de los polimorfismos se llevó a cabo visualmente y se confirmó en la otra cadena.

3

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Ejemplo 4 Identificación de BRCA2

Ensamblaje de la secuencia de BRCA2 de longitud completa. La secuencia de BRCA2 de longitud completa se ensambló por la combinación de varias secuencias más pequeñas obtenidas de la selección de híbridos, atrapamiento de exones, cribado de la genoteca de cDNA, secuenciación genómica, y experimentos de PCR usando cDNA como molde para la amplificación (esto es, "de isla en isla") (Figura 2). El extremo 5' final del mRNA que incluye el sitio previsto de comienzo de la traducción se identificó por un protocolo modificado de 5' RACE (Stone et al., 1995). El primer nucleótido de la secuencia (nucleótido 1) es una G que no pertenece al molde, una indicación de que el remate del mRNA está contenido en la secuencia. Uno de los exones (exón 11) localizado en el interior de cDNA de BRCA2 tiene cerca de 5 kb. Una porción del exón 11 fue identificada por el análisis de aproximadamente 900 kb de la secuencia genómica de dominio público (ftp://genome.wust1.edu/pub/gsl/brca). Esta secuencia genómica se condensó con la secuencia genómica determinada por esta invención en un conjunto de regiones contig de 160 secuencias. Cuando la secuencia genómica condensada se escaneó en cuanto a los marcos de lectura abierta (ORF), se identificó una extensión contigua de casi 5 kb que se había extendido por medio de largos ORF. Por medio de experimentos de saltos de isla en isla, esta secuencia se ligó con dos fragmentos génicos candidatos previamente identificados. La secuencia actual de cDNA de BRCA2 compuesta, consta de 11.385 bp, pero no incluye la señal de poliadenilación o cola poly(A). Esta secuencia de cDNA se indica en la SEQ ID NO:1 y en la Figura 3.

Estructura del gen BRCA2 y del polipéptido BRCA2. La traducción conceptual del cDNA reveló un ORF que empezaba en el nucleótido 229 y codificaba una proteína prevista de 3418 aminoácidos. El péptido no tiene similitud discernible con otras proteínas aparte de la composición de las secuencias. No hay una secuencia señal en el amino terminal y no hay regiones evidentes de extensión de la membrana. Como la BRCA1, la proteína BRCA2 tiene mucha carga. Aproximadamente un cuarto de los residuos son ácidos o básicos.

La estructura del gen BRCA2 se determinó por comparación de las secuencias de cDNA y las genómicas. El BRCA2 está compuesto de 27 exones distribuidos sobre aproximadamente 70 kb de DNA genómico. Una región rica en CpG en el extremo 5' de BRCA2 que se extiende hacia arriba sugiere la presencia de señales reguladoras asociadas a menudo con las "islas" CpG. Basándose en los experimentos de transferencia Southern, parece que el BRCA2 es único, sin homólogos próximos en el genoma humano.

Estudios de expresión del BRCA2. La hibridación de cDNA marcado a los filtros Northem de tejido múltiple humano reveló un transcrito de 11-12 kb que fue detectable solamente en los testículos. El tamaño de este transcrito da a entender que se ha perdido poco de la secuencia de mRNA de BRCA2 a partir del cDNA compuesto de esta invención. Debido a que los filtros Northern no incluyeron RNA de glándulas mamarias, se realizaron los experimentos de RT-PCR usando un amplicón del cDNA de BRCA2 sobre los RNA de líneas celulares de cinco cánceres de mama y de tres cánceres de próstata. Todas las líneas produjeron señales positivas. Además, se usaron la PCR de un amplicón de BRCA2 (1-BrCG026 5 kb) y la 5' RACE para comparar los cDNA de las glándulas mamarias y del timo como moldes para la amplificación. En ambos casos, el producto se amplificó más eficientemente de la mama que del
timo.

Mutaciones en la línea germinal de BRCA2. Los individuos de dieciocho familias con BRCA2 putativo se cribaron en cuanto a las mutaciones en la línea germinal de BRCA2 por análisis de la secuencia de DNA (Wooster et al., 1994). Doce familias tienen al menos un caso de cáncer de mama masculino, cuatro tienen dos o más casos; y cuatro incluyen al menos un individuo afectado con cáncer de ovario el cual comparte el haplotipo BRCA2 genético. Cada una de las dieciocho familias tiene una probabilidad posterior de tener una mutación de BRCA2 de al menos 69% y nueve familias tienen probabilidades posteriores mayores que 90%. Basándose en estas probabilidades combinadas, se espera que 16 de las 18 familias segreguen mutaciones de BRCA2. Las secuencias codificadoras completas y las uniones de corte y empalme asociadas se cribaron en cuanto a mutaciones en múltiples individuos de las nueve familias usando o bien cDNA o bien DNA genómico (Tabla 3). Los individuos de las nueve familias restantes se cribaron en cuanto a mutaciones usando solamente DNA genómico. Estos últimos experimentos de cribado abarcaron 99% de la secuencia codificadora (todos los exones excluyendo el exón 15) y todas menos dos de las uniones de corte y
empalme.

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Las alteraciones de las secuencias se identificaron en 9 de las 18 familias. Todas excepto una incluían deleciones de nucleótidos que alteraron el marco de lectura, llevando a la truncación de la proteína BRCA2 prevista. La única excepción contenía una deleción de tres nucleótidos (familia 1019). Las nueve mutaciones eran todas diferentes una de otra.

Un subconjunto de familias se analizó en cuanto a pérdida de transcrito. Las muestras de cDNA estuvieron disponibles para un grupo de nueve familias, pero tres de las nueve familias del grupo contenían mutaciones de desplazamiento del marco de lectura. Los sitios polimórficos específicos que se sabía que eran heterozigóticos en el DNA genómico se examinaron en el cDNA de los individuos de las familias. La aparición de hemizigosidad en estos sitios polimórficos se interpretó como signo de una mutación que lleva a la reducción de los niveles de mRNA. Solamente en uno de los seis casos sin alteración de la secuencia detectable (familia 2367) se pudo inferir una mutación reguladora semejante. Además, una de las tres familias con una mutación de desplazamiento del marco de lectura (familia 2044) presentó signos de pérdida de transcrito. Esto implica que algunas mutaciones de la secuencia que codifica BRCA2 pueden desestabilizar el transcrito además de interrumpir la secuencia proteínica. Tales mutaciones han sido observadas en BRCA1 (Friedman et al., 1995). Por tanto, 56% de las familias (10 de 18) contenían un gen BRCA2 alterado.

Papel del BRCA2 en el cáncer. La mayor parte de los genes supresores de tumores identificados hasta la fecha dan lugar a productos proteínicos que están ausentes, no son funcionales o tienen una función reducida. La mayoría de las mutaciones de TP53 tienen sentido alterado; se ha demostrado que algunas de ellas producen moléculas anormales de p53 que interfieren con la función del producto natural (Shaulian et al., 1992; Srivastava et al., 1993). Se ha indicado un mecanismo de acción similar negativo dominante para algunos alelos de la poliposis adenomatosa de cólon (APC) que producen moléculas truncadas (Su et al., 1993) y para mutaciones puntuales en el gen del tumor de Wilm (WT1) que alteran la unión del DNA de la proteína (LittLe et al., 1993). La naturaleza de las mutaciones observadas en la secuencia que codifica BRCA2 es coherente con la producción ya sea de proteínas negativas dominantes o ya sea de proteínas no funcionales.

Ejemplo 5 Análisis del gen BRCA2

La estructura y función del gen BRCA2 se determinan de acuerdo con los siguientes métodos.

Estudios biológicos. Los vectores de expresión en mamíferos que contienen cDNA de BRCA2 se construyen y transfectan en células apropiadas de carcinoma de mama con lesiones en el gen. Se utilizan cDNA de BRCA2 natural así como cDNA de BRCA2 alterado. El cDNA de BRCA2 alterado se puede obtener a partir de alelos de BRCA2 alterados o se produce como se describe más adelante. Se examina la inversión fenotípica en los cultivos (por ejemplo, morfología celular, tiempo de duplicación, crecimiento independiente del anclaje) y en los animales (por ejemplo, capacidad tumorígena). Los estudios emplearán tanto las formas naturales del gen como las mutantes (Sección B).

Estudios genéticos moleculares. Se realiza la mutagénesis in vitro para construir mutantes por deleciones y mutantes con sentido alterado (por sustituciones de un único par de bases en codones individuales y grupos cargados mutagénesis de escaneado de alanina). Los mutantes se usan en estudios biológicos, bioquímicos y biofísicos.

Estudios del mecanismo. Se examina la capacidad de la proteína BRCA2 para unirse a secuencias de DNA conocidas y desconocidas. Se analiza su capacidad para transactivar a los promotores por sistemas de expresión de indicadores transitorios en células de mamíferos. Los procedimientos convencionales tales como captura de partículas y sistema de dos híbridos en levaduras se usan para descubrir e identificar todos los copartícipes funcionales. Se caracterizan la naturaleza y funciones de los copartícipes. Estos copartícipes a su vez son objetivos para el descubrimiento de fármacos.

Estudios estructurales. Las proteínas recombinantes se producen en E. coli, levaduras, insectos y/o células de mamífero y se usan en estudios cristalográficos y de NMR. Se emplea también el modelado molecular de las proteínas. Estos estudios facilitan el diseño de fármacos basado en su estructura.

Ejemplo 6 Ensayo en dos etapas para detectar la presencia de BRCA2 en una muestra

Una muestra de un paciente se procesa de acuerdo con el método descrito por Antonarakis et al. (1985), se separa a través de un gel de agarosa al 1% y se transfiere a una membrana de nilón para análisis de transferencia Southern. Las membranas se reticulan a la luz UV a 150 mJ usando un GS Gene Linker (Bio-Rad). Se subclona en pTZ18U una sonda de BRCA2 seleccionada de la secuencia mostrada en la Figura 3. Los fagémidos se transforman en E. coli MV1190 infectada con el falto ayudador M13KO7 (Bio-Rad, Richmond, CA). Se aísla el DNA de cadena simple según los procedimientos estándar (véase Sambrook et al., 1989).

Las transferencias se prehibridan durante 15-30 minutos a 65ºC en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7% en NaPO_{4} 0,5 M. Los métodos son los descritos por Nguyen et al., 1992. Las trasferencias se hibridan durante la noche a 65ºC en SDS al 7%, NaPO_{4} 0,5 M con un DNA sonda de cadena simple a 25-50 ng/ml. Los lavados post-hibridación consisten en dos lavados de 30 minutos en SDS al 5%, NaPO_{4} 40 mM a 65ºC, seguidos por dos lavados de 30 minutos en SDS al 1%, NaPO_{4} 40 mM a 65ºC.

Seguidamente, se lavan las transferencias con solución salina tamponada de fosfato (pH 6,8) durante 5 min a temperatura ambiente y se incuban con caseína al 0,2% en PBS durante 30-60 min a temperatura ambiente y se aclaran con PBS durante 5 min. Después se preincuban las transferencias durante 5-10 minutos en un baño de agua con agitación a 45ºC con tampón de hibridación que consta de urea 6 M, NaCl 0,3 M, y 5X de solución de Denhardt (véase Sambrook et al., 1989). Se separa el tampón y se reemplaza con tampón de hibridación reciente a 50-75 \mul/cm^{2} más el conjugado de oligonucleótido-fosfatasa alcalina reticulado covalentemente a concentración 2,5 nM con la secuencia nucleotídica complementaria al sitio del cebador universal (UP-AP, Bio-Rad). Las transferencias se hibridan durante 20-30 minutos a 45ºC y los lavados post-hibridación se incuban a 45ºC como dos lavados de 10 min en urea 6 M, Ix citrato salino estándar (SSC), SDS al 0,1% y un lavado de 10 minutos en 1x SSC, Tritón®X-100 al 0,1%. Se aclaran las transferencias durante 10 minutos a temperatura ambiente con 1x SSC.

Se incuban las transferencias durante 10 minutos a temperatura ambiente con agitación en el tampón sustrato que consta de dietanolamina 0,1 M, MgCl_{2} 1 mM, azida de sodio al 0,02%, pH 10,0. Las transferencias individuales se ponen en bolsas sellables al calor con tampón sustrato y AMPPD (3-(2'-espiroadamantano)-4metoxi-4(3'-fosforiloxi)fenil-1,2-dioxietano, sal disódica, Bio-Rad) 0,2 mM. Después de 20 minutos de incubación a temperatura ambiente con agitación, se separa el exceso de AMPPD. Se expone la transferencia a una película de rayos X durante la noche. Las bandas positivas indican la presencia de BRCA2.

Ejemplo 7 Generación de anticuerpos policlonales frente a BRCA2

Los segmentos de la secuencia que codifica BRCA2 se expresan como proteína de fusión en E, coli. La proteína sobreexpresada se purifica por elución en gel y se usa para inmunizar conejos y ratones usando un procedimiento similar al descrito por Harlow y Lane, 1988. Se ha demostrado que este procedimiento genera Abs frente a otras proteínas diferentes (por ejemplo, véase Kraemer et al., 1993).

Brevemente, una extensión de la secuencia que codifica BRCA2 seleccionada de la secuencia que se muestra en la Figura 3, se clona como una proteína de fusión en el plásmido PET5A (Novagen, Inc., Madison. WI). Después de inducción con IPTG, se verifica por SDS/PAGE la sobreexpresión de una proteína de fusión con el peso molecular esperado. Se purifica la proteína de fusión desde el gel por electroelución. La identificación de la proteína como el producto de fusión de BRCA2 se verifica por la secuenciación de la proteína en el N terminal. Seguidamente, la proteína purificada se usa como inmunógeno en conejos. Se inmunizan los conejos con 100 \mug de la proteína en adyuvante completo de Freund y se les administra dosis de refuerzo dos veces en intervalos de 3 semanas, primero con 100 \mug de inmunógeno en adyuvante completo de Freund seguido por 100 \mug de inmunógeno en PBS. El suero que contiene anticuerpos se recoge dos semanas más tarde.

Este procedimiento se repite para generar anticuerpos frente a las formas mutantes del gen BRCA2. Estos anticuerpos, en unión con los anticuerpos frente al BRCA2 natural, se usan para detectar la presencia y el nivel relativo de las formas mutantes en diferentes tejidos y fluidos biológicos.

Ejemplo 8 Generación de anticuerpos monoclonales específicos para BRCA2

Los anticuerpos monoclonales se generan de acuerdo con el siguiente protocolo. Se inmunizan ratones con inmunógeno que comprende BRCA2 intacto o péptidos BRCA2 (naturales o mutantes) conjugados con la hemocianina de lapa californiana usando glutaraldehído o EDC como es bien conocido.

El inmunógeno se mezcla con un adyuvante. Cada ratón recibe cuatro inyecciones de 10 a 100 \mug de inmunógeno y después de la cuarta inyección se toman muestras de sangre de los ratones para determinar si el suero contiene anticuerpos frente al inmunógeno. El título del suero se determina por ELISA o RIA. Para la producción de hibridoma se seleccionan los ratones con suero que indica la presencia de anticuerpos frente al inmunógeno.

Se separan los bazos de los ratones inmunes y se prepara una única suspensión de células (véase Harlow and Lane, 1988). Las fusiones celulares se realizan esencialmente como están descritas por Kohler and Milstein, 1975. Brevemente, las células de mieloma P3,65.3 (American Type Culture Collection, Rockville, MD) se funden con células de bazo inmunes usando polietilenglicol como está descrito por Harlow and Lane, 1988. Las células se ponen en placas a una densidad de 2 x 10^{5} células/pocillo en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos. Se examinan los pocillos individuales en cuanto al crecimiento y los sobrenadantes de los pocillos con crecimiento se analizan en cuanto a la presencia de anticuerpos específicos frente a BRCA2 por ELISA o RIA usando la proteína objetivo BRCA2 mutante. Las células de los pocillos positivos se extienden y se subclonan para establecer y confirmar la monoclonalidad.

Los clones con las especificidades deseadas se extienden y cultivan como ascitos en los ratones o en un sistema de fibras huecas para producir suficientes cantidades de anticuerpos para caracterización y desarrollo del ensayo.

Ejemplo 9 Ensayo en sandwich de BRCA2

El anticuerpo monoclonal se une a una superficie sólida tal como una placa, tubo, perla o partícula. Preferiblemente, el anticuerpo se une a la superficie del pocillo de una placa de ELISA de 96 pocillos. Se añaden al anticuerpo en fase sólida 100 \mul de muestra (por ejemplo, suero, orina, citosol de tejidos) que contiene el péptido/proteína BRCA2 (natural o mutante). Se incuba la muestra durante 2 horas a temperatura ambiente. Después se decanta el fluido de la muestra, y la fase sólida se lava con tampón para separar el material no ligado. Se añaden a la fase sólida 100 \mul de un segundo anticuerpo monoclonal (para un determinante diferente sobre el péptido/proteína BRCA2). Este anticuerpo se marca con una molécula detectora (por ejemplo, ^{125}I, enzima, fluoróforo, o un cromóforo) y la fase sólida con el segundo anticuerpo se incuba durante dos horas a temperatura ambiente. El segundo anticuerpo se decanta y la fase sólida se lava con tampón para separar el material no ligado.

Se cuantifica la cantidad de marcador ligado, que es proporcional a la cantidad de péptido/proteína BRCA2 presente en la muestra. Se realizan ensayos separados usando anticuerpos monoclonales que son específicos para el BRCA2 natural así como anticuerpos monoclonales específicos para cada una de las mutaciones identificadas en BRCA2.

Ejemplo 10 La mutación 6174 delT es común en las mujeres judías Ashkenazi afectadas por cáncer de mama

Se ha encontrado que la mutación 6174delT (véase Tabla 3) está presente en muchos casos de mujeres judías ashkenazi que han tenido cáncer de mama (Neuhausen et al., 1996). Dos grupos de probandos estuvieron comprendidos en la investigación para este estudio. El primer grupo se investigó basándose tanto en la edad de inicio del cáncer como en una historia positiva de la familia. El primer grupo consistió en probandos afectados con cáncer de mama a los 41 años o antes de esa edad con o sin historia familiar de cáncer de mama. Los criterios de inclusión para el segundo grupo fueron que el probando hubiera sido afectado con cáncer de mama entre las edades de 41 y 51 años con uno o más parientes de primer grado afectados con cáncer de mama o de ovario a los 50 años o antes de esa edad; o que el probando hubiera sido afectado entre las edades de 41 y 51 años con dos o más parientes de segundo grado afectados con cáncer de mama o de ovario, 1 a los 50 años o antes de esa edad; o que el probando hubiera sido afectado entre las edades de 41 y 51 años tanto con cáncer de mama primario como con cáncer de ovario primario. Los probandos fueron investigados por medio de la oncología médica y clínicas de asesoramiento en genética, con esfuerzo para ofrecer la participación en el estudio a todos los pacientes elegibles. La historia familiar se obtuvo por medio de un cuestionario autoinformativo. La confirmación histológica del diagnóstico se obtuvo para los probandos en todos los casos. Se confirmaron los antecedentes religiosos en todos los probandos por medio del autoinforme o por
entrevistas.

Detección de mutaciones

La mutación 6174delT de BRCA2 se detectó amplificando el DNA genómico de cada paciente según los procedimientos estándar de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1985; Mullis et al., 1986; Weber and May, 1989). Los cebadores usados para la PCR son:

BC11-RP: GGGAAGCTTCATAAGTCAGTC

(SEQ ID NO:115) (cebador directo)

y

BC11-LP: TTTGTAATGAAGCATCTGATACC

(SEQ ID NO:116) (cebador inverso).

Las reacciones se realizaron en un volumen total de 10,0 \mul que contiene 20 ng de DNA con alineamiento a 55ºC. Esto produce un producto de la PCR de 97 bp de longitud en muestras naturales y de 96 bp de longitud cuando está presente la mutación 6174delT. Los productos de la PCR radiomarcados se sometieron a electroforesis sobre geles estándar de secuenciación desnaturalizante de poliacrilamida al 6% a 65 W durante 2 horas. Se secaron después los geles y se autorradiografiaron. Todos los casos que presentan la deleción de 1 bp se secuenciaron para confirmar la mutación 6174delT. Para la secuenciación, la mitad de las muestras se amplificaron con un conjunto de cebadores de POR y se secuenció la cadena codificadora y la otra mitad de las muestras se amplificaron con un segundo conjunto de cebadores de POR y se secuenció la cadena no codificadora. Para un conjunto, los cebadores de PCR fueron:

TD-SFB: AATGATGAATGTAGCACGC

(SEQ ID NO: 117) (cebador directo)

y

CGO RF-RH: GTCTGAATGTTCGTTACT

(SEQ ID NO: 118) (cebador inverso).

Esto dio como resultado un producto amplificado de 342 bp en las muestras naturales y de 341 bp para las muestras que contienen la mutación 6174delT. Para este conjunto de muestras el DNA amplificado se secuenció usando el cebador CGORF-RH como cebador de secuenciación. La otra mitad de las muestras se amplificaron usando el cebador directo BC11-RIP y el cebador inverso CGORF-RH dando como resultado un fragmento de 183 bp en las muestras naturales y de 182 bp en las muestras que contienen la mutación 6174delT. Éste se secuenció usando el cebador BC11-RP como el cebador de secuenciación.

Resultados

Seis de ochenta mujeres de ascendencia judía ashkenazi con cáncer de mama antes de la edad de 42 años tenían la mutación 6174delT. Esto se compara con los cero casos de presencia de la mutación en un grupo testigo de mujeres no judías que habían tenido cáncer de mama antes de la edad de 42 años. Estos casos se investigaron sin tener en cuenta la historia familiar. La Tabla 4 muestra los resultados del estudio. Cuatro de los seis casos con la mutación 6174delT tenían una historia familiar de cáncer de mama o de ovario en un pariente de primero o segundo grado. En cada una de dos familias en las que habla disponibles múltiples muestras para análisis, la mutación 6174delT estaba co-segregada con dos o más casos de cáncer de mama o de ovario. Un segundo conjunto de 27 miembros ashkenazi con cáncer de mama a la edad de 42-50 años y una historia de al menos un pariente adicional afectado con cáncer de mama o de ovario proporcionó un estimado adicional de la frecuencia de la mutación 6174delT. En este grupo de 27 mujeres, dos eran heterozigóticas para la mutación 6174delT de BRCA2. Uno de estos individuos tenía parientes de primer grado con ambos cánceres, de ovario y de mama. De los datos presentados, y asumiendo una penetrancia similar para las mutaciones de BRCA1 (Offit et al., 1996; Langston et al., 1996), la frecuencia de la mutación 6174delT en los ashkenazi se puede estimar como de aproximadamente 3 por mil. Sin embargo, si la penetrancia de esta mutación es menor que la de BRCA1, entonces la frecuencia de esta mutación será más alta. Un estimado más preciso de la frecuencia de portadores de la mutación 6174delT en individuos con ascendencia judía ashkenazi surgirá de los estudios de población a gran escala.

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TABLA 4

Grupo		Número de sujetos	Número con	%
		ensayados, n =	6174delT, n =
	Grupo 1a
Diagnóstico antes de los 42 años, no judíos^{a}	93	0	(0)
	Grupo 1b
Diagnóstico antes de los 42 años, judíos^{a}	80	6	(8)
\hskip0.5cm Antes de 37 años	40	4	(10)
\hskip0.5cm de 37-41 años	40	2	(5)
	Grupo 2
Diagnóstico a los 42-50 años e historia	27	2	(27)
familiar positiva^{b}
Claves:
^{a}-Confirmado sin tener en cuenta la historia familiar
^{b}- \begin{minipage}[t]{155mm} La historia familiar de este grupo se definió como un pariente de primer grado o dos de segundo grado diagnosticados de cáncer de mama o de ovario, uno antes de los 50 años.\end{minipage}

Ejemplo 11 El BRCA2 muestra una baja tasa de mutación somática en el carcinoma de mama y otros cánceres incluyendo los cánceres de ovario y de páncreas

El BRCA2 es un gen supresor de tumores. Una deleción homozigótica de este gen puede llevar a cáncer de mama así como a otros cánceres. Una deleción homozigótica en un xenotrasplante pancreático fue decisiva en el esfuerzo para aislar el BRCA2 por donación posicional. El cáncer puede desarrollarse también si hay una pérdida de un alelo de BRCA2 y una mutación en el alelo restante (pérdida de heterozigosidad o LOH). Las mutaciones en ambos alelos pueden llevar también al desarrollo del cáncer. En los estudios aquí, un análisis de 150 líneas celulares derivadas de diferentes cánceres no reveló ningún caso en el que hubiera una pérdida homozigótica del gen BRCA2. Puesto que la pérdida homozigótica es aparentemente rara, se hicieron investigaciones para estudiar lesiones más pequeñas tales como mutaciones puntuales en el BRCA2. Puesto que los heterozigotos mutantes y los homozigotos mutantes compuestos son raros, la inactivación del gen supresor de tumores casi siempre implica la LOH. El alelo remanente, aunque inactivo, contiene típicamente mutaciones perturbadoras. Para identificar éstas, es útil preseleccionar tumores o líneas celulares que presenten LOH en el locus de interés.

Identificación de tumores y líneas celulares que presentan LOH

Se analizaron un grupo de 104 muestras de tumor de mama primario y un conjunto de 269 líneas celulares para buscar LOH en la región BRCA2. En los tumores primarios, se compararon cuantitativamente usando fluorescencia, las amplificaciones de tres marcadores de repeticiones cortas en tándem (STR). Aproximadamente 10 ng de DNA genómico se amplificaron por PCR con los siguientes tres conjuntos de STR marcados fluorescentemente:

(1)	mM4247.4A.2F1	ACCATCAAACACATCATCC	(SEQ ID NO:119)
	mM4247.4A.2R2	AGAAAGTAACTTGGAGGGAG	(SEQ ID NO:120)
(2)	STR257-FC	CTCCTGAAACTGTTCCCTTGG	(SEQ ID NO:121)
	STR257-RD	TAATGGTGCTGGGATATTTGG	(SEQ ID NO:122)
(3)	mM B561A-3.1FA2	GAATGTCGAAGAGCTTGTC	(SEQ ID NO:123)
	mMB561A-3.1RB	AAACATACGCTTAGCCAGAC	(SEQ ID NO:124)

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Los productos de la PCR se resolvieron usando un secuenciador ABI 377 y se cuantificaron con software Genescan (ABI). En los tumores, las diferencias claras de altura del pico entre los alelos amplificados de las muestras normales y los de las muestras tumorales recibieron puntuaciones como poseedoras de LOH. En las líneas celulares, si un STR era heterozigótico, se puntuó la muestra como sin LOH. Solamente en un caso hubo una línea celular o tumor mal nombrado basándose en el posterior análisis de polimorfismos de una única base. Los índices de heterozigosidad para los marcadores son: STR4247 = 0,89; STR257 = 0,72; STR561A = 0,88 (S. Neuhausen, comunicación personal; B. Swedlund, datos sin publicar). Basándose en sus índices de heterozigosidad combinados, la posibilidad de que los marcadores sean todos homozigóticos en un particular individuo (asumiendo el equilibrio genético) es solamente uno en 250. Debido a la presencia de células normales en la muestra de un tumor primario, la LOH raras veces elimina completamente la señal del alelo perdido en el tumor. Más bien, están alteradas las intensidades relativas de los dos alelos. Esto se puede ver claramente comparando las alturas de los picos alélicos del tejido normal con las alturas de los picos del tumor (figuras 5A-5D). Basándose en este análisis, se clasificaron 30 tumores (29%) como poseedores de LOH en el locus BRCA2 (Tabla 5), una cifra que es similar a los estimados previos (Collins et al., 1995; Cleton-Jansen et al., 1995).

La LOH se evaluó en el conjunto de líneas celulares de una forma diferente. Puesto que la homozigosidad de los tres STR era improbable, y puesto que no hay presentes células normales, la homozigosidad evidente en todos los STR se interpretó como LOH de la región BRCA2 Usando este criterio, 85/269 de las líneas celulares presentaron LOH (véase la Tabla 5). Las frecuencias variaron según el tipo particular de células tumorales en consideración. Por ejemplo, 4/6 líneas celulares de ovario y 31/62 líneas de cáncer de pulmón presentaron LOH en comparación con 17/81 líneas de melanoma y 2/11 líneas de cáncer de mama.

Análisis de secuencias de tumores de mama primarios v líneas celulares con LOH

Los 30 cánceres de mama primarios identificados antes que presentaron LOH en la región BRCA2 se cribaron por análisis de secuencias del DNA para buscar variantes de la secuencia. Se examinó más del 95% de la secuencia codificadora y de las uniones de empalme. La secuenciación del DNA se realizó o bien en el ABI 377 (Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer) o manualmente. Para el cribado de la mutación radiactiva, se purificaron los productos amplificados por medio de perlas Qiagen (Qiagen, Inc.). La secuencia de DNA se generó usando el kit de secuenciación Cyclist (Stratagene) y se resolvió sobre geles de poliacrilamida al 6%. En paralelo, se realizó la secuenciación no radiactiva usando colorantes marcadores fluorescentes usando el kit de secuenciación TaqFS seguido por electroforesis en secuenciadores ABI 377. Las muestras se extendieron en cuadrículas en bandejas de 96 pocillos para facilitar la PCR y la secuenciación. Los fallos particulares de la PCR y de las reacciones de secuenciación se repitieron hasta que se obtuvo una cobertura de >95% para cada muestra. La información de la secuencia se analizó con el software Sequencher (Gene Codes Corporation). Todas las mutaciones detectadas fueron confirmadas secuenciando un producto de la PCR amplificado nuevamente para excluir la posibilidad de que la alteración de la secuencia fuera debida a un artefacto de la PCR.

\newpage

TABLA 5

Tipo	n^{o} LOH/n^{o} cribado	Porcentaje LOH	n^{o} secuenciaciones
Astrocitoma	6/19	32%	6
Vejiga	6/17	35%	4
Mama	2/11	18%	2
Colon	2/8	25%	2
Glioma	11/36	31%	5
Pulmón	31/62	50%	20
Linfoma	0/4	0%	0
Melanoma	17/81	21%	9
Neuroblastoma	1/10	10%	1
Ovario	4/6	67%	4
Pancreático	1/3	33%	1
Próstata	0/2	0%	0
\hskip1cm \underbar{Renal}	\underbar{\hskip0,17cm 4/10 \hskip0,17cm}	\underbar{40%}	\underbar{ 4 }
Total	85/269	33%	58
		(media = 28%)
Cáncer de mama	30/104	29%	42
Primario

Análisis de LOH de líneas celulares y tumores de mama primarios. El porcentaje de LOH se calculó de dos modos: como el total y como una media de porcentajes.

De las 30 muestras, dos muestras contenían mutaciones de desplazamiento del marco de lectura, una, una mutación sin sentido, y dos contenían cambios de sentido alterado (aunque uno de estos tumores contenía también un desplazamiento del marco de lectura). La mutación sin sentido delecionará 156 codones en el C terminal lo que da a entender que el extremo del C terminal de BRCA2 es importante para la actividad supresora del tumor. Todas las variantes de la secuencia estuvieron presentes también en el correspondiente DNA normal de estos pacientes de cáncer. Para excluir la improbable posibilidad de que la preselección para detectar LOH introdujera un error sistemático frente a la detección de mutaciones (por ejemplo, comportamiento dominante de las mutaciones, heterozigotos compuestos), se cribaron también 12 muestras que habían demostrado ser heterozigóticas en BRCA2. Tres de éstas revelaron cambios con sentido alterado que también fueron encontrados en las muestras normales. Por tanto, en un conjunto de 42 muestras de carcinoma de mama, 30 de las cuales presentaron LOH en el locus BRCA2, no se identificó ninguna mutación somática. El desplazamiento del marco de lectura y los cambios de sentido alterado es probable que sean mutaciones de predisposición que influyen en el desarrollo de cáncer de mama en estos pacientes. Las variantes con sentido alterado son raras; se observaron cada una de ellas solamente una vez durante el análisis de 115 cromosomas. De estos datos no es posible distinguir entre polimorfismos neutros raros y mutaciones de predisposición.

De las 85 líneas celulares que presentaron LOH (véase la Tabla 5), 58 fueron cribadas también en cuanto a cambios en la secuencia. Se cribó más del 95% de la secuencia codificadora de cada muestra. Por este análisis de la secuencia del DNA se identificó solamente una única mutación de desplazamiento del marco de lectura. Esta mutación (6174deIT) estaba presente en una línea de cáncer pancreático y es idéntica a la encontrada en la muestra de tumor primario BT111 y a un desplazamiento del marco de lectura de la línea germinal detectado previamente (Tavtigian et al., 1996). Esto sugiere que este particular desplazamiento del marco de lectura puede ser una mutación de BRCA2 en la línea germinal relativamente común. Además, se detectó una serie de variantes de la secuencia de sentido alterado (tablas 6A y 6B).

La detección de una probable mutación de BRCA2 en la línea germinal en una línea celular de un tumor pancreático sugiere que las mutaciones de BRCA2 pueden predisponer al cáncer pancreático, una posibilidad que no ha sido explorada con profundidad. Esta mutación también añade peso a la participación de BRCA2 en el cáncer pancreático esporádico, implicado previamente por la deleción homozigótica observada en un xenotrasplante pancreático (Schtte et al., 1995). Debido a que sólo se examinaron tres líneas celulares pancreáticas en este estudio, se necesita una investigación adicional de las mutaciones de BRCA2 en cánceres pancreáticos.

TABLA 6A

Muestra	Tipo	LOH	Cambio	Efecto	Línea germinal
4H5	Renal	Sí	G451C	Ala \rightarrow Pro
4G1	Ovario	Sí	A1093C	Asn \rightarrow His
2F8	Pulmón	Sí	G1291C	Val \rightarrow Leu
BT110	Mama primario	Sí	1493delA	Desplazamiento marco	Sí
4F8	Ovario	Sí	C2117T	Thr \rightarrow Ile
BT163	Mama primario	No	A2411C	Asp \rightarrow Ala	Sí
1D6	Vejiga	No	G4813A	Gly \rightarrow Arg
BT333	Mama primario	No	T5868G	Asn \rightarrow Lys	Sí
2A2	Glioma	Sí	C5972T	Thr \rightarrow Met
2I4	Pulmón	Sí	C5972T	Thr \rightarrow Met
BT111	Mama primario	Sí	6174delT	Desplazamiento marco	Sí
4G3	Pancreático	Sí	6174delT	Desplazamiento marco
1B7	Astrocitoma	Sí	C6328T	Arg \rightarrow Cys
BT118	Mama primario	No	G7049T	Gly \rightarrow Val	Sí
BT115	Mama primario	Sí	G7491C	Gln \rightarrow His	Sí
3D5	Melanoma	Sí	A9537G	Ile \rightarrow Met
BT85	Mama primario	Sí	A10204T	Lys \rightarrow Stop	Sí
1E4	Mama	Sí	C10298G	Thr \rightarrow Arg
BT110	Mama primario	Sí	A10462G	Ile \rightarrow Val	Sí

Mutaciones de la línea germinal identificadas en BRCA2. Se indican las posiciones de la mutación basándose en la entrada de BRCA2 en Genbank (Schtte et al., 1995).

TABLA 6B

Posición	Cambio	Efecto	Frecuencia
5'UTR(203)	G/A	-	0,32 (0,26)
PM(1342)	C/A	His \rightarrow Asn	0,32 (0,37)
PM(2457)	T/C	silencioso	0,04 (0,05)
PM(3199)	A/G	Asn \rightarrow Asp	0,04 (0,08)
PM(3624)	A/G	silencioso	0,35
PM(3668)	A/G	Asn \rightarrow Ser	0(0,15)
PM(4035)	T/C	silencioso	0,24 (0,10)
PM(7470)	A/G	silencioso	0,26 (0,15)
1593	A \rightarrow G	silencioso	<0,01
4296	G \rightarrow A	silencioso	<0,01
5691	A \rightarrow G	silencioso	<0,01
6051	A \rightarrow G	silencioso	<0,01
6828	T \rightarrow C	silencioso	<0,01
6921	T \rightarrow C	silencioso	<0,01

Polimorfismos comunes y sustituciones silenciosas detectados en BRCA2 por secuenciación del DNA. Puesto que algunas variantes silenciosas raras pueden afectar a la función del gen (por ejemplo, corte y empalme (Richard and Beckmann, 1995)), éstas no van precedidas por "PM". Las frecuencias de polimorfismos mostradas implican al segundo de los pares nucleotídicos. Las frecuencias descritas en un estudio previo se muestran entre paréntesis (Tavtigian et al., 1996). La numeración es como en la Tabla 6A.

Como se ha descrito previamente en lo que antecede, la presente divulgación proporciona materiales y métodos para uso en el análisis de los alelos de BRCA2 de un individuo. Los individuos reconocidos como con riesgo más alto del normal de cáncer de mama asociado con el gen BRCA2, pueden modificar su estilo de vida apropiadamente. El más importante factor para evitar el riesgo genético de dicho cáncer se refiere al efecto protector de un embarazo precoz, llevado a término. Por tanto, las mujeres con riesgo podrían considerar el embarazo precoz o una terapia diseñada para simular los efectos hormonales de un embarazo precoz, llevado a término. Las mujeres con alto riesgo deberían también esforzarse en una detección precoz y deberían estar más altamente motivadas para aprender y practicar el autoexamen de las mamas. Tales mujeres deberían estar también muy motivadas para realizarse mamografías regulares, empezando quizás a una edad más temprana que la población general. El examen de los ovarios se debería realizar también con mayor frecuencia.

Las mujeres con cánceres de mama pueden seguir diferentes procedimientos quirúrgicos si están predispuestas y por tanto con más probabilidad de tener cánceres adicionales, que si no estuvieran predispuestas. Se pueden desarrollar otras terapias, usando o bien péptidos o bien moléculas pequeñas (diseño racional de fármacos). Los péptidos pueden ser el propio producto génico que falta o una porción del producto génico que falta. Alternativamente, el agente terapéutico puede ser otra molécula que imita la función del gen pernicioso, ya sea una molécula peptídica o no peptídica que intenta contrarrestar el efecto pernicioso del locus heredado. La terapia puede estar también basada en los genes, por medio de la introducción de un alelo normal de BRCA2 en los individuos para formar una proteína que contrarrestará el efecto del alelo pernicioso. Estas terapias génicas pueden tomar muchas formas y pueden ser dirigidas a evitar que se forme el tumor, a curar un cáncer una vez que ha aparecido o a parar un cáncer de sufrir metástasis.

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Zenke, et al. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3655-3659.

Lista de patentes y solicitudes de patentes

Patente de Estados Unidos No. 3.817.837

Patente de Estados Unidos No. 3.850.752

Patente de Estados Unidos No. 3.939.350

Patente de Estados Unidos No. 3.996.345

Patente de Estados Unidos No. 4.275,149

Patente de Estados Unidos No. 4.277.437

Patente de Estados Unidos No. 4.366.241

Patente de Estados Unidos No. 4.376.110

Patente de Estados Unidos No. 4.486.530

Patente de Estados Unidos No. 4.683.195

Patente de Estados Unidos No. 4.683.202

Patente de Estados Unidos No. 4.816.567

Patente de Estados Unidos No. 4.868.105

Patente de Estados Unidos No. 5.252.479

Publicación EPO No. 225.807

Solicitud de patente europea, publicación EPO No. 0332435

Geysen, H., Solicitud PCT publicada WO 84/03564, publicada el 13 de septiembre de 1984.

Hitzeman et al., EP 73,675^{a}

Solicitud PCT publicada WO 93/07282

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: MYRIAD GENETICS, INC

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 320 WAKARA WAY

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: SALT LAKE CITY

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: UTAH

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: UNITED STATES OF AMERICA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 84108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: ENDO RECHERCE, INC

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 2989 DE LA PROMENADE

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: SAINTE-FOY

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: QUEBEC

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: CANADÁ

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): GIW 215

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: THE TRUSTEES OF THE UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 3700 MARKET STREET, SUITE 300

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: PHILADELPHIA

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: PENNSYLVANIA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: UNITED STATES OF AMERICA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: HSC RESEARCH AND DEVELOPMENT LIMITED PARTNERSHIP

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 555 UNIVERSITY AVENUE

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: TORONTO

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: ONTARIO

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: CANADÁ

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): M5G 1X8

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TITULO DE LA INVENCIÓN: GEN DE PREDISPOSICIÓN AL CÁNCER DE MAMA LIGADO AL CROMOSOMA 13

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 124

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DE LECTURA EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Versión #1,30 (EPO)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 11385 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 299..10482

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3418 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ D NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERITICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 32 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "(NH_{2}) en el nucleótido 1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGTGCAAG GCTCGAGAAC NNNNNNNNNN NN

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ D NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "(NH_{2}) en el nucleótido 1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGTAGAAT TCTAACGGCC GTCATTGTTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCION: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 29..30

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "(NH_{2}) en el nucleótido 30"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAACAATGAC GGCCGTTAGA ATTCTACTCA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCION: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGTAGAAT TCTAACGGCC GTCAT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 7;

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "(PO_{4}) en el nucleótido 1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGTGCAAG GCTCGAGAAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "(PO_{4}) en el nucleótido 1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGTAGAAT TCTAACGGCC GTCATTG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE característica_misc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 32..33

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "(NH_{2}) en el nucleótido 33"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTCACACG CGTATCGATT AGTCACCNNNN NNN

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "(PO_{4}) en el nucleótido 1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGACTAATC GATACGCGTG TGAAGGTGC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: característica_misc.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

LOCALIZACIÓN: 1..2

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

OTRA INFORMACIÓN: /nota = "Biotinilado en el nucleótido 1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGAAGAACA ACAGGACTTT CACTA

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

AIVTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACCTTCACA CGCGTATCG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCGTAATT GTTGTTTTTA TGTTCAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTCACACG CGTATCGATT AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGGAATCAT TTTCACACTG TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCTCATAG TCAGAAATGA AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTTCCCATC CTCACAGTAA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACTGGGTT TTTAGCAAGC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTTAAAACT AAGGTGGGA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTGCCCAG CATGACACA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCCCAGTA TAGAGGAGA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTAGGAAAAT GTTTCATTTA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTAAAGTA GTATTCCAAC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGGTAAAA AAAGGGGAA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGATAAGTC AGGTATGATT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTGCCTGT ATGAGGCAGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCAATTCAG TAAACGTTAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTGTCAGTT ACTAACACAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTCATGTA ATCAAATAGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGGTTTAGA GACTTTCTC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCTAGGT TGATTGCA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCAAGAAAG GTAAGGTAA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATGAGAAA GGTTGTGAG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTAGTCTTG CTAGTTCTT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACAGTTGTA GATACCTCTG AA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACTTTTTGA TACCCTGAAA TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCATCTTG AATCTCATAC AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGTATACA GATGATGCCT AAG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO; Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTTAGTGA AAAATATTTA GTGA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATACATCTTG ATTCTTTTCC AT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 41:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTAGTGAAT GTGATTGATG GT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 42:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAACCAACT TTGTCCTTAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 43:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTAGATTTGT GTTTTGGTTG AA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 44:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGCTCTTTT GGGACAATTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 45:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGGAAAAGA ATCAGATGT AT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 46:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTAATGTTA TGTTCAGAGA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 47:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTACCTCCA AAACTGTGA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 48:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTAAAGCA GCATATAAAA AT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 49:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 16 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGCTGCTG TCTACCTG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 50:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTGGTCTTA AGATAGTCAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 51:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATAATTTA ACACCTAGCC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 52:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52;

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAAAAAAGT TAAATCTGAC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 53:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCTTTTATT CTGCTCATGG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 54:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTCTGCAGA AGTTTCCTCA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 55:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACGGACTTG CTATTTACTG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 56:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTACCTTTGC TCTTTTTCAT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 57:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCTAGCGG GAAAAAAGTT A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 58:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCGGAGAGA TGATTTTTGT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 59:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCTTAGCTT TTTACACAA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 60:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTTGATTA TATCTCGTTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 61:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 61:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTATTCTCGT TGTTTTCCTT A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 62:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 62:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCATTAAATT GTCCATATCT A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 63:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 63:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACGTAGGTG AATAGTGAAG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 64:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 64:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAAATTCCT CTAACACTCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 65:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 65:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGATAGTA CCAAGCAAGT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 66:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 66:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAGACTTTG GTTCCTAATA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 67:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 67:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTAACGAAC ATTCAGACCA G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 68:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTTCACTA TTCACCTACG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 69:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 68:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCCCAAACT GACTACACAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 70:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 70:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCATACCAA GTCTACTGAA T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 71:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 71:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTCTTTCAA ACATTAGGTC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 72:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 72:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGAGAGGC AGGTGGAT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 73:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 73:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATAGAGGG AGAACAGAT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 74:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(8)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 74:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTATGCTGA TTTCTGTTGT AT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 75:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 75:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATAAAACGGG AAGTGTTAAC T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 76:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 76:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTGAGTTA TTTGGTGCAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 77:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA:lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 77:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATACAAAA CAGTTACCAG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 78:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 78:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCACCAAA GGGGGAAA

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 79:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 79:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAATGAGGGT CTGCAACAAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 80:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 80:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTCGACCAG AACTTGAG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 81:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 81:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCCATTTGT AGGATACTAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 82:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 82:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTACTAGACG GGCGGAG

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 83:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 83:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTTTTTGT AGTGAAGATT CT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 84:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 84:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAGTTCGAGA GACAGTTAAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 85:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 85:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGTTTTGGT TTGTTATAAT TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 86:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 86:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGAGAATAG TTGTAGTTGT T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 87:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 87:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACCTTAACC CATACTGCC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 88:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 88:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCAGTATCA TCCTATGTGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 89:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 89:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTTATTCTC AGTTATTCAG TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 90:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 90:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAATTGAGC ATCCTTAGTA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 91:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 91:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTCTAGAG TCACACTTCC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 92:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 92:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATATTTTTAA GGCAGTTCTA GA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 93:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 93:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTACACACAC CAAAAAAGTC A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 94:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 94:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAAAACTCT TATGATATCT GT

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 95:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 95:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGAATGTTAT ATATGTGACT TTT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 96:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 96:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGTTGCTA TTCTTTGTCT A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 97:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 97:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCTAGATAC TAAAAAATAA AG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 98:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 98:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTTAGCAG TTATATAGTT TC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 99:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 99:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCAGAGAGT CTAAAACAG

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 100:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 100:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTGGGTGT TTTATGCTTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 101:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANT1SENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 101:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGTTGTAT TTGTCCTGTT TA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 102:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 102:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTTTGTTAG TAAGGTCATT TTT

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 103:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 103:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTCTGATTG CTTTTTATTC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 104:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDQ: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 104:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCACTTCTT CCATTGCATC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 105:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 105:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGTGGCTGG TAAATCTG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 106:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGIA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 106:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGGTAGCTC CAACTAATC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 107:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 107:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCGGTACAA ACCTTTCATT G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 108:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 108:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATTTTGAT TTGCTTTTAT TATT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 109:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 109:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTAMCCT TGATACTGGA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 110:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 110:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGAAACAT AAATATGTGG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 111:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA:. DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 111:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTTACAGGA GCCACATAAC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 112:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 112:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTACATTAAT TATGATAGGC TCG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 113:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 113:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTACTAATGT GTGGTTTGAA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 114:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 114:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAATGCAAG TTCTTCGTCA GC

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 115:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 115:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGAAGCTTC ATAAGTCAGT C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 116:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 116:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTGTAATGA AGCATCTGAT ACC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 117;

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 117:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATGATGAAT GTAGCACGC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 118:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 118:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCTGAATGT TCGTTACT

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 119:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 119:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACCAATCAAAC ACATCATCC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 120:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 120:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAAAGTAAC TTGGAGGGAG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 121:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.800000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 121:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCCTGAAAC TGTTCCCTTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 122:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 122:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATGGTGCT GGGATATTG G

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 123:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 123:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATGTCGAA GAGCTTGTC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEQ ID NO: 124:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "cebada"

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 124:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAACATACGC TTAGCCAGAC

\hfill

20

Claims (1)

1. Uso de un ácido nucleico aislado que comprende la secuencia codificadora establecida en SEQ ID NO:1 desde la posición nucleotídica 229 a la posición nucleotídica 10482 y que comprende además la mutación asociada con una predisposición al cáncer de mama, en donde T, en la posición nucleotídica 6174, está delecionado, para diagnosticar una predisposición al cáncer de mama en mujeres judías Ashkenazi in vitro.