ES2433012T3 - Un nuevo gen BNO1 cartografiado en el cromosoma 16q24.3 - Google Patents

Abstract

Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que se cartografía en el cromosoma humano 16q24.3 y quecomprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3.

Description

Un nuevo gen BNO1 cartografiado en el cromosoma 16q24.3.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo gen que se ha identificado en la punta distal del brazo largo del cromosoma 16 en 16q24.3. El gen BNO1 codifica un polipéptido que forma parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en el direccionamiento de proteínas mediante ubicuitinación para una degradación en el proteasoma. Considerando que BNO1 está involucrado en la ubicuitinación y la degradación de proteínas, la invención también se refiere a la terapia de trastornos asociados con este proceso, tales como el cáncer (en particular el carcinoma de mama y de próstata), la enfermedad inmune/inflamatoria y la enfermedad neurológica. Además, la invención se refiere al diagnóstico de trastornos asociados con la ubicuitinación y al escrutinio de fármacos para una intervención terapéutica en estos trastornos.

Técnica anterior

Se ha observado que el desarrollo de carcinomas humanos surge por una acumulación de cambios genéticos que implican agentes reguladores positivos de la función celular (oncogenes) y agentes reguladores negativos (genes supresores de tumores). Para que una célula somática normal se desarrolle en un tumor metastásico se requieren cambios a nivel celular, tales como la inmortalización, la pérdida de inhibición por contacto y la capacidad de crecimiento invasivo, y cambios a nivel tisular, tales como evitar respuestas inmunes del hospedador y restricciones del crecimiento impuestas por las células circundantes, y la formación de un aporte de sangre para el tumor en crecimiento.

Estudios genéticos moleculares de carcinoma colorrectal han proporcionado pruebas sustanciales de que la generación de malignidad requiere la acumulación secuencial de una serie de cambios genéticos dentro de la misma célula madre epitelial del colon. Para que una célula epitelial colónica normal se convierta en un adenoma benigno, progrese a adenoma intermedio y final, y finalmente se convierta en una célula maligna, son necesarias mutaciones inactivadoras en genes supresores de tumores y mutaciones activadoras en proto-oncogenes (Fearon y Vogelstein, 1990).

El empleo de una variedad de técnicas, tales como la pérdida de heterocigosidad (LOH), la hibridación genómica comparativa (CGH) y estudios citogenéticos de tejidos cancerosos, beneficiándose todas ellas de anomalías cromosómicas asociadas con la célula afectada, ha ayudado a identificar una variedad de genes supresores de tumores y de oncogenes asociados con una serie de tipos de tumores.

En un aspecto, estudios de cánceres tales como retinoblastoma y carcinoma de colon han respaldado el modelo de que LOH es un episodio específico en la patogénesis del cáncer y se ha proporcionado un mecanismo para identificar los genes causantes de cáncer. Este modelo se pone de relieve aún más en el síndrome de Von Hippel-Lindau (VHL), un trastorno raro que predispone individuos a una variedad de tumores, tales como carcinomas de células claras del riñón y tumores de células de los islotes del páncreas. Tanto los casos esporádicos como los casos heredados del síndrome muestran LOH en el brazo corto del cromosoma 3 y translocaciones somáticas que implican 3p en tumores esporádicos, y también se ha observado un ligamiento genético con la misma región en familias afectadas. El gen supresor del tumor de VHL ya se ha identificado a partir de esta región del cromosoma 3 y se han detectado mutaciones en el mismo en el 100% de los pacientes que tienen un diagnóstico clínico de enfermedad de VHL. Además, el gen de VHL se inactiva en aproximadamente el 50-80% de la forma esporádica más común de carcinoma renal de células claras.

Los determinantes genéticos implicados en el cáncer de mama no están tan bien definidos como los del cáncer de colon, debido en parte a que los estadios histológicos del desarrollo del cáncer de mama están peor caracterizados. Sin embargo, igual que con el carcinoma de colon, se cree que una tienen que estar implicados variedad de genes en una progresión por etapas, durante la génesis de tumores de mama.

Algunas mujeres parecen tener un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama. Análisis de ligamiento genético han mostrado que 5 a 10% de todos los cánceres de mama son debidos al menos a dos genes de susceptibilidad autosómicos dominantes. Generalmente, las mujeres portadoras de una mutación en un gen de susceptibilidad desarrollan cáncer de mama a una edad más temprana, en comparación con la población general, frecuentemente tienen tumores de mama bilaterales y tienen un mayor riesgo de desarrollar cánceres en otros órganos, particularmente carcinoma de ovario.

Un análisis de ligamiento genético en familias que muestran una alta incidencia de cáncer de mama de aparición temprana (antes de los 46 años de edad) fue un éxito en la cartografía del primer gen de susceptibilidad, BRCA1, en el cromosoma 17q21 (Hall et al., 1990). Con posterioridad a esto, se cartografió el gen BRCA2 en el cromosoma 13q12q13 (Wooster et al., 1994), confiriendo este gen una mayor incidencia de cáncer de mama masculino y una menor incidencia de cáncer de ovario, cuando se comparaba con BRCA1.

Tanto BRCA1 como BRCA2, ya han sido clonados (Miki et al., 1994; Wooster et al., 1995) y se han identificado numerosas mutaciones en estos genes en individuos susceptibles con casos familiares de cáncer de mama.

Existen otros síndromes de cáncer de mama heredado, sin embargo, son raros. Las mutaciones hereditarias en el gen TP53 se han identificado en individuos con síndrome de Li-Fraumeni, un cáncer familiar que produce neoplasias epite

liales que tienen lugar en sitios múltiples, incluyendo la mama. Del mismo modo, mutaciones de la línea germinal en el gen MMC4C1/PTEN implicado en la enfermedad de Cowden y en el gen de la ataxia telangiectasia (AT), han mostrado que confieren un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama, entre otras manifestaciones clínicas, pero en conjunto solo representan un porcentaje bajo de las familias con una predisposición hereditaria al cáncer de mama.

Se ha mostrado que las mutaciones somáticas en el gen TP53 se producen en un alto porcentaje de individuos con cáncer de mama esporádico. Sin embargo, a pesar de que se ha observado LOH en los loci de BRCA1 y BRCA2 con una frecuencia de 30 a 40% en los casos esporádicos (Cleton-Jansen et al., 1995; Saito et al., 1993), no hay prácticamente ninguna señal de mutaciones somáticas en el alelo conservado de estos dos genes en los cánceres esporádicos (Futreal et al., 1994; Miki et al., 1996). Datos recientes sugieren que la metilación del ADN de la secuencia del promotor de estos genes puede ser un importante mecanismo de regulación a la baja. El uso de polimorfismos en la longitud de los fragmentos de restricción y de marcadores polimórficos de pequeñas repeticiones en tándem, ha identificado numerosas regiones con desequilibrio alélico en el cáncer de mama, lo que sugiere la presencia de genes adicionales que pueden estar implicados en el cáncer de mama. Datos compilados a partir de más de 30 estudios revelan la pérdida de ADN en al menos 11 brazos de cromosomas, con una frecuencia superior al 25%, estando regiones tales como 16q y 17p afectadas en más del 50% de los tumores (Devilee y Cornelisse, 1994; Brenner y Aldaz, 1995). Sin embargo, se conoce que solo algunas de estas regiones albergan genes supresores de tumores, los cuales se ha mostrado que están mutados en individuos con las dos formas de cáncer de mama, esporádica (genes TP53 y RB) y familiar (genes TP53, RB, BRCA1 y BRCA2).

Estudios citogenéticos han implicado la pérdida del brazo largo del cromosoma 16 como un episodio temprano en la carcinogénesis de mama, ya que se encuentra en tumores con pocas o ninguna otra anormalidad citogenética. Alteraciones en el cromosoma 1 y 16 también se han observado en varios casos de carcinoma ductal in situ (DCIS), el estadio preinvasivo de carcinoma de mama ductal. Además, estudios de LOH en muestras de DCIS identificaron la pérdida de marcadores de 16q en el 29 al 89% de los casos sometidos a ensayo (Chen et al., 1996; Radford et al., 1995). Además, el examen de tumores de otros tipos de tejido ha indicado que la LOH de 16q también se observa frecuentemente en los carcinomas de próstata, hígado, ovario y neuroectodérmicos primitivos. En conjunto, estos hallazgos sugieren la presencia de un gen que se cartografía en el brazo largo del cromosoma 16 que está involucrado de manera decisiva en el desarrollo temprano de una gran proporción de cánceres de mama, así como de cánceres de otros tipos de tejidos, pero hasta la fecha no se ha identificado un gen de este tipo.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que se cartografía en el cromosoma 16q24.3 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3.

También proporciona una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3, que codifica un polipéptido que forma parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en el direccionamiento de proteínas mediante ubicuitinación para una degradación en el proteasoma.

La invención también incluye una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que es al menos 95% idéntica a una molécula de ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3 y que codifica un polipéptido que forma parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en el direccionamiento de proteínas mediante ubicuitinación para una degradación en el proteasoma.

Una cualquiera de las variantes de polinucleótidos descritas anteriormente puede codificar una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una característica funcional o estructural de BNO1.

Típicamente, la identidad de secuencia se calcula utilizando el algoritmo BLASTN con la matriz por defecto BLOS-SUM62.

La invención también incluye una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que codifica un polipéptido que forma parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en la degradación de proteínas mediante ubicuitinación, y que se hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números : 1 o 3.

En condiciones rigurosas, la hibridación tendrá lugar lo más preferiblemente a 42ºC en NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM, 2% de SDS, 50% de formamida, 1X Denhart, 10% (p/v) de sulfato de dextrano y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Variaciones útiles de estas condiciones serán claramente evidentes para los expertos en la técnica. Las etapas de lavado que siguen a la hibridación se producen lo más preferiblemente a 65ºC en NaCl 15 mM, citrato trisódico 1,5 mM y 1% de SDS. Variaciones adicionales de estas condiciones serán claramente evidentes para los expertos en la materia

La invención también proporciona una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4.

Preferiblemente, la identidad de la secuencia se determina utilizando el algoritmo BLASTP con la matriz por defecto BLOSSUM62.

También describimos una molécula de ácido nucleico aislada que comprende los exones 1 a 9 o los exones 1, 2, 2.5 y 3 a 9, identificados en las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID Números: 1 y 3, respectivamente.

Aún más, se proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3.

También describimos una molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1 desde la base 4 hasta la base 1.621 o expuesta en SEQ ID NO: 3 desde la base 4 hasta la base 1.708.

También describimos un gen aislado que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3 y los elementos de control de BNO1.

Preferiblemente, los elementos de control de BNO1 son los que median en la expresión en el tejido de mama, próstata, hígado y ovario.

Las secuencias de nucleótidos de la presente invención se pueden modificar genéticamente usando métodos aceptados en la técnica para alterar las secuencias que codifican BNO1, para una variedad de objetivos. Estos incluyen, pero no se limitan a los mismos, la modificación de la clonación, el procesamiento y/o la expresión del producto génico. El reacoplamiento con PCR de fragmentos génicos y el uso de oligonucleótidos sintéticos permiten la modificación genética de secuencias de nucleótidos de BNO1. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio mediada con nucleótidos puede introducir mutaciones que crean nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación y producir variantes por corte y empalme, etc.

Como resultado de la degeneración del código genético, se puede producir una serie de secuencias de polinucleótidos que codifican BNO1, algunas que pueden tener un mínimo de similitud con las secuencias de polinucleótidos de cualquier gen conocido y de origen natural. Por lo tanto, describimos todas y cada variación posible de la secuencia de polinucleótidos que se podría realizar mediante la selección de combinaciones basadas en posibles opciones de codones. Estas combinaciones se realizan de acuerdo con el código genético de tripletes convencional, tal como se aplica a la secuencia de polinucleótidos de BNO1 de origen natural, y todas las variaciones de este tipo se deben considerar como que se han descrito específicamente.

Los polinucleótidos de esta invención incluyen ARN, ADNc, ADN genómico, formas sintéticas y polímeros mixtos, cadenas codificantes y no codificantes, y se pueden modificar química o bioquímicamente, o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, tal como apreciarán los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen marcadores, metilación, agentes intercalantes, alquilantes y enlaces modificados. En algunos casos, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican BNO1 o sus derivados que poseen un uso de codones sustancialmente diferente al de BNO1 de origen natural. Por ejemplo, se pueden seleccionar codones para aumentar la tasa de expresión del péptido en un hospedador procariótico o eucariótico particular que se corresponda con la frecuencia con la que codones particulares son utilizados por el hospedador. Otras razones para alterar la secuencia de nucleótidos que codifica BNO1 y sus derivados, sin alterar las secuencias de aminoácidos codificadas, incluyen la producción de transcritos de ARN que tienen propiedades más deseables, tales como una semivida mayor que los transcritos producidos a partir de la secuencia de origen natural.

La invención también incluye la producción de moléculas de ADN, que codifican BNO1 y sus derivados, o fragmentos de los mismos, enteramente mediante química sintética. Las secuencias sintéticas se pueden insertar en vectores de expresión y sistemas celulares que contienen los elementos necesarios para el control de la transcripción y la traducción de la secuencia codificadora insertada, en un hospedador adecuado. Estos elementos pueden incluir secuencias reguladoras, promotores, regiones 5' y 3' no traducidas y señales de iniciación específicas (tales como un codón de iniciación ATG y la secuencia de consenso Kozak) que permiten una traducción más eficaz de las secuencias que codifican BNO1. En los casos en los que se inserta la secuencia completa que codifica BNO1, incluyendo su codón de iniciación y secuencias reguladoras aguas arriba, en el vector de expresión apropiado, puede que no sean necesarias unas señales de control adicionales. Sin embargo, en los casos en que solo se inserta la secuencia codificadora o un fragmento de la misma, el vector tiene que proporcionar señales exógenas de control de la traducción, tal y como se ha descrito anteriormente. Tales señales pueden tener diversos orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de la expresión se puede potenciar mediante la inclusión de potenciadores apropiados para el sistema particular de células hospedadoras empleado (Scharf et al., 1994).

La presente invención permite la preparación de un polipéptido o una proteína purificada de BNO1, a partir de los polinucleótidos de la presente invención o de variantes de los mismos. Con el fin de realizar esto, las células hospedadoras se pueden transfectar con una molécula de ADN tal y como se ha descrito anteriormente. Típicamente, dichas células hospedadoras se transfectan con un vector de expresión que comprende una molécula de ADN de acuerdo con la invención. Una variedad de sistemas de vector de expresión/hospedador se puede utilizar para contener y expresar secuencias que codifican BNO1. Estos incluyen, pero no se limitan a los mismos, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN de plásmido o cósmido; levadura transformada con vectores de expresión de levadura, sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión vírica (por ejemplo, baculovirus); o sistemas de células tisulares de ratón o de otros animales o de seres humanos. Las células de mamífero también se pueden utilizar para expresar la proteína de BNO1 usando diversos vectores de expresión que incluyen sistemas de

plásmido, cósmido y víricos tales como sistemas de expresión de virus adenovíricos, retrovíricos o vaccinia. La invención no está limitada por la célula hospedadora empleada.

Las secuencias de polinucleótidos, o variantes de las mismas, de la presente invención se pueden expresar de manera estable en líneas celulares para permitir una producción a largo plazo de proteínas recombinantes en sistemas de mamíferos. Las secuencias que codifican BNO1 se pueden transformar en líneas celulares utilizando vectores de expresión que pueden contener orígenes de replicación víricos y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector distinto. El marcador seleccionable confiere resistencia a un agente selectivo, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de células que expresan convenientemente las secuencias introducidas. Los clones resistentes de células transformadas de forma estable se pueden propagar utilizando técnicas de cultivo tisular apropiadas para el tipo de célula.

La proteína producida por una célula transformada se puede secretar o retener intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Como bien entenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican BNO1 se pueden diseñar para que contengan secuencias señal que dirigen la secreción de BNO1 a través de una membrana celular procariota o eucariota.

Además, una cepa de células hospedadoras se puede seleccionar por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la proteína expresada de la manera deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, glicosilación, fosforilación y acilación. La escisión postraduccional de una forma "prepro" de la proteína, también se puede usar para direccionar, plegar y/o para la actividad de una proteína específica. Diferentes células hospedadoras que tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para las actividades postraduccionales (por ejemplo, células HeLa o CHO), están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC) y se pueden seleccionar para asegurar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña.

Cuando se necesitan grandes cantidades de BNO1 como para la producción de anticuerpos, se pueden utilizar vectores que dirigen niveles elevados de expresión de BNO1 como los que contienen el promotor inducible del bacteriófago T5 y T7. La presente invención también incluye el uso de los sistemas de expresión descritos anteriormente para la generación y el aislamiento de proteínas de fusión que contienen dominios funcionales importantes de la proteína. Estas proteínas de fusión se utilizan para estudios de ligamiento, estructurales y funcionales, así como para la generación de anticuerpos apropiados.

Con el fin de expresar y purificar la proteína como una proteína de fusión, la secuencia apropiada de ADNc de BNO1 se inserta en un vector que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica otro péptido (por ejemplo, la glutationina succinil transferasa). La proteína de fusión se expresa y se recupera a partir de células procariotas o eucariotas. La proteína de fusión se puede purificar a continuación mediante cromatografía de afinidad basada en la secuencia del vector de fusión y la proteína de BNO1 obtenida mediante escisión enzimática de la proteína de fusión.

Los fragmentos de BNO1 también se pueden producir por síntesis directa de péptidos utilizando técnicas de fase sólida. La síntesis automatizada se puede lograr mediante el uso del sintetizador de péptidos ABI 431A (Perkin-Elmer). Varios fragmentos de BNO1 se pueden sintetizar por separado y después se combinan para producir la molécula de longitud completa.

De acuerdo con la invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4, que forma parte de un complejo de ubicuitina-ligasa involucrado en la degradación de proteínas a través de la ubicuitinación.

La invención también incluye un polipéptido aislado que forma parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en la degradación de proteínas a través de la ubicuitinación que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4.

Preferiblemente, la identidad de secuencia se determina utilizando el algoritmo BLASTP con la matriz por defecto BLOSSUM62.

También está previsto un polipéptido aislado que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o4.

En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método de preparación de un polipéptido tal y como se ha descrito anteriormente, que comprende las etapas de:

(1)

cultivar las células hospedadoras en condiciones eficaces para la producción del polipéptido; y

(2)

recoger el polipéptido.

La proteína de BNO1 sustancialmente purificada o fragmentos de la misma se pueden utilizar a continuación en otros 5

análisis bioquímicos para establecer la estructura secundaria y terciaria, por ejemplo, mediante cristalografía de rayos X de la proteína de BNO1 o mediante resonancia magnética nuclear (RMN). La determinación de la estructura permite el diseño racional de productos farmacéuticos que interaccionan con la proteína, alteran la configuración de la carga de la proteína o la interacción de la carga con otras proteínas, o modifican su función en la célula.

El gen BNO1 se ha identificado a partir de una región de LOH restringida, observada en el cáncer de mama y de próstata, y parece estar regulado a la baja en su expresión en líneas celulares de cáncer obtenidas a partir de estos tejidos. Además, existe una similitud estructural y química en el contexto de las secuencias y motivos, entre las regiones de BNO1 y las proteínas F-box. Las proteínas F-box son los componentes de reconocimiento del sustrato de una clase de las ligasas ubicuitina-E3, la clase denominada “SCF”, que están implicadas en la degradación de proteínas a través de la ubicuitinación y la posterior proteolisis llevada a cabo por el proteasoma. Hasta la fecha, las proteínas que parecen estar reguladas por este mecanismo, incluyen oncogenes, genes supresores de tumores, factores de transcripción y otras moléculas de señalización. Estas proteínas influyen en muchos procesos celulares tales como la modulación de las respuestas inmunes e inflamatorias, el desarrollo y la diferenciación, así como procesos que están implicados en el desarrollo del cáncer, tales como la regulación del ciclo celular y la apoptosis. También se ha observado que BNO1 interacciona con Skp1, un componente esencial de las ligasas ubicuitina-E3 SCF.

Se ha proporcionado previamente un precedente convincente de una proteína supresora tumoral que pertenece al sistema de degradación ubicuitina-proteasoma, a través del gen VHL. Se ha demostrado que este gen se asocia con elongina C, elongina B y culina-2 en un complejo denominado VCB-CUL-2. Este complejo multiproteico muestra una similitud estructural y funcional con las ligasas de ubicuitina SCF y se ha mostrado que está involucrado en la ubicuitinación de sustratos de VHL.

En conjunto, esta información sugiere que BNO1 está implicado en los procesos que conducen al cáncer, especialmente carcinoma de mama y de próstata, lo más probable a través de su papel en la ubicuitinación de proteínas que participan en importantes funciones celulares, tales como la regulación del ciclo celular. Como BNO1 se expresa en muchos tipos de tejidos, alteraciones en la función de BNO1 también pueden causar patologías en esos tejidos a través de las consiguientes alteraciones en el proceso de ubicuitinación.

Con la identificación de la secuencia de nucleótidos y proteínas de BNO1, se pueden utilizar sondas y anticuerpos dirigidos al gen en una variedad de ensayos de hibridación e inmunológicos, para escrutar y detectar la presencia de un gen normal o mutado o del producto génico. Además, la secuencia de nucleótidos y proteínas del gen BNO1 proporcionada en esta invención, permite métodos terapéuticos para el tratamiento de todas las enfermedades asociadas con anormalidades de la función de BNO1, incluyendo cáncer, enfermedad inmune/inflamatoria y trastornos neurológicos, y también permite métodos para el diagnóstico o el pronóstico de todas las enfermedades asociadas con anormalidades en la función de BNO1.

Ejemplos de tales trastornos incluyen, pero no se limitan a, cánceres, trastornos inmunes/inflamatorios y trastornos neurológicos. Los cánceres incluyen adenocarcinoma, leucemia, linfoma, melanoma, mieloma, sarcoma, teratocarcinoma y, en particular, cánceres de mama, próstata, hígado, ovario, cabeza y cuello, corazón, cerebro, páncreas, pulmón, músculo esquelético, riñón, colon, útero, testículos, glándula suprarrenal, sangre, células germinales, placenta, membrana sinovial, amígdalas, cuello uterino, tejido linfático, piel, vejiga, médula espinal, glándula tiroides y estómago. Otros tipos de cáncer pueden incluir los de huesos, médula ósea, vesícula biliar, ganglios, tracto gastrointestinal, paratiroides, pene, glándulas salivales, bazo y timo. Los trastornos inmunes/inflamatorios incluyen el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la enfermedad de Addison, el síndrome de dificultad respiratoria de adulto, alergias, espondilitis anquilosante, amiloidosis, anemia, asma, aterosclerosis, anemia hemolítica autoinmune, tiroiditis autoinmune, polienodocrinopatía-candidiasis-distrofia ectodérmica autoinmune (APECED), bronquitis, colecistitis, dermatitis de contacto, enfermedad de Crohn, fibrosis quística, dermatitis atópica, dermatomiositis, diabetes mellitus, enfisema, linfopenia episódica con linfocitotoxinas, eritroblastosis fetal, eritema nodoso, gastritis atrófica, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, gota, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, hipereosinofilia, síndrome de intestino irritable, esclerosis múltiple, miastenia grave, inflamación miocárdica o pericárdica, osteoartritis, osteoporosis, pancreatitis, polimiositis, psoriasis, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjogren, anafilaxia sistémica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, púrpura trombocitopénica, colitis ulcerosa, uveítis, síndrome de Werner, complicaciones de la cicatrización de heridas (por ejemplo, formación de cicatrices), cáncer, hemodiálisis y circulación extracorpórea, infecciones víricas, bacterianas, fúngicas, parasitarias, de protozoos y helmintos, y trauma. Los trastornos neurológicos pueden incluir la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer.

En el tratamiento de enfermedades asociadas con una disminución de la expresión y/o de la actividad de BNO1, es deseable incrementar la expresión y/o la actividad de BNO1. En el tratamiento de trastornos asociados con el aumento de la expresión y/o de la actividad de BNO1, es deseable disminuir la expresión y/o la actividad de BNO1.

Mejora del gen BNO1 o de la función proteica de BNO1

Mejorar, estimular o reactivar el gen BNO1 o la función proteica de BNO1 se puede lograr en una variedad de maneras. También describimos la administración de una molécula de ADN aislada, tal y como se ha descrito anteriormente, a un sujeto que requiere que tal tratamiento se pueda iniciar.

Típicamente, BNO1 se administra a un sujeto para tratar o prevenir un trastorno asociado con la disminución de la actividad y/o la expresión de BNO1.

En un aspecto adicional, se proporciona el uso de una molécula de ADN aislada, tal y como se ha descrito anteriormente, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con una disminución de la actividad y/o la expresión de BNO1.

Típicamente, un vector capaz de expresar BNO1 o un fragmento o un derivado del mismo, se puede administrar a un sujeto para tratar o prevenir un trastorno asociado con una disminución de la actividad y/o la expresión de TSG18 incluyendo los descritos anteriormente, pero no limitado a los mismos. La transducción de vectores retrovíricos se utiliza frecuentemente para la terapia génica de células somáticas, debido a su elevada eficacia en la infección y la integración y la expresión estables. El gen BNO1 de longitud completa, o porciones del mismo, se pueden clonar en un vector retrovírico y se pueden dirigir desde su promotor endógeno o desde la repetición terminal larga retrovírica o desde un promotor específico para el tipo de célula diana de interés. Otros vectores víricos se pueden utilizar e incluyen, tal y como se conocen en la técnica, adenovirus, virus adenoasociado, virus vaccinia, papovavirus, lentivirus y retrovirus de origen aviar, murino y humano.

La terapia génica se llevaría a cabo según los métodos establecidos (Friedman, 1991; Culver, 1996). Se preparara un vector que contiene una copia del gen BNO1 ligada a elementos de control de la expresión y que es capaz de replicarse dentro de las células. Alternativamente, el vector puede tener una replicación incorrecta y puede requerir células auxiliares o un virus auxiliar para la replicación y la producción de virus y el uso en terapia génica.

La transferencia génica que emplea métodos no víricos de infección también se puede utilizar. Estos métodos incluyen la inyección directa de ADN, la captación de ADN desnudo en presencia de fosfato de calcio, la electroporación, la fusión de protoplastos o la entrega en liposomas. La transferencia génica también se puede lograr mediante la entrega como una parte de un cromosoma humano artificial o la transferencia génica mediada por receptores. Esto implica ligar el ADN a una molécula de direccionamiento que se unirá a receptores específicos de la superficie celular para inducir la endocitosis y la transferencia del ADN dentro de células de mamífero. Una de tales técnicas utiliza poli-L-lisina para enlazar la asialoglicoproteına al ADN. Un adenovirus también se añade al complejo para destruir los lisosomas y permitir de este modo que el ADN evite la degradación y pase al núcleo. La infusión de estas partículas por vía intravenosa ha dado lugar a la transferencia génica en hepatocitos.

En sujetos afectados que expresan una forma mutada de BNO1, se puede prevenir el trastorno introduciendo en las células afectadas una copia de tipo silvestre del gen, de tal manera que se recombina con el gen mutante. Esto requiere un caso de doble recombinación para la corrección de la mutación del gen. Los vectores para la introducción de genes de esta forma son conocidos en la técnica, y se puede utilizar cualquier vector adecuado. Alternativamente, la introducción de otra copia del gen que es portadora de una segunda mutación en ese gen, se puede emplear con el fin de anular la mutación del gen original y bloquear cualquier efecto negativo.

En sujetos afectados que tienen una expresión reducida de BNO1, un mecanismo de regulación a la baja puede ser la metilación anormal de la isla CpG presente en el extremo 5' del gen. Por lo tanto, en un enfoque alternativo de la terapia, la administración de agentes que eliminan la metilación del promotor de BNO1, reactivará la expresión del gen BNO1 y puede suprimir el fenotipo asociado con la enfermedad.

En un aspecto adicional, un agonista adecuado también puede incluir una molécula o un péptido pequeño que puede imitar la función de BNO1 de tipo silvestre.

Inhibición del gen BNO1 o de la función proteica de BNO1

La inhibición de la función de un gen o una proteína mutada se puede lograr por una variedad de vías. También describimos un método para tratar un trastorno asociado con el aumento de la actividad y/o la expresión de BNO1, que comprende administrar un antagonista de BNO1 a un sujeto que requiera tal tratamiento.

En todavía otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un antagonista de BNO1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con el aumento de la actividad y/o de la expresión de BNO1.

Tales trastornos pueden incluir los descritos anteriormente, pero no se limitan a los mismos. En un aspecto de la invención, una molécula de ADN aislada, que es el complemento de una cualquiera de las moléculas de ADN descritas anteriormente y que codifica una molécula de ARN que se hibrida con el ARNm codificado por BNO1, se puede administrar a un sujeto que requiera tal tratamiento.

En aún otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de una molécula de ADN aislada que es el complemento de una molécula de ADN de la invención y que codifica una molécula de ARN que se hibrida con el ARNm codificado por BNO1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con el aumento de la actividad y/o de la expresión de BNO1.

Típicamente, un vector que expresa el complemento del polinucleótido que codifica BNO1 se puede administrar a un sujeto para tratar o prevenir un trastorno asociado con el aumento de la actividad y/o la expresión de BNO1, que incluye

los descritos anteriormente, pero no se limita a los mismos. Las estrategias no codificadoras (del inglés, “antisense strategies”) pueden utilizar una variedad de enfoques incluyendo el uso de oligonucleótidos no codificadores, ribozimas, ADNzimas, inyección de ARN no codificador y transfección de vectores de expresión de ARN no codificador. Muchos métodos para introducir vectores en células o tejidos están disponibles y son igualmente adecuados para su uso in vivo, in vitro y ex vivo. Para la terapia ex vivo, los vectores se pueden introducir en células madre, excepto las células madre embrionarias humanas, tomadas del paciente y propagadas por clonación para un retrotrasplante autólogo en el mismo paciente. La entrega mediante transfección, inyecciones de liposomas o mediante polímeros amino policatiónicos, se puede lograr usando métodos que son bien conocidos en la técnica. (Por ejemplo, véase Goldman et al., 1997).

También describimos un método para tratar un trastorno asociado con un aumento de la actividad y/o de la expresión de BNO1 que comprende la administración de un antagonista de BNO1 a un sujeto que requiera tal tratamiento.

En todavía otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de un antagonista de BNO1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con el aumento de la actividad y/o la expresión de BNO1.

Tales trastornos pueden incluir, los descritos anteriormente, pero no se limitan a los mismos. En un aspecto, una proteína purificada de acuerdo con la invención se puede usar para producir anticuerpos que se unen específicamente a BNO1. Estos anticuerpos se pueden usar directamente como antagonistas o indirectamente como un mecanismo de direccionamiento o de entrega para llevar un agente farmacéutico a las células o tejidos que expresan BNO1. Tales anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a los mismos, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos y de cadena sencilla, tal como lo entenderá una persona experta en la técnica.

Para la producción de anticuerpos, diversos hospedadores que incluyen conejos, ratas, cabras, ratones, seres humanos y otros se pueden inmunizar mediante la inyección de una proteína de la invención o de cualquier fragmento u oligopéptido de la misma, que tiene propiedades inmunogénicas. Se pueden utilizar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica e incluyen, pero no se limitan a los mismos, adyuvante de Freund, geles minerales tales como hidróxido de aluminio y sustancias tensioactivas tales como lisolecitina. Los adyuvantes utilizados en los seres humanos incluyen BCG (bacilos de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum.

Se prefiere que los oligopéptidos, péptidos o fragmentos utilizados para inducir anticuerpos frente a BNO1, tengan una secuencia de aminoácidos que consiste en al menos aproximadamente 5 aminoácidos y, más preferiblemente, en al menos aproximadamente 10 aminoácidos. También es preferible que estos oligopéptidos, péptidos o fragmentos sean idénticos a una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína natural y que contengan la secuencia de aminoácidos completa de una pequeña molécula de origen natural. Tramos cortos de aminoácidos procedentes de estas proteínas se pueden fusionar con los de otra proteína, tal como KLH, y se pueden producir anticuerpos de la molécula quimérica.

Los anticuerpos monoclonales de BNO1 se pueden preparar usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas incluyen, pero no se limitan a las mismas, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de linfocitos B humanos y la técnica de hibridoma de VEB. (Por ejemplo, véase Kohler et al., 1975; Kozbor et al., 1985; Cote et al., 1983; Cole et al., 1984).

Los anticuerpos también se pueden producir induciendo la producción in vivo en la población de linfocitos o mediante el escrutinio de genotecas de inmunoglobulinas o paneles de reactivos que se unen de forma muy específica, tal y como se describe en la bibliografía. (Por ejemplo, véase Orlandi et al., 1989; Winter et al., 1991).

Los fragmentos de anticuerpo que contienen sitios de unión específica a BNO1 también se pueden generar. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen, fragmentos F(ab')2 producidos por digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo y fragmentos Fab generados por reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab)’2. Alternativamente, las genotecas de expresión de Fab se pueden construir para permitir una rápida y fácil identificación de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada. (Por ejemplo, véase Huse et al., 1989).

Se pueden usar varios inmunoensayos para escrutar e identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Numerosos protocolos para ensayos de unión competitiva o inmunorradiométricos que utilizan anticuerpos policlonales o monoclonales con especificidades establecidas, son bien conocidos en la técnica. Tales inmunoensayos implican típicamente medir la formación de complejos entre una proteína y su anticuerpo específico. Se prefiere un inmunoensayo de dos sitios basado en anticuerpos monoclonales, que utiliza anticuerpos monoclonales que reaccionan con dos epítopos que no interfieren, pero también se puede emplear un ensayo de unión competitiva.

También describimos un método para el tratamiento de un trastorno que se ha mostrado que está asociado con una actividad y/o una expresión anormal de BNO1, que comprende la administración de una molécula de ácido nucleico, un anticuerpo o un compuesto tal y como se ha descrito anteriormente, a un sujeto que requiera tal tratamiento.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una molécula de ácido nucleico, un anticuerpo o un compuesto tal y como se ha descrito anteriormente, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno que se ha mostrado que está asociado con una actividad y/o una expresión anormal de BNO1.

En un aspecto adicional, se puede administrar una composición farmacéutica que comprende una molécula de ácido

nucleico, un anticuerpo o un compuesto tal y como se ha descrito anteriormente, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La composición farmacéutica se puede administrar a un sujeto para tratar o prevenir un trastorno asociado con una actividad y/o una expresión anormal de BNO1 que incluye los proporcionados anteriormente pero no se limitan a los mismos. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención se preparan mezclando BNO1 o fragmentos activos de BNO1 o variantes de los mismos que tienen el grado de pureza deseado, con vehículos, excipientes

o estabilizadores aceptables que son bien conocidos. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcar alcoholes tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, Pluronics o polietilenglicol (PEG).

En otras realizaciones, cualquiera de los genes, péptidos, antagonistas, anticuerpos, secuencias complementarias o vectores de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes terapéuticos apropiados. La selección de los agentes adecuados la pueden realizar los expertos en la técnica, de acuerdo con principios farmacéuticos convencionales. La combinación de agentes terapéuticos puede actuar sinérgicamente para efectuar el tratamiento o la prevención de los diversos trastornos descritos anteriormente. Con el uso de este enfoque, puede ser posible una eficacia terapéutica con dosificaciones más bajas de cada agente, reduciendo de este modo el potencial de efectos secundarios adversos.

Detección de fármacos

De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, los péptidos de la invención, particularmente polipéptidos de BNO1 purificados y células que los expresan, son útiles para la detección de agentes farmacéuticos candidatos en una variedad de técnicas para el tratamiento de trastornos asociados con una disfunción de BNO1. Tales técnicas incluyen, pero no se limitan a las mismas, la utilización de células hospedadoras eucariotas o procariotas que se transforman de forma estable con moléculas recombinantes que expresan el polipéptido de BNO1 o un fragmento del mismo, preferiblemente en ensayos de unión competitiva. Los ensayos de unión medirán la formación de complejos entre el polipéptido de BNO1, o fragmentos del mismo, y el agente que se está sometiendo a ensayo, o medirán el grado con el que un agente que se está sometiendo a ensayo va a interferir con la formación de un complejo entre el polipéptido de BNO1, o un fragmento del mismo, y un ligando conocido, en particular otros miembros del complejo SCF y sustratos de BNO1 direccionados para la ubicuitinación.

Otra técnica para escrutar fármacos proporciona una detección rápida de compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada hacia el polipéptido de BNO1 (véase el documento de solicitud PCT publicada WO84/03564). En esta técnica mencionada, se puede sintetizar un gran número de pequeños compuestos peptídicos del ensayo sobre un sustrato sólido y se pueden analizar a través de la unión al polipéptido de BNO1 y lavar. El polipéptido de BNO1 unido se detecta a continuación por métodos bien conocidos en la técnica. En una variación de esta técnica, se pueden revestir placas directamente con los polipéptidos purificados para identificar los compuestos del ensayo que interaccionan.

Un método adicional para seleccionar fármacos implica el uso de líneas de células hospedadoras eucariotas que son portadoras de mutaciones en el gen BNO1. Las líneas de células hospedadoras también son defectuosas a nivel de polipéptido. Se pueden utilizar otras líneas celulares en las que la expresión génica de BNO1 se puede desconectar. Las líneas de células hospedadoras o las células se cultivan en presencia de diversos compuestos farmacéuticos y se mide la tasa de crecimiento de las células hospedadoras para determinar si el compuesto es capaz de regular el crecimiento de las células defectuosas.

El polipéptido de BNO1 también se puede usar para seleccionar compuestos obtenidos como resultado de la tecnología combinatoria de genotecas. Esta proporciona una forma de someter a ensayo un gran número de sustancias diferentes para estudiar su capacidad para modular la actividad de un polipéptido. Se prefiere el uso de bancos de péptidos (véase el documento de patente WO97/02048) con tales bancos y su uso conocido en la técnica.

Una sustancia identificada como moduladora de la función del polipéptido puede ser un péptido o un no péptido en la naturaleza. Las "moléculas pequeñas" no peptídicas se prefieren frecuentemente para muchas aplicaciones farmacéuticas in vivo. Además, un imitador o un agente mimético de la sustancia se puede diseñar para uso farmacéutico. El diseño de agentes miméticos basándose en un compuesto farmacéuticamente activo conocido (compuesto “guía”) es un método común para el desarrollo de nuevos productos farmacéuticos. Esto es deseable frecuentemente cuando el compuesto activo original es difícil de sintetizar o costoso, o cuando se proporciona un método inadecuado de administración. En el diseño de un agente mimético, se identifican partes particulares del compuesto activo original que son importantes para la determinación de la propiedad diana. Estas partes o residuos que constituyen la región activa del compuesto se conocen como su farmacóforo. Una vez encontrado, la estructura del farmacóforo sirve de modelo de acuerdo con sus propiedades físicas, utilizando datos que proceden de una variedad de fuentes, incluyendo los datos de difracción de rayos X y RMN. A continuación, se selecciona una molécula molde, a la que se pueden añadir grupos químicos

que imitan el farmacóforo. La selección puede hacerse de manera que el agente mimético sea fácil de sintetizar, sea probable que sea farmacológicamente aceptable, no se degrade in vivo y conserve la actividad biológica del compuesto guía. Una mejora o una modificación adicional se puede llevar a cabo para seleccionar uno o varios agentes miméticos finales, útiles para el ensayo in vivo o clínico.

También es posible aislar un anticuerpo específico de una diana y después explicar su estructura cristalina. En principio, este método produce un farmacóforo a partir del cual se puede basar el diseño de fármacos posteriores, tal y como se describió anteriormente. Puede ser posible evitar por completo la cristalografía de proteínas, generando anticuerpos anti-idiotípicos (anti-ids) de un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como imagen especular de una imagen especular, se esperaría que el sitio de unión de los anti-ids fuera un análogo del sitio de unión original. El anti-id se podría usar entonces para aislar péptidos a partir de bancos de péptidos producidos química o biológicamente.

Cualquiera de los métodos terapéuticos descritos anteriormente se puede aplicar a cualquier sujeto que requiera una terapia de este tipo, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos y, lo más preferiblemente, seres humanos.

Aplicaciones para diagnóstico y pronóstico

Las secuencias de polinucleótidos que codifican BNO1 se pueden utilizar para el diagnóstico o el pronóstico in vitro de trastornos asociados con una disfunción de BNO1, o una predisposición a tales trastornos. Ejemplos de tales trastornos incluyen, pero no se limitan a los mismos, cánceres, trastornos del sistema inmune/inflamatorio y trastornos neurológicos. Los cánceres incluyen adenocarcinoma, leucemia, linfoma, melanoma, mieloma, sarcoma, teratocarcinoma y, en particular, cánceres de mama, próstata, hígado, ovario, cabeza y cuello, corazón, cerebro, páncreas, pulmón, músculo esquelético, riñón, colon, útero, testículos, glándula suprarrenal, sangre, células germinales, placenta, membrana sinovial, amígdalas, cuello uterino, tejido linfático, piel, vejiga, médula espinal, glándula tiroides y estómago. Otros cánceres pueden incluir los de hueso, médula ósea, vesícula biliar, ganglios, tracto gastrointestinal, paratiroides, pene, glándulas salivales, bazo y timo. Los trastornos inmuno/inflamatorios incluyen el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la enfermedad de Addison, el síndrome de dificultad respiratoria de adulto, alergias, espondilitis anquilosante, amiloidosis, anemia, asma, aterosclerosis, anemia hemolítica autoinmune, tiroiditis autoinmune, polienodocrinopatía-candidiasisdistrofia ectodérmica autoinmune (APECED), bronquitis, colecistitis, dermatitis de contacto, enfermedad de Crohn, fibrosis quística, dermatitis atópica, dermatomiositis, diabetes mellitus, enfisema, linfopenia episódica con linfocitotoxinas, eritroblastosis fetal, eritema nodoso, gastritis atrófica, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, gota, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, hipereosinofilia, síndrome de intestino irritable, esclerosis múltiple, miastenia grave, inflamación miocárdica o pericárdica, osteoartritis, osteoporosis, pancreatitis, polimiositis, psoriasis, síndrome de Reiter, artritis reumatoide, esclerodermia, síndrome de Sjogren, anafilaxia sistémica, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, púrpura trombocitopénica, colitis ulcerosa, uveítis, síndrome de Werner, complicaciones de la cicatrización de heridas (por ejemplo, formación de cicatrices), cáncer, hemodiálisis y circulación extracorpórea, infecciones víricas, bacterianas, fúngicas, parasitarias, de protozoos y helmintos, y trauma. Los trastornos neurológicos pueden incluir la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer.

El diagnóstico o el pronóstico se pueden usar para determinar la gravedad, el tipo o el estadio del estado de la enfermedad con el fin de iniciar una intervención terapéutica apropiada.

En otra realización de la invención, los polinucleótidos que se pueden utilizar con fines de diagnóstico o pronóstico incluyen secuencias de oligonucleótidos, ADN genómico y moléculas de ADN y ARN complementarias. Los polinucleótidos se pueden utilizar para detectar y cuantificar la expresión génica en tejidos de biopsias en los que mutaciones en BNO1 o una expresión anormal de BNO1 se pueden correlacionar con una enfermedad. El ADN genómico utilizado para el diagnóstico o el pronóstico se puede obtener a partir de células corporales, tales como las presentes en la sangre, biopsia de tejidos, muestra quirúrgica o material de autopsias. El ADN se puede aislar y usar directamente para la detección de una secuencia específica o se puede amplificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) antes del análisis. Del mismo modo, el ARN o ADNc también se pueden utilizar, con o sin amplificación mediante PCR. Para detectar una secuencia específica de ácido nucleico, se puede emplear la secuenciación directa de nucleótidos, la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR), la hibridación usando oligonucleótidos específicos, la digestión con enzimas de restricción y cartografía, la cartografía mediante PCR, la protección contra ARNasa y varios otros métodos. Los oligonucleótidos específicos de secuencias particulares se pueden sintetizar químicamente y marcar radiactivamente o no radiactivamente e hibridar con muestras individuales, inmovilizadas sobre membranas u otros soportes sólidos o en solución. La presencia, la ausencia o el exceso de expresión de BNO1 se pueden visualizar a continuación usando métodos tales como autorradiografía, fluorometría o colorimetría.

En un aspecto particular, las secuencias de nucleótidos que codifican BNO1 pueden ser útiles en ensayos que detectan la presencia de trastornos asociados, en particular los mencionados anteriormente. Las secuencias de nucleótidos que codifican BNO1 se pueden marcar por métodos convencionales y añadir a una muestra de fluido o de tejido de un paciente, en condiciones adecuadas para la formación de complejos de hibridación. Después de un periodo de incubación adecuado, la muestra se lava y la señal se cuantifica y se compara con un valor estándar. Si la cantidad de señal en la muestra del paciente está significativamente alterada en comparación con una muestra testigo, entonces la presencia de niveles alterados de secuencias de nucleótidos que codifican BNO1 en la muestra indica la presencia del trastorno asociado. Tales ensayos también se pueden usar para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico

particular en estudios con animales, en ensayos clínicos o para vigilar el tratamiento de un paciente individual.

Con el fin de proporcionar una base para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno que se ha mostrado que está asociado con una mutación en BNO1, la secuencia de nucleótidos del gen BNO1 se puede comparar entre tejido normal y tejido enfermo con el fin de establecer si el paciente expresa un gen mutante.

Con el fin de proporcionar una base para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno que se ha mostrado que está asociado con una expresión anormal de BNO1, se establece un perfil normal o estándar de la expresión. Esto se puede lograr combinando fluidos corporales o extractos celulares tomados de sujetos normales, tanto animales como humanos, con una secuencia, o un fragmento de la misma, que codifica BNO1, en condiciones adecuadas para la hibridación

o la amplificación. La hibridación convencional se puede cuantificar mediante la comparación de los valores obtenidos a partir de sujetos normales con los valores procedentes de un experimento en el que se utiliza una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado. Otro método para identificar un perfil normal o estándar de la expresión de BNO1 es a través de estudios con RT-PCR cuantitativa. El ARN aislado a partir de células corporales de un individuo normal, particularmente el ARN aislado a partir de células tumorales, se transcribe de forma inversa y se realiza una PCR en tiempo real, utilizando oligonucleótidos específicos del gen BNO1, para establecer un nivel normal de expresión del gen.

Los valores estándar obtenidos en estos dos ejemplos se pueden comparar con los valores obtenidos a partir de muestras de pacientes que son sintomáticos de un trastorno. Una desviación de los valores estándar se usa para establecer la presencia de un trastorno.

Una vez que se ha establecido la presencia de un trastorno y se inicia un protocolo de tratamiento, los ensayos de hibridación o los estudios con RT-PCR cuantitativa se pueden repetir regularmente para determinar si el nivel de expresión en el paciente comienza a aproximarse al que se observa en el sujeto normal. Los resultados obtenidos a partir de sucesivos ensayos se pueden usar para mostrar la eficacia del tratamiento durante un período que oscila desde varios días a meses.

En un aspecto, la hibridación con sondas de PCR que son capaces de detectar secuencias de polinucleótidos, incluyendo secuencias genómicas, que codifican BNO1 o moléculas estrechamente relacionadas, se puede utilizar para identificar secuencias de ácidos nucleicos que codifican BNO1. La especificidad de la sonda, tanto si se prepara a partir de una región altamente específica, por ejemplo, la región reguladora 5', o a partir de una región menos específica, por ejemplo, un motivo conservado, y el rigor de la hibridación o la amplificación, determinarán si la sonda identifica solo secuencias de origen natural que codifican BNO1, variantes alélicas o secuencias relacionadas.

Las sondas también se pueden utilizar para la detección de secuencias relacionadas y deben tener preferiblemente al menos 50% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias que codifican BNO1. Las sondas para la hibridación de la presente invención pueden ser ADN o ARN, y se pueden obtener a partir de la secuencia de SEQ ID Números: 1 o 3, o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotores, potenciadores e intrones del gen BNO1 (SEQ ID Números: 5-11).

Los medios para producir sondas de hibridación específicas para los ADNs que codifican BNO1, incluyen la clonación de secuencias de polinucleótidos que codifican BNO1 o derivados de BNO1 en vectores, para la producción de sondas de ARNm. Tales vectores son conocidos en la técnica y están disponibles comercialmente. Las sondas de hibridación pueden estar marcadas con radionucleidos tales como 32P o 35S, o con marcadores enzimáticos, tales como fosfatasa alcalina acoplada a la sonda a través de sistemas de acoplamiento de avidina/biotina u otros métodos conocidos en la técnica.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un polipéptido tal y como se ha descrito anteriormente, en el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno que se ha mostrado que está asociado con BNO1, o una predisposición a tales trastornos.

Cuando un ensayo de diagnóstico o pronóstico se ha de basar en la proteína de BNO1, son posibles una variedad de métodos. Por ejemplo, el diagnóstico o el pronóstico se pueden conseguir vigilando las diferencias en la movilidad electroforética de proteínas normales y mutantes. Este método será particularmente útil para identificar mutantes en los que están presentes sustituciones de la carga, o en los que inserciones, deleciones o sustituciones han dado como resultado un cambio significativo en la migración electroforética de la proteína resultante. Alternativamente, el diagnóstico se puede basar en diferencias en los patrones de escisión proteolítica de proteínas normales y mutantes, diferencias en las relaciones molares de los diversos residuos de aminoácidos o mediante ensayos funcionales que muestran la función alterada de los productos génicos.

En otro aspecto, anticuerpos que se unen específicamente a BNO1 se pueden usar para el diagnóstico o el pronóstico de trastornos caracterizados por una expresión anormal de BNO1, o en ensayos para vigilar pacientes que están siendo tratados con BNO1 o con agonistas, antagonistas o inhibidores de BNO1. Los anticuerpos útiles para fines de diagnóstico se pueden preparar de la misma manera que como se ha descrito anteriormente para los agentes terapéuticos. Los ensayos de diagnóstico o pronóstico de BNO1 incluyen métodos que utilizan el anticuerpo y un marcador para detectar BNO1 en fluidos corporales humanos o en extractos de células o tejidos. Los anticuerpos se pueden usar con o sin modificación y se pueden marcar mediante la fijación covalente o no covalente de una molécula informadora.

Una variedad de protocolos para medir BNO1, que incluyen ELISAs, RIAs y FACS, son conocidos en la técnica y proporcionan una base para diagnosticar unos niveles alterados o anormales de la expresión de BNO1. Los valores normales o convencionales de expresión de BNO1 se establecen combinando fluidos corporales o extractos de células tomadas de sujetos mamíferos normales, preferiblemente humanos, con un anticuerpo de BNO1 en condiciones adecuadas para la formación de complejos. La cantidad de formación de complejo convencional se puede cuantificar mediante varios métodos, preferiblemente por medios fotométricos. Las cantidades de BNO1 expresadas en muestras de un sujeto, un testigo y en muestras de la enfermedad procedentes de tejidos de biopsias, se comparan con los valores estándar. La desviación entre los valores estándar y los del sujeto establece los parámetros para diagnosticar una enfermedad.

Una vez que a un individuo se le ha diagnosticado un trastorno, se pueden iniciar los tratamientos efectivos. Estos pueden incluir la administración de un agonista selectivo del BNO1 mutante, a fin de restablecer su función hasta un nivel normal, o la introducción de BNO1 de tipo silvestre, especialmente a través de métodos de terapia génica, tal y como se ha descrito anteriormente. Típicamente, se puede administrar un vector capaz de expresar el gen BNO1 de longitud completa apropiado o un fragmento o un derivado del mismo. En un método alternativo a la terapia, un polipéptido de BNO1 sustancialmente purificado y un vehículo farmacéuticamente aceptable se pueden administrar tal y como se ha descrito anteriormente o se pueden administrar fármacos que pueden sustituir la función de BNO1, o que imitan la acción de BNO1.

En el tratamiento de trastornos que se ha mostrado que están asociados con el aumento de la expresión y/o la actividad de BNO1, el individuo afectado se puede tratar con un antagonista selectivo, tal como un anticuerpo de la proteína correspondiente o una sonda no codificante (complementaria) para el gen correspondiente, tal y como se ha descrito anteriormente, o mediante el uso de fármacos que pueden bloquear la acción de BNO1.

Micromatrices

En otra realización, ADNc completos, oligonucleótidos o fragmentos más largos obtenidos a partir de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos descritas en este documento, se pueden utilizar como dianas en una micromatriz. La micromatriz se puede utilizar para controlar simultáneamente el nivel de expresión de un gran número de genes y para identificar variantes genéticas, mutaciones y polimorfismos. Esta información se puede utilizar para determinar la función génica, para comprender las bases genéticas de un trastorno, para diagnosticar o pronosticar un trastorno y para desarrollar y controlar las actividades de agentes terapéuticos. Las micromatrices se pueden preparar, utilizar y analizar usando métodos conocidos en la técnica. (Por ejemplo, véase Schena et al., 1996; Heller et al., 1997).

Hospedadores transformados

La presente invención también proporciona la producción de modelos animales no humanos modificados genéticamente (con gen desactivado (del inglés “knock-out”), con inserción de secuencias génicas (del inglés “knock-in”) y transgénicos) transformados con las moléculas de ADN de la invención. Estos animales son útiles para el estudio de la función del gen BNO1, para estudiar los mecanismos de una enfermedad en lo que se refiere al gen BNO1, para escrutar compuestos farmacéuticos candidatos, para la creación de cultivos de células de mamífero explantados que expresan la proteína o una proteína mutante y para la evaluación de posibles intervenciones terapéuticas.

El gen BNO1 se puede haber inactivado mediante una deleción desactivadora del gen y, por lo tanto, se proporcionan animales no humanos modificados genéticamente con gen desactivado.

Las especies animales que son adecuadas para uso en los modelos animales de la presente invención son ratas, ratones, hámsteres, cobayas, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos y primates no humanos, tales como monos y chimpancés. Para los estudios iniciales, son muy deseables los ratones y las ratas genéticamente modificados, debido a su mantenimiento relativamente sencillo y a una vida más corta. Para ciertos estudios, levaduras o invertebrados transgénicos pueden ser adecuados y preferidos porque permiten una detección rápida y proporcionan un manejo mucho más fácil. Para estudios a largo plazo, los primates no humanos pueden ser deseables debido a su similitud con los seres humanos.

Para crear un modelo animal con BNO1 mutado, se pueden emplear varios métodos. Estos incluyen la generación de una mutación específica en un gen animal homólogo, la inserción de un gen humano de tipo silvestre y/o un gen animal humanizado por recombinación homóloga, la inserción de un gen humano mutante (única o múltiple) en forma de estructuras artificiales de ADNc genómico o minigén, usando elementos promotores de tipo silvestre, mutantes o artificiales, o la inserción de fragmentos modificados artificialmente del gen endógeno mediante recombinación homóloga. Las modificaciones incluyen la inserción de codones de detención mutantes, la deleción de secuencias de ADN o la inclusión de elementos de recombinación (sitios lox p) reconocidos por enzimas tales como la recombinasa Cre.

Para crear un ratón transgénico, el cual se prefiere, una versión mutante de BNO1 se puede insertar en una línea germinal de ratón utilizando técnicas convencionales de microinyección de ovocitos o transfección o microinyección dentro de células madre embrionarias. Alternativamente, si se desea inactivar o reemplazar el gen BNO1 endógeno, se puede aplicar una recombinación homóloga utilizando células madre embrionarias murinas.

Para la inyección de ovocitos, una o varias copias del gen BNO1 mutante o de tipo silvestre se pueden insertar en el

pronúcleo de un ovocito de ratón recién fertilizado. El ovocito se reimplanta después en una madre adoptiva seudopreñada. Los ratones nacidos vivos se pueden seleccionar entonces según los integrantes, utilizando el análisis del ADN de la cola, buscando la presencia de secuencias de genes BNO1 humanos. El transgén puede ser una secuencia genómica completa inyectada como YAC, BAC, PAC o bien otro fragmento de ADN cromosómico, un ADNc ya sea con el promotor natural o con un promotor heterólogo, o un minigén que contiene toda la región codificadora y otros elementos que son necesarios para una expresión óptima.

De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona el uso de animales no humanos modificados genéticamente, tal como se ha descrito anteriormente, para el escrutinio de compuestos farmacéuticos candidatos.

La identificación de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos de ambas isoformas de BNO1, permite la identificación de sustratos proteicos específicos de BNO1, utilizando estudios de interacción de proteínas, tales como el análisis del doble híbrido en levadura, como lo entenderán los expertos en la técnica. Estos sustratos proteicos serían dianas para la degradación a través de la ubicuitinación mediada por la ligasa ubicuitina-E3 que contiene BNO1. Cada isoforma de BNO1 puede compartir sustratos proteicos comunes o puede interaccionar con sustratos específicos de la isoforma.

También describimos un complejo de BNO1 de tipo silvestre y un sustrato específico de BNO1 que está destinado a una degradación mediante ubicuitinación.

También describimos un complejo de BNO1 y proteínas del complejo de ligasa ubicuitina-E3

También describimos un complejo de BNO1 de tipo silvestre y la proteína Skp1.

También describimos un ácido nucleico que codifica un polipéptido mutante de BNO1 que no puede formar un complejo con las proteínas de tipo silvestre con las que BNO1 de tipo silvestre forma un complejo. Típicamente, una de estas proteínas es Skp1, mientras que otras son sustratos proteicos específicos de BNO1 destinados a la degradación mediante ubicuitinación.

También describimos un polipéptido mutante de BNO1 que no puede formar un complejo con proteínas de tipo silvestre con las que BNO1 de tipo silvestre forma un complejo. Típicamente, una de estas proteínas es Skp1 mientras que otras son sustratos proteicos específicos de BNO1 destinados a la degradación mediante ubicuitinación.

También describimos el uso de complejos, tal y como se ha descrito anteriormente, en el escrutinio de compuestos farmacéuticos candidatos. También se puede escrutar en busca de un fármaco que sustituya la actividad de BNO1 en un paciente que carece de BNO1.

Se entenderá claramente que, aunque en el presente documento se hace referencia a un número de publicaciones de la técnica anterior, esta referencia no constituye una admisión de que cualquiera de estos documentos forme parte del conocimiento general común en la técnica, en Australia o en cualquier otro país. En toda esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende" se utilizan en un sentido no exclusivo, salvo cuando el contexto requiere lo contrario.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Representación esquemática de tumores con pérdida alélica intersticial y terminal en el brazo del cromosoma 16q en las dos series de muestras tumorales. Los marcadores polimórficos se enumeran de acuerdo con su orden en 16q desde el centrómero al telómero y los marcadores utilizados para cada serie se indican con X. Los números de identificación de tumores se muestran en la parte superior de cada columna. A la derecha de la figura, se indican las tres regiones más pequeñas de pérdida de heterocigosidad.

Figura 2. Análisis por transferencia Northern del gen BNO1. El tamaño del gen BNO1 en kilobases se indica mediante una flecha en el lado izquierdo del Northern. La transferencia contenía ARN de los siguientes tejidos: 1: Glándula mamaria; 2: Médula ósea; 3: Testículo; 4: Ovario; 5: Útero; 6: Próstata; 7: Estómago; 8: Vejiga, 9: Médula espinal; 10: Cerebro;

11: Páncreas; 12: Tiroides. Una banda aislada de aproximadamente 3,6 Kb se observó en todos los tejidos excepto en la médula ósea. La expresión más potente del gen se observó en el cerebro.

Figura 3. Alineación de la secuencia de F-box de BNO1 en comparación con la secuencia de consenso de F-box de acuerdo con la descripción de Kipreos y Pagano (2000). Se utiliza el código de aminoácidos de una sola letra. Las mayúsculas en negrita indican los residuos que se encuentran en más del 40% de las secuencias de F-box; las mayúsculas sin negrita indican residuos que se encuentran en el 20-40% de las secuencias de F-box; las letras minúsculas en negrita indican los residuos que se encuentran en el 15-19% de las F-box; las letras minúsculas sin negrita indican residuos encontrados en el 10-14% de las F-box. La línea superior representa el motivo de F-box de BNO1 que indica un alto grado de homología con el de consenso.

Figura 4. Análisis de la expresión mediante RT-PCR cuantitativa del gen BNO1 en líneas celulares de cáncer de mama. El número de copias de BNO1 en el ADNc de glándula mamaria normal (mama) se estableció arbitrariamente para un “valor de referencia” de 1.0e+06 (barra blanca). Los números de copias de ADNc de líneas celulares de cáncer de mama y de otros tejidos normales se calcularon en relación con el “valor de referencia”. Las barras de color gris represen

tan la regulación a la baja de la expresión en número de veces del amplicón, en comparación con la referencia del valor de referencia, mientras que las barras de color negro representan la regulación al alza de la expresión en número de veces del amplicón de la referencia del valor de referencia. Nota: las líneas celulares replicadas (a y b) representan cultivos celulares independientes, el aislamiento del ARN total y las reacciones de transcripción inversa. Las réplicas servían como otro nivel de control para vigilar la variabilidad de la expresión genética como resultado de las diferencias en las eficacias de la confluencia celular, la integridad del ARN total y la transcripción inversa.

Modos de realizar la invención

EJEMPLO 1: Recogida de material a partir de pacientes con cáncer de mama

Para este estudio se analizaron dos series de pacientes con cáncer de mama. La clasificación histopatológica de cada espécimen tumoral la realizaron nuestros colaboradores de acuerdo con los criterios de la Organización Mundial de la Salud (OMS, 1981). Los pacientes se catalogaron histopatológicamente según el método modificado de Bloom y Richardson (Elston y Ellis, 1990) y el material de los pacientes fue obtenido con la aprobación de los Comités locales deÉtica Médica. El ADN del tejido tumoral y el ADN de sangre periférica de la misma persona se aislaron tal como se ha descrito anteriormente (Devilee et al., 1991) utilizando protocolos convencionales de laboratorio.

La serie 1 consistía en 189 pacientes operados entre 1986 y 1993 en tres hospitales holandeses, una universidad holandesa y dos centros periféricos. El tejido tumoral se congeló rápidamente a las pocas horas de la resección. Para el aislamiento del ADN, se seleccionó un bloque de tejido únicamente si contenía por lo menos 50% de células tumorales, tras el examen de secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina, realizado por un patólogo. Los bloques de tejido que contenían menos de 50% de células tumorales se excluyeron de un análisis adicional.

La serie 2 consistía en 123 pacientes operados entre 1987 y 1997 en el Centro Médico Flinders en Adelaida, Australia. De todos ellos, 87 se recogieron como especímenes frescos pocas horas después de la resección quirúrgica, confirmados como tejido maligno por un análisis patológico, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70ºC. Las 36 muestras restantes de tejido tumoral se obtuvieron a partir de bloques de tumores de archivo embebidos en parafina. Antes del aislamiento del ADN, las células tumorales se microdiseccionaron desde secciones de tejido montadas en portaobjetos de vidrio, con el fin de obtener al menos 80% de células tumorales. En algunos casos, no había sangre periférica disponible, de tal manera que en su lugar se utilizó tejido de ganglios linfáticos no malignos embebido en parafina, identificado patológicamente.

EJEMPLO 2: Análisis de LOH de marcadores del cromosoma 16q en muestras de cáncer de mama.

Con el fin de identificar la posición de los genes asociados con el cáncer de mama, se llevó a cabo el análisis de LOH de muestras tumorales. Un total de 45 marcadores genéticos que cartografían el cromosoma 16 se utilizaron para el análisis de LOH del tumor de mama, y se emparejaron con muestras normales de ADN recogidas para este estudio. La Figura 1 indica para qué serie tumoral se utilizaron y su posición citogenética. Los detalles relativos a todos los marcadores se pueden obtener a partir de la base de datos del genoma (GDB) en http://www.gdb.org. El orden físico de los marcadores con respecto uno al otro se determinó a partir de una combinación de información en GDB, cartografiando sobre un mapa híbrido celular somático del cromosoma 16 (Callen et al., 1995) y a través de la información de la secuencia genómica.

Se emplearon cuatro métodos alternativos para el análisis de LOH:

1) Para los marcadores de RFLP y VNTR, se utilizó la transferencia Southern para someter a ensayo el desequilibrio alélico. Estos marcadores se utilizaron solo sobre un subconjunto de muestras. Los métodos utilizados eran tal y como se han descrito previamente (Devilee et al., 1991).

2) Los marcadores de microsatélites fueron amplificados a partir de ADN tumoral y normal usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) incorporando metodologías convencionales (Weber y May, 1989; Sambrook et al., 1989). Una reacción típica consistía en 12 μl y contenía 100 ng de molde, 5 pmol de ambos cebadores, 0,2 mM de cada dNTP, 1 μCurie[α-32P]dCTP, MgCl2 1,5 mM, 1,2 μl de tampón Supertaq (HT biotechnologies). Se utilizó un formador de imágenes de fósforo de tipo 445 SI (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) para cuantificar los resultados ambiguos. En estos casos, el factor de desequilibrio alélico (FDA) se determinó como el cociente de las relaciones de altura de pico de la pareja de ADN normal y tumoral. El umbral de desequilibrio alélico se definió como una reducción del 40% de un alelo, de acuerdo con un FDA ≥1,7 o ≤0,59. Este umbral está de acuerdo con la selección de bloques de tejidos tumorales que contenían al menos 50% de células tumorales con un intervalo de error del 10%. El umbral de retención se ha determinado previamente dentro de un intervalo de 0,76 a 1,3 (Devilee et al., 1994). Esto deja un intervalo de FDAs (0,58 -0,75 y 1,31 -1,69) para el que no se ha tomado ninguna decisión definitiva. Esta "zona gris" se indica por cuadros grises en la Figura 1 y los tumores que solo tienen valores en la "zona gris" se descartaron completamente del análisis.

3) El tercer método para determinar el desequilibrio alélico era similar al segundo método anterior, sin embargo, se omitió dCTP marcada radiactivamente. En su lugar, se realizó una PCR de marcadores de microsatélites polimórficos con uno de los cebadores de la PCR marcado con fluorescencia con FAM, TET o HEX. El análisis de los productos de la PCR generados se realizó en un secuenciador automático ABI 377 (PE Biosystems), utili

zando geles de poliacrilamida al 6% que contenían urea 8 M. Los valores de la altura de los picos y los tamaños de los picos se analizaron con el programa GeneScan (PE Biosystems). Se utilizaron los mismos umbrales para desequilibrio alélico, retención y zonas grises que en el análisis radiactivo.

4) También se utilizó un sistema basado en fluorescencia alternativa. En este caso, los cebadores de la PCR se marcaron con fluoresceína o hexaclorofluoresceína. Los volúmenes de la reacción de PCR eran de 20 μl e incluían 100 ng de molde, 100 ng de cada cebador, 0,2 mM de cada dNTP, MgCl2 1-2 mM, 1X tampón Ampli-Taq Gold y 0,8 unidades de enzima AmpliTaq Gold (Perkin Elmer). Las condiciones de la ciclación eran 10 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, seguidos por 25 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 55ºC durante 30 segundos, 72ºC durante 1 minuto, con una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. Los amplímeros de la PCR fueron analizados en un secuenciador automatizado ABI 373 (PE Biosystems), utilizando el programa GeneScan (PE Biosystems). El intervalo del umbral de FDA para la retención alélica se definió como 0,61 -1,69, la pérdida alélica como ≤0,5 o ≥2,0, o la "zona gris" como 0,51 -0,6

o 1,7 -1,99.

Los tres primeros métodos se aplicaron a la primera serie de tumores mientras que el último método se adoptó para la segunda serie de muestras tumorales. Para el análisis estadístico, se realizó una comparación de los datos de desequilibrio alélico para la validación de los diferentes métodos de detección y de las diferentes series tumorales, utilizando la prueba de Chi-cuadrado.

La identificación de la región más pequeña de solapamiento (SRO) implicada en LOH es instrumental para reducir las posibilidades de la posición del gen que es diana de LOH. La Figura 1 muestra los resultados de LOH para muestras tumorales, que muestran pequeñas regiones de pérdida (es decir, LOH intersticial y telomérica) y no incluye muestras que mostraron LOH compleja (pérdida y retención alternas de marcadores). Al comparar los dos grupos de muestras, aparecen al menos tres regiones compatibles, estando dos en el telómero en la banda 16q24.3 y una en 16q22.1. La región en 16q22.1 se define por los marcadores D16S398 y D16S301 y se basa en los casos de LOH intersticial observados en tres tumores de la serie 1 (239/335/478) y un tumor de la serie 2 (237). En el telómero (16q24.2 -16q24.3), la primera región se define por los marcadores D16S498 y D16S3407 y se basa en cuatro tumores de la serie 2 (443/75/631/408), mientras que la segunda región (16q24.3) se extiende desde D16S3407 al telómero y se basa en un tumor de la serie 1 (559) y tres de la serie 2 (97/240/466). La LOH limitada al telómero pero que implicaba ambas regiones identificadas en este sitio, se pudo encontrar en 17 muestras tumorales adicionales.

Otros estudios han mostrado que el brazo largo del cromosoma 16 también es una diana para la LOH en tumores de próstata, de pulmón, hepatocelular, de ovario, de rabdomiosarcoma y de Wilms. Un análisis detallado de los carcinomas de próstata ha revelado un solapamiento en las regiones más pequeñas de LOH observadas en este tipo de cáncer, con las observadas con cáncer de mama, lo que sugiere que 16q alberga un gen implicado en muchos tipos de tumores.

EJEMPLO 3: Construcción de un mapa físico de 16q24.3

Para identificar nuevos genes candidatos de cáncer de mama que se cartografían en las regiones de solapamiento más pequeñas en 16q24.3, se necesitaba un cóntigo basado en clones para el mapa físico que cubriera esta región. Al comienzo de esta fase del proyecto, los fragmentos de ADN genómico clonados, utilizados más comúnmente y de fácil acceso estaban contenidos en vectores lambda, cósmidos o YAC. Durante la construcción de todos los mapas físicos del cromosoma 16, clones procedentes de una variedad de genotecas de YAC se incorporaron en el mapa (Doggett et al., 1995). Estos incluían clones procedentes de una genoteca de YAC específica del cromosoma 16 clasificada por flujo (McCormick et al., 1993), de las genotecas CEPH Mark I y MegaYAC y de una genoteca de YAC de medio-telómero (Riethman et al., 1989). Un análisis de STS y Southern detallado de los clones de YAC que cartografiaban 16q24.3, estableció que muy pocos estaban localizados entre el punto de ruptura del híbrido celular somático CY2/CY3 y el telómero del brazo largo. Sin embargo, aquellos que se habían localizado en esta región proporcionaron resultados incompatibles con la cartografía y se sospechó que se habían reorganizado o eliminado. El hecho de que los clones de YAC producen sustratos de secuenciación débiles, junto con la dificultad para aislar el ADN humano clonado, la opción inicial preferida fue un mapa físico basado en clones de cósmidos.

Se había construido previamente una genoteca de cósmidos específicos del cromosoma 16 clasificada por flujo (Longmire et al., 1993), con clones de cósmidos individuales reticulados en matrices de alta densidad sobre membranas de nailon. Estos filtros contenían colectivamente ~15.000 clones que representaban una cobertura de aproximadamente 5,5 veces el cromosoma 16. Los cósmidos individuales que cartografiaban las regiones decisivas en 16q24.3, se identificaron mediante la hibridación de estas membranas con marcadores identificados por cartografiar la región mediante este estudio y estudios anteriores. La estrategia para alinear clones de cósmidos solapantes se basa en su contenido en STS y en el patrón de digestión con endonucleasas de restricción. Aquellos clones que se extendían lo más lejos posible de cada cóntigo inicial, se utilizaron después para recorrer el cromosoma mediante la hibridación de nuevo de los extremos de estos cósmidos con las matrices de cósmidos de alta densidad. Este proceso continuó hasta que todos los cóntigos iniciales estaban unidos y, por lo tanto, la región que definía la posición de los genes supresores de tumores de cáncer de mama estaría contenida dentro del mapa. Los clones de cósmidos individuales que representaban el mínimo solapamiento posible en el cóntigo, se utilizaron a continuación para la identificación de secuencias transcritas mediante atrapamiento de exones y para la secuenciación genómica.

El cromosoma 16 se clasificó a partir del híbrido CY18 de células somáticas de ratón/humano, que contenía este cromosoma como el único ADN humano, y el ADN de CY18 parcialmente digerido con Sau3A se ligó en el sitio de clonación de BamHI del vector del cósmido sCOS-1. Todas las matrices se hibridaron y se lavaron usando métodos descritos en Longmire et al. (1993). Resumiendo, los 10 filtros se hibridaron previamente en 2 botellas grandes durante al menos 2 horas en 20 ml de una solución que contenía 6X SSC, EDTA 10 mM (pH 8,0); 10X solución de Denhardt, 1% de SDS y 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a 65ºC. Las hibridaciones durante una noche con sondas marcadas con [α-32P]dCTP se realizaron en 20 ml de solución de hibridación de nuevo aporte a 65ºC. Los filtros se lavaron secuencialmente en soluciones de 2X SSC; 0,1% de SDS (lavado a temperatura ambiente), 2X SSC, 0,1% de SDS (temperatura ambiente durante 15 minutos), 0,1X SSC, 0,1% de SDS (temperatura ambiente durante 15 minutos) y 0,1X SSC, 0,1% de SDS (dos veces durante 30 minutos a 50ºC si es necesario). Las membranas se expusieron a -70ºC entre 1 y 7 días.

Los marcadores iniciales utilizados para escrutar la matriz de cósmidos eran los conocidos por estar localizados por debajo de los puntos de ruptura de las células híbridas somáticas CY2/CY3 y el telómero del brazo largo (Callen et al., 1995). Estos incluían tres genes, CMAR, DPEP1 y MC1R; el marcador de microsatélites D16S303; un fragmento del extremo del cósmido 317E5, que contenía el gen BBC1; y cuatro clones de ADNc, yc81e09, yh09a04, D16S532E y ScDNA-C113. El clon de ADNc del consorcio IMAGEN, yc81e09, se obtuvo a través del escrutinio de una genoteca de ADNc cebada con oligo-dT de cerebro infantil, normalizada (Soares et al., 1994), con el inserto procedente del clon de ADNc ScDNA-A55. Tanto el clon ScDNA-A55 como el ScDNA-C113 se aislaron originalmente a partir de una genoteca de ADNc heteronuclear cebada con hexámero, construida a partir del híbrido CY18 de células somáticas de ratón/humano (Whitmore et al., 1994). El clon de ADNc de IMAGEN yh09a04 se identificó a partir de una selección de ADNc directa del cósmido 37B2 que se había observado previamente que se cartografiaba entre el punto de ruptura CY18A(D2) y el telómero 16q. El EST, D16S532E, también se cartografiaba en la misma región. Con posterioridad a estos escrutinios iniciales, se utilizaron fragmentos de restricción que representaban los extremos de cósmidos para identificar clones solapantes adicionales.

El conjunto de cóntigos se basaba en métodos descritos previamente (Whitmore et al., 1998). Más tarde, durante la construcción del mapa físico, se pusieron a disposición genotecas genómicas clonadas en vectores BAC o PAC (Genome Systems o Rosewell Park Cancer Institute). Estas genotecas se escrutaron para ayudar en el recorrido por el cromosoma o cuando se toparon con huecos que no se pudieron puentear usando los filtros de cósmidos. Todos los filtros de BAC y PAC se hibridaron y se lavaron de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Inicialmente, las membranas se hibridaron previamente por separado en botellas grandes de vidrio durante al menos 2 horas en 20 ml de 6X SSC; 0,5% de SDS; 5X Denhardt; 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado a 65ºC. Las hibridaciones durante una noche con sondas marcadas con [α-32P]dCTP se realizaron a 65ºC en 20 ml de una solución que contenía 6X SSC; 0,5% de SDS; 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. Los filtros se lavaron secuencialmente en soluciones de 2X SSC, 0,5% de SDS (temperatura ambiente, 5 minutos), 2X SSC, 0,1% de SDS (temperatura ambiente, 15 minutos) y 0,1X SSC, 0,5% de SDS (37ºC 1 hora si es necesario). Los clones de PAC o BAC identificados se alinearon con el cóntigo existente basándose en su patrón de enzimas de restricción o formaban cóntigos únicos que se extendían mediante el escrutinio de filtros adicionales.

Cuando se observó que el microsatélite D16S303 era el marcador más telomérico en la región 16q24.3 (Callen et al., 1995), se utilizó la hibridación fluorescente in situ (FISH) con cromosomas normales en metafase, utilizando cósmidos completos cartografiados en las proximidades de este marcador, para definir el límite telomérico del cóntigo. El ADN del cósmido completo se sometió a desplazamiento de mellas con biotina-14-dATP y se hibridó in situ con una concentración final de 20 ng/μl con metafases de 2 machos normales. El método FISH se había modificado en comparación con el previamente descrito (Callen et al., 1990). Los cromosomas se tiñeron antes del análisis tanto con yoduro de propidio (como tinción de contraste) como con DAPI (para la identificación de cromosomas). Imágenes de preparaciones en metafase se capturaron por una cámara CCD refrigerada, utilizando la colección de imágenes CytoVision Ultra y un sistema de mejora (Applied Image Int. Ltd.). El cósmido 369E1 mostraba señales fluorescentes claras en el telómero del brazo largo del cromosoma 16. Sin embargo, esta sonda también proporcionó una señal clara en los telómeros de los brazos cromosómicos 3q, 7p, 9q, 11p y 17p. Por el contrario, el cósmido 439G8, que se cartografió próximo a D16S303, proporcionó señales fluorescentes solo en 16qter sin ninguna señal compatible detectada en otros telómeros. Estos resultados nos han permitido establecer el marcador de microsatélites D16S303 como el límite de la transición desde la eucromatina hasta las repeticiones subteloméricas, proporcionando un límite telomérico para el cóntigo (Whitmore et al., 1998).

Se ha establecido un mapa físico de alta densidad que consistía en clones de cósmido, BAC y PAC, el cual se extiende aproximadamente 3 Mb desde el telómero del brazo largo del cromosoma 16. Este cóntigo se extiende más allá del punto de ruptura del híbrido celular somático CY2/CY3 e incluye las 2 regiones de LOH mínima, identificadas en la región 16q24.3 en muestras de cáncer de mama. Hasta la fecha, existe un solo hueco de tamaño desconocido en el cóntigo y se cerrará mediante experimentos adicionales de extensión del cóntigo. El grado de cobertura ha permitido la identificación del grupo de clones con mínimo solapamiento posible que se utilizaron posteriormente como moldes para métodos de identificación de genes, tales como la captura de exones y la secuenciación de ADN genómico.

EJEMPLO 4: Identificación de los genes candidatos de cáncer de mama mediante análisis de la secuencia de ADN genómico.

Clones de BAC y PAC seleccionados con un mínimo solapamiento a partir del cóntigo del mapa físico, se secuenciaron con el fin de ayudar en la identificación de los genes candidatos de cáncer de mama. Se preparó ADN a partir de clones seleccionados utilizando un kit para aislamiento de ADN de gran tamaño (Qiagen). Aproximadamente el 25-50 μg de ADN se cortó a continuación mediante nebulización (10 psi durante 45 segundos) y se establecieron extremos romos utilizando metodologías convencionales (Sambrook et al., 1989). A continuación, las muestras se aplicaron sobre un gel de agarosa con el fin de aislar el ADN en el intervalo de tamaño de 2-4 kb. Estos fragmentos se limpiaron eliminando la agarosa utilizando columnas QIAquick (Qiagen), se ligaron en puc18 y se utilizaron para transformar células de E. coli DH10B o DH5a competentes. Se aisló el ADN a partir de clones transformados y se secuenció utilizando cebadores específicos del vector en un secuenciador ABI377. El análisis de la secuencia genómica se realizó empleando un programa informático PHRED, PHRAP y GAP4 en una estación de trabajo SUN. Para ayudar en la generación de cóntigos grandes de la secuencia genómica, la información presente en la base de datos de secuencias genómicas de gran productividad (htgs) en el NCBI, fue incorporada en la fase de ensamblado del análisis de la secuencia. En los cóntigos resultantes de la secuencia genómica se enmascararon las repeticiones y se analizaron usando el algoritmo BLAST (Altschul et al., 1997) para identificar la homología de nucleótidos y proteínas con secuencias en las bases de datos de GenBank no redundantes y de EST en el NCBI. La secuencia genómica también se analizó para estudiar la estructura génica prevista, utilizando el programa GENSCAN.

Los clones de ADNc homólogos del consorcio IMAGEN fueron adquiridos de Genome Systems y se secuenciaron. Estos tramos más largos de secuencia se compararon después con genes conocidos mediante comparaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos, utilizando los procedimientos anteriores. Cualquier secuencia que se expresa en la mama se considera que es un gen candidato de cáncer de mama. Aquellos genes cuya función podría implicarlos en el proceso carcinogénico, tal y como se había previsto a partir de las búsquedas de homología con proteínas conocidas, fueron tratados como los candidatos más probables. La evidencia de que un candidato particular es el gen responsable, proviene de la identificación de alelos defectuosos del gen en individuos afectados o a partir del análisis de los niveles de expresión de un gen candidato particular en muestras de cáncer de mama, en comparación con tejidos normales testigos.

EJEMPLO 5: Identificación de la secuencia de BNO1

Análisis de la secuencia genómica

Secuencias procedentes de clones BAC que se cartografiaban cerca del punto de ruptura de CY2/CY3, se ensamblaron y se utilizaron en búsquedas de homología con BLASTN en la base de datos dbEST del NCBI (http://www.acbi.nlm.nih.gov). Un gran número de clones de ADNc, se identificaron por formar parte de la secuencia en esta región y éstos se pudieron caracterizar adicionalmente en distintas agrupaciones de UniGene.

El clon de ADNc humano de IMAGE, 46795, correspondiente a la agrupación de UniGene Hs.7970, se secuenció y se utilizó en otras búsquedas de homología en bases de datos. Esto identificó un clon de ADNc solapante presente en la base de datos no redundante (GenBank número de orden AL117444) que extendía la secuencia del clon 46795 más allá de 5'. Como esta secuencia 5' adicional también estaba presente en la secuencia genómica situada en 5' de la secuencia del clon 46795, se confirmó que AL117444 lo más probablemente pertenecía al transcrito Hs.7970. Para verificar este hecho, se realizó una RT-PCR.

Brevemente, ARNm poliA+ procedente de una glándula mamaria normal (Clontech) se cebó inicialmente con un cebador oligo-dT y se transcribió de forma inversa utilizando el kit de RT de OmniScript (Qiagen) de acuerdo con las condiciones del fabricante. Las reacciones de control se incluyeron para cada molde de ARN en las que se omitía la transcriptasa inversa de la etapa de síntesis del ADNc. Esto era para determinar la presencia de cualquier contaminación del ADN genómico en las muestras de ARN. La primera hebra de ADNc resultante se amplificó con PCR usando los cebadores AL-1 (específico para AL117444; SEQ ID NO: 20) y 7970-1 (específico para el extremo 3' de Hs.7970; SEQ ID NO: 21) utilizando el kit de HotStarTag (Qiagen) en un volumen de reacción de 10 μl durante 35 ciclos. Inicialmente, los cebadores para el gen de mantenimiento testigo, Esterasa D (SEQ ID Números: 22 y 23) se utilizaron en una reacción distinta para confirmar la presencia de moldes de ADNc para cada reacción de transcripción inversa. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 1. Estos experimentos confirmaron que el clon de ADNc AL117444 y de IMAGE 46795, pertenecían al transcrito Hs.7970.

Análisis Northern

Para determinar el tamaño del gen correspondiente a Hs.7970, una transferencia Northern poliA+ obtenida a partir de Clontech se investigó con una porción del gen que se había generado mediante PCR usando los cebadores BNO1-2 (SEQ ID NO: 24) y BNO1-3 (SEQ ID NO: 25). La Tabla 1 enumera las secuencias de los cebadores utilizados. Las hibridaciones se llevaron a cabo en 10 ml de solución ExpressHyb (Clontech) durante una noche a 65ºC. Los filtros se lavaron de acuerdo con las condiciones del fabricante. La Figura 2 muestra los resultados de la hibridación. Una sola banda de aproximadamente 3,6 kb se detectó en la glándula mamaria, testículo, ovario, útero, próstata, estómago, vejiga, médula espinal, cerebro, páncreas y tiroides. La expresión más fuerte del gen se observó en el cerebro. El tamaño del ARNm correspondiente a Hs.7970 tal y como se determinó por la hibridación Northern, indicaba que se necesitaba obtener una secuencia 5' adicional para el gen.

Identificación de la secuencia 5'

Para identificar una secuencia 5' adicional para el transcrito His.7970, se utilizaron secuencias de ADNc presentes en dbEST correspondientes al ortólogo de ratón. El clon de ratón que se extendía más 5' (AU080856) incluía un sitio putativo de inicio de la traducción. La alineación de AU080856 con la secuencia genómica humana que contenía Hs.7970 definía la secuencia humana correspondiente de esta transcripción, hasta un sitio de inicio de la traducción idéntico. Se realizaron otros experimentos de RT-PCR que confirmaron la presencia de esta secuencia 5' en el transcrito Hs.7970 humano. Además, búsquedas adicionales en dbEST blast identificaron clones de ADNc humanos que contenían el extremo 5' del gen (por ejemplo, el clon de IMAGE 3958783).

Experimentos de RT-PCR indicaron también que Hs.7970 existe como una isoforma de corte y empalme alternativos. Esta variante se debe a la inclusión de un exón adicional en marco (exón 2.5) situado entre los exones 2 y 3.

Además, estos experimentos han establecido que el transcrito Hs.7970, denominado BNO1, existe como dos isoformas de corte y empalme alternativos. Una isoforma tiene 3.574 pb de longitud (SEQ ID NO: 1) y está compuesta por 9 exones que abarcan aproximadamente 55 kb de ADN genómico, mientras que la segunda forma de BNO1, que contiene el exón 2.5, tiene 3661 pb de longitud (SEQ ID NO: 3). La Tabla 2 muestra la estructura genómica del gen que indica el tamaño de los intrones y exones. El análisis de las isoformas de BNO1 indica que la isoforma 1 (menos el exón 2.5) tiene un marco de lectura abierto de 1.617 nucleótidos que codifica una proteína de 539 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). La isoforma 2 (más el exón 2.5) de BNO1 tiene un marco de lectura abierto de 1.704 pb de longitud y codifica una proteína de 568 aminoácidos (SEQ ID NO: 4). Secuencias parciales de ADN genómico que indican uniones de exón/intrón para BNO1, se exponen en SEQ ID Números: 5-11.

EJEMPLO 6: Características de la secuencia de BNO1

Secuencia de nucleótidos

Un gran número de clones de ADNc humano están presentes en dbEST, los cuales representan el gen BNO1. Una observación de los tejidos de estos clones de ADNc se obtuvo a partir de indicaciones de que el gen también se expresa en la glándula suprarrenal, la sangre, el colon, las células germinales, el corazón, el riñón, el hígado, el pulmón, el músculo, la placenta, la membrana sinovial, las amígdalas, el cuello uterino, el tejido linfático y la piel. Estos tejidos son adicionales a los que se ha mostrado que expresan BNO1 por el análisis Northern (por ejemplo, glándula mamaria, testículo, ovario, útero, próstata, estómago, vejiga, médula espinal, cerebro, páncreas y tiroides) y procedimientos de RT-PCR (por ejemplo, glándula mamaria humana).

La secuencia de nucleótidos de BNO1 humano también detecta un gran número de clones de ADNc de ratón, tal y como se ha mencionado anteriormente. El análisis de BLAST in silico de una secuencia de ADN genómico de ratón en la base de datos htgs en el NCBI usando la secuencia de nucleótidos de BNO1 humano, tuvo éxito en la identificación del nucleótido de BNO1 de ratón (SEQ ID NO: 12) y la correspondiente secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13). La homología de los aminoácidos entre los dos genes tiene un valor tan alto como 95% (desde el aminoácido 76 en el exón 1 hasta el aminoácido 369 en el exón 8), lo que sugiere que el gen está muy conservado entre las dos especies.

El análisis de la secuencia genómica humana situada en 3' con respecto al gen BNO1 identificó la presencia de una variedad de agrupaciones UniGene adicionales (Hs.130367, Hs.227170 y Hs.87068) que se ejecutaban en la misma orientación. Experimentos de RT-PCR que empleaban un cebador específico de Hs.130367 (130367-1; SEQ ID NO: 26) y Hs.87068 (87068-1; SEQ ID NO: 27) (véase la Tabla 1 para las secuencias de cebadores) indicaban que estas dos agrupaciones UniGene podrían estar ligadas. La secuenciación del producto de la RT-PCR también identificó la presencia de la agrupación Hs.227170. Otros experimentos de RT-PCR que empleaban un cebador específico de BNO1 (BNO1-1, SEQ ID NO: 28) en combinación con un cebador específico de Hs.130367 (130367-2; SEQ ID NO: 29) establecieron que Hs.130367 también podría estar ligado al gen BNO1 (véase la Tabla 1 para las secuencias de cebadores). Por lo tanto, las tres agrupaciones UniGene situadas en 3’ de BNO1, representan lo más probablemente variantes de este gen que contienen secuencias 3' UTR adicionales. La ausencia de bandas de Northern que se corresponden con el tamaño de estas variantes de BNO1, sugiere que son formas raras del gen. SEQ ID Números: 14-19 representan las secuencias de nucleótidos de estas variantes.

Secuencia de aminoácidos

La secuencia de aminoácidos de BNO1 se utilizó en el análisis in silico para identificar proteínas homólogas con el fin de establecer la función del producto génico. El análisis de la proteína de BNO1 frente a las bases de datos Prosite y PfScan (http://www.isrec.isb-sib.ch/software/PFSCAN_form.html), mostró que las dos isoformas de corte y empalme de esta proteína (SEQ ID Números: 2 y 4) contienen un dominio F-box en el extremo amino terminal con un valor de esperanza altamente significativo de 5.6e-10. La Figura 3 muestra la secuencia de F-box de BNO1 en comparación con la secuencia de consenso de F-box.

F-box es un motivo proteico de aproximadamente 50 aminoácidos que define una familia en expansión de proteínas eucariotas. Las proteínas que contienen F-box son los componentes de reconocimiento del sustrato de los complejos SCF ubicuitina-ligasa. Estos complejos contienen cuatro componentes: Skp1, Culina, Rbx/Roc1/Hrt1 y una proteína Fbox. El motivo de F-box enlaza la proteína F-box a otros componentes del complejo SCF mediante la unión del compo

nente central de SCF, Skp1. Este motivo se encuentra generalmente en la mitad amino de las proteínas y frecuentemente se acopla con otros dominios proteicos en el extremo carboxi-terminal variable de la proteína. Los dominios carboxi terminales más comunes incluyen repeticiones ricas en leucina (LRRs) y dominios WD-40. Existen actualmente tres subdivisiones de la familia de proteínas F-box en función del tipo de motivos carboxi terminales presentes en las secuencias de proteínas. Siguiendo el modelo propuesto por Cenciarelli et al. (1999) y Winston et al. (1999), la nomenclatura adoptada por la Organización del Genoma Humano especifica las F-box que contienen LRRs como FBXL, las que contienen repeticiones WD como FBXW y las que carecen de todos los dominios conocidos de interacción proteica, como FBXO. El análisis de la secuencia de BNO1 no pudo identificar motivos de proteínas adicionales presentes en el gen, lo que indica que BNO1 forma parte de la clase FBXO de las proteínas F-box.

La vía de degradación del proteasoma dependiente de ubicuitina es un mecanismo importante para regular la abundancia de proteínas en organismos eucariotas. Se ha mostrado que una amplia variedad de proteínas están reguladas por este mecanismo e incluyen oncogenes, genes supresores de tumores, factores de transcripción y otras moléculas de señalización (Hershko y Ciechanover, 1998; Baumeister et al., 1998). Estas proteínas influyen sobre una serie de procesos celulares importantes tales como la regulación del ciclo celular y la apoptosis, la modulación de las respuestas inmunes e inflamatorias, el desarrollo y la diferenciación. La amplia gama de proteínas y de procesos que están regulados por la ubicuitinación, sugiere que patologías derivadas de una interrupción del proceso de ubicuitinación también serán diversas. Por ejemplo, hay un precedente de esto en los trastornos neurodegenerativos. Parkin, una proteína mutada en formas hereditarias de la enfermedad de Parkinson, es una ligasa E3 de ubicuitina (Shimura et al., 2000) y en la enfermedad de Alzheimer se ha identificado una ubicuitinación inadecuada de las proteínas cerebrales (López Salón et al., 2000).

El proceso de ubicuitinación comienza con la adición de restos de ubicuitina (ubicuitinación) a proteínas diana y continúa con un proceso de múltiples etapas, cuyo punto final es la proteólisis de sustratos poliubicuitinados a través de un complejo multiproteico de 26S (Haas y Siepmann, 1997; Hochstrasser, 1996). La ubicuitinación de sustratos que son diana para la degradación requiere 3 clases de enzimas: las enzimas activadoras de ubicuitina (E1), las enzimas que se conjugan con ubicuitina (E2) y las ligasas de ubicuitina (E3). Las proteínas E3 tienen una función esencial en la progresión del ciclo celular. Se ha observado que los complejos SCF (una clase de ligasas E3) regulan la transición de la fase G1-S (revisado en Peters, 1998). Una amplia variedad de dianas de SCF se ha descrito e incluyen ciclinas de la fase G1, inhibidores de cinasas dependientes de ciclina, factores de replicación del ADN, factores de transcripción que favorecen la progresión del ciclo celular y otras proteínas celulares importantes. Las secuencias presentes en la región carboxi terminal variable de las proteínas F-box permiten, por lo tanto, la captación de sustratos específicos para la ubicuitinación y la degradación posterior.

Estudios recientes de la proteína supresora de tumores de Von Hippel-Lindau (VHL) han mostrado que forma parte de un complejo que actúa como una ligasa E3 de ubicuitina-proteína (Zaibo et al., 2001). La proteína VHL se une al complejo de la ligasa para dirigirse a proteínas que incluyen HIFα (factor inducible de hipoxia) (Ohh et al., 2000; Cockman et al., 2000) y VDU1 (enzima 1 de desubicuitinación que interacciona con VHL)) (Zaibo et al., 2001). HIFα se ha mostrado que regula genes implicados en la angiogénesis, un proceso decisivo para el crecimiento de tumores (Wang et al., 1995; Semenza, 2000), mientras que VDU1 tiene actividad desubicuitinadora.

La función prevista para BNO1, basada en la presencia del dominio de F-box, indica que el gen puede estar implicado en una amplia gama de procesos celulares que incluyen la regulación del ciclo celular. Junto con el hecho que BNO1 se encuentra en una región de LOH observada en el cáncer de mama y otros tipos de tumores, esto sugiere que BNO1 es un gen candidato ideal para el cáncer de mama.

EJEMPLO 7: Examen del nivel de expresión de BNO1 en líneas celulares de cáncer de mama

Para investigar una posible función de BNO1 en el cáncer de mama, se comparó el nivel de expresión del gen en líneas celulares de cáncer de mama con testigos de tejido normal. El examen de la secuencia genómica que rodea BNO1 muestra que el extremo 5' que incluye el exón 1, es extremadamente rico en GC lo que sugiere la presencia de una isla de CpG. Sin pretender imponer ninguna teoría, se plantea la posibilidad de que existan mecanismos epigenéticos para inactivar la función de BNO1. Una metilación anormal en este sitio puede dar como resultado una regulación a la baja de la transcripción de BNO1 de la copia restante del gen. Estudios recientes han mostrado que este mecanismo ha sido responsable de la inactivación de otros genes supresores de tumores, tales como RB1 (Ohtani-Fujita et al., 1997), VHL (Prowse et al., 1997), MLH1 (Herman et al., 1998) y BRCA1 (Esteller et al., 2000).

Para detectar el nivel de expresión de BNO1 en muestras de cáncer en comparación con testigos normales, se realizó una RT-PCR cuantitativa utilizando cebadores específicos de BNO1. Esta implicaba inicialmente el aislamiento de ARN procedente de líneas celulares de cáncer de mama junto con testigos de líneas celulares apropiadas.

Líneas celulares de cáncer de mama/próstata y extracción de ARN

Las líneas celulares cancerígenas se adquirieron en la ATCC (EE.UU.) y se cultivaron en el medio de cultivo tisular recomendado. Se escogieron líneas celulares de cáncer de mama para el análisis con RT-PCR que mostraban homocigosidad para una serie de marcadores que cartografiaban el cromosoma 16q, indicando un potencial de LOH para este brazo cromosómico. Las células se recogieron de cultivos confluentes y el ARN total se extrajo usando el kit RNAeasy

(Qiagen). Las líneas celulares de cáncer de mama obtenidas para la extracción de ARN eran BT549, MDA-MB-468, CAMA-1, ZR75-30, MDAMB-157, ZR75-1, SKBR3, MDA-MB-231, T47D y MDA-MB-436. La línea celular epitelial de mama normal MCF12A y la línea celular de cáncer de próstata PC3 línea también se adquirieron. El ARNm poliA+ se aisló posteriormente a partir de todas las fuentes, utilizando el sistema de perlas de Oligotex (Qiagen). El ARNm poliA+ procedente de glándula mamaria, próstata, ovario e hígado normales fue adquirido comercialmente (Clontech, EE.UU.).

Transcripción inversa

El ARNm poliA+ se cebó con cebadores oligo-dT y se transcribió de forma inversa utilizando el kit de RT Omniscript (Qiagen) de acuerdo con las condiciones del fabricante. Las reacciones testigo se incluyeron para cada molde de ARN en las que se omitía la transcriptasa inversa de la etapa de síntesis del ADNc. Esto era para determinar la presencia de cualquier contaminación con ADN genómico en las muestras de ARN.

Normalización del ADNc

Se generaron amplicones internos con curva estándar a partir de una mezcla mixta de ADNc de tejido normal, usando el kit de polimerasa de ADN HotStarTaq® (Qiagen). Una mezcla de reacción suficiente para generar >1 μg de ADNc de amplicón contenía 10 μl de tampón 10X PCR (que contenía MgCl2 15 mM), 2 μl de mezcla de dNTPs 10 mM, 0,5 uM de cada cebador, 0,5 μl de 2,5 unidades de polimerasa HotStarTaq (Qiagen), 100 ng de molde de ADNc y agua tratada con DEPC hasta 100 μl. Los ciclos de la amplificación se realizaron del modo siguiente: 94ºC durante 10 minutos, seguido de 35 ciclos a 93ºC durante 20 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 70ºC durante 30 segundos, con una extensión final a 72ºC durante 4 minutos. Los amplicones se purificaron utilizando el kit de extracción en gel QIAquick (Qiagen) de acuerdo con las condiciones del fabricante y las concentraciones se midieron a A260. Los amplicones purificados se diluyeron en serie 10 veces desde 10 ng/μl hasta 1 fg/μl. Estas diluciones sirvieron como patrones internos de concentración conocida para el análisis en tiempo real de amplicones específicos de BNO1, tal y como se describe a continuación.

PCR en tiempo real

Todos los moldes de ADNc se amplificaron utilizando el kit SYBR Green I PCR Master Mix (PE Biosystems, EE.UU.). Las reacciones de PCR tenían un volumen de 25 μl e incluían 12,5 μl de SYBR Green I PCR Master Mix, 0,5 μM de cada cebador, 2 μl de molde de ADNc normalizado (ver más abajo) y 9,5 μl de agua. El análisis con PCR en tiempo real se realizó utilizando el Rotor-Gene® 2000 (Corbett Research, AUS) con las siguientes condiciones de ciclos de amplificación: 94ºC durante 10 minutos seguido por 45 ciclos a 93ºC durante 20 s, 60ºC durante 30 s y 70ºC durante 30 s. Los datos de fluorescencia se adquirieron a 510 nm durante la fase de extensión a 72ºC. El análisis de las curvas de fusión se realizó con una ciclación inicial de 99-50ºC seguida de una monitorización de la fluorescencia durante el calentamiento a 0,2ºC/segundo hasta 99ºC. Antes de la cuantificación en tiempo real, el tamaño y la especificidad del producto se confirmaron mediante tinción con bromuro de etidio de los geles de agarosa al 2,5% después de una electroforesis de las PCRs completadas. Los cebadores específicos del testigo y de BNO1 utilizados para todas las aplicaciones de PCR en tiempo real se muestran en la Tabla 1 y se representan por las SEQ ID Números: 30-41.

Cuantificación de la PCR en tiempo real

Los análisis de cuantificación se realizaron en el sistema de análisis de muestras de ADN Rotor-Gene® (Versión 4.2, fabricado 96). Las curvas estándar se generaron amplificando diluciones en serie de 10 veces (1 μl de 10 pg/μl hasta 1 μl de 1 fg/μl por triplicado) del amplicón estándar interno durante la PCR en tiempo real de los amplicones de BNO1, procedentes de tejidos normales y de líneas celulares de cáncer de mama. Las concentraciones de los amplicones estándar internos se establecieron arbitrariamente en 1.0e+12 copias para patrones de 10 pg hasta 1.0e+08 copias para patrones de 1 fg. Los coeficientes de CT (ciclo umbral) de variación para todas las diluciones estándar internas se promediaron en 2% entre las muestras por triplicado dentro de la misma ejecución y ejecuciones diferentes. El programa informático para la cuantificación RotorGene® generaba una línea de mejor ajuste en el parámetro CT y determinaba el número de copias de amplicones de BNO1 de tejido normal desconocido y de la línea celular de cáncer de mama, mediante la interpolación de la intersección de ruido de fondo-banda de los amplicones de BNO1 frente a los patrones internos con un número de copias conocido.

Normalización y expresión relativa de los datos

Para tener en cuenta la variación de las concentraciones de partida del molde de muestra a muestra, se utilizó una cuantificación del ARN de RiboGreen® (Molecular Probes) para someter a ensayo de precisión 1 μg de ARN de tejido normal y ARN de líneas celulares de cáncer mama, para la síntesis de ADNc. Los niveles de expresión del gen de mantenimiento seleccionado se analizaron a continuación en todas las muestras para determinar el testigo endógeno más preciso para la normalización de datos. Los amplicones de mantenimiento incluían la Esterasa D (Número de orden M13450), la ciclofilina (número de orden X52851), APRT (número de orden M16446) y la ARN polimerasa II (número de orden Z47727). Como la ciclofilina mostraba el perfil de expresión menos variable, el número de copias calculado para BNO1 se dividió entre el número de copias respectivo de amplicones de ciclofilina, para cada línea celular de cáncer de mama y de tejido normal analizados. El número de copias de BNO1 en ADNc normalizado de mama normal se estableció arbitrariamente en un “valor de referencia” de 1.0e+06 copias. El número de copias de ADNc de líneas celulares de cáncer de mama y de otros tejidos normales se calculó en relación con el “valor de referencia”. Los datos se expresaron

como el log del número de copias relativo de ARNm. La Figura 4 muestra los resultados de estos experimentos.

El grado de variación en los niveles de expresión de ARNm para la ciclofilina, la subunidad de la ARN polimerasa II y APRT era relativamente uniforme entre los tejidos normales y las líneas celulares de cáncer. Combinaciones de tres vías para la normalización entre ciclofilina, subunidad de ARN polimerasa II y APRT mostraron una variación media de 7 veces y como máximo 50 veces en el nivel de expresión del ARNm entre las muestras. La significación de los niveles de expresión variables del ARNm dentro de un gen de interés se puede evaluar, por lo tanto, razonablemente basándose en estos resultados de normalización. Una disminución aberrante prevista en el número de copias de un ARNm de un gen de interés de ~100 veces en líneas celulares de cáncer de mama, en relación con un nivel de expresión en mama normal de “valor de referencia”, se consideró, por lo tanto, que era significativamente anormal.

La Figura 4 indica que los amplicones de BNO1 específicos para el exón 5-7 y la isoforma 1 (menos el exón 2.5) muestran un patrón compatible de expresión de ARNm entre los tejidos normales y las líneas celulares de cáncer de mama. Para ambos amplicones analizados, las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-468, SK-BR3, MDA-MB-231 y la línea celular de cáncer de próstata PC3, todas ellas mostraban un bajo nivel de expresión del ARNm con respecto al tejido de mama normal del “valor de referencia”. Una reducción significativa de 725 veces en la expresión del ARNm del exón 5-7 de BNO1 se detectó en SK-BR3 con respecto a la expresión en tejidos normales de mama (equivalente a una regulación a la baja de aproximadamente 350.000-480.000 en la expresión de la molécula de ARNm). Se obtuvieron resultados similares para la isoforma 1 de BNO1 (menos el exón 2.5), con una reducción de 248 veces de la expresión del ARNm en SK-BR3 (equivalente a una regulación a la baja de aproximadamente 300.000-1.000.000 en la expresión de la molécula de ARNm). La isoforma 2 de BNO1 (más el exón 2.5) mostraba una expresión del ARNm significativamente baja en las líneas celulares MDA-MB-468, CAMA-1, SK-BR3 y MDA-MB-231, sin expresión detectada en ZR75

30. Estos resultados indican que ambas isoformas del gen BNO1 están reguladas a la baja en ciertas líneas celulares de cáncer de mama, así como en una línea celular de cáncer de próstata. El mecanismo exacto de esta regulación a la baja no se conoce en este estadio, pero puede ser el resultado de mecanismos tales como una mutación o una metilación del promotor. Partiendo de estos estudios de la expresión proponemos que BNO1 es una proteína responsable del desarrollo de cáncer de mama y de próstata. Debido a su amplio patrón de expresión tisular, BNO1 también puede estar implicada en cánceres que se originan en otros tejidos.

Se pueden utilizar otros métodos para detectar los niveles de expresión de BNO1. Estos incluyen la generación de anticuerpos policlonales o monoclonales, que son capaces de detectar cantidades relativas de las formas tanto normales como mutantes de BNO1, utilizando diversos inmunoensayos tales como los ensayos ELISA (véase el Ejemplo 11 y 12).

EJEMPLO 8: Análisis de tumores y de líneas celulares para estudiar mutaciones en BNO1

El gen BNO1 se escrutó mediante análisis de SSCP en ADN aislado a partir de tumores de la serie 1, así como de un subconjunto de tumores de la serie 2 (no se muestra en la Figura 1) que mostraban la pérdida de todo el brazo largo del cromosoma 16. Estas muestras de la serie 2 se utilizaron debido a que estaban disponibles mayores cantidades de ADN. En total se examinaron mutaciones en 45 tumores primarios de mama con LOH en 16q.

En una diversidad de líneas celulares también se escrutaron mutaciones. Estas incluían 22 líneas celulares de cáncer de mama (BT20, BT474, BT483, BT549, CAMA-1, DU4475, Hs578T, MCF7, MB157, MB231, MB361, MB415, MB436, MB453, MB468, SKBR3, T47D, UACC893, ZR75-1, ZR75-30, MB134 y MB175), 2 líneas celulares de cáncer de próstata (LNCAP y PC3), 2 líneas celulares de carcinoma gástrico (AGS y KATO), 1 línea celular de cáncer de hígado (HEP2) y 2 líneas de células epiteliales normales de mama (HBL100 y MCF12A). Todas las líneas celulares se adquirieron en la ATCC, se dejaron crecer de acuerdo con las condiciones de los fabricantes y el ADN se aisló a partir de las células cultivadas, utilizando protocolos convencionales (Wyman y White, 1980; Sambrook et al., 1989).

Los exones de BNO1 se amplificaron mediante PCR usando cebadores intrónicos flanqueantes que se marcaron en sus extremos 5' con HEX. Se hizo una excepción para el exón 1 y 8, ya que debido a su tamaño se tuvieron que dividir en 2 amplímeros solapantes. En la Tabla 3 se enumeran las secuencias de todos los cebadores utilizados para el análisis de SSCP, el tamaño esperado del amplímero y la concentración de MgCl2 utilizada en la reacción de PCR. Las reacciones típicas de PCR se realizaron en placas de 96 pocillos con un volumen de 10 μl utilizando 30 ng de ADN molde. Las condiciones de ciclación fueron una etapa inicial de desnaturalización a 94ºC durante 3 minutos, seguida por 35 ciclos a 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 11/2 minutos y 72ºC durante 11/2 minutos. Una etapa final de extensión a 72ºC durante 10 minutos se realizó a continuación. Veinte μl de colorante de carga que comprendía 50% (v/v) de formamida, EDTA 12,5 mM y 0,02% (p/v) de azul de bromofenol se añadieron a las reacciones completadas, que se aplicaron posteriormente sobre geles de poliacrilamida al 4% y se analizaron en el sistema GelScan 2000 (Corbett Research, AUS) de acuerdo con las especificaciones del fabricante.

De los 12 amplicones sometidos a ensayo, solo en 2 se identificaron desplazamientos de bandas en SSCP. En el exón 2.5, se observaron desplazamientos de bandas idénticos en 2 muestras de tumores de la serie 1 (380 y 355) y en la línea celular de cáncer de mama MCF7. El análisis de SSCP del ADN normal correspondiente procedente de la muestra 380 y 355, identificaba el mismo desplazamiento de bandas, indicando que el cambio lo más probablemente no causaba la enfermedad. El análisis de la secuencia de este desplazamiento de bandas en todas las muestras mostró que un solo cambio de una base de nucleótidos (-5T→C) era responsable de este desplazamiento de bandas. Este cambio no afecta a la puntuación de sitios de consenso aceptores de corte y empalme para este exón y, por lo tanto, lo más probable

es que represente un polimorfismo. La incidencia de este cambio en la población general no se ha examinado aún. En el exón 8b, un desplazamiento de bandas fue identificado en una sola línea celular de cáncer (KATO). La secuenciación de este desplazamiento de bandas indica un cambio de C→T en la posición +10 de este amplicón que se encuentra en el sitio donante de corte y empalme (5' del sitio de corte y empalme). Este cambio de base se produce fuera de la secuencia de consenso de unión de corte y empalme y se prevé que la mutación no tenga efecto sobre el corte y empalme de este exón.

EJEMPLO 9: Inmunoprecipitación de BNO1 y Skp1

Para someter a ensayo si BNO1 contenía un motivo de F-box funcional, se empleó un ensayo de coinmunoprecipitación. Este implicaba la clonación del marco de lectura abierto de longitud completa, marcado con Myc de BNO1 en los sitios SalI/ClaI del vector de expresión retrovírico LNCX2 (Clontech), utilizando técnicas convencionales (Sambrook et al., 1989). Después de esto, 107 células 293T se transfectaron con 10 μg de la estructura artificial BNO1-LNCX2 o por separado con el vector LCNX2 solo como testigo usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células se recogieron 24 horas después de la transfección y se lisaron en 2 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM [pH 7,5], NaCl 150 mM, 0,5% de Nonidet P-40 suplementado con PMSF 1 mM y 5 μg/ml de leupeptina, antipaína y aprotenina). Después de esto, se incubaron 0,5 ml de lisado celular con 2 μg de anticuerpo monoclonal anti-Myc (Roche) o un anticuerpo policlonal de conejo anti-p19Skp1 (Neo Markers, Fremont, CA) durante 1 hora y proteína A-Sefarosa durante 1 hora a 4ºC. Los complejos inmunes se lavaron tres veces con 1 ml de tampón de lisis seguido de separación en 10% de SDS-PAGE e inmunotransferencia de acuerdo con técnicas convencionales (Sambrook et al., 1989).

Los resultados de estos experimentos indicaron que BNO1 coprecipitaba específicamente con Skp1 endógena, lo que confirma tanto una asociación entre estas dos proteínas como la presencia de una F-box funcional dentro de BNO1. Esta interacción indica que BNO1 pertenece a un nuevo complejo de ligasas ubicuitina-E3 que puede ser decisivo para la degradación controlada de sustratos específicos de BNO1.

EJEMPLO 10: Análisis del gen BNO1

Los siguientes métodos se utilizan para determinar la estructura y la función de BNO1.

Estudios biológicos

Los vectores de expresión de mamíferos que contienen ADNc de BNO1 (que representa ambas isoformas de BNO1) se pueden transfectar en líneas celulares de carcinoma de mama, de próstata u otros que tienen lesiones en el gen. Se examina la inversión fenotípica en cultivos (por ejemplo, la morfología celular, el crecimiento de transformantes en agar blando, la tasa de crecimiento) y en animales no humanos (por ejemplo, la tumorigenicidad en ratones sin pelo). Estos estudios pueden utilizar formas de BNO1 de tipo silvestre o mutante. La deleción y los mutantes sustitutivos de BNO1, se pueden construir por mutagénesis in vitro.

Estudios biológicos moleculares

La capacidad de ambas isoformas de la proteína de BNO1 para unirse a proteínas conocidas y desconocidas, se puede examinar. Procedimientos tales como el sistema de doble híbrido en levadura se utilizan para descubrir e identificar cualquier ligando funcional, particularmente sustratos específicos de BNO1 o sustratos específicos de una isoforma que son dianas para la degradación por ubicuitinación. El principio que subyace al procedimiento de doble híbrido en levadura es que muchos activadores de la transcripción eucariota, que incluyen los de levadura, consisten en dos dominios modulares discretos. El primero es un dominio de unión al ADN que se une a una secuencia promotora específica y el segundo es un dominio de activación que dirige el complejo de la ARN polimerasa II para transcribir el gen aguas abajo del sitio de unión a ADN. Ambos dominios son necesarios para la activación de la transcripción ya que ninguno de los dos dominios puede activar la transcripción por sí mismo. En el procedimiento de doble híbrido en levadura, el gen de interés o partes del mismo (CEBO), se clona de tal manera que se expresa como una fusión con un péptido que tiene un dominio de unión al ADN. Un segundo gen, o una variedad de genes, tales como los de una genoteca de ADNc (DIA-NA), se clona de forma que se expresa como una fusión con un dominio de activación. La interacción de la proteína de interés con su ligando junta el péptido que se une a ADN con el dominio de activación e inicia la transcripción de los genes informadores. El primer gen informador seleccionará células de levadura que contienen proteínas que interaccionan (este informador es por lo general un gen nutricional requerido para el crecimiento en medios selectivos). El segundo informador se utiliza para la confirmación y aunque se expresa como respuesta a proteínas que interaccionan, generalmente no es necesario para el crecimiento.

La naturaleza de los genes y las proteínas que interaccionan con BNO1 también se puede estudiar de tal manera que estos ligandos también pueden ser dianas para el descubrimiento de fármacos. Son de particular interés las proteínas que interaccionan con BNO1 que se dirigen a una diana para la ubicuitinación y la posterior degradación mediante las ligasas ubicuitina-E3 que contiene BNO1.

Estudios estructurales

Proteínas recombinantes de BNO1 se pueden producir en células bacterianas, de levaduras, de insectos y/o de mamífe

ro, y se utilizan en estudios cristalográficos y de RMN. Junto con la formación de modelos moleculares de la proteína, se puede facilitar el diseño de fármacos dirigido por la estructura.

EJEMPLO 11: Generación de anticuerpos policlonales contra BNO1

La información de la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de BNO1 permite la producción de anticuerpos, que se unen selectivamente a la proteína de BNO1 o a fragmentos de la misma. Después de la identificación de mutaciones en el gen, los anticuerpos también se pueden preparar para que se unan selectivamente y distingan una proteína mutante de una proteína normal. Los anticuerpos específicos de epítopos mutagenizados son especialmente útiles en ensayos en cultivos celulares para la detección de células malignas en diferentes estadios del desarrollo tumoral. Estos anticuerpos también se pueden usar para detectar células malignas que se han tratado con agentes farmacéuticos, para evaluar el potencial terapéutico del agente.

Para preparar anticuerpos policlonales, se pueden diseñar péptidos cortos homólogos a la secuencia de aminoácidos de BNO1. Tales péptidos tienen típicamente una longitud de 10 a 15 aminoácidos. Estos péptidos se deben diseñar en regiones de menor homología con el ortólogo de ratón, para evitar interacciones cruzadas con especies en experimentos adicionales posteriores, tales como la producción de anticuerpos monoclonales. Los péptidos sintéticos se pueden conjugar entonces con biotina (Sulfo-NHS-LC biotina) usando protocolos convencionales suministrados con los kits disponibles comercialmente, tales como el kit de PIERCE® (PIERCE). Los péptidos biotinilados forman posteriormente complejos con avidina en solución y para cada complejo peptídico, se inmunizan 2 conejos con 4 dosis de antígeno (200 μg por dosis) a intervalos de tres semanas entre las dosis. La dosis inicial se mezcla con adyuvante completo de Freund, mientras que las dosis posteriores se combinan con inmuno-adyuvante de Freund. Después de completar la inmunización, a los conejos se les extrae sangre para el ensayo y la reactividad de los sueros se somete a ensayo mediante transferencia de manchas con diluciones en serie de los péptidos originales. Si los conejos muestran una reactividad significativa en comparación con el suero previo a la inmunización, son sacrificados posteriormente y la sangre se recoge de tal manera que se pueda separar el suero inmune para experimentos adicionales.

EJEMPLO 12: Generación de anticuerpos monoclonales específicos de BNO1

Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar para BNO1 de la siguiente manera. Un inmunógeno que comprende proteína intacta de BNO1 o péptidos de BNO1 (de tipo silvestre o mutante) se inyecta en adyuvante de Freund a ratones, en donde cada ratón recibe cuatro inyecciones de 10 a 100 μg de inmunógeno. Después de la cuarta inyección, muestras de sangre tomadas de los ratones se examinan para estudiar la presencia de anticuerpos para el inmunógeno. Los ratones inmunes se sacrifican, se extirpan sus bazos y se preparan suspensiones de células individuales (Harlow y Lane, 1988). Las células del bazo sirven como fuente de linfocitos, que se fusionan a continuación con una célula asociada de mieloma de crecimiento permanente (Kohler y Milstein, 1975). Las células se siembran en placas con una densidad de 2x105 células/pocillo en placas de 96 pocillos y los pocillos individuales se examinan para estudiar el crecimiento. Estos pocillos se analizan a continuación para estudiar la presencia de anticuerpos específicos de BNO1 mediante ELISA o RIA, utilizando proteína diana de BNO1 de tipo silvestre o mutante. Las células en los pocillos positivos se expanden y se subclonan para establecer y confirmar la capacidad de monoclonación. Los clones con la especificidad deseada se expanden y se cultivan como ascitis en ratones seguido de purificación, usando cromatografía de afinidad utilizando proteína A Sefarosa, cromatografía de intercambio iónico o variaciones y combinaciones de estas técnicas.

Aplicabilidad industrial

El gen BNO1 está implicado en el cáncer y basándose en su función en el proceso de ubicuitinación, BNO1 también puede estar implicado en mecanismos celulares que están regulados por este proceso. Las nuevas moléculas de ADN de la presente invención son por lo tanto útiles en métodos para la detección temprana de individuos susceptibles a una enfermedad, así como en procedimientos terapéuticos asociados con estos estados de la enfermedad.

TABLA 1

Cebadores empleados para el análisis de BNO1

Nombre del cebador

Secuencia del cebador (5' → 3')

AL-1

GTG AAG AAG GAT GAG TTC TCC

7970-1

AGC TGA GCA TCA CAA TCT CC

ESTD-F

GGA GCT TCC CCA ACT CAT AAA TGC C

ESTD-R

GCA TGA TGT CTG ATG TGG TCA GTA A

Cebadores empleados para el análisis de BNO1

Nombre del cebador

Secuencia del cebador (5' → 3')

BNO1-2

TGC GAA GCT GCT TCA CCG AT

BNO1-3

GGC CGT ACA TGC ACT CCA CTG

130367-1

GAG AAC CTG CAG TTG TGC TG

87068-1

ATG GTG CTG CTT GTA GCA AG

BNO1-1

TGC CCA TAT GAG ATG ACG AGG

130367-2

ACA CTC AGC AGT GGA CAC TTG

Ciclofilina-F1

GGC AAA TGC TGG ACC CAA CAC AAA

Ciclofilina-R1

CTA GGC ATG GGA GGG AAC AAG GAA

APRT-F1

GAC TGG GCT GCG TGC TCA TCC

APRT-R1

AGG CCC TGT GGT CAC TCA TAC TGC

ARN Polimerasa II-F1

AGG GGC TAA CAA TGG ACA CC

ARN Polimerasa II-R1

CCG AAG ATA AGG GGG AAC TAC T

BNO1 (Exón 5-7)-F1

CCG GCG GGA GGC AGG AGG AGT

BNO1 (Exón 5-7)-R1

GCG GCG GTA GGT CAG GCA GTT GTC

BNO1 (Isoforma 1)-F1

TGC GAA GCT GCT TCA CCG AT

BNO1 (Isoforma 1)-R1

GGC CGT ACA TGC ACT CCA CTG

BNO1 (Isoforma 2)-F1

GTG AAG TCG GGA CGT TTT GTG A

BNO1 (Isoforma 2)-R1

CCG TGG TGG GGC CCT TTG TGG

Nota: 1 Estos cebadores se marcaron en sus extremos 5' con HEX. La isoforma 1 de BNO1 carece de exón 2.5 (SEQ ID NO: 1). La isoforma 2 de BNO1 contiene el exón 2.5 (SEQ ID NO: 3).

TABLA 2

Sitios de corte y empalme del gen BNO1

Exón

Tamaño (pb) Sitio 3' de corte y empalme (intrón/exón) Potencia de consenso (%) Sitio 5' de corte y empalme (intrón/exón) Potencia de consenso (%) Tamaño del intrón (pb)

1

343 5'UTR TGCCGTGAGG/gtgagcgcgc 83,03 23042

Sitios de corte y empalme del gen BNO1

Exón

Tamaño (pb) Sitio 3' de corte y empalme (intrón/exón) Potencia de consenso (%) Sitio 5' de corte y empalme (intrón/exón) Potencia de consenso (%) Tamaño del intrón (pb)

2

72 cttgttacag/AGTATGGTGT 94,28 TATGCGAAGC/gtgagtgaat 75,36 1797

2.5

87 gtctgttcag/GTATAAACCC 90,0 TACACCTGCC/gtatgtacct 66,97 11160

3

77 cctcctgtag/TGCTTCACCG 78,70 GAACGTGGTG/gtaagtcccg 92,15 3408

4

168 cctcctgtag/GTGGACGGCC 84,95 CCACATCCAG/gtgtgtgcag 85,40 646

5

75 aacactgaag/ATTGTGAAGA 63,39 GAGGCAGGAG /gtgagcccac 90,87 6612

6

110 cttttggaag/GAGTTTCGGA 85,65 GTCAGTACGA/gtgagtgcgg 76,46 697

7

154 ctccccacag/CAACTGCCTG 85,32 CAAGATCACG/gtgagtggcg 88,50 1017

8

401 tgctccacag/GGCGACCCCA 89,22 GCAGGATGTG/gtaaggatg 87,59 2375

9

2174 ttctgctcag/TTTTTATGGC 90,62 3'UTR

TABLA 3

Cebadores empleados para el análisis de SSCP de BNO1

Exón

Cebador 1 (5' → 3') Cebador 2 (5' → 3') [MgCl2] Tamaño del producto (pb)

1a

GCGCTGGAGCGTGCGCACA AGCTCGGGCGGCAGCTCCA 2,0 mM 269

1b

GGTCGGGGGCGGCTTGTG GCCTCCACCTGGCAGGGA 2,0 mM 252

2

CTGTCGCGTTATGAGTTGTTG GTACAAAGTTAATCATGGATGGT 2,0 mM 168

2.5

AGGCATTGGGTCGTATTCAC AGAAGCCAAAGCTCGCAGGA 1,5 mM 198

3

GGCACGCTGGGTCTAACAC CCTGCCCGTGCACAGACCT 1,5 mM 167

4

CTCATGGACCTTTGCCCATCT GTCTGCAGCTGAGAATAGCAC 1,0 mM 290

5

GTGATGGACTCTGTTCCTCAC AGGTCCGCACCATATGAACAC 2,0 mM 170

6

CACAGCCTCCTGTCATATGGA ACCCCAGCACCGAGCAGGA 1,5 mM 187

7

GGCGTTCTCAGTCCTGCCT CCCTGACTCCACAGCCCAC 1,5 mM 284

8a

CTGGCCTGAGCCCTGCTGA ACCCTCTCGCGCACCTCCA 1,0 mM 171

8b

CAATGAGCTCTCCCGCATC CCATGCTGTCCCACCTTCA 1,5 mM 354

9

AGAATGCTGTACGTGGCGTG AGGAGGTGAGGGACTGAATG 1,0 mM 292

Cebadores empleados para el análisis de SSCP de BNO1

Exón

Cebador 1 (5' → 3') Cebador 2 (5' → 3') [MgCl2] Tamaño del producto (pb)

Nota: Todos los cebadores se marcaron en sus extremos 5' con HEX.

Referencias

Las referencias citadas en esta memoria se enumeran en las páginas siguientes y se incorporan en esta memoria como

referencia.

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Bionomics Limited

<120> BNO1

<130> P3 5 <160> 41

<170> PatentIn versión 3.1

<210> 1

<211> 3574

<212> ADN 10 <213> Homo sapiens

<400> 1

<210> 2

<211> 539

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

<210> 3

<211> 3661

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 3

<210> 4

<211> 568

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 2340

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 5

<210> 6

<211> 2072

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 6

<210> 7

<211> 2087

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 7

<210> 8

<211> 2077

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 8

<210> 9

<211> 2889

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 9

<210> 10

<211> 4378

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 10

<210> 11

<211> 3174

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 11

<210> 12

<211> 1767

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 12

<210> 13

<211> 507

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 13

<210> 14

<211> 5106

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 14

<210> 15

<211> 5193

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 15

<210> 16

<211> 5924

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 16

<210> 17

<211> 6011

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 7521

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 7608

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 20 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22 15 <211> 25

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 25

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 29 <210> 30

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 34

<210> 35

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 35

<210> 36

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 36 <210> 37

<211> 24

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 20

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 39

<210> 40

<211> 22

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 40

<210> 41

<211> 21

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<400> 41

Claims (38)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que se cartografía en el cromosoma humano 16q24.3 y que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3.

2. 2.

   Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3, que codifica un polipéptido capaz de formar parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en el direccionamiento de proteínas mediante ubicuitinación para una degradación en el proteasoma.

3. 3.

   Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que es al menos 95% idéntica a una molécula de ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3 y que codifica un polipéptido capaz de formar parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en el direccionamiento de proteínas mediante ubicuitinación para una degradación en el proteasoma.

4. 4.

   Una molécula aislada de ácido nucleico de BNO1 que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4.

5. 5.

   Una molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID Números: 1 o 3.

6. 6.

   Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico tal y como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, ligado funcionalmente a elementos de control adecuados.

7. 7.

   Una célula aislada transformada con el vector de expresión según la reivindicación 6.

8. 8.

   Una célula según la reivindicación 7, en la que la expresión de BNO1 recombinante se puede interrumpir.

9. 9.

   Una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, que es una célula eucariota.

10. 10.

    Un método de preparación de un polipéptido codificado por cualquiera de los ácidos nucleicos según las reivindicaciones 1 a 5, que comprende las etapas de:

    (1)

    cultivar una célula tal como se define en la reivindicación 7 o 9 en condiciones eficaces para la producción del polipéptido; y

    (2)

    recoger el polipéptido.

11. 11.

    Un polipéptido aislado de BNO1 que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2

    o 4.

12. 12.

    Un polipéptido aislado de BNO1, que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4, que es capaz de formar parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en la degradación de proteínas a través de la ubicuitinación.

13. 13.

    Un polipéptido aislado de BNO1 capaz de formar parte de un complejo de ubicuitina-ligasa implicado en la degradación de proteínas a través de la ubicuitinación que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2 o 4.

14. 14.

    Un polipéptido aislado de BNO1 que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID Números: 2

    o 4.

15. 15.

    Un anticuerpo para la detección de BNO1 que es inmunológicamente reactivo con un polipéptido tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, preferentemente un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo quimérico o un fragmento de anticuerpo que incluye un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fv, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos de dominio único.

16. 16.

    El uso de una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con una disminución de la expresión o de la actividad de BNO1.

17. 17.

    El uso según la reivindicación 16, en el que la molécula de ácido nucleico es una parte de un vector de expresión que también incluye elementos de control adecuados.

18. 18.

    El uso de un antagonista de BNO1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno asociado con el aumento de la expresión o la actividad de BNO1, en donde dicho antagonista es un anticuerpo según la reivindicación 15.

19. 19.

    El uso de una molécula de ácido nucleico aislada que es el complemento de una molécula de ácido nucleico tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, cuyo producto de transcripción es un ARNm que se hibrida con el ARNm codificado por BNO1, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno

    asociado con el aumento de la actividad o de la expresión de BNO1.

20. 20.

    Un método para escrutar un compuesto capaz de modular la actividad de BNO1 que comprende combinar un péptido según una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, y un compuesto candidato, y determinar la unión de dicho compuesto candidato con dicho péptido.

21. 21.

    Un método para escrutar candidatos a fármacos que comprende las etapas de:

    (1)

    proporcionar una célula según una cualquiera de las reivindicaciones 7 o 9;

    (2)

    añadir un candidato a fármaco a dicha célula; y

    (3)

    determinar el efecto de dicho candidato a fármaco sobre la expresión de BNO1 en dicha célula.

22. 22.

    El uso de un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para escrutar candidatos a fármacos.

23. 23.

    El uso in vitro de un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para el diagnóstico o el pronóstico de trastornos asociados con una disfunción de BNO1 o una predisposición a tales trastornos.

24. 24.

    El uso in vitro de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, para el diagnóstico o el pronóstico de trastornos asociados con una disfunción de BNO1 o una predisposición a tales trastornos.

25. 25.

    El uso in vitro de un anticuerpo según se ha definido en la reivindicación 15, para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno asociado con BNO1 o una predisposición a tales trastornos.

26. 26.

    Un método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno asociado con mutaciones en BNO1, o una predisposición a tales trastornos en un paciente, que comprende las etapas de:

    comparar BNO1 o un ácido nucleico que codifica BNO1 procedente de una muestra que se debe obtener a partir de un paciente con BNO1 de tipo silvestre o un ácido nucleico que lo codifica con el fin de establecer si la persona expresa un BNO1 mutante.

27. 27.

    Un método según la reivindicación 26, en el que se compara la secuencia de nucleótidos del ADN del paciente con la secuencia de ADN que codifica BNO1 de tipo silvestre.

28. 28.

    Un método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno asociado con una expresión o una actividad anormal de BNO1, o una predisposición a tales trastornos, que comprende las etapas de:

    (1)

    establecer un perfil para la expresión normal de BNO1 en sujetos no afectados;

    (2)

    medir el nivel de expresión de BNO1 en una persona sospechosa de tener una expresión o actividad anormal de BNO1; y

    (3)

    comparar el nivel de expresión medido con el perfil de expresión normal.

29. 29.

    Un método según la reivindicación 28, en el que se emplea una transcriptasa inversa-PCR para medir los niveles de expresión.

30. 30.

    Un método según la reivindicación 28, en el que un ensayo de hibridación que utiliza una sonda obtenida a partir de BNO1, o un fragmento del mismo, se emplea para medir los niveles de expresión.

31. 31.

    Un método según la reivindicación 30, en el que la sonda tiene al menos 50% de identidad de secuencia con una secuencia nucleotídica que codifica BNO1, o un fragmento del mismo.

32. 32.

    Un método in vitro para el diagnóstico o el pronóstico de un trastorno asociado con BNO1, o una predisposición a tales trastornos, que comprende las etapas de:

    (1)

    establecer una propiedad física de BNO1 de tipo silvestre;

    (2)

    medir la propiedad de un BNO1 expresado por una persona que es sospechosa de tener una anormalidad de BNO1; y

    (3)

    compararla con la propiedad establecida para BNO1 de tipo silvestre con el fin de establecer si la persona expresa un BNO1 mutante.

33. 33.

    Un método según la reivindicación 32, en el que la propiedad es la movilidad electroforética.

34. 34.

    Un método según la reivindicación 32, en el que la propiedad es el patrón de escisión proteolítica.

35. 35.

    Un animal no humano modificado genéticamente seleccionado entre el grupo que consiste en ratas, ratones,

    hámsteres, cobayas, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos y primates no humanos tales como monos y chimpancés, transformado con una molécula de ácido nucleico aislada tal y como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

36. 36.

    Un animal no humano modificado genéticamente seleccionado entre el grupo que consiste en ratas, ratones,

    5 hámsteres, cobayas, conejos, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos y primates no humanos tales como monos y chimpancés, en el que el gen BNO1 homólogo y la función génica se han desactivado.

37. 37.

    El uso de un animal no humano modificado genéticamente tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 35 o 36, en el escrutinio en busca de compuestos farmacéuticos candidatos.

38. 38.

    Una micromatriz para detectar BNO1 que comprende un ácido nucleico que codifica o bien una isoforma de

    10 BNO1, o un fragmento de la misma, o ácidos nucleicos que codifican ambas isoformas de BNO1, o fragmentos de las mismas.