ES2217328T3

ES2217328T3 - Materiales y procedimientos relacionados con la identificacion y secuenciacion del gen de susceptibilidad al cancer brca2 y utilizaciones del mismo.

Info

Publication number: ES2217328T3
Application number: ES96939218T
Authority: ES
Inventors: Phillip Andrew Futreal; Richard Francis Wooster; Alan Ashworth; Michael Rudolf Stratton
Original assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd; Duke University
Current assignee: Cancer Research Campaign Technology Ltd; Duke University
Priority date: 1995-11-23
Filing date: 1996-11-25
Publication date: 2004-11-01
Anticipated expiration: 2016-11-25
Also published as: AU707636C; JP2001507563A; EP0858467A1; DK0858467T3; ATE259378T1; AU707636B2; WO1997019110A1; AU7635096A; US6045997A; DE69631540D1; DE69631540T2; CA2238010A1; EP0858467B1

Abstract

SE DESCRIBE LA INDENTIFICACION Y SECUENCIACION DEL GEN BRCA2, ASI COMO TAMBIEN SE DESCRIBE LA SECUENCIA DE AMINOACIDOS DE LOS CORRESPONDIENTES POLIPEPTIDOS BRCA2, Y LOS ALELOS BRCA2 INCLUYENDO AQUELLOS CON MUTACIONES EN EL GEN BRCA2 QUE ESTAN ASOCIADOS CON UNA PREDISPOSICION A DESARROLLAR CANCER, EN ESPECIAL CANCER DE MAMA Y DE OVARIO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN TRATA DE POLIPEPTIDOS CODIFICADOS POR EL ANTERIOR ACIDO NUCLEICO. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN TRATA DE LOS USOS DE TAL ACIDO NUCLEICO DE BRCA2 Y DE TALES POLIPEPTIDOS BRCA2, EN PARTICULAR EN EL DIAGNOSTICO, PROGNOSTICO O TRATAMIENTO TERAPEUTICO DEL CANCER.

Description

Materiales y procedimientos relacionados con la identificación y secuenciación del gen de susceptibilidad al cáncer BRCA2 y utilizaciones del mismo.

Campo de la invención

La presente invención hace referencia a la identificación y secuenciación del gen de susceptibilidad al cáncer BRCA2 y a los materiales y procedimientos que se derivan de estos hallazgos. En particular, la presente invención hace referencia a las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos BRCA2 y a los alelos del gen BRCA2, incluyendo aquellos con mutaciones asociadas con una predisposición a desarrollar cáncer, especialmente cáncer de mama y de ovario y a los polipéptidos codificados por este ácido nucleico. La presente invención hace referencia además a la utilización del mencionado ácido nucleico BRCA2 y del polipéptido de BRCA2, en particular en el diagnóstico, pronóstico o tratamiento terapéutico del cáncer.

Antecedentes de la invención

Aproximadamente, 1 de cada 12 mujeres desarrollan un cáncer de mama. Mientras que la gran mayoría de estos cánceres son esporádicos, una proporción de estos casos de cáncer de mama, con una frecuencia estimada de aproximadamente el 5%, se atribuye a una predisposición a la enfermedad que se transmite como una característica autosómica dominante de alta penetrancia. Esta predisposición se manifiesta generalmente en grupos familiares con cáncer de mama de aparición temprana, los cuales se asocian a menudo con cánceres de otros órganos, en particular el de ovario.

También se conocen anomalías en diversos otros genes que confieren susceptibilidad para el cáncer de mama. El gen BRCA1 se localiza en el cromosoma 17q21 (1). El BRCA1 codifica una proteína de 1863 aa que contiene un dominio de tipo dedo RING y que tiene poca más identidad de secuencia con las proteínas caracterizadas anteriormente (3). Por lo general, las mutaciones de línea germinal de BRCA1 producen un truncamiento o ausencia de la proteína y por lo tanto la inactivación presunta de una o más de sus funciones críticas. BRCA1 está implicado en aproximadamente un tercio de las familias con cáncer de mama de sitio específico. Una pequeña proporción de cánceres de mama familiares son atribuibles a mutaciones de línea germinal del gen p53 y unos grupos raros de cánceres de mama (4) son debidos a mutaciones en el receptor de andrógenos. En la patente europea EP-A-0705902 se describe el trabajo relacionado con el gen del BRCA1, los procedimientos utilizados para aislarlo y las aplicaciones del ácido nucleico y polipéptidos de BRCA1.

Utilizando familias con múltiples casos de cáncer de mama de aparición temprana que muestran evidencias en contra del ligamiento con BRCA1, los inventores de la presente invención han demostrado recientemente la existencia de un segundo locus de susceptibilidad al cáncer de mama, BRCA2, en el cromosoma 13q12-q15 (5). Los estudios preliminares indican que las mutaciones en el BRCA2 confieren un riesgo similar de cáncer de mama al de BRCA1. Sin embargo, el riesgo de cáncer de ovario parece ser inferior y el riesgo de cáncer de mama en hombres es considerablemente superior. Ambos genes juntos, BRCA1 y BRCA2, están implicados en las tres cuartas partes de familias con múltiples cánceres de mama de aparición temprana y en casi todas las familias con cáncer de mama y cáncer de ovario.

Berman y col., (Cancer Research, 56:3409-3414, 1996) publicaron después de las dos fechas claves e identificaron una deleción de 1 pb en el nucleótido 6174 del gen BRCA2.

La patente europea EP 0 785 216 A (Myriad Genetics, Inc.) se cita en el Art 54(3) EPC por el tema en cuestión, aunque no tiene el derecho de las dos primeras fechas principales, describe el gen BRCA2 y los alelos mutantes de lo mismo.

Resumen de la invención

En general, el trabajo descrito en la presente invención se basa en la identificación del gen BRCA2 y la descripción de su secuencia y de la secuencia aminoacídica de los polipéptidos correspondientes de BRCA2. También se describen los alelos de BRCA2, incluyendo los que presentan mutaciones en la secuencia normal.

Los inventores hallaron inicialmente un fragmento del exón 16 del gen BRCA2 y lo utilizaron para secuenciar aproximadamente el 10% de la secuencia codificante. La secuencia del cDNA de BRCA2 correspondiente con este fragmento del gen BRCA2 se muestra en la figura 1, la secuencia genómica de los intrones y exones secuenciada inicialmente por los inventores se muestra en la Figura 2, con la secuencia de la proteína traducida que se muestra en la Figura 3.

Posteriores trabajos de los presentes inventores utilizando esta secuencia y otros procedimientos conocidos aislaron aproximadamente el 75% de la secuencia codificante de BRCA2. Ello se muestra en la secuencia de cDNA de la Figura 4, con la secuencia aminoacídica correspondiente traducida que se muestra en la Figura 5. Los inventores también identificaron al mismo tiempo 6 mutaciones en el gen BRCA2, en concreto una mutación 6174delT a partir del análisis de linajes de familias de judíos Ashkenazi de Montreal.

La secuencia de BRCA2 con la estructura de intrones y exones se muestra en la Figura 7, con la región promotora del locus BRCA2 que se muestra en la Figura 6. Los cebadores adecuados para la amplificación de la secuencia de BRCA2 se muestran en la Figura 8 y también se publicaron el 12/3/1996 en Nature Genetics, 12:333-337, 1996.

Tras la secuenciación inicial del gen BRCA2 descrito anteriormente y utilizando la información contenida en las figuras 1 a 3, una persona experta puede reunir la secuencia completa del gen BRCA2 incluido en la secuencia publicada en Internet mediante las técnicas descritas con detalle más adelante.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia codificante de ácido nucleico que se muestra en las Figuras 1 ó 2, o los alelos de ésta.

El ácido nucleico puede utilizarse para obtener la secuencia de tamaño completo del gen BRCA2. Según ello, en otro aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia codificante de tamaño completo o del gen BRCA2 tal como se obtiene mediante:

(a) utilización de las secuencias de ácido nucleico que se muestran en las figuras 1 ó 2 para construir las sondas para el cribaje de librerías de cDNA o genómicas, secuenciando los clones positivos obtenidos y repitiendo este proceso para reunir la secuencia de BRCA2 de tamaño completo a partir de las secuencias así obtenidas;

(b) utilización de las secuencias que se muestran en las figuras 1 ó 2 para obtener oligonucleótidos para cebar con los fragmentos de ácido nucleico de BRCA2, siendo dichos oligonucleótidos utilizados junto con los oligonucleótidos diseñados para hibridar con un vector de clonaje, para amplificar mediante PCR los fragmentos de ácido nucleico en una librería que contiene fragmentos de la secuencia de BRCA2, secuenciación de los fragmentos amplificados para obtener la secuencia de BRCA2 entre las regiones conocidas de la secuencia y el vector de clonaje y repitiendo este proceso para reunir la secuencia de BRCA2 de tamaño completo a partir de las secuencias así obtenidas; y/o,

(c) mediante una amplificación rápida de los extremos del cDNA (RACE), mediante síntesis de cDNAs a partir de una serie de RNAs de distintos tejidos, los cDNAs se ligan a un engarce oligonucleotídico y se amplifican mediante PCR los cDNAs de BRCA2 utilizando un cebador que hibrida con la secuencia del cDNA de BRCA2 de la Figura 1 y un segundo cebador que hibrida con el engarce oligonucleotídico, secuenciando el ácido nucleico amplificado y repitiendo este proceso para reunir la secuencia de BRCA2 de tamaño completo a partir de secuencias así obtenidas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que consiste de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 4, o los alelos de lo mismo. El ácido nucleico de la figura 4 puede utilizarse de la misma manera que el ácido nucleico mostrado en las Figuras 1 y 2 para obtener la secuencia codificante del gen BRCA2 de tamaño completo.

Las secuencias mostradas en las Figuras 1, 2 y 4 se cree que son un ayuste alternativo y raro del mRNA de BCRA2 incluyendo ácido nucleico del extremo 3' del exón 16 codificante para 8 aminoácidos adicionales (ALCDVKAT). La secuencia en la figura 7 muestra lo que se piensa que es la secuencia normal aminoacídica del polipéptido BRCA2 en esta posición. Sin embargo, la presencia del ayuste alternativo no tiene ningún efecto sobre la metodología citada anteriormente para aislar el gen BRCA2 de tamaño completo utilizando las secuencias del 10% y 75% aisladas inicialmente por los presentes inventores.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido BRCA2 incluyendo la secuencia aminoacídica mostrada en las Figuras 3 ó 5.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia nucleotídica que codifica un fragmento o porción activa de un polipéptido BRCA2 incluyendo la secuencia aminoacídica mostrada en la Figura 3 ó 5.

En otros aspectos, la presente invención incluye los vectores replicables que comprenden el ácido nucleico anterior unido operativamente a las secuencias control para dirigir su expresión, las células huésped transformadas con estos vectores y los procedimientos de producción del polipéptido BRCA2 incluyendo el cultivo de las células huésped y la recuperación del polipéptido producido.

En otro aspecto, la presente invención proporciona las moléculas de ácido nucleico anteriores para utilizar en los procedimientos de tratamiento médico, especialmente en el diagnóstico y terapia del cáncer. También se incluye la utilización de las moléculas anteriores de ácido nucleico en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Ello se discute más adelante.

En otro aspecto, la presente invención proporciona las sustancias que comprenden los polipéptidos codificados por el ácido nucleico anterior.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento diagnóstico de una susceptibilidad o predisposición de cáncer de mama en mujeres, cáncer de mama en hombres, cáncer de ovario o cáncer de próstata en un paciente mediante el análisis de una muestra del paciente para el gen BRCA2 o el polipéptido codificado por éste. Como ejemplo, ello se podría llevar a cabo de la siguiente manera:

(a) comparar la secuencia de una molécula de ácido nucleico en la muestra con la secuencia del ácido nucleico de BRCA2 que se muestra en las Figuras 1, 2 ó 4 para determinar si la molécula de ácido nucleico en la muestra contiene una o más mutaciones; o,

(b) determinar la presencia en la muestra del polipéptido codificado por el gen BRCA2 que comprende la secuencia parcial de la Figura 3 ó 5 y, en caso afirmativo, determinar si el polipéptido tiene un tamaño completo y/o si está mutado; o,

(c) utilizar la PCR con uno o más cebadores con secuencias del gen BCRA2 normales tal como se muestran en las Figuras 1, 2 ó 4, o con formas mutadas, para cribar los genes BCRA2 normales o mutados en una muestra de un paciente.

Mientras que los procedimientos diagnósticos (a)-(c) se proporcionan como ejemplos, también existen otros ensayos bien conocidos en la materia que serán evidentes a los expertos en la materia.

La detección de mutaciones en el gen BCRA2 indica una susceptibilidad al cáncer, especialmente al cáncer de mama en mujeres, cáncer de mama en hombres y al cáncer de ovario y próstata.

Descripción resumida de las figuras

Los anteriores y otros aspectos de la presente invención se describen a continuación mediante ejemplos que se refieren a las figuras acompañantes. Estos ejemplos se presentan como vía de ilustración y no de limitación. Otros aspectos de la invención serán evidentes a los expertos en la materia.

La Figura 1 muestra la secuencia parcial del gen BCRA2 obtenido a partir del clon 14 de cDNA.

La Figura 2(a)-(e) muestra las secuencias de los exones e intrones del clon 14 conocidas.

La Figura 3 muestra la secuencia aminoacídica traducida de la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la Figura 1. De las 3 posibles pautas de lectura, la utilizada para traducir la secuencia aminoacídica mostrada en esta figura es el candidato más probable como ácido nucleico, ya que cuando la pauta de lectura se halla en las otras posiciones, el ácido nucleico contiene codones de parada en la secuencia.

La Figura 4 muestra la segunda parte de la secuencia de cDNA del gen BCRA2 aislado por los inventores, incluyendo la secuencia de cDNA que se muestra en la Figura 1.

La Figura 5(a)-(d) muestra las secuencia aminoacídica traducida de la secuencia de ácido nucleico mostrada en la Figura 4, con flechas en negrita sobre la secuencia indicando los límites entre las regiones de la proteína codificada por los diferentes exones en el gen.

La Figura 6 muestra las secuencias de la región promotora de BCRA2 con los sitios de unión para los factores potenciales de transcripción subrayados y la isla CpG en negrita. La secuencia del promotor puede utilizarse en el cribaje de sustancias que modulen la expresión del gen BCRA2 para su utilización como terapéuticos.

La Figura 7 muestra la secuencia del gen BCRA2, incluyendo la estructura exón/intrón definida mediante comparación de la secuencia del cDNA de BCRA2 con la secuencia genómica del cromosoma 13q entre D13S260 y D13S171. Los exones se muestran en mayúscula y las secuencias intrónicas flanqueantes en minúscula. La secuencia aminoacídica se muestra debajo de la pauta de lectura desde el exón 2 al 26.

La Figura 8 muestra los cebadores para el estudio de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) que se han diseñado para amplificar el gen BRCA2 mediante la PCR para la amplificación de cambios de secuencia en el DNA genómico que pueden predisponer al desarrollo de un cáncer de mama. Los cebadores se localizan en las secuencias intrónicas flanqueantes de cada uno de los 26 exones que contienen la pauta de lectura del gen. Los productos amplificados incluyen las secuencias consenso de los sitios de ayuste. Para los exones más grandes del gen se han diseñado dos o más grupos de cebadores. Los cebadores están señalados por: su número de exón, la subsección del exón correspondiente y como cebador 5' o 3'. Los productos de PCR se hallan en el intervalo de 160 a 360 pb. La columna marcada CON indica las condiciones que se utilizaron.

Se probaron los cebadores utilizando una serie limitada de condiciones basada en la PCR "touchdown" (TD), en donde las figuras indican la temperatura primera y la última de hibridación, respectivamente. Una vez identificada la presencia de mutaciones, se secuenciaron los productos de PCR utilizando los mismos cebadores y secuenciación cíclica fluorescente.

La Figura 9 muestra el alineamiento de los motivos de aminoácidos en el exón 11 de BCRA2 de especies distintas.

La Figura 10 muestra ejemplos de cebadores para utilizar en los ensayos de PTT.

La Figura 11 muestra la inmunoprecipitación de l proteína de BCRA2 macada con FLAG de células COS transfectadas con el plásmido de expresión p13120. Los lisados celulares totales de las células COS transfectadas (carriles a y b) y no transfectadas (carriles c y d) sometidos a inmunoprecipitación con el anticuerpo anti-FLAG (carriles b y d), o con un anticuerpo control contra una proteína Golgi (carriles a y c). El anticuerpo anti-FLAG inmunoprecipita una proteína de aproximadamente 400 KDa (flecha) del lisado de células COS transfectadas, pero no de las no transfectadas (comparar carriles d y b). El anticuerpo control no inmunoprecipita esta proteína (véase el carril c). La banda intensa de proteína de elevado peso molecular que se observa en el carril de marcadores corresponde a un peso de 220 KDa.

La Figura 12 muestra una transferencia de Western de la proteína BCRA2 marcada con FLAG. Los lisados celulares totales de células COS (carriles a y b) y de células 293T (carriles c y d) transfectadas con el plásmido de expresión p1320 (carriles a y c) o sin DNA (carriles b y d). El anticuerpo anti-FLAG detecta una proteína de aproximadamente 400 KDa (flecha) en los lisados de células transfectadas, pero no en las no transfectadas. La proteína en el carril de marcadores tiene un peso molecular de 220 KDa.

La Figura 13 muestra la detección de una proteína BRCA2 marcada con FLAG mediante inmunofluorescencia. Las células COS transfectadas con el plásmido de expresión, p1320 se fijaron, 48 horas más tarde, con formaldehído al 4% y luego se permeabilizaron con Triton-X100 al 0,4%. El anticuerpo anti-FLAG pone de manifiesto una variación en la localización celular de la proteína BRCA2 marcada con FLAG. Mientras que la proteína BRCA2 se distribuye por igual entre el núcleo y el citoplasma en el 14% de las células, es predominantemente nuclear (A) en el 42% y citoplasmática (B) en el 44% de las células (n = 50). La expresión en el citoplasma es granular, lo que puede indicar una asociación con el retículo endoplasmático. La tinción no se observó en las células no transfectadas.

Descripción detallada Preparación del ácido nucleico BRCA2 y de los vectores y células huésped que incorporan el ácido nucleico

La "región BRCA2" hace referencia a la porción del cromosoma 13q12-13 identificado en Wooster y col. (5), que contiene el locus BCRA2.

El "locus BCRA2" incluye el gen BCRA2, tanto la secuencia codificante (exones) y las secuencias intrónicas (intrones) y sus elementos reguladores para el control de la transcripción y/o traducción. El locus BCRA2 cubre las variaciones alélicas dentro de este locus.

El término "gen BCRA2" o "ácido nucleico BCRA2" incluye alelos normales del gen BCRA2, tanto los alelos silenciosos sin ningún efecto sobre la secuencia aminoacídica del polipéptido BCRA2 como los alelos que producen variantes de secuencia aminoacídica del polipéptido BCRA2 y que no afectan esencialmente su función. Estos términos también incluyen alelos que tienen uno o más mutaciones que están unidas a una predisposición para desarrollar cáncer, especialmente cáncer de mama en mujeres y hombres o cáncer de ovario. Una mutación puede ser un cambio en la secuencia de ácido nucleico de BCRA2 que produzca un cambio deletéreo en la secuencia aminoacídica del polipéptido BCRA2, dando como resultado una pérdida parcial o completa de la función de BRCA2, o puede ser un cambio en la secuencia de ácido nucleico que da como resultado la pérdida efectiva de la expresión de BRCA2 o la producción de formas aberrantes del polipéptido BCRA2. Ejemplos de dichas mutaciones se muestran en la Tabla 1. Los alelos que incluyen dichas mutaciones también se conocen como alelos de susceptibilidad.

El ácido nucleico BCRA2 puede ser el que se muestra en las Figuras 1, 2, ó 4 o puede ser un alelo tal como se describió anteriormente, que difiera del mostrado por un cambio debido a una, o más de una, adición, inserción, deleción o sustitución de uno o más nucleótidos de la secuencia mostrada. Los cambios de secuencia nucleotídica pueden dar, o no, como resultado un cambio de aminoácido a nivel proteico, tal como se determina por el código genético.

De acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico puede incluir una secuencia distinta de la secuencia que se muestra en las Figuras 1, 2 ó 4 o codificar un polipéptido con la misma secuencia aminoacídica. La secuencia aminoacídica que se muestra en la Figura 7 consiste de 3418 residuos.

Los alelos mutantes particulares de la presente invención se muestran en la Tabla 1, utilizando la nomenclatura propuesta en primer lugar en (8). Estas mutaciones se asocian generalmente con la producción de formas truncadas del producto del gen BRCA2. Estos se han demostrado mediante trabajo experimental descrito aquí y asociado con la susceptibilidad de cáncer de mama de hombres y mujeres y/o de cáncer de ovario. Las implicaciones para el cribaje, p.ej., para propósitos diagnósticos o pronósticos, se discuten más adelante.

En general, se proporciona el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención como una forma aislada, y/o purificada, o libre o esencialmente libre del material con el que normalmente está asociado, es decir sin el ácido nucleico flanqueante del gen en el genoma humano, excepto posiblemente de una o más secuencias reguladoras de la expresión. El ácido nucleico puede ser parcial o completamente sintético y puede incluir DNA genómico, cDNA o RNA. Si el ácido nucleico de acuerdo con la invención incluye RNA, la referencia de la secuencia mostrada debería realizarse teniendo en cuenta su equivalente en RNA, con U sustituyendo a T.

Las secuencias de ácido nucleico que codifican para todo o una parte del gen BCRA2 y/o sus elementos reguladores pueden prepararse fácilmente por un experto en la materia utilizando la información y las referencias contenidas aquí y las técnicas conocidas en la materia (por ejemplo, ver Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 y Ausubel y col., Short Protocols en Molecular Biology, John Whiley and Sons, 1992). Estas técnicas incluyen: (i) la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar muestras de dicho ácido nucleico, p.ej., a partir de fuentes genómicas, (ii) La síntesis química, o (iii) la preparación de secuencias de cDNA. Las modificaciones de las secuencias de BCRA2 pueden realizarse, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida, para proporcionar la expresión del polipéptido BCRA2 o para tener en cuenta el codón de preferencia en las células huésped utilizadas para expresar el ácido nucleico.

Con el fin de expresar las secuencias de ácido nucleico de BCRA2, se incorporaron las secuencias en un vector con secuencias control unidas operativamente al ácido nucleico de BCRA2 para controlar su expresión. Los vectores pueden incluir otras secuencias como promotores o intensificadores para conducir la expresión del ácido nucleico insertado, secuencias de ácido nucleico para producir el polipéptido BCRA2 como un producto de fusión y/o secuencias de ácido nucleico que codifican señales de secreción para que el polipéptido producido en la célula huésped se secrete. El polipéptido BCRA2 puede obtenerse mediante transformación de los vectores en las células huésped en las que el vector sea funcional, cultivo de las células huésped para que el polipéptido BCRA2 se produzca y recuperación del polipéptido BCRA2 de las células huésped o del medio de cultivo. Para este propósito, se utilizan células procariotas o eucariotas, incluyendo las cepas de E. coli, levaduras y células eucariotas como COS o CHO. La elección de la célula huésped puede utilizarse para controlar las propiedades del polipéptido BCRA2 expresado en estas células, p.ej., controlando si el polipéptido se ha depositado en las células huésped o afecta a propiedades como su glicosilación.

Las técnicas de PCR para la amplificación de ácidos nucleicos se describen en la patente americana U.S. 4.683.195. En general, dichas técnicas requieren que la información de secuencia de los extremos de la secuencia diana sea conocida para permitir que los cebadores adecuados 5' y 3' a diseñar sean idénticos o similares a la secuencia polinucleotídica que es la diana de amplificación. La PCR comprende las etapas de desnaturalización del ácido nucleico molde (si es de cadena doble), la hibridación del cebador con la diana y la polimerización. El ácido nucleico hibridado o utilizado como molde en la amplificación puede ser DNA genómico, cDNA o RNA. La PCR se puede utilizar para amplificar secuencias específicas de DNA genómico, secuencias de RNA específico y cDNA transcrito a partir de mRNA, secuencias de bacteriófagos o plásmidos. Las secuencias de ácido nucleico de BCRA2 que se proporcionan aquí permiten fácilmente a un experto en la materia diseñar los cebadores de la PCR, ver por ejemplo la Figura 8. Las referencias para la utilización general de las técnicas de PCR incluyen Mullis y col., Cold Spring Harbor Symp., Quant. Biol., 51: 263 (1987), Ehrlich (ed), PCR technology,Stockton Press, NY, 1989, Erlich y col., Science, 252:1643-1650 (1991), PCR protocols; A guide to methods and applications, Eds., Innis y col., Academic Press, New York (1990).

También se incluyen dentro del ámbito de la invención las secuencias oligonucleotídicas antisentido basadas en las secuencias de ácido nucleico de BCRA2 aquí descritas. Los oligonucleótidos antisentido pueden diseñarse para hibridar con la secuencia complementaria de ácido nucleico, el pre-mRNA o el mRNA maduro, interfiriendo con la producción de polipéptido codificado por una secuencia de DNA dada (p.ej., el polipéptido BCRA2 nativo o una forma mutante del mismo), de modo que su expresión se reduce o se impide totalmente. Además de la secuencia codificante de BCRA2, se pueden utilizar las técnicas antisentido para dirigir las secuencias control del gen BCRA2, p.ej., en la secuencia flanqueante 5' de la secuencia codificante de BCRA2, con lo que los oligonucleótidos antisentido pueden interferir con las secuencias control de BCRA2. La construcción de secuencias antisentido y de su utilización se describe en Peyman y Ulman, Chemical Reviews, 90:543-584 (1990), Crooke, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 32:329-376 (1992) y Zamecnik y Stephenson, P.N.A.S. 75:280-284, (1974).

Las secuencias de ácido nucleico proporcionadas en las Figuras 1, 2 y 4 son útiles para identificar el ácido nucleico de interés (las cuales pueden estar de acuerdo con la presente invención) en una muestra test. La presente invención proporciona un procedimiento de obtención del ácido nucleico de interés, el procedimiento incluye la hibridación de una sonda que tiene la secuencia mostrada en las figuras 1, 2 ó 4, o una secuencia complementaria, para hibridar con el ácido nucleico.

La hibridación se prosigue generalmente de la identificación de la hibridación satisfactoria y del aislamiento del ácido nucleico que ha hibridado con la sonda, pudiendo comprender una o más etapas de PCR.

De acuerdo con la presente invención, el ácido nucleico se obtiene utilizando una o más sondas oligonucleotídicas o cebadores diseñados para hibridar con uno o más fragmentos de la secuencia de ácido nucleico que se muestra en las figuras 1, 2 ó 4, en particular los fragmentos de secuencia relativamente rara, según la utilización de codones o análisis estadísticos. El cebador diseñado para hibridar con un fragmento de la secuencia de ácido nucleico mostrada en las figuras anteriores puede utilizarse junto con uno o más oligonucleótidos diseñados para hibridar con una secuencia en un vector de clonaje en el que se ha clonado el ácido nucleico, o el procedimiento denominado "RACE" (amplificación rápida de los extremos de cDNA) en donde los cDNAs de una librería se ligan a un engarce oligonucleotídico y se realiza una PCR utilizando un cebador que hibrida con la secuencia mostrada en las Figuras 1, 2 ó 4 y un cebador que hibrida con el engarce oligonucleotídico.

Dichas sondas oligonucleotídicas o cebadores, así como las secuencia de tamaño completo (y los alelos, variantes y derivados) también son útiles en el cribaje de una muestra test que contenga un ácido nucleico para la presencia de alelos y variantes, especialmente aquellos que confieren susceptibilidad o predisposición al cáncer, sondas que hibridan con una secuencia diana de una muestra obtenida de un individuo a analizar. Las condiciones de la hibridación pueden controlarse para minimizar la unión inespecífica, prefiriéndose condiciones de astringencia moderada a alta. Los expertos en la materia serán capaces de diseñar dichas sondas, marcarlas y elaborar las condiciones adecuadas para las reacciones de hibridación, con ayuda de libros de texto como los de Sambrook y col., (1989) y Ausubel y col. (1992).

Al igual que la determinación de la presencia de polimorfismos o mutaciones en la secuencia de BCRA2, las sondas pueden también utilizarse para determinar si el mRNA que codifica el BRCA2 está presente en una célula o tejido.

El ácido nucleico aislado y/o purificado de una o más células (p.ej., humanas) o de una librería de ácido nucleico derivada de ácido nucleico aislado y/o purificado a partir de células (p.ej., una librería de cDNA derivada del mRNA aislado de dichas células), puede hibridarse en condiciones de hibridación selectiva y/o someterse a una reacción de amplificación de ácido nucleico específica como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

En el contexto de clonaje, puede ser necesario ligar uno o más fragmentos génicos para generar una secuencia codificante de tamaño completo. También, si no se ha obtenido una molécula de ácido nucleico codificante de tamaño completo, puede utilizarse una molécula menor representativa de la molécula de tamaño completo para obtener los clones de tamaño completo. Los insertos se pueden preparar a partir de clones de cDNA parcial y utilizar para cribar las librerías de cDNA. Los clones de tamaño completo aislados se pueden subclonar en vectores de expresión y se puede analizar su expresión mediante transfección en células huésped adecuadas, p.ej., con un plásmido reportero.

Un procedimiento puede incluir la hibridación de una o más (dos) sondas o cebadores con el ácido nucleico diana. Si el ácido nucleico es de doble cadena, la hibridación se realizará generalmente mediante desnaturalización para producir DNA de cadena sencilla. La hibridación puede ser parte del procedimiento de PCR, o parte de un procedimiento de hibridación que no implique la PCR. Un ejemplo de procedimiento sería una combinación de PCR e hibridación a baja astringencia. Un procedimiento de cribaje, elegido a partir de los disponibles para los expertos en la materia, se utiliza para identificar satisfactoriamente los sucesos de hibridación y aislar el ácido nucleico hibridado.

La unión de una sonda con el ácido nucleico (p.ej., DNA) puede cuantificarse utilizando cualquiera de las muchas técnicas disponibles por los expertos en la materia. Por ejemplo, las sondas pueden mediante radioactividad, fluorescencia o enzimáticamente. Otros procedimientos que no utilizan el marcaje de sondas incluyen el examen de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, la amplificación utilizando la PCR, el corte por RNAasa y la hibridación con oligonucleótidos específicos de alelos.

La hibridación puede utilizar técnicas de transferencia de Southern estándares. Por ejemplo, el DNA puede extraerse de células y digerirse con distintas enzimas de restricción. A continuación, se pueden separar los fragmentos de restricción mediante electroforesis en gel de agarosa, desnaturalizar y transferir a un filtro de nitrocelulosa. La sonda marcada puede hibridarse a los fragmentos de DNA en el filtro y, por último, determinarse su unión. El DNA a hibridar se puede preparar a partir de preparaciones de RNA de células.

Los experimentos preliminares pueden realizarse hibridando en condiciones de baja astringencia diversas sondas para las transferencias de Southern de los DNAs digeridos con enzimas de restricción. Las condiciones adecuadas se alcanzan cuando se obtiene un gran número de fragmentos que hibridan mientras que el ruido de fondo de la hibridación se mantiene bajo. Utilizando estas condiciones, se puede realizar una búsqueda de librerías de ácidos nucleicos, por ejemplo, librerías de cDNA de secuencias expresadas.

Los expertos en la materia serán capaces de utilizar las condiciones adecuadas de astringencia deseada para una hibridación selectiva, teniendo en cuenta los factores como la longitud de oligonucleótidos y la composición de las bases, la temperatura y demás.

Según la información de la secuencia aminoacídica, se pueden diseñar sondas oligonucleotídicas o cebadores, teniendo en cuenta la degeneración del código genético y, cuando sea apropiado, la utilización del código del organismo de donde proviene el ácido nucleico candidato. Un oligonucleótido para utilizar en la amplificación de ácido nucleico puede tener aproximadamente 10 o menos codones (p.ej., 6, 7 u 8), es decir, tener aproximadamente 30 o menos nucleótidos de longitud (p.ej., 18, 21 ó 24). En general, los cebadores específicos tendrán más de 14 nucleótidos de longitud, pero no menos de 18-20. Los expertos en la materia conocen bien el diseño de cebadores para utilizar en procesos como la PCR.

En algunas realizaciones preferidas, los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención que son fragmentos de cualquiera de las secuencias de las figuras 1, 2 ó 4, o cualquier alelo asociado con la susceptibilidad al cáncer, son por lo menos de aproximadamente 10 nucleótidos de longitud, más preferentemente de por lo menos 15 nucleótidos de longitud, más preferentemente de por lo menos 20 nucleótidos de longitud. Dichos fragmentos representan individualmente aspectos de la presente invención. Se pueden utilizar fragmentos y otros oligonucleótidos como cebadores o sondas, tal como se discutió, pero también pueden generarse (p.ej., mediante PCR) en procedimientos relativos a la determinación de la presencia en una muestra test de una secuencia indicativa de la susceptibilidad al cáncer.

Se discuten más adelante los procedimientos que implican la utilización de un ácido nucleico en contextos diagnósticos y/o pronósticos, por ejemplo en la determinación de la susceptibilidad al cáncer de mama en mujeres, cáncer de mama en hombres, cáncer de ovario o cáncer de próstata, y otros procedimientos relativos con la determinación de la presencia de secuencias indicativas de susceptibilidad al cáncer.

Un procedimiento conveniente de producción de un polipéptido de acuerdo con la presente invención es expresar el ácido nucleico que lo codifica, utilizando el ácido nucleico en un sistema de expresión. En la actualidad, la utilización de sistemas de expresión ha alcanzado un grado importante de sofisticación.

Según ello, la presente invención también abarca un procedimiento para la realización de un polipéptido (tal como se describió), el procedimiento incluye la expresión del ácido nucleico que codifica para el polipéptido (generalmente el ácido nucleico de acuerdo con la invención). Ello se puede lograr de forma adecuada creciendo las células huésped en un cultivo, conteniendo dichas células un vector, en condiciones adecuadas que causen o permitan la expresión del polipéptido. Los polipéptidos también se pueden expresar en sistemas in vitro, como el lisado de reticulocitos.

Son bien conocidos los sistemas de clonaje y expresión de un polipéptido en diversas tipos de células huésped. Células huésped adecuadas incluyen las bacterias, las eucariotas como las células de mamífero y las levaduras, y los sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la materia para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen las células de ovario de hámster chino, las células HeLa, las células de riñón de cría de hámster, las células COS y muchas otras. Un huésped bacteriano frecuente y preferido es E. coli.

Los vectores adecuados se pueden elegir o construir, conteniendo secuencias reguladoras adecuadas, incluyendo secuencias promotoras, fragmentos terminadores, secuencias de poliadenilación, secuencias intensificadoras, genes marcadoras y otras secuencias convenientes. Los vectores pueden ser plásmidos, virus, p.ej. fagos o fagémidos. Para mayores detalles véase por ejemplo, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2º edición, Sambrook y col., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Muchas de las técnicas conocidas y protocolos para la manipulación de ácidos nucleicos, por ejemplo en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, introducción del DNA en las células y expresión génica y análisis de proteínas, se describen con detalle en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, 1992.

Por ello, en otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula huésped que contiene un ácido nucleico tal como se describió aquí. El ácido nucleico de la invención puede estar integrado en el genoma (p.ej., cromosoma) de la célula huésped. La integración puede facilitarse por la inclusión de secuencias que estimulan la recombinación con el genoma, de acuerdo con técnicas estándares. El ácido nucleico puede estar en un vector extracromosómico en la célula.

En otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento que incluye la introducción del ácido nucleico en una célula huésped. La introducción, que puede (en particular para la introducción in vitro) ser referida generalmente sin limitación como "transformación", puede utilizar cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección con fosfato cálcico, DEAE-Dextran, la electroporación, la transfección mediada con liposomas y la transducción utilizando retrovirus u otros virus, p.ej., vaccinia o, para células de insectos, baculovirus. Para células bacterianas, técnicas adecuadas pueden incluir la transformación con cloruro cálcico, la electroporación y la transfección utilizando un bacteriófago. Como una alternativa, se podría utilizar la inyección directa del ácido nucleico.

Se pueden utilizar genes marcadores como los de resistencia a antibióticos en la identificación de clones que contengan el ácido nucleico de interés, como bien se conoce en la materia.

La introducción puede proseguirse causando o provocando la expresión del ácido nucleico, p.ej., cultivando las células huésped (pudiendo incluir células transformadas, aunque más probablemente las células serán los descendientes de las células transformadas) en condiciones para la expresión del gen, de modo que se produzca el polipéptido codificado. Si el polipéptido se expresa acoplado a un péptido señal líder adecuado, puede ser secretado por la célula al medio de cultivo. Después de la producción mediante expresión, se puede aislar el polipéptido y/o purificar de la célula huésped y/o medio de cultivo, según sea el caso, y a continuación puede utilizarse según se desee, p.ej., en la formulación de una composición que puede incluir uno o más de un componente, como una composición farmacéutica que incluya uno o más de un excipiente, vehículo o vector aceptable farmacéuticamente (p.ej., véase más adelante).

Las células huésped se pueden utilizar como una fábrica de ácidos nucleicos para replicar el ácido nucleico de interés con el fin de generar grandes cantidades de éste. Se pueden obtener múltiples copias del ácido nucleico de interés dentro de una célula cuando está acoplado con un gen amplificable como el DHFR. Las células huésped transformadas con el ácido nucleico de interés, o las descendientes de las células huésped en las que se ha introducido el ácido nucleico, pueden cultivarse en condiciones adecuadas, p.ej., en un fermentador, recogerse del cultivo y someterse al proceso de purificación del ácido nucleico. Después de la purificación, el ácido nucleico o uno o más fragmentos de lo mismo se pueden utilizar tal como se desee, por ejemplo en un ensayo diagnóstico o pronóstico, tal como se discute aquí.

Producción de polipéptidos BCRA2

El experto en la materia puede utilizar las técnicas descritas aquí y otras bien conocidas en la materia para producir grandes cantidades de polipéptido BCRA2, o fragmentos o porciones activas de lo mismo, para utilizar como productos farmacéuticos, en el desarrollo de fármacos y para el estudio posterior de sus propiedades y función in vivo. El trabajo experimental que confirma la producción de polipéptido BCRA2 se describe en el Ejemplo 3 de más adelante.

Por ello, en un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un polipéptido que tiene la secuencia aminoacídica que se muestra en las figuras 3 ó 5 y que puede estar en forma aislada y/o purificada, libre o esencialmente libre de material con el que se halla asociado de forma natural, como otros polipéptidos, por ejemplo polipéptidos humanos distintos al polipéptido BCRA2 o (por ejemplo si se produce mediante expresión en una célula procariota) carente de la glicosilación nativa, p.ej., no glicosilados.

Los polipéptidos que son variantes de secuencia aminoacídica, alelos o derivados también se proporcionan por la presente invención. Un polipéptido que es una variante, alelo, o derivado puede tener una secuencia aminoacídica que difiera de las proporcionadas en las Figuras 3 ó 5 por una o más de una adición, sustitución, deleción e inserción de uno o más aminoácidos. Tales polipéptidos preferidos tienen función de BCRA2, es decir, poseen una o más de las propiedades siguientes: reactividad inmunológica cruzada con un anticuerpo reactivo con el polipéptido cuya secuencia se muestra en las Figuras 3 ó 5; comparte un epitopo con el polipéptido cuya secuencia se muestra en las Figuras 3 ó 5 (determinado por ejemplo mediante reactividad inmunológica cruzada entre dos polipéptidos.

A modo de ejemplo, las variantes mutacionales representativas de realizaciones preferidas de la presente invención se muestran en la Tabla 1. El rastreo para la presencia de uno o más de estas variantes en una muestra test tiene una utilidad diagnóstica y pronóstica, por ejemplo en la determinación de la susceptibilidad al cáncer, tal como se discute más adelante.

Un polipéptido de acuerdo con la presente invención puede aislarse y/o purificarse (p.ej., utilizando un anticuerpo) por ejemplo después de la producción mediante expresión del ácido nucleico codificante (para lo cual véase más adelante). Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención pueden también generarse total o parcialmente mediante síntesis química. El polipéptido aislado y/o purificado puede utilizarse en la formulación de una composición, que puede incluir al menos un componente adicional, por ejemplo una composición farmacéutica incluyendo un excipiente, vehículo o vector aceptable farmacéuticamente. Una composición que incluye un polipéptido de acuerdo con la invención puede utilizarse en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico, tal como se discute más adelante.

Un polipéptido, fragmento peptídico, alelo o variante de acuerdo con la presente invención puede utilizarse como un inmunógeno o dicho de otra manera en la obtención de anticuerpos específicos. Los anticuerpos son útiles en la purificación y otras manipulaciones de polipéptidos y péptidos, cribaje diagnóstico y contextos terapéuticos. Todo ello se discute más adelante.

Producción de anticuerpos BCRA2

Otra utilización importante de los polipéptidos BCRA2 es la producción de anticuerpos que tengan la propiedad de unirse específicamente a los polipéptidos BCRA2, o fragmentos o porciones activas de lo mismo.

La producción de anticuerpos monoclonales está bien estandarizada en la materia. Los anticuerpos monoclonales pueden someterse a técnicas de la tecnología del DNA recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retengan la especificidad del anticuerpo original. Dichas técnicas pueden implicar la introducción del DNA que codifica la región variable de la inmunogloblulina, o las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), de un anticuerpo con las regiones constantes, o las regiones constantes más las regiones de entramado, de una inmunoglobulina distinta. Véase, por ejemplo, la patente europea EP-A-184187, la patente inglesa GB-A-2188638 o la patente europea-A-239400. Un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales puede someterse a una mutación genética u otros cambios, que pueden o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

La producción de nuevos polipéptidos BCRA2 permite por primera vez la producción de anticuerpos capaces de unirse a éstos específicamente. Según ello, en otro aspecto de la invención se proporciona un anticuerpo capaz de unirse específicamente al polipéptido cuya secuencia se muestra en las Figuras 3 ó 5. Un tal anticuerpo puede ser específico en el sentido de que es capaz de diferenciar entre el polipéptido capaz de unirse y otros polipéptidos humanos para los cuales no tiene esencialmente afinidad de unión (p.ej., una afinidad de unión de aproximadamente 1000 veces peor). Los anticuerpos específicos se unen a un epitopo sobre la molécula que o bien no está presente o no es accesible en otras moléculas. Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser específicos para el polipéptido de tipo salvaje. De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos pueden ser específicos para una variante, alelo o derivado polipeptídico particular como por ejemplo entre la molécula y el polipéptido BCRA2 de tipo salvaje, con lo que pueden ser útiles en procedimientos diagnósticos y pronósticos tal como se discute más adelante. Los anticuerpos son también útiles en la purificación del polipéptido o polipéptidos a los cuales se unen, p.ej., después de la producción mediante expresión recombinante del ácido nucleico codificante.

De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos preferidos se aíslan, en el sentido de estar exentos de contaminantes, como anticuerpos capaces de unirse a otros polipéptidos y/o libres de componentes del suero. Los anticuerpos monoclonales son preferibles para ciertos propósitos, aunque los anticuerpos policlonales se hallan dentro del ámbito de la presente invención.

Los anticuerpos pueden obtenerse utilizando técnicas que son estándares en la materia. Los procedimientos de producción de anticuerpos incluyen la inmunización de un mamífero (p.ej., ratón, rata, conejo. Caballo, cabra, oveja o mono) con la proteína o un fragmento de lo mismo. Los anticuerpos se pueden obtener de animales inmunizados utilizando una variedad de técnicas conocidas en la materia y rastrear preferentemente, mediante la unión del anticuerpo al antígeno de interés. Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas de transferencia de Western o la inmunoprecipitación (Armitage y col., Nature, 357:80-82, 1992). El aislamiento de anticuerpos y/o las células productoras de anticuerpos de un animal se logra tras una etapa que incluye el sacrificio del animal.

Como alternativa o complemento a la inmunización de un mamífero con un péptido, un anticuerpo específico para una proteína puede obtenerse a partir de una librería producida de forma recombinante de dominios variables de inmunogloblina expresados, p.ej., utilizando el bacteriófago lambda o el bacteriófago filamentoso que expresa dominios de unión de inmunoglobulina funcionales en sus superficies; por ejemplo, ver la patente internacional WO92/01047. La librería puede ser naif, es decir construida a partir de secuencias obtenidas de un organismo que no ha sido inmunizado con cualquiera de las proteínas (o fragmentos), o puede construirse utilizando secuencias obtenidas de un organismo que ha sido expuesto al antígeno de interés.

De acuerdo con la presente invención, los anticuerpos pueden estar modificados de muy diversas formas. El término "anticuerpo" debería interpretarse como un término que abarca cualquier sustancia de unión que tenga un dominio de unión con la especificidad requerida. Por ello, la invención abarca los fragmentos de anticuerpos, los derivados, los equivalentes funcionales y los homólogos de anticuerpos, incluyendo las moléculas sintéticas y las moléculas cuya forma mimetiza la de un anticuerpo, impidiéndole su unión a un antígeno o epitopo.

Ejemplos de fragmentos de anticuerpos, capaces de unirse a un antígeno u otra pareja de unión son el fragmento Fab que consiste de los dominios VL, VH, CI y CH1; el fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; el fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; el fragmento dAb que consiste de un dominio VH; aislado de regiones CDR y fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que incluye dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra. También se incluyen los fragmentos Fv de cadena sencilla.

Los anticuerpos humanizados en los que se injertan CDRs de origen no humano en regiones de entramado humanas con la alteración típica de algunos de los residuos aminoacídicos de la región de entramado, para proporcionar anticuerpos que son menos inmunogénicos que los anticuerpos no humanos parentales, también incluidos en la presente invención.

Un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la presente invención puede someterse a mutación genética o a otros cambios. Se entenderá por los expertos en la materia que un anticuerpo monoclonal pueda someterse a técnicas de tecnología del DNA recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que retengan la especificidad del anticuerpo original. Dichas técnicas pueden implicar la introducción del DNA que codifica para la región variable de la inmunoglobulina, o las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs), de un anticuerpo con las regiones constantes, o las regiones constantes más las regiones de entramado, de una inmunoglobulina distinta. Ver, por ejemplo, la patente europea EP-A-184187, la patente inglesa GB-A-2188638 o la patente europea EP-A-0239400. El clonaje y la expresión de anticuerpos quiméricos se describen en la patente europea EP-A-0120694 y la patente europea EP-A-0125023.

Los hibridomas capaces de producir anticuerpos con las características de unión se hallan dentro del ámbito de la presente invención, al igual que las células huésped, eucariotas o procariotas, que contienen el ácido nucleico que codifica los anticuerpos (incluyendo fragmentos de anticuerpos) y capaces de realizar su expresión. La invención también proporciona los procedimientos de producción de los anticuerpos, incluyendo el crecimiento de una célula capaz de producir el anticuerpo en condiciones en las que se produzca el anticuerpo y preferentemente se
secrete.

Las reactividades de los anticuerpos en una muestra pueden determinarse mediante cualquier medio adecuado. Una posibilidad es el marcaje con moléculas reporteras individuales. Las moléculas reporteras pueden generar de forma directa o indirecta señales detectables y preferentemente cuantificables. La unión de moléculas reporteras puede ser directa o indirectamente, covalentemente, p.ej., mediante un enlace peptídico o no-covalente. La unión mediante un enlace peptídico puede ser el resultado de la expresión recombinante de un gen de fusión que codifica un anticuerpo y la molécula reportera.

Uno de los modos preferidos es la unión covalente de cada anticuerpo con un fluorocromo, fósforo o colorante láser con una absorción aislada espectralmente o emisión características. Los fluorocromos adecuados incluyen la fluoresceína, la rodamina, la ficoeritrina y el Texas Red. Los colorantes cromogénicos adecuados incluyen la diaminobenzidina.

Otras moléculas reporteras incluyen partículas coloidales macromoleculares o material particulado como las bolas de látex que son coloreadas, magnéticas o paramagnéticas y los agentes activos biológica o químicamente que pueden causar directa o indirectamente señales detectables visualmente observables, detectadas electrónicamente o registradas. Estas moléculas pueden ser enzimas que catalizan reacciones que desarrollan o cambian el color o causan cambios en las propiedades eléctricas, por ejemplo. Pueden ser excitables molecularmente, de modo que las transiciones electrónicas entre los estados de energía dan como resultado absorciones espectrales o emisiones características. Pueden incluir entidades químicas junto con biosensores. Se pueden utilizar sistemas de detección biotina/avidina o biotina/estreptavidina y fosfatasa alcalina.

La manera de determinar la unión no es una característica de la presente invención, con lo que los expertos en la materia son capaces de elegir un modo adecuado de acuerdo con sus preferencias y conocimientos generales.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse para el rastreo de la presencia de un polipéptido, por ejemplo, en una muestra test que contenga células o lisados celulares tal como se discutió anteriormente y pueden utilizarse en la purificación y/o aislamiento de un polipéptido de la invención, por ejemplo después de la producción del polipéptido mediante expresión del ácido nucleico codificante. Los anticuerpos pueden modular la actividad del polipéptido al que se unen y en consecuencia, si el polipéptido tiene un efecto deletéreo en un individuo, se pueden utilizar en un contexto terapéutico (que podría incluir la profilaxis).

Un anticuerpo se puede proporcionar en un equipo, que puede incluir las instrucciones del anticuerpo, p.ej., en la determinación de la presencia de una sustancia en particular en una muestra test. Pueden incluirse otros reactivos más, como por ejemplo moléculas de marcaje, soluciones de tampón, eluyentes y demás. Los reactivos se pueden proporcionar dentro de recipientes que los protejan del medio externo, como un vial estanco.

Procedimientos diagnósticos

Una serie de procedimientos son conocidos en la materia para el análisis de muestras biológicas de individuos para determinar si los individuos portan un alelo BRCA2 de predisposición al cáncer, especialmente al cáncer de mama (de mujer u hombre) o de cáncer de ovario o de cáncer de próstata. El objetivo de dicho análisis puede utilizarse para el diagnóstico o el pronóstico y servir para detectar la presencia de un cáncer existente, para ayudar a identificar el tipo de cáncer, para facilitar al médico la determinación de la gravedad o probablemente del curso del cáncer y/o para optimizar el tratamiento de éste. Alternativamente, los procedimientos pueden utilizarse para detectar alelos BCRA2 que están asociados estadísticamente con una susceptibilidad al cáncer en el futuro, p.ej., cáncer de mama de aparición temprana, identificación de individuos que podrían beneficiarse de un cribaje para proporcionar un diagnóstico precoz del cáncer. Ejemplos de procedimientos de rastreo para mutaciones de BRCA2 se describen en el ejemplo 5 de más adelante.

En general, los procedimientos se dividen en procedimientos de rastreo de la presencia de secuencias de ácido nucleico de BRCA2 o de alelos o de variantes de lo mismo y procedimientos basados en la detección de la presencia o ausencia del polipéptido BRCA2. Los procedimientos emplean muestras biológicas de los individuos sospechosos de contener las secuencias del ácido nucleico o del polipéptido. Ejemplos de muestras biológicas incluyen la sangre, el plasma, el suero, las muestras de tejido, las muestras tumorales, la saliva y la orina.

En la mayoría de realizaciones para el rastreo de alelos BRCA2 de susceptibilidad, se amplifica inicialmente el ácido nucleico en la muestra, p.ej., utilizando la PCR, para aumentar la cantidad del analito en comparación con otras secuencias presentes en la muestra. Esto permite que las secuencias diana se detecten con un grado elevado de sensibilidad si se hallan en la muestra. Esta etapa inicial puede eliminarse utilizando técnicas en serie altamente sensible que se están volviendo de gran importancia en la materia.

La identificación del gen BRCA2 y su asociación con el cáncer prepara el terreno de otros aspectos de la presente invención al proporcionar la utilización de materiales y procedimientos, como los descritos y discutidos anteriormente, para el establecimiento de la presencia o ausencia en una muestra test de una forma variante del gen, en particular un alelo o una variante asociada específicamente con el cáncer, especialmente con el cáncer de mama y de ovario. Esto puede servir para el diagnóstico de una predisposición individual al cáncer. Puede utilizarse para diagnosticar el cáncer de un paciente, habiéndose asociado la enfermedad con dicho gen.

Ello permite planificar un tratamiento terapéutico y/o profiláctico adecuado, permitiendo racionalizar mejor el tratamiento al dirigirlo a aquellos que puedan obtener beneficiarse con éste.

Una forma variante del gen puede contener uno o más inserciones, deleciones, sustituciones y/o adiciones de uno o más nucleótidos comparado con la secuencia de tipo salvaje (tal como se muestra en la Tabla 1) que puede o no interrumpir la función génica. Las diferencias a nivel de ácido nucleico no se reflejan necesariamente por una diferencia en la secuencia aminoacídica del polipéptido codificado. Sin embargo, una mutación u otra diferencia en un gen puede dar como resultado un desplazamiento de la pauta de lectura o la aparición de un codón de parada, que podría afectar gravemente la naturaleza del polipéptido producido (si lo hubiera), o una mutación puntual o un cambio mutacional importante en el polipéptido codificado, incluyendo inserciones, deleciones, sustituciones y/o adiciones de uno o más aminoácidos o regiones aminoacídicas en el polipéptido. Una mutación en una secuencia promotora u otra región reguladora puede evitar o reducir la expresión del gen o afectar el procesamiento o la estabilidad del tránscrito de mRNA.

Existen diversos procedimientos para determinar la presencia o la ausencia en una muestra test de una secuencia de ácido nucleico en particular, como la secuencia que se muestra en las Figuras 1, 2 ó 4 o una variante o un alelo de lo mismo.

Los análisis se pueden llevar a cabo en preparaciones que contengan DNA genómico, cDNA y/o mRNA. El análisis de cDNA o mRNA tiene la ventaja de que se reduce la complejidad del ácido nucleico por la ausencia de secuencias intrónicas, pero presenta la posible desventaja de necesitar más tiempo y más esfuerzos para realizar las preparaciones. El RNA es más difícil de manipular que el DNA debido a la presencia extensa de RNasas.

El ácido nucleico en una muestra test se puede secuenciar y su secuencia comparar con la mostrada en las Figuras 1, 2 ó 4 para determinar si existe o no una diferencia. En caso afirmativo, la diferencia se puede comparar con alelos de susceptibilidad conocidos (p.ej., tal como se resume en la tabla 1) para determinar si el ácido nucleico contiene alguna de las variaciones indicadas, o la diferencia puede investigarse por su asociación con el cáncer.

Dado que no es practicable ni eficiente secuenciar todo ácido nucleico en una muestra test o incluso de todo el gen BRCA2, se puede utilizar una reacción de amplificación específica como la PCR utilizando una o más parejas de cebadores para amplificar la región de interés en el ácido nucleico, por ejemplo el gen BRCA2 o una región en particular donde se produzcan mutaciones asociadas con la susceptibilidad al cáncer. Ejemplos de cebadores para este propósito se muestran en la Figura 8. El ácido nucleico amplificado puede secuenciarse entonces como antes y/o analizarse de cualquier otra manera para determinar la presencia o ausencia de una característica determinada. El ácido nucleico para el análisis puede prepararse a partir del ácido nucleico extraído de células o en una librería utilizando diversas otras técnicas como la digestión con enzimas de restricción y la electroforesis.

Se pueden utilizar de igual forma oligonucleótidos específicos de alelos o variantes en la PCR para amplificar específicamente secuencias determinadas en el caso se hallarse presentes en una muestra test. La valoración de que una banda de PCR contenga una variante génica puede llevarse a cabo de muy diversas maneras por los expertos en la materia. El producto de PCR puede, por ejemplo, tratarse de forma que se permita la visualización de la mutación o el polimorfismo en un gel de secuenciación de DNA de poliacrilamida desnaturalizante, seleccionándose las bandas que están ligadas a las variantes génicas.

Un procedimiento alternativo o adicional para buscar la presencia de secuencias variantes en una muestra test es buscar la presencia de la secuencia normal, p.ej., utilizando un cebador oligonucleotídico específico y adecuado.

La presencia o ausencia de una lesión en un promotor u otra región reguladoras puede también valorarse determinando el nivel de producción de mRNA mediante transcripción o el nivel de la producción de poipéptido mediante traducción a partir del mRNA.

Una muestra test de ácido nucleico puede proporcionarse por ejemplo mediante extracción del ácido nucleico de las células, p.ej., de la saliva o preferentemente de sangre, o para un análisis prenatal del amnion, placenta o del propio feto.

Existen diversos procedimientos para determinar la presencia o ausencia de una muestra test de un polipéptido determinado, como el polipéptido con la secuencia aminoacídica que se muestra en las Figuras 3 ó 5 o en una secuencia aminoacídica variante o alelo de lo mismo.

Se puede analizar una muestra para la presencia de una pareja de unión para un miembro de unión específico como por ejemplo un anticuerpo (o mezcla de anticuerpos) y específico para una o más de las variantes particulares del polipéptido que se muestran en las Figuras 3 ó 5.

Se puede analizar una muestra para la presencia de una pareja de unión para un miembro de unión específico como un anticuerpo (o una mezcla de anticuerpos) y específico para el polipéptido que se muestra en las Figuras 3 ó 5.

En dichos casos, la muestra puede analizarse contactándola con un miembro de unión específico como un anticuerpo en condiciones adecuadas para la unión específica, antes de determinar la unión, por ejemplo utilizando un sistema reportero tal como se citó anteriormente. Si se utiliza un panel de anticuerpos, se pueden utilizar distintos marcajes reporteros para cada anticuerpo, a fin de poder determinar la unión de cada uno de ellos.

Se puede utilizar un miembro de unión específico como un anticuerpo para aislar y/o purificar su pareja de unión polipeptídica en una muestra test, para permitir el análisis de secuencia y/o bioquímico del polipéptido y determinar si tiene la secuencia y/o las propiedades del polipéptido cuya secuencia se muestra en las Figuras 3 ó 5, o si es una forma mutante o variante. La secuenciación de aminoácidos es una técnica rutinaria en la materia ya que utiliza máquinas de secuenciación automatizada.

También existe una elevada tendencia en el campo diagnóstico hacia la miniaturización de dichos ensayos, p.ej., utilizando agentes de unión (como anticuerpos o secuencias de ácido nucleico) inmovilizadas en localizaciones discretas y pequeñas (micromanchas) y/o como series en soportes sólidos o en chips de diagnóstico. Estas aproximaciones puede ser muy valiosas ya que pueden proporcionar una gran sensibilidad (en especial gracias a la utilización de reactivos marcados con fluorescencia), requieren únicamente muy pocas cantidades de muestra biológica de los individuos que se analizan y permite una gran variedad de ensayos que pueden llevarse a cabo por separado o simultáneamente. Esta última ventaja puede ser de utilidad ya que proporciona un ensayo de diferentes mutaciones en el gen BRCA2 o en otro gen de susceptibilidad al cáncer (como el BRCA1, ver la patente europea EP-A-705902) para llevarse a cabo utilizando un única muestra. Ejemplos de técnicas que permiten esta tecnología miniaturizada se proporcionan en las patentes internacionales WO84/01031, WO88/1058, WO89/01157, WO93/8472, WO95/18376, WO95/18377, WO95/24649 y la patente europea EP-A-0373203. Por ello, en otro aspecto de la presente invención, se proporciona un equipo que comprende un chip diagnóstico o de soporte con uno o varios agentes de unión inmovilizados capaces de unirse específicamente al ácido nucleico o a los polipéptidos de BRCA2, opcionalmente y en combinación con otros reactivos (como los reactivos reveladores del marcaje) han de presentarse en el ensayo.

Terapéuticos Terapias farmacéuticas y peptídicas

Los polipéptidos, anticuerpos, péptidos y el ácido nucleico de BRCA2 de la invención pueden formularse en composiciones farmacéuticas. Estas composiciones pueden comprender, además de una de las sustancias anteriores, un excipiente aceptable farmacéuticamente, vehículo, tampón, estabilizante u otros materiales bien conocidos por los expertos en la materia. Dichos materiales no deberían ser tóxicos y no deberían interferir con la eficiencia del ingrediente activo. La naturaleza precisa del vehículo u otro material puede depender de la vía de administración, p.ej., vía oral, intravenosa, cutánea o subcutánea, nasal, intramuscular, intraperitoneal.

Las composiciones farmacéuticas para la administración oral pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede incluir un vehículo sólido como una gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas incluyen generalmente un vehículo líquido como el agua, el petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o sintético. Pueden incluirse una solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles como el etilén glicol, el propilén glicol o el polietilén glicol.

Para una inyección intravenosa o subcutánea, o inyección en el sitio de aflicción, el principio activo estará en la forma de una solución acuosa aceptable que sea apirógena y tenga un pH, isotonicidad y estabilidad aceptables. Los expertos en la materia serán capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos como la inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de Ringer lactado. Según se requiera, se pueden incluir conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/o otros aditivos.

La sustancia que se administre al individuo puede ser un polipéptido, anticuerpo, péptido, molécula de ácido nucleico, pequeñas moléculas u otros compuestos de utilidad farmacéutica de acuerdo con la presente invención. Su administración será preferentemente en una "cantidad efectiva profilácticamente" o una "cantidad efectiva terapéuticamente" (según sea el caso, aunque la profilaxis puede considerarse una terapia), que será suficiente para mostrar un beneficio al individuo. La cantidad real administrada y la tasa y tiempo de administración dependerán de la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se trate. La prescripción de tratamiento, p.ej., las decisiones sobre la dosificación y etc. son responsabilidad de los médicos generalistas y de otros especialistas, y tiene en consideración la enfermedad a tratar, la condición del paciente, el sitio de liberación del fármaco, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los médicos. Ejemplos de técnicas y protocolos mencionados anteriormente pueden hallarse en Remington Pharmaceutical Sciences, 16ª edición, Osol, A. (ed.) 1980.

Alternativamente, las terapias dirigidas pueden utilizarse para liberar el principio activo más específicamente a ciertos tipos de células, mediante la utilización de sistemas de marcaje como un anticuerpo o ligandos específicos de células. El marcaje de direccionamiento puede ser deseable por diversas razones; por ejemplo, si el agente es inaceptablemente tóxico, o si fuera necesario una dosis muy elevada, o si no fuera capaz de entrar en las células diana.

En lugar de administrar estos agentes directamente, se podrían producir en las células diana mediante expresión de un gen codificante introducido en las células, p.ej., un vector viral (una variante de la técnica VDEPT - véase más adelante). El vector podría dirigirse a las células específicas a tratar, o podría contener elementos reguladores que se activarían más o menos selectivamente por las células diana.

Alternativamente, el agente podría administrarse en una forma precursora, para la conversión de la forma activa por un agente activador producido en, o dirigido a, las células a tratar. Este tipo de aproximación es conocida como ADEPT o vDEPT; la primera implica dirigir el agente activador a las células mediante conjugación con un anticuerpo específico de la célula, mientras que la última implica la producción del agente activador, por ejemplo de una enzima, en un vector mediante expresión a partir del DNA codificante en un vector viral (véase por ejemplo, la patente europea EP-A-415731 y la patente internacional WO90/07936).

Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, bien simultáneamente o secuencialmente dependiendo de la afección a tratar.

Ejemplo 1 Identificación del gen BRCA2

De acuerdo con la definición del intervalo D13S289-D13S297 en donde se cree se halla el gen BRCA2 (Wooster y col., (1994)), se utilizaron diversos procedimientos para identificar el gen. Se construyó un contigo de cromosomas artificiales de levaduras (YAC) de YACS dentro de la región a partir de los resultados del banco de datos CEPH. Se examinaron los quimerismos de YACS utilizando hibridación in situ fluorescente. Se identificaron los solapamientos de YACs mediante amplificación de sitios etiquetados por la secuencia (STS), la hibridación de productos de PCR STS y de impronta digital por alu-PCR.

Utilizando sondas localizadas en y derivadas de cóntigos de YAC, se rastreó una librería de cromosomas artificiales de P1 (PAC) y se aislaron PACs positivos. Estos PACs se rehibridaron con la librería PAC para rellenar los huecos entre clones. A continuación se pudo reunir una región de 1 megabase con los cóntigos de PACs.

Los solapamientos entre PACs se identificaron mediante:

(a) amplificación de STS;

(b) hibridación de sondas de los extremos producidas por PCR lineal;

(c) Impronta digital HindIII/Sau3A.

Los marcadores polimórficos adicionales de la región se identificaron mediante rastreo de librerías en M13 construidas a partir de PACs, con oligonucleótidos que contenían secuencias repetidas que son comúnmente polimórficas (Gn, Gan, CAGn, GATAn, GAATn). Utilizando nuevos marcadores, la región en donde el BRCA2 se localiza probablemente se acotó posteriormente.

Los tránscritos de la región se identificaron utilizando los DNAs de PAC en:

(a) experimentos de exon-trapping utilizando un vector lambda GET;

(b) selección del híbrido entre las librerías de DNA genómico y cDNA en PACs.

Los exones y los fragmentos de cDNA identificados mediante estos procedimientos se secuenciaron.

Utilizando cebadores sintetizados a partir de estas secuencias como sondas, se identificaron subclones genómicos de 15Kb de los PACs que portaban todo o una parte de los cDNAs y se identificaron los exones. Estos se secuenciaron a partir de la secuencia de cDNA en secuencias genómicas flanqueantes adyacentes.

Utilizando cebadores oligonucleotídicos sintetizados teniendo en cuenta las secuencias genómicas flanqueantes, se amplificaron los fragmentos de DNA que contenían el tránscrito potencial y se analizó la presencia de mutaciones en las muestras de DNA siguientes: DNAs de 46 familias con evidencia de ligamiento con el gen BRCA2 y/o evidencia en contra del ligamiento con BRCA1 y/o sin mutaciones en BRCA1 y/o con evidencia de cáncer de mama. También se rastrearon las líneas celulares de cáncer que eran homocigotas para todos los marcadores polimórficos en la región de BRCA2; DNAs de 12 tumores humanos primarios que muestran evidencias de pérdida de heterocigosis en la región de BRCA2.

Se detectaron variantes de secuencia migrando los productos de amplificación marcados con P^{32} en:

(a) geles de poliacrilamida desnaturalizante a temperatura ambiente y a 4ºC;

(b) geles de poliacrilamida desnaturalizante.

Los fragmentos que mostraron una movilidad alterada se reamplificaron mediante PCR y se secuenciaron directamente. Las secuencias se migraron en un secuenciador ABI 377 DNA.

Durante este trabajo, se detectaron algunas variantes de secuencia, muchas de las cuales se pensó que no estaban asociadas con polimorfismos. Sin embargo, una anomalía detectada en un fragmento predijo la destrucción de un sitio de ayuste y creaba la finalización de un codón en una familia que presenta fuerte ligamiento con el BRCA2. Las variantes segregaban con el cromosoma de la enfermedad. Esto es precisamente el tipo de anomalía que se esperaría en un gen de susceptibilidad al cáncer y hacen de este fragmento un fuerte candidato para parte del gen BRCA2.

A continuación se utilizó este fragmento (a) como una sonda en el rastro de librerías de cDNA, (b) como una secuencia de inicio para los experimentos de amplificación por PCR a partir de cDNAs y librerías de cDNA. Los clones positivos y los fragmentos de amplificación se secuenciaron. Estos resultados se muestran en las figuras 1 y 2.

A partir del aislamiento inicial de esta parte del exón 16 del gen BRCA2, se utilizaron diversas técnicas convencionales para aislar las porciones restantes de la secuencia de BRCA2.

La secuencia de 900.000 pb obtenida de Internet (Secuencia Sanger) ayudó en este proceso. La figura 4 muestra alrededor del 75% de la secuencia de cDNA aislada por los inventores, mientras que la secuencia del gen BRCA2 completa, incluyendo la estructura exón/intrón, se muestra en la figura 7. La región promotora del gen se muestra en la figura 6. Estas secuencias pudieron obtenerse del sitio ftp y guardarse en el ordenador local. Las secuencias, a continuación, se pueden analizar utilizando programas como el BLAST, FASTA, GRAIL o el GeneFinder para identificar las regiones codificantes putativas. De este modo pueden oligos entonces para estas regiones codificantes predichas y se pueden utilizar en la RT-PCR para confirmar o rechazar las regiones codificantes. Las regiones codificantes también podrían compararse con los resultados experimentales de los procesos aquí mostrados.

Por ello, dado el conocimiento de una parte de la secuencia de BRCA2 y su orientación en la secuencia de Sanger, el experto en la materia podrá fácilmente aislar el resto de la secuencia utilizando un programa convencional de predicción de exones para localizar las pautas de lectura/exones potenciales en la misma orientación que la porción conocida de la secuencia de BRCA2 y así realizar la conexión de exones en los exones potenciales que se utilizan para diseñar los cebadores que se hallan en la secuencia codificante putativa. Los cebadores se diseñan de modo que un cebador se basa en la secuencia de BRCA2 conocida y el otro cebador es desconocido, así cuando se utilizan dichos cebadores para hibridar con el cDNA se produce un producto contiguo con secuencia conocida si el cebador desconocido es parte del gen BRCA2. Este proceso podría continuarse de forma reiterativa, permitiendo que un experto en la materia se desplace por la secuencia de Sanger para obtener la secuencia completa de BRCA2, obteniendo las uniones intrón/exón como parte del proceso. En el caso de BRCA2, una gran porción de la secuencia codificante (aproximadamente 5 Kb) se halla en el exón 11, parte del cual se incluye en el 10% de la secuencia descrita en las figuras 1 y 2.

A modo de referencia, las técnicas descritas anteriormente y otras de utilidad para el aislamiento de genes mediante clonaje posicional se revisan en Monaco, Curr. Opinion Gen. Devl., 4:360-365, 1994 y se resumen en la patente europea EP-A-0705902.

A modo de ayuda, más adelante se describe un protocolo para el aislamiento de la secuencia de tamaño completo y del polipéptido codificado por el gen BRCA2 a partir de la secuencia que se muestra en las figuras 1, 2 y 4 y podrían utilizarse reiterativamente para aislar porciones sucesivas del gen BCRA2.

Rastreo de librerías de cDNA mediante hibridación

Los fragmentos de cDNA identificado se pueden marcar con P32 e hibridar con las librerías disponibles de cDNA o dispuestas en chips. A continuación, se pueden aislar los clones positivos y, si fuera necesario, realizar un nuevo plaqueo y rehibridación hasta conseguir aislar un clon puro. El DNA puede obtenerse de los clones puros y secuenciarse mediante el método de los didesoxi-terminadores de Sanger en un secuenciador de DNA ABI 377.

Cribaje de librerías de cDNA mediante amplificación por PCR

Oligonucleótidos diseñados a partir de las secuencias del BRCA2, secuencias que se han descrito aquí, se utilizan conjuntamente con oligonucleótidos diseñados por su complementariedad con el vector de clonaje en las amplificaciones por PCR de alícuotas de librerías de cDNA comúnmente disponibles. Esto permitirá la amplificación de fragmentos del cDNA de BRCA2 localizados entre un fragmento conocido y el lugar de inserción en el vector de clonaje. Los productos obtenidos de la amplificación por PCR se pueden secuenciar a continuación mediante secuenciación con didesoxi-terminadores de Sanger en un secuenciador ABI 377.

Amplificación rápida de los extremos del cDNA (RACE)

Los cDNAs primarios sintetizados a partir de una serie de RNAs procedentes de diferentes tejidos se pueden ligar a un engarce oligonucleotídico. Después de la purificación, se amplifican por PCR utilizando un oligonucleótido que hibrida con la secuencia del cDNA del BRCA2 y un segundo oligonucléotido que hibrida con el engarce. Los productos de la amplificación se secuencian directamente mediante secuenciación con didesoxi-terminadores de Sanger. La técnica del RACE se describe en (6).

Las secuencias generadas de novo se integran en la secuencia completa del gen a medida que se detectan las superposiciones con los componentes de la secuencia ya conocidos con anterioridad.

El cribaje de librerías de cDNA o genómicas con sondas seleccionadas se realiza con procedimientos estandarizados, como por ejemplo se describe en Ausubel y co., y en Sambrook y col., (supra).

Estas técnicas permiten el aislamiento de la secuencia codificante completa en base a la información incluida en las figuras 1, 2 y 4. La secuencia completa se define como la secuencia entre el codón de iniciación de la traducción (ATG) y un codón de terminación de la traducción (TAA, TAG, TGA), entre los que existe una pauta de lectura abierta. Esto a su vez puede utilizarse para definir la estructura en intrones y exones del gen. Los cebadores se diseñan para flanquear cada exón de manera que se amplifica toda la secuencia codificante del gen a partir del DNA genómico, véase por ejemplo los cebadores descritos en la figura 8 o en Nature Genetics, 12:333-337, 1996.

Otros fragmentos adicionales de la secuencia codificante se amplificaron a partir del DNA genómico en el grupo de análisis mutacional previamente descrito con el fin de detectar mutaciones adicionales asociadas a la enfermedad en el gen BRCA2.

Ejemplo 2 Mutaciones en el gen BRCA2 Identificación de las mutaciones en el gen BRCA2

En un primer estudio, los inventores hallaron una serie de mutaciones en la secuencia de BRCA2 por comparación de la secuencia nativa con las obtenidas de las familias con un historial de casos múltiples o de desarrollo temprano de cáncer de mana. La localización de esas mutaciones en la secuencia de aminoácidos se muestra mediante un recuadro de los residuos en la secuencia nativa que están afectados (ver figura 5). Las mutaciones para el gen de BRCA2 se resumen en la tabla 3, que muestra las familias en la parte izquierda de la columna frente a las mutaciones en el gen BRCA2 en la parte derecha. El resto de columnas en la tabla 3, de izquierda a derecha representan los siguientes términos:

Número de FBCs=	Número de mujeres con cáncer de mama en la familia.
Número de FBCs<50=	Número de mujeres con cáncer de mama en sujetos menores de 50 años.
Número de OvCs=	Número de cánceres de ovario en la familia.
Número de MBCs=	Número de hombres con cáncer de mama.

Las columnas referidas a los valores LOD en BRCA1 y BRCA2 muestran la posibilidad de que la incidencia de estos cánceres en la familia esté asociado a los genes BRCA1 y BRCA2, con lo que cuanto más positivo es un valor, mayor es la indicación de asociación. Por tanto, por ejemplo, un valor de LOD de +3 indica un fuerte ligamiento entre la incidencia de cáncer y el gen determinado en esa familia.

Para estudiar el gen BRCA2, se investigaron las mutaciones presentes en fragmentos de DNA genómico inferiores a 300 bp que contenían secuencias codificantes putativas. Por lo menos se examinó un miembro afecto de cada una de las 46 familias con cáncer de mama. Cada una de las familias incluidas en este grupo muestra evidencia de ligamiento entre BRCA2 y/o muestra evidencia de cáncer de mama. En la mayoría, aunque probablemente no en todas, se esperaría que fuera debido a las mutaciones de BRCA2.

Las mutaciones asociadas a la enfermedad en la mayoría de los genes de susceptibilidad al cáncer conocidos, dan como resultado el truncamiento y la inactivación de funciones críticas de la proteína codificada. En el curso del estudio mutacional de las secuencias codificantes candidatas de la región de BRCA2, la primera variante de secuencia detectada que se predijo interrumpía la traducción de un proteína codificada se observó en IRCA 2932. Esta familia presenta una asociación clara con BRCA2 con un valor de LOD multipunto de 3,01 utilizando los marcadores D12S260 y D13S267. Una deleción de seis pares de bases suprime las cinco bases del exón examinado (exón S66), deleciona una G conservada en el lugar 5' del ayuste del intrón y directamente convierte el codón TTT para fenilamina en un codón de terminación TAA. Mediante secuenciación, esta mutación se detectó en el DNA de linfocitos de otros dos casos con desarrollo temprano de cáncer de mama en esta familia. Los individuos examinados comparten sólo el haplotipo asociado a la enfermedad. La mutación está ausense en más de 500 cromosomas de individuos normales o en las restantes familias y cánceres. Además, este hallazgo identificó el gen candidato, demostrándose por el presente trabajo que era el gen BRCA2.

Para una mejor caracterización del gen BRCA2, se utilizó el exón S66 para aislar una serie de clones de cDNA que representaban segmentos del gen candidato BRCA2. Del alineamiento del cDNA y los datos de la secuencia de DNA genómico, el gen candidato BRCA2 se halló en tres cóntigos de secuencias que también contenían otras secuencias transcritas y aisladas previamente. El exón y la pauta abierta de lectura predicha mediante el programa Genemark se empleó para definir exones adicionales putativos en 5' del gen. La contigüidad de la unidad de transcripción se confirmó en el cDNA mediante RT-PCR y por análisis de la secuencia. La disponibilidad de extensa información de la secuencia a nivel de cDNA y de DNA genómico permitió un análisis mutacional de otras regiones codificantes putativas del gen BRCA2 en muestras de las familias con cáncer de mama.

En las familias CRC B196 y CRCB211, se detectaron una deleción TG (6819delTG) y una deleción TT
(6503delTT), respectivamente (tablas 1 y 2). En ambas familias la mutación se detecto mediante secuenciación de otros individuos con desarrollo temprano de cáncer de mama que compartían únicamente el haplotipo para los marcadores microsatélites del 13q que segregan con la enfermedad.

Por tanto, las mutaciones están en los cromosomas asociados con la enfermedad. Una deleción CT se detectó en la familia IARC 3594. Esta mutación se presentó en una secuencia repetitiva corta (CTCTCT), una circunstancia que es característica de las mutaciones de deleción/inserción en muchos genes y que presuntamente se producen por errores durante la síntesis de DNA. Por último, en los casos Montreal 681 y 440, se hallaron una deleción de T (6174delT) y una deleción de AAAC, respectivamente. En ambas familias, se incluye un caso de cáncer de mama en un varón y también en ambas los análisis previos fueron indicativos de que en la gran mayoría de estas familias se presentarán mutaciones de BRCA2. Todas estas mutaciones ocasionan cambios en la pauta de lectura que generan codones de interrupción temprana de la traducción. Ninguna de estas mutaciones se halló en los cromosomas de unas 500 mujeres sanas y por tanto no es probable que sean polimorfismos. La identificación de diferentes mutaciones germinales que truncan el tamaño completo de la proteína codificada en familias con cáncer de mama con una alta probabilidad de estar causadas por BRCA2, sugiere que hemos identificado el gen BRCA2. En particular, los datos de la mutación 6174delT en una familia de judíos Ashkenazi se reproduce en otras familias estudiadas, por lo que puede ser útil para analizar individuos por su susceptibilidad al cáncer, especialmente varones o mujeres con cáncer de mama o de ovario.

El análisis mediante transferencia de Northen ha demostrado que el BRCA2 está codificado por un tránscrito de 10-12kb que se expresa en células epiteliales normales de mama, placenta y en la línea celular cancerígena MCF-7. Esto sugiere que nuestro cóntigo de cDNAs, que cubre aproximadamente 9 kb (incluyendo 1,6 kb de la secuencia no traducida 3'), no incluye toda la secuencia codificante para el BRCA2. La secuencia conocida de 2329 aminoácidos codificadora para el gen BRCA2 no muestra gran homología con las secuencias disponibles de DNA o de los bancos de datos de proteínas. La homología y los motivos de BRCA2 hallados en el análisis de genes correspondientes en otras especies se describen el ejemplo 6. Sin embargo, se detectaron algunas débiles coincidencias que incluyen, sorprendentemente, una similitud muy débil con la proteína BRCA1 en una región restringida (entre los aminoácidos 1394-1474 en el BRCA1 y 1783-1863 en el BRCA2, tal como se muestra en la figura 5).

Identificación de otras mutaciones en el gen BRCA2 Pacientes

Se identificaron familias según presentaban un mínimo de tres casos de cáncer de mama y de las cuales se disponía de muestras de DNA de al menos un individuo afecto. El análisis completo o parcial del gen BRCA1 identificó aquellas familias con enfermedad asociada a la presencia de mutaciones en la línea germinal. En las familias restantes, se analizó la presencia de mutaciones en la línea germinal de la secuencia completa codificante de BRCA2. Estas mutaciones se muestran en la tabla 1 al mismo tiempo que las incidencias de cáncer de mama (incluyendo la aparición precoz de cáncer de mama) y cáncer de ovario. No se incluyeron los casos de cáncer de ovario en el límite de la normalidad. Se dispuso de la confirmación del diagnóstico a partir de los informes patológicos o los certificados de defunción.

Análisis mutacional de BRCA2 en familias con cáncer de ovario

Se analizaron las mutaciones de BRCA2 en setenta y siete familias con dos o más parientes de primer grado con cáncer de ovario epiteloide. El rastreo de mutaciones se realizó combinando un ensayo de truncamiento de la proteína (PTT) y un análisis de conformación de cadena sencilla /análisis de heterodúplex (SSCA/HA). El análisis de PTT se realizó con el DNA genómico para el exón 11 en todos los casos y para toda la región codificante en aquellos individuos en los que se disponía de RNA derivado de las líneas celulares linfoblastoides para poder realizar una transcripción inversa y PCR. Los cebadores se diseñaron para amplificar por PCR el exón 11 o la secuencia codificante completa en fragmentos solapantes abarcando un tamaño de 1,0 a 1,3 kb.

La PTT se realizó mediante un sistema de lisados de reticulocitos de conejo (Promega) y la incorporación de ^{35}S metionina (Amersham) para la detección de proteína. Los productos se migraron en una electroforesis en gel de poliacrilamida al 12-15% con SDS a 30-60 mA y durante 12-16 horas. Los geles de SDS-PAGE se fijaron en una solución de metanol al 30%/ácido acético glacial al 10%, se secaron y se expusieron con una película Kodak X-Omat durante 16-72 horas. Se localizó el sitio aproximado de la alteración de la secuencia que producía variantes truncadas de la proteína y a continuación se secuenció la región para confirmar la alteración nucleotídica precisa. Se realizó también un análisis SSCA/HA con DNA genómico para los exones codificantes 2-10 y 12-27. Se analizaron los extremos 5' y 3' del ayuste para el exón 11. Las variantes de conformación de SSCA y HA se secuenciaron, tal como se describió anteriormente (3), para caracterizar el cambio preciso de nucleótido. Las mutaciones detectadas por PTT, se detectaron a su vez por SSCA/HA en fragmentos de 300-600 bp. Todas las secuencias diseñadas para PTT y SSCA/HA están disponibles si se solicitan (e-mail seg200@cam.ac.uk).

Análisis mutacional de BRCA2 en familias con cáncer de mama Métodos estadísticos

Se examinó si existía una asociación entre la localización de la mutación y el fenotipo de la enfermedad mediante un argumento de permutación similar al que utilizaron Gayther y col (12). El test estadístico se basó en un análisis estándar de la chi-cuadrado para la diferencia en la tasa de cánceres de ovario, como una proporción respecto a todos los cánceres de ovario y mama, confirmados para cada categoría. En el análisis principal, se calculó el estadístico X asumiendo una hipótesis alternativa en la que se aplicaron diferentes tasas para las mutaciones en tres regiones distintas, por ejemplo antes del codón n1-n2 y después del n2 (es decir, con 2 grados de libertad para chi-cuadrado). En este análisis, se ignoraron las tres posibles mutaciones de cambio de aminoácido, puesto que su significación no está clara. El estadístico X se maximizó para todos los valores posibles de los puntos de corte n1 y n2, definiéndose el estadístico Xm. La significación de estos chi-cuadrados maximizados se analizó de manera empírica calculando el valor de Xm en 50,000 grupos de datos en los que las 26 mutaciones se permutaron aleatoriamente entre las familiar. Se calculó también una prueba estadística para analizar la tendencia proporcional entre el riesgo del cáncer de ovario y el de cáncer de mama a lo largo del gen, basándose en una prueba de chi-cuadrado para la tendencia, similar a la referencia (12) que no había resultado significativa.

En un intento por confirmar la asociación utilizando datos de otros informes publicados con anterioridad, se calculó el estadístico chi-cuadrado (con dos grados de libertad) con los datos de cinco estudios (9, 10, 15-17), con los puntos de corte n1 y n2 determinándose los mejores valores según el grupo de datos de UK. La significación de estos resultados se comparó posteriormente con la permutación de mutaciones entre familias.

Discusión

El BRCA2, probablemente, está implicado en la mayoría de familias de alto riesgo de cáncer no atribuible al BCRA1. La identificación de BRCA2 debería por consiguiente permitir una evaluación más exhaustiva de familias con un alto riego de desarrollar cáncer de mama. Sin embargo, todavía no se conoce el papel del medioambiente, del estilo de vida y de los factores genéticos sobre la posible modificación del riesgo de cáncer en los portadores del gen, con lo que antes de poder ofrecer un test diagnóstico de rutina, son necesarios más estudios.

Aunque muchas mutaciones de las descritas en estos ejemplos no son comunes a los genes BRCA2 en familias distintas, sin embargo estas mutaciones pueden ser útiles en métodos de diagnóstico o detección de la predisposición al cáncer, especialmente de cáncer de mama. Además, ello puede facilitar que, mediante análisis de rutina de un gran número de familias, en un futuro pueda detectarse una mutación que sea común en una porción significativa de casos de cáncer y por tanto sentar las bases de un ensayo simple de diagnóstico. Incluso, si éste no fuera el caso, el conocer la localización de las mutaciones será sin duda una ayuda para reducir la cantidad de trabajo de secuenciación necesaria para realizar el análisis de un paciente, p.ej., secuenciando parte de su gen BRCA2 con el fin de determinar la predisposición o susceptibilidad al cáncer. En la sección general se han incluido otras aplicaciones y utilizaciones de estas mutaciones.

Se ha predicho que las mutaciones germinales de BRCA2 son la causa de aproximadamente el 35% de cáncer en las familias con casos de cáncer múltiple con desarrollo temprano del cáncer de mama en mujeres y están también asociadas a un riesgo incrementado de cáncer de mama en el hombre, de cáncer de ovario, de cáncer de próstata y de cáncer de páncreas (5,9,10). Las mutaciones de línea germinal de un segundo gen de susceptibilidad al cáncer, BRCA1 (3), están asociadas con una mayor predisposición al cáncer de ovario así como al cáncer de mama en mujeres (11). Estudios recientes han sugerido que el fenotipo BRCA1 en familias con respecto a la proporción de cáncer de mama respecto al de ovario varía con la localización de la mutación de BRCA1 (12, 13). Para determinar cuándo la mutación germinal en BRCA2 está asociada con una variación similar del riesgo fenotípico, se analizó la distribución de las mutaciones de familias con casos múltiples de cáncer de mama y/o ovario estudiadas en el Reino Unido e Irlanda. La gran mayoría de estas mutaciones conducen a un truncamiento prematuro de BRCA2 como resultado de un cambio en la pauta de lectura por deleciones, inserciones, mutaciones sin sentido o alteraciones en los lugares de ayuste del RNA. El análisis de la distribución de las mutaciones a lo largo del gen indica una correlación significativa genotipo-fenotipo. Las mutaciones que ocasionan truncamiento de la proteína BCRA2 en familias con mayor riesgo de cáncer de ovario en relación al cáncer de mama se agrupan en una región de aproximadamente 3,3 kb en el exón 11 (p=0,0005). Los resultados publicados de las mutaciones en otras 45 familias ligadas al BRCA2 apoyan esta correlación.

Las familias se analizaron teniendo en cuenta la presencia de tres o más casos de cáncer de mama o de dos o más parientes de primer grado con cáncer de ovario epitelial diagnosticados a cualquier edad. Se identificaron las mutaciones del gen de BRCA1 y se utilizó el DNA genómico de un único individuo afectado de cada una de las familias restantes para investigar las mutaciones en la secuencia codificante de BRCA2, empleando una combinación de los ensayos de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP) y truncamiento de proteína (PTT). La secuencia codificante para el BRCA2 consiste en 10248 nucleótidos codificados en 26 exones (15). La mayoría de los exones son relativamente pequeños aunque los exones 10 y 11 representan aproximadamente el 60% de toda la región codificante. Las mutaciones halladas se muestran en las tablas 1 y 2. El espectro mutacional consistió en 22 deleciones o inserciones con cambio de pauta de lectura, 3 mutaciones sin sentido y una alteración de un lugar de ayuste del RNA. En todas estas mutaciones se predice como resultado un truncamiento prematuro del péptido predicho de BRCA2. También se detectaron tres nuevas mutaciones de cambio de aminoácido. Las mutaciones estaban distribuidas a lo largo del gen y sólo una mutación adicional, 6503delTT, fue recurrente.

Los resultados sobre las mutaciones del BRCA2 en familias estudiadas fuera de UK derivadas de informes previos y los obtenidos por informes previos, así como los resultados no publicados procedentes de nuestros mismos laboratorios apoyan este agrupamiento. Las mutaciones BRCA2 se han identificado en 45 de estas familias (9, 10, 15-17). Se ha descrito que las 17 familias con mutaciones en OCCR presentaban 11 cánceres de ovario y 45 de mama comparadas con los 22 cánceres de ovario y 282 cánceres de mama en las familias restantes (cociente de probabilidad 22,9; test de permutación de las diferencias p=0.007). Consistente con lo anterior, están disponibles muestras de tres grandes familias con implicación de BRCA2 y evidencia razonablemente sistemática de riesgo de cáncer, denominadas UTAH 107 (15), CRC 186 y la familia Icelandic (10). Las mutaciones en estas tres familias se localizan cerca de los extremos 5' o 3' del gen y parecen estar asociadas con un riesgo elevado de padecer cáncer de mama a lo largo de su vida, con mutaciones en el OCCR asociadas con una riesgo de cáncer de ovario más elevado que la media, o un menor riesgo de cáncer de mama, o ambos. En este aspecto, será de especial importancia disponer de más datos en un futuro sobre la 6174delT. Esta mutación que reside en el OCCR es común en los judíos Ashkenazi, con lo que se espera sean posibles las estimaciones basadas en la población directa de la prevalencia en pacientes con cáncer de mama y ovario.

La correlación observada entre genotipo-fenotipo es algo sorprendente, al contrario que en el BRCA1, ya que una región en el centro del gen parece estar asociada con un riesgo diferenciado. Existen precedentes de genes de susceptibilidad al cáncer, por ejemplo el gen de la poliposis adenomatosa colónica, en donde se asocian regiones génicas de agrupaciones de mutaciones con la predisposición de un fenotipo específico (18, 19). No conocemos todavía porqué las mutaciones de truncamiento en una porción central del gen BRCA2 resultan en un aumento del riesgo de cáncer de ovario. Tampoco se ha identificado ninguna región de homología funcional entre BRCA2 y otros genes. Una serie de ocho repeticiones internas de aminoácidos se ha observado recientemente en el exón 11 pero con poca identidad de secuencia con otros genes conocidos (20). Es, sin embargo, interesante remarcar que todas las repeticiones están contenidas en el OCCR. El conjunto de mutaciones en un único exón sugiere una explicación basada en el ayuste alternativo. El ayuste completo o parcial del exón 11 puede producir formas ayustadas alternativas con la capacidad de "rescatar" mutaciones en el epitelio de la mama pero no en el epitelio del ovario. Nuestros resultados sugieren que pueden existir diferencias en la estructura y la función del BRCA2 entre el epitelio de la mama y del
ovario.

Ejemplo 3 Expresión del polipéptido BRCA2 Construcción de un clon de cDNA completo para el BRCA2 humano

Se reunieron aproximadamente las 10.5kb del cDNA codificante para el BRCA2 humano a partir de los fragmentos del cDNA amplificado por PCR y del DNA genómico clonado. Todos los números de residuos proceden del Genbank con un número de acceso U43746.

El extremo 5' del cDNA (residuos 204-2357) se amplificó por PCR de cDNAobtenido de RNA de células de MCF-7 y utilizando los cebadores;

CATTGGAGGAATATCGTAGG (bases 204-223)

y

GACAGAGAATCAGCTTCTGG (bases 2338-2357),

Este fragmento de 2,1 kb se clonó en pBluescript y se determinó su secuencia.

El plásmido (p12302) se digirió a continuación con Asp718 que corta en el poliengarce y parcialmente con BamHI que corta en las bases 238 y 792. El oligonucleótido de doble cadena:

GTACCGCCGCCATGGAACAGAAGATTTCCGAAGAAGATCTGCCTATTG

\hskip1.3cm

GCGGCGGTACCTTGTCTTCTAAAGGCTTCTTCTTCTAGACGATAACCTAG

se ligó con el plásmido y se seleccionaron los recombinantes que portaban el oligo ligado al plásmido y a continuación se digirieron por la base 238.

El plásmido se digirió con NdeI que corta en el pb 1795 y SmaI que corta en el poliengarce del plásmido. Este se ligó en una ligación de tres etapas a un producto de PCR (1795-2280) que había sido digerido con NdeI y BstYI y los residuos 2280-6571 como un fragmento stY1-BsiHKAI. El último fragmento consiste del exón 11 del gen BRCA2 y se aisló de un plásmido que portaba el DNA genómico. De este modo se generó el plásmido
p12672.

El extremo 3' del cDNA de BRCA2 se generó mediante RT-PCR con los cebadores:

AAAAGTAACGAACATTCAGACCA (bases 6277-6299) y

ATTGTCGCCTTTGCAAATGC (bases 10.486-10.505) en el cDNA de las células MCF7.

Este fragmento se subclonó en pBluscript para generar el plásmido p12661. A continuación este fragmento se amplificó con un cebador (GTACTCCAGAACATTTAATATCC, bases 6325-6344) y el cebador T3 de bluescript.

Este fragmento se digirió con Bsp1201 y luego se ligó en p12672 cortado con SnaBI-NotI para generar el clon p12806 de tamaño completo.

Este plásmido se modificó para incluir un epitopo FLAG de la manera siguiente. Se digirió p12806 con Asp718 y SalI y luego se ligó a pBlueBac2B digerido con las mismas enzimas, generándose el plásmido p13013. A continuación, éste plásmido se digirió con SacI y BglII y se ligó a un engarce codificante para una secuencia Kozak consenso y un epitopo Flag, tal como se detalla más adelante:

\hskip1.3cm

CGGGTACCAGATCTGCCGCCATGGATTACAAGGACGACGATGACAAG

TCGAGCCCATGGTCTAGACGGCGGTGGTACCTAATGTTCCTGCTACTGTTCCTAG

Este cDNA de BRCA2 de tamaño completo se ligó en vectores de expresión. En particular, se utilizó un vector modificado del vector pMTSM, esta versión porta un promotor tardío mayor del adenovirus y el origen de replicación de SV40.

Expresión de BRCA2 en células de mamífero

El vector de expresión de BRCA2 de tamaño completo se transfectó en células COS utilizando técnicas estándar. La expresión de la proteína se controló mediante inmunoprecipitación de la transferencia de Western e inmunofluorescencia. Esto demostró que la proteína BRCA2 podía ser detectada como una proteína de aproximadamente 400 KDa, de tamaño similar al predicho por la secuencia del cDNA. En estas condiciones, es este tipo de células, la proteína presentó una localización subcelular compleja, localizándose bien en un compartimiento similar a la membrana (probablemente el retículo endoplasmático) o en el núcleo, o en ambos (véanse las figuras 11
a 13).

Interacción de BRCA2 con otras proteínas

Ello se puede valorar utilizando el sistema del híbrido doble de levaduras para clonar las proteínas que interactúan con BRCA2. Dado que este sistema es potencialmente complicado por el tamaño del ORF de BRCA2, el ORF puede dividirse en 5-10 fragmentos y analizarse separadamente. Estos fragmentos se utilizarán como "cebos" episomales e integrantes en el genoma de levadura y se utilizarán para rastrear librerías peptídicas como las derivadas de las células HeLa, cerebro fetal humano y una nueva librería derivada de mama humana normal. Los clones confirmados como interactuantes con el sistema del híbrido doble se ensayan para la interacción in vivo e in vitro. Las proteínas de fusión-GEX se analizarán para la interacción directa in vitro. Las versiones etiquetadas con el epitopo de BRCA2 y las proteínas interactuantes potenciales se co-microinyectan en las líneas celulares y se determina su localización subcelular mediante inmunofluorescencia para establecer su localización. Se pueden utilizar la co-transfección y la inmunoprecipitación cruzada para establecer que las dos proteínas interactúan in vivo. Además de identificar nuevas proteínas de BRCA2 que interactúan, se pueden utilizar las anteriores aproximaciones para asegurarse que el BRCA2 puede dimerizar o interactuar directamente con el BRCA1.

La naturaleza de las proteínas que interactúan con el BRCA2 puede también determinarse directamente mediante fraccionamiento bioquímico seguido de espectrometría de masas. Para estimar el peso molecular de estas proteínas, pueden utilizarse la inmunoprecipitación de los extractos marcados con S^{35} y electroforesis en gel-SDS. Estas proteínas se analizan posteriormente mediante un gel 2D analítico seguido de espectrometría de masas MALDI-TOF y del mapeo de masas peptídicas (23). Esta técnica permite identificar ciertas proteínas cuyas secuencias están presentes en el banco de datos y en consecuencia asignar la pertenencia a una familia (>80% identidad de secuencia).

Función biológica del BRCA2

Se puede realizar un experimento para analizar si la expresión de BRCA2 puede bloquear el crecimiento de líneas de cáncer celulares de cáncer de mama y de ovario específicamente. Idealmente, estos experimentos utilizan células tumorales de mama que no expresan BRCA2, con lo que pueden fácilmente identificarse mediante un rastreo de líneas celulares de cáncer de mama para la ausencia de la expresión de BRCA2. Alternativamente, las líneas celulares pueden establecerse a partir de pacientes que muestran la ausencia de BRCA2 de tipo salvaje. También es posible que la sobreexpresión de BRCA2 en las células cancerosas que todavía lo expresan suprima el crecimien-
to.

Los cDNAs de BRCA2 pueden expresarse adecuadamente bajo el control del LTR retroviral (pBABE) o los promotores del factor de elongación 1\alpha (las series pEFBos-(22)). Los plásmidos pueden co-transfectarse con marcadores de resistencia al fármaco y compararse el número de colonias con controles que crecen con el vector. A continuación se pueden expandir las colonias supervivientes y analizarse su tumorigenicidad mediante inyección en ratones nude. En algunos casos, si nos es posible detectar la acción inhibidora de las proteínas en el ensayo de crecimiento de colonias a relativamente largo plazo, ya que los plásmidos transfectados no se expresan de forma estable, se puede utilizar una microinyección de construcciones de expresión de BRCA2 con lo que las células inyectadas se detectan mediante inmunofluorescencia de la proteína endógena o mediante co-inyección de una plásmido marcador (21). Además, se puede utilizar un vídeo de registro del período de tiempo, tal como se describió anteriormente, esto podría utilizarse para determinar si cualquier efecto inhibidor del crecimiento es independiente de la célula, es decir si el efecto es paracrino o autocrino. Estos sistemas también serán de utilidad para detectar cualquier efecto
apoptótico.

Ejemplo 5 Procedimientos para detectar mutaciones de BRCA2 Ensayos de cambio de migración para detectar mutaciones de BRCA2 Amplificación del DNA en la PCR

Se amplifican 25 ng de DNA genómico de cada individuo a analizar la presencia de mutaciones durante 35 ciclos de la PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos pertinentes (véase la lista de cebadores). Antes de la incorporación en la PCR, los cebadores oligonucleotídicos se marcan radioactivamente con P^{32}-gamma utilizando la T4 polinucleótido quinasa. Después de la amplificación en la PCR, se añade el colorante de carga con formamida a cada muestra y éstas se desnaturalizan a 94ºC durante 3 minutos. Después de la desnaturalización se colocan inmediatamente en hielo.

Análisis del tamaño de los fragmentos de DNA

Inmediatamente, se cargan 2 \mul de cada muestra en un pocillo formado por el típico peine de "tiburón" de 40 ranuras de 0,4 mm de grosor de un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 5%. Las muestras se migran durante 2-5 horas a 90 watios a temperatura ambiente.

Análisis de los heterodúplex de SSCP

El ensayo de SSCP es un ensayo basado en la PCR para el rastreo de mutaciones/variantes de secuencia de fragmentos de DNA. Este ensayo implica amplificar fragmentos de 100-300 pb marcados isotópicamente del gen BRCA2, diluir estos productos y desnaturalizarlos a 95ºC. Los fragmentos se enfrían rápidamente de modo que el DNA permanece en su forma de cadena sencilla. Estos fragmentos de cadena sencilla de BRCA2 migran a través del gel de acrilamida. Las diferencias en la composición de secuencia producen que las moléculas de cadena sencilla adopten conformaciones distintas en la matriz del gel, haciendo que su movilidad sea distinta a la de los fragmentos de tipo salvaje, con lo que se permite la detección de mutaciones en los fragmentos que se analizan en relación con un fragmento control tras exponer el gel a una película de rayos X.

Estos fragmentos con conformaciones/movilidad alterada se recortan directamente del gel y se secuencian directamente para determinar la mutación. Después de la desnaturalización, la muestra se enfría en hielo durante 10 minutos para permitir la formación de heterodúplex. Cada muestra se migra en dos tipos de gel distintos.

Las condiciones típicas para los SSCP son las siguientes. Se migran 3 \mul de la muestra durante toda la noche a 4 watios a temperatura ambiente en un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 6% con glicerol al 10%.

Se migran 3 \mul de la muestra durante 4 horas a 30 watios a 4ºC en un gel de poliacrilamida-acrilamida no-desnaturalizante al 4,5% sin glicerol.

Después de la electroforesis, los geles se secan sobre papel 3MM Whatman y se colocaron en un cassette de
autorradiografía a temperatura ambiente durante un período que puede oscilar desde las dos horas a varios
días.

Después del revelado autorradiográfico, los cambios de migración se pueden observar a simple vista.

Secuenciación del producto de PCR

Cuando se observa un cambio de migración en el heterodúplex de SSCP o en los geles de análisis del tamaño de los fragmentos de DNA, se reamplifica el fragmento concerniente a partir del DNA genómico original y se secuencia directamente. Para secuenciar el producto de PCR, éste se precipita con isopropanol, se resuspende y se secuencia utilizando TaqFS + didesoxi-terminadores del equipo de secuenciación. Los productos de extensión se migran en una electroforesis en un secuenciador de DNA ABI 377 y los resultados se analizan utilizando el programa Sequence Navigator.

Ensayo PTT de BRCA2

La técnica de la PTT es otro ensayo basado en la PCR. Se amplifican los fragmentos de BRCA2 con los cebadores que contienen las secuencias de iniciación Kozak consenso y un promotor de T7 RNA polimerasa. Estas secuencias extra se incorporan en el cebador 5' de modo que se hallen en la misma pauta de lectura respecto a la secuencia codificante del fragmento a analizar. Estos productos de PCR se introducen en un sistema acoplado de transcripción/traducción. Esta reacción permite la producción de RNA de BRCA2 a partir del fragmento y la traducción de este RNA en un fragmento de proteína BRCA2. Los productos de PCR de los controles producen un producto proteico de un tamaño correspondiente a la proteína de tipo salvaje en relación con el fragmento que se analiza. Si el producto de PCR analizado tiene una mutación de desplazamiento de la pauta de lectura o una mutación sin sentido, el ensayo produce un producto proteico truncado en relación con los controles. El tamaño del producto truncado se relaciona con la posición de la mutación y la región relativa del gen BRCA2 de este paciente se secuencia para identificar la mutación causante del truncamiento.

El protocolo siguiente se adaptó para un ensayo PTT de BRCA2. Los cebadores para la PTT se muestran en la figura 10.

Cada uno de los cebadores de PTT está precedido por la secuencia T7/Kozak.

GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACCATG

1.: Treinta y cinco ciclos de la primera reacción de PCR en 20 \mul.

2.: Confirmación del producto mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

3.: Amplificación de una alícuota de 3 \mul con cebadores de PTT durante 15 ciclos.

4.: Confirmación del producto mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.

5.: Transcripción/traducción in vitro utilizando el equipo de Promega (CA) TNT, incorporando metionina marcada con S^{35}.

6.: Parada de la reacción con tampón de Laemmli y desnaturalización.

7.: Electroforesis en gel de los productos en gel de acrilamida al 15% a 16 mA.

8.: Fijar, amplificar y secar el gel.

9.: Exposición autorradiográfica durante 2 horas.

Estas aproximaciones se pueden combinar para proporcionar un ensayo eficaz y exacto, en términos de resultados logrados, coste económico y tiempo utilizado para lograr los resultados. A modo de ejemplo, un protocolo combinado utilizado por los inventores implica lo siguiente:

1) Muestras de DNA de casos de referencia familiar (probandos) se analizan primero mediante PTT. Los exones 10, 11 y el último exón, 27, se analizan utilizando esta técnica. Los exones 10 y 27 se obtienen en un fragmento, mientras que el 11 más grande se obtiene en 2 fragmentos. Si se observa una proteína truncada, se secuencia la correspondiente región genómica del paciente para identificar la mutación exacta. Esta aproximación es capaz de rastrear aproximadamente el 60% de la región codificante de manera rápida.

2) A continuación se analizan las muestras negativas para el ensayo PTT utilizando SSCP. Toda la región codificante, incluyendo aquellas regiones ya examinadas mediante PTT, se analizan mediante SSCP para detectar mutaciones. La secuencia codificante se amplifica a partir del DNA genómico utilizando un grupo de cebadores tal como se describió en esta aplicación. Además, los productos de PCR marcados isotópicamente y generados mediante análisis de SSCP también se migran en geles de secuenciación de acrilamida que permiten la detección de cambios pequeños de tamaño en relación con los fragmentos control, lo que es indicativo de inserciones o deleciones. Cualquier fragmento mutante que se detecte se extrae directamente de los geles y se secuencia directamente junto con el fragmento de DNA genómico homólogo para determinar la mutación exacta.

Ejemplos de cribajes que utilicen estos procedimientos se describen en la tabla siguiente.

1

Ejemplo de 6 resultados del alineamiento de secuencia Materiales y métodos

Se obtuvo DNA genómico total de mono verde (Cercopithecus aethiops), hámster (Critetulus griseus), cerdo (Sus scrofa), perro (Canis familiaris), vaca, chimpancé, pollo, serpiente, pez cebra, X. laevis, S. pombe, S. cerevisiae. Los cebadores de la PCR se diseñaron a partir de una secuencia consenso para el motivo BRC humano. Estos incluyeron cebadores que se emparejan exactamente con la secuencia de DNA humana y cebadores degenerados basados en la secuencia proteica de BRCA2. Las secuencias fueron las siguientes.

Grupo 1 de cebadores del motivo 5': cebador natural -AAAGCTGTGAAACTGTT y un grupo degenerado que contenía una mezcla equivalente de -AA(AG)GCIIIIAA(AG)CTITT y -AA(AG)GCIIIIAA(AG)TT(AG)TT en donde I es inosina.

Grupo 2 de cebadores del motivo 5': cebador natural, el mismo que para el grupo 1 y el grupo degenerado realizado con -AA(AG)GCIGTIAA/AG)CTITT y -AA(AG)GCIGTIAA(AG)TT(AG)TT.

Grupo de cebadores 3' del motivo: cebador natural -TTCCCACTTGCAGTCTGAAA y un grupo mezclado de -TICC(GA)CTIGCIGT(CT)TG(GA)AA y -TTICCIGAIGCIGT(CT)TG(GA)AA.

Se diseñaron otros grupos de cebadores en una región de BRCA2 que está conservada entre el hombre y el ratón. Estos fueron un cebador natural de AGCAAGCAATTTCAAGG y un grupo de cebadores degenerados de -TCIAA(AG)CA(AG)TT(TC)GA(AG)GG y -AG(TC)AA(AG)CA(AG)TT(TC)GA(AG)GG. La PCR se realizó utilizando cada cebador 5' junto con un cebador 3' relevante. Las condiciones de reacción fueron las descritas en (4), excepto para las condiciones de los ciclos de PCR. Estas fueron 94ºC durante 1 min, XºC durante 1 min, 72ºC durante 1 min, en donde X fue 65ºC para los dos primeros ciclos y luego se disminuyeron 2ºC cada dos ciclos hasta alcanzar los 55, 49, 45, 39 ó 35ºC, en cuyo punto X permaneció constante. Se realizaron 30 ciclos adicionales a la temperatura de hibridación final. Los productos de PCR se migraron en geles de agarosa y las bandas discretas se extrajeron del gel y secuenciaron utilizando el protocolo de los didesoxi-terminadores (Perkin-Elmer). Los productos de secuencia se separaron en un secuenciador de DNA automatizado ABI377.

Todas las reacciones de secuenciación se realizaron por lo menos dos veces y en ambas cadenas del molde. Se diseñaron cebadores de PCR específicos para el exón 11 del gen BRCA2 utilizando la secuencia de DNA anterior. Estos se utilizaron junto con un grupo de parejas S2 de cebadores de PCR diseñados para el gen BRCA2 humano para amplificar y secuenciar otros segmentos del exón 11 del mono, perro, cerdo y hámster. Una sonda de BRCA2 humano (exón 11) se utilizó para identificar un clon \lambda que contenga una porción del gen BCRA2 de ratón. Esto se utilizó para obtener una secuencia de BRCA2 específica de ratón que a su vez se utilizó para diseñar cebadores de PCR específicos de ratón. Estos se utilizaron para identificar clones positivos en una librería de BAC de ratón. Los fragmentos de BACS positivos se clonaron aleatoriamente y se secuenciaron los que contenían fragmentos del exón 11 del gen BRCA2.

Secuenciación de los motivos BRC

Se utilizaron dos aproximaciones para obtener la secuencia del exón 11 de BRCA2 (incluyendo los motivos BRC) en cinco especies de mamíferos, utilizando la secuencia del BRCA2 humano obtenida de trabajos previos, ver también la figura 7. La secuencia del exón 11 del gen BRCA2 de ratón se obtuvo de un clon BAC aislado mediante hibridación a baja astringencia con fragmentos del gen BRCA2 humano. Los fragmentos de BACs se clonaron aleatoriamente y se secuenciaron los que contenían fragmentos del gen BRCA2. A continuación, se diseñaron cebadores de PCR se para los motivos BRC y las regiones conservadas entre el hombre y el ratón. Estos se utilizaron para amplificar fragmentos del gen BRCA2 en los DNAs de 12 especies (tal como se describe en los Materiales y Métodos). Se obtuvo una secuencia que mostraba identidad de secuencia con la de BRCA2 humano del mono verde, hámster, cerdo, perro, vaca y chimpancé. Las secuencias obtenidas del pollo, serpiente, pez cebra, Xenopus laevis, Schizosaccharomyces pombe y Saccharomyces cerevisiae no mostraron identidad de secuencia con ninguna secuencia de BRCA2. Se diseñaron cebadores específicos de especie para el mono verde, el hámster, el cerdo y el perro. Estos se utilizaron en combinación con todas las parejas de cebadores de PCR utilizadas para amplificar el exón 11 de BRCA2 humano para amplificar otros segmentos del exón. El proceso se repitió hasta obtener todas las secuencias entre e incluyendo los motivos 1 y 8 de BCR del mono verde, el hámster y el perro. Utilizando esta aproximación, sólo fue posible obtener la secuencia para las repeticiones 3-8 para el cerdo. En total, se secuenciaron 46 BRC repeticiones en seis mamíferos distintos (incluyendo el hombre).

El motivo BRC está conservado en las especies de mamíferos

El porcentaje de identidad de secuencia de la traducción del exón 11 del gen BRCA2 (aproximadamente la mitad de toda la secuencia codificante) entre los seis mamíferos se muestra en la tabla de más adelante. En general, el grado de conservación es bajo, con un 58% de identidad de secuencia entre los 1062 residuos del hombre y del ratón, el 54% de identidad de secuencia entre el ratón o hámster y el perro y el 49% entre el cerdo y el ratón (sobre 928 aminoácidos). Incluso entre especies estrechamente relacionadas como el hombre y el mono, y el ratón y el hámster, la identidad de secuencia es de sólo el 93 y el 72%, respectivamente. Sin embargo, un alineamiento de secuencias entre los seis mamíferos estudiado demuestra que las traducciones del exón 11 se pueden alinear en todas su longitud y que el grado de conservación es variable (figura 9). Existen una serie de regiones de identidad elevada. Algunas de estas regiones coinciden con los motivos BRC, por ejemplo BRC1, 2, 3, 4, 7 y 8 (Figura 9). Existen otros segmentos altamente conservados, por ejemplo los aminoácidos 469-493 (utilizando la numeración de la secuencia humana en la figura 9) que no muestra similitud con los motivos BRC o ninguna otra secuencia publicada en las bases de datos. Ninguno de estos últimos se hallan repetidos dentro de BRCA2.

Un alineamiento de todos los 46 motivos secuenciados demuestra el elevado grado de conservación interespecies e intraespecies entre BRC1, 3, 4, 7 y 8. En este alineamiento se identificó una región de 26 aminoácidos que está conservada en todos los motivos BRC (Fig. 2), y que permitió generar una secuencia BRC consenso. Es posible alinear algunos residuos fuera de esta región común; sin embargo, dichos alineamientos no son robustos, siendo muy sensibles los parámetros utilizados. Existen motivos que contienen todas las secuencias consenso, por ejemplo BRCA4, mientras que otros, por ejemplo BRC6, muestran una divergencia considerable del consenso. En total, 30/46 de los motivos BRC (65%) tienen 11 o más de los 13 residuos consenso, mientras que el 87% tiene 8 o más residuos de la secuencia consenso.

La tabla siguiente muestra el porcentaje de identidades entre la traducción del exón 11 del gen BRCA2 del hombre, mono, cerdo, perro, hámster y ratón.

	Hombre	Mono	Cerdo	Perro	Hámster	Ratón
Hombre	100	93	62	70	57	58
Mono		100	61	68	58	58
Cerdo			100	64	50	49
Perro				100	54	54
Hámster					100	72
Ratón						100

Discusión

Las bajas identidades de secuencia para el exón 11 (que se muestra en la tabla anterior) sugieren que el BRCA2 evoluciona a una velocidad más rápida que la mayoría de genes de susceptibilidad al cáncer/genes supresores de tumores. Por ejemplo, existe un 98% de identidad de secuencia entre el hombre y el ratón para NF1 y un 95% y 91% entre el hombre y el ratón para WT1 y Rb1, respectivamente. Una importante excepción es, sin embargo, BRCA1 que sólo muestra un 58% de identidad de secuencia entre el ratón y el hombre. En consecuencia, aunque el BRCA1 y BRCA2 no muestran una similitud de secuencia sustancial, son similares en virtud de una tasa elevada de evolución, una estructura génica inusual (ambos tienen un gran exón 11, véase (3) y (7) y carecen de mutaciones somáticas en cánceres esporádicos. Queda todavía por elucidar si alguna de estas características está relacionada con una función específica.

Aunque la identidad de secuencia para la traducción del exón 11 del gen BRCA2 es baja, la mayoría de los motivos BRC están altamente conservados entre las especies analizadas. Esto sugiere que se ha ejercido presión para mantener las repeticiones BRC en el BRCA2 y, en consecuencia, éstas deben ser importantes para su función. Sin embargo, a partir de nuestro alineamiento, BRC6 es mucho menos conservado que BRC1, 2, 3, 4, 7 y 8 (31 y 85% de identidad entre el hombre y el ratón para BRC6 y BRC7, respectivamente). Además, ha sido alterado por inserciones o deleciones de modo que la longitud del motivo difiere entre especies. BRC3 y BRC5 también muestra menos conservación que el BRC1, 2, 3, 4, 7 y 8 (62% y 58% de identidad, respectivamente entre el hombre y el ratón para BRC3 y BRC5). Sin embargo, ambos presentan un nivel superior de conservación que la traducción del exón 11 en general. Los resultados sugieren que la multiplicación de los motivos tuvo lugar antes de la radiación de los mamíferos. Por ejemplo, algunos residuos aminoacídicos dentro de las unidades de los motivos (especialmente en BRCA2) son distintos de los residuos equivalentes en otras unidades, pero están altamente conservados en las especies de mamíferos. Además, las secuencias flanqueantes los motivos no están conservadas entre las repeticiones, pero en algunos casos están conservadas entre las especies (por ejemplo BRC1 y 4, figura 9).

Los productos de PCR que se derivaron del DNA de no-mamíferos no presentaron ninguna similitud con el BRCA2 de mamífero. Esto sugiere que el BRCA2 está restringido a mamíferos o que los ortólogos no-mamíferos de BRCA2 han divergido de forma tan extensa que no es posible identificarlos por las técnicas utilizadas. Sin embargo, hay evidencias de una similitud débil entre las secuencia BRC y el gen Caenorhabditis elegans (CET073_2), lo que sugiere que el motivo BRC no está restringido a mamíferos.

Existen pocas claves sobre la función de BRC. Las mutaciones de línea germinal de truncamiento en el gen BRCA2 que predisponen al desarrollo de cáncer de mama se localizan a través de la región codificante del gen. En muchos casos, las mutaciones dejan todas las repeticiones intactas, dando poca información sobre la relación enter los motivos y su función en la función normal de BRCA2. El espacio entre los motivos individuales varía de -60 a 300 aminoácidos, pero está razonablemente bien conservada entre los mamíferos. Además, existen múltiples elementos de estructura secundaria dentro de cada motivo que pueden indicar la formación de dominios globulares. Sin embargo, no queda claro cómo funcionan. En consecuencia, es necesaria una mayor investigación para elucidar las funciones bioquímicas de los motivos BRC.

Las regiones conservadas como los motivos BRC identificados en el exón 11 proporcionan indicaciones valiosas de dominios del polipéptido BRCA2 que son probablemente importantes para determinar su actividad. En consecuencia, estos motivos son buenos candidatos para los estudios de rastreo descritos anteriormente, con el fin de hallar miméticos para el polipéptido BRCA2.

Los motivos del exón 11 que están conservados entre algunas o todas las especies examinadas y que se muestran en la figura 9 se resumen en la tabla 4:

TABLA 4

2

TABLA 1 Mutaciones de línea general del gen BRCA2 en familias con cáncer de mama y ovario

3

TABLA 2

4

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

5

\vskip1.000000\baselineskip

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Claims

1. Molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de ácido nucleico codificante que se muestra en las figuras 1 ó 2, o los alelos de los mismos.

2. Molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de ácido nucleico codificante de uno o más de los exones que se muestran en la figura 2.

3. Molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia codificante de tamaño completo o del gen completo de BRCA2 que es obtenible mediante:

(a) utilización de las secuencias de ácido nucleico que se muestran en las figuras 1, 2 ó 4 para construir sondas para el cribaje de librerías de cDNA o genómicas, secuenciar los clones positivos obtenidos y repetir este proceso para reunir la secuencia de BRCA2 de tamaño completo a partir de las secuencias obtenidas;

(b) utilización de las secuencias que se muestran en las figuras 1, 2 ó 4 para obtener oligonucleótidos para que hibriden con los fragmentos de ácido nucleico de BRCA2, siendo utilizados estos oligonucleótidos junto con oligonucleótidos diseñados para hibridar con un vector de clonación; amplificar mediante PCR los fragmentos de ácido nucleico en una librería que contenga los fragmentos de la secuencia de BRCA2; secuenciar los fragmentos amplificados para obtener la secuencia de BRCA2 entre las partes conocidas de la secuencia y el vector de clonación, y repetir este proceso hasta reunir la secuencia de BRCA2 completa a partir de las secuencias así obtenidas; y/o,

(c) utilización de una amplificación rápida de extremos de cDNA (RACE) sintetizando los cDNAs a partir de una serie de RNAs distintos, estando ligados los cDNAs a un engarce oligonucleotídico y amplificar mediante PCR el cDNA de BRCA2 utilizando un cebador que hibrida desde la secuencia del cDNA de BRCA2 de las figuras 1 ó 4 y un segundo cebador que hibrida desde el engarce oligonucleotídico, secuenciar el ácido nucleico amplificado y repetir el proceso hasta reunir la secuencia completa de BRCA2 a partir de las secuencias así obtenidas.

4. Molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia codificante de tamaño completo o del gen completo de BRCA2 que es obtenible mediante:

(a) utilización de las secuencias de ácido nucleico que se muestran en las figuras 1 ó 2 para construir sondas para el cribaje de librerías de cDNA o genómicas, secuenciar los clones positivos obtenidos y repetir este proceso para reunir la secuencia de BRCA2 de tamaño completo a partir de las secuencias obtenidas;

(b) utilización de las secuencias que se muestran en las figuras 1 ó 2 para obtener oligonucleótidos que hibriden con los fragmentos de ácido nucleico de BRCA2, siendo utilizados estos oligonucleótidos junto con los oligonucleótidos diseñados para hibridar con un vector de clonación; amplificar mediante PCR los fragmentos de ácido nucleico en una librería que contenga los fragmentos de la secuencia de BRCA2; secuenciar los fragmentos amplificados para obtener la secuencia de BRCA2 entre las partes conocidas de la secuencia y del vector de clonación, y repitiéndose este proceso hasta reunir la secuencia de BRCA2 completa a partir de las secuencias así obtenidas; y/o,

(c) utilización de una amplificación rápida de extremos de cDNA (RACE) sintetizando los cDNAs a partir de una serie de RNAs distintos, estando ligados los cDNAs a un engarce oligonucleotídico y amplificando mediante PCR los cDNA de BRCA2 utilizando un cebador que hibrida desde la secuencia de cDNA del BRCA2 de la figura 1 y un segundo cebador que hibrida desde el engarce oligonucleotídico, secuenciar el ácido nucleico amplificado y repetir este proceso hasta reunir la secuencia de BRCA2 completa a partir de las secuencias así obtenidas.

5. Molécula de ácido nucleico aislada que consiste en la secuencia de ácido nucleico codificante que se muestra en la figura 4, o los alelos del mismo.

6. Vector replicable que comprende un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, unido operativamente a secuencias control para dirigir su expresión.

7. Células hospedadoras transformadas con un vector de acuerdo con la reivindicación 6.

8. Procedimiento de producción de un polipéptido BRCA2 que comprende el cultivo de células hospedadoras de acuerdo con la reivindicación 7, a fin de generar el polipéptido BRCA2.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 que comprende una etapa adicional de recuperación del polipéptido producido.

10. Molécula de ácido nucleico aislada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para utilizar en un procedimiento de tratamiento médico.

11. Sustancia que es un polipéptido de BRCA2 aislado codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 3 o reivindicación 4.

12. Sustancia que es un fragmento del polipéptido de BRCA2 aislado que consiste en la secuencia aminoacídica que se muestra en la figura 3.

13. Sustancia que es un fragmento del polipéptido de BRCA2 aislado que consiste en la secuencia aminoacídica que se muestra en la figura 5.

14. Sustancia de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 para utilizar en un procedimiento de tratamiento médico.

15. Anticuerpo que se une específicamente al polipéptido BRCA2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13.

16. Procedimiento in vitro de diagnóstico de una susceptibilidad o predisposición al cáncer de mama en mujeres, cáncer de mama en hombres, cáncer de ovario o cáncer de próstata en un paciente mediante el análisis de una muestra procedente del paciente para el gen BRCA2 o el polipéptido codificado por éste, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) comparar la secuencia de una molécula de ácido nucleico en la muestra con la secuencia de ácido nucleico de BRCA2 que se muestra en las figuras 1, 2 ó 4 para determinar si la molécula de ácido nucleico en la muestra contiene una o más mutaciones; o,

(b) determinar la presencia en la muestra del polipéptido codificado por el gen BRCA2, y que comprende la secuencia parcial que se muestra en la figura 3 ó 5 y, si estuviera presente, determinar si el polipéptido tiene un tamaño completo y/o está mutado; o,

(c) utilizar la PCR que implique uno o más cebadores basados en la secuencia del gen BRCA2 normal que se muestra en las figuras 1, 2 ó 4, o en las formas mutadas de las mismas, para rastrear genes BRCA2 normales o mutados en una muestra de un paciente.