KR20020063387A - 항암활성을 나타내는 ｒｕｎｘ３유전자 및 그의 용도 - Google Patents

항암활성을 나타내는 ｒｕｎｘ３유전자 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항암활성을 나타내는 RUNX3 유전자 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 RUNX3 유전자가 TGF-β의존성 프로그램된 세포사멸 (programed cell death, apoptosis) 기전에 필수적으로 관여하고 우수한 암 형성 억제활성을 나타내며 다양한 위암 및 폐암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 억제가 RUNX3 유전자의 엑손 (exon) 1 부근에 존재하는 전형적인 CpG 섬 (CpG island)에의 비정상적인 DNA 메틸화 (DNA methylation)에 기인한 것임을 밝힌 것이다. 본 발명의 RUNX3 유전자 및 그의 유전자 산물은 항암제의 개발에 유용하게 이용될 수 있을 뿐 아니라 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 비정상적인 DNA 메틸화를 측정하여 암을 진단하는 검사방법의 개발과 비정상적인 DNA 메틸화를 조절함으로써 RUNX3 유전자의 발현을 유도하는 방법 개발에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

항암활성을 나타내는 ＲＵＮＸ３ 유전자 및 그의 용도{RUNX3 gene showing anti-tumor activity and use thereof}
본 발명은 항암활성을 나타내는 RUNX3 유전자 및 그의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 RUNX3 유전자가 TGF-β의존성 프로그램된 세포사멸 (programed cell death, apoptosis) 기전에 필수적으로 관여하고 우수한 암 형성 억제활성을 나타내며 다양한 위암 및 폐암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 억제가 RUNX3 유전자의 엑손 (exon) 1 부근에 존재하는 전형적인 CpG 섬 (CpG island)에의 비정상적인 DNA 메틸화 (DNA methylation)에 기인한 것임을 밝힌 것이다.
종양은 자율적인 과잉 증식을 나타내는 세포의 집합으로서, 죽음에 이르게 할 가능성이 있는 악성종양 (이른바 암)과 그렇지 않은 양성종양으로 구별되는데 예외도 많아 엄격한 구별은 곤란하다. 특히, 암은 발암유전자 (oncogene) 및 종양 억제 유전자 (tumor suppressor gene)와 같은 유전자에 변이 (mutation)가 일어나서 발생하는 유전적 질환이며, 세포 차원에 원인이 있는 질환이다. 암 유전자 산물 (oncogene product)들은 세포에서 서로 네트워크 (network)를 이루어 세포의 분열이나 분화의 신호전달 체계를 조절하는 역할을 수행하고 있다. 즉, 이들의 조절이 비정상적이 되면 세포의 분화과정이 단절되고 무한정 분열을 계속하게 되는데, 이러한 잘못된 신호 전달 경로 (signal transduction pathway)를 정상적으로 환원시켜 줄 수 있다면 부작용이 적으면서도 탁월한 치료효과를 얻을 수 있는 항암제의 개발이 기대되고 있다.
현재, 암의 3가지 주요 치료법은 외과적 치료법, 약물 요법, 방사선 요법인데, 현실적으로는 이들 혹은 이들을 레이저 요법 등과 조합한 집학적 (集學的) 요법이 널리 행해지고 있지만 치료에 동반한 고통, 전이 등을 고려하면 약물 요법에 대한 기대가 큰 것이 당연하다. 따라서, 이에 부응할만한 수많은 항암제가 개발되어 사용되고 있는데, 이들 대부분의 항암제는 활발하게 분열하는 세포를 선택적으로 죽임으로써 항암 효과를 내는 원리에 준하여 개발된 것이다. 이러한 항암제는 정상적으로 인체 내에서 활발하게 분열하는 면역세포, 모근세포와 같은 정상세포도 함께 죽이게 되기 때문에 심각한 부작용을 동반하므로 장기간 사용이 불가능한 문제점이 지적되고 있다. 그러므로, 암 발병의 원인 규명에 기초한 새로운 항암제의 개발이 요구되고 있다.
한편, 암을 유발하는 발암 유전자의 비정상적인 활성화는 세포의 증식을 유도하게 되는데 반해 암 억제 유전자는 반대로 세포의 비정상적인 증식을 억제하거나 때로는 세포사멸 프로그램 (cell death program)을 작동시켜 특정 세포를 사멸시킴으로써 암세포의 생성을 차단한다. 일단 비정상적으로 활성화된 암유전자를 가지는 세포라 할지라도 암억제 유전자가 정상적인 활성을 나타내게 되면 그 세포는 암을 형성하지 못하고 사멸된다. 따라서, 암세포가 되기 위해서는 암 유전자의 활성화 뿐 아니라 암 억제 유전자의 불활성화가 하나의 세포에서 동시에 나타나야 한다.
암억제 유전자의 불활성화가 일어나는 기전 중 하나는 CpG 섬 (CpG island)에의 비정상적인 DNA 메틸화 (DNA methylation)이다 (Jones and Laird,Nature genet.Vol. 21, 163-167, 1999). CpG 섬의 메틸화는 DNA 메틸라아제 (DNA methylase)라는 효소에 의하여 이루어지며 메틸화가 축적되면 MeCP2와 같은 단백질이 메틸화된 DNA에 결합하게 되고 그로 인해 히스톤 디아세틸라아제 (hidtone deacethylase)를 불러 모으게 된다. 히스톤 디아세틸라아제는 다시 히스톤에 결합된 아세틸기 (acethyl group)를 제거하고 그 결과 그 부근의 DNA 구조가 조밀해져 유전자 발현 또한 억제되게 된다. DNA 메틸화에 의하여 유전자 발현이 억제된 경우는 DNA 메틸라아제 저해제 또는 히스톤 디아세틸라아제 저해제에 의하여 발현이 유도될 수 있다. 현재까지 알려진 DNA 메틸화에 의하여 발현이 억제되는 암억제 유전자로는 RB1, TP53, VHL, CDKN2A, CDKN2B, MLH1, APC 등이 알려져 있다 (Jones and Laird,Nature genet.Vol. 21, 163-167,1999).
전술한 바와 같이, 히스톤 아세틸화 (acetylation) 및 탈아세틸화 (deacetylation)가 진핵세포에서 전사의 조절에 매우 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있으며 (Grunstein M.,Nature, 389, 349-352, 1997), 트라폭신 (trapoxin), 트리코스타틴 A (trichostatin A), 디퓨데신 (depudecin)과 같은 천연의 HDAC 억제제들의 암세포에 대한 형질전환 억제 (detransforming) 활성이 알려져 왔다. 그 중에서, 디퓨데신의 혈관형성 억제활성 (anti-angiogenic activity)이 생체내 (in vivo) 및 생체외 (in vitro) 모두에서 밝혀져 있으며, 세포주기 (cell cycle) 정지, 유전자 발현양상의 변화 및 아폽토시스 (apoptosis) 유도 등을 포함하는 HDAC 억제제들의 세포성 반응이 알려져 있다.
암 억제 활성이 나타나는 또 다른 기전의 하나로서 TGF-β신호 전달계가 잘 알려져 있다. TGF-β가 TGF-β수용체 (receptor)에 결합하게 되면 세포 내의 Smad 단백질을 인산화하여 활성화시킨다. 활성화된 Smad 단백질은 세포 핵 내로 이동하여 유전자 발현을 조절함으로써 세포의 분열을 억제하거나 프로그램된 세포사멸 (programed cell death 또는 apotosis)을 유도함으로써 TGF-β에 의한 암 억제 활성 (tumor suppressor activity)을 나타내게 된다 (Massague et al.,Cell, 103(2):295-309, 2000). TGF-β수용체 또는 Smad4 단백질의 불활성화는 다양한 암세포에서 관찰되고 있다. 또한, TGF-β수용체가 불활성화 된 세포주에 TGF-β수용체를 과발현시키고 상기 세포주가 도입된 누드 마우스를 이용한 암억제 효과 분석 실험에서도 TGF-β수용체는 강력한 암 억제 활성을 가지고 있음이 확인되었다 (Chang et al.,Cancer Res., 57(14):2856-2859, 1997). TGF-β 신호 전달계가 Smad 단백질을 통하여 CDK 저해 단백질 p21의 발현을 촉진함으로써 세포증식을 억제하는 과정은 잘 밝혀져 있으나 프로그램된 세포사멸을 유도하는 기전은 거의 밝혀지지 않고 있다.
한편, PEBP2 패밀리 유전자에는 RUNX1/PEBP2αB/CBFA2/AML1과 RUNX2/PEBP2αA/CBFA2/AML3 그리고 RUNX3/PEBP2αC/CBFA3/AML2 세 종류가 알려져 있다 (Bae and Ito,Histol. Histopathol., 14(4):1213-1221, 1999). RUNX1, RUNX2, RUNX3 유전자 상호간에는 전체적으로 약 60-70% 정도의 아미노산 서열의 유사성을 보이고 있는데, 이들은 진화적으로 대단히 잘 유지되어 각각의 마우스와 사람 유전자간의 유사성은 약 95% 정도이다.
RUNX1은 염색체 전이 (chromosome translocation)에 의하여 다른 유전자와 접합됨으로써 사람의 급성 골수성 백혈병 또는 급성 림프성 백혈병을 일으키는 유전자로서 중요한 백혈병 원인 유전자이다 (Miyoshi et al.,EMBO J., 12:2715-2721, 1993; Romana et al.,Blood, 85:3662-3670, 1995; Okuda et al.,Blood,91:3134-3143, 1996; Okuda et al.,Cell, 84:321-330, 1998). RUNX1 유전자는 암을 유도할 수 있는 암 유전자 활성을 가지고 있는 것으로 보고되어 있다 (Kurokawa et al.,Oncogene, 12(4):883-892, 1996). RUNX2는 골(骨)조직 형성에 대단히 중요한 역할을 하고 있으며 사람의 골조직 형성 이상을 유발하는 쇄골두개이골증 (cleidocranial dysplasia)의 원인 유전자임이 밝혀졌다 (Komori et al.,Cell, 89:755-764, 1997; Lee et al.,Nat. Genet., 15:303-306, 1997; Mundlos et al.,Cell, 89:773-779, 1997; Otto et al.,Cell, 89:756-771, 1997). Runx2 유전자 또한 T-cell 림포마 (lymphoma)를 형성할 수 있는 암 유전자 활성을 가지고 있음이 보고되어 있다 (Stewart et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 94(16):8646-8651, 1997).
PEBP2 패밀리에 속하는 세번째 유전자로서 RUNX3 유전자의 존재는 본 발명자들에 의하여 수년 전에 밝혀진 바 있으나 (Bae et al.,Gene, 159(2):245-248, 1995; Levanon et al.,Genomics, 23(2):425-532, 1994), RUNX3 유전자의 활성과 관련 질병에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.
이에 본 발명자들은 RUNX3 유전자의 활성과 관련 질병에 대해 밝히고자 연구를 계속한 결과, PEBP2 패밀리에 속하는 다른 유전자 (RUNX1, RUNX2)들이 암유도 기능을 가지는데 반하여 본 발명의 RUNX3 유전자 산물은 암 억제 활성을 가지고 있으며 TGF-β에 의한 세포사멸 기전에 필수적으로 관여하고 다양한 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현과 RUNX3 엑손 1 부근의 DNA 메틸화 사이에 깊은 상관관계가있음을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 암 억제 유전자 및 상기 유전자의 암억제 기전과 발현 조절기전을 규명함으로써 암의 진단방법 개발과 치료제 개발에 이용하기 위하여 RUNX3 유전자의 활성과 작용기작을 제공하는 것이다.
도 1a는 사람의 RUNX3 유전자의 cDNA 염기서열을 나타낸 것으로 RT-PCR 분석에 이용된 시발체의 위치를 화살표로, 전사개시 코돈 (ATG)과 전사종료 코돈 (TGA)을 굵은 문자로 표시한 것이고,
도 1b는도 1a의 사람 RUNX3 유전자의 cDNA 염기서열이 계속된 것이고,
도 1c는도 1a의 사람 RUNX3 유전자의 cDNA 염기서열로부터 추정된 아미노산 배열순서이고,
도 2a는 사람의 RUNX3 유전자의 엑손 (exon) 1 부위에 존재하는 CpG 섬 (CpG island)의 염기서열을 나타낸 것으로, 게놈 DNA 서던 블럿 분석 (genomic DNA Southern blot analysis)의 탐침으로 이용된 부위를 밑줄로, 엑손 I 내에 위치하는 전사개시 코돈 (ATG)을 굵은 문자로 표시한 것이고,
도 2b는도 2a의 사람 RUNX3 유전자의 엑손 (exon) 1 부위에 존재하는 CpG 섬의 염기서열이 계속된 것이고,
도 3은 본 발명의 안티센스 (antisenxe) RUNX3 유전자를 발현하는 SNU16 세포주 SNU16-Rx3-AS-cl1 및 SNU16-Rx3-AS-cl2와 센스 (sense) RUNX3 유전자를 발현하는 MKN28 세포주 MKN28-Rx3로부터 각각의 센스 및 안티센스 RUNX3 유전자가 발현되는지를 노던 블럿 분석 (northern blot analysis)으로 확인한 결과이고,
도 4a는 TGF-β에 의하여 유도되는 프로그램된 세포사멸 효과를 분석하기 위하여 SNU16-Rx3-AS-cl1 세포주에 TGF-β1을 1 ng/㎖ 농도로 처리한 후 생존하는 세포수를 세어 대조군 SNU16 세포주와 비교한 결과이고,
도 4b는 TGF-β1에 의한 SNU16 세포주의 사멸이 프로그램된 세포사멸 기전에 의한 것인지를 확인하기 위하여 본 발명의 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에 1 ng/㎖의 TGF-β1을 6시간 동안 처리한 후 게놈 (genomic) DNA를 정제하여 프로그램된 세포사멸 특이적인 아폽토시스성 밴드 (apoptotic band)를 검사한 결과이고,
도 5a는 RUNX3 유전자의 암형성능 억제활성을 조사하기 위하여 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현시켜 RUNX3의 발현을 선택적으로 차단시킨 SNU16-Rx3-AS-cl1, SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주 및 RUNX3을 정상적으로 발현하는 대조군-SNU16 세포주를 각각 누드 마우스에 동략씩 피하주사한 후 98일간 암조직의 크기 변화를 측정한 결과이고,
도 5b는 RUNX3 유전자를 발현하지 않는 대조군-MKN28 세포와 RUNX3을 과발현시킨 MKN28-Rx3 세포를 각각 누드 마우스에 동량씩 피하주사한 후 37일간 암조직의 크기 변화를 측정한 결과이고,
도 5c는 상기도 5a및도 5b에서 암형성능 관찰 최종일에 마우스를 희생시키고 암조직을 적출하여 크기를 직접 비교한 결과이고,
도 6a는 RUNX3 cDNA의 전체적인 구조를 간략히 나타낸 모식도로서, RT-PCR 시발체의 대략적인 위치와 RUNX3 단백질이 DNA에 결합하는데 중요한 역할을 하는 런트 도메인 (Runt domain)을 빗줄상자로 표시한 것이고,
도 6b는 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 15종의 위암 세포주에서 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR 방법으로 RUNX3 mRNA의 발현 여부를 분석한 결과이고,
PS-N; PS-N 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR,
PS-C; PS-C 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR,
PS-C ST; PS-C 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR 후 RUNX3 cDNA를 탐침으로 서던 블럿 분석,
PEBP2β; 사람의 PEBP2β/CBFB cDNA 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR,
β-엑틴 (β-actin); 사람의 β-엑틴 cDNA 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR.
도 6c는 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여 17종의 폐암 세포주에서 전체 RNA를 분리하고 RT-PCR 방법으로 RUNX3 mRNA의 발현 여부를 분석한 결과이고,
PS-N; PS-N 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR,
PS-C; PS-C 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR,
β-엑틴 (β-actin); 사람의 β-엑틴 cDNA 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR.
도 7a는 RUNX3 엑손 1 부근의 제한효소 배치와 전형적인 CpG 섬 내 CpG가 나타나는 빈도를 개략적으로 나타낸 모식도로서, 게놈 DNA 서던 블럿 분석에 이용된탐침 DNA 단편의 대략적인 위치를 굵은 막대로 표시한 것이고,
도 7b는 다양한 위암 세포주에서 RUNX3 유전자 엑손 1 부근의 메틸화 (methylation) 상태를 분석하기 위하여, 제한효소 처리 후 CpG 섬의 일부를 인지하는 DNA 탐침으로 게놈 서던 블럿 분석을 수행한 결과이고,
위쪽: 메틸화된 DNA에는 활성을 나타내지 못하는 제한효소인 SmaI 처리,
아래쪽; DNA 메틸화와는 관계없이 활성을 나타내는 제한효소인 BamHI 처리.
도 8은 DNA 메틸라아제 (DNA methylase) 저해제 또는 히스톤 디아세틸라아제 (histone deacethylase) 저해제 처리에 의한 RUNX3 유전자의 발현 여부를 조사하기 위하여, 정상적으로는 RUNX3을 발현하지 않음이 확인된 NUGC3, MKN28, MKN74 세포주에 DNA 메탈라아제 저해제인 5-아자-2-데옥시시티딘 (5-aza-2-deoxycytidine, AZA, 300 nM) 또는 히스톤 디아세틸라아제 저해제인 트리코스타틴 A (trichostatin A, TSA, 1 mM) 또는 두가지 저해제를 동시에 처리한 후 이들 세포로부터 분리·정제한 전체 RNA를 RT-PCR로 분석한 결과이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 센스 RUNX3 유전자를 포함하여 RUNX3 유전자를 과발현시킨 세포주 및 안티센스 RUNX3 유전자를 포함하여 RUNX3 유전자의 발현을 선택적으로 차단시킨 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 암 형성 억제 활성을 나타내는 RUNX3 유전자 및 그의 단백질을 제공한다.
본 발명에서는 상기 RUNX3 유전자를 과발현시킨 세포주 및 RUNX3 유전자의 발현을 선택적으로 차단시킨 세포주를 이용하여 RUNX3 유전자가 TGF-β의존성 프로그램된 세포사멸 기전에 필수적임을 밝힌다.
또한, 본 발명에서는 다양한 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 억제가 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 DNA 메틸화에 기인한 것임을 밝힌다.
아울러, 본 발명은 상기 RUNX3 유전자 및 그의 단백질을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
마지막으로, 본 발명은 상기 RUNX3 유전자 및 그의 단백질을 항암제의 개발 및 암을 진단하는 검사방법의 개발에 사용하는 용도를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 센스 RUNX3 유전자를 포함하여 RUNX3 유전자를 과발현시킨 세포주 및 안티센스 RUNX3 유전자를 포함하여 RUNX3 유전자의 발현을 선택적으로 차단시킨 세포주를 제공한다.
본 발명자들은 RUNX3 유전자의 활성과 작용기작을 밝히기 위하여 센스 RUNX3 유전자와 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주를 수립하였다.
우선, 본 발명자들은 RUNX3 유전자의 센스 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터를 제조하기 위하여 1995년 본 발명자에 의하여 발표된 바 있는 인간의 RUNX3 유전자를 이용하였다 (Bae et al.,Gene, 159(2):245-248, 1995; cDNA 염기배열 순서 GenBank accession No. Z35278). RUNX3 유전자의 cDNA는서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지며 이로부터서열번호 2로 기재되는 RUNX3 유전자의 전사개시 코돈과 전사종료 코돈 사이에 나타나는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)으로부터 추정되는 아미노산 서열로 구성된 415개의 폴리펩타이드가 암호화된다 (도 1a, 1b및1c참조). 또한, RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 유전자 단편은서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다 (도 2a및2b참조).
RUNX3 유전자의 센스 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터는서열번호 1로 기재되는 RUNX3 유전자의 cDNA 중 RUNX3 cDNA의 코딩 부위 (coding region) 전체를포함하는 2,244 bp크기의 DNA 단편 (도 1a참조)을 pEF-BOS 벡터 (Mizushima et al,Nucleic Acids Res., 18(17):5322, 1990)에 올바른 방향으로 삽입하여 제조하였고 이를 pEF-BOS-Rx3라 명명하였다. 또한, RUNX3 cDNA를 pEF-BOS 벡터에 역방향으로 삽입하여 제조하였고 이를 pEF-BOS-Rx3-AS라 명명하였다.
상기와 같이 제조된 플라스미드 벡터 pEF-BOS-Rx3를 다양한 암 세포주에 동시-형질감염 (co-transfection)시킨 후 pEF-BOS-Rx3가 안정적으로 도입된 형질감염체 (stable transfectant)를 선별하여 센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주를 수립하였다. 본 발명에서는 바람직한 실시 예로서 플라스미드 벡터 pEF-BOS-Rx3를 RUNX3 유전자를 발현하지 않은 MKN28 세포주에 리포펙타민 (Lipofectmin, Gibco-BRL)을 이용하여 네오마이신 선별 마커 (neo selection marker)를 가진 플라스미드와 동시-형질감염시킨 후 형질감염체를 G418로 선별하였다. 이와 같이 선별된 센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주를 MKN28-Rx3라 명명하였고 이를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 1월 9일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0933BP).
또한, 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주는 상기에서 제조된 플라스미드 벡터 pEF-BOS-Rx3-AS를 p53 유전자가 불활성화된 위암 세포주로서 (Kim et al.,J. Natl. Cancer Inst., 8(13):938-943, 1991) TGF-β신호 전달 체계는 정상적으로 유지하고 있는 (Park et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,91(10):9772-8776, 1994) SNU16 세포주에 상기와 동일한 방법으로 선별 마커를 포함하는 플라스미드와 동시-형질감염시킨 후 pEF-BOS-Rx3-AS가 안정적으로 도입된형질감염체를 선별하였다. 이와 같이 선별된 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현하여 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 저해된 세포주를 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2라 명명하였고 이들 각각을 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 1월 9일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0934BP 및 KCTC 0935BP).
본 발명의 MKN28-Rx3, SNU16-Rx3-AS-cl1 및 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에서 센스 RUNX3 유전자 및 안티센스 RUNX3 유전자가 실제로 과발현되는지 확인하기 위하여서열번호 1의 RUNX3 cDNA를 DNA 탐침으로 사용하여 노던 블럿 분석을 수행한 결과, 센스 RUNX3 유전자를 과발현시킨 MKN28-Rx3 세포주에서는 18S RNA와 거의 일치하는 위치에서 RUNX3 유전자의 전사체가 단일 밴드로 검출되어 RUNX3 유전자가 상기 세포주에서 실제로 발현되고 있음을 확인하였다. 반면, 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현시킨 SNU16-Rx3-AS-cl1 및 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에서는 다양한 크기의 안티센스 RUNX3 RNA가 검출되었다. 대조군 SNU16 세포주에서의 내생적인 (endogenous) RUNX3 유전자의 발현은 노던 블럿 분석 방법으로는 검출되지 않았다 (도 3참조).
또한, 본 발명은 항암활성을 나타내는 RUNX3 유전자 및 그의 산물을 제공한다.
본 발명자들은 RUNX3 유전자의 활성과 작용기작을 밝히기 위하여 상기에서 수립된 RUNX3 유전자가 과발현되는 MKN28-Rx3 세포주 및 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 차단된 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주를 이용하였다.
우선, TGF-β에 의하여 유도되는 프로그램된 세포사멸 효과를 분석하기 위하여 정상적인 SNUX3 세포주와 본 발명의 안티센스 RUNX3 유전자가 과발현되어 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 저해되는 SNU16-Rx3-AS-cl1 및 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에 TGF-β1을 처리한 후 생존하는 세포의 수를 대조군과 비교한 결과, SNU16 세포주에서 TGF-β1 처리에 의해 세포가 사멸됨이 관찰되었다. 구체적으로, 생존하는 SNU16 세포의 수는 TGF-β1의 처리 후 급격히 감소하여 2일 후에는 완전히 사멸됨을 알 수 있다. 그러나, 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현시켜 RUNX3 유전자의 발현을 선택적으로 차단시킨 SNU16-Rx3-AS-cl1 세포주에서는 이러한 TGF-β1에 의한 세포사멸 현상이 전혀 관찰되지 않았으며, SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에서도 동일한 현상이 관찰되었다 (도 4a참조). 따라서, TGF-β1에 의한 SNU16 세포주의 사멸에는 RUNX3 유전자가 관여함을 알 수 있다.
또한, 본 발명자들은 SNU16 세포주에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포사멸이 프로그램된 세포사멸 (programed cell death of apoptosis) 기전에 의한 것인지 아니면 세포괴사 (necrosis)에 의한 것인지 규명하기 위하여 프로그램된 세포사멸 기전 특이적인 아폽토시스성 DNA 밴드를 분석하였다.
그 결과, SNU16 세포주에서는 TGF-β1 처리 후 분명한 세포사멸 기전 특이적인 아폽토시스성 DNA 밴드가 생성되었으나 (도 4b참조, 레인 1 및 2), 안티센스 RUNX3 유전자가 과발현되어 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 억제된 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에서는 이러한 아폽토시스성 DNA 밴드가 관찰되지 않았다 (도 4b참조, 레인 3, 4, 5 및 6).
이러한 결과로부터 본 발명자들은 SNU16 세포주에서는 TGF-β1 자극에 의한 아폽토시스 기전에 의하여 세포가 사멸되며 이 과정에 RUNX3가 필수적임을 확인하였다.
TGF-β1 자극에 의한 프로그램된 세포사멸 기전은 정상세포가 암세포로 변하는 것을 억제하는 대단히 중요한 기전으로서, 이러한 과정에 중요한 역할을 하는 인자들은 대부분 항암효과를 가지고 있음이 잘 알려져 있다(Chang et al.,Cancer Res., 57(14):2856-2859, 1997). 이에 본 발명자들은 RUNX3 유전자 역시 항암효과를 가질 것으로 기대하고 RUNX3 유전자의 항암효과를 분석하기 위하여 누드 마우스를 이용한 암형성능 (tumorigenecity) 분석을 수행하였다. 암형성능 분석은 각각의 세포주를 동량씩 피하주사한 후 실험기간 동안 암 조직의 크기변화를 정기적으로 외부에서 측정하였으며 최종일에는 마우스를 희생시키고 암 조직을 적출하여 크기를 비교하였다.
그 결과, RUNX3의 발현이 차단된 SNU16 세포주인 본 발명의 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2가 주사된 마우스에서 대조군 세포에 비하여 현저히 빠른 속도로 암이 형성됨을 관찰하였다 (도 5a참조). 구체적으로, 최종일에 대조군의 암 조직 크기는 800 ㎜3인데 반하여 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2가 주사된 실험군의 암 조직 크기는 1,600 ㎜3에 달하여 암 조직의 형성능이 2배 정도 증가하였음을 알 수 있었다. 약 98일 경과 후 마우스로부터 암을 적출하고 그 크기를 직접 비교한 결과 역시 대조군에서 적출한 암 조직 보다 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2가 주사된 실험군에서 적출한 암 조직의 크기가 현저하게 비대해져 있음을 관찰하였다 (도 5c참조).
또한, 대조군-MKN28 세포주와 본 발명의 센스 RUNX3 유전자를 과발현시킨 MKN28-Rx3 세포주를 이용하여 SNU16의 경우와 동일한 방법으로 누드 마우스를 이용하여 암형성 억제 효과를 분석한 결과, 대조군-MKN28 세포주를 주사한 마우스에 비하여 센스 RUNX3 유전자를 과발현시킨 MKN28-Rx3 세포주를 주사한 마우스에서 암형성이 현저히 억제됨이 확인되었다 (도 5b참조). 구체적으로, 최종일에 대조군의 암 조직 크기는 600 ㎜3인데 반하여 MKN28-Rx3가 주사된 실험군의 암 조직 크기는 250 ㎜3에 달하여 암 조직의 형성능이 58% 정도 감소하였다. 약 30일 경과 후 마우스로부터 암을 적출하고 그 크기를 직접 비교한 결과 역시 대조군에서 적출한 암 조직 보다 MKN28-Rx3가 주사된 실험군에서 적출한 암 조직의 크기가 육안으로 식별가능한 정도로 감소하였음을 관찰하였다 (도 5c참조).
이러한 결과로부터 본 발명자들은 RUNX3 유전자가 암형성 억제 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 다양한 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여, 15종의 위암 세포주와 17종의 폐암 세포주로부터 전체 RNA를 분리한 후 RT-PCR 방법을 이용하여 RUNX3 유전자의 mRNA 발현 여부를 조사하였다. 위암 세포주로는 SNU1, SNU5, SNU16, SNU719, NUGC3, MKN1, MKN7, MKN28, MKN45, MKN74, AGS, KatoIII, RF1, RF48 및 AZ521를 사용하였고, 폐암 세포주로는 NCI-H522, 86-2, A549, LK79, LK87, LCSC#1, LCSC#2, NCI-H23, NCI-H226, NCI-460, NCI-H322, Sq-19, NCI-H1915, NCI-H630, Hs 888Lu, Lu65 및 LX-1을 사용하였으며, 상기 세포주들은 한국생명공학연구원 유전자은행으로부터 분양받아 사용하였다.
그 결과, 위암 세포주 중 SNU5, SNU16, SNU719, MKN1, MKN45, RF1, RF48, MKN7, AZ521 세포주에서 PS-N과 PS-C 시발체 쌍을 이용한 증폭에서 모두 예상되는 크기 (PS-N 시발체 쌍 = 1,080 bp; PS-C 시발체 쌍 = 870 bp)의 RT-PCR 산물을 생성하였고 이 중 MKN7의 경우는 대단히 소량의 산물이 생성되었다 (도 6b참조). 반면 SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS, KatoIII 세포주에서는 PS-N과 PS-C 시발체 쌍을 이용한 증폭에서 모두 RT-PCR 산물을 전혀 생성하지 않았다. 또한, 17종의 폐암 세포주에서도 동일한 방법으로 RUNX3 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 분석한 결과, Hs888Lu 세포주에서는 RUNX3 유전자의 발현이 현저히 억제되어 있었으며 NCI-H226, NCI-460, NCI-H630, Lu65 4종에서는 RUNX3 유전자의 발현이 완전히 억제되어 있었다 (도 6c참조).
상기에서 RT-PCR 증폭에 의해 생성된 PCR 산물이 RUNX3 유전자의 cDNA로부터 증폭된 산물임을 입증하기 위하여 서던 블럿 분석을 수행한 결과, RT-PCR로부터 생성된 산물이 RUNX3 cDNA로부터 증폭된 산물임을 확인하였다 (도 6b참조, PS-3ST). 동일한 제일 가닥 (first strand) cDNA로부터 PEBP2β(도 6b참조, PEBP2β)와 β-엑틴 cDNA (도 6b, β-actin)를 증폭해 낼 수 있음을 관찰함으로써 상기 실시예 <4-1>에서 위암 세포주인 SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS, KatoⅢ, NCI-H226, NCI-460, NCI-H630, Lu65에서 RUNX3 cDNA가 증폭되지 않은 것은 상기 세포주에서 RUNX3 유전자가 발현되지 않았기 때문임을 확인하였다. 마찬가지로 MKN7, Hs888Lu 세포주에서 대단히 소량의 RT-PCR 산물이 생성된 것도 RUNX3 유전자의 발현 수준이 매우 낮기 때문임을 알 수 있었다.
이상과 같은 결과로부터 본 발명자들은 위암 세포주의 약 47% 그리고 폐암 세포주의 약 30%에서 RUNX3 유전자의 발현이 현저히 또는 완전히 억제되어 있음을 알 수 있었다. RUNX3 유전자가 발현되지 못하면 TGF-β에 의한 프로그램된 세포사멸이 일어나지 못하며 암세포의 암형성능도 증대되는 것으로 볼 때 RUNX3 유전자의 발현억제는 약 47%의 위암과 약 30%의 폐암 (위암과 폐암 전체적으로는 약 37%)에 있어서 중요한 진단지표가 될 수 있음을 확인하였다.
아울러, 본 발명자들은 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 돌연변이 분석시 각종 암 세포주로부터 RUNX3 유전자의 모든 엑손이 증폭된다는 사실을 통하여 몇 종의 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현이 관찰되지 않은 것은 RUNX3 유전자가 세포 내에 존재하지만 다만 발현되지 않을 뿐임을 알게되었다. 이에 본 발명자들은 RUNX3 유전자의 발현 억제가 DNA 메틸화에 기인하는지 밝히기 위하여 RUNX3 유전자의 발현상태와 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화 (hypermethylation) 사이에의 상관관계를 DNA 메틸화에 대하여 민감한 제한효소를 사용한 게놈 DNA 서던 블럿 분석을 수행하여 조사하였다. 이때, 암 세포주로부터 분리·정제된 게놈 DNA는 DNA가 메틸화되어 있으면 절단하지 못하는 제한효소 또는 DNA 메틸화와는 관계없이 절단할 수 있는 제한효소로 처리하였다. 본 발명의 바람직한 실시 예에서는 DNA 메틸화에 의해 절단하지 못하는 제한효소로 SmaI을, DNA 메틸화와는 상관없이 절단하는 제한효소로 BamHI을 사용하였다.
그 결과, RUNX3 유전자의 발현이 관찰되지 않은 위암 세포주 SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS, KatoⅢ에서만 특이적으로 SmaI 절단이 크게 저해된 결과를 관찰할 수 있었으며, 상기에서 발현 수준이 특히 낮았던 MKN7 세포주는 부분적으로 메틸화된 양상을 나타내었다 (도 7b참조). 이러한 결과는 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 억제와 RUNX3 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화 사이에 깊은 상관관계가 있음을 의미하는 것이다.
상기에서 관찰된 DNA 메틸화가 RUNX3 유전자의 발현을 억제하는 직접적인 원인인지 분석하기 위하여, 본 발명자들은 DNA 메틸라아제 저해제 또는 히스톤 디아세틸라아제 저해제를 처리하였을 때 RUNX3 유전자의 발현이 재활성화 되는지 조사하였다. 이때, DNA 메틸라아제 저해제로는 5-아자-2-데옥시시티딘 (5-aza-2-deoxycytidine, AZA, 300 nM)를 사용하였고 히스톤 디아세틸라아제 저해제로는 트리코스타틴 (trichostatin A, TSA, 1 mM)을 사용하였다.
그 결과, DNA 메틸라아제 저해제 또는 히스톤 디아세틸라아제 저해제를 처리하였을 때 RUNX3 유전자의 발현이 다시 유도됨을 확인하였다 (도 8참조). 이러한 결과로부터 약 37%의 위암, 폐암 세포주에서 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화에 의하여 RUNX3 유전자의 발현이 억제되어 있음이 증명되었다. 이러한 결과는 또한 RUNX3 유전자의 발현을 촉진하는 약제가 DNA 메틸라아제 저해제 또는 히스톤 디아세틸라아제 저해제로부터 개발되어 항암제로 사용될 수 있음을 의미한다.
상기와 같은 결과들을 통하여 본 발명자들은 RUNX3 유전자 산물이 TGF-β1의존성 아폽토시스 기전에 관여함으로써 항암 활성을 가지며 약 37%의 위암과 폐암 세포주에 있어서 정상적인 RUNX3 유전자의 발현이 상기 유전자의 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화에 의하여 억제되어 있음을 확인하였다.
아울러, 본 발명은 상기 센스 또는 안티센스 RUNX3 유전자를 발현하는 발현벡터 및 그의 단백질을 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은 암의 예방, 진단 또는 치료에 사용될 수 있는데, 보다 상세하게는 TGF-β의존성 프로그램된 세포사멸기전의 비정상화에 기인하는 질환 또는 위암, 폐암 등을 포함하는 다양한 암 질환을 예방, 진단 또는 치료 목적으로 사용할 수 있다.
이때, 상기 약학적 조성물의 유효성분으로는 RUNX3 cDNA, RUNX3 RNA 또는 이로부터 생산된 단백질을 사용할 수도 있으며, 보다 바람직하게는 그 발현벡터 자체를 사용하는 것이 좋은데, 이는 RUNX3 유전자 발현벡터를 투여하면 그로부터 지속적으로 RUNX3 단백질이 생산될 수 있기 때문이다. 상기 발현벡터를 유효성분으로 하는 약학적 조성물을 비경구로 생체 조직에 투여하면, 투여된 생체 조직은 RUNX3를 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 RUNX3 유전자 또는 이를 포함하는 발현 벡터는 유전자 치료요법 (gene therapy)에 사용되는 약학적 조성물의 유효성분으로서 이용할 수 있다.
상기 RUNX3 cDNA, 그로부터 생산된 RUNX3 RNA 또는 RUNX3 단백질은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 특히 비경구 주사 투여가 바람직하다.
즉, 상기 발현벡터 또는 그로부터 생산된 RUNX3 단백질은 실제 임상투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 세포내 흡수를 돕기 위하여 리포좀 (Liposome) 과 같은 제형이 이용될 수 있다.
상기 RUNX3 cDNA의 유효용량은 0.002 ∼ 1 ㎎/㎏ 이고, 바람직하기로는 0.02 ∼ 0.2 ㎎/㎏ 이며, RUNX3 RNA의 유효용량은 0.001 ∼ 0.5 ㎎/㎏ 이고, 바람직하기로는 0.01 ∼ 0.1 ㎎/㎏ 이며 상기 RUNX3 단백질의 유효용량은 0.04 ∼ 4 ㎎/㎏ 이고, 바람직하기로는 0.4 ∼ 1 ㎎/㎏ 이다.
마지막으로, 본 발명은 상기 RUNX3 유전자 및 그의 단백질을 항암제의 개발 및 암을 진단하는 검사방법의 개발에 사용하는 용도를 제공한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 RUNX3 유전자는 우수한 항암 활성을 나타내며 TGF-β의존성 프로그램된 세포사멸 (programed cell death, apoptosis) 기전에 필수적으로 관여한다. 구체적으로, RUNX3의 발현은 약 47%의 위암 세포주 및 약 30%의 폐암 세포주 (위암과 폐암 전체적으로는 약 37%)에서 억제되어 있음을 확인하였다. 또한, 다양한 위암 및 폐암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 억제는 RUNX3 유전자의 엑손 (exon) 1 부근에 존재하는 전형적인 CpG 섬 (CpG island)에의 비정상적인 DNA 메틸화 (DNA methylation)에 기인하는 것이며, DNA 메틸라아제 억제제 또는 히스톤 디아세틸라아제 억제제 처리에 의하여 RUNX3 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 RUNX3 유전자 및 그의 유전자 산물은 항암제의 개발 뿐 아니라 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 비정상적인 DNA 메틸화를 측정하여 암을 진단하는 검사방법의 개발에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, RUNX3의 발현이 억제된 암의 치료목적으로 RUNX3 유전자의 발현을 유도하는 활성물질의 개발에도 이용될 수 있다.
이러한 연구의 일환으로서,서열번호 3으로 기재되는 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열 (도 2a및2b참조)의 메틸화를 조절하는 활성을 가진 물질을 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물을 개발할 수 있다.
또한,서열번호 3으로 기재되는 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출함으로써 암을 진단하는 검사방법은
1) 피험자의 암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리·정제하는 단계;
2) 단계 1의 게놈 DNA를 DNA가 메틸화에 민감한 제한효소로 절단하는 단계;
3) 단계 2의 게놈 DNA를 아가로오스 겔에 전기영동한 후 막에 이동시키는 단계;
4) 단계 3의 막을 제 1항의 RUNX3 유전자 DNA 탐침으로 혼성화 반응을 수행하는 단계;
5) 단계 4의 막을 필름에 노출시켜 RUNX3 유전자의 발현을 검출하는 단계로 구성되거나,
1) 피험자의 혈액 또는 암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리·정제하는 단계;
2) 단계 1의 게놈 DNA를 DNA가 메틸화에 민감한 제한효소로 절단하는 단계;
3) 단계 2의 게놈 DNA를 주형 (template)로 이용하고 서열번호 3의 염기서열 일부를 시발체 (primer)로 이용하여 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계; 및
4) 아가로오스 겔에 전기영동하여 반응 산물을 검출하는 단계로 구성될 수 있다.
PCR을 이용하는 상기 검사방법은 목적하는 유전자 부위가 메틸화 되어있으면 PCR 산물이 나타나며 메틸화 되어있지 않으면 PCR 산물이 나타나지 않는 원리를 이용하였다.
또한, 본 발명의서열번호 1로 기재되는 RUNX3 cDNA 염기서열의 일부 또는 이로부터 생산된 RUNX3 단백질은 암을 진단하기 위한 생물학적 마이크로칩 (biological microchip) 형태로 제공될 수 있다.
마이크로칩은 분자생물학적 지식과 기계 및 전자공학적 기술을 접목하여 제조되는 것으로, 적게는 수 십개부터 많게는 수 만개의 DNA 또는 단백질을 아주 작은 공간에 고밀도로 붙여 놓은 것이다. 이로 인하여 마이크로칩은 동시에 최소 수백 개 이상의 유전자 또는 단백질을 빠른 시간 내에 검색할 수 있어, 상기 마이크로칩을 이용하면 기존의 생명공학적 기술을 이용하는 것보다 새로운 유전자 탐색 및 진단을 신속하고 간편하게 할 수 있다. 마이크로칩은 유전물질의 크기에 따라 올리고뉴클레오티드 칩 (Oligonucleotide chip) 및 cDNA 칩으로 나눌 수 있고 찾고자 하는 유전자 및 실험목적에 따라 선택하여 사용할 수 있다. 따라서, 상기의RUNX3 cDNA 염기서열의 일부 또는 이로부터 생산된 RUNX3 단백질에 대한 항체를 이용한 마이크로칩은 위암 및 폐암을 포함하는 각종 암으로 의심되는 수많은 환자들의 진단에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> SNU16-Rx3-AS 와 MKN28-Rx3 세포주의 수립
본 발명자들은 RUNX3 유전자의 활성과 작용기작을 밝히기 위하여 센스 RUNX3 유전자와 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주를 하기와 같이 수립하였다.
<1-1> 센스 및 안티센스 RUNX3 유전자 발현 플라스미드 벡터의 제조
우선, 본 발명자들은 RUNX3 유전자의 센스 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터를 제조하기 위하여 1995년 본 발명자에 의하여 발표된 바 있는 인간의 RUNX3 유전자를 이용하였다 (Bae et al.,Gene, 159(2):245-248, 1995). RUNX3 유전자의 cDNA는서열번호 1로 기재되는 염기서열을 가지며 이로부터서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 415개의 폴리펩타이드가 암호화된다 (도 1a, 1b및1b). 또한, RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 유전자 단편은서열번호 3으로 기재되는 염기서열로 구성되어 있다 (도 2a및2b).
구체적으로, RUNX3 유전자의 센스 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터는서열번호 1로 기재되는 RUNX3 유전자의 cDNA 중 RUNX3 cDNA의 코딩 부위 (coding region) 전체를 포함하는 2,244 bp크기의 BamHI 단편 (도 1a)을 pEF-BOS 벡터의 (Mizushima et al, 1990) 제한효소 XbaI 부위에 올바른 방향으로 삽입하여 제조하였고 이를 pEF-BOS-Rx3라 명명하였다.
또한, RUNX3 유전자의 안티센스 유전자를 발현하는 플라스미드 벡터는서열번호 1로 기재되는 RUNX3 cDNA를 pEF-BOS 벡터의 제한효소 XbaI 부위에 역방향으로 삽입하여 제조하였고 이를 pEF-BOS-Rx3-AS라 명명하였다.
<1-2> 형질감염 (Stable transfection)
센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주를 제조하기 위하여 상기 실시예 <1-1>로부터 제조된 플라스미드 벡터 pEF-BOS-Rx3를 RUNX3 유전자를 발현하지 않는 MKN28 세포주에 리포펙타민 (Lipofectmin, Gibco-BRL)을 이용하여 네오마이신 선별 마커 (neo selection marker)를 가진 pcDNA3.1 플라스미드와 동시-형질감염 (co-transfection)시킨 후 pEF-BOS-Rx3가 안정적으로 도입된 형질감염체 (stable transfectant)를 G418로 선별하였다. 이와 같이 선별된 센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주를 MKN28-Rx3라 명명하였고 이를 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 1월 9일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0933BP).
또한, 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주는 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 플라스미드 벡터 pEF-BOS-Rx3-AS를 p53 유전자가 불활성화된 위암 세포주로서 (Kim et al., 1991) TGF-β신호 전달 체계는 정상적으로 유지하고 있는 (park et al., 1994) SNU16 세포주에 상기와 동일한 방법으로 pcDNA3.1 플라스미드와 동시-형질감염시킨 후 pEF-BOS-Rx3-AS가 안정적으로 도입된 형질감염체를 선별하였다. 이와 같이 선별된 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현하여 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 저해된 세포주를 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2라 명명하였고 이들 각각을 한국생명공학연구원 유전자은행에 2001년 1월 9일자로 기탁하였다 (수탁번호: KCTC 0934BP 및 KCTC 0935BP). 대조군으로는 SNU16과 MKN28 세포주에 pcDNA3.1 플라스미드만을 형질감염시키고 G418로 선별하여 얻은 클론인 대조군-SNU16과 대조군-MKN28을 사용하였다.
<1-3> 노던 블럿 분석 (northern blot analysis)
상기 실시예 <1-2>로부터 확보된 MKN28-Rx3, SNU16-Rx3-AS-cl1 및 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에서 센스 RUNX3 유전자 및 안티센스 RUNX3 유전자가 실제로 과발현되는지 확인하기 위하여 노던 블럿 분석을 수행하였다.
구체적으로, 전체 세포성 (total cellular) RNA를 표준화된 방법에 따라 각각의 세포주로부터 분리하였으며 (Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd ed., 1988, Cold Spring Harbor Laboratory) 이로부터 얻어진 각각의 RNA 5 ㎍을 1.2% 포름알데히드/아가로오스 겔 (formaldehyde/agarose gel)에 전기영동한 후 하이본드-N+ 나일론 막 (Hybond-N+ nylon membrane,Amersham)에 이동시켰다. 탐침 DNA는 [α-32P]dCTP (3,000 Ci/mmol; NEN)로 표지된서열번호 1의 RUNX3 cDNA (Bae et al.,Gene, 159(2):245-248, 1995)를 이용하였다. 혼성화 반응은 하이본드-N+ 나일론 막을 106cpm/㎖의 RUNX3 탐침 DNA를 포함한 5 ×SSPE, 5 ×덴하르츠 용액 (Denhardts solution), 0.5% SDS 및 100 ㎎/㎖ 연어 정자 (salmon sperm) DNA 용액 내에서 65℃, 16시간 동안 수행하였다. 혼성화 반응이 끝난 막을 2 ×SSPE/0.1% SDS 용액으로 실온에서 15분간 2회, 0.1 ×SSPE/0.1% SDS 용액으로 65℃에서 15분간 2회 세척하였다. 유전자의 발현은 상기 막을 -70℃에서 16시간 동안 Kodak XAR-5 필름에 노출시킨 후 현상하여 관찰하였다.
그 결과, 센스 RUNX3 유전자를 과발현시킨 MKN28-Rx3 세포주에서는 18S RNA와 비슷한 위치에서 RUNX3 유전자의 전사체가 단일 밴드로 검출되어 RUNX3 유전자가 상기 세포주에서 실제로 발현되고 있음을 확인하였다. 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현시킨 SNU16-Rx3-AS-cl1 및 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에서는 안티센스 RUNX3 RNA가 다양한 크기로 발현됨이 관찰되었다. 대조군 SNU16 세포주에서의 내생적인 (endogenous) RUNX3 유전자의 발현은 노던 블럿 분석 방법으로는 검출되지 않았다 (도 3참조).
<실시에 2> TGF-β에 의해 유도되는 프로그램된 세포사멸 효과 분석 및 RUNX3 유전자의 역할
<2-1> TGF-β에 의해 유도되는 프로그램된 세포사멸 효과 분석
TGF-β에 의하여 유도되는 프로그램된 세포사멸 효과를 분석하기 위하여 정상적인 SNUX3 세포주와 본 발명의 안티센스 RUNX3 유전자가 과발현되어 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 저해되는 SNU16-Rx3-AS-cl1 및 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에 TGF-β1을 1 ng/㎖ 농도로 처리한 후 생존하는 세포의 수를 세어 그래프로 나타내었다.
그 결과,도 4a에 나타난 바와 같이 SNU16 세포주는 1 ng/㎖ 농도의 TGF-β1 처리에 의해 세포가 사멸됨이 관찰되었다. 구체적으로, 생존하는 SNU16 세포의 수는 TGF-β1의 처리 후 급격히 감소하여 2일 후에는 완전히 사멸됨을 알 수 있다. 그러나, 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현시켜 RUNX3 유전자의 발현을 선택적으로 차단시킨 SNU16-Rx3-AS-cl1 세포주에서는 이러한 TGF-β1에 의한 세포사멸 현상이 전혀 관찰되지 않았으며, SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에서도 동일한 현상이 관찰되었다. 따라서, TGF-β1에 의한 SNU16 세포주의 사멸에는 RUNX3 유전자가 관여함을 알 수 있다.
<2-2> TGF-β에 의해 유도되는 프로그램된 세포사멸에 있어서 RUNX3 유전자의 역할
또한, 본 발명자들은 상기 실시예 <2-1>에서 확인된 SNU16 세포주에서 TGF-β에 의해 유도되는 세포사멸이 프로그램된 세포사멸 (programed cell death of apoptosis) 기전에 의한 것인지 아니면 세포괴사 (necrosis)에 의한 것인지 규명하기 위하여 프로그램된 세포사멸 기전 특이적인 아폽토시스성 DNA 밴드를 분석하였다.
구체적으로, 대조군-SNU16, SNU16-Rx3-AS-cl1 그리고 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주를 1 ng/㎖의 TGF-β1으로 6시간 동안 처리한 후 각각의 세포로부터 게놈 DNA를 분리·정제하여 정량 하였다 (Sambrook et al., 1988. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.). 0.2 ㎍의 정제된 게놈 DNA를 1.5% 아가로오스 겔에 전기영동하고 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide)로 염색하여 프로그램된 세포사멸에서 나타나는 특이적인 아폽토시스성 밴드를 관찰하였다.
그 결과, SNU16 세포주에서는 TGF-β1 처리 후 분명한 세포사멸 기전 특이적인 아폽토시스성 DNA 밴드가 생성되었으나 (도 4b, 레인 1 및 2), 안티센스 RUNX3 유전자가 과발현되어 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 억제된 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주에서는 이러한 아폽토시스성 DNA 밴드가 관찰되지 않았다 (도 4b, 레인 3, 4, 5 및 6).
이러한 결과로부터 본 발명자들은 SNU16 세포는 TGF-β1 자극에 의하여 프로그램된 세포사멸 기전에 의하여 사멸되며 이 과정에 RUNX3가 관여함을 확인하였다.
<실시예 3> RUNX3의 암형성능 (Tumorigenicity) 억제 활성 조사
TGF-β1 자극에 의한 프로그램된 세포사멸 기전은 정상세포가 암세포로 변하는 것을 억제하는 대단히 중요한 기전으로서, 이러한 과정에 중요한 역할을 하는인자들은 대부분 항암효과를 가지고 있음이 잘 알려져 있다. 이에 본 발명자들은 RUNX3 유전자 역시 항암효과를 가질 것으로 기대하고 RUNX3 유전자의 항암효과를 분석하기 위하여 누드 마우스를 이용한 암형성능 (tumorigenecity) 분석을 수행하였다.
구체적으로, 본 발명의 안티센스 RUNX3 유전자를 과발현하여 RUNX 유전자의 발현이 선택적으로 차단된 SNU16-Rx3-AS-cl1 및 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주와 대조군-SNU16 세포주를 0.85% 인산염 완충 식염수 (phosphate buffered saline) 용액에 3 x 107cells/㎖ 농도로 현탁시키고 0.3 ㎖을 누드 마우스에 피하주사하였다. 또한, 센스 RUNX3 유전자를 과발현하는 MKN28-Rx3 세포주와 대조군-MKN28 세포주를 상기와 동일한 용액에 5 x 107cells/㎖ 농도로 현탁시키고 0.3 ㎖을 누드 마우스에 피하주사하였다. 각각의 세포주 클론에 대하여 9마리씩의 누드 마우스에 피하주사하였고 이를 하나의 실험군으로 정하였다.
MKN28-Rx3과 대조군-MKN28 세포주의 암형성능은 주사 후 37일간 관찰하였으며 SNU16-Rx3-AS-cl1, SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주 그리고 대조군-SNU16 세포주의 암형성능은 98일간 관찰하였다. 이 기간 중 암 조직의 크기를 정기적으로 외부에서 측정하였으며 최종일에는 마우스를 희생시키고 암 조직을 적출하여 크기를 비교하였다.
그 결과, RUNX3의 발현이 차단된 SNU16 세포주인 본 발명의 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2가 주사된 마우스에서 대조군 세포에 비하여 현저히 빠른속도로 암이 형성됨을 관찰하였다 (도 5a). 구체적으로, 최종일에 대조군의 암 조직 크기는 800 ㎜3인데 반하여 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2가 주사된 실험군의 암 조직 크기는 1,600 ㎜3에 달하여 암 조직의 형성능이 2배 정도 증가하였음을 알 수 있었다. 약 98일 경과 후 마우스로부터 암을 적출하고 그 크기를 직접 비교한 결과 역시 대조군에서 적출한 암 조직 보다 SNU16-Rx3-AS-cl1과 SNU16-Rx3-AS-cl2가 주사된 실험군에서 적출한 암 조직의 크기가 현저하게 비대해져 있음을 관찰하였다 (도 5c).
또한, 대조군-MKN28 세포주와 본 발명의 센스 RUNX3 유전자를 과발현시킨 MKN28-Rx3 세포주를 이용하여 SNU16의 경우와 동일한 방법으로 누드 마우스를 이용하여 암형성 억제 효과를 분석한 결과, 대조군-MKN28 세포주를 주사한 마우스에 비하여 센스 RUNX3 유전자를 과발현시킨 MKN28-Rx3 세포주를 주사한 마우스에서 암형성이 현저히 억제됨이 확인되었다 (도 5b). 구체적으로, 최종일에 대조군의 암 조직 크기는 600 ㎜3인데 반하여 MKN28-Rx3가 주사된 실험군의 암 조직 크기는 250 ㎜3에 달하여 암 조직의 형성능이 58% 정도 감소하였다. 약 30일 경과 후 마우스로부터 암을 적출하고 그 크기를 직접 비교한 결과 역시 대조군에서 적출한 암 조직 보다 MKN28-Rx3가 주사된 실험군에서 적출한 암 조직의 크기가 육안으로 식별가능할 정도로 감소하였음을 관찰하였다 (도 5c).
이러한 결과로부터 본 발명자들은 RUNX3 유전자가 암형성 억제 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
<실시예 4> 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 양상 분석
<4-1> RT-PCR 분석
다양한 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 양상을 분석하기 위하여, 15종의 위암 세포주와 17종의 폐암 세포주로부터 전체 RNA를 분리한 후 RT-PCR 방법을 이용하여 RUNX3 유전자의 mRNA 발현 여부를 조사하였다.
위암 세포주로는 SNU1, SNU5, SNU16, SNU719, NUGC3, MKN1, MKN7, MKN28, MKN45, MKN74, AGS, KatoIII, RF1, RF48 및 AZ521를 사용하였고, 폐암 세포주로는 NCI-H522, 86-2, A549, LK79, LK87, LCSC#1, LCSC#2, NCI-H23, NCI-H226, NCI-460, NCI-H322, Sq-19, NCI-H1915, NCI-H630, Hs888Lu, Lu65 및 LX-1을 사용하였으며, 상기 세포주들은 한국생명공학연구원 유전자은행으로부터 분양받아 사용하였다.
전체 RNAs는 표준화된 단일 단계 구아니디움 방법 (single step guanidium method, Sambrook et al., Molecular Cloning, a laboratory manual, 2nd ed., 1988, Cold Spring Harbor Laboratory)에 따라 각각의 암세포주로부터 분리·정제하였다. 이렇게 정제된 RNA를 주형으로, 올리고-dT (oligo-dT)를 시발체로 사용하고 Superscript kit (Gibco-BRL)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 기초로 하여 RT-PCR 방법으로 RUNX3 mRNA 발현 여부를 분석하였다. RUNX3 유전자의 증폭을 위하여 두쌍의 PCR 시발체 (Ps-N과 Ps-C)를 제조하였는데, Ps-N 시발체 쌍은서열번호 4로 기재되는 정방향 시발체 PS-NA와서열번호5로 기재되는 역방향 시발체 PS-NB로 구성되어 있으며, Ps-C 시발체 쌍은서열번호 6으로 기재되는 정방향 시발체 Ps-CA와서열번호 7로 기재되는 역방향 시발체 Ps-CB로 구성되어 있다. 각각의 상기 두쌍의 PCR 시발체들은서열번호 1의 RUNX3 유전자의 cDNA 염기서열을 기초로 디자인하여 합성하였다 (도 5a).
대조군 실험의 RT-PCR을 위하여 PEBP2β/CBFB cDNA 및 β-엑틴 cDNA 염기서열을 이용하여 PEBP2β/CBFB를 특이적으로 인식하는서열번호 8로 기재되는 정방향 시발체 h-β5와서열번호 9로 기재되는 역방향 시발체 h-β3의 시발체 쌍과 β-엑틴을 특이적으로 인식하는서열번호 10으로 기재되는 정방향 시발체 h-엑틴 5와서열번호 11로 기재되는 역방향 시발체 h-엑틴 3의 시발체 쌍을 제조하였다. 이들 시발체 쌍은 사람의 PEBP2βcDNA 또는 β-엑틴 cDNA의 염기서열을 기초로 디장인하여 합성하였다.
RT-PCR 반응은 유전자 증폭장치 (Perkin-Elmer Cetus, model 9600)를 이용하였으며, 전체 반응용액을 50 ㎕로 하여 초기에 95℃로 2분간 처리한 후 변성 (denaturation) 단계 95℃로 15초, 어닐링 (annealing) 단계 50℃로 1분, 효소반응 단계 72℃로 1분의 반응을 연속적으로 30회 반복하였다. 반응이 종결된 후 반응액 중에서 5 ㎕를 취하여 1.2% 아가로오스 겔 상에 전기영동한 후 에티디움 브로마이드로 염색하여 관찰하였다.
그 결과, 위암 세포주 중 SNU5, SNU16, SNU719, MKN1, MKN45, RF1, RF48, MKN7, AZ521 세포주에서 PS-N과 PS-C 시발체 쌍을 이용한 증폭에서 모두 예상되는 크기 (PS-N 시발체 쌍 = 1080 bp; PS-C 시발체 쌍 = 870 bp)의 RT-PCR 산물을 생성하였고 이 중 MKN7의 경우는 대단히 소량의 산물이 생성되었다 (도 6b). 반면 SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS, KatoIII 세포주에서는 PS-N과 PS-C 시발체 쌍을 이용한 증폭에서 모두 RT-PCR 산물을 전혀 생성하지 않았다.
또한, 17종의 폐암 세포주에서도 동일한 방법으로 RUNX3 유전자의 발현을 RT-PCR 방법으로 분석한 결과, Hs888Lu 세포주에서는 RUNX3 유전자의 발현이 현저히 억제되어 있었으며 NCI-H226, NCI-460, NCI-H630, Lu65 4종에서는 RUNX3 유전자의 발현이 완전히 억제되어 있었다 (도 6c).
<4-2> DNA 서던 블럿 분석
상기 실시예 <4-1>에서 RT-PCR 증폭에 의해 생성된 PCR 산물이 RUNX3 유전자의 cDNA로부터 증폭된 산물임을 입증하기 위하여 서던 블럿 분석을 수행하였다. RT-PCR 산물을 1.5% 아가로오스 겔에 전기영동한 후 하이본드-N+ 나일론 막에 이동시켰다. DNA 탐침으로 RUNX3 cDNA의 BamHI 단편 2,244 bp를 이용하여 상기 실시예 <1-3>에 기술한 노던 블럿 분석 방법과 동일한 방법으로 혼성화하고 XAR-5 필름에 노출하여 관찰하였다.
그 결과, RT-PCR로부터 생성된 산물이 RUNX3 cDNA로부터 증폭된 산물임을 확인하였다 (도 6b, PS-3 ST). 동일한 제일 가닥 (first strand) cDNA로부터 PEBP2β(도 6b, PEBP2β)와 β-엑틴 cDNA (도 6b, β-actin)를 증폭해 낼 수 있음을 관찰함으로써 상기 실시예 <4-1>에서 위암 세포주인 SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS, KatoⅢ에서 RUNX3 cDNA가 증폭되지 않은 것은 상기 세포주에서 RUNX3유전자가 발현되지 않았기 때문임을 확인하였다. 마찬가지로 MKN7 세포주에서 대단히 소량의 RT-PCR 산물이 생성된 것도 RUNX3 유전자의 발현 수준이 매우 낮기 때문임을 알 수 있었다.
이상과 같은 결과로부터 본 발명자들은 위암 세포주의 약 47% 그리고 폐암 세포주의 약 30%에서 RUNX3 유전자의 발현이 현저히 또는 완전히 억제되어 있음을 알 수 있었다. RUNX3 유전자가 발현되지 못하면 TGF-β에 의한 프로그램된 세포사멸이 일어나지 못하며 암세포의 암형성능도 증대되는 것으로 볼 때 RUNX3 유전자의 발현억제는 약 47%의 위암과 약 30%의 폐암 (위암과 폐암 전체적으로는 약 37%)에 있어서 중요한 진단지표가 될 수 있음을 확인하였다.
<실시예 5> 암 세포주에서 RUNX3 유전자 엑손 1 부근의 메틸화 상태 분석
<5-1> 게놈 DNA 서던 블럿 분석을 이용한 메틸화 상태 조사
이에 본 발명자들은 RUNX3 유전자의 발현 억제가 DNA 메틸화에 기인한 것인지 밝히기 위하여 RUNX3 유전자의 발현상태와 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화 (hypermethylation) 사이에의 상관관계를 DNA 메틸화에 대하여 민감한 제한효소를 사용한 게놈 DNA 서던 블럿 분석을 수행하여 조사하였다.
우선, 암 세포주로부터 게놈 DNA를 표준화된 SDS/프로테나아제 K (proteinase K) 방법 (Sambrook et al., 1988)에 의하여 분리·정제하였다. 정제된 게놈 DNA를 DNA가 메틸화되어 있으면 절단하지 못하는 제한효소 (SmaI) 또는DNA 메틸화와는 관계없이 절단할 수 있는 제한효소 (BamHI)로 처리하고 1.5% 아가로오스 겔에 전기영동한 후 하이본드-N+ 나일론 막에 이동시켰다. DNA 탐침으로 RUNX3 유전자의 CpG 섬을 포함하는 게놈 DNA Nhe1/MluI 단편 (도 7a)을 이용하여 상기 실시예 <1-3>에 기술한 노던 블럿 분석 방법과 동일한 방법으로 혼성화하고 XAR-5 필름에 노출하여 관찰하였다. 게놈 DNA는 인간 게놈 DNA 라이브러리를서열번호 1의 RUNX3 cDNA를 탐침으로 검색하여 분리하였다.
그 결과, RUNX3 유전자의 발현이 관찰되지 않은 위암 세포주 SNU1, NUGC3, MKN28, MKN74, AGS, KatoⅢ에서만 특이적으로 SmaI 절단이 크게 저해된 결과를 관찰할 수 있었다 (도 7b). 상기 실시예 4에서 발현 수준이 특히 낮았던 MKN7 세포주는 부분적으로 메틸화된 양상을 나타내었다 (도 7b). 이러한 결과는 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 억제와 RUNX3 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화 사이에 깊은 상관관계가 있음을 의미하는 것이다. 또한 메틸화의 차이는 있으나 모든 세포주에서 RUNX3 유전자 특이적인 밴드들이 나타남으로 미루어 본 발명자들은 몇 종의 암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현이 관찰되지 않은 것은 RUNX3 유전자가 세포 내에 존재하지만 다만 비정상적인 메틸화에 의하여 발현되지 않을 뿐임을 확인하였다.
<5-2> RUNX3 유전자의 재활성화
상기 실시예 <6-1>에서 관찰된 DNA 메틸화가 RUNX3 유전자의 발현을 억제하는 직접적인 원인인지 분석하기 위하여, DNA 메틸라아제 저해제 또는 히스톤 디아세틸라아제 저해제를 처리하였을 때 RUNX3 유전자의 발현이 재활성화되는지 조사하였다.
구체적으로, RT-PCR 분석 방법에 의하여 RUNX3 유전자의 발현이 검출되지 않은 세포주 중에서 세 종류의 세포주 NUGC3, MKN28, MKN74를 임의로 선택하여 DNA 메틸라아제 저해제인 5-아자-2-데옥시시티딘 (5-aza-2-deoxycytidine, AZA, 300 nM) 또는 히스톤 디아세틸라아제 저해제인 트리코스타틴 (trichostatin A, TSA, 1 mM)을 단독으로 처리하거나 두가지 저해제를 동시에 처리하였다. 3일간 처리 후 각각의 세포주로부터 전체 RNA를 상기 실시예 <4-1>과 동일하게 표준화된 단일 단계 구아니디움 방법에 따라 분리·정제하였으며서열번호 4및5의 PS-N 시발체 쌍을 이용한 RT-PCR 방법으로 RUNX3 유전자의 발현 여부를 분석하였다.
그 결과, DNA 메틸라아제 저해제 또는 히스톤 디아세틸라아제 저해제를 처리하였을 때 RUNX3 유전자의 발현이 다시 유도됨을 확인하였다 (도 8). 이러한 결과로부터 약 37%의 위암, 폐암 세포주에서 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화에 의하여 RUNX3 유전자의 발현이 억제되어 있음이 증명되었다.
상기와 같은 결과들을 통하여 본 발명자들은 RUNX3 유전자 산물이 TGF-β의존성 아폽토시스 기전에 관여함으로써 항암 활성을 가지며 약 37%의 위암과 폐암 세포주에 있어서 정상적인 RUNX3 유전자의 발현이 상기 유전자의 엑손 1 부근에 존재하는 CpG 섬의 고메틸화에 의하여 억제되어 있음을 확인하였다.
한편, 상기 실시예 <1-1>의 센스 RUNX3 유전자를 발현하는 발현 플라스미드의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<실시예 6> 랫트에 대한 비경구투여 급성 독성실험
6주령의 특정병원부재 (SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 상기 실시예 <1-1>의 pEF-BOS-Rx3를 1 ㎖의 생리식염수에 현탁하여 1 ㎎/㎏의 용량으로 상기 랫트 2 마리의 전경골근 (anterior tibialis)에 근육 내 주사 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 pEF-BOS-Rx3 벡터는 랫트에서 1 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 비경구 투여 최소치사량 (LD50)은 1 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 RUNX3 유전자는 우수한 항암 활성을 나타내며 TGF-β의존성 프로그램된 세포사멸 (programed cell death, apoptosis) 기전에 필수적으로 관여한다. 또한, 다양한 위암 및 폐암 세포주에서 RUNX3 유전자의 발현 억제는 RUNX3 유전자의 엑손 (exon) 1 부근에 존재하는 전형적인 CpG 섬 (CpG island)에의 비정상적인 DNA 메틸화 (DNA methylation)에 기인하는 것이다. 따라서, 본 발명의 RUNX3 유전자 및 그의 유전자 산물 (RNA 및 단백질)은 암의 유전자 치료법 개발에 이용될 수 있으며, RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 비정상적인 DNA 메틸화 정도의 측정은 암 진단에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 비정상적인 DNA 메틸화를 조절하는 약물은 RUNX3 유전자의 발현을 촉진시킴으로써 암 치료제로 이용될 수 있다.

Claims (18)

  1. 서열번호 1로 기재되는 cDNA 염기서열로 구성된 항암활성을 나타내는 사람 RUNX3 유전자.
  2. 서열번호 2로 기재되는 아미노산 서열로 구성된 제 1항의 RUNX3 유전자의 전사개시 코돈과 전사종결 코돈 사이의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)으로부터 암호화되는 RUNX3 단백질.
  3. 제 1항의 RUNX3 유전자가 정방향으로 삽입되어 센스 (sense) RUNX3 유전자를 발현하는 발현 플라스미드.
  4. 제 1항의 RUNX3 유전자가 역방향으로 삽입되어 안티센스 (antisense) RUNX3 유전자를 발현하는 발현 플라스미드.
  5. 제 3항의 발현 플라스미드가 형질감염되어 RUNX3 유전자를 과발현하는 세포주.
  6. 제 5항에 있어서, 제 3항의 발현 플라스미드가 MKN28 세포주에 형질감염되어 RUNX3 유전자를 과발현하는 MKN28-Rx3 세포주 (수탁번호: KCTC 0933BP).
  7. 제 4항의 발현 플라스미드가 형질감염되어 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 차단된 세포주.
  8. 제 7항에 있어서, 제 4항의 발현 플라스미드가 SNU16 세포주에 형질감염되어 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 차단된 SNU16-Rx3-AS-cl1 세포주 (수탁번호: KCTC 0934BP).
  9. 제 7항에 있어서, 제 4항의 발현 플라스미드가 SNU16 세포주에 형질감염되어 RUNX3 유전자의 발현이 선택적으로 차단된 SNU16-Rx3-AS-cl2 세포주 (수탁번호: KCTC 0935BP).
  10. 제 3항의 발현 플라스미드를 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  11. 제 1항의 RUNX3 유전자를 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  12. 서열번호 1로 기재되는 염기서열로 구성된 RUNX3 cDNA를 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  13. 제 1항의 RUNX3 유전자로부터 전사되는 RUNX3 RNA를 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  14. 제 2항의 RUNX3 단백질을 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  15. 서열번호 3으로 기재되는 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 조절하는 활성물질을 유효성분으로 하는 항암용 약학적 조성물.
  16. 1) 피험자의 암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리·정제하는 단계;
    2) 단계 1의 게놈 DNA를 DNA가 메틸화에 민감한 제한효소로 절단하는 단계;
    3) 단계 2의 게놈 DNA를 아가로오스 겔에 전기영동한 후 막에 이동시키는 단계;
    4) 단계 3의 막을 제 1항의 RUNX3 유전자 DNA 탐침으로 혼성화 반응을 수행하는 단계; 및
    5) 단계 4의 막을 필름에 노출시켜 RUNX3 유전자의 발현을 검출하는 단계로 구성되는,서열번호 3으로 기재되는 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출함으로써 암을 진단하는 검사방법.
  17. 1) 피험자의 혈액 또는 암 조직으로부터 게놈 DNA를 분리·정제하는 단계;
    2) 단계 1의 게놈 DNA를 DNA가 메틸화에 민감한 제한효소로 절단하는 단계;
    3) 단계 2의 게놈 DNA를 주형 (template)으로 이용하고서열번호 3의 염기서열의 일부를 시발체 (primer)로 이용하여 중합효소 연쇄반응 (Polymerase Chain Reaction, PCR)을 수행하는 단계; 및
    4) 아가로오스 겔에 전기영동하여 반응 산물을 검출하는 단계로 구성되는,서열번호 3으로 기재되는 RUNX3 유전자의 엑손 1 부근의 CpG 섬을 포함하는 염기서열의 메틸화를 검출함으로써 암을 진단하는 검사방법.
  18. 서열번호 1로 기재되는 RUNX3 cDNA의 염기서열 일부 또는 이로부터 생산된 RUNX3 단백질에 대한 항체를 이용하여 암을 진단하기 위한 생물학적 마이크로칩 (biological microchip).
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