JP2002518292A - Ｒｔｋ−過剰機能−誘導障害、特に癌の治療のための阻害剤の使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は増加した受容体チロシンキナーゼ活性の結果である病気、特に癌の治療および／または予防のための阻害剤の使用に関する。該使用は、特に、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の過剰発現および／または改変された活性の阻害あるいは低下に係わる。このような受容体チロシンキナーゼの活性の変化は、特にＦＧＦＲ−４の突然変異によってトリガーされ、ここに、前記突然変異は特にＦＧＦＲ−４の膜貫通ドメイン中の点突然変異であり、疎水性アミノ酸の親水性アミノ酸への交換に導く。本発明は、さらに、癌の治療および／または予防のためのＦＧＦＲ−４に対する阻害剤の使用に関する。さらに、本発明は、細胞において過剰発現および／または改変された活性を引き起こす突然変異ＦＧＦＲ−４に関する。最後に、本発明は突然変異ＦＧＦＲ−４分子のＤＮＡおよびＲＮＡ配列、前記の阻害剤を含有する医薬組成物および、さらに、診断およびスクリーニング手法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は増大した受容体チロシンキナーゼ活性の結果である病気、特に癌の
治療および／または予防のための阻害剤の使用に関する。該使用は、特に、受容
体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の過剰発現および／または改変された活性の阻害
あるいは低下に指向される。特に、受容体チロシンキナーゼのこの改変された活
性はＦＧＦＲ−４の突然変異によってトリガーすることができ、ここに、この突
然変異は特にＦＧＦＲ−４の膜貫通ドメイン中の点突然変異であり、疎水性アミ
ノ酸を親水性アミノ酸への交換に導く。本発明は、さらに、癌の治療および／ま
たは予防のためのＦＧＦＲキナーゼの阻害剤の使用に関する。さらに、本発明は
突然変異ＦＧＦＲ−４に関し、これは細胞において過剰発現および／または改変
された活性に導く。最後に、本発明は突然変異ＦＧＦＲ−４分子のＤＮＡおよび
ＲＮＡ配列に関する。最後に、加えて、本発明は前記の阻害剤を含有する医薬組
成物および、さらに、診断およびスクリーニング手法に関する。

【０００２】

【従来の技術】

細胞の増殖は生物の特別の要求に依存した注意深く調節されるプロセスであ
る。若い生物において、細胞分裂速度は細胞の死滅速度を超え、これは生物のサ
イズの増加に導く。成体生物においては、細胞の新しい形成および細胞の死滅は
「定常状態」が生起するようにバランスしている。しかしながら、稀な場合には
、細胞増殖の制御が破壊され、細胞は増殖し分裂を始めるが、このタイプの非常
に多数の細胞に対して特別の要求は生物では存在しない。この制御されない細胞
増殖は癌の原因である。時々転移形成と関連する制御されない細胞増殖を誘導す
ることができる因子はしばしば化学的性質であるが、例えば放射線照射のごとき
物理的性質のものでもあり得る。癌をトリガーするもう１つの原因はある種の生
物における遺伝的特別性あるいは突然変異であり、これは多かれ少なかれ細胞変
性に導く。

【０００３】 今日まで、例えば乳房において正常増殖および分化を制御するプロセスを解明
するのは満足すべき程度には依然として可能ではなかった。ホルモン制御に加え
て、哺乳動物細胞の発生に介入する異なる局所的に生じた成長因子の複雑なネッ
トワークもある。哺乳動物細胞における癌の細胞の発生の正確な原因、他の細胞
にもあてはまるように、それらが発散するほどに不明確かつ知られていない。オ
ンコジイン（癌遺伝子）および腫瘍サプレッサー遺伝子における改変は乳癌の癌
発生において重要な役割を演じるようである。加えて、遺伝的に改変された細胞
で生起する調節因子による補強された刺激は細胞増殖の増大した進行に導き得る
。

【０００４】 現在、実質的に２つの代替法が癌の治療で利用できる。外科的介入によって完
全に病気生物から癌細胞が首尾よく除去されるか、あるいは例えば、医薬の投与
によって（化学療法）あるいは照射のごとき物理的治療手法によって生物中の変
性細胞を無害なものとするような試みが成されるかのいずれかである。

【０００５】 化学療法においては、ある形態においてはＤＮＡに介入し、迅速に増殖する細
胞に損傷を与え、ゆっくりと分裂するか全く分裂しない細胞よりも強くより高い
ＤＮＡ代謝能力を生じさせる必要がある医薬がしばしば使用される。しかしなが
ら、多くの化学療法剤の著しく不利な点は、健康な細胞も化学療法の間に損傷さ
れる結果として、使用される活性物質の低い特異性である。活性物質のこの低い
特異性は、さらに、その用量が各場合において癌細胞を同時に殺しつつ、損傷さ
れる健康な細胞ができるだけ少なくなるようなものでなければならないことを必
要とする。これはしばしば可能ではなく、さらに癌が拡大し、最終段階では非常
に重要な機能の不全を引き起こすので癌患者は死亡する。

【０００６】 ある種の成長因子受容体の過剰発現および／または改変された活性は乳癌を含
めた多くの新生物の激化した増殖に寄与すると推定されている。例えば、乳癌に
おけるＥＧＦＲ、すなわち上皮因子受容体、あるいはＥＲＢ Ｂ−２受容体の過
剰発現は貧弱な予後に関連付けられてきた。ＦＧＦ（歴史的には：繊維芽細胞成
長因子）蛋白質も乳腺中の癌のあるいは他の癌の発生に関与し得た。しかしなが
ら、この点についての結果は矛盾しているか、あるいは結論が出ていない。

【０００７】 ＦＧＦは、そのうち９つのメンバーがこれまでに知られているペプチド調節因
子の大きなファミリーを構成する。これらのうち８つはヒトにおいてよく特徴付
けられている（ＢａｓｉｌｉｃｏおよびＭｏｓｃａｔｅｌｌｉ， １９９２；
Ｃｏｕｌｉｅｒ， １９９３）。ＦＧＦは高親和性チロシンキナーゼ受容体を介
して働き、これは少なくとも４つの異なる遺伝子によってコードされる。さらに
、ＦＧＦは腫瘍形成に対して効果を有するのみならず、心臓血管病、組織損傷後
の復元、神経生物学および胚発育でも主要な役割を演じ得るマルチ機能の調節ペ
プチドである。酸性および塩基性ＦＧＦ（ａＦＧＦおよびｂＦＧＦ）が最初のも
のであり、該ファミリーの最良に特徴づけられているメンバーである。インビボ
では、例えば、胚発生における中胚葉誘導（Ｓｌａｃｋら、 １９８７；Ｋｉｍ
ｅｌｍａｎら、 １９８８）および血管形成（Ｔｈｏｍａｓら、１９８５；Ｔｈ
ｏｍｐｓｏｎら、 １９８９； ＦｏｌｋｍａｎｎおよびＫｌａｇｓｂｒｕｎ、
１９８７）に関与することが示されている。

【０００８】 対応する受容体（ＦＧＦＲ）では、それらをコードする４つの同様の遺伝子が
同定されている。これらの遺伝子は、３つの免疫グロブリンループおよび酸性部
分、疎水性膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインよりなり、チロシンキナーゼ活
性を取り込む細胞外ドメインを持つ構造的に関連した蛋白質をコードする。これ
らの遺伝子のうち２つ、ＦＧＦＲ−１およびＦＧＦＲ−２では、それらはオルタ
ーナティブスプライシングによって生起する複数の転写体を有することを示すこ
とができた（ＧｉｖｏｌおよびＹａｙｏｎ， １９９２およびＪｏｈｎｓｏｎお
よびＷｉｌｌｉａｍｓ， １９９３）。これらの遺伝子から生起するスプライシ
ング変異体は、代替エクソンから生起し得る、受容体の細胞外領域および第３の
免疫グロブリンドメインの第２の半分についての配列中の免疫グロブリン様ドメ
インの数に関して異なる。加えて、膜貫通および膜近接の欠点あるいは欠失が起
こりかねず、これは分泌されたあるいはキナーゼ不活性蛋白質産物を生じ得る。

【０００９】 ＦＧＦＲ−３では、代替転写体および対応するイソ型を見いだすことができた
が、ＦＧＦＲ−４では、ただ１つの知られた蛋白質産物があるにすぎない。非常
に多数のＦＧＦＲ遺伝子および転写体および規定されたＦＧＦに対する特異性の
多くの蛋白質産物に対する欠如のため、特異的受容体に対する特異的リガンドの
作用を測定するのは困難である。従って、特異的ＦＧＦ受容体および規定された
病気の間の相関は、規定された受容体の作用の特別のメカニズムと病気との相関
は別として、大きな困難性を伴って確立できたに過ぎない。従って、ＦＧＦＲを
利用して、複雑な病像の癌を治療するのはかなり困難である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】

従って、本発明の目的は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＰＫ）がその発生に関
与する体細胞障害、特に癌の可能な治療および／または予防を特定することにあ
る。特に、本発明の目的は、受容体チロシンキナーゼの過剰発現および／または
改変された、例えば構成的活性を阻害しおよび／または低下させることにある。

【００１１】 本発明のさらなる目的は、突然変異ＦＧＦＲ−４の受容体チロシンキナーゼの
改変された活性を阻害しおよび／または低下させることにある。

【００１２】 本発明のさらなる目的は、癌発生および／または転移形成に関与するさらなる
ＲＴＫを特定することにある。さらに、本発明の目的は、ＲＴＫのＤＮＡ配列あ
るいは対応するＲＮＡ配列を特定することにある。

【００１３】 本発明のさらなる目的は、改良された診断あるいは種々の診断およびスクリー
ニング手法を特定することにある。

【００１４】 最後に、本発明の目的は、特に癌がそれで治療することができる医薬組成物を
特定することにある。

【００１５】 これらの目的は独立の請求項の目的によって達成される。従属の請求項は本発
明の好ましい開発を特定する。

【００１６】

【発明の実施の形態】

本発明をよく理解するために、本明細書中で用いる用語を詳細に説明する。

【００１７】 「阻害剤」とはＲＴＫを阻害し、あるいはその活性を低下させるいずれもの物
質と理解される。これはＲＴＫ、キナーゼ−不活性受容体あるいは抗受容体抗体
に対して向けられた低分子量物質であり得る。

【００１８】 「キナーゼ−不活性受容体」とは、もはやいずれのチロシンキナーゼ活性も有
しないいずれもの受容体と理解される。

【００１９】 「受容体チロシンキナーゼ」［Ｓｉｃ］とは、チロシンキナーゼ活性を有する
いずれもの受容体と理解される。該発現はチロシンキナーゼ活性を有する成長因
子受容体、およびＨＥＲ２あるいはｍｅｔ−受容体を含む。

【００２０】 「ＲＴＫ−過剰機能」とは過剰発現（後記参照）および／または改変された活
性（後記参照）と理解される。

【００２１】 「欠陥シグナル伝達活性」とは、突然変異受容体がこの欠陥シグナル発生がも
はやリガンド例えば成長因子の存在に依存しないという意味で、突然変異受容体
がもはや細胞外増殖シグナルあるいはもう１つのシグナルを細胞内シグナルに変
換できないことを意味する。

【００２２】 「成長因子」とは、正常および／または形質転換哺乳動物細胞によってとりわ
け分泌され、細胞の増殖およびその活性の維持の刺激において、細胞増殖の調節
において重要な役割を演じるいずれの細胞分裂促進性化学物質、通常はポリペプ
チドも意味する。用語「成長因子」とは例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小
板由来成長因子（ＰＤＧＦ）および神経成長因子（ＮＧＦ）およびＦＧＦ、すな
わち繊維芽細胞成長因子を含む。

【００２３】 「突然変異受容体チロシンキナーゼ」とは、該受容体が野生型受容体からの異
なる、もはや調節できないチロシンキナーゼ活性を有するように、野生型受容体
と比較して、構造改変を含有する受容体チロシンキナーゼと理解される。突然変
異の１つのクラスはＲＴＫの改変された活性に導く。

【００２４】 「野生型成長因子受容体」あるいは「野生型」受容体とは、天然に生じる成長
因子受容体あるいは非突然変異アミノ酸配列を保有する受容体と理解される。「
野生型」は集団で最も通常に起こる受容体に対応する。

【００２５】 成長因子受容体あるいは受容体の「細胞外ドメイン」とは、通常細胞から細胞
外環境に突き出た受容体の部分と理解される。細胞外ドメインは、例えば、それ
にもう１つの分子の成長因子が結合する受容体の一部を含む。

【００２６】 成長因子受容体あるいは受容体の「膜貫通領域」とは、通常、受容体を発現す
る細胞の細胞膜に位置する受容体の疎水性部分と理解される。

【００２７】 成長因子受容体あるいは受容体の「チロシンキナーゼドメイン」あるいは「細
胞質ドメイン」とは、通常、細胞の内部に位置し、チロシン残基のトランスリン
酸化をもたらす受容体の部分であると理解される。

【００２８】 「有効量」とは、所望の治療効果を達成できる本発明による組成物の量と理解
される。

【００２９】 「繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）」とは、細胞、とりわけ繊維芽細胞の増殖お
よび他の特性に影響する細胞分裂促進性ポリペプチドと理解される。

【００３０】 「過剰発現」とは、野生型と比較した細胞によるＲＴＫ蛋白質の増大した生産
と理解される。これは、たとえばＲＴＫ遺伝子の遺伝子の増幅によって、トリガ
ーされ、拡張した、コントロールされていない細胞分列活性を引き起こしうる。

【００３１】 「改変された活性」とは、成長因子受容体によって媒介される単一移動経路の
永久的活性と理解される。かくして、改変されたＲＴＫをもって、キナーゼ活性
がリガンド存在しない場合には存在する。

【００３２】 本発明に従えば、突然変異ＦＧＦＲ−４は細胞において対応する受容体チロシ
ンキナーゼの過剰発現および／または改変された活性に至ることができ、よって
、癌に至り得る。

【００３３】 成長因子受容体はヒト癌細胞の発達および増殖において決定的な役割を演じる
。健康な細胞において、成長因子受容体は、とりわけ、細胞増殖の制御のみなら
ず分化、細胞移動に関与する。細胞分裂についての現実のシグナルは、生物の要
求に応じて形成される成長因子である。受容体はシグナル伝達の機能を取り、す
なわち、それは細胞外増殖シグナルの細胞の内側における分裂活性への変換に関
与する。多くの成長因子受容体でもって、成長因子が細胞外ドメインに結合した
後、蛋白質におけるチロシン残基へのリン酸を移動させるその能力は決定的な役
割を演じる。また、これらの受容体は受容体チロシンキナーゼとして記載される
。受容体チロシンキナーゼの総説はＹａｒｄｅｎ Ｙ およびＵｌｌｉｃｈ
Ａ， ＲＥＶ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １９８８， ５７， ４４３−
７８に見いだされる。成長因子の結合後におけるこれらの成長因子受容体の二量
体化はシグナル伝達のプロセスにおけるさらなる重要な事象である。細胞外シグ
ナルの、チロシンキナーゼ活性を持つ成長因子受容体によって媒介される細胞内
シグナルへの変換は以下の５つの工程に分けることができる： １．受容体の細胞外ドメインでの（リガンドとも記載される）成長因子の結合
は立体配座の変化を誘導し、これは、 ２．改変された立体配座の持つ受容体の二量体化を引き起こし、同時に ３．キナーゼ活性の同時の誘導、 ４．一旦再度活性化された受容体立体配座を生じ、それを安定化させると、受
容体ダイマー中のチロシン残基のトランスリン酸化、および ５．ポリペプチド基質のリン酸化および細胞因子との相互作用を引き起こす。

【００３４】 例えば、受容体の過剰発現あるいは改変された活性によるこのシグナル伝達鎖
の制御されない過剰機能は、とりわけ、関連細胞の増大した分裂活性および極端
な場合には変性癌細胞に至り得る。成長因子受容体および細胞外から細胞内媒体
へのシグナル伝達におけるその機能、ならびに癌発生に対する異常に発現された
受容体の可能な影響に関する総説は、Ｕｌｌｉｃｈ Ａ，およびＳｃｈｌｅｓ
ｓｉｎｇｅｒ Ｊ（１９９０）Ｃｅｌｌ ６１ ２０３−２１２に提供さ
れている。

【００３５】 今回、驚くべきことに、前記で説明した５段階シグナル伝達鎖において突然変
異ＦＧＦＲ−４の結果、突然変異ＲＴＫの改変された活性がその発生に決定的に
関与するシグナル伝達活性が増大することが見出された。

【００３６】 よって、本発明の請求項１によると、受容体チロシンキナーゼの少なくとも１
つの阻害剤がＲＴＫ−過剰機能−誘導障害、特に癌の治療および／または予防で
用いられる。さらに、本発明によると、増大したシグナル伝達に帰すことができ
る組織の過剰増殖および／または組織の増大した侵入性の結果である病気あるい
は体細胞障害を排除し、あるいは軽減することができる。

【００３７】 阻害剤ならびに低分子量物質として、例えば、少なくとも１つのキナーゼ不活
性受容体を使用することができる。阻害剤の、例えばキナーゼ−不活性受容体の
使用を介して、受容体チロシンキナーゼの改変された活性を阻害しおよび／また
は低下させることができる。すでに記載したごとく、成長因子受容体の過剰発現
および／または改変された活性は癌をトリガーし、あるいは進行させるのに重要
な因子である。乳癌におけるＥＧＦＲあるいはＥｒｂ Ｂ−２受容体の過剰発
現は、例えば、貧弱な予後と関連付けられてきた（前記参照）。よって、この過
剰発現および／または改変された活性の阻害は癌の治療および／または予防にお
いて重要な要素である。ＦＧＦＲ−４は胚形成の間に組織特異的にスイッチを切
られる。しかしながら、それは乳癌患者の３０％に存在し、またそれは健康な被
験者の組織では検出できない。受容体チロシンキナーゼの阻害剤の使用は、過剰
発現および／または改変された活性の低下あるいは完全な阻害に至る。同様に、
キナーゼ−不活性受容体の使用は、受容体チロシンキナーゼの活性の低下および
／または完全な阻害に至る。というのは、ヘテロダイマーのキナーゼ機能はもは
やシグナル伝達できないからである。キナーゼ−不活性受容体の作用は、非機能
的ヘテロダイマーが形成される（希釈効果）という事実に基づく。シグナルが細
胞の生物学的応答に変換されるのが妨げられる結果として、シグナル伝達の欠如
は過剰発現および／または改変された活性シグナルの伝達の妨げに至る。その結
果、受容体チロシンキナーゼのこの阻害を介して、あるいはこれらのキナーゼ−
不活性受容体を介して、効果的かつ積極的に癌の治療および／または予防に介入
することは可能である。

【００３８】 驚くべきことに、ＦＧＦＲ−４突然変異は健康な個人の原基管でも起こること
が判明した。原基管突然変異は遺伝的素因に至り、これは個人を種々の病気の活
性にかかりやすくすると推定される。癌形成との関係で、腫瘍組織における突然
変異受容体の増大発現は癌形成に関与すると推定される。原基管突然変異は、さ
らに、とりわけ、以下の病気、すなわち動脈硬化症、白血病、リンパ腫、肝細胞
癌腫および胆管癌についての素因と見なされる。

【００３９】 その結果、本発明は利用できるさらなる遺伝子マーカーを作成し、これは種々
の病気およびこれらに対する罹患性の診断および初期認識において非常に助けと
なることが判明する。

【００４０】 従って、本発明は本件物質であるＦＧＦＲ−４をコードする核酸の検出方法に
関し、それにより、特に受容体コーディング核酸の突然変異が検出される。これ
は例えばオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションによって行う
ことができ、これは具体的には突然変異、特に点突然変異の存在あるいは不存在
を示すことができる。これにおいて、例えば、突然変異核酸およびオリゴヌクレ
オチドの間の「ミスマッチ」を、もし「ミスマッチ」が存在すると、ハイブリダ
イゼーションが起こらず、従ってシグナルがないように利用される。別法として
、特異的ＦＧＦＲ−４ ＰＣＲプライマーでの核酸の増幅および適当な制限エ
ンドヌクレアーゼでの引き続いての切断によって突然変異を検出することができ
る。もし、例えば、突然変異認識配列がもはや制限エンドヌクレアーゼによって
切断部位として認識されないように制限エンドヌクレアーゼの認識配列に影響す
るならば、これは、非突然変異野生型におけるよりも異なる制限断片に至る。Ｐ
ＣＲによって、制限断片は特異的に検出することができ、従って、述べた場合に
おいて、例えば、より大きな制限断片が野生型で比較して突然変異体に存在する
。しかしながら、別法として、適当な酵素での切断後に「野生型断片」が突然変
異体中でより小さくなる結果として、突然変異は新しい制限切断部位の創製に至
り得る。野生型におけるＧｌｙの代わりに突然変異体中のＡｒｇへの交換に至る
、ＥＭＢＬ Ｇｅｎｅ Ｂａｎｋ／ＤＤＢＪにＸ５７２０５下で寄託された、配
列の位置３８８におけるＦＧＦＲ−４の膜貫通ドメイン中の突然変異は、制限エ
ンドヌクレアーゼＢｓｔＮ１の認識配列ＧＧＷＣＣに関する。その結果、８０お
よび２９ｂｐの２つの新しい制限断片が形成され、これはとりわけ制限分析によ
って検出できる。

【００４１】 本発明によると、さらに、ＲＴＫの過剰発現および特に改変された活性は増大
された侵入性、すなわち、強化された転移形成に至ることが示され得る。転移形
成は癌の腫瘍な問題の１つであるので、これは、過剰発現および／または改変さ
れた活性の阻害あるいは低下が、癌と闘うにおいて効果的な薬剤をもたらし、そ
れにより特に転移形成が阻害される。

【００４２】 可能な阻害剤は、例えば、Ｍｏｈａｍｍａｄｉら（１９９７）に記載されてい
る。

【００４３】 好ましくは、本発明によると、受容体チロシンキナーゼの過剰発現および／ま
たは改変された活性に介入され、これはＦＧＦＲ−４の突然変異によってトリガ
ーされる。この突然変異は１個あるいは数個の点突然変異であり得る。特に、突
然変異／複数の突然変異が、特に疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸へと交換され
る結果として、ＦＧＦＲ−４の膜貫通ドメインで起こる。

【００４４】 ＦＧＦＲ−３における疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸に代える交換に至る、
突然変異はある種の病気と関連することが知られている。かくして、例えば、膜
貫通ドメイン中の点突然変異による繊維芽細胞成長因子受容体３の改変された活
性が軟骨形成不全で見いだされている。小人症の最も普通に起こる遺伝形態であ
る軟骨形成はある種の骨の成熟過程における血管に実質的に基づく常染色体優性
障害である。ＦＧＦＲ−３の膜貫通ドメインにおけるＧｌｙからＡｒｇへの置換
によって軟骨形成不全がトリガーされることを示すことができた。さらに、ＦＧ
ＦＲ−３におけるＡｒｇ突然変異はダイマー受容体のキナーゼ機能を活性化する
ことを示すことができた。また、Ａｒｇ点突然変異はＦＧＦＲ−３それ自体のチ
ロシンキナーゼ活性のリガンド−非依存性および受容体上のホスホチロシンのか
なり増大した改変レベルに至る。これらの結果は、軟骨形成異常の分子的基礎が
ＦＧＦＲ−３による調節されからグナル移動であることを示唆する。

【００４５】 ＦＧＦＲ−３の膜貫通ドメインにおけるさらなる突然変異は、アラニンをグル
タミンへの交換である。このアミノ酸交換はもう１つの病気、すなわち黒色表皮
症を持つクルーゾン病に至る。

【００４６】 本発明によると、ＦＧＦＲ−４における突然変異、特に、疎水性アミノ酸を親
水性アミノ酸への交換に至る膜貫通ドメイン中の点突然変異は癌についてのトリ
ガリングおよび良好でない予後に関し、そのためには受容体チロシンキナーゼの
阻害あるいはキナーゼ不活性受容体の使用が癌の治療および／または予防に適し
、ここに、受容体チロシンキナーゼは突然変異のため改変された方法にて過剰発
現されるかあるいは活性である。

【００４７】 特に、グリシンのアルギニンへの交換に至る位置３８８における点突然変異で
は、この結果、受容体チロシンキナーゼが改変された方法で活性となり、このホ
モ−およびヘテロ接合の結果、リガンド刺激なくしてシグナル伝達が起こり、そ
の結果細胞の制御されない増殖がトリガーされ得る。最悪の場合、この制御され
ない増殖は癌に至る。次いで、膜貫通ドメインは配列（配列番号１）： ＲＹＴＤＩＩＬＹＡＳＧＳＬＡＬＡＶＬＬＬＬＡＲＬＹを有し、 他方、非突然変異ドメインは以下の配列（配列番号２）： ＲＹＴＤＩＩＬＹＡＳＧＳＬＡＬＡＶＬＬＬＬＡＧＬＹを有する。

【００４８】 理論に拘束されるつもりはないが、前記突然変異の１つ、特にグリシンのアル
ギニンへの交換に至る位置３８８での点突然変異を保有する受容体チロシンキナ
ーゼの活性化は、それを通じて膜貫通ドメインにおける交換が可能とされる相互
作用ため起こる、ダイマー立体配座における受容体の安定化に基づくと推定され
る。リガンド−非依存性ダイマーの強化された形成は、増大した受容体チロシン
キナーゼ活性および細胞形質転換に至る。癌のトリガリングに対する点突然変異
の効果についての１つの可能性は、例えば、突然変異がＦＧＦＲ−４によるシグ
ナル伝達に作用する点に、膜を通じての受容体移動が防止され、それ自体とのあ
るいは他のＦＧＦＲとの二量体化が乱される点に、あるいは受容体のチロシンキ
ナーゼ活性が影響される点に基礎を有し得る。

【００４９】 本発明によると、乳癌を持つＳｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇからの患者の５６％
が（バイオプシーによる検査）が位置３８８で突然変異を担い、これはグリシン
のアルギニンへの交換に結び付けることができた。これらのうち、４５％がヘテ
ロ接合であり、１１％がホモ接合である。これは、これは、高い割合で、位置３
８８における点突然変異と乳癌の発生との間のつながりを示唆する。

【００５０】 乳癌を持つドイツ人患者を調べたさらなる検査において、患者の４３％のみが
位置３８８で点突然変異を示した。癌患者の正常組織および正常個体の組織から
のＤＮＡでの実験から、突然変異は原基管突然変異であると帰結することができ
る。

【００５１】 さらに、細胞系からのゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡも実験して、位置３８８に
おける点突然変異の割合を決定した。乳癌、比較としての正常乳房上皮細胞系、
偏平細胞癌腫、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫および子宮癌に由来する細胞系を
実験した。正常乳房上皮細胞系を除いて全ての細胞系で、ＦＧＦＲ−４分子にお
ける位置３８８での点突然変異のかなりの割合を見いだすことができた。よって
、阻害剤あるいはキナーゼ−不活性受容体の前記使用は癌腫の治療で特に適する
。ここに、神経芽細胞腫、子宮癌および膵臓癌の治療は特に有望なようであるが
、他のタイプの癌はそうではない。

【００５２】 特に好ましいのは、特に膜貫通ドメインにおいて位置３８８において突然変異
ＧｌｙからＡｒｇへの突然変異を持つ、突然変異ＦＧＦＲ−４を阻害する阻害剤
の使用である。

【００５３】 さらに、本発明は、細胞において受容体の過剰発現および／または改変された
活性に至る突然変異ＦＧＦＲ−４に関する。好ましくは、この突然変異ＦＧＦＲ
−４は、野生型受容体における疎水性アミノ酸が、突然変異受容体において親水
性アミノ酸に交換されていることに特徴がある。特に好ましくは、点突然変異で
あり、膜貫通ドメインにおいて起こる、突然変異である。さらにより好ましくは
、点突然変異が位置３８８で起こり、その結果、好ましくは、グリシンがアルギ
ニンによって置換される。

【００５４】 従来、専門家に間では、突然変異されていない唯１つのＦＧＦＲ−４が起こる
と推定された。突然変異ＦＧＦＲ−４は知られていなかった。従って、本発明に
より、突然変異ＦＧＦＲ−４が存在することを示すことができたのは驚くべきこ
とであった。特に、本発明により、突然変異、特に位置３８８における点突然変
異と、癌の発生との間の関係を示すことができた。さらに、健康な個人における
原基管突然変異は、とりわけ、動脈硬化症の発生についての遺伝素因と関係付け
られた。

【００５５】 本発明は、さらに、突然変異ＦＧＦＲ−４をコードする配列を含有するＤＮＡ
分子に関する。また、本発明は、突然変異ＦＧＦＲ−４をコードするＲＮＡ配列
を含有するＲＮＡ分子を含む。前記配列は癌の診断に使用することができる。こ
れにおいて、配列はＦＧＦＲ−４における突然変異を特異的に認識することがで
きる。ＦＧＦＲ−４における突然変異の存在は、癌の治療のために貧弱な予後と
関係付けられる。この理由は対応する腫瘍の攻撃的増殖挙動であり得る。

【００５６】 これとは別に、本発明は、乳癌の差異的診断のための手法に関し、ここで、患
者の核酸を前記したＤＮＡおよび／またはＲＮＡのうちの一方と接触させ、従っ
て、突然変異ＦＧＦＲ−４の存在および／または不存在を示すシグナルが得られ
る。最後に、本発明は、前記阻害剤あるいはキナーゼ−不活性受容体を含有する
医薬組成物に関する。これとは別に、チロシンキナーゼ活性の阻害剤の同定のた
めのスクリーニング手法に関し、ここに、本発明の受容体は可能な阻害剤と接触
され、阻害剤の存在下および／または不存在下におけるチロシンキナーゼ活性が
測定される。

【００５７】 さらに、既に前記にて詳細に記載されたごとく、突然変異の存在の検出がＰＣ
Ｒ、続いての制限酵素切断によって行うことができる。

【００５８】 最後に、他の分子生物学的診断手法も可能である。

【００５９】 さらに、本発明の目的は、本発明による突然変異ＦＧＦＲ−４と特異的に反応
する抗体である。本発明の意味における「特異的」とは、本発明による抗体は特
異的受容体に結合するが、非特異的受容体には結合しないということである。

【００６０】 以下、図面および実施例によって本発明を詳細に記載する。

【００６１】

【実施例】

細胞培養。ヒト細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＺＲ ７５−１、Ｋ５６２およ
びＳＫＢｒ３はＡＴＣＣから得た。個々の供給源は最後の表に見いだすことがで
きる。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、Ｋ５６２およびＺＲ ７５−１は、１０％の胎児
ウシ血清（Ｓｉｇｍａ， Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ）を含有するＲＰＭＩ（Ｇｉ
ｂｃｏ， Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）で培養した。ＳＫＢＲ３は１５％胎児ウシ血
清を含有するＭｃＣｏｙ５ａ（Ｇｉｂｃｏ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ）で培養した
。全ての細胞培養培地はペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕ
ｆｋｉｒｃｈｅｎ）を含有していた。細胞を水−蒸気飽和雰囲気および８％ＣＯ ₂ 中にて３７℃でインキュベートした。

【００６２】 ＦＧＦＲ−４^388Arg／ｗｔのクローニング。Ｋ５６２およびＭＤＡ−ＭＢ−４
５３細胞からのＲＮＡの調製では、３×１０⁷細胞をグアニジニウムイソシアネ
ートで溶解させ、ＣｓＣｌグラジエントでの超遠心によって精製した。ｃＤＮＡ
合成は、製造業者の指示に従って、各場合において、逆転写酵素（Ｂｏｅｈｒｉ
ｎｇｅｒ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および１０ｐｍｏｌの「ランダムオリゴヌクレ
オチド」を用いて行った。引き続いてのＰＣＲ反応では０．５μｌを用いた。

【００６３】 ＦＧＦＲ−４^388ArgおよびＦＧＦＲ−４ｗｔをＰＣＲ反応によって増幅した。
このために、以下のプライマーを用いた：センス−ＧＣＴＣＡＧＡＧＧＧＣＧＧ
ＧＣＧＧＧＧＧＴＧＣＣＧＧＣＣＧ、アンチセンスＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＧＣＣ
ＴＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＧＣＣＴＴＧＣ。ＰＣＲ反応では、以下のものを用
いた：製造業者の指示に従って１．５Ｕ／２５μｌのＥｘｐａｎｄ−Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および反応緩衝液：
２００μＭ ｄＮＴＰ、０．０１％ ｖ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ１００；１０％ ｖ
／ｖＤＭＳＯ、および各々０．２ｐｍｏｌのセンスおよびα−センスプライマー
。以下の反応工程を行った：３５サイクル、９４℃ １分、６４℃ １分、７２
℃ ２．５分。ＦＧＦＲ−４^388ArgのクローニングではＭＤＡ−ＭＢ−４５３
ｃＤＮＡを用い、ＦＧＦＲ−４ｗｔのクローニングではＫ５６２ ｃＤＮＡを用
いた。ＰＣＲ産物はｐｃＤＮＡ３ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニ
ングした。このようにして、Ｇ３８８Ｒを有するＦＧＦＲ−４および野生型ＦＧ
ＦＲをさらなる工程のために得ることができた。

【００６４】 ＦＧＦＲ−４の膜貫通ドメインの増幅。以下のプライマーを用いた：センス−
ＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＡＧ；アンチセンスＡＧＡＧＧ
ＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧ。ＰＣＴ反応では以下のものを用いた。
製造業者の指示に従った１．５Ｕ／２５μｌ Ｔａｑ−Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ）および反応緩衝液：２００μＭ
ｄＴＮＰ；各々０．２ｐｍｏｌのセンスおよびα−センスプライマー、０．５α
ｌ ｃＤＮＡあるいは腫瘍バイオプシーおよび細胞系からのゲノムＤＮＡ。以下
の反応工程を用いた：３５サイクル、９５℃ ４５秒、７２℃ ４５秒。

【００６５】 制限酵素消化による分析。ゲノムあるいはｃＤＮＡからのＦＧＦＲ−４の膜貫
通ドメインを前記したごとくに増幅した。制限酵素消化を用いて、Ｇ１２１７Ａ
突然変異につきバイオプシーおよび細胞系をテストするために、ＰＣＲ産物を、
５Ｕ／２５μｌのＢｓｔＢ１（ＮＥＢ、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ／Ｔａｕｎｕｓ）
と、６０℃で１時間インキュベートした。制限酵素消化からのＤＮＡ断片を２０
％ポリアクリルアミドゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。野生型受容体
の分析は１０９、３７および２２塩基対サイズの断片を生じる（トラック４）。
他方、突然変異Ｇ１２１７Ａの結果として、ＢｓｔＢ１についてのさらなる制限
酵素切断部位が形成される。突然変異受容体はさらなる８０および２９塩基対サ
イズの断片を示し、他方、１０９塩基対サイズの断片は消失する（トラック：ホ
モ接合体；トラック２および３：ヘテロ接合体）（図２参照）。

【００６６】 制限酵素消化によるゲノムＤＮＡの遺伝子型 初代腫瘍の組織試料からのゲノムＤＮＡを標準的な方法によって単離した（Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ．， １９９５）。
ゲノムＤＮＡの遺伝子型分析ができるためには、ＦＧＦＲ−４遺伝子における膜
貫通領域をＰＣＲ反応において以下のプライマーで増幅した： ５’−ＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＣＣＡＧ−３’（ｂｐ１２７
５−１１４２）、および ５’−ＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧＣＴＴＣＴＧ−３’（ｂｐ１２７５
−１２９７）。ＰＣＲ反応では、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−Ｇｏ ＰＣＲ Ｂｅａｔｓ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｕｐｐｓａｌａ， スウェーデン）を用いた。以下の
ＰＣＲサイクルを用いた：９５℃における３分、９４℃における４５秒、７２℃
における４５秒、および７２℃における５分。合計３５サイクルを行った。ＰＣ
Ｒ産物を、５Ｕ／２５μｌのＢｓｔＢ１（ＮＥＢ、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ／Ｔａ
ｕｎｕｓ）と、６０℃で１時間インキュベートした。制限酵素消化からのＤＮＡ
断片を２０％ポリアクリルアミドゲルで分離し、臭化エチジウムで染色した。^{38 8} Ａｒｇアレレ（対立遺伝子）は８０および２９ｂｐサイズの２つの断片によっ
て特徴付けられ、他方、³⁸⁸Ｇｌｙアレレは単一の１０９ｂｐサイズの断片によ
って示される。各遺伝子型分析は３回反復された。

【００６７】 ＰＣＲ産物のＤＮＡ配列決定。ＦＧＦＲ−４の膜貫通ドメインの配列分析では
、ＰＣＲ産物をＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローンニングした。このために、ＰＣ
Ｒ反応を既に記載したごとくに行った。以下のプライマーを用いた：センス−Ｇ
ＧＧＡＡＴＴＧＡＣＣＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧ；α−センス−ＧＣＴ
ＣＴＡＧＡＡＧＡＧＧＧＡＡＧＡＧＧＧＡＧＡＧ。ＦＧＦＲ−４^Arg388／ｗｔの
クローニングのＰＣＲ産物はベクターｐｃＤＮＡ３中で、直接配列決定すること
ができた。Ｔ／−プライマーのプラスミドＤＮＡへのアニーリングの後、配列決
定反応をＴ／−ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｓｂｕｒｇ
）を用いて行った。次いで、配列決定反応の産物を変性５％ポリアクリルアミド
ゲル（７．５Ｍ尿素、１×ＴＢＥ）で分離し、乾燥した後にＸ線フイルムに暴露
した（図３参照）。これより、野生型および突然変異のＤＮＡ配列が得られた。

【００６８】 免疫沈殿およびウェスタンブロット分析。２．２×１０⁶細胞を１０ｃｍのペ
トリ皿上に広げ、一晩インキュベートした。細胞培地を、胎児ウシ血清を含まな
い培地によって置換し、さらに２４時間インキュベートした。刺激には、細胞を
５０ｎｇのｓＦＧＦ／ｍｌで１０分間インキュベートし、冷ＰＢＳで２回洗浄し
、氷上に置いた。細胞を３００μｌの冷溶解緩衝液（１％ ｗ／ｗ ＮＰ−４０
、１．２５％ ｗ／ｖデオキシコール酸ナトリウム、０．１％ ｗ／ｖＳＤＳ、
０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、２ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ、１０ｍＭフッ化ナトリウム、１ｍＭ ＰＭＳＦ、２０μｇ／ｍｌアプロ
チニン、１ｍＭオルトバナデート、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム）と共に４℃
で１５分間インキュベートし、溶解物を４℃の遠心（１３，０００ＲＰＭ）によ
って清澄化した。蛋白質値決定では、Ｍｉｃｒｏ−ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ
ｓｓａｙ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造業者の指示に従って用いた。免疫沈殿では、細
胞溶解物を等しい蛋白質含有量に調整し、次いで、０．５μｇの抗−ＦＧＦＲ−
４（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）にて、回転するホイール上のプロテイン−Ａ−Ｓｅ
ｐｈａｒｏｓｅ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｆｒｅｉｓｂｕｒｇ）にて４℃で１
８時間インキュベートした。免疫複合体を冷ＨＮＴＧ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０％グ
リセリン、１０ｍＭピロリン酸ナトリウム）で４回洗浄した。試料の調製では、
免疫複合体を５０μｌ３×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液で処理し、９９℃で５分間イン
キュベートした。沈殿した蛋白質を７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した（図
１参照）。

【００６９】 ウェスタンブロットでは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した蛋白質をニトロ
セルロースに移した。膜上の非特異的蛋白質結合部位をＴＢＳ−Ｔ／０．２５％
ゼラチン（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、
０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）と共に室温で２時間のインキュベーションによって
ブロックした。初代抗体でのインキュベーションは傾いたシェーカー上にて４℃
で６時間行った。次いで、非特異的に結合した抗体をＴＢＳ−Ｔ／０．２５％ゼ
ラチンで４回洗浄することによって除去した。二次抗体の結合は室温にて１時間
行った。非特異的に結合した二次抗体はさらなる洗浄工程によって除去した。免
疫複合体は製造業者の指示に従ってＥＣＬ^TMキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ， Ｂｒ
ａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）で可視化した。

【００７０】 統計学的方法。統計学的計算は統計学プログラムＭｅｄＣａｌｃ（ＭｅｄＣａ
ｌｃ ＳＯｆｔｗａｒｅ， ベルギー）およびＥｐｉｌｌｎｆｏ ６．０４（Ｃ
ＤＣ、アトランタ、ジョージア）の助けを借りて行った。異なる群における遺伝
子型および臨床的領域との間の相関を決定するために、優劣比、信頼区間（ＣＩ
）および統計的有意性（Ｐ値）を計算した。少数の³⁸⁸Ａｒｇホモ結合患者のた
め、この群を統計的計算では³⁸⁸Ａｒｇヘテロ接合患者の群と組合せた。

【００７１】 腫瘍細胞系におけるＦＧＦＲ−４の検出。表ＩはＲＴＫの発現および乳癌の間
の相関関係を示す。ＲＴＫの発現は、明瞭に、乳癌よりも細胞系でしばしば起こ
り、他方、正常上皮細胞の細胞系では検出できない。

【００７２】

【表１】

【００７３】 表２から、Ｇ３８８Ｒ突然変異は他の癌タイプの細胞系でも起こり、これらと
相関性があることが明らかである。健康な上皮細胞系では、前記突然変異は検出
できない。

【００７４】

【表２】

【００７５】 バイオプシーにおけるＦＧＦＲ−４突然変異Ｇ３８８Ｒの検出。表３は調べた
乳癌を持つＳｔ Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇからの６１人の女性患者のうち、５６％
がＧ３８８Ｒ突然変異（そのうち４５％がヘテロ接合であり、１１％がホモ接合
である）を保有していたことを示す。調べたミュンヘンからの６９人の女性乳癌
患者のうち、４３％がＧ３８８Ｒ突然変異（そのうち３２％がヘテロ的であり、
１１％がホモ接合的である）を保有していた。Ｓｔ Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇおよ
びミュンヘンからの女性患者における突然変異の全パーセンテージの割合は異な
る。これは、Ｇ３８８Ｒ突然変異が原基管突然変異であることを示唆する。

【００７６】

【表３】

【００７７】 ＦＧＦＲ−４−Ｇ３８８Ｒ突然変異およびＦＧＦＲ−４発現の検出の間の相関
関係。以下の表４から、Ｇ３８８Ｒ突然変異（ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡ）は
、発現および／または強化された発現が起こる場合のみ起こることが明らかであ
る。突然変異は、ＲＴＫ発現が見いだされない、正常乳房上皮細胞系でも乳癌細
胞系でも検出できない。

【００７８】 そのＲＴＫ発現が特に顕著である細胞系ＭＤＡ−ＭＢ ４５３はホモ接合Ｇ３
８８Ｒ突然変異を示す。

【００７９】

【表４】

【００８０】 ＦＧＦＲ−４突然変異Ｇ３８８Ｒおよびリンパ節転移状態、あるいは再発なし
の生存時間の間の相関関係の研究 表５は、乳癌の腫瘍形成におけるＧ３８８Ｒ突然変異の役割の研究に参画する
全ての患者の臨床的パラメーターを示す。Ｇ３８８Ｒ突然変異を持つ患者はＧ３
８８Ｒ突然変異を持たない患者よりも不良な長期予後を有することが見いだされ
た。 表５に対する記号 Ｈｅｒ２：Ｈｅｒ２受容体の発現レベル、０＝発現なし、〜３＝過剰発現 ＯＰＤＡＴ：手術の日付 Ｍ／Ｒ：転移形成／再発、０＝無し／１＝有り Ｖｅｒｓ：死亡；０＝無し／１＝有り ＢＥＲＲＥ：再発なくしての生存時間（月数で） グレード：腫瘍の分化グレード；１＝強力な分化／３＝低い分化段階：初代腫瘍
のサイズ Ｅ−Ｒｅｃ：エストロゲン受容体の発現、０＝発現無し、〜１２＝最高発現 ＧＥＮ：ＦＧＦＲ−４の遺伝子型；Ｇ＝野生型アレレ；Ｒ＝突然変異アレレ ＢＥＤＡＴ：最後の観察の日付 ＲＥＺＤＡＴ：再発診断の日付 ＴＯＤＤＡＴ：死亡の日付 ＢＥＲＬＥＢ：通算しての生存時間 Ｎｏｄ．：リンパ節における転移；０＝無し／１＝有り Ｍｅｎ：閉経 Ｐ−Ｒｅｃ：プロゲステロン受容体の発現：０＝発現無し、〜１２＝最高発現

【００８１】

【表５】

【００８２】 図４から、Ｇ３８８Ｒ突然変異は、最初の治療時においてリンパ節に転移を既
に有する患者において数が多いことが見いだされる。Ｇ３８８Ｒ突然変異を持つ
患者のうち、６２．７％がリンパ節転移を有し、他方、Ｇ３８８Ｒ突然変異を持
たない患者のうち、３８．２％のみがリンパ節において転移を呈した。リンパ節
転移状態は不良な予後を持つ腫瘍および良好な予後を持つ腫瘍のさらなる区別の
ための重要な予後マーカーであるので、この結果から、調べた８５人の患者にお
いてＧ３８８Ｒはよりひどい腫瘍進行に至れしめると結論できる。

【００８３】 図５より、調べた患者の群において、再発なし生存確率は、Ｇ３８８Ｒ突然変
異を有しない患者についてよりもＧ３８８Ｒ突然変異を持つものにつき、非常に
低いことが分かる。再発した患者の７４．４％が３８８Ｒ遺伝子型を有するが、
２５．６％のみが３８８Ｇ遺伝子型を有する。これは、Ｇ３８８Ｒ突然変異を持
つ患者がより速やかに再発し、従って、成功裡に治療できなかったことを示す。

【００８４】 要約すると、ＦＧＦＲ−４突然変異Ｇ３８８Ｒはリンパ節における転移形成の
２．７倍（ＯＲ＝２．７；ＣＩ：１．０２＜ＯＲ＜７．４）増大した危険性に至
らしめ、さらに５．４４倍（ＯＲ＝５．４４；ＣＩ：１．９３＜ＯＲ＜７．４）
増大した腫瘍の再発の危険性に至らしめると云うことができる。かくして、突然
変異したＦＧＦＲ−４アレレ（Ｇ３８８Ｒ）を持つ患者は、腫瘍再発に対して素
因を有するようであり、よって、より良好でない病気予後を有するようである。

【００８５】 材料 アクリルアミド Ｓｅｒｖａ，ハイデルベルグ 寒天 Ｄｉｆｃｏ，デトロイト アガロース ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ アンピシリン Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，マイハイム アプロチニン Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ Ｎ，Ｎ’−ビスアクリルアミ Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｉｓｒｕｈｅ ド 塩化セシウム ＢＲＬ，Ｅｇｇｅｎｓｔｅｉｎ デスオキシヌクレオチド Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｆｒｅｉｓｂｕ ｒｇ 臭化エチジウム Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ ゼラチン Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ グアニジウムイソチオシアネ Ｆｌｕｋａ，スイス国 ート ＨＥＰＥＳ Ｓｅｒｖａ，ハイデルベルグ フッ化ナトリウム Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ ＰＭＳＦ Ｓｉｇｍａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ ＳＤＳ Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ Ｔｒｉｓ Ｒｉｅｄｅｌ ｄｅ Ｈａｅｎ， Ｓ ｅｅｚｅ ＴｒｉｔｏｎＸ１００ Ｓｅｒｖａ，ハイデルベルグ Ｔｗｅｅｎ２０ Ｓｅｒｖａ，Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ リストされていない全ての物質は、会社Ｓｉｇｍａ（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ
）， Ｓｅｒｖａ（ハイデルベルグ）， Ｒｉｅｄｅｌ Ｄｅｕｒｓｃｈｅ Ｐ
ａｔｅｎｔａｍｔ［ｓｉｃ］ＨａｅｎあるいはＭｅｒｃｋ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ
）会社から入手し、最高に可能な純度グレードを用いた。

【００８６】 装置 ＤＮＡの電気泳動 Workshop, MPI for Biochemistry, Martinsrie d 蛋白質の電気泳動 Atto,日本 冷凍遠心 Ｂｉｏｆｕｇｅ１７Ｓ Heraeus,Hanau 蛋白質移動 Semidryフ゛ロット装置, Workshop, MPI for Bioche mistry, Martinstried 滅菌ワークベンチ Biogard, The Baker Company, USA 細胞培養 インキュヘ゛ーター B5060 EK/Co₂, Hanau 細胞計数 コールターカウンター, Counter Electronics, ク゛ラスコ゛ー

【００８７】 文献 バシリコ・シイおよびマスカテリィ・デイ：ザ・エフジイエフ・ファミリー・
オブ・グロウス・ファクターズ・アンド・オンコジーン アドバーンスト・キャ
ンサー・リサーチズ，５９，１１５−１６４（１９９２） クーリエ・エフ， デ・ラペイリエール・オーおよびビルムバウム・デイ：コ
ンプレクシティー・オブ・ザ・エフジイエフ・ファミリー：ザ・プルーフ・ナイ
ン／メディ／サイ ９，１１１３−１１１５（１９９３） フォークマン・ジェイおよびクラグスブルン・エム：サイエンス２３５， ４
４２−４４７（１９８７） ジバル・デイおよびヤヨン・エイ：コンプレクシティー・オブ・エフジイエフ
・レセプターズ：ジェネティックス・ベーシス・フォー・ストラクチュラル・デ
リバリー・アンド・ファンクショナル・スペシフィシティー、エフエイエスイー
ビイ・ジャーナル ６：３３６２−３３６９（１９９２） ジョンソン・デイ・イーおよびウィリアムズ・エル・ティー：ストラクチュラ
ル・アンド・ファンクショナル・ダイバーシティー・イン・ザ・エフジーエフ・
レセプター・マルチジーン・ファミリー， アドバーンスト・キャンサー・リサ
ーチズ ６０：１−４１（１９９３） キメイマン・デイ， アブラハム・ジェイ・エイ， ハーパランタ・テイ，
パルシィー・テイ・エムおよびキルシュナー・エム・ダブリュー：サイエンス， ２４２， １０５３−１０５８（１９８８） モハマディー・エムら， サイエンス７７６，９５５−９５９（１９９７） スラック・ジェイ・エム・ダブリュー， ダーリントン・ジイ・ジイ， ヘル
ス・ジェイ・ケイおよびゴッドサーブ・エス・エフ：ネイチャー３２６， １９
７−２００（１９８７） トーマス・ケイ・エイ， リオス−カンデロール・エム， グリメズ−ガレゴ
・ジイ， ジサルボ・ジェイ， ベルネット・シイ， ロドケイ・ジェイおよび
フィッツパトリック・エス：プロシーディングズ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシズ・ユーエスエイ， ８２， ６４０９−６４１３（１９８５） トンプソン・ジェイ・エイ， ハウデンシルト・シイ・シイ， アンダーソン
・ケイ・デイ， ジピエテロ・ジェイ・ウム， アンダーソン・ダブリ・エフお
よびマシアーグ・テイ（１９８９）：プロシーディングズ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンシズ・ユーエスエイ，８６， ７９２８−７９３２（１９
８９）

【００８８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＦＧＦＲ−４（リン酸化されたＦＧＲ受容体−４は、矢印で示されている）の
免疫沈殿物のＳＤＳＰＡＧＥを示す。

【図２】 突然変異ＦＧＦＲ−４のポリアクリルアミドゲルである。

【図３】 ＦＧＦＲ−４の膜貫通ドメインの配列分析である。

【図４】 ＦＧＦＲ−４突然変異Ｇ３８８Ｒとリンパ節転移形成の状態（n：患者数、ｐ
：Ｐ値）との相間関係である。

【図５】 ＦＧＦＲ−４突然変異Ｇ３８８Ｒと再発なしでの生存時間（n：患者数、ｐ：
Ｐ値）との相間関係である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/50 Ｚ 33/50 33/566 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 クヌヤチェフ， ピュトル ドイツ， デー−82131 ガウティング， フベルトゥスストラッセ 66 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA26 AA28 CB01 CB17 DA12 DA13 DA14 DA20 DA36 DA54 DA80 FB01 FB02 FB03 FB04 FB05 FB06 FB07 FB15 JA01 4B024 AA01 AA11 BA63 CA03 CA11 HA01 HA12 4B063 QA18 QA19 QQ27 QQ43 QQ52 QQ91 QR14 QR56 QR62 QS25 QS34 4C084 AA02 AA17 BA44 DC32 ZB262 ZC202 4H045 AA10 AA11 AA30 CA40 DA50 DA75 EA28 FA74

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）−過剰機能−誘導障害、
   特に癌の治療および／または予防のためのＲＴＫの少なくとも１つの阻害剤の使
   用。
2. 【請求項２】 前記阻害剤がキナーゼ−不活性受容体であることを特徴とす
   る、請求項１に記載の使用。
3. 【請求項３】 受容体チロシンキナーゼの過剰発現および／または改変され
   た活性が低下されおよび／または阻害されることを特徴とする、請求項１または
   ２に記載の使用。
4. 【請求項４】 受容体チロシンキナーゼの過剰発現および／または改変され
   た活性がＦＧＦＲ−４の突然変異によってトリガーされることを特徴とする、請
   求項３に記載の使用。
5. 【請求項５】 前記突然変異が１個あるいは数個の点突然変異であることを
   特徴とする、請求項４に記載の使用。
6. 【請求項６】 前記突然変異がＦＧＦＲ−４の膜貫通ドメインでおこること
   を特徴とする、請求項５に記載の使用。
7. 【請求項７】 前記突然変異が疎水性アミノ酸を親水性アミノ酸への交換に
   導く請求項５または６に記載の使用。
8. 【請求項８】 前記点突然変異がＦＧＦＲ−４分子中のＡＡ位置３８８で起
   こることを特徴とする、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用。
9. 【請求項９】 前記ＡＡ位置３８８における点突然変異がグリシンに代えて
   アルギニンへの交換に導く（Ｇ３８８Ｒ）ことを特徴とする、請求項５〜８のい
   ずれか一項、または複数項に記載の使用。
10. 【請求項１０】 前記突然変異が原基管突然変異であることを特徴とする前
    記請求項のいずれか一項、または複数項に記載の使用。
11. 【請求項１１】 特に転移形成の阻害によって過剰増殖および／または侵入
    、特に癌種に帰せられる癌および／または病気の治療のための、前記請求項のい
    ずれか一項、または複数項に記載の使用。
12. 【請求項１２】 乳癌の治療のための前記請求項のいずれか一項、または複
    数項に記載の使用。
13. 【請求項１３】 偏平細胞癌腫の治療のための請求項１〜１１のいずれか一
    項、または複数項に記載の使用。
14. 【請求項１４】 神経膠芽細胞腫の治療のための請求項１〜１１のいずれか
    一項、または複数項に記載の使用。
15. 【請求項１５】 神経芽細胞腫の治療のための請求項１〜１１のいずれか一
    項、または複数項に記載の使用。
16. 【請求項１６】 子宮癌の治療のための請求項１〜１１のいずれか一項、ま
    たは複数項に記載の使用。
17. 【請求項１７】 阻害剤がＦＧＦＲ−４、好ましくは突然変異ＦＧＦＲ−４
    を阻害することを特徴とする、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
18. 【請求項１８】 細胞中での受容体の過剰発現および／または改変された活
    性に導く突然変異ＦＧＦＲ−４。
19. 【請求項１９】 野生型受容体における疎水性アミノ酸が突然変異受容体中
    の親水性アミノ酸に交換されたことを特徴とする、請求項１８に記載の突然変異
    ＦＧＦＲ−４。
20. 【請求項２０】 前記突然変異が点突然変異であり、好ましくは膜貫通ドメ
    インで起こることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の突然変異ＦＧＦ
    Ｒ−４。
21. 【請求項２１】 点突然変異が位置３８８で起こり、好ましくはグリシンが
    アルギニンによって置換されることを特徴とする、請求項１８に記載の突然変異
    ＦＧＦＲ−４。
22. 【請求項２２】 請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の突然変異ＦＧＦ
    Ｒ−４をコードする配列を含有するＤＮＡ分子。
23. 【請求項２３】 請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の突然変異ＦＧＦ
    Ｒ−４をコードする配列を含有するＲＮＡ分子。
24. 【請求項２４】 病気、特に癌の診断における請求項２２および２３のいず
    れか一項に記載の配列の使用。
25. 【請求項２５】 前記配列がＦＧＦＲ−４の位置３８８における点突然変異
    を特異的に検出することができることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
26. 【請求項２６】 症例試料中の、突然変異ＦＧＦＲ−４蛋白質またはそれを
    コードする核酸の検出の工程を含む、特に癌の差異的診断のための診断手法。
27. 【請求項２７】 突然変異ＦＧＦＲ−４の存在および／または不存在を示す
    シグナルが得られるように患者の核酸をＤＮＡおよび／またはＲＮＡと接触させ
    、および／または患者の核酸をＰＣＲによって増幅し、引き続いて、その認識配
    列が突然変異によって影響される制限酵素で切断し、および／または患者の蛋白
    質を突然変異蛋白質につき特異的な抗体と接触させることを特徴とする、請求項
    ２６に記載の診断手法。
28. 【請求項２８】 症例試料中の、突然変異ＦＧＦＲ−４蛋白質またはそれを
    コードする核酸、あるいは増幅されたＦＧＦＲ−４核酸を検出する工程を含む、
    癌および／または他の病気の発生についての遺伝的素因の存在につきスクリーニ
    ングする手法。
29. 【請求項２９】 請求項１〜１７のいずれか一項、または複数項に記載され
    た阻害剤を含む医薬組成物。
30. 【請求項３０】 チロシンキナーゼ活性の阻害剤の同定のためのスクリーニ
    ング手法であって、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の受容体を、潜在的
    な阻害剤と接触させ、該阻害剤の存在および／または不存在においてチロシンキ
    ナーゼ活性を測定する前記手法。
31. 【請求項３１】 癌治療における標的としての、好ましくは請求項１８〜２
    １のいずれか一項に記載の突然変異ＦＧＦＲ−４。
32. 【請求項３２】 請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の突然変異ＦＧＦ
    Ｒ−４蛋白質と特異的に反応する抗体。