KR20090048644A

KR20090048644A - Ｒｅｔ 수용체 티로신 키나아제를 타겟으로 하는 약물 치료를 위한 환자 평가 방법

Info

Publication number: KR20090048644A
Application number: KR1020097006399A
Authority: KR
Inventors: 앤더슨 요셉 리안; 제임스 셔우드; 알란 우키
Original assignee: 아스트라제네카 아베
Priority date: 2006-09-07
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2009-05-14
Also published as: NO20090788L; BRPI0716555A2; CN101512017A; WO2008029123A1; CA2662591A1; MX2009002471A; AU2007293280A1; EP2064340A1; JP2010502209A; IL197157A0; US20110028498A1

Abstract

본 발명은 RET 약물 치료에 대한 후보인, 환자의 선별 방법을 제공하여, RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측할 수 있다. 본 발명은 RET의 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 본 방법은 RET 서열을 확인하는데 최적화된 ARMS 프라이머를 제공한다. 본 발명은 또한 ARMS 프라이머를 포함하는 진단 키트를 제공한다.

RET 수용체, 티로신 키나아제, 환자 선별, RET 서열, ARMS 프라이머

Description

ＲＥＴ 수용체 티로신 키나아제를 타겟으로 하는 약물 치료를 위한 환자 평가 방법{METHOD FOR EVALUATING PATIENTS FOR TREATMENT WITH DRUGS TARGETING RET RECEPTOR TYROSINE KINASE}

본 발명은 RET 약물 치료에 대한 후보인, 환자의 선별 방법에 관한 것으로서, RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측할 수 있다. 본 발명은 RET의 서열을 확인하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 RET 서열을 확인하기 위해 최적화된 ARMS 프라이머를 제공한다. 본 발명은 또한 ARMS 프라이머를 포함하는 진단 키트를 제공한다.

티로신 잔기상의 단백질의 인산화(phosphorylation)는 세포내 신호 전달(signal transduction)의 중요 요소이다. 이러한 반응을 촉매할 수 있는 효소를 티로신 키나아제(tyrosine kinase)라고 한다. 많은 수의 트랜스멤브레인 수용체들은 티로신 키나아제 활성을 갖는 도메인을 포함하며, 수용체 티로신 키나아제(RTK)로서 분류된다. RTK는 세포 성장, 분화, 생존 및 세포 예정사(programmed cell death)와 같이 다양한 과정에서 세포외 신호들을 전달한다. 세포외 리간드와의 결합에 대한 반응으로, RTK는 일반적으로 이량화되어 인산화된 형태의 RTK를 인식하여, 상호반응하는 효과기(effector)를 통한 세포내 신호 전달 및 자동인산화를 유 도한다. 이 RTK 패밀리의 많은 멤버가 존재하며, 이 중 하나는 RET 원암유전자(proto oncogene)로서, 이는 120kDa의 단백질 RET(형질감염동안 재배열되는 단백질)을 암호화한다. RET는 신경교 유도성 향신경 인자(GDNF) 패밀리의 성장 인자에 대한 수용체이다. RET에 대한 두개의 리간드가 동정되었다; GDNF 및 뉴트린(NTN). RET는 이의 리간드가 보조 수용체와 결합하고, 이 후 복합체가 RET와 상호작용할 때, 활성화된다(Eng, 1999 Journal Clinical Oncology: 17(1) 380-393).

활성화는 티로신 잔기에서 RET를 인산화시키며, RAS-RAF 및 PI3 키나아제 경로 및 가능한 다른 경로를 통해 세포 성장 및 분화에 대한 신호 전달을 유도한다.

RET를 활성화하는 점 돌연변이(point mutant)는 3개의 연관된 우성 유전된 암 증후군; 다발성 내분비 신생물 유형 2A와 2B(MEN2A 및 MEN2B), 및 가족성 갑상선 수질암(FMTC)을 유발하는 것으로 알려져 있다(Santoro et al. 2004 Endocrinology: 145, 5448-5451).

거의 모든 MEN2A의 경우 및 일부 FTMC의 경우에서는, 세포외 및 막근접 시스테인 풍부 도메인(juxtamembrane cysteine-rich domain)에서 시스테인 치환이 일어나는 반면, MEN2B의 95%에서는 키나아제 도메인(M918T)상의 918번 코돈에서 단일 점 돌연변이가 일어난다. 918번 코돈은 촉매 코어(catalytic core)내의 기질 인식 포켓상에 위치하는 것으로 여겨진다. 이 자리에서의 돌연변이는 RET 촉매 도메인의 활성 루프의 구조를 바꿈으로서, RET를 구조적으로 활성화하는 것으로 사료된다. M918T 돌연변이는 산발성 수질암에서도 발견되는데, 이는 진행성 질환의 표현형(phenotype)과 관련 있다. 시험관내 연구에서는 돌연변이가 기질 특이성에 영향 을 미쳐, RET가 c-src 및 c-abl과 같은 비-수용체 티로신 키나아제에 의해 선호되는 기질을 인식하고, 인산화함을 보여준다(Eng et al. 1996 JAMA276, 1575-1579; Ponder et al. 1999 Cancer Research59, 1736-1741; Schilling et al. 2001 International Journal of Cancer95, 62-66; Santoro et al. 1995 Science267, 381-383; Zhou et al. 1995 Nature273, 536-539).

RET 유전자상의 돌연변이가 MEN2 패밀리의 대부분에서 동정됨에 따라, 분자 진단 테스트가 가능해지고, 임상 진단 확인을 위해서도 유용할 수 있다. RET 돌연변이 테스트는 폴리머라제(polymerase) 연쇄 반응에 기초한 프로토콜을 이용하여 수행될 수 있는데, 여기서 표적 액손 서열은 직접 시퀀싱(direct sequencing) 또는 제한효소 엔도뉴클라아제 절단(restriction endonuclease digestion)을 위해 증폭된다(Zhong et al. 2006 Clinica Chimica Acta364, 205-208).

RTK 패밀리의 다른 멤버는 혈관 내피 성장 인자 수용체 2(VEGFR2 (키나아제 삽입 도메인 포함 수용체, KDR(Flk-1로도 언급됨)))이다. VEGFR2는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)에 대한 수용체이다. VEGF는 정상 혈관형성(angiogenesis)과 질환 관련 혈관형성 모두(Jakeman, et al. 1993 Endocrinology133,848-859; Kolch, et al. 1995 Breast Cancer Research and Treatment36,139-155) 및 혈관 투과성(Connolly, et al. 1989 J. Biol. Chem264,20017-20024)의 중요한 자극제인 것으로 간주된다. 항체와 VEGF의 격리에 의한 VEGF 작용의 길항작용은 종양 성장을 억제할 수 있다(Kim, et al. 1993 Nature362,841-844). VEGF 유전자의 이형 분열은 혈관화(vascularisation)에 있어서 치명적인 결함을 유발한다(Carmeliet, et al. 1996 Nature 380435-439; Ferrara, et al. 1996 Nature 380439-442).

VEGF의 VEGFR2에 대한 결합은, 수용체 이량화(dimerisation)을 유도하여, 특정 세포내 티로신 잔기의 VEGFR2 자동인산화를 초래한다. 자동인산화는 티로신 키나아제의 촉매 활성을 증가시키고, 포스포리파아제 C-γ와 같은 세포질 신호 전달을 위한 잠재적인 도킹 자리(docking site)를 제공한다. 이 단백질 상호작용은 VEGFR2, 예를 들어, 내피 세포의 증식, 생존 및 이주에 대한 세포 반응을 유도하는데 필수적인 세포내 시그널링을 매개한다(Ryan et al. 2005 British Journal Cancer: 92(Suppl.1) S6-S13).

병리적인 혈관형성에서 VEGF-매개 VEGFR2 시그널링의 중요한 역할에 대한 인식은 VEGFR2 활성화를 억제하기 위한 다양한 선택적인 접근법의 발전으로 이어졌다. 이들은 소분자 ATP-경쟁적인 티로신 키나아제 억제제를 포함하며, 이것은 ATP 결합 억제에 있어서, 자동인산화 및 연속적인 세포내 신호 전달이 일어나지 못하게 한다(Ryan, 2005).

VEGF 수용체 티로신 키나아제의 억제제인 퀴나졸린(quinazoline) 유도체는 국제 특허 공개 공보 WO98/13354호 및 WO01/32651호에 기술되어 있다. WO98/13354호 및 WO01/32651호에서는, 내피 성장 인자 수용체(EGFR) 티로신 키나아제에 대해일부 활성을 갖으며, VEGF 수용체 티로신 키나아제에 대한 활성을 갖는 화합물을 개시하고 있다.

VEGFR2 티로신 키나아제 억제제인, 화합물 4-(4-브로모-2-플루오로아닐리노)-6-메톡시-7-(1-메틸피페리딘-4-일메톡시)퀴나졸린이 개시되어 있다(Wedge et al., 2002 Cancer Research62,4645-4655). 이 화합물은 코드 번호 ZD6474 및 일반 상품명 반데타니브(Vandetanib)인, Zactima^TM(등록상표)로도 알려져있다. 이하, 상기 화합물을 반데타니브라 한다.

반데타니브는 VEGFR2 티로신 키나아제에 대한 ATP-결합의 강력하고 가역적인 억제제로서 개발되었다. 또한 반데타니브는 또한 EGFR 티로신 키나아제 활성을 억제한다. EGFR 시그널링 경로는, 비정상적인 EGFR 활성이 종양 세포 증식, 생존 및 침입 뿐만 아니라 VEGF가 과발현을 증가시키는 암 진행에 있어서 또한 중요한 인자이다. EGFR 시그널링의 억제는 종양 내피 세포에서의 선별적인 아폽토시스(apoptosis)를 유도하는 것으로 밝혀지고 있다.

2002년, 반데타니브는 리간드 의존성 RET 티로신 키나아제 활성의 강력한 억제제로서, RET의 시그널링과 변형 능력을 억제할 수 있다는 보고가 있었다. 또한 반데타니브는 시험관내에서 RET-의존성 갑상선 종양 세포 성장에 대한 강력한 성장 억제 효과를 가짐이 보고되었다(Carlomagno et al. 2002 Cancer Research: 62, 7284-7290). 반데타니브는 RET의 돌연변이된 활성형 대부분 및 야생형 수용체도 억제하였다. 따라서, VEGFR2 및 EGFR 티로신 키나아제의 억제 뿐만 아니라, 반데타니브에 의한 RET 티로신 키나아제의 억제는 RET-의존성 종양 세포 성장을 유도하는 RET 유전자의 돌연변이를 수반하는, 종양 치료에 있어서 추가적인 항종양 효과를 부여할 수도 있다(Ryan, 2005).

본 발명은 RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측하기 위하여, RET 약물 치료 후보인 환자의 선별을 가능하게 한다. RET를 구조적으로 활성화하는 돌연변이가 중대한 RET-시그널링 의존성 암 증후군을 유도하는 것으로 알려져 있기 때문에, 환자에서 이 돌연변이를 확인하는 것은 RET 약물 치료를 위한 환자의 적합성을 평가하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 양태에 따르면, RET 약물 치료에 대한 후보인, 환자가 상기 치료에 반응할 가능성을 예측하기 위한 방법을 제공하며, 이는 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 다음 위치, 105번 위치에서 티민이 아닌지를 확인하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 본 방법은 환자로부터 얻은 샘플 중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 105번 위치에서 티민이 아닌지를 확인하는 단계를 포함함으로써, RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측할 수 있다. 일 구체예에서, 본 방법은 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 다음 위치, 105번 위치에서 시토신인지를 확인하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 본 방법은 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 105번 위치에서 시토신인지를 확인하는 단계를 포함함으로써, RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, RET 약물 치료에 대한 후보인, 환자가 상기 치료에 대해 반응할 가능성을 예측하기 위한 방법을 제공하며, 이는 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된 다음 위치, 918번 위치에서 메티오닌이 아닌지를 확인하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 본 방법은 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된 918번 위치에서 메티오닌이 아닌 지를 확인하는 단계를 포함함으로써, RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측한다. 일 구체예에서, 본 방법은 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된 다음 위치, 918번 위치에서 트레오닌인지를 확인하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 본 방법은 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된, 918번 위치에서 트레오닌인지를 확인하는 단계를 포함함으로써, RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측한다.

일 구체예에서, RET 약물 치료에 대한 후보인 환자가 상기 치료에 반응할 가능성을 예측하기 위한 방법을 제공하며, 이는 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 다음 위치, 105번 위치에서 시토신인지를 확인하거나, 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된, 다음 위치, 918번 위치에서 트레오닌인지를 확인하는 단계를 포함함으로써, RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측한다.

일 구체예에서, 본 발명은 RET 약물 치료에 대한 후보인 환자, 특히, RET에 대한 단독 의존성 또는 일부 의존성 종양 환자의 RET 약물에 대한 반응성을 예측하는데 특히 적절하다. 일 구체예에서, 본 발명은 돌연변이 RET에 대하여 단독 의존성 또는 일부 의존성 종양 환자에 있어서, RET 약물에 대한 반응을 예측하는데 사용하기에 특히 적합하다. 이러한 종양은 예를 들어, 갑상선 암종(thyroid carcinoma)을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 갑상선 수질암종, 부신샘 종양(예를 들어, 크롬친화세포종), 폐암(특히, 소세포성 폐암), 유두 갑상선암종, 중피종 및 결장직장암으로부터 선택되는 종양 환자에 있어서, RET 약물에 대한 반응 을 예측하는데 사용되기에 특히 적절하다. 다른 구체예에서, 본 발명은 갑상선 수질암종, 부신샘 종양(예를 들어, 크롬친화세포종) 및 폐암(특히, 소세포성 폐암)으로부터 선택되는 종양 환자에게 있어서, RET 약물에 대한 반응을 예측하는데 사용하기에 특히 적절하다.

다른 구체예에서, 본 발명은 RET에 단독 의존성 또는 부분 의존성인 종양 환자에 있어서, RET 약물 치료에 대한 후보인 환자가 상기 치료에 반응할 가능성을 예측하는데 사용되기에 특히 적절하다. 일 구체예에서, 본 발명은 돌연변이 RET에 대하여 단독 의존성 또는 일부 의존성인 종양 환자에게 있어서, RET 약물 치료에 대한 후보인 환자가 상기 치료에 반응할 가능성을 예측하는데 특히 적절하다. 이러한 종양은 예를 들어, 갑상선 암종을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 갑상선 수질암종, 부신샘 종양(예를 들어, 크롬친화세포종), 폐암(특히 소세포성 폐암), 유두 갑상선암, 중피종 및 결장직장암으로부터 선택되는 종양 환자에 있어서, RET 약물 치료에 대한 후보인 환자가 상기 치료에 반응할 가능성을 예측하는데 사용되기에 특히 적절하다. 다른 구체예에서, 본 발명은 갑상선 수질암종, 부신샘 종양(예를 들어, 크롬친화세포종) 및 폐암(특히, 소세포성 폐암)으로부터 선택되는 종양 환자에 있어서, RET 약물 치료에 대한 후보인 환자가 상기 치료에 반응할 가능성을 예측하는데 사용되기에 특히 적절하다.

본 발명의 일 구체예에서는, 이상에서 전술된 바와 같은 방법을 제공하며, 이때 RET상의 핵산 돌연변이를 검출하고 이로써, RET 서열을 확인하는 방법은 시퀀싱, WAVE 분석, 증폭 불응 돌연변이 시스템(ARMS) 및 제한효소 단편 길이 다형 성(RFLP)으로부터 선택된다. 하나의 염기만이 다른 주형 서열의 선택적인 증폭 방법을 개시 및 청구하고 있는 유럽 특허 공개 공보 0332435호에 ARMS가 개시되어 있으며, 이의 내용은 여기 참고적으로 포함되며, 상기 방법은 오늘날 흔히 ARMS라고 불린다. RFLP는 Zhong에 의해 개시되었다(Zhong et al. 2006 Clinica Chimica Acta: 364, 205-208). 본 발명의 일 구체예에서, 이상에서 기술한 바와 같은 방법을 제공하며, 환자로부터 얻어진 샘플중의 RET 서열을 확인하기 위한 방법은, 증폭 불응 돌연변이 시스템, 제한효소 단편 길이 다형성 또는 WAVE 분석 중 어느 하나로부터 선택된다. 본 발명의 일 구체예에서는, 이상에서 기술된 바와 같은 방법을 제공하며, 이때 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열을 확인하기 위한 방법은 증폭 불응 돌연변이 시스템이다. 일 구체예에서, ARMS는 아가로스 겔, 시퀀싱 겔 또는 실시간 PCR의 사용을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, ARMS는 실시간 PCR의 사용을 포함한다. ARMS 분석은 반응에서 DNA의 존재를 검출하는 두번째 PCR 반응과 복합화(multiplex)됨으로써, 성공적인 PCR을 나타낼 수 있다. TaqMan^TM기술은 다른 형광성 태크로 라벨링된 TaqMan^TM프로브를 이용한 양 반응의 PCR 생성물을 검출하는데 사용될 수 있다. 돌연변이를 검출하는데 있어 시퀀싱 또는 RFLP보다 ARMS를 이용하는 것의 장점은 ARMS가 빠른 단일 단계 분석으로, 적은 공정과 데이터 분석이 요구되고, ARMS는 야생형 폴리뉴클레오티드의 백그라운드(background)에 대하여 샘플의 돌연변이를 검출할 수 있다는 것이다.

본 발명의 일 양태에서는, 서열번호 1에서 보이는 105번 위치에서 RET 서열 을 인식할 수 있는 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머를 사용하는 것을 포함하여, 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 본 발명의 일 구체예에서는, 서열번호 1에서 보이는 105번 위치를 포함하는 RET 서열의 영역을 증폭하는데 최적화된 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머 및 ARMS 역방향 프라이머를 사용하는 것을 포함하여, 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열을 확인하는 방법을 제공한다. 당업자는 "증폭하기에 최적화된"이 순방향 프라이머 및 역방향 프라이머의 가장 적당한 길이 및 위치를 결정하는 단계를 포함하는 것을 이해할 것이다. 일 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머 및 ARMS 역방향 프라이머는 500 염기 미만의 영역을 증폭하는데 최적화되어 있다. 일 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머 및 ARMS 역방향 프라이머는 250 염기 미만의 영역을 증폭하기에 최적화되어 있다. 일 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머 및 ARMS 역방향 프라이머는 200 염기 미만의 영역을 증폭하기에 최적화되어 있다. 일 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머 및 ARMS 역방향 프라이머는 100 염기 초과의 영역을 증폭하기에 최적화되어 있다.

일 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 서열번호 1에서 정의된 105번 위치에서 RET 서열을 인식할 수 있다. 일 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 서열번호 3에 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 서열번호 3을 포함한다. 추가 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 서열번호 3으로 이루어져 있다.

일 구체예에서, ARMS 역방향 프라이머는 서열번호 4에서 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 일 구체예에서, ARMS 역방향 프라이머는 서열번호 4를 포함한다. 일 구체예에서, ARMS는 서열번호 4로 이루어져 있다.

잠금 핵산(Locked Nucleic Acid (LNA)) 올리고뉴클레오티드는 리보스의 2'-산소를 4'-탄소에 연결하는 메틸렌 브릿지를 포함한다. 이 브릿지에 의해 잠금 3'-엔도 구조가 형성되며, 이로써 리보스의 구조적 가요성(flexibility)이 감소되며, 포스페이트 골격(backbone)의 국소 조직화가 증가된다. Braasch 및 Corey는 LNA/DNA 하이브리드의 특성에 대해 고찰하였다(Braasch and Corey, 2001, Chemistry & Biology 8,1-7).

여러 연구들은, LNA를 포함하는 프라이머가 상보적인 DNA 서열에 대한 향상된 친화성을 가짐을 보고하고 있다. 단일 LNA 염기의 혼입은 동일한 길이 및 서열을 갖는 DNA: DNA 복합체와 비교시, 융점(Tm)이 41℃까지 상승될 수 있게 하고, 9.6℃까지 Tm 값을 상승시킬수도 있다. Braasch 및 Corey는 LNA 염기를 포함하는 경우가 10 염기보다 짧은 올리고뉴클레오티드에 대하여 가장 큰 효과를 가질 것을 제안한다.

PCR 프라이머의 고안에 있어 LNA의 사용에 대한 의미에 대해서도 보고되어 왔다(Latorra, Arar and Hurley, 2003, Molecular and Cellular Probes 17, 253-259). 확고한 프라이머 고안에의 규칙은 정립되지는 않았으나, PCR 프라이머상의 LNA 치환의 최적화는 복잡하며, 수, 위치 및 서열 내용에 따라 달라졌다는 점이 보 고 되었다. Ugozolli 등(Ugozolli, Latorra, Pucket, Arar and Hamby, 2004, Analytical Biochemistry 324, 143-152)은 5' 뉴클라아제 분석을 이용한 실시간 PCR로 SNP을 검출하기 위해 LNA 프로브의 사용을 기술하였다. Latorra 등(Latorra, Campbell, Wolter and Hurley, 2003, Human Mutant 22, 79-85)은 대립형질 특이 프라이머로서, 3'-말단과 3'-말단에 인접한 위치에서 LNA 염기를 포함하는 일련의 프라이머를 합성하였다. 미스매치된 LNA 서열로부터의 프라이밍은 DNA 프라이머에 비례하여 감소됨에도 불구하고, 개별 반응에서의 최적화가 요구된다.

일 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 하나 이상의 표준 DNA 염기가 LNA 염기로 치환된 서열을 포함한다. 일 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 서열번호 9에서 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 서열번호 9를 포함한다. 추가 구체예에서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 서열번호 9로 이루어진다.

일 구체예에서는, ARMS 분석에서, 이상에서 기술된, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머와 ARMS 역방향 프라이머의 사용으로 얻은 증폭 생성물과 결합가능한 ARMS 프로브를 제공한다. 일 구체예에서, ARMS 프로브는 서열번호 5에서 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, ARMS 프로브는 서열번호 5를 포함한다. 추가 구체예에서, ARMS 프로브는 서열번호 5로 이루어진다. 일 구체예에서, ARMS 프로브는 하나 이상의 표준 DNA 염기가 LNA 염기로 치환된 서열을 포함한다. 일 구체예에서, ARMS 프로브는 서열번호 10에서 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, ARMS 프로브는 서열번호 10을 포함한다. 추가 구체예에서, ARMS 프로브는 서열번호 10으로 이루어진다. 일 구체예에서, ARMS 프로브는 5' 말단에 Yakima Yellow^TM 형광성 태그를 포함한다. 일 구체예에서, ARMS 프로브는 3' 말단에 BHQ^TM 켄처(quencher)를 포함한다. 당업자는 프로브가 증폭 생성물에 결합되는 (이로인해 프로브의 서열에 상보적인) 위치가 증폭된 생성물을 확인하는 순방향 및 역방향 프라이머에 의해 정해진 경계에 의해서만 제한되는 것을 인식할 것이다.

대조 프로브는 ARMS 분석이 의도하는 대로 작동되는지 확인하고, ARMS 분석에 사용되는 샘플중 DNA가 존재하는지를 확인하기 위해 사용된다. 당업자는 대조 프로브가 임의로 선택된 유전자를 타겟으로 할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일 구체예에서, 대조 순방향 프라이머는 서열번호 6에 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 대조 순방향 프라이머는 서열번호 6을 포함한다. 추가 구체예에서, 대조 역방향 프라이머는 서열번호 6으로 이루어진다. 일 구체예에서, 대조 역방향 프라이머는 서열번호 7에서 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 대조 역방향 프로브는 서열번호 7를 포함한다. 추가 구체예에서, 대조 역방향 프라이머는 서열번호 7로 이루어진다. 일 구체예에서, 대조 프로브는 서열번호 8에서 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 대조 프로브는 서열번호 8을 포함한다. 추가 구체예에서, 대조 프로브는 서열번호 8로 이루어진다. 일 구체예에서, 대조 프로브는 하나 이상의 표준 DNA 염기가 LNA 염기로 치환된 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 대조 프로브는 서열번호 11에서 개시된 서열과 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 동일한 서열을 포함한다. 다른 구체예에서, 대조 프로브는 서열번호 11을 포함한다. 추가 구체예에서, 대조 프로브는 서열번호 11로 이루어진다. 일 구체예에서, 대조 프로브는 5' 말단에 Cy^TM-5 형광성 태그를 포함한다. 일 구체예에서, 대조 프로브는 3' 말단에 ElleQuencher^TM 켄처를 포함한다.

대조 유전자는 α1 안티트립신(antitrypsin)이다. Yakima Yellow 및 Cy^TM-5 는 형광성 태그이고, BHQ (Black Hole Quencher^TM) 및 ElleQuencher는 켄처이다.

굵게 밑줄 표시된 염기들은 미스매치 위치를 나타낸다. LNA 치환은 '+', 예를 들어, +C, +A, +T 및 +G로 나타내었다.

본 발명의 다른 양태에서, 이상에서 기술된 바와 같은 방법을 제공하며, 이때 RET 서열을 확인하는 방법은 보관된 종양 절편이나 기타 임상 물질에서 추출한 RET mRNA의 역전사에 의해 생성된 cDNA 서열을 확인하는 단계를 포함한다. 포르말린 고정 조직으로부터의 RNA 추출은 [Bock et al., 2001 Anaylytical Biochemistry295 116-117]에서 기술되고, 비고정된 조직으로부터의 RNA 추출을 위한 방법 및 역전사, PCR 증폭 및 시퀀싱에 의한 cDNA 생성 프로토콜은 [Sambroock, J. and Russell, D.W., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2003]에 기술되어 있다.

본 발명의 다른 양태에서는, 이상에서 기술된 바와 같은 방법을 제공하며, 이때 RET 서열을 확인하기 위한 방법은 RET 유전자의 개개 액손을 증폭하고, Cel I으로 절단된 개별 액손을 헤테로듀플렉스(heteroduplex) 어닐링하는 것을 포함한다(Crepin et al., 2006 Endocrinology: 36, 369-376; and Marsh et al., 2001 Neoplasia: 3, 236-244에 기술됨).

다른 양태에서, 본 발명은 서열번호 1에서 정의된 다음 위치에서, 다음 핵산 염기가 105번 위치에서 시토신을 포함하는 돌연변이 인간 RET 폴리뉴클레오티드, 또는 105번 위치를 포함하는 단편인 경우, 20개 이상의 핵산 염기를 포함하는 이의 단편을 제공한다.

추가 양태에서, 본 발명은 서열번호 2에서 정의된 다음 위치에서, 다음 아미노산 잔기가 918번 위치에서의 트레오닌을 포함하는 돌연변이 인간 RET 폴리펩타이드, 또는 918번 위치를 포함하는 단편인 경우, 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 이의 단편을 제공한다.

다른 양태에서, 돌연변이 RET 유전자에 의해 암호화되는 mRNA상의 RET 서열을 확인하는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에서는, 본 명세서에 기술된 방법을 제공하며, 이때 RET 서열을 확인하는 방법은 예를 들어, 한명의 환자로부터 얻은 슬라이드를 이용할 수 있는 면역조직화학계 분석, 또는 조직 마이크로어레이(Mayr et al., 2006 American Journal of Clinical Pathology: 126, 101-109; Zheng et al., 2006 Anticancer Research: 26, 2353-2360) 또는 선택적인 프로테오믹스 방법의 적용에서 선택되며, 마지막 방법은 세포 용해(lysis), 단백질 분해, 겔상의 단백질 단편 분리, 돌연변이된 아미노산을 포함하는 펩타이드 획득 및 질량 분석기로 펩타이드 분석을 포함할 수 있다.

다른 양태에서, 본 발명은 이상에서 정의된 바와 같이, 돌연변이 인간 RET 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항체를 제공한다.

본 발명의 추가 양태에서, 서열번호 1에서 정의된 105번 위치에서 RET의 돌연변이를 검출할 수 있는 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머, 및 선택적으로 ARMS 역방향 프라이머, 및 선택적으로 사용을 위한 지시서를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 본 방법의 일 구체예에서, 서열번호 1에서 정의된 105번 위치에서 RET 서열을 인식할 수 있고, 하나 이상의 LNA 염기를 포함하는 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머, 및 선택적으로 ARMS 역방향 프라이머, 및 선택적으로 사용을 위한 지시서를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 일 구체예에서, 진단키트는 RET 약물 치료에 대한 후보인 환자가 상기 치료에 반응할 가능성을 예측하는 방법에 사용될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 진단 키트는 RET 약물 치료에 대한 후보인 환자를 상기 치료에 대해 선별하는데 사용될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 진단 키트는 RET 약물 치료에 대한 후보 환자의 상기 치료에 대한 적합성을 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 추가 양태에서, 이상에서 정의된 돌연변이 인간 RET 폴리펩타이드에 대해 특이적인 항체, 및 선택적으로 사용을 위한 지시서를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 일 구체예에서, 진단 키트는 RET 약물 치료 후보 환자가 상기 치료에 대하여 반응할 가능성을 예측하는 방법에 사용될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 진단 키트는 RET 약물 치료에 대한, 상기 치료 후보 환자를 선별하는데 사용될 수 있다. 대안적인 구체예에서, 진단 키트는 RET 약물 치료 후보 환자의 상기 치료에 대한 적합성을 측정하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 추가 양태에서, 이상에서 기술된 ARMS 프라이머 및 프로브는 야생형 또는 돌연변이 RET를 발현하는 세포주 패널에서 RET 서열을 확인하는데 사용될 수 있다. 세포주가 야생형 또는 돌연변이 RET를 발현하는지에 대한 지식은 야생형 수용체와 관련된 표현형에 대한 활성을 갖는, 돌연변이 RET 표현형에 특이성을 갖는 신규한 RET 억제제 또는 신규한 억제제를 확인하는 스크리닝 프로그램에 사용될 수 있다. 돌연변이 RET 발현하는 세포주 패널의 유용성은 RET를 통해 활성화된 시그널링 경로를 한정하는데 도움을 주며, 치료적 개입을 위한 추가적인 표적을 확인하도록 유도할 것이라는 점이다.

다른 양태에서, 본 발명은 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열에서 서열번호 1에서 정의된 105번 위치 및/또는 서열번호 2에서 정의된 918번 위치를 확인하는 단계, 및 상기 분석으로 얻은 데이타를 요약하여 보고서를 작성하는 단계를 포함하여 환자에 대한 개인화된 게놈 프로파일의 제조 방법을 제공한다.

특정 구체예에서, 이상에서 기술된 방법은 RET 약물의 약리 유전학을 평가하는데 사용될 수 있다. 약리 유전학은 약물에 대하여 다른 반응을 야기하는 유전적인 다양성에 대한 학문이다. 환자로부터 얻은 샘플의 RET 서열을 확인하고, RET 약물에 대한 환자의 반응을 분석함으로써, RET 약물의 약리 유전학이 설명될 수 있다.

일 구체예에서, RET 약물 치료에 대한 후보 환자가 상기 치료에 대하여 반응할 가능성을 예측하는 방법은 RET 약물 치료에 대한 종양 환자, 또는 환자군을 선별하는데 사용될 수 있다.

일 구체예에서, RET 약물 치료 후보 환자가 상기 치료에 대하여 반응할 가능성을 예측하는 방법은 RET 약물 치료에 대한 종양 환자, 또는 환자군의 반응성을 예측하는데 사용될 수 있다.

환자로부터 얻은 샘플은 종양으로부터 유래된 물질, 예를 들어, 순환 종양 세포(circulating tumor cell) 또는 DNA를 포함하는 혈액 샘플을 포함하는 임의의 종양 조직 또는 임의의 생물학적 샘플일 수 있다. 일 구체예에서, 혈액 샘플은 전혈, 혈장, 혈청 또는 펠렛화 혈액(pelleted blood)일 수 있다. 일 구체예에서, 종양 샘플은 종양 조직 샘플이다. 종양 조직 샘플은 고정 또는 비고정형 샘플일 수 있다. 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 종양 또는 종양이 의심되는 소량의 샘플을 얻는 최소한의 침습적인 기술을 이용하여 얻고, 이 샘플로부터 RET 서열을 확인한다. 다른 구체예에서, 생물학적 샘플은 이상에서 기술된 바와 같이, 임의의 돌연변이를 테스트할 수 있는 단일 샘플, 또는 이상에서 기술된 바와 같은 임의의 돌연변이를 테스트할 수 있는 여러 샘플을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따라, RET 약물의 적절한 투여량을 확인하는데 있어서, 이상에서 기술된 방법의 결과를 이용하는 방법을 제공한다. 예를 들어, RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 갖을 것으로 예측되는 환자에 대한 지식을 RET 약물의 적절한 투여량을 결정하는데 사용할 수 있다. 치료 약물 용량을 계산하는 것은 의약, 약동학 및 약리 유전학의 고려사항을 요구하는 복잡한 업무이다. 당해 환자에 대한 치료 약물 용량은 주치의에 의해, 질병의 중증도 및 유형, 체중, 성별, 식이, 투여 시간 및 경로, 다른 약제 및 다른 관련된 임상 요소를 포함하는 약물 작용을 변화시키는 것으로 알려진 다양한 인자를 고려하여 결정될 것이다. 치료 유효량은 시험관내 또는 생체내 방법에 의해 확인될 수 있다.

RET 약물은 RET 억제제이다. RET 억제제는 RET 활성을 억제하는 제제이다. 상기 제제는 항체 또는 소분자일 수 있다. 일 구체예에서, RET 억제제는 RET 티로신 키나아제 억제제이다. RET 억제제는 다른 티로신 키나아제, 예를 들어, VEGFR2 및/또는 EGFR의 활성을 억제하는 것과 같이, 다른 단백질에 대항하는 활성을 가질 수 있다. 일 구체예에서, RET 억제제는 EGFR 티로신 키나아제 활성을 또한 억제한다. 일 구체예에서, RET 억제제는 VEGFR2 티로신 키나아제 활성을 또한 억제한다. 일 구체예에서, RET 억제제는 또한 VEGFR2 및 EGFR 티로신 키나아제 활성을 또한 억제한다.

RET, EGFR 또는 VEGFR2 티로신 키나아제 억제제는 반데타니브, 세디라디브(AZD2171, Recentin^TM(Wedge et al., 2005 Cancer Research: 65, 4389-4400)), 제피티니브, 엘로티니브, 수니티니브(SU11248, Sutent® Pfizer), SU14813(Pfizer), 바타라니브(Novartis), 소라페니브(BAY43-9006, Nexavar, Bayer), XL-647(Exelixis), XL-999(Exelixis), AG-013736(Pfizer), 모테사니브(AMG706, Amgen), BIBF1120(Boehringer), TSU68(Taiho), GW786034, AEE788(Novartis), CP-547632(Pfizer), KRN 951(Kirin), CHIR258(Chiron), CEP-7055(Cephalon), OSI-930(OSI Pharmaceuticals), ABT-869(Abbott), E7080(Eisai), ZK-304709(Schering), BAY57-9352(Bayer), L-21649(Merck), BMS582664(BMS), XL-880(Exelixis), XL-184(Exelixis) 또는 XL-820(Exelixis)를 포함한다.

일 구체예에서, RET 억제제는 반데타니브, 세디라니브, 수니티니브, 모테사니브 또는 항체로부터 선택된다. 일 구체예에서, RET 억제제는 반데타니브이다. 일 구체예에서, RET 억제제는 세디라니브이다. 일 구체예에서, RET 억제제는 모테사니브이다. 일 구체예에서, RET 억제제는 수니티니브이다. 일 구체예에서, RET 억제제는 항체이다.

RET 약물의 유효량은 예를 들어, 치료 목적, 투여 경로 및 환자 상태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 임상의는 최적의 치료 효과를 얻기 위해 필요한 투여 경로의 조정 및 용량을 적정하는 것이 바람직하다. 통상적인 일일 용량 또는 매주, 격주 또는 매달과 같은 간헐적인 용량은 위에서 언급된 요소에 따라 약 0.5 mg 내지 300 mg, 500 mg, 1000 mg 또는 1200 mg 이상의 범위일 수 있다.

본 연구자들은 RET 약물이 다른 약물과의 병용요법 또는 단일요법으로 사용될 수 있음을 예상하고 있다. 본 발명은 보조 치료요법 또는 1차 치료요법으로도 유용하다.

일 구체예에서, 본 발명의 방법은 이상에서 기술된 방법에 따라, RET 약물 치료에 대한 반응을 예측하거나, 선별된 환자에 대한 RET 약물의 투여를 추가적으로 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기에 기술된 방법에 따라 RET 약물 치료에 대해 반응할 것으로 예측되거나, 선별된 환자 또는 환자군 치료용 약제의 제조에서의 RET 약물의 용도를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 명세서에 기술된 방법에 따라 RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 갖을 것으로 예측되거나, 선별된 환자 또는 환자군을 치료하는 방법을 제공하며, 이는 상기 환자(들)에 RET 약물을 투여하는 단계를 포함한다.

본 발명의 일 구체예에서, 하기를 포함하는 RET 약물 치료 후보인 환자를 치료하는 방법을 제공한다:

(i) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 105번 위치에서 티민이 아닌지를 확인하는 단계; 또는

(ii) 환자로부터 얻어진 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된 918번 위치에서 메티오닌이 아닌지를 확인하는 단계; 및

RET 약물의 유효량을 투여하는 단계.

(i) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 다음 위치, 105번 위치에서 티민이 아닌지를 확인하는 단계; 또는

(ii) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된 다음 위치, 918번 위치에서 메티오닌이 아닌지를 확인하는 단계; 및

RET 약물의 유효량을 투여하는 단계.

(i) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 다음 위치, 105번 위치에서 시토신인지를 확인하는 단계; 또는

(ii) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된 다음 위치, 918번 위치에서 트레오닌인지를 확인하는 단계, 및

RET 약물의 유효량을 투여하는 단계.

(i) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에서 정의된 105번 위치에서 시토신인지를 확인하는 단계; 또는

(ii) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에서 정의된 918번 위치에서 트레오닌인지를 확인하는 단계; 및

RET 약물의 유효량을 투여하는 단계.

본 발명은 다음의 비제한적인 실시예에 의해서 설명된다.

도 1은 통상적인 DNA ARMS 프라이머를 이용한 M918T RET 돌연변이의 검출을 보여준다. 오픈 다이아몬드는 돌연변이 DNA의 1000 카피를 얻은 신호를 보여주며, 검은 사각형은 야생형 DNA의 10000 카피를 얻은 신호를 보여주고, 검은 다이아몬드는 야생형 DNA의 1000 카피를 얻은 신호를 보여준다.

도 2는 LNA 변형된 ARMS 프라이머를 이용한 M918T RET 돌연변이의 검출을 보여준다. 검은 삼각형은 돌연변이 DNA의 1000 카피를 얻은 신호를 보여주고, 검은 사각형은 야생형 DNA의 1000 카피를 얻은 신호를 보여주며, 검은 원은 야생형 DNA의 10000 카피를 얻은 신호를 보여준다.

일반적인 분자 생물학 기술은 ["Current Protocols in Molecular Biology Volumes 1-3, edited by F M Asubel, R Brent and R E Kingston; published by John Wiley, 1998] 및 [Sambrook, J. and Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001]에 기술되어 있다.

실시예 1 - 산발성 갑상선 수질 종양(sporatic medullary thyroid tumor) 절편의 돌연변이 동정

종양 절편은 진단 또는 수술시에 환자로부터 얻었다. 본 절편을 포르말린으 로 고정하고, 파라핀 왁스에 함몰(embeded)시켰다. 준비된 샘플을 5-20 micron의 두께로 다양한 절편으로 잘랐다. 종양을 포함하는 절편 영역은 마스터 슬라이드의 조직병리로 동정하고, 종양 물질은 [Lynch et al. 2004 New England Journal of Medicine: 350 2129-2139]에서 기술된 바와 같이, 동일한 종양 샘플로부터 잘라낸인접한 슬라이드 관련 부위에서 회수하였다. 종양 샘플의 다른 유형은, 예를 들어, 신선한 조직 또는 냉동 조직 또는 순환 종양 세포를 포함할 수 있다. 이러한 샘플을 이용하는 기술의 세부사항은 [Sambrook, J. and Russell, D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, the third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2001]에서 찾을 수 있다.

실시예 2 - 슬라이드 단편으로부터의 DNA 추출

한 덩어리를 한 절편의 추출물로부터 얻었다. 한 절편상의 조직 병리에 의해 확인된 종양 영역은, 관련 영역을 슬라이드에서 에펜도르프 튜브로 긁어내어 인접한 절편으로부터 분리하였다. 20 micron의 절편으로부터 얻은 물질을 100㎕ 0.5% Tween-20 (Sigma Aldrich)에 재현탁하고, 10분 동안 90℃로 가열한 후, 55℃로 냉각하였다. 프로테인나아제 K (2㎕, 10mg/ml)을 현탁액에 가하고, 용액을 혼합하고, 가끔식 혼합하면서, 3시간동안 55℃에서 배양하였다. Chelex-100^TM(C7901, Sigma)(Tris EDTA 중 100㎕, 5%(w/v))를 가하고, 현탁액을 10분 동안 99℃에서 배양하였다. 추출한 DNA를 15분 동안 10500 x g 에서 원심분리하여 회수하고, 왁스층 아래 형성된 용액을 클린 튜브로 옮겼다. 용액에 클로로포름(100ml)을 가하기 전 에, 45℃로 가열하였다. 현탁액을 15분 동안 추가로 10500 x g 에서 원심분리하기 전에, 혼합한 후 DNA를 에탄올 침전에 의해 상부 수성층으로부터 회수하였다. DNA 펠렛을 70% 에탄올에서 린스하고, 원심분리 펄스(pulse)로 회수하고, 공기 건조 및 물(50㎕)에 용해하였다.

실시예 3 - ARMS 프라이머를 이용한 RET상의 Met918Thr 돌연변이의 검출용 증폭 불응 돌연변이 시스템

증폭 불응 돌연변이 시스템 분석(ARMS)은 정상 RNA의 백그라운드와 비교하여, RET 유전자상의 뉴클레오티드 염기 변화의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 각 ARMS 분석은 주어진 돌연변이에 대하여 특이적으로, 예를 들어, 당해 위치의 한 염기에서부터 다른 염기의 변화를 검출하기 위해 고안되어 있다. 본 분석은 반응에서의 DNA의 존재를 검출하는 두번째 PCT 반응과 복합화되어, 성공적인 PCT를 나타낸다. TaqMan^TM기술은 다른 형광성 태그로 라벨링된 TaqMan^TM프로브를 이용하여 양 반응의 PCR 생성물을 검출하는데 이용된다.

PCR은 돌연변이 및 야생형 DNA의 다앙한 비율 및 유입 DNA의 다양한 농도를 포함하는 게놈 DNA 5㎕에서 수행된다. 각 PCR에는 총 반응 부피 25㎕가 사용된다. Amplitaq 골드 DNA 폴리머라제(N80080246, ABI) 1 유닛은 버퍼(최종 버퍼 조성 15mM Tris-HCl Ph 8.3, 50 mM KCl) 중 3.5 mM 염화마그네슘, 200 ㎕ dNTPs(데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트) 및 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머와 ARMS 역방향 프라이머 단쇄(표 1 참조) 각각 1.0㎕의 최종 농도로 각 반응에 사용되었다. TaqMan^TM프로브(Eurogentech)을 최종 농도 0.5 ㎕로 각 반응에 가하였다. 주기 조건은 다음과 같았다: 실시간 PCR 기기(예를 들어, Stratagene Mx4000 또는 ABI 7900)에서 10분 동안 95℃ 후, 45초 동안 94℃, 45초 동안 60℃, 1분 동안 72℃의 40주기. 돌연변이 10 카피는 야생형 DNA의 1000 카피의 백그라운드에서 검출될 수 있다.

실시예 4 - ARMS LNA 프라이머를 이용한 임상 샘플로부터 얻은 RET의 Met918Thr 돌연변이의 검출용 증폭 불응 돌연변이 시스템

산발성 갑상선 수질암에서의 반데타니브의 활성을 측정하기 위해, 임상 시험 참여환자로부터 포르말린 고정 조직 샘플을 얻었다.

DNA는 실시예 2에서 기술된 방식으로 추출하였다. 한명의 환자로부터 얻은 두개의 샘플을 포함하여, 19개의 샘플이 분석을 위해 사용되었다. 모든 샘플을 3번씩 분석하였고, 두 독립적인 오퍼레이터에 의해 기록되었다.

증폭 불응 돌연변이 시스템 분석(ARMS)은 정상 DNA의 백그라운드와 비교하여, RET 유전자상의 뉴클레오티드 염기 변화의 존재를 검출하는데 사용된다. 본 분석은 반응에서의 DNA의 존재를 검출하는 두번째 PCR 반응과 복합화되어, 성공적인 PCR을 나타낸다. TaqMan^TM기술은 다른 형광성 태그로 라벨링화된 TaqMan^TM프로브를 이용하여 양 반응의 PCR 생성물을 검출하는데 사용되었다.

PCR은 돌연변이 및 야생형 DNA의 다양한 비율 및 유입 DNA의 다양한 농도를 포함하는 게놈 DNA에서 수행되었다. 각 PCR에 대하여 25㎕의 총 반응 부피가 사용 되었다. Amplitaq 골드 DNA 폴리머라제 1 유닛은 버퍼(최종 버퍼 조성 15mM Tris-HCl Ph 8.3, 50mM KCl) 중 3.5 mM 염화마그네슘, 200mM dNTPs 및 ARMS LNA 돌연변이 순방향 프라이머와 ARMS 역방향 프라이머 단쇄(표 1 참조) 각각 1.0 μM의 최종 농도로 각 반응에서 사용되었다. TaqMan^TM프로브는 0.5 μM의 최종농도에서 각 반응에 가하여졌다. 주기 조건은 다음과 같다: 실시간 PCR 기기(예를 들어, Stratagene Mx4000 또는 ABI 7900)에서, 10분 동안 95℃ 후, 45초 동안 94℃, 1분 동안 60℃, 45초 동안 72℃의 40 주기.

여섯개의 샘플은 낮은 DNA 농도로 인해 기록이 불가능하였다. 돌연변이는 산출가능한 샘플 중 8/13에서 검출되어, 61.5%의 돌연변이 빈도를 나타냈다. 돌연변이 상태를 확인하기 위해, 모든 샘플에서 시퀀싱이 이루어졌다; 하지만 서열 데이타는 DNA 농도 > 50 카피인 샘플에서만 얻을 수 있었기 때문에, 4개의 샘플만이 918번 코돈에서 해독가능한 서열을 제공하였다. 시퀀싱에 의해 얻어진 결과는 ARMS 분석에 의한 데이터와 완전히 일치하였다.

두 샘플(-a, -b) 은 환자 E0002001로부터 얻었다.

실시예 5 - M918T RET 돌연변이를 검출하기 위한 ARMS 분석에서의 LNA 프라이머와 비교한 통상의 DNA 프라이머의 특이성 비교

M918T RET 돌연변이를 검출하기 위해 고안된 ARMS 프라이머가 야생형 DNA로부터 신호를 생성할 수 있는 역치를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. PCR은 유입 DNA의 다른 농도를 나타내는 돌연변이 게놈 DNA 또는 야생형 게놈 DNA 5 ㎕에서 수행하였다. 각 PCR 당 총 반응 부피 25㎕가 사용되었다. Amplitaq 골드 DNA 폴리머라제 1 유닛은 버퍼(최종 버퍼 조성 15 mM Tris-HCl Ph 8.3, 50 mM KCl) 중 3.5 mM 염화마그네슘, 200mM dNTPs 및 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머와 ARMS 역방향 프라이머 단쇄(표 1 참조) 각각 1 ml의 최종 농도로 각 반응에 사용되었다. TaqMan^TM프로브는 최종 농도 0.5 μM로 각 반응에 가하여졌다. 주기 조건은 다음과 같다: 실시간 PCR 기기(예를 들어, Stratagene Mx4000 또는 ABI 7900)에서, 10분 동안 95℃ 이후, 45초 동안 94℃, 45초 동안 60℃, 1분 동안 72℃의 40주기까지.

통상의 DNA ARMS 프라이머를 이용한 29주기에서의 돌연변이 DNA의 1000 카피로부터 신호가 생성된다(도 1). 그러나, 야생형 DNA의 1000 또는 10000 카피를 포함하는 샘플에서부터도 신호가 발생된다. 야생형 DNA로부터의 신호는 각각 35 및 32 주기에서 발생하지만, 야생형 DNA로부터 신호를 얻을 가능성은, 고정된 종양 샘플이 정상 및 종양 조직의 혼합물을 포함하는 것이 일반적인, 임상 세팅에서는 통상적인 DNA ARMS 프라이머의 사용을 제한할 수 있다.

유사한 실험이 LNA 변형 프라이머를 이용하여 수행되었다. 이 실험에서, 신호는 31주기에서의 돌연변이 DNA의 1000 카피를 포함하는 샘플에서부터 생성되지만, 분석이 45 주기까지 확장된 경우일지라도, 야생형 DNA의 1000 또는 10000 카피를 포함하는 샘플로부터도 신호는 생성되지 않았다(도 2).

실시예 6 - 치료 환자의 선별

종양 샘플중의 RET 유전자의 돌연변이의 검출은 단일치료요법 또는 병용치료요법으로서, 반데나티브 또는 RET 티로신 키나아제의 다른 억제제 치료에 대한 후보인 환자의 선별을 향상하기 위해 사용될 수 있고, 이로 인해 반데타니브 또는 RET 티로신 키나아제의 다른 억제제에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측할 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> AstraZeneca AB <120> Method <130> 102477 CCH Aug07 <160> 11 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 320 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 gatagggcct ggccttctcc tttacccctc cttcctagag agttagagta acttcaatgt 60 ctttattcca tcttctcttt agggtcggat tccagttaaa tggatggcaa ttgaatccct 120 ttttgatcat atctacacca cgcaaagtga tgtgtaagtg tgggtgttgc tctcttgggg 180 tggaggttac agaaacaccc ttatacatgt agtggggcca cgacgcccgt ctgtgcagct 240 tggccaggga attgcactgg ccctgagcac ctgtctgcag tgctagccct ctgcaatgac 300 cccctcactg aggggccttc 320 <210> 2 <211> 1114 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Ala Lys Ala Thr Ser Gly Ala Ala Gly Leu Arg Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Lys Val Ala Leu Gly Leu Tyr Phe Ser 20 25 30 Arg Asp Ala Tyr Trp Glu Lys Leu Tyr Val Asp Gln Ala Ala Gly Thr 35 40 45 Pro Leu Leu Tyr Val His Ala Leu Arg Asp Ala Pro Glu Glu Val Pro 50 55 60 Ser Phe Arg Leu Gly Gln His Leu Tyr Gly Thr Tyr Arg Thr Arg Leu 65 70 75 80 His Glu Asn Asn Trp Ile Cys Ile Gln Glu Asp Thr Gly Leu Leu Tyr 85 90 95 Leu Asn Arg Ser Leu Asp His Ser Ser Trp Glu Lys Leu Ser Val Arg 100 105 110 Asn Arg Gly Phe Pro Leu Leu Thr Val Tyr Leu Lys Val Phe Leu Ser 115 120 125 Pro Thr Ser Leu Arg Glu Gly Glu Cys Gln Trp Pro Gly Cys Ala Arg 130 135 140 Val Tyr Phe Ser Phe Phe Asn Thr Ser Phe Pro Ala Cys Ser Ser Leu 145 150 155 160 Lys Pro Arg Glu Leu Cys Phe Pro Glu Thr Arg Pro Ser Phe Arg Ile 165 170 175 Arg Glu Asn Arg Pro Pro Gly Thr Phe His Gln Phe Arg Leu Leu Pro 180 185 190 Val Gln Phe Leu Cys Pro Asn Ile Ser Val Ala Tyr Arg Leu Leu Glu 195 200 205 Gly Glu Gly Leu Pro Phe Arg Cys Ala Pro Asp Ser Leu Glu Val Ser 210 215 220 Thr Arg Trp Ala Leu Asp Arg Glu Gln Arg Glu Lys Tyr Glu Leu Val 225 230 235 240 Ala Val Cys Thr Val His Ala Gly Ala Arg Glu Glu Val Val Met Val 245 250 255 Pro Phe Pro Val Thr Val Tyr Asp Glu Asp Asp Ser Ala Pro Thr Phe 260 265 270 Pro Ala Gly Val Asp Thr Ala Ser Ala Val Val Glu Phe Lys Arg Lys 275 280 285 Glu Asp Thr Val Val Ala Thr Leu Arg Val Phe Asp Ala Asp Val Val 290 295 300 Pro Ala Ser Gly Glu Leu Val Arg Arg Tyr Thr Ser Thr Leu Leu Pro 305 310 315 320 Gly Asp Thr Trp Ala Gln Gln Thr Phe Arg Val Glu His Trp Pro Asn 325 330 335 Glu Thr Ser Val Gln Ala Asn Gly Ser Phe Val Arg Ala Thr Val His 340 345 350 Asp Tyr Arg Leu Val Leu Asn Arg Asn Leu Ser Ile Ser Glu Asn Arg 355 360 365 Thr Met Gln Leu Ala Val Leu Val Asn Asp Ser Asp Phe Gln Gly Pro 370 375 380 Gly Ala Gly Val Leu Leu Leu His Phe Asn Val Ser Val Leu Pro Val 385 390 395 400 Ser Leu His Leu Pro Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Val Ser Arg Arg Ala 405 410 415 Arg Arg Phe Ala Gln Ile Gly Lys Val Cys Val Glu Asn Cys Gln Ala 420 425 430 Phe Ser Gly Ile Asn Val Gln Tyr Lys Leu His Ser Ser Gly Ala Asn 435 440 445 Cys Ser Thr Leu Gly Val Val Thr Ser Ala Glu Asp Thr Ser Gly Ile 450 455 460 Leu Phe Val Asn Asp Thr Lys Ala Leu Arg Arg Pro Lys Cys Ala Glu 465 470 475 480 Leu His Tyr Met Val Val Ala Thr Asp Gln Gln Thr Ser Arg Gln Ala 485 490 495 Gln Ala Gln Leu Leu Val Thr Val Glu Gly Ser Tyr Val Ala Glu Glu 500 505 510 Ala Gly Cys Pro Leu Ser Cys Ala Val Ser Lys Arg Arg Leu Glu Cys 515 520 525 Glu Glu Cys Gly Gly Leu Gly Ser Pro Thr Gly Arg Cys Glu Trp Arg 530 535 540 Gln Gly Asp Gly Lys Gly Ile Thr Arg Asn Phe Ser Thr Cys Ser Pro 545 550 555 560 Ser Thr Lys Thr Cys Pro Asp Gly His Cys Asp Val Val Glu Thr Gln 565 570 575 Asp Ile Asn Ile Cys Pro Gln Asp Cys Leu Arg Gly Ser Ile Val Gly 580 585 590 Gly His Glu Pro Gly Glu Pro Arg Gly Ile Lys Ala Gly Tyr Gly Thr 595 600 605 Cys Asn Cys Phe Pro Glu Glu Glu Lys Cys Phe Cys Glu Pro Glu Asp 610 615 620 Ile Gln Asp Pro Leu Cys Asp Glu Leu Cys Arg Thr Val Ile Ala Ala 625 630 635 640 Ala Val Leu Phe Ser Phe Ile Val Ser Val Leu Leu Ser Ala Phe Cys 645 650 655 Ile His Cys Tyr His Lys Phe Ala His Lys Pro Pro Ile Ser Ser Ala 660 665 670 Glu Met Thr Phe Arg Arg Pro Ala Gln Ala Phe Pro Val Ser Tyr Ser 675 680 685 Ser Ser Gly Ala Arg Arg Pro Ser Leu Asp Ser Met Glu Asn Gln Val 690 695 700 Ser Val Asp Ala Phe Lys Ile Leu Glu Asp Pro Lys Trp Glu Phe Pro 705 710 715 720 Arg Lys Asn Leu Val Leu Gly Lys Thr Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly 725 730 735 Lys Val Val Lys Ala Thr Ala Phe His Leu Lys Gly Arg Ala Gly Tyr 740 745 750 Thr Thr Val Ala Val Lys Met Leu Lys Glu Asn Ala Ser Pro Ser Glu 755 760 765 Leu Arg Asp Leu Leu Ser Glu Phe Asn Val Leu Lys Gln Val Asn His 770 775 780 Pro His Val Ile Lys Leu Tyr Gly Ala Cys Ser Gln Asp Gly Pro Leu 785 790 795 800 Leu Leu Ile Val Glu Tyr Ala Lys Tyr Gly Ser Leu Arg Gly Phe Leu 805 810 815 Arg Glu Ser Arg Lys Val Gly Pro Gly Tyr Leu Gly Ser Gly Gly Ser 820 825 830 Arg Asn Ser Ser Ser Leu Asp His Pro Asp Glu Arg Ala Leu Thr Met 835 840 845 Gly Asp Leu Ile Ser Phe Ala Trp Gln Ile Ser Gln Gly Met Gln Tyr 850 855 860 Leu Ala Glu Met Lys Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile 865 870 875 880 Leu Val Ala Glu Gly Arg Lys Met Lys Ile Ser Asp Phe Gly Leu Ser 885 890 895 Arg Asp Val Tyr Glu Glu Asp Ser Tyr Val Lys Arg Ser Gln Gly Arg 900 905 910 Ile Pro Val Lys Trp Met Ala Ile Glu Ser Leu Phe Asp His Ile Tyr 915 920 925 Thr Thr Gln Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Val Leu Leu Trp Glu Ile 930 935 940 Val Thr Leu Gly Gly Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Pro Pro Glu Arg Leu 945 950 955 960 Phe Asn Leu Leu Lys Thr Gly His Arg Met Glu Arg Pro Asp Asn Cys 965 970 975 Ser Glu Glu Met Tyr Arg Leu Met Leu Gln Cys Trp Lys Gln Glu Pro 980 985 990 Asp Lys Arg Pro Val Phe Ala Asp Ile Ser Lys Asp Leu Glu Lys Met 995 1000 1005 Met Val Lys Arg Arg Asp Tyr Leu Asp Leu Ala Ala Ser Thr Pro 1010 1015 1020 Ser Asp Ser Leu Ile Tyr Asp Asp Gly Leu Ser Glu Glu Glu Thr 1025 1030 1035 Pro Leu Val Asp Cys Asn Asn Ala Pro Leu Pro Arg Ala Leu Pro 1040 1045 1050 Ser Thr Trp Ile Glu Asn Lys Leu Tyr Gly Met Ser Asp Pro Asn 1055 1060 1065 Trp Pro Gly Glu Ser Pro Val Pro Leu Thr Arg Ala Asp Gly Thr 1070 1075 1080 Asn Thr Gly Phe Pro Arg Tyr Pro Asn Asp Ser Val Tyr Ala Asn 1085 1090 1095 Trp Met Leu Ser Pro Ser Ala Ala Lys Leu Met Asp Thr Phe Asp 1100 1105 1110 Ser <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 3 ctttagtgtc ggattccagt taaatggtc 29 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 22; PCR Primer <400> 4 tgcaattccc tggccaagct gc 22 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR Primer <400> 5 ctacaccacg caaagtgatg tgtaagtgtg ggtgttgctc 40 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR PRIMER <400> 6 aggacaccga ggaagaggac tt 22 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR PRIMER <400> 7 ggaatcacct tctgtcttca ttt 23 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR PRIMER <400> 8 ccatcttctt cctgcctgat gaggggaaa 29 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR PRIMER <400> 9 tcggattcca gttaaatggt c 21 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> PCR Primer <400> 10 tgatgtgtaa gtgtgggtgt tgctc 25 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> PCR PRIMER <400> 11 ctgcctgatg aggggaa 17

Claims

RET 약물 치료에 대한 후보인 환자가 상기 치료에 대해 반응할 가능성을 예측하기 위한 방법으로서,

환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에 정의된 105번 위치에서 티민이 아닌지를 확인하거나; 또는

환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에 정의된 918번 위치에서 메티오닌이 아닌지를 확인하는 단계를 포함함으로써,

RET 약물에 대한 반응의 증가된 가능성을 예측하는 방법.
제1항에 있어서,

105번 위치는 시토신이거나; 또는

918번 위치는 트레오닌인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 105번 위치는 시토신인 것인 방법.
RET 약물의 약리유전학(pharmacogenetics)을 평가하기 위한 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법의 용도.
RET 약물 치료에 대한 후보인 환자를 치료하는 방법으로서,

(i) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 1에 정의된 105번 위치에서 티민이 아닌지를 확인하는 단계; 또는

(ii) 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열이 서열번호 2에 정의된 918번 위치에서 메티오닌이 아닌지를 확인하는 단계, 및

유효량의 RET 약물을 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법.
제5항에 있어서,

105번 위치는 시토신이거나; 또는

918번 위치는 트레오닌이며,

유효량의 RET 약물을 투여하는 방법.
제5항 또는 제6항에 있어서, 105번 위치는 시토신인 것인 방법.
제3항 또는 제7항에 있어서, 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열을 확인하기 위한 방법은 증폭 불응 돌연변이 시스템(amplification refractory mutation system), 제한효소 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism), 또는 WAVE 분석 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 방법.
제8항에 있어서, 환자로부터 얻은 샘플중의 RET 서열을 확인하기 위한 방법은 증폭 불응 돌연변이 시스템인 것인 방법.
제3항, 또는 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1에 정의된 105번 위치에서 RET 서열을 인식할 수 있는 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
제3항, 또는 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1에 정의된 105번 위치를 포함하는 RET 서열의 영역을 증폭하기에 최적화된 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머 및 ARMS 역방향 프라이머를 사용하는 단계를 포함하는 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, ARMS 돌연변이 순방향 프라이머는 서열번호 9를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, RET 약물은 RET 티로신 키나아제 억제제인 것인 방법.
제13항에 있어서, RET 약물은 반데타니브(vandetanib)인 것인 방법.
제13항에 있어서, RET 약물은 세디라니브(cediranib)인 것인 방법.
서열번호 1에 정의된 105번 위치에서 RET 서열을 인식할 수 있는 ARMS 돌연 변이 순방향 프라이머.
제16항에 있어서, 서열번호 9를 포함하는 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머.
제16항 또는 제17항의 ARMS 돌연변이 순방향 프라이머를 포함하는 진단 키트.