ES2300106T3 - Conjugados de agente de union al surco menor y oligonucleotidos unidos covalentemente. - Google Patents
Conjugados de agente de union al surco menor y oligonucleotidos unidos covalentemente. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2300106T3 ES2300106T3 ES96910723T ES96910723T ES2300106T3 ES 2300106 T3 ES2300106 T3 ES 2300106T3 ES 96910723 T ES96910723 T ES 96910723T ES 96910723 T ES96910723 T ES 96910723T ES 2300106 T3 ES2300106 T3 ES 2300106T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- ring
- group
- minor groove
- carbons
- groups
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
- C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
- C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
- C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
- C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
- C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
- C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
- C07D487/04—Ortho-condensed systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/06—Pyrimidine radicals
- C07H19/073—Pyrimidine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/16—Purine radicals
- C07H19/173—Purine radicals with 2-deoxyribosyl as the saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
- C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
- C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
- C07H19/23—Heterocyclic radicals containing two or more heterocyclic rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, not provided for in groups C07H19/14 - C07H19/22
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
SE UNEN DE FORMA COVALENTE MOLECULAS CONECTORAS DE HENDIDURA MENOR A OLIGONUCLEOTIDOS, CUYA SECUENCIA DE BASES RESULTA COMPLEMENTARIA CON UNA SECUENCIA DIANA DE ARN, ADN MONOCATENARIO O BICATENARIO, O HIBRIDOS DE LOS MISMOS. LOS CONJUGADOS DE CONECTOR DE HENDIDURA MENOR UNIDO DE FORMA COVALENTE A OLIGONUCLEOTIDOS SE UNEN CON FUERZA A LA SECUENCIA DIANA DE LA CADENA COMPLEMENTARIA.
Description
Conjugados de agente de unión al surco menor y
oligonucleótidos unidos covalentemente.
La presente invención se refiere a nuevos
derivados de oligonucleótidos. Más particularmente, la presente
invención se refiere a derivados de oligonucleótidos en los que una
o más moléculas de unión al surco menor están unidas covalentemente
al oligonucleótido. Los conjugados del resto de unión al surco menor
del oligonucleótido muestran una fuerte afinidad para hibridar y
unirse fuertemente a secuencias complementarias de ácidos nucleicos
mono o bicatenarios y, por lo tanto, tienen utilidad como sondas con
especificidad de secuencia y como agentes terapéuticos antisentido
y anti-gen.
En la técnica se conocen agentes de unión al
surco menor que no se unen covalentemente al surco menor del ADN
bicatenario. También se conocen bien en la técnica agentes
intercalantes que se unen al ARN o ADN bicatenario. Los agentes
intercalantes son, en términos generales, moléculas aromáticas
planas que no se unen covalentemente al ARN o ADN bicatenario al
colocarse (intercalarse) entre las bases de purina y pirimidina que
interconectan bases de las dos cadenas del ADN bicatenario o ARN. La
Patente de Estados Unidos No. 4.835.263 describe oligonucleótidos
que se unen covalentemente a un grupo intercalante. Estos
oligonucleótidos que llevan un grupo intercalante pueden ser útiles
como sondas de hibridación.
La presente invención se refiere a una
combinación de oligonucleótido unido covalentemente y agente de
unión al surco menor que incluye un oligonucleótido que tiene una
pluralidad de unidades nucleotídicas, un extremo 3' y un extremo
5', y un resto de unión al surco menor unido covalentemente a al
menos uno de dichos nucleótidos. El agente de unión al surco menor
típicamente se une al oligonucleótido a través de un grupo de
enlace que comprende una cadena de no más de 15 átomos. El resto de
unión al surco menor es un radical de una molécula que tiene un
peso molecular de aproximadamente 150 a aproximadamente 2000 Dalton,
uniéndose dicha molécula de una manera no intercalante en el surco
menor de ADN bicatenario, ARN o híbridos de los mismos con una
constante de asociación mayor de aproximadamente 10^{3}
M^{-1}.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al proceso de síntesis de ciertas combinaciones de
oligonucleótido y agente de unión al surco menor unidos
covalentemente y a la forma de usar estas combinaciones para una
sonda de hibridación y para fines analíticos y de diagnóstico
relacionados, así como para fines terapéuticos (antisentido y
anti-gen).
La Figura 1 es un gráfico que muestra los
resultados de un ensayo de hibridación slot blot.
Una característica prominente de la nueva
composición de materia de la presente invención es que una molécula
de unión al surco menor se une covalentemente a un oligonucleótido.
Como se indica en la sección de introducción de la presente
solicitud de patente, un agente de unión al surco menor es una
molécula que se une dentro del surco menor de un ácido
desoxirribonucleico (ADN) bicatenario. Aunque no puede
proporcionarse una fórmula química general para todos los
compuestos de unión al surco menor conocidos porque dichos
compuestos tienen estructuras químicas que varían ampliamente, los
compuestos que pueden unirse al surco menor del ADN, en términos
generales, tienen una estructura tridimensional en forma de media
luna. La mayoría de los compuestos que se unen al surco menor de la
técnica anterior tienen una fuerte preferencia por regiones ricas en
A-T (adenina y timina) de la forma B del ADN
bicatenario. Los compuestos de unión al surco menor o, más
exactamente, los restos indicados de los conjugados de
oligonucleótido-agente de unión al surco menor de la
presente invención, también tienen la misma preferencia. (Los
conjugados de oligonucleótido-agente de unión al
surco menor de la presente invención se denominan en lo sucesivo en
algunas ocasiones ODN-MGB). Sin embargo,
teóricamente también son posibles compuestos de unión al surco
menor que muestren preferencia por regiones ricas en
C-G (citosina y guanina). Por lo tanto, también
están dentro del alcance de la presente invención compuestos
ODN-MGB que incorporan un radical o resto derivado
de moléculas de unión al surco menor que tiene preferencia por
regiones C-G. La preferencia por regiones
A-T de los agentes de unión al surco menor conocidos
se explica actualmente por la existencia de una interferencia
estérica desfavorable entre el grupo 2-amino de la
guanina y algunos agentes de unión al surco menor bien conocidos.
Sin embargo, como será evidente tras la consiguiente descripción
adicional, cuando la guanina se reemplaza por hipoxantina en un
ODN-MGB de la presente invención, ya no existe la
posibilidad de que se produzca la interferencia estérica
desfavorable indicada anteriormente y puede producirse una fuerte
unión del ODN-MGB a una cadena complementaria.
En términos generales, los compuestos de unión
al surco menor conocidos en la técnica anterior no se unen al ARN
bicatenario o a un híbrido bicatenario de ADN y ARN.
Sin embargo, los compuestos
ODN-MGB de la presente invención presentan potencial
para unirse al ARN monocatenario, y la característica anterior
constituye otro aspecto nuevo e interesante de la presente
invención.
Son ejemplos de compuestos de unión al surco
menor conocidos de la técnica anterior que pueden, de acuerdo con
la presente invención, unirse covalentemente a ODN para constituir
los nuevos conjugados ODM-MGB, ciertos compuestos
naturales tales como netropsina, distamicina y lexitropsina,
mitramicina, cromomicina A_{3}, olivomicina, antramicina,
sibiromicina, así como otros antibióticos relacionados y derivados
sintéticos. Ciertos compuestos heterocíclicos de amonio
biscuaternarios, diarilamidinas tales como pentamidina,
estilbamidina y berenilo, CC-1065 y polipéptidos de
indol y pirroloindol relacionados, Hoechst 33258,
4'-6-diamidino-2-fenilindol
(DAPI) así como varios oligopéptidos constituidos por aminoácidos
naturales o sintéticos, son compuestos de unión al surco menor. A
continuación se ilustran las estructuras químicas de los ejemplos
anteriores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para los fines de la presente invención, una
molécula es un agente de unión al surco menor si es capaz de unirse
dentro del surco menor de un ADN bicatenario con una constante de
asociación de 10^{3} M^{-1} o mayor. Este tipo de unión puede
detectarse por procedimientos espectrofotométricos bien establecidos
tales como espectroscopía ultravioleta (u.v.) y de resonancia
magnética nuclear (rmn) y también por electroforesis en gel. Los
cambios en el espectro u.v. después de la unión de una molécula de
unión al surco menor, y la espectroscopía de rmn utilizando el
efecto "Nuclear Overhauser" (NOSEY) son técnicas
particularmente bien conocidas y útiles para este fin. La
electroforesis en gel detecta la unión de un agente de unión al
surco menor al ADN bicatenario o a un fragmento del mismo, porque
después de dicha unión cambia la movilidad del ADN bicatenario.
Las moléculas o agentes intercalantes se
distinguen fácilmente de los agentes de unión al surco menor
basándose en que los agentes intercalantes son moléculas aromáticas
planas (preferentemente policíclicas) frente a la "forma de media
luna" o geometría análoga de los agentes de unión al surco menor.
También puede realizarse una distinción experimental por
espectroscopía de rmn utilizando el efecto Overhauser nuclear.
Como se ha indicado anteriormente, para los
fines de la presente invención, una molécula es un agente de unión
al surco menor si su constante de asociación dentro del surco menor
del ADN bicatenario es de 10^{3} M^{-1} o mayor. Sin embargo,
algunos agentes de unión al surco menor se unen a los sitios de alta
afinidad del ADN bicatenario con una constante de asociación de la
magnitud de 10^{7} a 10^{9} M^{-1}.
De acuerdo con la presente invención, la
molécula de unión al surco menor se modifica, en esencia, se
transforma en un "radical" y se une a una estructura covalente
apropiada o cadena de átomos que unen el agente de unión al surco
menor al ODN. En un sentido, la cadena de "unión" puede
considerarse y algunas veces se considera parte del agente de unión
al surco menor, ya que la naturaleza del enlace es tal que no afecta
adversamente a las propiedades de unión al surco menor de la
molécula ODN-MGB. Sin embargo, es mejor en la
presente descripción separar conceptualmente el agente de unión al
surco menor del grupo que lo une covalentemente al ODN. El radical
"formado" a partir de la molécula de unión al surco menor se
denomina en lo sucesivo "resto de unión al surco
menor", y el enlace covalente (que puede ser una cadena de
hasta aproximadamente 15 átomos) que une el resto de unión al surco
menor al oligonucleótido se denomina "grupo de unión".
Las realizaciones preferidas de los restos del surco menor de
acuerdo con la presente invención se describen con detalle después
de la descripción de la parte de oligonucleótido de los compuestos
conjugados ODN-MGB de la presente invención.
Hablando en términos generales, la porción de
oligonucleótido de los conjugados ODN-MGB de la
presente invención comprende de aproximadamente 3 a 100 unidades
nucleotídicas. Las unidades nucleotídicas que pueden incorporarse
en los ODN de acuerdo con la presente invención incluyen las bases
heterocíclicas principales que se encuentran de manera natural en
ácidos nucleicos (uracilo, citosina, timina, adenina y guanina), así
como modificaciones naturales y sintéticas y análogos de estas
bases, tales como hipoxantina, 2-aminoadenina,
2-tiouracilo, 2-tiotimina,
5-N^{4}-etenocitosina,
4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina y
6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina.
A continuación se muestran las estructuras respectivas de los
2-desoxirribósidos de
5-N^{4}-etenocitosina,
4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina y de
6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina.
Además, las unidades nucleotídicas que se
incorporan en los ODN de los conjugados ODN-MGB de
la presente invención pueden tener una función de entrecruzamiento
(un agente alquilante) unida covalentemente a una o más de las
bases, a través de un brazo de unión. Como los conjugados
ODN-MGB que tienen un agente de entrecruzamiento
unido forman una clase importante de realizaciones preferidas de la
presente invención, estas estructuras se describirán con más
detalle a continuación.
El "azúcar" o porción de glicósido de los
ODN-MGB de la presente invención puede comprender
desoxirribosa, ribosa, 2-fluororribosa,
2-O-alquil o alquenilribosa, donde el grupo alquilo puede
tener de 1 a 6 carbonos y el grupo alquenilo de 2 a 6 carbonos. En
los nucleótidos naturales y en las modificaciones y análogos
descritos en este documento, el resto de desoxirribosa o ribosa
forma un anillo de furanosa, el enlace glicosídico es de la
configuración \beta y las bases de purina se unen al resto de
azúcar a través de la posición 9, las pirimidinas a través de la
posición 1 y las pirazolopirimidinas a través de la posición 1.
Actualmente, se prefieren oligodesoxirribonucleótidos de acuerdo
con la presente invención, y por lo tanto el azúcar preferido es
2-desoxirribosa. Las unidades nucleotídicas de los
ODN están interconectadas por un esqueleto de "fosfato", como
se conoce bien en la técnica. Los ODN de los conjugados
ODN-MGB de la presente invención pueden incluir,
además de los enlaces fosfodiéster "naturales", fosforotioatos
y metilfosfonatos.
Los ODN de los conjugados
ODN-MGB de la presente invención también pueden
tener un "resto de cola" con un peso molecular relativamente
bajo unido al extremo 3' o 5'. El "resto de cola" en este
contexto particular debe distinguirse del resto de unión al surco
menor, que con preferencia también se une al extremo 3' o 5', o a
los dos. Por lo tanto, en este contexto, el "resto de cola", si
está presente, se une al extremo del ODN que no tiene el resto de
unión al surco menor. A modo de ejemplo, una molécula de cola puede
ser un fosfato, un éster fosfato, un grupo alquilo y un grupo
aminoalquio, o un grupo lipófilo.
Con respecto a las posibles variaciones de las
unidades nucleotídicas, el "esqueleto de fosfato" y la
"cola" de los ODN de los conjugados ODN-MGB de
la presente invención, debe tenerse en consideración lo siguiente.
La acción útil principal de los conjugados ODN-MGB
de la presente invención reside en la capacidad de la parte ODN de
la molécula de unirse a una secuencia complementaria en el ADN
monocatenario, ARN, ADN bicatenario e híbridos de
ADN-ARN, de una manera en la que el resto de unión
al surco menor se incorpora en el "dúplex" recién formado y
por lo tanto refuerza el enlace, es decir, aumenta la temperatura de
fusión (y la constante de asociación) del dúplex recién formado.
Además, las realizaciones preferidas de los conjugados
ODN-MGB de la presente invención que incluyen un
agente de entrecruzamiento, también dan como resultado una unión
covalente permanente de la molécula de ODN-MGB a la
cadena de ADN o ARN complementaria, dando como resultado una forma
unida permanentemente. En vista de lo anterior, los expertos en la
materia entenderán fácilmente que la principal limitación
estructural de las diversas partes componentes de la parte de ODN
del conjugado ODN-MGB de la presente invención
reside únicamente en la capacidad de la parte de ODN de formar una
cadena complementaria a cualquier secuencia diana específica, y que
dentro de estos límites son posibles un gran número de
modificaciones estructurales, conocidas en la técnica per se.
Además, los procedimientos sintéticos para preparar las diversas
bases heterocíclicas, nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos
que pueden formar la parte de ODN de los conjugados
ODN-MGB de la presente invención, en términos
generales, están bien desarrollados, y son conocidas en la técnica.
Pueden prepararse
N_{4},N_{4}-etano-5-metildesoxicitidina,
sus nucleósidos, nucleótidos y/u oligonucleótidos que incorporan
esta base, de acuerdo con las enseñanzas de Webb, T. R.; Matteucci,
M.D. Nucleic Acids Res., 1986, 14, 7661-7674,
Webb, T. R.; Matteucci, M.D. J. Am. Chem. Soc., 1986, 108,
2764. Pueden prepararse
4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina,
6-amino-4-hidroxipirazolo[3,4-d]pirimidina,
sus nucleósidos, nucleótidos y oligonucleótidos que incorporan esta
base, de acuerdo con las enseñanzas de Kazimierczuk et
al. J. Am. Chem. Soc., 1984, 106,
6379-6382. Mientras que la síntesis de
oligonucleótidos, con el fin de preparar un ODN de secuencia
predeterminada específica para que sea complementario a una
secuencia diana, puede realizarse de acuerdo con el estado de la
materia, a continuación se describe un procedimiento preferido. El
procedimiento preferido incorpora las enseñanzas de la Patente de
Estados Unidos Nº 5.419.966 (solicitud con número de
serie 08/090.408) presentada el 12 de julio de 1993, que ha sido concedida y cuya tasa de expedición se ha abonado.
serie 08/090.408) presentada el 12 de julio de 1993, que ha sido concedida y cuya tasa de expedición se ha abonado.
El grupo de unión es un resto que une
covalentemente la parte de ODN del conjugado con el resto de unión
al surco menor. Con preferencia, el grupo de unión es tal que el
enlace se produce a través de una cadena de no más de 15 átomos.
También con preferencia, de acuerdo con la presente invención, el
resto de unión al surco menor se une covalentemente con el extremo
3' o 5' del oligonucleótido. Sin embargo, la unión a un nucleótido
en una posición intermedia, y particularmente a la base
heterocíclica del nucleótido en la posición intermedia, también
está dentro del alcance de la invención. En términos generales, el
grupo de unión se obtiene a partir de una molécula bifuncional de
manera que una funcionalidad tal como una funcionalidad amina se
una, por ejemplo, al fosfato que se encuentra en el extremo 5' del
ODN, y la otra funcionalidad, tal como un grupo carbonilo (CO), se
una a un grupo amino del resto de unión al surco menor. Como
alternativa, el grupo de unión puede obtenerse a partir de un amino
alcohol de manera que la función alcohol se una, por ejemplo, al
extremo 3'-fosfato del ODN y la función amino se
una a un grupo carbonilo del resto de unión al surco menor. Otra
alternativa más de un grupo de unión incluye un aminoalcohol (unido
al 3'-fosfato con un enlace éster) unido a un ácido
aminocarboxílico que a su vez está unido en un enlace peptídico al
grupo carbonilo del agente de unión al surco menor. Por lo tanto,
las realizaciones preferidas del grupo de unión tienen las fórmulas
-HN(CH_{2})_{m}CO,
O(CH_{2})_{m}CO y
(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH
donde la limitación de m es que el resto de unión al surco menor no
debe separarse por más de aproximadamente 15 átomos del ODN. Las
realizaciones preferidas de los grupos de unión son
-O(CH_{2})_{6}NH,
-OCH_{2}CH(OH)CH_{2}NHCOCH_{2}CH_{2}NH y
-HN(CH_{2})_{5}CO. Como se ha indicado
anteriormente, el grupo de unión también puede estar conceptualizado
como parte del resto de unión al surco menor, que en ese caso
debería considerarse unido directamente al ODN.
La limitación básica para el resto de unión al
surco menor se ha indicado anteriormente, y no puede definirse por
la estructura química específica. Además de la estructura molecular
que provoca la unión al surco menor, el resto de unión al surco
menor también puede tener funciones adicionales, siempre que estas
funciones no interfieran con la capacidad de unión al surco menor.
Por ejemplo, un grupo reportador, que hace que el agente de unión
al surco menor sea fácilmente detectable por color, espectro uv u
otra característica física o química fácilmente perceptible, puede
unirse covalentemente al resto de unión al surco menor. Un ejemplo
de tal grupo reportador es una función diazobenceno que, en el
ejemplo de una realización preferida, se une a una función
carbonilo del agente de unión al surco menor a través de un enlace
-HN(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}-.
De nuevo, el grupo reportador u otra función parecida que lleva el
agente de unión al surco menor también puede conceptualizarse como
parte del propio resto de unión al surco menor.
Las realizaciones preferidas de los conjugados
ODN-MGB se definen por la siguiente Fórmula química
1. Esta definición incluye las realizaciones preferidas del resto de
unión al surco menor de acuerdo con la presente invención, que
también pueden incluir todo o parte del grupo de unión y otros
grupos colgantes tales como un grupo reportador, como se ha
analizado anteriormente:
en la
que
x es O o S;
q es un número entero de 3 a 100;
R_{8} es H, OH, alcoxi que tiene de 1 a 6
carbonos, O-alquenilo
C_{2}-C_{6} o F;
B es un aglicón seleccionado entre un grupo
constituido por una base heterocíclica que se encuentra de manera
natural en ácidos nucleicos e hipoxantina,
2-aminoadenina, 2-tiouracilo,
2-tiotimina,
5-N^{4}-etenocitosina,
4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina y
6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina;
W_{1} es H, PO(OH)_{2} o una
sal del mismo, o un resto de unión al surco menor unido al extremo
3' o 5' de dicho oligonucleótido, incluyendo el grupo W_{1} el
grupo de unión que une covalentemente el resto de unión al surco
menor con el oligonucleótido a través de no más de 15 átomos;
W_{2} está ausente o es un resto de unión al
surco menor unido a uno de los aglicones B, incluyendo el grupo
W_{2} el grupo de unión que une covalentemente el resto de unión
al surco menor con dicho aglicón, o W_{2} es una funcionalidad de
entrecruzamiento incluyendo un brazo enlazador que une
covalentemente la funcionalidad de entrecruzamiento con dicho
aglicón,
donde el resto de unión al surco menor es un
radical de una molécula que tiene un peso molecular de
aproximadamente 150 a aproximadamente 2000 Dalton que se une de
manera no intercalante en el surco menor del ADN bicatenario, ARN o
híbridos de los mismos con una constante de asociación mayor de
aproximadamente 10^{3}, con la condición de que al menos uno de
dichos grupos W_{1} y W_{2} sea un resto de unión al surco
menor; y
donde además el resto de unión al surco menor
que incluye el grupo de unión tiene la fórmula seleccionada entre
el grupo constituido por los grupos (a), (b), (c), (d) y (e):
(a)R_{1}-(HN-Y_{1}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{1} representa un anillo
de 5 miembros que tiene dos dobles enlaces y de 0 a 3 heteroátomos
seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, los grupos NH
y CO están unidos respectivamente a dos carbonos del anillo que
están separados entre sí por un átomo del anillo, el átomo del
anillo situado entre dichos dos carbonos del anillo sólo está
sustituido con H o está sin sustituir, pudiendo estar cada uno de
los átomos restantes del anillo opcionalmente sustituidos con 1, 2 ó
3 grupos
R_{3};
(b)R_{1}-(R_{6}N-Y_{2}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{2} es un sistema de
anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado
con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el
sistema de anillos condensado de 0 a 3 heteroátomos seleccionados
entre el grupo constituido por N, S y O, cada uno de los grupos
R_{6}N y CO está unido a un carbono del anillo que está en un
anillo diferente del sistema de anillos condensados, y que es el
segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo de
cabeza de puente común, colocando por lo tanto los grupos CO y
NR_{6} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos
en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el
otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos
átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado
opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres
átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del
sistema de anillos condensado opcionalmente sustituidos con un
grupo
R_{3};
(c)R_{1}-(CO-Y_{3}-NH)_{n}-R_{2}
donde Y_{3} es un anillo
aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde
cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono del anillo,
estando dichos carbonos del anillo en posición 1,4 entre sí,
estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en
uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente
sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos del anillo
no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente
sustituidos con un grupo
R_{7};
(d)R_{1}-(HN-Y_{4}-HN-CO-Y_{4}-CO)_{p}-R_{2}
donde Y_{4} es un anillo
aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde
cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono del anillo,
estando dichos carbonos del anillo en posición 1,4 entre sí en cada
anillo, estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO
o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente
sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos del anillo
no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente
sustituidos con un grupo
R_{7};
(e)R_{1}-(Y_{5})_{n}-R_{2}
donde Y_{5} es un sistema de
anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado
con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el
sistema de anillos condensado de 0 a 3 heteroátomos seleccionados
entre el grupo constituido por N, S y O, donde cada uno de los
grupos R_{1} y R_{2} está unido a un carbono del anillo que
está en un anillo diferente del sistema de anillos condensados, y
que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del
anillo cabeza de puente común, colocando los grupos R_{1} y
R_{2} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos
en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el
otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos
átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado
opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres
átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del
sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un
grupo
R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente
H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, -O-, -S-, OR_{4}, SH,
SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2},
R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2},
CONHR_{4},
H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4},
-HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4},
-HN(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4}
y
-(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH-,
o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido
por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4},
o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros
condensado con el anillo Y_{1};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que
tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que
tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo
aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático
heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo
carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde
R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F,
Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2},
N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{6} es H, alquilo de 1 a 5 carbonos, o
R_{6} y R_{7} juntos forman un anillo de 4, 5 ó 6 miembros,
siendo parte de dicho anillo opcionalmente un grupo -O-, -S-, -NH-,
-NCH_{3}- o N-alquilo inferior;
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}- o
-CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero entre 1 y 10;
n es un número entero entre 1 y 10, y
p es un número entero entre 1 y 5.
Son realizaciones aún más preferidas de los
conjugados ODN-MGB de la presente invención aquellas
en las que el resto de unión al surco menor es como se define a
continuación:
(1) el resto de unión al surco menor se
representa por la fórmula (a) anterior y el anillo de cinco miembros
tiene la estructura
(2) el resto de unión al surco menor se
representa por la fórmula (a) anterior en la que el anillo de cinco
miembros tiene la estructura
y
(3) el resto de unión al surco menor se
representa por la fórmula (b) y el sistema de anillos condensado
tiene la estructura
Una clase de realizaciones preferidas de los
conjugados ODN-MGB de la presente invención también
incluye una o más funcionalidades de entrecruzamiento, con lo que
después de que el conjugado ODN-MGB se una a una
secuencia diana complementaria de ADN, ARN o un fragmento de la
misma, la funcionalidad de entrecruzamiento reacciona de forma
irreversible con la diana y forma un enlace covalente con ella. Las
ventajas de dicha unión covalente con una secuencia diana están en
el uso analítico y de diagnóstico, así como en sondas de
hibridación, y en aplicaciones terapéuticas
(anti-sentido y anti-gen). El resto
de unión al surco menor que también se une covalentemente al ODN
que complementa a la secuencia diana, potencia la unión no covalente
inicial del conjugado ODN-MGB con la secuencia
diana y, por lo tanto, facilita la unión covalente posterior a
través de la función de entrecruzamiento. Las siguientes
consideraciones son pertinentes en lo que respecta a las
funcionalidades o agentes de entrecruzamiento incorporados en esta
clase de conjugados ODN-MGB.
Los agentes de entrecruzamiento incorporados en
la presente invención se unen covalentemente a un sitio del
ODN-MGB. Su longitud y orientación estérica debe ser
tal que puedan alcanzar un sitio de reacción adecuado en la
secuencia diana de ADN o ARN después de que el
ODN-MGB se hibride con la diana. Por definición, la
funcionalidad o agente de entrecruzamiento tiene un grupo reactivo
que reaccionará con un grupo reactivo de la secuencia diana de ADN
o ARN. El agente (o agentes) de entrecruzamiento pueden unirse
covalentemente a una o más de las bases heterocíclicas, a los
restos de azúcar o de azúcar modificado, o a las funciones fosfato o
fosfato modificado de los conjugados ODN-MGB. El
agente de entrecruzamiento también puede unirse al resto de unión
al surco menor siempre que no interfiera con su capacidad de unión
al surco menor. Con preferencia, el agente o funcionalidad de
entrecruzamiento se une a una de las bases heterocíclicas.
En términos sencillos, el propio agente de
entrecruzamiento puede dividirse conceptualmente en dos grupos o
restos, particularmente el grupo reactivo, que es típicamente y con
preferencia un grupo saliente electrófilo (L), y un "brazo"
(A) que une el grupo saliente L con el sitio respectivo del
ODN-MGB. El grupo saliente L puede elegirse, por
ejemplo, entre grupos tales como cloro, bromo, yodo, SO_{2}R''' o
S^{+}R'''R'''', donde cada uno de R''' y R'''' es
independientemente alquilo C_{1-6} o arilo o R'''
y R'''' juntos forman un enlace alquileno
C_{1-6}. Se prefieren cloro, bromo y yodo. Dentro
de estos grupos, se prefieren grupos haloacetilo tales como
-COCH_{2}I, y "mostazas nitrogenadas" bifuncionales, tales
como -N-[(CH_{2})_{2}-Cl]_{2}.
El grupo saliente se alterará por su capacidad de salida.
Dependiendo de la naturaleza y reactividad del grupo saliente
particular, el grupo a usar se elige en cada caso para dar la
especificidad deseada de las sondas de unión irreversible.
Aunque, como se ha indicado anteriormente, el
"brazo" (o brazo enlazador) A puede considerarse
conceptualmente una sola entidad que une covalentemente el
ODN-MGB con el grupo saliente L, y mantiene al grupo
saliente L a una distancia deseada y en posición estérica relativa
al ODN-MGB, en la práctica el "brazo" A puede
construirse en un esquema sintético en el que una molécula
bifuncional se une covalentemente al ODN-MGB, o al
ODN antes de que el resto de unión al surco menor se una (por
ejemplo, mediante un enlace éster fosfato al extremo 3' o 5', por
medio de un enlace carbono a carbono a una base heterocíclica o por
medio de un enlace carbono a nitrógeno con una base heterocíclica
sustituida con amino) a través de su primera funcionalidad, y
también se une covalentemente a través de su segunda funcionalidad
(por ejemplo, una amina) a un "puente hidrocarbilo" (puente
alquilo, puente alquilarilo o puente arilo, o similar) que, a su
vez, lleva el grupo saliente L.
Una fórmula general de la función de
entrecruzamiento es -A-L o
-A-L_{2} donde L es el grupo saliente definido
anteriormente y A es un resto que se une covalentemente al
ODN-MGB. El resto de "brazo" A no debe ser
reactivo por sí mismo (al contrario que a través del grupo saliente
L) en las condiciones de hibridación del ODN-MGB
con la secuencia diana, y debe mantener al grupo saliente L en una
posición estérica y a una distancia deseadas del sitio deseado de
reacciones, tal como en la posición N-7 de un resto
guanosina de la secuencia diana. En términos generales, la longitud
del grupo A debe ser equivalente a la longitud de una cadena alquilo
normal de aproximadamente 2 a 20 carbonos.
Una fórmula más específica ejemplar para una
clase de realizaciones preferidas de la función de entrecruzamiento
es
-(CH_{2})_{q}
- Y - (CH_{2})_{m} -
L,
en la que L es el grupo saliente,
definido anteriormente, cada uno de m y q es independientemente de
0 a 8, ambos incluidos, y en la que Y se define como un "grupo de
unión funcional". Para que la descripción esté más clara, este
"grupo de unión funcional" debe distinguirse del "grupo de
unión" que une el resto de unión al surco menor con el ODN,
aunque los grupos de unión funcionales descritos en este documento
para la unión del agente de entrecruzamiento también pueden usarse
para unir un resto de unión al surco menor con cualquier extremo
del ODN, o con un nucleótido en posición intermedia del ODN. Un
"grupo de unión funcional" es un grupo que tiene dos
funcionalidades, por ejemplo -NH_{2} y -OH, o -COOH y -OH, o -COOH
y -NH_{2}, que son capaces de unir los puentes
(CH_{2})_{q} y (CH_{2})_{m}.
Un extremo acetilénico (HC\equivC-) también es una funcionalidad adecuada para Y, debido a que puede acoplarse con ciertos heterociclos, como se describe a continuación.
Un extremo acetilénico (HC\equivC-) también es una funcionalidad adecuada para Y, debido a que puede acoplarse con ciertos heterociclos, como se describe a continuación.
Otras fórmulas ejemplares y más específicas para
una clase de realizaciones preferidas de la función de
entrecruzamiento son
-(CH_{2})_{q}-NH-CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L
\vskip1.000000\baselineskip
y
\vskip1.000000\baselineskip
-(CH_{2})_{q'}-O-(CH_{2})_{q''}-NH-CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L
en las que q, m y L son como se han
definido anteriormente con respecto a la descripción de las
funciones de entrecruzamiento, q' es de 3 a 7, ambos incluidos, q''
es de 1 a 7, ambos incluidos, X es fenilo o fenilo monosustituido
(tal como fenilo sustituido con cloro, bromo, alquilo inferior o
alcoxi inferior), n es 0 ó 1, p es un número entero de 1 a 6, y
R_{1} es H, alquilo inferior o
(CH_{2})_{p}-L. Con preferencia, p es 2.
Los expertos en la materia apreciarán que la estructura
-N(R_{1})-(CH_{2})_{2}-L
describe una "mostaza nitrogenada", que es una clase de
agentes alquilantes potentes. Dentro de esta clase de conjugados
ODN-MGB, se prefieren particularmente aquellos en
los que el agente de entrecruzamiento incluye la funcionalidad
-N(R_{1})-(CH_{2})_{2}-L, en la
que L es halógeno, con preferencia cloro; y se prefieren aún más los
conjugados ODN-MGB en los que el agente de
entrecruzamiento incluye la agrupación
-N-[(CH_{2})_{2}-L]_{2} (una
N-mostaza
"bifuncional").
Una estructura particularmente preferida del
agente de entrecruzamiento incluye la agrupación
-CO-(CH_{2})_{3}-C_{6}H_{4}-N-[(CH_{2})_{2}Cl]_{2}.
En una realización preferida, el grupo de
entrecruzamiento que se acaba de mencionar se une a una cola que
lleva n-hexilamina en los extremos 5' y 3' del ODN de acuerdo
con la siguiente estructura:
R'-O-(CH_{2})_{6}-NH-CO-(CH_{2})_{3}-C_{6}H_{4}-N-[(CH_{2})_{2}Cl]_{2}
en la que R' significa el grupo 5'
o 3'-fosfato terminal del ODN. El otro extremo, o un
nucleótido en una posición intermedia, lleva el resto de unión al
surco
menor.
De acuerdo con otras realizaciones preferidas,
la funcionalidad de entrecruzamiento se une covalentemente a la
base heterocíclica, por ejemplo al resto uracilo de un componente de
ácido 2'-desoxiuridílico del conjugado
ODN-MGB. El enlace puede producirse a través de un
grupo amino, es decir, la "combinación de
brazo-grupo saliente" (A-L)
puede unirse a una unidad componente de ácido
5-amino-2'-desoxiuridílico
del ODN. En otras realizaciones preferidas, la "combinación de
brazo-grupo saliente" (A-L) se
une a la posición 5 de la unidad componente de ácido
2'-desoxiuridílico del ODN mediante un enlace
carbono-carbono. El términos generales, pueden
obtenerse -2'-desoxiuridinas
5-sustituidas por una adaptación del procedimiento
general de Robins et al. (Can. J. Chem., 60:
554 (1982); J. Org. Chem., 48: 1854 (1983)). De
acuerdo con esta adaptación, el acoplamiento mediado con paladio de
un 1-alquino sustituido con
5-yodo-2'-desoxiuridina
da un producto acoplado con acetileno. El análogo de dUrd
acetilénico se reduce, por ejemplo, con níquel Raney, para dar el
compuesto saturado, que después se usa para la conversión directa
en un reactivo para uso en un sintetizador de ADN automático. Los
ejemplos de reactivos que pueden acoplarse a
5-yodo-2'-desoxiuridina
de acuerdo con este procedimiento son
HC\equivCCH_{2}OCH_{2}CH_{2}N(CO)_{2}C_{6}H_{4}
(ftalimidoetoxipropino) y
HC\equivCCH_{2}OCH_{2}CH_{2}NHCOCF_{3}
(trifluoroacetamidoetoxipropino).
\newpage
En estos ejemplos, los nucleósidos que se
obtienen en este esquema se incorporan en el ODN deseado, y la
porción alquilante del agente de entrecruzamiento se une al grupo
amino terminal sólo después de la retirada de los grupos
bloqueantes ftálicos o de trifluoroacetilo respectivos. Otros
ejemplos de nucleótidos en los que el agente de entrecruzamiento se
une a una base heterocíclica son derivados de
2'-desoxi-4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina.
Estos compuestos pueden prepararse de acuerdo con las enseñanzas de
la publicación de solicitud PCT WO: 90/03370 (publicada el
4/05/90).
Analizando aún en términos generales las
estructuras de los ODN modificados de la presente invención, se
aprecia que el examen del ADN bicatenario mediante modelos de bolas
y varillas y gráficos computarizados de alta resolución indica que
la posición 7 de las purinas y la posición 5 de las pirimidinas
residen en el surco mayor del dúplex de forma B de los ácidos
nucleicos bicatenarios. Estas posiciones pueden estar sustituidas
con cadenas laterales de volumen considerable sin interferir con las
propiedades de hibridación de las bases. Estos brazos laterales
pueden introducirse por derivatización de dThd o dCyd, o por
síntesis total sencilla de la base heterocíclica, seguido de
glicosilación. Estos nucleósidos modificados pueden convertirse en
los nucleótidos activados apropiados para la incorporación en
oligonucleótidos con un sintetizador de ADN automático. Con las
pirazolo[3,4-d]pirimidinas, que son
análogos de adenina, el brazo de entrecruzamiento se une a la
posición 3, que es equivalente a la posición 7 de
purina.
purina.
La cadena lateral de entrecruzamiento (brazo =
A) debe tener una longitud suficiente para alcanzar el otro lado
del surco mayor desde la posición 7- u 8- de purina, la posición 5
de pirimidina, la posición 5 de pirrolopirimidina o la posición 3
de pirazolopirimidina y reaccionar con el N-7 de una purina
(con preferencia guanina) situada por encima (sobre el lado 3' del
oligómero), conteniendo el par de bases el análogo modificado. La
cadena lateral de entrecruzamiento (brazo = A) sostiene el grupo
funcional lejos de la base cuando la base se empareja con otra
dentro del complejo bicatenario. Como se ha indicado anteriormente,
el brazo A debe ser equivalente en longitud a una cadena alquilo
normal de 2 a 20 carbonos. Con preferencia, los brazos incluyen
grupos alquileno de 1 a 12 átomos de carbono, grupos alquenileno de
2 a 12 átomos de carbono y 1 ó 2 enlaces olefínicos, grupos
alquinileno de 2 a 12 átomos de carbono y 1 ó 2 enlaces
acetilénicos, o dichos grupos están sustituidos en un punto
terminal con grupos nucleófilos tales como oxi, tio, amino o
derivados químicamente bloqueados de los mismos (por ejemplo,
trifluoroacetamido, ftalimido, CONR', NR'CO y SO_{2}NR', donde R'
= H o alquilo C_{1-6}). Dichas funcionalidades,
incluyendo aminas alifáticas o aromáticas, muestran propiedades
nucleófilas y son capaces de servir como punto de unión para grupos
tales como
\vskip1.000000\baselineskip
-(CH_{2})_{m}-L,
y
-CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L
\vskip1.000000\baselineskip
que se han descrito anteriormente
como componentes de grupos funcionales de entrecruzamiento
ejemplares.
Después de que se prepare la unidad nucleosídica
o nucleotídica que tiene la funcionalidad de entrecruzamiento
A-L, o un precursor adecuado de la misma (tal como
el grupo -(CH_{2})_{q}-NH_{2} o
-(CH_{2})_{q}-Y, donde Y termina con un
grupo nucleófilo tal como NH_{2}), puede realizarse la preparación
adicional de los oligonucleótidos modificados de la presente
invención de acuerdo con lo establecido en esta materia. Por lo
tanto, para preparar oligonucleótidos, se introducen grupos
protectores en los nucleósidos o nucleótidos y los compuestos se
activan para el uso en la síntesis de oligonucleótidos. La
conversión en formas protegidas y activadas puede seguir los
procedimientos que se describen con detalle para
2'-desoxinucleósidos en diversas revisiones. Véase
Sonveaux, Bioorganic Chemistry, 14:
274-325 (1986); Jones, en "Oligonucleotide
Synthesis, a Practical Approach", M. J. Gait, Ed., IRL Press, p.
23-35
(1984).
(1984).
Los nucleótidos activados se incorporan en
oligonucleótidos de una manera análoga a la empleada para
nucleótidos de ADN y ARN, ya que los nucleótidos correctos se unirán
secuencialmente para formar una cadena de nucleótidos que es
complementaria a una secuencia de nucleótidos en el ADN o ARN diana.
Los nucleótidos pueden incorporarse enzimáticamente o por síntesis
química. Los nucleótidos pueden convertirse en sus derivados de
cianoetil éster de
5'-O-dimetoxitritil-3'-(N,N-diisopropil)fosforamidita,
e incorporarse en oligonucleótidos sintéticos siguiendo los
procedimientos de "Oligonucleotide Synthesis: A Practical
Approach", supra. Después, los grupos
N-protectores se retiran, junto con los otros grupos
bloqueantes de oligonucleótidos, por aminolisis posterior a la
síntesis, mediante procedimientos conocidos generalmente en la
técnica.
En una realización preferida, los nucleótidos
activados pueden usarse directamente en un sintetizador de ADN
automático de acuerdo con los procedimientos e instrucciones del
sintetizador particular empleado. Los oligonucleótidos pueden
prepararse en el sintetizador usando la química de fosforamidita o
de H-fosfonato estándard comercial.
Puede añadirse un resto que contiene el grupo
saliente, tal como un grupo haloacilo o un grupo
-CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L
(con más preferencia, un
CO-(CH_{2})_{3}-C_{6}H_{4}-N-[CH_{2}CH_{2}Cl]_{2})
al aminoalquilo o colas similares
(-CH_{2})_{q}-Y) después de la incorporación en los oligonucleótidos y de la retirada de cualquier grupo bloqueante.
(-CH_{2})_{q}-Y) después de la incorporación en los oligonucleótidos y de la retirada de cualquier grupo bloqueante.
En las situaciones en las que el agente de
entrecruzamiento (resto A-L) se une al extremo 3' o
5' del oligonucleótido, por ejemplo mediante un enlace alquilamina
de la fórmula -(CH_{2})_{q}-Y (Y termina
en una amina), la síntesis de oligonucleótidos puede realizarse
produciendo primero el oligonucleótido con dicha cola de
aminoalquilo, en la que después se introduce un resto alquilante,
tal como el grupo haloacilo indicado anteriormente o
-CO-(CH_{2})_{m}-(X)_{n}-N(R_{1})-(CH_{2})_{p}-L.
Una realización preferida ejemplar de un
conjugado ODN-MGB que tiene un agente de
entrecruzamiento unido a una de las bases nucleotídicas se
representa por la siguiente fórmula:
5'-GGTTATTTTTGAAGATACGAATTTCUCCAGAGACACAGCAGGATTTGTCA-CDPI_{3}
en la que el símbolo subrayado
"U" (la 26ª unidad nucleotídica del
50-mero) representa una
5-(3-aminopropil)-2'-desoxiuridina
que tiene un resto clorambucilo unido al grupo amino. El símbolo
"CDPI_{3}" representa un resto de unión al surco menor como
se describe a continuación con respecto al Esquema de Reacción 1. El
componente
5-(3-aminopropil)-2'-desoxiuridina
se incorpora en el ODN usando
3'-(N,N-diisopropil-cianoetil)-fosforamidita
de
5'-O-tritil-5-trifluoroacetamidopropil-2'-desoxiuridina
de acuerdo con el procedimiento de Gibson, K.J., & Benkovic,
S.J. (1987) Nucleic Acids Res. 15, 6455. El residuo clorambucilo y
el resto de unión al surco menor se introducen en el ODN como se
describe a continuación en la sección
experimental.
Las realizaciones más preferidas actualmente de
los restos de unión al surco menor de la presente invención son
"oligopéptidos" obtenidos a partir de ácido
1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
(CDPI) y de ácido
4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico.
Éstos son péptidos sintéticos que tienen unidades de repetición de
las estructuras mostradas respectivamente en la Fórmula 2 y en la
Fórmula 4, donde el grado de polimerización (m) del péptido es con
preferencia de 3 a 5, con más preferencia 5, para el péptido de
Fórmula 2 y 3 para el péptido de Fórmula 4. El Esquema de Reacción
1 describe un proceso para preparar un tripéptido específico
abreviado como "CDPI_{3}" que después puede acoplarse con o
sin modificación minoritaria a los ODN, para formar realizaciones
preferidas de los conjugados ODN-MGB de la presente
invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema de Reacción
1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Con respecto al Esquema de Reacción 1, el
material de partida en este esquema sintético es ácido
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
o ácido
3-t-butiloxicarbonil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
que pueden prepararse de acuerdo con la bibliografía química (D.L.
Boger, R.S. Coleman y B.J. Invergo, J. Org. Chem., 1987, Vol.
52, 1521-1530). Los compuestos de partida se
convierten en un éster activo por tratamiento con el
tetrafluorofenil éster del ácido trifluoroacético
(TFP-TFA). En el compuesto 1a mostrado en el
esquema, el grupo R es CONH_{2}, en 1b R es
t-butiloxicarbonilo (^{t}Boc). El grupo
t-butiloxicarbonilo (^{t}Boc) es un grupo
protector bien conocido para funciones amino que puede retirarse
con un ácido. Los ésteres activados resultantes 1a y 1b se hacen
reaccionar con
1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato
de metilo (también disponible de acuerdo con la bibliografía
química, véase D.L. Boger, R.S. Coleman y B,J. Invergo, J. Org.
Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530) para
producir los compuestos peptídicos "diméricos" 2a y 2c. El
grupo metilo de la función carboxilo se retira por tratamiento con
una base para producir los péptidos "diméricos" en los que el
grupo ácido carboxílico está libre. Este dímero se activa una vez
más para formar un éster activo con tetrafluorofenol (2e cuando R =
CONH_{2}, TFP-CDPI_{2}; y 2f cuando R =
^{t}Boc,
TFP-^{t}Boc-CDPI_{2}). Después
de la activación con TFP-TFA, el éster activo del
dímero puede usarse para formar el conjugado ODN-MGB
como se describe a continuación con respecto al trímero
correspondiente. El éster activado del péptido dimérico también
puede hacerse reaccionar con otra molécula más de
1,2-dihidro-3H-pirroloindol-7-carboxilato
de metilo para formar un "péptido trimérico" que tiene su
función ácido carboxílico protegida en forma de un éster metílico,
3a (trímero
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
de metilo). El grupo metilo se retira por tratamiento con una base
y el "péptido trimérico" resultante 3b se convierte de nuevo
en un tetrafluorofenil éster activado 3c (trímero
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo,
TFP-CDPI_{3}). El tetrafluorofenil éster activo 3c
puede usarse para alargar adicionalmente la cadena peptídica
repitiendo las etapas de reacción con
1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato
de metilo, saponificando el éster metílico resultante y, si se
desea, haciéndolo reaccionar de nuevo con TFP-TFA
para preparar el tetrafluorofenil éster activo del péptido que
incorpora 4 restos CDPI. Como se apreciará fácilmente, estas etapas
pueden repetirse adicionalmente hasta que se incluya el número
deseado de restos CDPI en el péptido. En las realizaciones
preferidas descritas en este documento, el tetrafluorofenil éster
activo del tripéptido 3c (TFP-CDPI_{3}) se utiliza
para el acoplamiento con un ODN para preparar un
ODN-MGB, o para sintetizar un
ODN-MGB en un soporte sólido de vidrio de poro
controlado (CPG) modificado adecuado como se describe a
continuación con respecto a los Esquemas de Reacción 4 y 5. El
Esquema de Reacción 1 indica como su última etapa la preparación de
un derivado de hidroxilpropilamida a partir del tetrafluorofenil
éster activo del tripéptido 3c (TFP-CDPI_{3}). El
derivado de hidroxilpropilamida del tripéptido 3d (trímero
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxi)-1-amido-3-propanol,
CDPI_{3}-3-hidroxipropilamida)
puede usarse para el acoplamiento con un ODN para obtener un
ODN-MGB de acuerdo con la presente invención. Sin
embargo, el tripéptido 3d también puede usarse como una molécula de
unión al surco menor "que permanece libre" como control en
ciertos estudios de unión que se describen a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Esquema pasa a página
siguiente)
\newpage
Esquema de Reacción
2
\vskip1.000000\baselineskip
Ahora, con respecto al Esquema de Reacción 2, se
describe la síntesis de otra realización preferida de los péptidos
de unión al surco menor, donde el "monómero" es el resto de
ácido
4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico,
y cuya realización también tiene un grupo reportador que contiene
un resto diazobenceno. Por lo tanto, de acuerdo con este esquema,
el ácido
6-[(terc-butiloxi)carboxamido]hexanoico
se condensa en presencia de N,N-diciclohexilcarbodiimida con
2-[4-(fenilazo)-benciltio]-etanol
para formar
5-[(terc-butiloxi)carboxamido]pentilcarboxilato
de 2-[4-(fenilazo)-benciltio]etil, 11). El
grupo protector de ^{t}Boc se retira del compuesto 11 por
tratamiento con ácido trifluoroacético (TFA) y el compuesto
resultante que tiene una función amino libre se hace reaccionar con
un éster activado del ácido
4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico
protegido con ^{t}Boc. El último compuesto de éster activado
(1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido-pirrolo-2-carboxilato
de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo)
se prepara a partir de ácido
1-metil-4-[terc-butiloxi]carboxamido]pirrolo-2-carboxílico,
que está disponible conforme al procedimiento bibliográfico de L.
Grehn, V. Ragnarsson, J. Org. Chem., 1981, 46,
3492-3497. El
5-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato
de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo, 12) resultante
tiene una unidad del residuo monómero "ácido
2-amino-N-metilpirrolocarboxílico" unido
al grupo reportador que tiene el resto diazobenceno. Después, puede
realizarse la retirada del grupo protector de ^{t}Boc con ácido
trifluoroacético y del acoplamiento con una o más moléculas de
1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido-pirrolo-2-carboxilato
de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo,
hasta que se obtenga un péptido que contiene el número deseado de
residuos de monómero. Tal compuesto que tiene un número n de
monómeros y un grupo amino libre se indica en el Esquema de
Reacción 2 como 16a. El compuesto 16a puede hacerse reaccionar con
un éster activado (tal como un éster activado de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo)
del ácido 6-aminohexanoico protegido con ^{t}Boc
para proporcionar el oligopéptido mostrado como compuesto 16b en el
Esquema de Reacción 2. El grupo protector de ^{t}Boc puede
retirarse del último compuesto en condiciones ácidas, y el derivado
resultante que tiene una función amino libre puede unirse por
procedimientos sintéticos convencionales a cualquiera de los
extremos 3'-fosfato o 5'-fosfato de
un ODN. Como alternativa, el derivado que tiene una función amino
libre también puede unirse al extremo 3' o 5'-OH de
un oligonucleótido usando una diversidad de grupos de unión
bifuncionales, como se ha analizado anteriormente.
\newpage
Esquema de Reacción
3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ahora, con respecto al Esquema de Reacción 3, se
ilustra un procedimiento general para el acoplamiento de un ODN de
cola 3'-amino o 5'-amino con los
oligopéptidos de unión al surco menor ejemplares activados con
tetrafluorofenil (TFP) éster. Aunque los esquemas muestran el uso de
los compuestos de unión al surco menor ejemplares activados con TFP
obtenidos de acuerdo con el Esquema de Reacción 1, debe tenerse en
mente que este procedimiento general también es adecuado para el
acoplamiento de otros compuestos de unión al surco menor activado
con TFP con los ODN. Las referencias numéricas 1a a 3c en el Esquema
de Reacción 3 se refieren a los compuestos ejemplares obtenidos de
acuerdo con el Esquema de Reacción 1.
Los ODN con cola 3'- o 5'-amino
pueden sintetizarse por procedimientos convencionales; por ejemplo,
un residuo aminohexilo puede unirse a cualquier extremo del ODN
usando fosforamidita de N-monometoxitritilaminohexilo
disponible en el mercado. Como alternativa, los ODN de cola amino
pueden sintetizarse de acuerdo con los procedimientos descritos en
la Patente U.S. No. 5.419.966 (solicitud con número de serie
08/090.408) presentada el 12 de julio de 1993, que ha sido
concedida y cuya tasa de ha sido abonada. La memoria descriptiva de
la solicitud con número de serie 08/090.408 se incorpora
expresamente en este documento como referencia. De acuerdo con el
presente esquema, el ODN de cola amino se convierte en una sal de
cetiltrimetilamonio para que sea soluble en disolventes orgánicos,
y la molécula de unión al surco menor activada con tetrafluorofenil
éster se condensa con ella, con preferencia en DMSO como
disolvente.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de Reacción
4
\vskip1.000000\baselineskip
El Esquema de Reacción 4 describe otro
procedimiento de acoplamiento de un éster activo de una molécula de
unión al surco menor con un ODN de cola 5'-amino. El
ejemplo mostrado en el esquema es el del éster de TFP del
tripéptido obtenido a partir de residuos de ácido
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
(TFP-CDPI_{3}) pero debe apreciarse que los
principios genéricos descritos con respecto a este esquema de
reacción pueden usarse también con otras moléculas de unión al surco
menor. En este procedimiento, el ODN aún está unido a un soporte de
CPG, y tiene un grupo amino libre en su "cola amino". Éste
puede obtenerse usando el fosforamidita de
N-monometoxitritilaminohexilo mencionado anteriormente. El
grupo monometoxitritilo se retira después del acoplamiento del
fosforamidita para dar el "ODN de cola amino" que tiene CPG.
Como alternativa, dicho CPG- puede obtenerse de acuerdo con la
descripción de la Patente de Estados Unidos Nº 5.419.966 (solicitud
con número de serie 08/090.408), y referencias citadas en ese
documento. A modo de resumen, el ODN se sintetiza por etapas unido
al CPG, y tiene una cola que tiene un grupo amino protegido con un
grupo 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Después de
que se haya construido la secuencia deseada de nucleótidos, el grupo
Fmoc se retira del grupo amino mientras que el ODN aún está unido
al soporte de CPG. De acuerdo con el Esquema de Reacción 4 de la
presente invención, este "ODN de cola amino que tiene CPG" que
tiene el grupo amino libre se condensa con el éster activo
(TFP-CDPI_{3}, 3c) o con una forma activada
similar de un agente de unión al surco menor. Después, el conjugado
de ODN-MGB se retira del soporte de CPG por
procedimientos convencionales, más frecuentemente por tratamiento
con
amoniaco.
amoniaco.
\vskip1.000000\baselineskip
Esquema de Reacción
5
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
El Esquema de Reacción 5 describe otro
procedimiento preferido para preparar los ODN-MGB de
la presente invención. Más particularmente, el Esquema de Reacción
5 describe el proceso sintético preferido para preparar los
ODN-MGB uniendo primero una molécula de unión a un
soporte de CPG, uniendo después una forma activada del agente de
unión al surco menor con la molécula de unión y construyendo después
el ODN de la secuencia etapa a etapa en un sintetizador de ODN
automático usando el soporte de CPG descrito ya modificado. El
conjugado ODN-MGB se retira del soporte de CPG sólo
después de que se haya completado el resto ODN de la secuencia
deseada. En este caso, la molécula de unión es una molécula
trifuncional, donde cada función tiene una reactividad diferente,
lo que permite la unión al CPG, la reacción con la forma activada
del resto de unión al surco menor y la construcción de la porción
de ODN, cada una usando una funcionalidad diferente de la molécula
de unión. Una descripción más general y detallada de este
procedimiento sintético y de las moléculas de unión trifuncionales
que pueden utilizarse en el procedimiento, pero sin ninguna
referencia a los agentes de unión al surco menor, puede encontrarse
en la Patente U.S. No. 5.419.966 (solicitud con número de serie
08/090.408). El Esquema de Reacción 5 ilustra este proceso
sintético con el ejemplo de
\beta-alanilil-3-amino-1,2-propanodiol
como molécula de unión trifuncional y
TFP-CDPI_{3} (compuesto 3c) como forma activada
del agente de unión al surco menor.
Por lo tanto, de acuerdo con el Esquema de
Reacción 5, se hace reaccionar \beta-alanina
protegida con Fmoc con trifluoroacetato de tetrafluorofenilo
(TFP-TFA) para proporcionar
3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)]-aminopropionato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (4). El éster activado
4 se hace reaccionar con
3-amino-1,2-propanodiol
para proporcionar
1-[3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2,3-propanodiol
(5). El grupo hidroxilo primario de 5 se protege después con un
grupo dimetoxitritilo para dar
1-[3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)-amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2-[[bis(metoxifenil)fenilmetoxi]metil]-2-etanol
(6). El grupo hidroxilo secundario del compuesto 6 se hace
reaccionar con anhídrido succínico y el grupo carboxílico del
compuesto resultante se convierte después en un éster activo,
1-[3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2-[[bis(metoxifenil)fenilmetoxi]metil]-2-etil-butanodioato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (7). Después, el
compuesto 7 se une a un soporte de vidrio poroso controlado por
aminoalquilo de cadena larga (LCAA-CPG, o
alquilamina CPG) que está disponible en el mercado y se ha descrito
en la Patente U.S. No. 5.419.966 citada anteriormente (solicitud con
número de serie 08/090.408). El "CPG modificado" resultante se
muestra en el Esquema de Reacción 5 como compuesto 8. El grupo
protector de Fmoc se retira de 8 por tratamiento con una base débil
(piperidina en dimetilformamida) para producir el "CPG
modificado" 9 que tiene una función amina primaria libre como
parte de la molécula de unión. En la siguiente etapa, la molécula
de unión al surco menor activada, en este caso
TFP-CDPI_{3} (compuesto 3c) se hace reaccionar con
la función amina primaria de 9, para producir el CPG modificado 10
que incluye el resto de unión al surco menor y aún tiene el grupo
hidroxilo primario del grupo de unión protegido con un grupo
dimetoxitritilo. Aunque esto no se muestra en el Esquema de
Reacción 5, en las siguientes etapas se retira el grupo
dimetoxitritilo y se realiza la síntesis del ODN en un sintetizador
automático, por etapas que ahora se consideran convencionales en la
técnica. Cuando se completa la síntesis, el conjugado
ODN-MGB se retira del soporte de CPG por tratamiento
con amoniaco. La última etapa escinde el enlace que une al grupo
hidroxilo secundario del resto
3-amino-1,2-propanodiol
al soporte de CPG.
Los conjugados ODN-MGB se unen
al ADN monocatenario. También se unen al ADN bicatenario en
presencia de una enzima recombinasa, y en algunos casos al ARN
monocatenario y también a híbridos de ADN y ARN. Sin embargo, la
unión se produce únicamente si el resto de ODN es complementario, o
sustancialmente complementario en el sentido de
Watson-Crick, a una secuencia diana en el ADN o ARN
diana. Cuando se cumple esta condición, la unión del
ODN-MGB con la secuencia diana es significativamente
más fuerte que la unión que se produciría si el mismo ODN no
tuviera el agente de unión al surco menor. Lo anterior se demuestra
por los ensayos que se describen a continuación, y proporciona
utilidad para los conjugados ODN-MGB de la presente
invención como sondas de hibridación analíticas y diagnósticas para
secuencias diana de ADN o ARN, y en aplicaciones terapéuticas
antisentido y anti-gen.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 1 ilustra la temperatura de fusión de
diversos complejos formados por oligonucleótidos complementarios
que tienen el resto de unión al surco menor obtenido a partir de
restos de ácido
4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico.
El resto de unión al surco menor se muestra específicamente como el
radical X por la fórmula que se encuentra bajo la Tabla 1. Debe
apreciarse que el radical X también incluye un resto de unión que se
obtiene a partir de ácido 6-aminohexanoico. Los
oligonucleótidos utilizados aquí son 8-meros de
ácido 2'-desoxiadenílico, y 8-meros
de ácido timidílico. El agente de unión al surco menor X se une a
los ODN en el extremo 3'-fosfato, y el extremo 5'
de estos ODN no tiene fosfato. A este respecto, debe apreciarse que
los ODN se abrevian en esta y otras tablas de la manera habitual en
la técnica. El grupo Y simboliza un residuo de bromuro de etidio
unido al extremo 3'-fosfato a través de un resto de
unión "\beta-alanina". El grupo Y representa
un grupo de intercalación y actúa como control para la comparación
con los grupos de unión al surco menor. El símbolo m representa el
número de residuos de ácido
4-amino-N-metil-pirrolo-2-carboxílico
presentes en cada ODN-MGB de la tabla.
Como se conoce en la técnica, la temperatura de
fusión (T_{m}) de un dúplex de oligonucleótidos o polinucleótidos
se define como la temperatura a la que el 50% del oligonucleótido o
polinucleótido respectivo se disocia de su dúplex, la forma unida
por enlaces de hidrógeno de Watson Crick. Una temperatura de fusión
mayor (T_{m}) significa un dúplex más estable. Como se sabe
también, la temperatura de fusión de un oligonucleótido o
polinucleótido depende de la concentración del nucleótido en la
solución en la que se mide la temperatura de fusión, de manera que
mayores concentraciones dan como resultado mayores temperaturas de
fusión medidas. Las temperaturas de fusión indicadas en estas
tablas se midieron en las condiciones indicadas en la tabla y en la
sección experimental. \DeltaT_{m} representa el cambio en la
temperatura de fusión del dúplex modificado en relación con la
temperatura de fusión del complejo
(dAp)_{8}\cdot(dTp)_{8} que no tiene
resto de unión al surco menor.
Como puede observarse en la Tabla 1, el resto de
unión al surco menor unido covalentemente aumenta
significativamente la estabilidad (temperatura de fusión T_{m})
del complejo, tanto si el grupo X (resto de unión al surco menor)
se une al oligonucleótido (dTp)_{8} como si se une al
(dAp)_{8}. En este caso, el mayor grado de estabilización
(mayor temperatura de fusión) se alcanza cuando el resto de unión al
surco menor es un oligopéptido 5-mero. En el
experimento comparativo, cuando el grupo de intercalación Y se une
al oligómero (dAp)_{8}, se logra un grado de estabilización
comparativamente mucho menor. Incluso uniendo el grupo de
intercalación Y a cada una de las dos cadenas de oligómeros en este
experimento, la temperatura de fusión aumentaba menos que el resto
de unión al surco menor que tenía cinco residuos de ácido
4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico.
La Tabla 2 describe la información de una manera
similar a la Tabla 1. En los ensayos reportados en esta tabla, los
ODN 16-meros de ácido timidílico que tienen el
resto de unión al surco menor representado por X (X es igual que en
la Tabla 1) se complejaron con ácido polidesoxirriboadenílico. Como
control comparativo, también se ensayó un ODN
16-mero de ácido timidílico (dTp)_{16}
conectado en su extremo 3'-fosfato con ácido
6-aminohexanoico. Además, también se ensayaron un
8-mero de ácido timidílico (dTp)_{8} y sus
conjugados con los agentes de unión al surco menor de longitud
peptídica variable. En estos dos ensayos, además, el agente de
unión al surco menor unido al ODN provocó una estabilización
significativa del complejo entre el ODN-MGB y la
cadena complementaria de ADN. La mayor estabilización se produce
cuando el número de residuos de ácido
4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico
en el resto de unión al surco menor es cinco. Por el contrario, la
cola de ácido aminohexanoico del ODN 16-mero
virtualmente da como resultado la no estabilización del
complejo.
La Tabla 3 describe los datos de temperatura de
fusión (T_{m}) y cambio en la temperatura de fusión
(\DeltaT_{m}) en ensayos en los que el oligonucleótido es un
8-mero de ácido timidílico que tiene un resto de
unión al surco menor unido a cualquiera de los extremos
5'-fosfato o 3'-fosfato, como se
indica en la tabla. Los restos de unión al surco menor
representados aquí por X e Y son "oligopéptidos" basados en el
residuo de ácido
1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
(CDPI o BocDPI) y sus estructuras se muestran en la tabla. Estos
oligopéptidos de unión al surco menor se une al ODN a través de un
resto de unión "L1 o L2", cuyas estructuras también se
muestran a continuación en la tabla. Los conjugados
ODN-MGB se incubaron con un ribo- o desoxirribo-
homopolímero complementario. Por lo tanto, para los conjugados
ODN-MGB que comprenden ODN de ácido timidílico, se
usó poli A o poli-dA. El cambio en la temperatura de
fusión (\DeltaT_{m}) se indica con respecto al complejo con el
ODN que tiene el grupo de unión correspondiente L1 o L2 en el
extremo correspondiente del ODN, pero no tiene ningún resto de
unión al surco menor. Como puede observarse en la Tabla 3, estos
complejos de ODN-MGB muestran nuevamente una
estabilización significativa del complejo con el
desoxirribohomopolímero complementario, produciéndose la mayor
estabilización en estos ensayos cuando el resto de unión al surco
menor tiene 3 unidades CDPI. Sorprendentemente, la estabilización
del complejo se produce incluso cuando el ODN-MGB
se incuba con un ribohomopolímero complementario. Esto es
sorprendente debido a que se ha observado generalmente en la
técnica anterior que las moléculas de unión al surco menor que
permanecen libres no se unen a híbridos de
ADN-ARN.
La Tabla 4 describe los resultados de un estudio
de formación de dúplex entre derivados de dos octámeros
complementarios: CpApTpCpCpGpCpT y ApGpCpGpGpApTpG. Cada octámero se
modificó, como se muestra en la tabla, para examinar la hibridación
de los oligodesoxirribonucleótidos correspondientes y de los
oligodesoxirribonucleótidos que tienen un esqueleto de
fosforotioato. El ODN también tenía un tripéptido basado en los
residuos de ácido
1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
(CDPI) (resto de unión al surco menor X) unido al extremo 3' o al
5' (como se indica) a través de un grupo de unión de la estructura
L1 o L2. (X, L1 y L2 son iguales que en la Tabla 3.) Como control,
también se determinó la temperatura de fusión de los dúplex para
dúplex en los que los ODN soportaban únicamente los grupos de
unión. Como puede observarse en la tabla, los dúplex se
estabilizaron significativamente por la presencia de un resto de
unión al surco menor, y se producía una mayor estabilización cuando
cada cadena del dúplex tenía un agente de unión al surco menor unido
covalentemente.
La Tabla 5 describe los datos de temperatura de
fusión obtenidos cuando se incubaron ODN-MGB
complementarios o "cuasi-complementarios" y se
examinaron para determinar la formación de dúplex. El resto de unión
al surco menor X y los grupos de unión L1 y L2 se muestran en la
tabla y son iguales que en las Tablas 3 y 4. Como se anticipó,
cuando se reemplaza guanina por inosina (I) en las cadenas, la unión
de los dúplex es muy débil (T_{m} es de aproximadamente 0ºC) si
no está presente ningún resto de unión al surco menor. Sin embargo,
cuando se reemplaza guanina por inosina en los oligonucleótidos, la
presencia de un agente de unión al surco menor unido covalentemente
X estabilizaba el híbrido en casi 50ºC y la presencia de dos de
estos agentes de unión al surco menor en orientación antiparalela
proporcionaba 63ºC de estabilización. Cuando las mismas cadenas
contenían guanina, un agente de unión al surco menor aumentó la
T_{m} en 15ºC mientras que dos la aumentaron en casi 45ºC. Para
el conocimiento de los inventores de la presente invención, una
T_{m} de 81ºC para un 8-mero no tiene precedentes
en la técnica anterior.
Se demostró que se requiere esa especificidad de
secuencia en el sentido de Watson-Crick de la parte
de ODN del conjugado ODN-MGB para complejar el
conjugado ODN-MGB con una secuencia diana por un
experimento de extensión de cebador. En este experimento, la
extensión de cebador se produce con la enzima ADN polimerasa de T7
que trabaja desde el extremo 5' de una cadena de plantilla. Se
incubó un 16-mero ODN-MGB que era
complementario en el sentido de Watson Crick a una secuencia diana
de la cadena plantilla con una plantilla de ADN monocatenario y la
enzima T7 ADN polimerasa. El bloqueo de la extensión del cebador se
apreció en el sitio de unión con el ODN-MGB cuando
el resto de unión al surco menor estaba en el extremo 5' del
16-mero ODN. El agente de unión al surco menor era
el tripéptido de pirroloindol mostrado en esta solicitud en la Tabla
5. Cuando existía una sola disparidad en la especificidad de
secuencia del 16-mero con la diana, no se bloqueó la
extensión del cebador. La extensión del cebador tampoco se bloqueó
cuando el resto de unión al surco menor estaba unido al extremo 3'
del 16-mero. La extensión del cebador tampoco se
bloqueó cuando el 16-mero de secuencia específica y
la molécula de unión al surco menor libre (compuesto 3d, no unido
covalentemente al ODN) se incubó con la plantilla y la enzima.
Estos experimentos demuestran que la especificidad de secuencia del
ODN-MGB es importante para la formación de
complejos, y que el resto de unión al surco menor no actúa
simplemente como un "soporte" para la unión no específica del
ODN adjunto a otra cadena. La capacidad de los conjugados
ODN-MGB para inhibir la extensión del cebador
indica que estos conjugados pueden usarse diagnósticamente como
agentes de sujeción para la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). (véase Nucleic Acid Research (1993) 21:
5332-5336).
Los conjugados ODN-MGB de la
presente invención son útiles como sondas de hibridación. Esto se
demuestra por la descripción del siguiente experimento utilizando
un conjugado ODN-MGB marcado con ^{32}P como sonda
de diagnóstico. Cuando se compara con el mismo ODN sin un resto de
unión al surco menor (MGB) unido covalentemente, el conjugado
hibrida con su complemento con mayor fuerza, eficacia y
especificidad. El ensayo de hibridación slot-blot
es un ensayo de diagnóstico con sondas de ADN usado ampliamente, y
los atributos de estos conjugados MGB-ODN mejoran
el rendimiento del ensayo.
Específicamente, en el experimento descrito en
este documento se siguió un protocolo convencional, como se
describe en Protocols for Nucleic Acid Blotting and
Hybridization, 1988, Amersham, United Kingdom. Se cuantificó un
ODN de ensayo marcado que hibridaba con el plásmido inmovilizado
como cuentas por minuto (cpm), y se representó frente a la
temperatura de hibridación. Se evaluaron cuatro sondas
16-méricas complementarias al ADN de M13mpl9 (un
ADN de fago). Dos de estas sondas fueron totalmente complementarias
a un sitio en el ADN del fago; una de éstas contenía un resto
CDPI_{3} conjugado en posición 3' mientras que la otra no se
había modificado. El segundo par de sondas se dirigió al mismo sitio
en el ADN de M13mpl9 pero cada uno contenía un solo desacoplamiento
(subrayado en el dibujo de la Figura 1). Aquí de nuevo, un ODN
estaba conjugado en posición 3' con CDPI3 mientras que el otro no
se había modificado.
Los resultados del estudio de hibridación slot
se muestran en la Figura 1. En comparación con un
16-mero no modificado pero por lo demás idéntico,
la sonda que contenía CDPI_{3} formaba un híbrido con una
temperatura de fusión (T_{m}) de 50ºC frente a sólo 33ºC. Esta
mayor temperatura de fusión produjo un rendimiento más de dos veces
mayor que el rendimiento de los híbridos perfectamente emparejados.
Cuando se introdujo un desacoplamiento en cualquier sonda, se
redujo la estabilidad de los híbridos respectivos. Las sondas
modificadas con CDPI_{3} presentaron una buena discriminación de
secuencia entre 37º-50ºC. Además, en las condiciones de hibridación
usadas aquí no hubo pruebas de unión del resto CDPI_{3} a regiones
bicatenarias preexistentes en la diana de ADN de M13mpl9, indicando
que no está presente una unión totalmente no específica de estos
conjugados.
Los conjugados ODN-MGB de la
presente invención que también llevan un agente de alquilación unido
covalentemente pueden usarse como agentes
"anti-gen", es decir, para la supresión de la
expresión de genes indeseados (que producen enfermedades), siempre
que el conjugado ODN-MGB sea complementario a una
secuencia diana en el gen diana. En este caso, el resto MGB mejora
la unión al gen bicatenario (en presencia de una enzima recombinasa)
y el resto alquilante produce una unión covalente permanente del
conjugado ODN-MGB a la secuencia diana.
Como experimento demostrativo, el ODN
50-mérico descrito anteriormente que estaba
modificado en el extremo 3' con un grupo CDPI_{3} y modificado
internamente con un grupo de mostaza nitrogenada (clorambucilo)
formaba enlaces cruzados con especificidad de secuencia con el sitio
esperado en un gen diana (alelo HLA DQ\beta1 0302) presente en
células BSM humanas vivas (una línea celular de linfocitos B
humana). El conjugado ODN-MGB se añadió a una
suspensión de células BSM a una concentración final de
1-50 \muM. Después de 3,5 h, se extrajo el ADN
genómico y se trató con pirrolidina caliente para convertir
cualquier suceso de alquilación en muescas. A continuación, la
región diana del alelo 0302 se amplificó por LM-PCR
(reacción en cadena de la polimerasa mediada por ligamiento), una
técnica que puede usarse para detectar sucesos de unión en la
resolución de una sola base. El análisis de los productos en un gel
de secuenciación demostró que el ODN modificado se había unido y
alquilado el sitio diana. Un ODN similar que carecía del grupo
CDPI_{3} era considerablemente menos eficaz en eficacia de
alquilación del sitio diana.
Es probable que en el experimento anterior, el
reconocimiento y unión del conjugado ODN-MGB al ADN
bicatenario homólogo tenga lugar con la ayuda de recombinasas
nucleares. En experimentos y aplicaciones similares, las enzimas
recombinasas endógenas pueden catalizar la dirección con
especificidad de secuencia del ADN genómico bicatenario por
conjugados ODN-CDPI3 en otras células vivas. Cuando
estos ODN tienen un agente de entrecruzamiento unido, pueden
alquilar al ADN diana. Al estabilizar el bucle D formado en
presencia de recombinasa, el CDPI_{3} promueve la reacción de
entrecruzamiento. El suceso de entrecruzamiento es un inhibidor
poderoso de la expresión del gen diana. De esta manera, el
entrecruzamiento de conjugados ODN-CDPI^{3} puede
usarse como agentes anti-genes.
Todas las reacciones sensibles al aire y al agua
se realizaron con una ligera presión positiva de argón. Los
disolventes anhidros se obtuvieron en Aldrich (Milwaukee, WI). La
cromatografía de Flash se realizó en gel de sílice de malla
230-400. Los puntos de fusión se determinaron en un
aparato de puntos de fusión Mel-Temp en capilares
abiertos y se presentan sin corregir. El análisis elemental se
realizó por Quantitative Technologies Inc. (Boundbrook, NJ). Los
espectros de absorción UV-visible se registraron en
el intervalo de 200-400-nm en un
espectrofotómetro UV-2100 (Shimadzu) o Lambda 2
(Perkin Elmer). Los espectros de ^{1}H RMN se realizaron a 20ºC
en un espectrofotómetro Bruker WP-200 o en un
espectrofotómetro Varian XL-200; los desplazamientos
químicos se reportan en ppm campo abajo de Me_{4}Si.
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (1a). Se añadió
gota a gota trifluoroacetato de
2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,6 g, 10 mmol, H.B.
Gamper, M.W. Reed, T. Cox, J.S. Virosco, A.D. Adams, A.A. Gall,
J.K. Scholler y R.B. Meyer, Jr. Nucleic Acids Res.,
1993, Vol, 21, No. 1, 145-150) a una
solución de ácido
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
(1,4 g, 6,1 mmol, D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J. Invergo. J.
Org. Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530) y
trietilamina (1,4 ml, 10 mmol) en 15 ml de DMF anhidra. Después de
1 h, la mezcla de reacción se concentró al vacío (0,2 mm). El
residuo se trituró con 2 ml de diclorometano seco. Se añadió éter
etílico (50 ml) y la mezcla se dejó a 0ºC durante una noche. El
precipitado se recogió por filtración en un embudo de vidrio
sinterizado, se lavó primero con éter al 50%/CH_{2}Cl_{2} (10
ml) y después con éter (50 ml) y se secó al vacío. El producto se
obtuvo en forma de un sólido amarillo (1,8 g, 75%): ^{1}H RMN
(Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,32 (s, 1H, NH), 8,13
(d, 1H, J = 9 Hz, C4-H), 8,01 (m, 1H,
C_{6}F_{4}H), 7,41 (s, 1H, C8-H), 7,26 (d, 1H,
J = 9 Hz, C5-H), 6,17 (s, 2H, CONH_{2}),
3,99 (t, 2H, J = 9 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,30 (t, 2H, J
= 9 Hz, NCH_{2}CH_{2}). Anál. calc. para
C_{18}H_{11}N_{3}O_{3}F_{4} x 2H_{2}O: C, 50,3; H,
3,52; N, 9,7. Encontrado: C, 50,81; H, 3,60; N, 9,95.
3-(terc-Butiloxicarbonil)-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (1b). Se añadió
gota a gota trifluoroacetato de
2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,6 g, 10 mmol) a una
solución de ácido
3-(terc-butiloxicarbonil)-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
(1,0 g, 3,7 mmol, D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J. Invergo. J.
Org. Chem., 1987, Vol. 52, 1521-1530) y
trietilamina (1,5 ml, 10 mmol) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}
anhidro. Después de 4 h, el CH_{2}Cl_{2} se retiró por
evaporación a presión reducida. La cromatografía por Flash (4 x 20
cm, hexano-acetato de etilo, 1:2) proporcionó 1b en
forma de un sólido cristalino amarillo (1,25 g, 75%): ^{1}H RMN
(Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,39 (d, 1H, J =
1,4 Hz, NH), 8,02 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 7,9 (br s 1H,
C4-H), 7,45 (d, 1H, J = 1,4 Hz,
C8-H), 7,33 (d, 1H, J = 9 Hz,
C5-H), 4,02 (t, 2H, J = 9 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 3,26 (t, 2H, J = 9 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 1,51 (s, 9H, C(CH_{3})_{3}).
Anál. calcd. para C_{22}H_{18}N_{2}O_{4}F_{4}: C, 58,67;
H, 4,03; N, 6,22. Encontrado: C, 58,45; H, 4,09; N, 6,13.
Éster metílico de dímero de
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
(2a). Una solución de
1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato
de metilo (0,6 g, 1,5 mmol), 1a (0,45 g, 2,25 mmol) y trietilamina
(0,2 ml, 1,4 mmol) en 10 ml de DMF anhidra se incubó a TA durante 24
h y después a 0ºC durante 12 h. El sólido insoluble resultante se
recogió por filtración y se lavó con DHF (10 ml) y éter (20 ml). El
secado al vacío proporcionó 2a (0,61 g, 91%) en forma de un sólido
amarillo pálido: (^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz,
ppm) 12,00 (d, 1H, J = 1,8 Hz, NH'), 11,54 (s, 1H, NH), 8,28
(d, 1H, J = 9 Hz, C4'-H), 7,97 (d, 1H, J
= 9 Hz, C4-H), 7,33 (d, 1H, J = 9 Hz,
C5'-H), 7,22 (d, 1H, J = 9 Hz,
C5-H), 7,13 (d, 1H, J = 1,4 Hz,
C8'-H), 6,94 (d, 1H, J = 1,1 Hz,
C8-H), 6,01 (s, 2H, CONH_{2}), 4,62 (t, 2H, J
= 8 Hz, (NH_{2}CH_{2})'), 3,98 (t, 2H, J = 8 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 3,88 (s, 3H, CH_{3}), 3,41 (t, 2H, J =
8 Hz, (NCH_{2}CH_{2})'), 3,29 (t, 2H, NCH_{2}CH_{2},
parcialmente oscurecido con agua). Anál. calc. para
C_{24}H_{21}N_{5}O_{5} x 1H_{2}O x 1DMF: C, 58,69; H,
5,84; N, 15,21. Encontrado: C, 58,93; H, 5,76; N, 15,82.
Éster metílico de dímero de
3-(terc-butiloxicarbonil)-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
(2c). Una solución de
1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato
de metilo (0,5 g, 2,5 mmol), 1b (1,0 g, 2,2 mmol) y trietilamina
(0,1 ml, 0,7 mmol) en 10 ml de DMF anhidra se incubó a TA durante 10
h y a 0ºC durante 12 h. El sólido insoluble resultante se recogió
por filtración y se lavó con DMF (5 ml) y éter (40 ml). El secado
al vacío proporcionó 2c (0,81 g, 74%) en forma de un sólido
blanquecino: ^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm)
12,01 (s, 1H, NH'), 11-64 (s, 1H, NH), 8,28 (d, 1H,
J = 9 Hz, C4'-H), 7,8 (br s, 1H,
C4-H), 7,32 (t aparente, 2H, C5'-H
+ C5-H), 7,13 (d, 1H, J = 1,1 Hz,
C8'-H), 6,98 (d, 1H, J = 1,1 Hz,
C8-H), 4,62 (t, 2H, J = 8 Hz,
(NH_{2}CH_{2})'), 4,02 (t, 2H, J = 8 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 3,88 (s, 3H, CH_{3}), 3,41 (t, 2H, J =
8 Hz, (NCH_{2}CH_{2})'), 3,25 (t, 2H, NCH_{2}CH_{2}), 1,52
(s, 9H, C(CH_{3})). Anál. calc. para
C_{28}H_{28}N_{4}O_{5}: C, 67,19; H, 5,64; N, 11,19.
Encontrado: 66,72, H, 5,69; N, 11,31.
Dímero de
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2a). Se añadió
gota a gota trifluoroacetato de
2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,6 g, 10 mmol) a una
suspensión de 2b (1,2 g, 2,8 mmol, D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J.
Invergo. J. Org. Chem., 1987, Vol. 52,
1521-1530) en 15 ml de DMF anhidra. Se añadió
trietilamina (1,4 ml, 10 mmol) y la mezcla se agitó durante 3 h. La
mezcla se concentró al vacío (0,2 mm) usando un evaporador
rotatorio. El residuo se trituró con 20 ml de diclorometano seco.
El producto obtenido se filtró, se lavó con diclorometano (10 ml) y
éter (20 ml) y se secó al vacío para dar 2e en forma de un sólido
amarillo (1,5 g, 93%): (^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6},200
MHz, ppm) 12,51 (d, 1H, J = 1,8 Hz, NH'), 11,58 (s, 1H, NH),
8,39 (d, 1H, J = 8,9 Hz, C4'-H), 8,04 (m, 1H,
C_{6}F_{4}H), 7,98 (d, 1H, J = 8,8 Hz,
C4-H), 7,58 (s, 1H, C8'), 7,42 (d, 1H, J = 9
Hz, C5'-H), 7,22 (d, 1H, J = 9 Hz,
C5-H), 6,98 (s, 1H, C8-H), 6,11 (s,
2H, CONH_{2}), 4,66 (t, 2H, J = 7,8 Hz,
(NCH_{2}CH_{2})'), 3,94 (t, 2H, J = 9,1 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 3,47 (t, 2H, J = 8 Hz,
(NCH_{2}CH_{2})'), 3,29 (t, 2H, J = 9,1 Hz,
NCH_{2}CH_{2}). Anál. calc. para
C_{29}H_{19}N_{5}O_{4}F_{4} x 1,5H_{2}O: C, 57,62; H,
3,67; N, 11,59. Encontrado: C, 57,18; H, 3,31; N, 11,54.
Dímero de
3-(terc-butiloxicarbonil)-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2f). Se añadió
gota a gota trifluoroacetato de
2,3,5,6-tetrafluorofenilo (0,75 g, 2,9 mmol) a una
suspensión de 2d (0,25 g, 0,5 mmol, D.L. Boger, R.S. Coleman y B.J.
Invergo. J. Org. Chem., 1987, Vol. 52,
1521-1530) y trietilamina (0,5 ml, 3,5 mmol) en una
mezcla de CH_{2}Cl_{2} anhidro (8 ml) y DMF (2 ml). La mezcla
se agitó durante 20 h. La solución transparente resultante se
concentró al vacío y se añadió gota a gota a 40 ml de acetato
sódico 1 M (pH 7,5). El precipitado se centrifugó y se lavó con agua
(2 x 40 ml), con MeOH al 10% en éter (2 x 40 ml), con éter (40 ml)
y con hexano (40 ml). Finalmente, se secó al vacío para dar 2f en
forma de un sólido amarillo pálido (0,29 g, 91%); (^{1}H RMN
(Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,51 (s, 1H, NH'), 11,66
(s, 1H, NH), 8,37 (d, 1H, J = 8,8 Hz, C4'-H),
8,03 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 7,8 (br s, 1H,
C4-H), 7,58 (s, 1H, C8'-H), 7,40 (d,
1H, J = 9,1 Hz, C5'-H), 7,27 (d, 1H, J
= 8,6 Hz, C5-H), 7,1 (s, 1H,
C8-H), 4,65 (t, 2H, J = 8 Hz,
(NCH_{2}CH_{2})'), 4,02 (t, 2H, J = 9 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 3,46 (t, 2H, J = 8 Hz,
(NCH_{2}CH_{2})'), 3,25 (t, 2H, J = 8,9 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 1,51 (s, 9H, C(CH_{3})_{3}).
Anál. calc. para C_{33}H_{26}N_{4}O_{5}F_{4} x
0,5H_{2}O: C, 61,59; H, 4,23; N, 8,71. Encontrado: C, 61,73; H,
4,12; N, 8,61.
Éster metílico de trímero de
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
(3a). Una solución de
1,2-dihidro-3H-pirroloindolo-7-carboxilato
de metilo (1,0 g, 5 mmol), 2e (1,2 g, 2,1 mmol) y trietilamina (0,1
ml, mmol) en 15 ml de DMF anhidra se incubó a TA durante 24 h y a
0ºC durante 12 h. El sólido insoluble resultante se recogió por
filtración y se lavó con DMF (10 ml), CH_{2}Cl_{2} (20 ml) y
éter (20 ml). El secado al vacío proporcionó 3a (1,1 g, 83%) en
forma de un sólido amarillo pálido: (^{1}H RMN
(Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,02 (s, 1H, NH''),
11,75 (s, 1H, NH''), 11,56 (s, 1H, NH), 8,28 (t aparente, 2H, J
= 8,3 Hz, C4-H'' + C4'-H), 7,98
(d, 1H, J = 9,4 Hz, C4-H), 7,98 (d, 1H, J
= 9 Hz, C4-H), 7,39-7,33 (2 d,
2H, C5''-H+C5'-H), 7,23 (d, 1H, J
= 8,7 Hz, C5-H), 7,14 (d, 1H, J = 1,6 Hz,
C8''-H), 7,10 (d, 1H, J = 1 Hz,
C8'-H), 6,97 (s, 1H, C8-H), 6,11 (s,
2H, CONH_{2}), 4,65 (t, 4H, (NCH_{2}CH_{2})'' +
(NCH_{2}CH_{2})'), 3,98 (t, 2H, J = 8,7 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 3,88 (s, 3H, CH_{3}),
3,48-3,25 (m, 6H, (NCH_{2}CH_{2})'' +
(NCH_{2}CH_{2})' +
NCH_{2}CH_{2} parcialmente oscurecido con H_{2}O). Anál. calc. para C_{35}H_{29}N_{7}O_{5} x 4,5H_{2}0: C, 59,32; H, 5,0; N, 13,03. Encontrado: C, 58,9; N, 5,06; N, 13,77.
NCH_{2}CH_{2} parcialmente oscurecido con H_{2}O). Anál. calc. para C_{35}H_{29}N_{7}O_{5} x 4,5H_{2}0: C, 59,32; H, 5,0; N, 13,03. Encontrado: C, 58,9; N, 5,06; N, 13,77.
Trímero de
3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxilato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (3e). Se añadió
gota a gota trifluoroacetato de
2,3,5,6-tetrafluorofenilo (2,6 g, 10 mmol) a una
suspensión de 3b (1,1 g, 1,8 mmol) en 15 ml de DMF anhidra y
trietilamina (1,4 ml, 10 mmol). La mezcla se agitó durante 3 h. La
mezcla se concentró al vacío (0,2 mm). El residuo se trituró con una
mezcla de diclorometano seco (20 ml) y metanol (2 ml). El producto
resultante se recogió por filtración, se lavó con diclorometano (20
ml) y éter (20 ml) y se secó al vacío para dar 1,3 g (95%) de un
sólido amarillo-verde. (^{1}H RMN
(Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 12,54 (d, 1H, J =
1 Hz, NH''), 11,79 (s, 1H, NH'), 11,56 (s, 1H, NH), 8,41 (d, 1H,
J = 9,3 Hz, C4-H''), 8,27 (d, 1H, J =
9,4 Hz, C4'-H), 8,03 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 7,98
(d, 1H, J = 9 Hz, C4-H), 7,56 (s, 1H,
C8''-H), 7,45-7,35 (m, 2H,
C5''-H+C5'-H), 7,23 (d, 1H, J
= 9,2 Hz, C5-H), 7,13 (s, 1H,
C8'-H), 6,97 (s, 1H, C8-H), 6,11 (s,
2H, CONH_{2}), 4,65 (m, 4H, (NCH_{2}CH_{2})'' +
(NCH_{2}CH_{2})'), 3,98 (t, 2H, J = 8,7 Hz,
NCH_{2}CH_{2}), 3,45 (m, 4H, (NCH_{2}CH_{2})'' +
(NCH_{2}CH_{2})''), 3,25 (t, 2H, J = 8,7 Hz,
NCH_{2}CH_{2}). Anál. calc. para
C_{40}H_{27}N_{7}O_{5}F_{4} x 2H_{2}O: C, 61,59; H,
4,23; N, 8,71. Encontrado: C, 61,73; H, 4,12; N, 8,61.
Trímero de
(3-carbamoil-1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxi)-1-amido-3-propanol
(3d). Una solución de
3-amino-1-propanol
(70 \mul, 1,4 mmol), 3c (75 mg, 0,1 mmol) y trietilamina (0,1 ml,
mm) en 2,5 ml de DMF anhidra se agitó a TA durante 10 h. El sólido
insoluble resultante se recogió por filtración y se lavó con DMF (2
ml), CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y éter (20 ml). El secado al vacío
proporcionó 3d (55 mg, 89%) en forma de un sólido amarillo pálido:
(^{1}H RMN (Me_{2}SO-d_{6}, 200 MHz, ppm) 11,76 (s, 1H,
NH''), 11,65 (s, 1H, NH'), 11,57 (s, 1H, NH), 8,47 (m, 1H,
C4-H), 8,24 (m, 1H, C4-H), 7,99 (d,
1H, J = 8,4 Hz, C4-H),
7,40-7,32 (2d, 2H,
C5''-H+C5'-H), 7,23 (d, 1H, J
= 8,9 Hz, C5-H), 7,12 (s, 1H,
C8''-H), 7,10 (s, 1H, C8'-H), 6,99
(s, 1H, C8-H), 6,12 (s, 3H, CONH_{2} + NHCO), 4,66
(t, 4H, (NCH_{2}CH_{2})'' + (NCH_{2}CH_{2})'), 3,98 (t, 2H,
J = 8,7 Hz, NCH_{2}CH_{2}), 3,51-3,25 (m,
10H, (NCH_{2}CH_{2})'' + (NCH_{2}CH_{2})' +
NCH_{2}CH_{2} + NHCH_{2} + CH_{2}OH parcialmente oscurecido con H_{2}O), 1,70 (p, 2H, J = 6,6 Hz, CH_{2}CH_{2}CH_{2}).
NCH_{2}CH_{2} + NHCH_{2} + CH_{2}OH parcialmente oscurecido con H_{2}O), 1,70 (p, 2H, J = 6,6 Hz, CH_{2}CH_{2}CH_{2}).
3-[N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)]aminopropionato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (4). Se añadió gota
a gota trifluoroacetato de
2,3,5,6-tetrafluorofenilo (1,7 g, 6,5 mmol) a una
solución de FMOC-alanina (2,0 g, 6,4 mmol) y
trietilamina (1,0 ml, 7 mmol) en 20 ml de CH_{2}Cl_{2} anhidro.
Después de 1 h, el CH_{2}Cl_{2} se retiró por evaporación a
presión reducida usando un evaporador rotatorio y se disolvió de
nuevo en 30 ml de acetato de etilo/hexano (1:1). La cromatografía
por Flash (4 x 20 cm, hexano/acetato de etilo, 3:1) proporcionó 4
bruto en forma de un sólido blanco. Se recristalizó en
hexano/acetato de etilo para dar 4 en forma de un sólido cristalino
blanco (2,3 g, 78%): ^{1}HRMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm) 7,73 (d,
2H, J = 7,1 Hz, protones aromáticos), 7,75 (d, 2H, J
= 7,7 Hz, protones aromáticos), 7,24-7,42 (m,
4H, protones aromáticos), 7,01 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 5,21 (br
s, 1H, -CONH-), 4,38 (d, 2H, J = 7,1 Hz, -CH_{2}OCO-), 4,20
(m, 1H, protón bencilo), 3,58 (m, 2H, NCH_{2}), 2,93 (t, 2H, J
= 5,4 Hz, -CH_{2}CO-). Anál. calc. para
C_{24}H_{17}NO_{4}F_{4}: C, 62,75; H, 3,73; N, 3,05.
Encontrado: C, 62,52; H, 3,59; N, 3,01.
1-[3-[N-(9-Fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2,3-propanodiol
(5). Una solución de 4 (2,0 g, 4,35 mmol) en 20 ml de
CH_{2}Cl_{2} anhidro se añadió a una solución agitada de
3-amino-1,2-propanodiol
(0,6, mmol) en 10 ml de MeOH. Después de 10 min, se añadió ácido
acético (3 ml) y la mezcla se evaporó a sequedad. El residuo se
trituró con 100 ml de agua. El sólido obtenido se retiró por
filtración, se lavó con agua y se secó por
co-evaporación con tolueno (2 x 50 ml) a presión
reducida. El lavado con 50 ml de acetato de etilo seguido de secado
al vacío durante una noche proporcionó 5 en forma de un sólido
cristalino blanco (1,65 g, 99%): ^{1}H RMN (CDCl_{3} +
MeOD-d_{4}, 200 MHz, ppm, Me_{4}Si) 7,77 (d, 2H,
J = 7,7 Hz, protones aromáticos), 7,61 (d, 2H, J =
7,3 Hz, protones aromáticos), 7,45-7,29 (m, 4H,
protones aromáticos), 4,35 (d, 2H, J = 7,1 Hz,
-CH_{2}OCO-), 4,22 (m, 1H, protón bencilo), 3,72 (m, 1H, -CH- de
NHCH_{2}CHOHCH_{2}OH), 3,52-3,27 (m, 6H,
OCONHCH_{2} + CH_{2}CHOHCH_{2}OH), 2,44
(t, 2H, J = 6,6 Hz, -CH_{2}CO-); Anál. calc. para
C_{21}H_{24}N_{2}O_{5}: C, 5,61; H, 6,29; N, 7,29%.
Encontrado: C, 65,43; H, 6,28; N, 7,21.
1-[3-[N(9-Fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2-[[bis(metoxifenil)fenilmetoxi]metil]-2-etanol
(6). A una solución agitada de 5 (1,6 g, 4,2 mmol) en 30 ml de
piridina anhidra se le añadió DMTrCl (1,6 g, 4,7 mmol). Después de
agitar durante 3 h en una atmósfera de argón, la mezcla se evaporó a
sequedad. La piridina residual se retiró por
co-evaporación con tolueno. El residuo se disolvió
en 100 ml de CH_{2}Cl_{2}, se lavó con 2 x 100 ml de agua, se
secó sobre sulfato sódico y se evaporó a sequedad. El residuo se
purificó por cromatografía por Flash (4 x 20 cm, sílice) usando
acetato de etilo como eluyente. Las fracciones que contenían el
producto puro se combinaron y se evaporaron a sequedad para producir
1,9 g (66%) de 6 en forma de una espuma incolora. ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 200 MHz, ppm, Me_{4}Si) 7,72 (d, 2H, J = 7,2
Hz, protones aromáticos), 7,56 (d, 2H, J = 7 Hz, protones
aromáticos), 7,40-7,20 (m, 13H, protones
aromáticos), 6,80 (d, 4H, J = 9 Hz, protones DMTr), 5,76 (br
s, 1H, NH), 5,42 (br s, 1H, NH), 4,35 (d, 2H, J = 6,6 Hz,
-CH_{2}OCO-), 4,17 (m, 1H, protón bencilo), 3,83 (m, 1H, -CH- de
NHCH_{2}CHOHCH_{2}OH), 3,75 (s, 6H, OCH_{3}),
3,60-3,30 (m, 4H, OCONHCH_{2} +
CH_{2}CHOHCH_{2}OH), 3,13 (d, 2H, J = 5,4 Hz,
CH_{2}ODMTr), 2,30 (t, 2H, J = 5,4 Hz, -CH_{2}CO-);
Anál. calc. para C_{42}H_{42}K_{2}O_{7}: C, 73,45; H, 6,16;
N, 4,08. Encontrado: C, 65,43; H, 6,28; N, 7,21.
1-[3-[N-(9-fluorenilmetoxicarbonil)amino]-1-oxopropil]amino-(R,S)-2-[[bis(metoxifenil)fenilmetoxi]metil]-2-etilbutanodioato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (7). A una
solución de 6 (1,2 g, 1,75 mmol), trietilamina (0,2 g, 2 mmol) y
1-metilimidazol (20 \mul) en 10 ml de
CH_{2}Cl_{2} anhidro se le añadieron 0,2 g (2 mmol) de anhídrido
succínico. Esta solución se agitó durante 20 h. A la solución se le
añadió trietilamina (60 \mul) seguido de 0,6 g (2,2 mmol) de
trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo.
Después de 1 h, el CH_{2}Cl_{2} se retiró por evaporación a
presión reducida usando un evaporador rotatorio y el residuo se
disolvió en 15 ml de acetato de etilo/hexano (1:2). La
cromatografía por Flash (4 x 20 cm, hexano/acetato de etilo, 2:1)
proporcionó 1b en forma de una espuma amarilla pálida (1,2 g, 73%):
^{1}H RMN (CDCl_{3}, 300 MHz, ppm, Me_{4}Si) 7,71 (d, 2H,
J = 7,2 Hz, protones aromáticos), 7,54 (d, 2H, J = 7
Hz, protones aromáticos), 7,40-7,20 (m, 13H,
protones aromáticos), 7,00 (m, 1H, C_{6}F_{4}H), 6,78 (d, 4H,
J = 7 Hz, protones DMTr), 5,71 (br s, 1H, NH), 5,42 (br s,
1H, NH), 5,15 (m, 1H, -CH- de NHCH_{2}CHOHCH_{2}OH), 4,31
(d, 2H, J = 6,2 Hz, -CH_{2}OCO-), 4,16 (d, 5,5 Hz, 1H,
protón bencilo), 3,74 (s, 6H, OCH_{3}), 3,60-3,30
(m, 4H, OCONHCH_{2} + CH_{2}CHOHCH_{2}OH), 3,20
(br s, 2H, CH_{2}ODMTr), 2,98 (br s, 2H, COCH_{2}CH_{2}CO),
2,72 (br s, 2H, COCH_{2}CH_{2}CO), 2,20 (br s, 2H,
-CH_{2}CO-); Anál. calc. para C_{42}H_{42}N_{2}O_{7}: C,
66,80; H, 4,96; N, 3,00. Encontrado: C, 66,18; H, 4,98; N, 2,86.
Preparación del derivado de CPG 8. Una
mezcla de 5,0 g de vidrio poroso controlado con aminoalquilo de
cadena larga (LCAA-CPG), 0,5 ml de
1-metilimidazol y 0,45 g (0,5 mmol) de 7 en 20 ml de
piridina anhidra se removió en un matraz de 100 ml (mezclador
orbital, 150 rpm). Después de 3 h, el CPG se filtró en un embudo de
vidrio sinterizado y se lavó con porciones de 100 ml de DMF, acetona
y éter dietílico. El CPG se secó al vacío y se trató con una mezcla
de piridina (20 ml), anhídrido acético (2 ml) y
1-metilimidazol (2 ml). Después de remover durante
30 min, el CPG se lavó con piridina, metanol y éter dietílico y
después se secó al vacío. El producto (8) se analizó para
determinar el contenido de dimetoxitritilo (DMTr) de acuerdo con el
procedimiento bibliográfico (T. Atkinson y H. Smith, en M. Gait
(ed.), Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach. IRL
Press, 1984, Oxford, Reino Unido, págs.
35-81) y se descubrió que tenía una carga de 28
\mumol/g.
Preparación del derivado de CPG 9. El
derivado de CPG 8 (3,0 g) se trató dos veces, cada una de ellas con
20 ml de piperidina al 20% en DMF seca durante 5 min. El CPG se lavó
con porciones de 100 ml de DMF, metanol y éter dietílico y después
se secó al vacío.
Preparación del derivado de CPG 10. Una
mezcla de 2,5 g de 9, 7,5 ml de trietilamina y 0,38 g
(0-5 mmol) de 3c en 7,5 ml de DMSO anhidro se
removió en un matraz de 50 ml (mezclador orbital, embudo a 150 rpm).
Después de 2 días, el CFG se filtró en un embudo de vidrio
sinterizado y se lavó con porciones de 100 ml de DMSO, acetona y
éter dietílico. El CPG se secó al vacío y se trató con una
mezcla de piridina (10 ml), anhídrido acético (1 ml) y
1-metilimidazol (1 ml). Después de remover durante
30 min, el CPG se lavó con DMSO, piridina, metanol y éter dietílico
y después se secó al vacío.
5-[(terc-Butiloxi)carboxamido]pentilcarboxilato
de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (11). Se secó
ácido
6-[(terc-butiloxi)carboxamido]hexanoico
(4,16 g, 18 mmol) por co-evaporación con DMF seca
(70ºC). El residuo se disolvió de nuevo en DMF seca (25 ml) y se
añadieron
2-[4-(fenilazo)-benciltio]-etanol
(4,08 g, 15 mmol),
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (3,71 g, 18
mmol) y 4-dimetilaminopiridina (1,83 g, 15 mmol) a
0ºC. Después de agitar a 0ºC durante 2 h y a 20ºC durante 12 h, la
mezcla de reacción se evaporó a sequedad por
co-evaporación con acetato de butilo y se añadió
más cantidad de acetato de etilo (150 ml). Esta solución se extrajo
con HCl 0,7 M (1 x 30 ml), NaHCO_{3} al 5% y H_{2}O (2 x 50
ml). La capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró
en el evaporador rotatorio. El lavado con 20 ml de éter y la
filtración proporcionaron el compuesto 11 (6,91 g, 89%). ^{1}H
RMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 7,91 (m, 4H), 7,52 (m, 5H), 4,48 (t,
2H), 4,34 (s, 2H), 3,20 (t, 2H), 3,08 (m, 2H), 2,35 (t, 2H),
1,64-1,2 (m, 7H), 1,41 (s, 9H).
1-Metil-4-[terc-Butiloxi]carboxamido-pirrolo-2-carboxilato
de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo.
Se añadió N,N'-diciclohexilcarbodiimida (1,1
g, 5,3 mmol) a una solución de ácido
1-metil-4-[terc-butiloxi)carboxamido]pirrolo-2-carboxí-
lico^{4} (1,2 g, 5,2 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol (0,63 g, 4,7 mmol). Después de agitar durante 1 h, la mezcla se filtró a través del filtro de vidrio sinterizado para separar la N,N'-diciclohexilcarbodiimida precipitada. El filtrado se evaporó a sequedad, se disolvió de nuevo en una mezcla de CHCl_{3} y pentano (1:1) y se cargó sobre una columna de gel de sílice. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y se evaporaron a sequedad para dar 1,45 g (80%) del producto deseado en forma de un sólido blanco: p.f. 138-138,5ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 200 MHz) 8,04 (d, 1H), 7,49-7,40 (m, 4H), 7,09 (d, 1H), 3,87 (s, 3H), 1,50 (s, 9H).
lico^{4} (1,2 g, 5,2 mmol) y 1-hidroxibenzotriazol (0,63 g, 4,7 mmol). Después de agitar durante 1 h, la mezcla se filtró a través del filtro de vidrio sinterizado para separar la N,N'-diciclohexilcarbodiimida precipitada. El filtrado se evaporó a sequedad, se disolvió de nuevo en una mezcla de CHCl_{3} y pentano (1:1) y se cargó sobre una columna de gel de sílice. Las fracciones que contenían el producto puro se combinaron y se evaporaron a sequedad para dar 1,45 g (80%) del producto deseado en forma de un sólido blanco: p.f. 138-138,5ºC; ^{1}H RMN (CDCl_{3}, 200 MHz) 8,04 (d, 1H), 7,49-7,40 (m, 4H), 7,09 (d, 1H), 3,87 (s, 3H), 1,50 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato
de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (12). Se añadió
ácido trifluoroacético (5 ml) a 0ºC a 11 (0,73 g, 1,5 mmol). Después
de agitar a 0ºC durante 20 min, la mezcla de reacción se evaporó a
sequedad por co-evaporación con CHCl_{3}. El
residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} seco (15 ml) y se añadieron
1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamido-pirrolo-2-carboxilato
de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo
(0,59 g, 1,65 mmol) y trietilamina seca (0,23 g, 2,3 mmol). Después
de agitar a temperatura ambiente durante 15 min, se añadió
CHCl_{3} (100 ml). La mezcla de reacción se extrajo con
NaHCO_{3} al 5% (2 x 20 ml) y H_{2}O (2 x 2 ml). La capa
orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró en un
evaporador rotatorio. La cromatografía sobre gel de sílice (100 g)
con CHCl_{3} proporcionó 0,88 g (91,8%) de 12. ^{1}HRMN
(CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 7,88 (m, 4H), 7,46 (m, 5H), 6,74 (s,
1H), 6,38 (s, 1H), 6,26 (s, 1H), 5,87 (t, 1H), 4,18 (t, 2H, J
= 6 Hz), 3,82 (s, 3H), 3,79 (s, 2H), 3,3 (m, 2H), 2,63 (t, 2H,
J = 6 Hz), 2,30 (t, 2H, J = 6 Hz),
1,64-1,2 (m, 6H), 1,46 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato
de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (13). Una
solución de 12 (2,43 g, 4 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (8 ml) se
trató con ácido trifluoroacético (4 ml) a 0ºC. La solución
resultante se dejó a temperatura ambiente en un matraz tapado
durante 1 h y después se repartió entre K_{2}CO_{3} acuoso al
30% (30 ml) y CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La capa inferior se
recogió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 20 ml) y
los extractos orgánicos combinados, después de lavarse con H_{2}O
(1 x 20 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron. El
residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (10 ml) y se añadieron
1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxilato
de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo
(1,43 g, 4 mmol) y trietilamina seca (0,8 g, 8 mmol). Después de
agitar a temperatura ambiente durante 30 min, se añadió CHCl_{3}
(100 ml). La mezcla de reacción se extrajo con NaHCO_{3} al 5% (2
x 20 ml) y H_{2}O (2 x 2 ml). La capa orgánica se secó sobre
Na_{2}SO_{4} y se concentró en un evaporador rotatorio. La
cromatografía sobre gel de sílice (100 g) con CHCl_{3} proporcionó
1,95 g (66,8%) de 13. ^{1}HRMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 7,87
(m, 4H), 7,46 (m, 5H), 7,04 (d, 1H, J = 1,5 Hz), 6,77 (br s,
1H), 6,52 (br s, 1H), 6,50 (d, 1H, J = 1,5 Hz), 6,31 (br s,
1H), 5,95 (t, 1H), 4,19 (t, 2H, J = 6 Hz), 3,85 (s, 6H),
3,78 (s, 2H), 3,32 (m, 2H), 2,64 (t, 2H, J = 6 Hz), 2,31 (t,
2H, J = 6 Hz), 1,64-1,2 (m, 6H), 1,48 (s,
9H).
5-[1-Metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]
pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato
de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (14). Una
solución de 13 (1,90 g, 2,6 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (6 ml)
se trató con ácido trifluoroacético (3 ml) a 0ºC. La solución
resultante se dejó a temperatura ambiente en un matraz tapado
durante 1 h y después se repartió entre K_{2}CO_{3} acuoso al
30% (30 ml ) y CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La capa inferior se
recogió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 20 ml) y
los extractos orgánicos combinados, después de lavarse con H_{2}O
(1 x 20 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporaron. El
residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (2,5 ml) y se añadieron
1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxilato
de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo
(1,4 g, 3,9 mmol) y trietilamina seca (0,8 g, 8 mmol). Después de
agitar a temperatura ambiente durante 1 h, se añadió CHCl_{3}
(100 ml). La mezcla de reacción se extrajo con NaHCO_{3} al 5% (2
x 20 ml) y H_{2}O (2 x 20 ml). La capa orgánica se secó sobre
Na_{2}SO_{4} y se concentró en un evaporador rotatorio. La
cromatografía sobre gel de sílice (100 g) con metanol al
0-1,5% en CHCl_{3} proporcionó 1,56 g (70,5%) de
14. ^{1}HRMN (CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 7,87 (m, 4H), 7,68 (br s,
1H), 7,60 (br s, 1H), 7,46 (m, 5H), 7,08 (br s, 2H), 6,78 (br s,
1H), 6,56 (d, 1H, J = 1,5 Hz), 6,60 (br s, 1H), 6,55 (d, 1H,
J = 1,5 Hz), 6,03 (t, 1H), 4,18 (t, 2H, J = 6 Hz),
3,86 (m, 9H), 3,78 (s, 2H), 3,32 (m, 2H), 2,63 (t, 2H,
J = 6 Hz), 2,30 (t, 2H, J = 6 Hz), 1,64-1,2 (m, 6H), 1,48 (s, 9H).
J = 6 Hz), 2,30 (t, 2H, J = 6 Hz), 1,64-1,2 (m, 6H), 1,48 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato
de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (15). Una
solución de 14 (0,32 g, 0,32 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (5 ml)
se trató con ácido trifluoroacético (2,5 ml) a 0ºC. La solución
resultante se dejó a temperatura ambiente en un matraz tapado
durante 1 h y después se repartió entre K_{2}CO_{3} acuoso al
30% (30 ml) y CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La capa inferior se
recogió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 20 ml) y
los extractos orgánicos combinados, después de lavarse con H_{2}O
(1 x 20 ml), se secaron sobre Na_{2}SO y se evaporaron. El
residuo se disolvió en CH_{2}Cl_{2} (1 ml) y se añadieron
1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxilato
de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo
(0,11 g, 0,32 mmol) y trietilamina seca (0,06 g, 0,03 mmol). Después
de agitar a temperatura ambiente durante 1,5 h, se añadió
CHCl_{3} (100 ml). La suspensión se filtró y el filtrado se
extrajo con NaHCO_{3} al 5% (2 x 20 ml) y H_{2}O (2 x 20 ml). La
capa orgánica se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó a
sequedad. El rendimiento de 15 fue de 0,25 g (80%). ^{1}H RMN
(CDCl_{3}, 200 MHz, ppm): 8,17 (br s, 1H), 7,98 (br s), 7,96 (br
s), 1H 7,85 (m, 4H), 7,44 (m, 5H), 7,09 (br s, 2H), 7,02 (s, 1H),
6,78 (br s, 1H), 6,74 (br s, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,58 (s, 3H), 6,29
(t, 1H), 4,18 (t, 2H, J = 6 Hz), 3,78 (m, 14H), 3,28 (m,
2H), 2,60 (t, 2H, J = 6 Hz), 2,26 (t, 2H, J = 6 Hz),
1,64-1,2 (m, 6H), 1,48 (s, 9H).
5-[1-Metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-[1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pirrolo-2-carboxamido]pentilcarboxilato
de 2-[4-(fenilazo)benciltio]etilo (16). Una
solución de 15 (0,65 g, 0,67 mmol) en CH_{2}Cl_{2} seco (10 ml)
se trató con ácido trifluoroacético (5 ml) a 0ºC. La solución
amarillenta resultante se dejó a temperatura ambiente en un matraz
tapado durante 1 h y después se repartió entre K_{2}CO_{3}
acuoso al 30% (30 ml) y CH_{2}Cl_{2} (30 ml). La capa inferior
se recogió. La fase acuosa se extrajo con diclorometano (2 x 20 ml)
y los extractos orgánicos combinados, después de lavarse con
H_{2}O (1 x 20 ml), se secaron sobre Na_{2}SO_{4} y se
evaporaron. El residuo se disolvió en DMF (1 ml) y se añadieron
1-metil-4-(terc-butiloxi)carboxamidopirrolo-2-carboxilato
de
1,2,3-benzotriazol-1-ilo
(0,24 g, 0,67 mmol) y trietilamina seca (0,13 g, 0,67 mmol). Después
de agitar a temperatura ambiente durante 3 h, la mezcla de reacción
se evaporó a sequedad por co-evaporación con acetato
de butilo. El residuo se disolvió en 3 ml de DMF al 2,5% en
CHCl_{3}. La cromatografía sobre gel de sílice (100 g) con
metanol al 0-2,5% en CHCl_{3} (DMF al 2,5%)
proporcionó 0,67 g (45%) de 16.
4'-[bis(2-Cloroetil)amino]fenilbutirato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo
(2,3,5,6-tetrafluorofenil éster de clorambucilo)
A una solución de 0,25 g (0,82 mmol) de
clorambucilo (suministrado por Fluka A. G.) y 0,3 g (1,1 mmol) de
trifluoroacetato de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo en 5
ml de diclorometano seco se le añadieron 0,2 ml de trietilamina
seca. La mezcla se agitó en una atmósfera de argón a temperatura
ambiente durante 0,5 h y se evaporó. El aceite residual se purificó
por cromatografía en columna sobre gel de sílice con
hexano-cloroformo (2:1) como disolvente de elución
para dar el éster en forma de un aceite: 0,28 g (75%); TLC sobre gel
de sílice (CHCI_{3}) R_{F} 0,6; IR (en CHCl_{3}) 3010, 1780,
1613, 1521, 1485 cm^{-1}.
Preparación de la sal de cetiltrimetilamonio de
oligonucleótidos: se inyectaron 100 \mul de una solución acuosa
de oligonucleótido (50-500 \mug), generalmente sal
trietilamonio, en una columna cargada con Dowex 50wx8 en forma del
cetiltrimetilamonio y prelavada con alcohol al 50% en agua. La
columna se eluyó con etanol acuoso al 50% (0,1 ml/min). La fracción
que contenía el oligonucleótido se secó en un Speedvac durante 2
horas y se usó en reacciones posteriores.
Una solución en etanol (50 \mul) de sal
cetiltrimetilamonio de un oligonucleótido (50-100
\mug) se mezcló con una solución 0,08 M de
4'-[bis(2-cloroetil)amino]fenilbutirato
de 2,3,5,6-tetrafluorofenilo (tetrafluorofenil
éster de clorambucilo) en acetonitrilo (50 \mul) y 3 \mul de
diisopropiletilamina. Después de agitar durante tres horas a
temperatura ambiente, el producto se precipitó con LiClO_{4} al 2%
en acetona (1,5 ml). El producto se precipitó de nuevo tres veces
en agua (60 \mul) con LiClO_{4} al 2% en acetona. Finalmente,
el derivado de clorambucilo del oligonucleótido se purificó por
Cromatografía de Fase Inversa con un rendimiento de aproximadamente
el 50-80%. La fracción que contenía un producto se
concentró con aproximadamente butanol. El derivado de clorambucilo
del oligonucleótido aislado se precipitó en una solución en acetona
de LiClO_{4}, se lavó con acetona y se secó al vacío en una bomba
de aceite. Cualquier manipulación del oligonucleótido reactivo se
realizó tan rápido como fue posible, con el producto en solución
enfriada con hielo, partiendo de la fracción cromatográfica
colectada.
Todos los oligonucleótidos se prepararon en 1
\mumol del soporte de CPG apropiado en un AMB 394 usando el
protocolo suministrado por el fabricante. Los reactivos
convencionales para la química de acoplamiento del
cianoetilfosforamidita se adquirieron en Glen Research. Se
introdujeron modificaciones de 5'-aminohexilo
usando un enlazador de fosforamidita de
N-MMT-hexanolamina (Glen Research).
Se introdujeron modificaciones de 3'-aminohexilo
usando el CPG preparado como se ha descrito previamente, C.R.
Petrie, M.W. Reed, A.D. Adams y R.B. Meyer, Jr. Bioconjugate
Chemistry, 1992, 3, 85-87.
A una solución de sal cetiltrimetilamonio de un
oligonucleótido modificado con aminohexilo (30-50
nmol, Jost, J.-P., Jiricny, J. y Saluz, H. (1989) Quantitative
precipitation of short oligonucleotides with low concentrations of
cetyltrimethylammonium bromide. Nucleic Acids Res. 17, 2143)
y 1,5 \mul de N,N-diisopropiletilamina en 40
\mul de DMSO seco se le añadieron 40 \mul de una solución 4 mM
del éster de TFP (1a, 1b, 2e, 2f o 3c). La mezcla de reacción se
mantuvo durante 12 h a TA. El material relacionado con el
oligonucleótido se precipitó mediante la adición de 1,5 ml de
LiClO_{4} al 2% en acetona. El sedimento se lavó con acetona y se
secó al vacío. El sedimento se disolvió de nuevo en 60 \mul
de DMF al 50% en H_{2}O y se precipitó de nuevo como se ha
descrito anteriormente usando una solución al 2% de LiClO_{4} en
acetona. Este procedimiento se repitió dos veces. El residuo se
purificó por HPLC (4,6 x 250 mm, C-18,
Dynamax-300A, Rainin) usando un gradiente de
acetonitrilo del 20 al 75% en presencia de LiClO_{4} 50 mM. La
fracción que contenía el producto puro se secó al vacío
usando Speedvac. El residuo se disolvió en 60-80 ml
de H_{2}O y se precipitó con 1,5 ml de LiClO_{4} al 2% en
acetona. Después del lavado con acetona (2 x 1,5 ml) y del secado al
vacío, el gránulo se disolvió en 100 \mul de H_{2}O. El
rendimiento del producto final fue del 20-50%.
Se usó un procedimiento modificado de Godovikova
et al. (T. S. Godovikova, V.F. Zarytova, T.V. Maltzeva, L.M.
Khalimskaya. Bioorgan. Khim., 1989, 15,
1246-1259) para la preparación de los conjugados
oligonucleotídicos que tienen restos de ácido
4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico.
Una solución de sal cetiltrimetilamonio del oligonucleótido que
contiene 3'-fosfato (50-100 nmol),
trifenilfosfina (10 mg), disulfuro de
2,2'-dipiridilo (10 mg),
N,N-dimetilaminopiridina (10 mg) y uno de los
análogos seleccionados entre los compuestos 11 a 16 en 100 \mul
de DMF seca se incubó durante 20 min a TA. El material relacionado
con el oligonucleótido se precipitó mediante la adición de 1,5 ml
de LiClO_{4} al 2% en acetona. El sedimento se lavó con acetona y
se secó al vacío. El residuo se purificó por HPLC usando un
gradiente de acetonitrilo del 20 al 75% en presencia de LiClO_{4}
50 mM. La fracción que contenía el producto puro se secó al
vacío usando Speedvac. El residuo se disolvió en
60-80 \mul de H_{2}O y se precipitó con 1,5 ml
de LiClO_{4} al 2% en acetona. Después del lavado con acetona (2
x 1,5 ml) y del secado al vacío, el sedimento se disolvió en
100 \mul de H_{2}O. El rendimiento del producto final fue del
30-50%.
El oligonucleótido obtenido a partir de
5'-aminohexilo que contenía CPG obtenido en una
síntesis a escala 1 \mumol se trató con ácido dicloroacético al
2% en CH_{2}Cl_{2} para retirar el grupo protector de
9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) del grupo amino,
seguido de lavado con acetonitrilo y secado mediante lavado
abundante con argón. El CPG se transfirió a un tubo de plástico de
1,5 ml y se añadieron 100 \mul de una solución 50 mM de éster de
TFP en DMSO anhidro. El tubo se agitó durante 24 h, después se lavó
con 3 x 1,5 ml de DMSO y 2 x 1,5 ml de acetona y se secó al
vacío. El CPG se trató con amoniaco concentrado para
desproteger el oligonucleótido usando condiciones convencionales. La
mezcla de reacción resultante se separó usando HPLC de fase inversa
como se ha descrito anteriormente. El rendimiento típico fue de
aproximadamente el 50%.
Se obtuvieron curvas de fusión óptica de
complejos de oligonucleótidos que llevaban residuos de ácido
4-amino-N-metilpirrolo-2-carboxílico
en NaCl 200 mM, Na_{2}HPO_{4} 10 mM, EDTA 0,1 mM (pH 7,0) en el
detector UV de un cromatógrafo líquido Milichrom en una celda
termorregulada diseñada especialmente para este fin. Los datos se
recogieron y procesaron en un ordenador personal como se describe
por S.G. Lokhov et al. (S.G. Lokhov, M.A. Podyminogin, D.S.
Sergeev, V.N. Silnikov, I.V. Kutyavin, G.V. Shishkin, V.F. Zarytova.
Bioconjugate Chem. 1992, 3, 414).
Los complejos de oligonucleótidos que llevaban
ácido
1,2-dihidro-3H-pirrolo[3,2-e]indolo-7-carboxílico
(CDPI) se fundieron en KCl 140 mM, MgCl_{2} 10 mM y
HEPES-HCl 20 mM (pH 7,2) en un espectrofotómetro
Lambda 2 (Perkin Elmer) con un programador de temperatura
multicelda automático PTP-6. Las temperaturas de
fusión de los complejos (Tm) se determinaron a partir de la máxima
obtenida.
Las reacciones de extensión de cebadores se
realizaron como se ha descrito previamente por Lee, et al.,
[Biochemistry (1994) 33: 6024-6030]. Las
concentraciones finales de plantilla, cebador y ADN de bloqueo
fueron de 5 x 10^{-10} M, 4 x 10^{-8} M y 10^{-9} M,
respectivamente. La extensión de cebadores se realizó durante 15
min a 45ºC, y los productos se analizaron por electroforesis en gel
desnaturalizante como se ha descrito en la referencia.
En ausencia de cualquier ODN de bloqueo, la
reacción de extensión de cebadores generó un producto de alto peso
molecular que se presentó como una banda no resuelta en el gel de
secuenciación. En todas las mezclas de reacción se observaron
reproduciblemente bandas débiles correspondientes a sitios de pausa
o a sucesos de terminación espontánea. Los ODN
16-méricos y 32-méricos no
modificados, completamente complementarios a la diana, no pudieron
bloquear la extensión de cebadores. También carecían de actividad
los ADN 8-mérico y 16-mérico
complementarios, cada uno de los cuales estaba unido en posición 3'
a un grupo CDPI_{3}. Sólo un ODN 16-mérico
completamente complementario con un grupo CDPI_{3} conjugado en
posición 5' detuvo la extensión del cebador por la ADN polimerasa
de T7. Un ODN 8-mérico complementario con la misma
modificación 5' generó únicamente una pequeña cantidad de producto
bloqueado. Los ODN de control confirmaron que la inhibición de la
extensión de cebadores requiere tanto un ODN complementario
como un MGB unido covalentemente. Dos ODN
16-méricos desacoplados individualmente, cada uno
con un péptido CDPI_{3} unido en posición 5', eran mucho menos
inhibidores que los conjugados ODN-MGB perfectamente
acoplados. La adición de un ODN 16-mérico no
modificado junto con una cantidad equimolar de CDPI_{3} libre no
tuvo ningún efecto sobre la extensión de cebadores, subrayando la
importancia de la conjugación del MGB con el ODN. Cuando un resto de
acridina 5' se conjugó con el ODN 16-mérico
totalmente complementario en lugar del MGB, se observó una pérdida
de actividad inhibidora.
El conjugado ODN-MGB era
complementario a los nucleótidos 815-864 de la
cadena de plantilla del alelo DQ\beta1 [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA (1983) 80: 7313-7317]. Las células B de BSM
humanas usadas aquí son homocigotas para este alelo y lo expresan
constitutivamente. Antes de añadir el ODN, las células BSM se
cultivaron en un matraz de 25 ml a una densidad de 4,5 x 10^{6}
células por ml de medio.
Para cada tratamiento, las células de una
alícuota de 2 ml de cultivo se sedimentaron y se resuspendieron en
200 \mul de medio sin suero que contenía ODN unido a clorambucilo
50-mérico 0, 1, 10 ó 50 \muM (con o sin un grupo
CDPI_{3} conjugado en posición 3'). Cada muestra se incubó durante
3,5 horas a 37ºC con 5% de CO_{2} en una placa de microtitulación
de 48 pocillos. Las células después se transfirieron a tubos de
centrífuga Eppendorf de 0,5 ml, se sedimentaron durante 5 min a
2,000 rpm, se lavaron dos veces con 500 \mul de solución salina
tamponada con fosfato (PBS) y se desproteinaron con Proteinasa K/SDS
durante una noche a 37ºC. Después de la extracción con
fenol/cloroformo y digestión con Rnasa A, el ADN se trató con
pirrolidina 1 M a 90ºC durante 30 min. La pirrolidina se retiró por
precipitación con etanol y la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) mediada por ligamiento se realizó como se describe por Lee
et al. [Biochemistry (1994) 33: 6024-6630].
El ADN amplificado se analizó en un gel de secuenciación para
visualizar cualquier muesca con especificidad de secuencia que
pudiera haberse producido como resultado de la alquilación de la
diana por ODN que contenían clorambucilo. Los resultados mostraron
la escisión en el nucleótido en la diana adyacente al agente de
entrecruzamiento en el ODN, y que el 50-mero que
contenía CDPI_{3} era 10 veces más eficaz que el mismo ODN sin el
MGB en la secuencia alquilando específicamente el alelo 0302.
Se preparó medio completo a partir de los
siguientes componentes (el medio sin suero carecía de
HI-FCS): 500 ml de RPMI 1640 con
L-glutamina (2 mM) (Gibco BRL Nº Cat.
11875-036)
50 ml de HI-FCS (Gibco BRL Nº
Cat. 26140, inactivado con calor 30 min a 55ºC),
5 ml de Penicilina/Estreptomicina 100X (Gibco
BRL Nº Cat., 15070-022),
5 ml de L-Glutamina 200 mM
(Gibco BRL Nº Cat. 25030-024),
5 ml de piruvato sódico 100X (11 mg/ml; obtenido
en Gibco BRL Nº Cat. 11840-030)
5 ml de HEPES 1 M, pH 7,3 (Gibco BRL Nº Cat.
15630-023).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Microprobe Corporation, Bothell WA 98021
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MENOR OLIGONUCLEÓTIDO UNIDO COVALENTEMENTE
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIA: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: KLEIN & SZEKERES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4199 Campus Drive, Suite 700
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Irvine
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: ESTADOS UNIDOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 92715
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- IMPRESO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn nº de Distribuión 1.0, Nº de versión 1,25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/415.370
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 03-ABRIL-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Szekeres, Gabor L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 28.675
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: 491-09-PA
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 714-854-5502
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FAX: 714-854-5502
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID. SEC. Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 50 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTTATTTTT GAAGATACGA ATTTCUCCAG AGACACAGCA GGATTTGTCA
\hfill50
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PAR ALA ID. SEC. Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 16 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- ENCADENAMIENTO: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: ID. SEC. Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTTTTTTTTT TTTTTT
\hfill16
Claims (31)
1. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor, que comprende un
oligonucleótido que tiene una pluralidad de unidades nucleotídicas,
un extremo 3' y un extremo 5', y la capacidad de unirse a una
secuencia diana complementaria o sustancialmente complementaria de
ácidos nucleicos, y
un resto de unión al surco menor unido al menos
a uno de dichos nucleótidos a través de un grupo de unión que une
covalentemente el resto de unión al surco menor con el
oligonucleótido a través de una cadena de preferentemente no más de
15 átomos, donde el resto de unión al surco menor es un radical de
una molécula que tiene un peso molecular de 150 a 2000 Dalton y se
une de una manera no intercalante en el surco menor de ADN
bicatenario, ARN o híbridos de los mismos, con una constante de
asociación de 10^{3} M^{-1} o mayor.
2. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que
incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (a):
(a)R_{1}-(HN-Y_{1}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{1} representa un anillo
de 5 miembros que tiene dos dobles enlaces y de 0 a 3 heteroátomos
seleccionados entre el grupo constituido por N, S y O, los grupos
NH y CO se unen respectivamente a dos carbonos del anillo que están
separados entre sí por un átomo de anillo, estando el átomo de
anillo situado entre dichos dos carbonos de anillo sustituido
únicamente con H cuando es carbono o nitrógeno y sin sustituir
cuando es oxígeno o azufre, pudiendo estar cada uno de los átomos
restantes del anillo opcionalmente sustituidos con 1, 2 ó 3 grupos
R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente
H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, -O-, -S-, OR_{4}, SH,
SR_{4}, COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2},
R_{4}, H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2},
CONHR_{4},
H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4},
O(CH_{2})_{m}CO,
O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH,
-O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-,
-CONR_{4}, -HN(CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH-, o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH-, o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido
por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4},
o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros
condensado con el anillo Y_{1} y estar sustituidos con uno, dos o
tres R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que
tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que
tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo
aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático
heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo
carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde
R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F,
Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2},
N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5}; y
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5}; y
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos.
3. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que
incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (b):
(b)R_{1}-(R_{6}N-Y_{2}-CO)_{n}R_{2}
donde Y_{2} es un sistema de
anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado
con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el
sistema de anillos condensado de 0 a 3 heteroátomos seleccionados
entre el grupo constituido por N, S y O, cada uno de los grupos
R_{6}N y CO está unido a un carbono del anillo que está en un
anillo diferente del sistema de anillos condensado, y que es el
segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo
de cabeza de puente común, colocando por lo tanto los grupos CO y
NR_{6} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos
en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el
otro lado del sistema de anillos condensado, estando los dos átomos
del anillo que no es cabeza de puente de un lado opcionalmente
sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres átomos del
anillo que no es cabeza de puente del otro lado del sistema de
anillos condensados opcionalmente sustituidos con un grupo
R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente
H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4},
H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y
H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4},
O(CH_{2})_{m}CO,
O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH,
-O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4},
-HN (CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido
por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4},
o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros
condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres
R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que
tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que
tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo
aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático
heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo
carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde
R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F,
Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2},
N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{6} es H, alquilo de 1 a 5 carbonos, o
R_{6} y R_{7} juntos forman un anillo de 4, 5 ó 6 miembros,
siendo parte de dicho anillo opcionalmente un grupo -O-, -S-, -NH-,
-NCH_{3}-, o N-alquilo inferior;
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}-, o
-CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero de 1 a 10;
n es un número entero de 1 a 10, y
p es un número entero de 1 a 5.
4. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que
incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (c):
(c)R_{1}-(CO-Y_{3}-NH)_{n}-R_{2}
donde Y_{3} es un anillo
aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde
cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono, estando
dichos carbonos del anillo en la posición 1,4 entre sí, estando dos
átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en uno de los
dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un
grupo R_{3}, estando los dos átomos en el anillo no ocupados en el
otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente sustituidos con un
grupo
R_{7};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente
H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4},
H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y
H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4},
O(CH_{2})_{m}CO,
O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH,
-O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4},
-HN (CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido
por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4},
o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros
condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres
R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que
tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que
tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo
aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático
heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo
carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde
R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F,
Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2},
N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}-, o
-CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero entre 1 y 10;
n es un número entero entre 1 y 10, y
p es un número entero entre 1 y 5.
5. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que
incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (d):
(d)R_{1}-(HN-Y_{4}-HN-CO-Y_{4}-CO)_{p}-R_{2}
donde Y_{4} es un anillo
aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde
cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono del anillo,
estando dichos carbonos del anillo en la posición 1,4 entre sí en
cada anillo, estando dos átomos del anillo no ocupados por los
grupos CO o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros
opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos
átomos del anillo no ocupados en el otro lado del anillo de 6
miembros opcionalmente sustituidos con un grupo
R_{7};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente
H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4},
H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y
H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4},
O(CH_{2})_{m}CO,
O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH,
-O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4},
-HN (CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido
por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4},
o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros
condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres
R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que
tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que
tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo
aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático
heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo
carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde
R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F,
Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2},
N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}-, o
-CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero entre 1 y 10;
n es un número entero entre 1 y 10, y
p es un número entero entre 1 y 5.
6. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor que
incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (e):
(e)R_{1}-(Y_{5})_{n}-R_{2}
donde Y_{5} es un sistema de
anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado
con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el
sistema de anillos condensados de 0 a 3 heteroátomos seleccionados
entre el grupo constituido por N, S y O, donde cada uno de los
grupos R_{1} y R_{2} está unido a un carbono del anillo que
está en un anillo diferente del sistema de anillos condensados, y
que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo
del anillo de cabeza de puente común, colocando los grupos R_{1}
y R_{2} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos
en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el
otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos
átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado
opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres
átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del
sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un
grupo
R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente
H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4},
H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y
H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4},
O(CH_{2})_{m}CO,
O(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH,
-O-, -S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4},
-HN (CH_{2})_{m}
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido
por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4},
o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros
condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres
R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que
tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que
tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo
aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático
heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo
carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde
R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos F,
Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2},
N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}-, o
-CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero entre 1 y 10;
n es un número entero entre 1 y 10, y
p es un número entero entre 1 y 5.
7. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor está
unido al extremo 5'- del oligonucleótido.
8. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor está
unido al extremo 3'- del oligonucleótido.
9. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor está
unido a una unidad nucleotídica que no está en el extremo 3' ni en
el extremo 5' del oligonucleótido.
10. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1, en la que el resto de unión al surco menor está
unido a la porción de base heterocíclica de una unidad
nucleotídica.
11. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 9, en la que el resto de unión al surco menor está
unido a la porción de base heterocíclica de una unidad
nucleotídica.
12. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según una cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 6, en la que el resto de unión al surco
menor que incluye el grupo de unión tiene la fórmula
en la que n es de 2 a
5.
13. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 12, en la que el resto de unión al surco menor está
unido al extremo 3' del oligonucleótido.
14. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según una cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 6, en la que el resto de unión al surco
menor que incluye el grupo de unión tiene la fórmula
en la que n =
2-5.
15. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según una cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 6, en la que el resto de unión al surco
menor que incluye el grupo de unión tiene la fórmula
en la que n =
2-5.
16. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 15, en la que el resto de unión al surco menor está
unido al extremo 3' del oligonucleótido.
17. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 2, en la que el resto de unión al surco menor se
representa por la fórmula (a) en la que el anillo de cinco miembros
tiene la estructura
18. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 2, en la que el resto de unión al surco menor se
representa por la fórmula (a) en la que el anillo de cinco miembros
tiene la estructura
19. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 3, en la que el resto de unión al surco menor se
representa por la fórmula (b) en la que el anillo de cinco miembros
tiene la estructura
20. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 1 que comprende adicionalmente una funcionalidad de
entrecruzamiento unida covalentemente al menos a una de dichas
unidades nucleotídicas.
21. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor que comprende un
oligonucleótido que tiene una pluralidad de unidades nucleotídicas,
un extremo 3' y un extremo 5', y la capacidad de unirse a una
secuencia diana complementaria o sustancialmente complementaria de
ácidos nucleicos, y
un resto de unión al surco menor unido al menos
a uno de dichos nucleótidos a través de un grupo de unión que une
covalentemente el resto de unión al surco menor con el
oligonucleótido a través de una cadena de preferentemente no más de
15 átomos, teniendo la combinación la fórmula
en la que x es O o
S;
q es un número entero comprendido entre 3 y
100;
R_{8} es H, OH, alcoxi que tiene de 1 a 6
carbonos, O-alquenilo
C_{2}-C_{8} o F;
B es un aglicón seleccionado entre un grupo
constituido por una base heterocíclica natural en ácidos nucleicos
e hipoxantina, 2-aminoadenina,
2-tiouracilo, 2-tiotimina,
5-N^{4}-etenocitosina,
4-aminopirazolo[3,4-d]pirimidina,
6-amino-4-hidroxi-[3,4-d]pirimidina;
W_{1} es H, PO(OH)_{2} o una
sal del mismo, o un resto de unión al surco menor unido al extremo
3' o 5' de dicho oligonucleótido, incluyendo el grupo de unión que
une covalentemente al resto de unión al surco menor con el
oligonucleótido a través de no más de 15 átomos;
W_{2} está ausente o es un resto de unión al
surco menor unido a uno de los aglicones B, incluyendo el grupo de
unión que une covalentemente el resto de unión al surco menor con
dicho aglicón, o W_{2} es una funcionalidad de entrecruzamiento
incluyendo un brazo enlazador que une covalentemente la
funcionalidad de entrecruzamiento con dicho aglicón,
donde el resto de unión al surco menor es un
radical de una molécula que tiene un peso molecular de 150 a 2000
Dalton que se une de manera no intercalante en el surco menor del
ADN bicatenario, ARN o híbridos de los mismos con una constante de
asociación mayor de 10^{3} M^{-1}, con la condición de que al
menos uno de dichos grupos W_{1} y W_{2} sea un resto de unión
al surco menor.
22. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 21, en la que el resto de unión al surco menor que
incluye el grupo de unión tiene la fórmula seleccionada entre el
grupo constituido por los grupos (a), (b), (c), (d) y (e):
(a)R_{1}-(HN-Y_{1}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{1} representa un anillo
de 5 miembros que tiene dos dobles enlaces y de 0 a 3 heteroátomos
seleccionados entre el grupo constituido por N, S, y O, los grupos
NH y CO están unidos respectivamente a dos carbonos del anillo que
están separados entre sí por un átomo del anillo, el átomo del
anillo situado entre dichos dos carbonos del anillo sólo está
sustituido con H cuando es carbono o nitrógeno o está sin sustituir
cuando es oxígeno o azufre, pudiendo estar cada uno de los átomos
restantes del anillo opcionalmente sustituido con 1, 2 ó 3 grupos
R_{3};
(b)R_{1}-(R_{6}N-Y_{2}-CO)_{n}-R_{2}
donde Y_{2} es un sistema de
anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado
con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el
sistema de anillos condensados de 0 a 3 heteroátomos seleccionados
entre el grupo constituido por N, S y O, cada uno de los grupos
R_{6}N y CO está unido a un carbono del anillo que está en un
anillo diferente del sistema de anillos condensados, y que es el
segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo del anillo
de cabeza de puente común, colocando por lo tanto los grupos CO y
NR_{6} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos
en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el
otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos
átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado
opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres
átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del
sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un
grupo
R_{3};
(c)R_{1}-(CO-Y_{3}-NH)_{n}-R_{2}
donde Y_{3} es un anillo
aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde
cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono de anillo,
estando dichos carbonos del anillo en la posición 1,4 entre sí,
estando dos átomos del anillo no ocupados por los grupos CO o NH en
uno de los dos lados del anillo de 6 miembros opcionalmente
sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos átomos del anillo
no ocupados en el otro lado del anillo de 6 miembros opcionalmente
sustituidos con un grupo
R_{7};
(d)R_{1}-(HN-Y_{4}-HN-CO-Y_{4}-CO)_{p}-R_{2}
donde Y_{4} es un anillo
aromático de 6 miembros que tiene de 0 a 3 heteroátomos N, y donde
cada uno de los grupos CO y NH está unido a un carbono del anillo,
estando dichos carbonos del anillo en la posición 1,4 entre sí en
cada anillo, estando dos átomos del anillo no ocupados por los
grupos CO o NH en uno de los dos lados del anillo de 6 miembros
opcionalmente sustituidos con un grupo R_{3}, estando los dos
átomos del anillo no ocupados en el otro lado del anillo de 6
miembros opcionalmente sustituidos con un grupo
R_{7};
(e)R_{1}-(Y_{5})_{n}-R_{2}
\newpage
donde Y_{5} es un sistema de
anillos constituido por un anillo aromático de 6 miembros condensado
con un anillo de 5 miembros que tiene un doble enlace, teniendo el
sistema de anillos condensados de 0 a 3 heteroátomos seleccionados
entre el grupo constituido por N, S y O, donde cada uno de los
grupos R_{1} y R_{2} está unido a un carbono del anillo que
está en un anillo diferente del sistema de anillos condensados, y
que es el segundo átomo del anillo, respectivamente, de un átomo
del anillo de cabeza de puente común, colocando los grupos R_{1}
y R_{2} 2 átomos del anillo que no es cabeza de puente entre ellos
en un lado y 3 átomos del anillo que no es cabeza de puente en el
otro lado del sistema de anillos condensados, estando los dos
átomos del anillo que no es cabeza de puente de un lado
opcionalmente sustituidos con un grupo R_{7}, estando los tres
átomos del anillo que no es cabeza de puente del otro lado del
sistema de anillos condensados opcionalmente sustituidos con un
grupo
R_{3};
donde R_{1} y R_{2} son independientemente
H, F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2}, R_{4},
H_{2}N(CH_{2})_{m}CO, CONH_{2}, CONHR_{4} y
H_{2}N(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4},
-O-,
-S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}
NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
-S-, -HN(CH_{2})_{m}CO, -CONH-, -CONR_{4}, -HN(CH_{2})_{m}COO(CH_{2})_{m}S(CH_{2})_{m}C_{6}H_{4}NNC_{6}H_{4} y -(CH_{2})_{m}CH(OH)(CH_{2})_{m}
NHCO(CH_{2})_{m}NH- o uno de los grupos R_{1} y R_{2} está ausente;
R_{3} se selecciona entre el grupo constituido
por F, Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{4},
N(R_{4})_{2},
N(R_{4})_{3}^{+}, OH, OR_{4}, SH, SR_{4},
COR_{4}, CONHR_{4}, CON(R_{4})_{2} y R_{4},
o los grupos R_{3} pueden formar un anillo de 3, 4, 5 ó 6 miembros
condensado con el anillo Y_{1} y sustituido con uno, dos o tres
R_{4};
R_{4} es un grupo alquilo o cicloalquilo que
tiene de 1 a 20 carbonos, un grupo alquenilo o cicloalquenilo que
tiene de 1 a 20 carbonos y de 1 a 3 dobles enlaces, un grupo
aromático carbocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo aromático
heterocíclico de no más de 25 carbonos, un grupo arilalquilo
carbocíclico o heterocíclico de no más de 25 carbonos, donde
R_{4} puede estar opcionalmente sustituido con 1,2 ó 3 grupos F,
Cl, Br, I, NH_{2}, NHR_{5}, N(R_{5})_{2},
N(R_{5})_{3}^{+},
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
OH, OR_{5}, SH, SR_{5}, COR_{5}, CONHR_{5}, CON(R_{5})_{2} o R_{5};
R_{5} es alquilo de 1 a 6 carbonos,
R_{6} es H, alquilo de 1 a 5 carbonos, o
R_{6} y R_{7} juntos forman un anillo de 4, 5 ó 6 miembros,
siendo parte de dicho anillo opcionalmente un grupo -O-, -S-, -NH-,
-NCH_{3}- o N-alquilo inferior;
R_{7} es F, metilo o etilo; -CH_{2}- o
-CH_{2}CH_{2}-;
m es un número entero de 1 a 10;
n es un número entero de 1 a 10, y
p es un número entero de 1 a 5.
23. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 22, en la que al menos uno de los grupos W_{1} es
un resto de unión al surco menor y un grupo de unión, y W_{2} está
ausente.
24. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 22, en la que W_{2} es un resto de unión al surco
menor y un grupo de unión.
25. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 23, en la que el resto de unión al surco menor que
incluye el grupo de unión se representa por la fórmula (a) en la
que el anillo de cinco miembros tiene
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
26. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 23, en la que el resto de unión al surco menor se
representa por la fórmula (a) en la que el anillo de cinco miembros
tiene la estructura
27. Combinación de oligonucleótido unido
covalentemente y agente de unión al surco menor según la
reivindicación 23, en la que el resto de unión al surco menor se
representa por la fórmula (b) en la que el sistema de anillos
condensados tiene la estructura
28. Uso del conjugado de agente de unión al
surco menor unido covalentemente-oligonucleótido
según una de las reivindicaciones 1 a 27 como una sonda de
hibridación.
29. Uso según la reivindicación 28, donde el
conjugado de MGB-oligonucleótido es una sonda que
comprende un grupo reportador, que hace fácilmente detectable al
agente de unión al surco menor.
30. Uso de un conjugado de agente de unión al
surco menor-oligonucleótido unido covalentemente
según una de las reivindicaciones 1 a 27 como una sonda de
diagnóstico.
31. Uso de un conjugado de agente de unión al
surco menor-oligonucleótido unido covalentemente
según una de las reivindicaciones 1 a 27 para la fabricación de
agentes terapéuticos antisentido y anti-gen.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US415370 | 1995-04-03 | ||
US08/415,370 US5801155A (en) | 1995-04-03 | 1995-04-03 | Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2300106T3 true ES2300106T3 (es) | 2008-06-01 |
Family
ID=23645421
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES96910723T Expired - Lifetime ES2300106T3 (es) | 1995-04-03 | 1996-04-03 | Conjugados de agente de union al surco menor y oligonucleotidos unidos covalentemente. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (6) | US5801155A (es) |
EP (1) | EP0819133B1 (es) |
JP (1) | JP4948690B2 (es) |
CN (3) | CN1187363C (es) |
AT (1) | ATE382627T1 (es) |
AU (1) | AU716108B2 (es) |
CA (1) | CA2223678C (es) |
DE (1) | DE69637389T2 (es) |
DK (1) | DK0819133T3 (es) |
ES (1) | ES2300106T3 (es) |
PT (1) | PT819133E (es) |
WO (1) | WO1996032496A2 (es) |
Families Citing this family (263)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6339066B1 (en) | 1990-01-11 | 2002-01-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C |
US6537973B1 (en) | 1992-03-16 | 2003-03-25 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide inhibition of protein kinase C |
US5985558A (en) * | 1997-04-14 | 1999-11-16 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos |
US6312894B1 (en) | 1995-04-03 | 2001-11-06 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders |
US5801155A (en) * | 1995-04-03 | 1998-09-01 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates |
AU734715B2 (en) | 1996-02-26 | 2001-06-21 | California Institute Of Technology | Improved polyamides for binding in the minor groove of double stranded DNA |
US6555692B1 (en) | 1996-02-26 | 2003-04-29 | California Institute Of Technology | Preparation and use of bifunctional molecules having DNA sequence binding specificity |
US6506906B1 (en) | 1996-02-26 | 2003-01-14 | California Institute Of Technology | Preparation and use of bifunctional molecules having DNA sequence binding specificity |
US6090947A (en) | 1996-02-26 | 2000-07-18 | California Institute Of Technology | Method for the synthesis of pyrrole and imidazole carboxamides on a solid support |
WO1998045284A1 (en) | 1996-02-26 | 1998-10-15 | California Institute Of Technology | Stereochemical control of the dna binding affinity, sequence specificity, and orientation-preference of chiral hairpin polyamides in the minor groove |
US6635417B1 (en) * | 1996-07-31 | 2003-10-21 | California Institute Of Technology | Complex formation between DSDNA and oligomer of cyclic heterocycles |
US6143901A (en) * | 1996-07-31 | 2000-11-07 | Genesoft, Inc. | Complex formation between dsDNA and pyrrole imidazole polyamides |
CN1260006A (zh) | 1996-02-26 | 2000-07-12 | 加利福尼亚州技术学院 | 双链dna和杂环低聚物之间复合物的形成 |
US5898031A (en) | 1996-06-06 | 1999-04-27 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Oligoribonucleotides for cleaving RNA |
US9096636B2 (en) | 1996-06-06 | 2015-08-04 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation |
US7812149B2 (en) | 1996-06-06 | 2010-10-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations |
US20040266706A1 (en) * | 2002-11-05 | 2004-12-30 | Muthiah Manoharan | Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation |
US6660255B1 (en) * | 1996-08-01 | 2003-12-09 | California Institute Of Technology | Inhibition of gene transcription by polyamide DNA-binding ligands |
US6143877A (en) * | 1997-04-30 | 2000-11-07 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides including pyrazolo[3,4-D]pyrimidine bases, bound in double stranded nucleic acids |
US6312925B1 (en) | 1997-05-08 | 2001-11-06 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions to facilitate D-loop formation by oligonucleotides |
US6262252B1 (en) * | 1997-05-19 | 2001-07-17 | Mirus, Inc. | Single-step method for labeling nucleic acids with mustard or aziridine labeling reagents |
US6887906B1 (en) | 1997-07-01 | 2005-05-03 | Isispharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the delivery of oligonucleotides via the alimentary canal |
US5877309A (en) * | 1997-08-13 | 1999-03-02 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotides against JNK |
US6133246A (en) * | 1997-08-13 | 2000-10-17 | Isis Pharmaceuticals Inc. | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins |
US6809193B2 (en) | 1997-08-13 | 2004-10-26 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins |
US6518017B1 (en) * | 1997-10-02 | 2003-02-11 | Oasis Biosciences Incorporated | Combinatorial antisense library |
US20030165888A1 (en) * | 2001-07-18 | 2003-09-04 | Brown Bob D. | Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes |
US20060167239A1 (en) * | 1997-12-02 | 2006-07-27 | Slattum Paul M | Compounds and processes for single-pot attachment of a label to siRNA |
US6683173B2 (en) * | 1998-04-03 | 2004-01-27 | Epoch Biosciences, Inc. | Tm leveling methods |
US6949367B1 (en) | 1998-04-03 | 2005-09-27 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Modified oligonucleotides for mismatch discrimination |
US6127121A (en) * | 1998-04-03 | 2000-10-03 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides containing pyrazolo[3,4-D]pyrimidines for hybridization and mismatch discrimination |
US7045610B2 (en) * | 1998-04-03 | 2006-05-16 | Epoch Biosciences, Inc. | Modified oligonucleotides for mismatch discrimination |
US7715989B2 (en) * | 1998-04-03 | 2010-05-11 | Elitech Holding B.V. | Systems and methods for predicting oligonucleotide melting temperature (TmS) |
US6072046A (en) * | 1998-08-26 | 2000-06-06 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Diaziridinyl-aryl and bis-[di(chloroethyl)amino]-aryl oligonucleotide conjugates and reagents for making the same |
US6432642B1 (en) * | 1999-01-15 | 2002-08-13 | Pe Corporation (Ny) | Binary probe and clamp composition and methods for a target hybridization detection |
US6410231B1 (en) * | 1999-02-26 | 2002-06-25 | Incyte Genomics, Inc. | SNP detection |
AU777499B2 (en) * | 1999-04-08 | 2004-10-21 | Gen-Probe Incorporated | Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases |
US6339147B1 (en) | 1999-07-29 | 2002-01-15 | Epoch Biosciences, Inc. | Attachment of oligonucleotides to solid supports through Schiff base type linkages for capture and detection of nucleic acids |
US6660845B1 (en) | 1999-11-23 | 2003-12-09 | Epoch Biosciences, Inc. | Non-aggregating, non-quenching oligomers comprising nucleotide analogues; methods of synthesis and use thereof |
US20040081959A9 (en) * | 1999-12-08 | 2004-04-29 | Epoch Biosciences, Inc. | Fluorescent quenching detection reagents and methods |
US7205105B2 (en) * | 1999-12-08 | 2007-04-17 | Epoch Biosciences, Inc. | Real-time linear detection probes: sensitive 5′-minor groove binder-containing probes for PCR analysis |
US6727356B1 (en) | 1999-12-08 | 2004-04-27 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Fluorescent quenching detection reagents and methods |
AU2001243403A1 (en) * | 2000-03-01 | 2001-09-12 | Epoch Biosiences, Inc. | Modified oligonucleotides for mismatch discrimination |
EP1944310A3 (en) | 2000-03-01 | 2008-08-06 | Epoch Biosciences, Inc. | Modified oligonucleotides for mismatch discrimination |
US7078536B2 (en) * | 2001-03-14 | 2006-07-18 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Charged compounds comprising a nucleic acid binding moiety and uses therefor |
JP2003529609A (ja) | 2000-03-16 | 2003-10-07 | ジーンソフト インコーポレイティッド | 核酸結合部分を含む荷電した化合物およびその利用法 |
AU2001265121A1 (en) * | 2000-05-30 | 2001-12-11 | Applera Corporation | Methods for detecting target nucleic acids using coupled ligation and amplification |
US6887664B2 (en) | 2000-06-06 | 2005-05-03 | Applera Corporation | Asynchronous primed PCR |
US7238795B2 (en) * | 2000-08-03 | 2007-07-03 | Roche Molecular Systems, Inc. | Nucleic acid binding compounds containing pyrazolo[3,4-d]pyrimidine analogues of purin-2,6-diamine and their uses |
US6358679B1 (en) * | 2000-08-24 | 2002-03-19 | Pe Corporation (Ny) | Methods for external controls for nucleic acid amplification |
EP1366057B1 (en) * | 2001-03-08 | 2005-12-14 | Applera Corporation | Method for deprotecting oligonucleotides |
US6774082B2 (en) * | 2001-05-11 | 2004-08-10 | Ibc Advanced Technologies, Inc. | Compositions for separating heterocyclic aromatic amine bases, nucleosides, nucleotides, and nucleotide sequences |
US20020177157A1 (en) * | 2001-05-24 | 2002-11-28 | Yuling Luo | Pairs of nucleic acid probes with interactive signaling moieties and nucleic acid probes with enhanced hybridization efficiency and specificity |
CA2450628A1 (en) | 2001-06-13 | 2002-12-19 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Benzothiophene compounds having antiinfective activity |
US8569516B2 (en) | 2001-09-07 | 2013-10-29 | Elitech Holding B.V. | Compounds and methods for fluorescent labeling |
US6972339B2 (en) * | 2001-09-07 | 2005-12-06 | Epoch Biosciences, Inc. | Compounds and methods for fluorescent labeling |
US6744502B2 (en) * | 2001-09-28 | 2004-06-01 | Pe Corporation (Ny) | Shaped illumination geometry and intensity using a diffractive optical element |
US6818420B2 (en) * | 2002-02-27 | 2004-11-16 | Biosource International, Inc. | Methods of using FET labeled oligonucleotides that include a 3′-5′ exonuclease resistant quencher domain and compositions for practicing the same |
WO2003078450A2 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-25 | Epoch Biosciences, Inc. | Negatively charged minor groove binders |
US7498349B2 (en) | 2002-08-02 | 2009-03-03 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Biaryl compounds having anti-infective activity |
US7153658B2 (en) * | 2002-09-19 | 2006-12-26 | Applera Corporation | Methods and compositions for detecting targets |
JP4694201B2 (ja) * | 2002-09-20 | 2011-06-08 | インテグレイテッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレイテッド | アントラキノン消光色素、それらの製造方法及び使用 |
US20040235005A1 (en) * | 2002-10-23 | 2004-11-25 | Ernest Friedlander | Methods and composition for detecting targets |
CA2503119A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-05-13 | Genesoft Pharmaceuticals, Inc. | Anti-infective biaryl compounds |
AU2003290598A1 (en) | 2002-11-05 | 2004-06-03 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Modified oligonucleotides for use in rna interference |
AU2003287270A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-06-03 | The Scripps Research Institute | PURIFIED COMPOUNDS THAT INHIBIT INTRACELLULAR Alpha4/PAXILLIN BINDING |
AU2003295692A1 (en) * | 2002-11-15 | 2004-06-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for analysis of regulatory sequences |
WO2004052304A2 (en) | 2002-12-10 | 2004-06-24 | Oscient Pharmaceuticals Corporation | Antibacterial compounds having a (pyrrole carboxamide)-(benzamide)-(imidazole carboxamide) motif |
WO2005001129A2 (en) * | 2003-06-06 | 2005-01-06 | Applera Corporation | Mobility cassettes |
US7348146B2 (en) * | 2003-10-02 | 2008-03-25 | Epoch Biosciences, Inc. | Single nucleotide polymorphism analysis of highly polymorphic target sequences |
PT1687609E (pt) * | 2003-10-28 | 2015-03-02 | Epoch Biosciences Inc | Sondas fluorescentes para a detecção de adn por hibridação com uma maior sensibilidade e menor ruído de fundo |
US7439341B2 (en) | 2003-11-14 | 2008-10-21 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Fluorescence quenching azo dyes, their methods of preparation and use |
JP2007534308A (ja) * | 2003-11-19 | 2007-11-29 | アレロジック・バイオサイエンシズ・コーポレーション | 複数のフルオロフォアで標識したオリゴヌクレオチド |
US8569474B2 (en) | 2004-03-09 | 2013-10-29 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand |
GB0406015D0 (en) * | 2004-03-17 | 2004-04-21 | Dynal Biotech Asa | Improvements in magnetic polymer particles |
US7445898B2 (en) * | 2004-04-01 | 2008-11-04 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Quantitative amplification with a labeled probe and 3′ to 5′ exonuclease activity |
WO2005103249A1 (ja) | 2004-04-26 | 2005-11-03 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 結核菌検出用プライマー及びプローブ、並びにこれを用いたヒト型結核菌の検出方法 |
EP2471924A1 (en) | 2004-05-28 | 2012-07-04 | Asuragen, INC. | Methods and compositions involving microRNA |
US8394947B2 (en) | 2004-06-03 | 2013-03-12 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Positionally modified siRNA constructs |
US20070054276A1 (en) * | 2004-08-12 | 2007-03-08 | Sampson Jeffrey R | Polynucleotide analysis and methods of using nanopores |
ATE508206T1 (de) | 2004-08-13 | 2011-05-15 | Epoch Biosciences Inc | Amplifikationsverfahren |
US7884086B2 (en) | 2004-09-08 | 2011-02-08 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays |
JP2008513028A (ja) | 2004-09-21 | 2008-05-01 | アプレラ コーポレイション | マイクロRNA(miRNA)の二色リアルタイム/エンドポイント定量化 |
US20060078894A1 (en) * | 2004-10-12 | 2006-04-13 | Winkler Matthew M | Methods and compositions for analyzing nucleic acids |
EP2302055B1 (en) | 2004-11-12 | 2014-08-27 | Asuragen, Inc. | Methods and compositions involving miRNA and miRNA inhibitor molecules |
WO2006076650A2 (en) * | 2005-01-12 | 2006-07-20 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for selective amplification of nucleic acids |
DE602005018840D1 (de) | 2005-04-14 | 2010-02-25 | Applied Biosystems Llc | 3'-modifizierte oligonukleotide mit pseudoisocytosin-nukleobasenderivaten sowie deren anwendungen als primer oder sonden |
ES2357902T3 (es) | 2005-05-13 | 2011-05-03 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Cebadores, sondas, procedimientos y usos de los mismos para la detección de mycobacteriium kansasii. |
JP2008545659A (ja) | 2005-05-20 | 2008-12-18 | インテグレイテッド ディーエヌエイ テクノロジーズ インコーポレイテッド | オリゴヌクレオチドを標識する化合物及び方法 |
US20070048758A1 (en) * | 2005-06-09 | 2007-03-01 | Epoch Biosciences, Inc. | Improved primer-based amplification methods |
US20070087360A1 (en) * | 2005-06-20 | 2007-04-19 | Boyd Victoria L | Methods and compositions for detecting nucleotides |
CA2624634A1 (en) | 2005-10-03 | 2007-04-12 | Applera Corporation | Compositions, methods, and kits for amplifying nucleic acids |
ATE553220T1 (de) | 2006-03-13 | 2012-04-15 | Wako Pure Chem Ind Ltd | Verfahren zur erkennung eines mutierten gens |
US20080166712A1 (en) * | 2006-04-10 | 2008-07-10 | Ryusuke Murayama | Gene detection method |
CN101432426B (zh) | 2006-05-02 | 2012-09-19 | 和光纯药工业株式会社 | 胞内分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用该引物和探针的胞内分枝杆菌的检测方法 |
EP2029726A4 (en) * | 2006-06-09 | 2010-07-28 | Univ Miami | EVALUATION OF CELL COMPOSITION AND FRACTIONAL VIABILITY AND USES THEREOF |
WO2008002920A2 (en) * | 2006-06-26 | 2008-01-03 | Epoch Biosciences, Inc. | Methods for generating target nucleic acid sequences |
EP2484781B1 (en) | 2006-08-01 | 2017-08-23 | Applied Biosystems, LLC | Detection of analytes and nucleic acids |
AU2007281082A1 (en) | 2006-08-04 | 2008-02-07 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for the modulation of JNK proteins |
GB0619325D0 (en) * | 2006-09-30 | 2006-11-08 | Univ Strathclyde | New compounds |
US20080131878A1 (en) * | 2006-12-05 | 2008-06-05 | Asuragen, Inc. | Compositions and Methods for the Detection of Small RNA |
US7902345B2 (en) * | 2006-12-05 | 2011-03-08 | Sequenom, Inc. | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry |
US8133701B2 (en) * | 2006-12-05 | 2012-03-13 | Sequenom, Inc. | Detection and quantification of biomolecules using mass spectrometry |
AU2007333106A1 (en) * | 2006-12-08 | 2008-06-19 | Asuragen, Inc. | miR-20 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
CN104531684A (zh) | 2006-12-18 | 2015-04-22 | 和光纯药工业株式会社 | 鸟分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用它们检测鸟分枝杆菌的方法 |
US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
AU2008251381B2 (en) | 2007-05-11 | 2014-10-30 | The Johns Hopkins University | Biomarkers for melanoma |
US8143006B2 (en) * | 2007-08-03 | 2012-03-27 | Igor Kutyavin | Accelerated cascade amplification (ACA) of nucleic acids comprising strand and sequence specific DNA nicking |
US8071338B2 (en) * | 2007-08-08 | 2011-12-06 | Roche Molecular Systems, Inc. | Suppression of amplification using an oligonucleotide and a polymerase significantly lacking 5′-3′ nuclease activity |
ATE549419T1 (de) | 2007-08-29 | 2012-03-15 | Sequenom Inc | Verfahren und zusammensetzungen für die universelle grössenspezifische polymerasekettenreaktion |
EP2198050A1 (en) | 2007-09-14 | 2010-06-23 | Asuragen, INC. | Micrornas differentially expressed in cervical cancer and uses thereof |
WO2009045536A2 (en) * | 2007-10-05 | 2009-04-09 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Receptor targeted oligonucleotides |
WO2009052386A1 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | Asuragen, Inc. | Micrornas differentially expressed in lung diseases and uses thereof |
WO2009070805A2 (en) | 2007-12-01 | 2009-06-04 | Asuragen, Inc. | Mir-124 regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention |
EP2546344A3 (en) | 2008-02-08 | 2013-04-03 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detecting chlamydophilia caviae, as well as chlamydophilia caviae detection method using the same |
EP2268608A4 (en) | 2008-04-01 | 2012-01-11 | Biosearch Technologies Inc | DARK NUCLEIC ACID STABILIZED FLUOROPHORE DEACTIVATOR PROBES |
WO2009126726A1 (en) * | 2008-04-08 | 2009-10-15 | Asuragen, Inc | Methods and compositions for diagnosing and modulating human papillomavirus (hpv) |
WO2009126933A2 (en) | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components |
US8258111B2 (en) | 2008-05-08 | 2012-09-04 | The Johns Hopkins University | Compositions and methods related to miRNA modulation of neovascularization or angiogenesis |
ES2650066T3 (es) | 2008-05-28 | 2018-01-16 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Cebador y sonda para la detección de Mycobacterium intracellulare, y método para la detección de Mycobacterium intracellulare empleando el cebador o la sonda |
US8097412B2 (en) * | 2008-07-12 | 2012-01-17 | Biodiagnostics, Inc. | DNA-based test for detection of annual and intermediate ryegrass |
WO2010030716A1 (en) * | 2008-09-10 | 2010-03-18 | Igor Kutyavin | Detection of nucleic acids by oligonucleotide probes cleaved in presence of endonuclease v |
CN104328109A (zh) * | 2008-09-22 | 2015-02-04 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 微阵列底物上的生物材料的选择性处理 |
WO2010039548A2 (en) | 2008-09-23 | 2010-04-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition |
EP3238738B1 (en) | 2008-11-10 | 2020-09-23 | Arbutus Biopharma Corporation | Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics |
WO2010077324A2 (en) | 2008-12-17 | 2010-07-08 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants |
EP2669290A1 (en) | 2009-03-02 | 2013-12-04 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Nucleic Acid Chemical Modifications |
CA2755615A1 (en) * | 2009-03-18 | 2010-09-23 | Sequenom, Inc. | Use of thermostable endonucleases for generating reporter molecules |
EP3249053A1 (en) | 2009-03-27 | 2017-11-29 | Life Technologies Corporation | Methods, compositions, and kits for detecting allelic variants |
SI3431076T1 (sl) | 2009-06-10 | 2022-04-29 | Arbutus Biopharma Corporation | Izboljšana lipidna formulacija |
DK2462230T3 (en) | 2009-08-03 | 2015-10-19 | Recombinetics Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETED RE-MODIFICATION |
EP2483425B1 (en) | 2009-09-28 | 2016-08-24 | Igor Kutyavin | Methods and compositions for detection of nucleic acids based on stabilized oligonucleotide probe complexes |
WO2011046972A2 (en) * | 2009-10-12 | 2011-04-21 | Life Technologies Corporation | Compositions and methods for suppressing primer interactions |
CN103025872A (zh) * | 2009-11-25 | 2013-04-03 | 艾泰控股有限公司 | 小沟结合剂(MGB)-寡核苷酸miRNA拮抗剂 |
EP3296398A1 (en) | 2009-12-07 | 2018-03-21 | Arbutus Biopharma Corporation | Compositions for nucleic acid delivery |
AU2010330814B2 (en) | 2009-12-18 | 2017-01-12 | Acuitas Therapeutics Inc. | Methods and compositions for delivery of nucleic acids |
WO2011087707A1 (en) | 2009-12-22 | 2011-07-21 | Elitech Holding B.V. | Hypertheromostable endonuclease iv substrate probe |
WO2011094580A2 (en) | 2010-01-28 | 2011-08-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides |
WO2011100131A2 (en) | 2010-01-28 | 2011-08-18 | Alnylam Pharmacuticals, Inc. | Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s) |
EP2557156B1 (en) | 2010-03-23 | 2015-02-11 | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | Primer and probe for detecting chlamydia trachomatis, and method for detecting chlamydia trachomatis using same |
US10745467B2 (en) | 2010-03-26 | 2020-08-18 | The Trustees Of Dartmouth College | VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
US8916345B2 (en) * | 2010-03-26 | 2014-12-23 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Methods for enhancing nucleic acid hybridization |
EP2552947A4 (en) | 2010-03-26 | 2013-11-13 | Dartmouth College | VISTA REGULATORY T CELL MEDIATOR PROTEIN, VISTA BINDING ACTIVE SUBSTANCES AND USE THEREOF |
US9506057B2 (en) | 2010-03-26 | 2016-11-29 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Modifications for antisense compounds |
US20150231215A1 (en) | 2012-06-22 | 2015-08-20 | Randolph J. Noelle | VISTA Antagonist and Methods of Use |
WO2011123621A2 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | 2' and 5' modified monomers and oligonucleotides |
AU2011243039B2 (en) | 2010-04-16 | 2015-01-15 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Real time PCR assay for detection of bacterial respiratory pathogens |
WO2011133876A2 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs |
US9725479B2 (en) | 2010-04-22 | 2017-08-08 | Ionis Pharmaceuticals, Inc. | 5′-end derivatives |
WO2011133868A2 (en) | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides |
GB201007868D0 (en) | 2010-05-11 | 2010-06-23 | Enigma Diagnostics Ltd | Sequence detection assay |
WO2011143611A2 (en) | 2010-05-14 | 2011-11-17 | Life Technologies Corporation | Karyotyping assay |
US8658776B2 (en) | 2010-05-28 | 2014-02-25 | Life Technologies Corporation | Synthesis of 2′,3′-dideoxynucleosides for automated DNA synthesis and pyrophosphorolysis activated polymerization |
EP2576599B1 (en) | 2010-06-02 | 2015-03-18 | Merck Patent GmbH | A genetically modified bacterium of the species listeria monocytogenes |
WO2011163121A1 (en) | 2010-06-21 | 2011-12-29 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Multifunctional copolymers for nucleic acid delivery |
US20130189268A1 (en) | 2010-06-22 | 2013-07-25 | Precision Biologics, Inc. | Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies |
US20130202652A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-08-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Methods and compositions for delivery of active agents |
US20130323269A1 (en) | 2010-07-30 | 2013-12-05 | Muthiah Manoharan | Methods and compositions for delivery of active agents |
CA2809457C (en) | 2010-09-07 | 2019-07-30 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Modifications for antisense compounds |
CA2812556C (en) | 2010-09-23 | 2023-02-14 | Xue-Ping Wang | Colon and pancreas cancer peptidomimetics |
ES2847891T3 (es) | 2010-11-23 | 2021-08-04 | Vitaeris Inc | Anticuerpos anti-IL-6 para el tratamiento de la mucositis oral |
CA2824526C (en) | 2011-01-11 | 2020-07-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Pegylated lipids and their use for drug delivery |
WO2012125220A2 (en) | 2011-01-14 | 2012-09-20 | Life Technologies Corporation | Methods for isolation, identification, and quantification of mirnas |
ES2728743T3 (es) | 2011-01-17 | 2019-10-28 | Life Technologies Corp | Flujo de trabajo para la detección de ligandos utilizando ácidos nucleicos |
US8969003B2 (en) | 2011-03-23 | 2015-03-03 | Elitech Holding B.V. | Functionalized 3-alkynyl pyrazolopyrimidine analogues as universal bases and methods of use |
EP2689031B1 (en) | 2011-03-23 | 2016-10-19 | ELITechGroup B.V. | Functionalized 3-alkynyl pyrazolopyrimidine analogues as universal bases and methods of use |
WO2012142003A2 (en) | 2011-04-15 | 2012-10-18 | Life Technologies Corporation | Chemical ligation |
ES2537189T3 (es) | 2011-05-24 | 2015-06-03 | Elitech Holding B.V. | Detección de estafilococos áureos resistentes a la meticilina |
AU2012260601B2 (en) | 2011-05-25 | 2018-02-01 | Innate Pharma, S.A. | Anti-KIR antibodies for the treatment of inflammatory disorders |
US9567628B2 (en) | 2011-06-08 | 2017-02-14 | Life Technologies Corporation | Polymerization of nucleic acids using proteins having low isoelectric points |
ES2692894T3 (es) | 2011-06-08 | 2018-12-05 | Life Technologies Corporation | Diseño y desarrollo de nuevos detergentes para su uso en sistemas de PCR |
WO2012178187A1 (en) | 2011-06-23 | 2012-12-27 | Paul Yager | Reagent patterning in capillarity-based analyzers and associated systems and methods |
WO2013016321A1 (en) | 2011-07-26 | 2013-01-31 | Elitech Holding B.V. | Minor groove binder phosphoramidites and methods of use |
WO2013040251A2 (en) | 2011-09-13 | 2013-03-21 | Asurgen, Inc. | Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease |
US9701623B2 (en) | 2011-09-27 | 2017-07-11 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Di-aliphatic substituted pegylated lipids |
GB201119903D0 (en) * | 2011-11-17 | 2011-12-28 | Univ Vilnius | Nucleic acid production and sequence analysis |
US8981318B1 (en) | 2011-12-30 | 2015-03-17 | Gene Capture, Inc. | Multi-dimensional scanner for nano-second time scale signal detection |
CN107674071B (zh) | 2012-05-11 | 2021-12-31 | 同步制药公司 | 作为隐花色素调节剂的含有咔唑的磺酰胺类 |
US9394574B2 (en) | 2012-06-12 | 2016-07-19 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Methods for detecting Legionella nucleic acids in a sample |
CN110343673B (zh) | 2012-06-14 | 2024-04-05 | 生命技术公司 | 用于聚合酶链式反应(pcr)的新型组合物、方法和试剂盒 |
US9890215B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-02-13 | King's College London | Vista modulators for diagnosis and treatment of cancer |
AU2013277051B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-06-07 | King's College London | Novel VISTA-Ig constructs and the use of VISTA-Ig for treatment of autoimmune, allergic and inflammatory disorders |
AU2013312211B2 (en) | 2012-09-07 | 2018-03-29 | King's College London | VISTA modulators for diagnosis and treatment of cancer |
EP2904120B1 (en) | 2012-10-04 | 2018-01-10 | The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University | Methods and reagents for detection, quantitation, and serotyping of dengue viruses |
CN111793621A (zh) | 2012-11-02 | 2020-10-20 | 生命技术公司 | 用于增强pcr特异性的新颖组合物、方法和试剂盒 |
CA2896723C (en) | 2012-12-28 | 2024-02-13 | Precision Biologics, Inc. | Humanized monoclonal antibodies and methods of use for the diagnosis and treatment of colon and pancreas cancer |
CN105050720A (zh) | 2013-01-22 | 2015-11-11 | 华盛顿大学商业化中心 | 顺序递送流体体积和相关的设备、系统和方法 |
CN105339505B (zh) | 2013-03-12 | 2021-08-10 | 生命技术公司 | 基于通用报告体的基因分型方法和材料 |
WO2014164874A2 (en) | 2013-03-13 | 2014-10-09 | Becton, Dickinson And Company | Methods and compositions for modulation of amplification efficiency |
EP2971086A1 (en) | 2013-03-14 | 2016-01-20 | ELITechGroup B.V. | Functionalized 3-alkynyl pyrazolopyrimidine analogues as universal bases and methods of use |
JP2016515380A (ja) | 2013-03-15 | 2016-05-30 | ライフ テクノロジーズ コーポレーション | 肺癌の分類及び実施可能性インデックス |
CA2918194C (en) | 2013-03-27 | 2022-12-06 | The General Hospital Corporation | Methods and agents for treating alzheimer's disease |
WO2014165710A2 (en) | 2013-04-05 | 2014-10-09 | Life Technologies Corporation | Gene fusions |
ES2654631T3 (es) | 2013-05-13 | 2018-02-14 | Elitechgroup B.V. | PCR digital en gotas con sondas cortas de ranura menor |
CN105722996A (zh) | 2013-09-13 | 2016-06-29 | 生命科技公司 | 癌症的分类和可行性指数 |
WO2015061475A2 (en) | 2013-10-22 | 2015-04-30 | THE GOVERNMENT OF THE USA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEATLH AND HUMAN SERV | Compositions and methods for detection and discrimination of influenza viruses |
EP3063129B1 (en) | 2013-10-25 | 2019-04-17 | Life Technologies Corporation | Novel compounds for use in pcr systems and applications thereof |
JP6466437B2 (ja) | 2013-10-30 | 2019-02-06 | メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツングMerck Patent Gesellschaft mit beschraenkter Haftung | 微生物を複雑な試料から単離する方法 |
US11014987B2 (en) | 2013-12-24 | 2021-05-25 | Janssen Pharmaceutics Nv | Anti-vista antibodies and fragments, uses thereof, and methods of identifying same |
WO2015097536A2 (en) | 2013-12-24 | 2015-07-02 | Janssen Pharmaceutical Nv | Anti-vista antibodies and fragments |
US20170058366A1 (en) | 2014-02-21 | 2017-03-02 | The United States of America, as represented by th e Secretary, Dept. of Health and Human Services | Hiv-2 nucleic acids and methods of detection |
WO2015149034A2 (en) | 2014-03-27 | 2015-10-01 | Life Technologies Corporation | Gene fusions and gene variants associated with cancer |
TWI690521B (zh) | 2014-04-07 | 2020-04-11 | 美商同步製藥公司 | 作為隱花色素調節劑之含有咔唑之醯胺類、胺基甲酸酯類及脲類 |
US20170044631A1 (en) | 2014-04-14 | 2017-02-16 | The Unite States of America, as represented by the Secretary, Dept. of Health and Human Services | Methods for rapid detection and identification of viral nucleic acids |
AU2015274504B2 (en) | 2014-06-11 | 2021-02-04 | Kathy A. Green | Use of VISTA agonists and antagonists to suppress or enhance humoral immunity |
KR20170016915A (ko) | 2014-06-11 | 2017-02-14 | 마이크로닉스 인코포레이티드. | 핵산의 분석을 위한 통합 검정 대조군을 갖는 마이크로 유체 공학적 카트리지 및 장치 |
US9212388B1 (en) | 2014-06-30 | 2015-12-15 | Life Technologies Corporation | Direct quantitative PCR absent minor groove binders |
WO2016061111A1 (en) | 2014-10-13 | 2016-04-21 | Life Technologies Corporation | Methods, kits & compositions for determining gene copy numbers |
AU2015357463B2 (en) | 2014-12-05 | 2021-10-07 | Immunext, Inc. | Identification of VSIG8 as the putative vista receptor and its use thereof to produce vista/VSIG8 modulators |
US10266903B2 (en) | 2014-12-12 | 2019-04-23 | Elitechgroup, Inc. | Methods and compositions for detecting antibiotic resistant bacteria |
EP3230468B1 (en) | 2014-12-12 | 2020-09-16 | ELITechGroup, Inc. | Methods and kits for detecting antibiotic resistant bacteria |
AU2015364508A1 (en) | 2014-12-18 | 2017-07-06 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | ReversirTM compounds |
BR112017027870A2 (pt) | 2015-06-24 | 2018-08-28 | Janssen Pharmaceutica Nv | anticorpos e fragmentos anti-vista |
WO2017015109A1 (en) | 2015-07-17 | 2017-01-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Multi-targeted single entity conjugates |
US10899836B2 (en) | 2016-02-12 | 2021-01-26 | Janssen Pharmaceutica Nv | Method of identifying anti-VISTA antibodies |
CA3020848A1 (en) | 2016-04-15 | 2017-10-19 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Anti-human vista antibodies and use thereof |
WO2017200790A1 (en) | 2016-05-20 | 2017-11-23 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay with modified probe for the diagnosis of rabies viruses and other lyssaviruses |
WO2017218938A1 (en) | 2016-06-16 | 2017-12-21 | Life Technologies Corporation | Novel compositions, methods and kits for microorganism detection |
WO2018005284A1 (en) | 2016-06-27 | 2018-01-04 | The United State Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for influenza a virus subtyping |
US11613777B2 (en) | 2016-08-26 | 2023-03-28 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid extraction and amplification controls and methods of use thereof |
WO2018047148A1 (en) | 2016-09-12 | 2018-03-15 | Novartis Ag | Compounds for the inhibition of mirna |
WO2018162516A1 (en) | 2017-03-08 | 2018-09-13 | Etablissement Francais Du Sang | Rhd gene allele associated with a weak d phenotype and its uses |
WO2018162986A2 (en) | 2017-03-09 | 2018-09-13 | Elitechgroup B.V. | Nitrodiarylethenes as fluorescence quenchers for nucleic acid probes |
EP3668884B1 (en) | 2017-08-17 | 2022-03-09 | ELITechGroup Inc. | Duplex stabilizing fluorescence quenchers for nucleic acid probes |
JP2021502825A (ja) | 2017-11-13 | 2021-02-04 | ライフ テクノロジーズ コーポレイション | 尿路微生物検出のための組成物、方法、およびキット |
US10689629B1 (en) | 2017-12-06 | 2020-06-23 | Cepheid | Inhibition of nucleic acid polymerases by endonuclease V-cleavable circular oligonucleotide ligands |
US10724017B1 (en) | 2017-12-06 | 2020-07-28 | Cepheid | Inhibition of DNA polymerases by uracil-DNA glycosylase-cleavable oligonucleotide ligands |
US10724083B1 (en) | 2017-12-06 | 2020-07-28 | Cepheid | Inhibition of nucleic acid polymerases by endonuclease V-cleavable oligonucleotide ligands |
CA3098623A1 (en) | 2018-05-07 | 2019-11-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Extrahepatic delivery |
EP3802526A1 (en) | 2018-05-29 | 2021-04-14 | ELITechGroup, Inc. | Carborhodamine compounds and methods of preparation thereof |
WO2020037290A1 (en) | 2018-08-16 | 2020-02-20 | Life Technologies Corporation | Reagents, mixtures, kits and methods for amplification of nucleic acids |
EP3856907A1 (en) | 2018-09-28 | 2021-08-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases |
JP7432610B2 (ja) | 2018-10-01 | 2024-02-16 | ジェン-プローブ・インコーポレーテッド | 水痘帯状疱疹ウイルスを増幅または検出するための組成物および方法 |
US20220211743A1 (en) | 2019-05-17 | 2022-07-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Oral delivery of oligonucleotides |
WO2021086753A1 (en) * | 2019-10-28 | 2021-05-06 | Geron Corporation | Amorphous solid succinylated 3-(fatty acid amido)-2-hydroxy-1-(protected hydroxy)-propane salts and methods of making the same |
EP4055165A1 (en) | 2019-11-06 | 2022-09-14 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing ttr-associated ocular diseases |
CN114945669A (zh) | 2019-11-06 | 2022-08-26 | 阿尔尼拉姆医药品有限公司 | 肝外递送 |
BR112022016493A2 (pt) | 2020-02-18 | 2022-10-25 | Life Technologies Corp | Composições, kits e métodos para detecção de sequências virais |
EP3929310A1 (en) | 2020-06-26 | 2021-12-29 | FRAUNHOFER-GESELLSCHAFT zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Methods and means for corona virus nucleic acid detection |
DE202021100985U1 (de) | 2020-06-26 | 2021-06-18 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Ein diagnostisches Assay-Kit und Mittel zum Nachweis von Coronavirus-Nukleinsäure |
US20230257745A1 (en) | 2020-07-10 | 2023-08-17 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Circular siRNAs |
CA3186955A1 (en) | 2020-07-23 | 2022-01-27 | Scott Benson | Energy transfer dye conjugates for use in biological assays |
EP4185858A2 (en) | 2020-07-23 | 2023-05-31 | Life Technologies Corporation | Compositions, systems and methods for biological analysis using dyes |
WO2022147214A2 (en) | 2020-12-31 | 2022-07-07 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Cyclic-disulfide modified phosphate based oligonucleotide prodrugs |
EP4271695A2 (en) | 2020-12-31 | 2023-11-08 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | 2'-modified nucleoside based oligonucleotide prodrugs |
EP4278002A2 (en) | 2021-01-18 | 2023-11-22 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for direct amplification from crude biological samples |
WO2022159874A1 (en) | 2021-01-25 | 2022-07-28 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
WO2022203748A1 (en) | 2021-03-23 | 2022-09-29 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for variant-resistant detection of target viral sequences |
EP4074839A1 (en) | 2021-04-16 | 2022-10-19 | Biotype GmbH | Optimized oligonucleotide tx probe for a multiplexing analysis of nucleic acids and a multiplexing method |
WO2023283403A2 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Bis-rnai compounds for cns delivery |
WO2023004400A1 (en) | 2021-07-21 | 2023-01-26 | Life Technologies Corporation | Dibenzoxanthene quenchers, uses, and methods of preparation |
WO2023003922A1 (en) | 2021-07-21 | 2023-01-26 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Metabolic disorder-associated target gene irna compositions and methods of use thereof |
WO2023014729A1 (en) | 2021-08-02 | 2023-02-09 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detection of nucleic acid sequence loads |
WO2023064530A1 (en) | 2021-10-15 | 2023-04-20 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Extra-hepatic delivery irna compositions and methods of use thereof |
WO2023069604A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for quantification of nucleic acid sequences using an internal quantitative standard |
WO2023220744A2 (en) | 2022-05-13 | 2023-11-16 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Single-stranded loop oligonucleotides |
CN114672482B (zh) * | 2022-05-31 | 2022-08-30 | 上海百力格生物技术有限公司 | 核酸探针制备方法 |
WO2024006927A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits, and methods for detecting nucleic acids using intra-channel multiplexing |
WO2024006924A1 (en) | 2022-06-29 | 2024-01-04 | Life Technologies Corporation | Systems and methods for analyte detection from multiplexed assays |
WO2024006999A2 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Cyclic-disulfide modified phosphate based oligonucleotide prodrugs |
WO2024054925A1 (en) | 2022-09-09 | 2024-03-14 | Life Technologies Corporation | Compositions, kits and methods for detection of viral variant sequences |
WO2024073732A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Modified double-stranded rna agents |
EP4350002A1 (en) | 2022-10-07 | 2024-04-10 | Biotype GmbH | Nachweis von molekularen analyten auf der grundlage massgeschneiderter sondenkonkurrenz |
Family Cites Families (55)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4169888A (en) | 1977-10-17 | 1979-10-02 | The Upjohn Company | Composition of matter and process |
US4458066A (en) | 1980-02-29 | 1984-07-03 | University Patents, Inc. | Process for preparing polynucleotides |
US4358535A (en) | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
US4711955A (en) | 1981-04-17 | 1987-12-08 | Yale University | Modified nucleotides and methods of preparing and using same |
CA1190838A (en) | 1981-07-17 | 1985-07-23 | Cavit Akin | Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer |
US4942227A (en) * | 1982-01-11 | 1990-07-17 | California Institute Of Technology | Bifunctional molecules having a DNA intercalator or DNA groove binder linked to ethylene diamine tetraacetic acid, their preparation and use to cleave DNA |
FR2540122B1 (fr) * | 1983-01-27 | 1985-11-29 | Centre Nat Rech Scient | Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application |
US4665184A (en) * | 1983-10-12 | 1987-05-12 | California Institute Of Technology | Bifunctional molecules having a DNA intercalator or DNA groove binder linked to ethylene diamine tetraacetic acid |
US4883750A (en) | 1984-12-13 | 1989-11-28 | Applied Biosystems, Inc. | Detection of specific sequences in nucleic acids |
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4868105A (en) | 1985-12-11 | 1989-09-19 | Chiron Corporation | Solution phase nucleic acid sandwich assay |
US4800159A (en) | 1986-02-07 | 1989-01-24 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences |
US4868103A (en) | 1986-02-19 | 1989-09-19 | Enzo Biochem, Inc. | Analyte detection by means of energy transfer |
US6270961B1 (en) | 1987-04-01 | 2001-08-07 | Hyseq, Inc. | Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification |
US5202231A (en) | 1987-04-01 | 1993-04-13 | Drmanac Radoje T | Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes |
US5525464A (en) | 1987-04-01 | 1996-06-11 | Hyseq, Inc. | Method of sequencing by hybridization of oligonucleotide probes |
US5124246A (en) | 1987-10-15 | 1992-06-23 | Chiron Corporation | Nucleic acid multimers and amplified nucleic acid hybridization assays using same |
AU622426B2 (en) | 1987-12-11 | 1992-04-09 | Abbott Laboratories | Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization |
JPH03503894A (ja) | 1988-03-25 | 1991-08-29 | ユニバーシィティ オブ バージニア アランミ パテンツ ファウンデイション | オリゴヌクレオチド n‐アルキルホスホラミデート |
CA1341584C (en) | 1988-04-06 | 2008-11-18 | Bruce Wallace | Method of amplifying and detecting nucleic acid sequences |
US4921788A (en) | 1988-04-12 | 1990-05-01 | The Research Foundation Of State University Of New York | Competitive nucleic acid immunoassay for the detection of analytes |
WO1990003370A1 (en) | 1988-09-28 | 1990-04-05 | Microprobe Corporation | DERIVATIVES OF PYRAZOLO[3,4-d]PYRIMIDINE |
US5849482A (en) | 1988-09-28 | 1998-12-15 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Crosslinking oligonucleotides |
EP0472648A4 (en) | 1989-05-18 | 1992-09-16 | Microprobe Corporation | Crosslinking oligonucleotides |
CA2024548C (en) * | 1989-09-05 | 2002-05-28 | David Issachar | Analyte specific chemical sensor |
EP0942000B1 (en) | 1989-10-24 | 2004-06-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | 2'-Modified oligonucleotides |
US5237101A (en) * | 1990-01-26 | 1993-08-17 | The Trustees Of The Univ. Of Penna. | Propargylic and allenic sulfones |
US5210015A (en) | 1990-08-06 | 1993-05-11 | Hoffman-La Roche Inc. | Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase |
US5512667A (en) | 1990-08-28 | 1996-04-30 | Reed; Michael W. | Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides |
US5296350A (en) | 1990-10-31 | 1994-03-22 | The Research Foundation Of State University Of New York | Ion triggered alkylation of biological targets by silyloxy aromatic agents |
WO1992010588A1 (en) | 1990-12-06 | 1992-06-25 | Affymax Technologies N.V. | Sequencing by hybridization of a target nucleic acid to a matrix of defined oligonucleotides |
AU2028792A (en) * | 1991-05-17 | 1992-12-30 | Uab Research Foundation | Sequence specific dna binding drugs |
US5340716A (en) | 1991-06-20 | 1994-08-23 | Snytex (U.S.A.) Inc. | Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label |
US5419966A (en) * | 1991-06-10 | 1995-05-30 | Microprobe Corporation | Solid support for synthesis of 3'-tailed oligonucleotides |
JPH06509945A (ja) | 1991-08-19 | 1994-11-10 | マイクロプローブ・コーポレイション | 酵素媒介三本鎖形成のための架橋性オリゴヌクレオチド |
US5574142A (en) | 1992-12-15 | 1996-11-12 | Microprobe Corporation | Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery |
WO1994017092A1 (en) | 1993-01-26 | 1994-08-04 | Microprobe Corporation | Bifunctional crosslinking oligonucleotides adapted for linking to a desired gene sequence of invading organism or cell |
US5786138A (en) | 1993-01-29 | 1998-07-28 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Hyperstabilizing antisense nucleic acid binding agents |
US5395849A (en) * | 1993-10-05 | 1995-03-07 | Bristol-Myers Squibb Company | Hybrid antitumor compounds containing a cyclic enediyne and a DNA-binder |
US5925517A (en) * | 1993-11-12 | 1999-07-20 | The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. | Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits |
US5538848A (en) * | 1994-11-16 | 1996-07-23 | Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. | Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe |
US5446137B1 (en) * | 1993-12-09 | 1998-10-06 | Behringwerke Ag | Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides |
US5646126A (en) | 1994-02-28 | 1997-07-08 | Epoch Pharmaceuticals | Sterol modified oligonucleotide duplexes having anticancer activity |
FR2719048B1 (fr) * | 1994-04-25 | 1996-07-19 | Pasteur Strasbourg I Universit | Bases nucléiques polycationiques et oligonucléotides les contenant. |
US5968933A (en) * | 1994-08-26 | 1999-10-19 | Auckland Division Cancer Society Of New Zealand Inc. | DNA-targeted alkylating agents |
US5556752A (en) | 1994-10-24 | 1996-09-17 | Affymetrix, Inc. | Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA |
US5801155A (en) * | 1995-04-03 | 1998-09-01 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates |
US6312894B1 (en) * | 1995-04-03 | 2001-11-06 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders |
AU693023B2 (en) * | 1995-05-05 | 1998-06-18 | Applied Biosystems, Llc | Methods and reagents for combined PCR amplification and hybridization probing assay |
US5912340A (en) | 1995-10-04 | 1999-06-15 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Selective binding complementary oligonucleotides |
US5659022A (en) | 1996-01-05 | 1997-08-19 | Epoch Pharmaceuticals, Inc. | Oligonucleotide-cyclopropapyrroloindole conjugates as sequence specific hybridization and crosslinking agents for nucleic acids |
US5776907A (en) | 1996-05-20 | 1998-07-07 | Texas Biotechnology Corporation | Mitomycin oligonucleotide conjugates |
US5955590A (en) | 1996-07-15 | 1999-09-21 | Worcester Foundation For Biomedical Research | Conjugates of minor groove DNA binders with antisense oligonucleotides |
EP0986539A1 (en) | 1997-04-06 | 2000-03-22 | California Institute Of Technology | Dna-binding pyrrole and imidazole polyamide derivatives |
US6080868A (en) * | 1998-01-23 | 2000-06-27 | The Perkin-Elmer Corporation | Nitro-substituted non-fluorescent asymmetric cyanine dye compounds |
-
1995
- 1995-04-03 US US08/415,370 patent/US5801155A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-04-03 DE DE69637389T patent/DE69637389T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-03 CN CN96194421.8A patent/CN1187363C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-03 AT AT96910723T patent/ATE382627T1/de active
- 1996-04-03 AU AU53842/96A patent/AU716108B2/en not_active Expired
- 1996-04-03 CA CA002223678A patent/CA2223678C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-03 WO PCT/US1996/004559 patent/WO1996032496A2/en active IP Right Grant
- 1996-04-03 CN CN2009101732576A patent/CN101914099A/zh active Pending
- 1996-04-03 JP JP53105196A patent/JP4948690B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-03 DK DK96910723T patent/DK0819133T3/da active
- 1996-04-03 CN CN200410055897.4A patent/CN1644585A/zh active Pending
- 1996-04-03 EP EP96910723A patent/EP0819133B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-04-03 PT PT96910723T patent/PT819133E/pt unknown
- 1996-04-03 ES ES96910723T patent/ES2300106T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-27 US US09/141,764 patent/US6084102A/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-02-18 US US09/507,345 patent/US6426408B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-12-18 US US09/739,928 patent/US6486308B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-07-14 US US12/172,999 patent/US7794945B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-08-31 US US12/847,148 patent/US8465921B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1996032496A2 (en) | 1996-10-17 |
US20110275070A1 (en) | 2011-11-10 |
US6084102A (en) | 2000-07-04 |
DK0819133T3 (da) | 2008-05-13 |
PT819133E (pt) | 2008-04-07 |
JPH11504626A (ja) | 1999-04-27 |
EP0819133A2 (en) | 1998-01-21 |
CA2223678C (en) | 2009-09-08 |
CA2223678A1 (en) | 1996-10-17 |
AU716108B2 (en) | 2000-02-17 |
DE69637389D1 (de) | 2008-02-14 |
CN1187363C (zh) | 2005-02-02 |
CN1644585A (zh) | 2005-07-27 |
CN1186496A (zh) | 1998-07-01 |
DE69637389T2 (de) | 2008-12-18 |
WO1996032496A3 (en) | 1996-11-28 |
US5801155A (en) | 1998-09-01 |
JP4948690B2 (ja) | 2012-06-06 |
US6486308B2 (en) | 2002-11-26 |
AU5384296A (en) | 1996-10-30 |
US20090048427A1 (en) | 2009-02-19 |
US20020052482A1 (en) | 2002-05-02 |
ATE382627T1 (de) | 2008-01-15 |
CN101914099A (zh) | 2010-12-15 |
US6426408B1 (en) | 2002-07-30 |
EP0819133B1 (en) | 2008-01-02 |
US7794945B2 (en) | 2010-09-14 |
US8465921B2 (en) | 2013-06-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2300106T3 (es) | Conjugados de agente de union al surco menor y oligonucleotidos unidos covalentemente. | |
US6884584B2 (en) | Hybridization and mismatch discrimination using oligonucleotides conjugated to minor groove binders | |
US7999098B2 (en) | Triphosphate oligonucleotide modification reagents and uses thereof | |
ES2204537T3 (es) | Sistesis de oligonucleotidos marcados sobre soportes solidos. | |
US6593466B1 (en) | Guanidinium functionalized nucleotides and precursors thereof | |
Lukhtanov et al. | Oligodeoxynucleotides with conjugated dihydropyrroloindole oligopeptides: Preparation and hybridization properties | |
AU1442101A (en) | Hybridization-triggered fluorescent detection of nucleic acids | |
ES2269239T3 (es) | Derivados de poliamida-oligonucleotidos, su preparacion y uso. | |
JPH08506093A (ja) | 2本鎖核酸の塩基配列特異結合ポリマー | |
Wojciechowski et al. | Nucleobase modifications in peptide nucleic acids | |
De Napoli et al. | A new solid-phase synthesis of oligonucleotides 3′-conjugated with peptides | |
Kawashima et al. | Design, Synthesis, and Analysis of Minor Groove Binder Pyrrolepolyamide--Deoxyguanosine Hybrids | |
Gerrard | Novel nucleotide analogues for forming stable DNA triple helices | |
US20080207890A1 (en) | Reagents for the Improved Synthesis of Isoguanosine Containing Oligonucleotides | |
Emanuel | SYNTHESIS, CARBON-13 NMR AND STEREOCHEMISTRY OF A REVERSED AMINOACYL NUCLEOSIDE ANALOG OF PUROMYCIN. |